JP2023526057A - Ｃｒｉｓｐｒゲノム編集のための修飾されたガイドｒｎａ - Google Patents
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Abstract
化学的に修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが提供される。５’及び／または３’共役部分を有するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが提供される。ｃｒＲＮＡのリピート領域またはｔｒａｃｒＲＮＡのアンチリピート領域に修飾を有するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが提供される。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによるゲノム編集のためのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの使用方法、ならびにそれらを行うためのキットもまた提供される。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月１２日に出願された米国仮出願第６３／０２３，３１３号の利益を主張するものであり、その内容全体が、参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２０年５月１２日に出願された米国仮出願第６３／０２３，３１３号の利益を主張するものであり、その内容全体が、参照により本明細書に援用される。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国国立衛生研究所により付与された助成金番号ＴＲ００２６６８の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所により付与された助成金番号ＴＲ００２６６８の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本開示は、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集のための修飾されたガイドＲＮＡの組成物及び方法に関する。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイドされたゲノム工学は、ヒト遺伝子疾患及び生物学の他の多くの側面に関する研究に革命をもたらした。多数のＣＲＩＳＰＲベースのインビボまたはエクスビボゲノム編集療法が臨床試験に近づいている。この革命の中心は、Ｃａｓ９（ＩＩ型）及びＣａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１（Ｖ型）などのクラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に見られる微生物エフェクタータンパク質である（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６－８２１（２０１２）、Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １０９，Ｅ２５７９－Ｅ２５８６（２０１２）、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６３，７５９－７７１（２０１５））。
最も広く使用されているゲノム編集ツールは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ株ＳＦ３７０（ＳｐＣａｓ９）由来のＩＩ－Ａ Ｃａｓ９型である（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ，上記）。Ｃａｓ９は、細菌及び真核生物の両方における効率的なＤＮＡ切断のために、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する（図１）。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰを標的ＤＮＡとの塩基対合を介して特定の遺伝子座に誘導してＲループを形成するガイド配列を含有する。このプロセスは、ＳｐＣａｓ９に対してはＮＧＧである、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の事前認識を必要とする。Ｒループ形成により、ＤＮＡの標的鎖及び非標的鎖をそれぞれ切断するＨｉｓ－Ａｓｎ－Ｈｉｓ（ＨＮＨ）及びＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインが活性化され、二本鎖切断（ＤＳＢ）が生じる。
哺乳動物用途では、Ｃａｓ９及びそのガイドＲＮＡは、ＤＮＡ（例えば、ウイルスベクター）、ＲＮＡ（例えば、脂質ナノ粒子中のＣａｓ９ ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡ）から発現されることができ、またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）として導入されることができる。Ｃａｓ９のウイルス送達は、効率的な編集をもたらすが、Ｃａｓ９及びそのガイドの長期発現は、オフターゲット編集をもたらし得、ウイルスベクターは、強い宿主免疫応答を誘発し得るため、問題となり得る（Ｍｉｎｇｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １２２，２３－３６（２０１３））。Ｃａｓ９のＲＮＡ及びＲＮＰ送達プラットフォームは、多くの用途に好適なウイルスベクターの代替物であり、インビボでの効果的なゲノム編集ツールであることが最近示されている（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３５，１１７９（２０１７）、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ． ｅＬｉｆｅ ６，ｅ２５３１２（２０１７））。Ｃａｓ９のＲＮＰ送達はまた、Ｃａｓ９発現の要件をバイパスし、より速い編集につながる。更に、ｍＲＮＡまたはＲＮＰとして送達されるＣａｓ９は、細胞内に一過性にのみ存在し、したがって、減少したオフターゲット編集を示す。例えば、Ｃａｓ９ ＲＮＰは、測定可能なオフターゲット効果なしに、ヒト胚における肥大型心筋症（ＨＣＭ）を補正するために成功裏に使用された（Ｍａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５４８，４１３（２０１７））。
ゲノム編集のためのＣａｓ９の汎用性は、そのＲＮＡガイド性に由来する。ＳｐＣａｓ９のｃｒＲＮＡは、通常、２０ヌクレオチドのガイド領域、続いて１６ヌクレオチドのリピート領域を含む（図１）。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡと対合するアンチリピート領域からなり、３つのステムループも含む。これらの二次構造エレメントは全て、哺乳動物系における効率的な編集のために必要である（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，８２７（２０１３））。それにもかかわらず、既存のガイドＲＮＡはいくつかの制限を受け、治療用途におけるそれらの有用性を制限する。例えば、既存のガイドＲＮＡは、循環中及び細胞内で急速に分解され得る。更に、ガイドＲＮＡの化学修飾は、安定性及び編集効率を低下させ得る。したがって、Ｃａｓ９等のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと対合したときに、インビボ及びエクスビボで効率的なゲノム編集活性を維持する最適化されたガイドＲＮＡの必要性が当該技術分野に存在する。
本開示は、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集のための化学修飾されたガイドＲＮＡを提供する。ある特定の実施形態において、本開示のガイドＲＮＡは、重度にまたは完全に化学修飾される。本開示のガイドＲＮＡは、インビボまたはエクスビボで、安定性、向上した効力、及び／または減少したオフターゲット効果を含む、いくつかの利点を付与し得る。更に、ある特定の実施形態において、本開示の修飾されたＲＮＡは、低減された免疫原性、例えば、先天性免疫応答を誘導する能力の低下を有する。
特定の態様において、本開示は、化学修飾されたガイドＲＮＡであって、（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに（ｂ）リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含み、ｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも５０％修飾されたヌクレオチドを含み、ｃｒＲＮＡ部分が、１～１０個の２’デオキシ修飾リボース基を含む、化学修飾されたガイドＲＮＡを提供する。
ある形態において、修飾されたヌクレオチドはそれぞれ独立して、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組み合わせの修飾を含む。
ある実施形態において、リボース基の各修飾は、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、２’－ＮＨ２（２’－アミノ）、４’－チオ、二環式ヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）からなる群から独立して選択される。
ある形態において、リボース基の少なくとも８０％が化学修飾されている。ある実施形態において、リボース基の少なくとも９０％が化学修飾されている。ある実施形態において、リボース基の１００％が化学修飾されている。
ある実施形態において、リン酸基の各修飾が、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、及びホスホトリエステル修飾からなる群から独立して選択される。
ある形態において、核酸塩基基の各修飾が、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基からなる群から独立して選択される。
ある形態において、ガイドＲＮＡは、少なくとも９０％修飾されたヌクレオチドを含む。ある形態において、ガイドＲＮＡは、少なくとも１００％修飾されたヌクレオチドを含む。
ある形態において、ｃｒＲＮＡ部分の少なくとも１つのヌクレオチドは、２’－デオキシ化学修飾及びホスホロチオエート化学修飾のそれぞれを含む。
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から４、５、６、１２、１５、１６、１９、２２、２３、及び２４位のヌクレオチドのうちの１つ以上は、２’－デオキシ化学修飾（例えば、配列番号：１に示されるｃｒＲＮＡ部分の５’末端から４、５、６、１２、１５、１６、１９、２２、２３、及び２４位のヌクレオチドのうちの１つ以上）を含む。ある実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から４、５、及び６位のヌクレオチドは、２’－デオキシ化学修飾及びホスホロチオエート化学修飾のそれぞれを含む。ある実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１２位のヌクレオチドは、２’－デオキシ化学修飾及びホスホロチオエート化学修飾のそれぞれを含む。ある実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１５、１６、及び１９位のヌクレオチドは、２’－デオキシ化学修飾及びホスホロチオエート化学修飾のそれぞれを含む。ある実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２２、２３、及び２４位のヌクレオチドは、２’－デオキシ化学修飾及びホスホロチオエート化学修飾のそれぞれを含む。
一実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、少なくとも１つの２’－デオキシ修飾を含む。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、表１に列挙される、ｃｒＲＮＡ ３８、ｃｒＲＮＡ ４０、ｃｒＲＮＡ ４１、ｃｒＲＮＡ ４２、ｃｒＲＮＡ ４４、ｃｒＲＮＡ ５２、ｃｒＲＮＡ ５３、ｃｒＲＮＡ ５４、ｃｒＲＮＡ ５５、ｃｒＲＮＡ ５６、ｃｒＲＮＡ ５７、ｃｒＲＮＡ ５８、ｃｒＲＮＡ ５９、ｃｒＲＮＡ ６０、ｃｒＲＮＡ ６１、ｃｒＲＮＡ ６２、ｃｒＲＮＡ ６３、ｃｒＲＮＡ ６４、ｃｒＲＮＡ ６５、ｃｒＲＮＡ ６６、ｃｒＲＮＡ ６７、ｃｒＲＮＡ ６８、ｃｒＲＮＡ ６９、ｃｒＲＮＡ ７０、ｃｒＲＮＡ ７１、ｃｒＲＮＡ ７２、ｃｒＲＮＡ ７３、ｃｒＲＮＡ ７４、ｃｒＲＮＡ ７５、ｃｒＲＮＡ ７６、ｃｒＲＮＡ ７７、ｃｒＲＮＡ ７８、ｃｒＲＮＡ ７９、ｃｒＲＮＡ ８０、ｃｒＲＮＡ ８１、ｃｒＲＮＡ ８２、ｃｒＲＮＡ ８３、ｃｒＲＮＡ ８４、ｃｒＲＮＡ ８５、ｃｒＲＮＡ ８６、ｃｒＲＮＡ ８７、ｃｒＲＮＡ ８８、ｃｒＲＮＡ ８９、ｃｒＲＮＡ ９０、ｃｒＲＮＡ ９１、ｃｒＲＮＡ ９２、またはｃｒＲＮＡ ９３のｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含む。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｍＵｍＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３８）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４０）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｄＮ＃ｄＮ＃ｆＮｆＮｄＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４１）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｄＵ＃ｄＵ＃ｄＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４２）、及び
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｄＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ （ｃｒＲＮＡ ４４）からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである。
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｍＵｍＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３８）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４０）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｄＮ＃ｄＮ＃ｆＮｆＮｄＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４１）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｄＵ＃ｄＵ＃ｄＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４２）、及び
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｄＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ （ｃｒＲＮＡ ４４）からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、表２のｔｒａｃｒＲＮＡ １～１１６のうちのいずれかから選択されるｔｒａｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含む。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、以下からなる群から選択されるｔｒａｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含む：
ある態様において、本開示は、（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに（ｂ）リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含み、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から４、５、及び６位のヌクレオチドが、２’－フルオロ化学修飾またはホスホロチオエート化学修飾を含む、化学修飾されたガイドＲＮＡを提供する。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組み合わせの修飾から選択される１つ以上の追加の化学修飾を含む。
ある実施形態において、リボース基の各修飾は、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、２’－ＮＨ２（２’－アミノ）、４’－チオ、二環式ヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）からなる群から独立して選択される。
ある実施形態において、リボース基の少なくとも８０％が化学修飾されている。ある実施形態において、リボース基の少なくとも９０％が化学修飾されている。ある実施形態において、リボース基の１００％が化学修飾されている。
ある実施形態において、リン酸基の各修飾は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、及びホスホトリエステル修飾からなる群から独立して選択される。
ある実施形態において、核酸塩基基の各修飾は、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基からなる群から独立して選択される。
ある実施形態において、ガイドＲＮＡは、少なくとも９０％修飾されたヌクレオチドを含む。ある実施形態において、ガイドＲＮＡは、１００％修飾されたヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から４、５、及び６位のヌクレオチドは、２’－フルオロ化学修飾を含む。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１５、１６、１９、２２、２３、及び２４位のうちの１つ以上（例えば、配列番号１に記載のｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１５、１６、１９、２２、２３、及び２４位のうちの１つ以上）に２’－フルオロ化学修飾を更に含む。ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１５、１６、１９、２２、２３、及び２４位に２’－フルオロ化学修飾を更に含む。
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から４、５、及び６位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート化学修飾を含む。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１５、１６、１９、２２、２３、及び２４位のうちの１つ以上に２’－フルオロ化学修飾を更に含む。ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１５、１６、１９、２２、２３、及び２４位に２’－フルオロ化学修飾を更に含む。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｒＡ＃ｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３３）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３４）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｍＵｍＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３６）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｍＵｍＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３７）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３９）、及び
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｆＮｆＮｆＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ （ｃｒＲＮＡ ４５）からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである。
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｒＡ＃ｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３３）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３４）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｍＵｍＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３６）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｍＵｍＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３７）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３９）、及び
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｆＮｆＮｆＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ （ｃｒＲＮＡ ４５）からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、表２のｔｒａｃｒＲＮＡ １～１１６のうちのいずれか１つから選択されるｔｒａｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含む。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、以下からなる群から選択されるｔｒａｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含む：
別の態様において、本開示は、（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに（ｂ）リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含み、ｃｒＲＮＡ部分が、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２３）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２４）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２５）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｆＵｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２６）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｆＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２７）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２８）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２９）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮｒＮｒＮｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３０）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮｒＮｒＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３１）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮｒＮｒＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮｍＮｍＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３２）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮｒＮｒＮｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｍＵｍＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３５）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４３）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４６）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４７）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｆＮｆＮｍＮｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４８）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｍＵｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４９）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｍＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ５０）、及び
ｍＧ＃ｍＧ＃ｍＵ＃ｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｆＵｆＡｆＵｆＵｒＵ＃ｒＧ＃ｆＣｆＧｒＵ＃ｍＡｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｍＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ５１）、からなる群から選択される修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである、化学修飾されたガイドＲＮＡを提供する。
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２３）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２４）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２５）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｆＵｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２６）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｆＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２７）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２８）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２９）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮｒＮｒＮｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３０）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮｒＮｒＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３１）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮｒＮｒＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮｍＮｍＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３２）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮｒＮｒＮｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｍＵｍＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３５）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４３）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４６）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４７）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｆＮｆＮｍＮｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４８）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｍＵｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４９）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｍＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ５０）、及び
ｍＧ＃ｍＧ＃ｍＵ＃ｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｆＵｆＡｆＵｆＵｒＵ＃ｒＧ＃ｆＣｆＧｒＵ＃ｍＡｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｍＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ５１）、からなる群から選択される修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである、化学修飾されたガイドＲＮＡを提供する。
ある実施形態において、ｔｒａｃｒ部分は、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組み合わせの修飾からそれぞれ独立して選択される１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、リボース基の各修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、２’－ＮＨ２（２’－アミノ）、４’－チオ、二環式ヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）からなる群から独立して選択される。
ある実施形態において、リボース基の少なくとも５０％が化学修飾されている。ある実施形態において、リボース基の少なくとも８０％が化学修飾されている。ある実施形態において、リボース基の１００％が化学修飾されている。
ある実施形態において、リン酸基の各修飾が、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、及びホスホトリエステル修飾からなる群から独立して選択される。
ある実施形態において、核酸塩基基の各修飾が、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基からなる群から独立して選択される。
ある実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、少なくとも５０％修飾されたヌクレオチドを含む。ある実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、少なくとも８０％修飾されたヌクレオチドを含む。ある実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、少なくとも９０％修飾されたヌクレオチドを含む。ある実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、１００％化学修飾されたヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、表２のｔｒａｃｒＲＮＡ １～１１６のうちのいずれかから選択されるｔｒａｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含む。
一態様において、本開示は、（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに（ｂ）リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含み、ｃｒＲＮＡ部分が、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２９）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３９）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４０）、及び
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｆＮｆＮｆＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４５）からなる群から選択される修飾パターンを含み、
ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｆＵｆＵｍＡｆＡｍＡｍＡｆＵｍＡｍＡｍＧｍＧｆＣｆＵｍＡｆＧｆＵｆＣｍＣｆＧｆＵｆＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｆＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ９）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｆＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １２）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｆＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １７）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｆＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １８）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵ＃ｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ３７）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣ＃ｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ３８）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵ＃ｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ４１）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｆＣｆＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ４９）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧ＃ｒＵ＃ｒＣ＃ｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ９２）、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣ＃ｒＵ＃ｍＡｒＧ＃ｒＵ＃ｒＣ＃ｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ （ｔｒａｃｒＲＮＡ ９５）からなる群から選択される修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、かつＮ＝任意のヌクレオチドである、化学修飾されたガイドＲＮＡを提供する。
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２９）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３９）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４０）、及び
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｆＮｆＮｆＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４５）からなる群から選択される修飾パターンを含み、
ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｆＵｆＵｍＡｆＡｍＡｍＡｆＵｍＡｍＡｍＧｍＧｆＣｆＵｍＡｆＧｆＵｆＣｍＣｆＧｆＵｆＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｆＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ９）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｆＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １２）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｆＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １７）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｆＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １８）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵ＃ｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ３７）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣ＃ｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ３８）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵ＃ｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ４１）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｆＣｆＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ４９）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧ＃ｒＵ＃ｒＣ＃ｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ９２）、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣ＃ｒＵ＃ｍＡｒＧ＃ｒＵ＃ｒＣ＃ｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ （ｔｒａｃｒＲＮＡ ９５）からなる群から選択される修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、かつＮ＝任意のヌクレオチドである、化学修飾されたガイドＲＮＡを提供する。
一態様において、本開示は、（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに（ｂ）リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含み、ｃｒＲＮＡ部分及びｔｒａｃｒＲＮＡ部分がそれぞれ独立して、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオチドを含み、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が少なくとも１つの２’－デオキシ修飾リボース基を含む、化学修飾されたガイドＲＮＡを提供する。
ある実施形態において、修飾されたヌクレオチドがそれぞれ独立して、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組み合わせの修飾を含む。
ある実施形態において、リボース基の各修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、２’－ＮＨ２（２’－アミノ）、４’－チオ、二環式ヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）からなる群から独立して選択される。
ある実施形態において、リボース基の少なくとも８０％が化学修飾されている。ある実施形態において、リボース基の少なくとも９０％が化学修飾されている。ある実施形態において、リボース基の１００％が化学修飾されている。
ある実施形態において、リン酸基の各修飾は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、及びホスホトリエステル修飾からなる群から独立して選択される。
ある実施形態において、核酸塩基基の各修飾は、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基からなる群から独立して選択される。
ある実施形態において、ガイドＲＮＡは、少なくとも９０％修飾されたヌクレオチドを含む。ある実施形態において、ガイドＲＮＡは、１００％修飾されたヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｄＵｄＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７４）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｄＡｍＡｍＡｄＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７５）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｄＵｄＵｍＡｄＡｍＡｍＡｄＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７６）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７７）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｄＧｄＵｄＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７８）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｄＧｄＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７９）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｄＧｄＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８０）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｄＧｄＵｄＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８１）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｄＧｄＵｄＣｍＣｄＧｄＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８２）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｄＧｒＵｄＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８３）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｄＧｒＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８４）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｄＧｒＵｄＣｍＣｄＧｒＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８５）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｄＧｒＵｄＣｍＣｄＧｒＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８６）、ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｒＵｍＡｄＧｒＵｄＣｍＣｄＧｒＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８７）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｄＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｒＧｄＵｄＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０４）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｄＵｍＡｒＡｍＡｍＡｄＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｄＧｄＵｄＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０５）、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｄＵｄＵｍＡｄＡｍＡｍＡｄＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｄＧｄＵｄＣｍＣｄＧｄＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ （ｔｒａｃｒＲＮＡ １０６）からなる群から選択されるｔｒａｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである。
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｄＵｄＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７４）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｄＡｍＡｍＡｄＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７５）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｄＵｄＵｍＡｄＡｍＡｍＡｄＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７６）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７７）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｄＧｄＵｄＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７８）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｄＧｄＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７９）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｄＧｄＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８０）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｄＧｄＵｄＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８１）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｄＧｄＵｄＣｍＣｄＧｄＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８２）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｄＧｒＵｄＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８３）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｄＧｒＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８４）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｄＧｒＵｄＣｍＣｄＧｒＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８５）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｄＧｒＵｄＣｍＣｄＧｒＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８６）、ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｒＵｍＡｄＧｒＵｄＣｍＣｄＧｒＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８７）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｄＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｒＧｄＵｄＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０４）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｄＵｍＡｒＡｍＡｍＡｄＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｄＧｄＵｄＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０５）、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｄＵｄＵｍＡｄＡｍＡｍＡｄＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｄＧｄＵｄＣｍＣｄＧｄＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ （ｔｒａｃｒＲＮＡ １０６）からなる群から選択されるｔｒａｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、表１のｃｒＲＮＡ １～１３４のうちのいずれかから選択されるｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含む。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、以下からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含む：
一態様において、本開示は、（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに（ｂ）リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含み、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、表２のｔｒａｃｒＲＮＡ ２１～１１６のうちのいずれか１つから選択される修飾パターンを含む、化学修飾されたガイドＲＮＡを提供する。
一態様において、本開示は、（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに（ｂ）リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含み、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が：
ある実施形態において、リボース基の各修飾は、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、２’－ＮＨ２（２’－アミノ）、４’－チオ、二環式ヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）からなる群から独立して選択される。
ある実施形態において、リボース基の少なくとも５０％が化学修飾されている。ある実施形態において、リボース基の少なくとも８０％が化学修飾されている。ある実施形態において、リボース基の１００％が化学修飾されている。
ある実施形態において、リン酸基の各修飾は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、及びホスホトリエステル修飾からなる群から独立して選択される。
ある実施形態において、核酸塩基基の各修飾は、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基からなる群から独立して選択される。
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、少なくとも５０％修飾されたヌクレオチドを含む。ある実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、少なくとも８０％修飾されたヌクレオチドを含むある実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、少なくとも９０％修飾されたヌクレオチドを含むある実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、１００％化学修飾されたヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、表１のｃｒＲＮＡ １～１３４のうちのいずれか１つから選択されるｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含む。
一態様において、本開示は、（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに（ｂ）リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含み、ｃｒＲＮＡ部分が少なくとも１つの２’－ＮＨ２（２’－アミノＲＮＡ）修飾を含む、化学修飾されたガイドＲＮＡを提供する。
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの２’－ＮＨ２（２’－アミノＲＮＡ）修飾を含む、化学修飾されたｃｒＲＮＡを提供する。
ある特定の実施形態において、ピリミジンヌクレオチドは、２’－ＮＨ２修飾を含む。ある特定の実施形態において、プリンヌクレオチドは、２’－ＮＨ２修飾を含む。
ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１６、１９、２２、２３、及び２４位のうちの１つ以上（例えば、配列番号１に記載されるｃｒＲＮＡ部分の５’末端からの１６、１９、２２、２３、及び２４位のうちの１つ以上）に２’－ＮＨ２（２’－アミノＲＮＡ）修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１６位に２’－ＮＨ２（２’－アミノ）修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１９位に２’－ＮＨ２（２’－アミノ）修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２２位に２’－ＮＨ２（２’－アミノ）修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２３位に２’－ＮＨ２（２’－アミノ）修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２４位に２’－ＮＨ２（２’－アミノ）修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２２、２３、及び２４位に２’－ＮＨ２（２’－アミノ）修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１９、２２、２３、及び２４位に２’－ＮＨ２（２’－アミノ）修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１６位及び１９位に２’－ＮＨ２（２’－アミノ）修飾を含む。
ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分が、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組み合わせの修飾からそれぞれ独立して選択される１つ以上の追加の修飾されたヌクレオチドを更に含む。
ある特定の実施形態において、リボース基の各修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、４’－チオ、二環式ヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）からなる群から独立して選択される。
ある特定の実施形態において、リン酸基の各修飾は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、またはホスホトリエステル修飾からなる群から独立して選択される。
ある特定の実施形態において、核酸塩基基の各修飾は、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基からなる群から独立して選択される。
ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、少なくとも５０％修飾されたヌクレオチド（例えば、５０％修飾されたヌクレオチド、５５％修飾されたヌクレオチド、６０％修飾されたヌクレオチド、６５％修飾されたヌクレオチド、７０％修飾されたヌクレオチド、７５％修飾されたヌクレオチド、８０％修飾されたヌクレオチド、８５％修飾されたヌクレオチド、９０％修飾されたヌクレオチド、９５％修飾されたヌクレオチド、または１００％修飾されたヌクレオチド）を含む。
ある特定の実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮａＮｍＮｍＧａＵａＵａＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１４）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮａＮｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１５）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧａＵｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１６）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ａＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１７）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ａＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１８）、及び
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧａＵａＵａＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ （ｃｒＲＮＡ １２８）からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、ａＮ＝２’－ＮＨ２（２’－アミノＲＮＡ）、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである。
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮａＮｍＮｍＧａＵａＵａＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１４）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮａＮｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１５）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧａＵｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１６）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ａＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１７）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ａＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１８）、及び
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧａＵａＵａＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ （ｃｒＲＮＡ １２８）からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、ａＮ＝２’－ＮＨ２（２’－アミノＲＮＡ）、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである。
ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組み合わせからそれぞれ独立して選択される修飾を含む、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態において、リボース基の各修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、２’－ＮＨ２（２’－アミノ）、４’－チオ、二環式ヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）からなる群から独立して選択される。
ある特定の実施形態において、リン酸基の各修飾は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、またはホスホトリエステル修飾からなる群から独立して選択される。
ある特定の実施形態において、核酸塩基基の各修飾は、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基からなる群から独立して選択される。
ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、少なくとも５０％修飾されたヌクレオチド（例えば、５０％修飾されたヌクレオチド、５５％修飾されたヌクレオチド、６０％修飾されたヌクレオチド、６５％修飾されたヌクレオチド、７０％修飾されたヌクレオチド、７５％修飾されたヌクレオチド、８０％修飾されたヌクレオチド、８５％修飾されたヌクレオチド、９０％修飾されたヌクレオチド、９５％修飾されたヌクレオチド、または１００％修飾されたヌクレオチド）を含む。
ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、以下からなる群から選択される修飾パターンを含む：表２のｔｒａｃｒＲＮＡ １～ｔｒａｃｒＲＮＡ １１６（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ １、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１、ｔｒａｃｒＲＮＡ １２、ｔｒａｃｒＲＮＡ １３、ｔｒａｃｒＲＮＡ １４、ｔｒａｃｒＲＮＡ １５、ｔｒａｃｒＲＮＡ １６、ｔｒａｃｒＲＮＡ １７、ｔｒａｃｒＲＮＡ １８、ｔｒａｃｒＲＮＡ １９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９９、ｔｒａｃｒＲＮＡ １００、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０１、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０２、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０３、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０４、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０５、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０６、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０７、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０８、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０９、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１０、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１１、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１２、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１３、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１４、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１５、またはｔｒａｃｒＲＮＡ １１６）。
一態様において、本開示は、（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに（ｂ）リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含み、ｃｒＲＮＡ部分及びｔｒａｃｒＲＮＡ部分の一方または両方が、少なくとも１つの４’－チオＲＮＡ修飾を含む、化学修飾されたガイドＲＮＡを提供する。
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの４’－チオＲＮＡ修飾を含む化学修飾されたｃｒＲＮＡを提供する。
更に別の態様において、本開示は、少なくとも１つの４’－チオＲＮＡ修飾を含む化学修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡを提供する。
ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端からの１９、２２、２３、及び２４位のうちの１つ以上（例えば、配列番号１に記載されるｃｒＲＮＡ部分の５’末端からの１９、２２、２３、及び２４位のうちの１つ以上）に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１９位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２２位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２３位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２４位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２２位及び２３位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２２位及び２４位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２３位及び２４位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１９、２２、２３、及び２４位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。
ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１２、１３、１８、２４、２７、３１、及び３２位のうちの１つ以上（例えば、配列番号２に記載されるｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端からの１２、１３、１８、２４、２７、３１、及び３２位のうちの１つ以上）に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１２位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１３位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１８位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２４位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２７位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から３１位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から３２位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１２、１３、及び１８位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２４、２７、３１、及び３２位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１２、１３、１８、２４、２７、３１、及び３２位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む。
ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組み合わせの修飾からそれぞれ独立して選択される１つ以上の更なる修飾されたヌクレオチドを更に含む。
ある特定の実施形態において、リボース基の各修飾は、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、２’－ＮＨ２（２’－アミノ）、二環式ヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）からなる群から独立して選択される。
ある特定の実施形態において、リン酸基の各修飾は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、またはホスホトリエステル修飾からなる群から独立して選択される。
ある特定の実施形態において、核酸塩基基の各修飾は、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基からなる群から独立して選択される。
ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、少なくとも５０％修飾されたヌクレオチド（例えば、５０％修飾されたヌクレオチド、５５％修飾されたヌクレオチド、６０％修飾されたヌクレオチド、６５％修飾されたヌクレオチド、７０％修飾されたヌクレオチド、７５％修飾されたヌクレオチド、８０％修飾されたヌクレオチド、８５％修飾されたヌクレオチド、９０％修飾されたヌクレオチド、９５％修飾されたヌクレオチド、または１００％修飾されたヌクレオチド）を含む。
ある特定の実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｓＮ＃ｍＮｍＧｓＵ＃ｓＵ＃ｓＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１９）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｓＮｍＮｍＧｓＵｓＵｓＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２０）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｓＮｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２１）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｓＵｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２２）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｓＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２３）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｓＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２４）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｓＵｒＵ＃ｓＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２５）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｓＵｓＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２６）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｓＵｓＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２７）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｓＵ＃ｓＵ＃ｓＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２９）、及び
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｓＵｓＵｓＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １３０）からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｓＮ＝４’－チオＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである。
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｓＮ＃ｍＮｍＧｓＵ＃ｓＵ＃ｓＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１９）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｓＮｍＮｍＧｓＵｓＵｓＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２０）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｓＮｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２１）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｓＵｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２２）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｓＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２３）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｓＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２４）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｓＵｒＵ＃ｓＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２５）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｓＵｓＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２６）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｓＵｓＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２７）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｓＵ＃ｓＵ＃ｓＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２９）、及び
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｓＵｓＵｓＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １３０）からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｓＮ＝４’－チオＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである。
ある特定の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、表２のｔｒａｃｒＲＮＡ １～ｔｒａｃｒＲＮＡ １１６（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ １、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１、ｔｒａｃｒＲＮＡ １２、ｔｒａｃｒＲＮＡ １３、ｔｒａｃｒＲＮＡ １４、ｔｒａｃｒＲＮＡ １５、ｔｒａｃｒＲＮＡ １６、ｔｒａｃｒＲＮＡ １７、ｔｒａｃｒＲＮＡ １８、ｔｒａｃｒＲＮＡ １９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９９、ｔｒａｃｒＲＮＡ １００、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０１、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０２、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０３、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０４、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０５、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０６、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０７、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０８、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０９、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１０、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１１、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１２、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１３、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１４、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１５、またはｔｒａｃｒＲＮＡ １１６）からなる群から選択される修飾パターンを含む。
ある特定の実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｓＵｓＵｍＡｒＡｍＡｍＡｓＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｓＵｍＡｒＧｓＵｒＣｍＣｒＧｓＵｓＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０７）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｓＵｓＵｍＡｒＡｍＡｍＡｓＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０８）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｓＵｍＡｒＧｓＵｒＣｍＣｒＧｓＵｓＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０９）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｓＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１０）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｓＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１１）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｓＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１２）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｓＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１３）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｓＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１４）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｓＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１５）、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｓＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１６）からなる群から選択されるｔｒａｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｓＮ＝４’－チオＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである。
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｓＵｓＵｍＡｒＡｍＡｍＡｓＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｓＵｍＡｒＧｓＵｒＣｍＣｒＧｓＵｓＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０７）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｓＵｓＵｍＡｒＡｍＡｍＡｓＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０８）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｓＵｍＡｒＧｓＵｒＣｍＣｒＧｓＵｓＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０９）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｓＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１０）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｓＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１１）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｓＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１２）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｓＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１３）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｓＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１４）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｓＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１５）、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｓＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１６）からなる群から選択されるｔｒａｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｓＮ＝４’－チオＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである。
ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、表１のｃｒＲＮＡ １～ｃｒＲＮＡ １３４（例えば、ｃｒＲＮＡ １、ｃｒＲＮＡ ２、ｃｒＲＮＡ ３、ｃｒＲＮＡ ４、ｃｒＲＮＡ ５、ｃｒＲＮＡ ６、ｃｒＲＮＡ ７、ｃｒＲＮＡ ８、ｃｒＲＮＡ ９、ｃｒＲＮＡ １０、ｃｒＲＮＡ １１、ｃｒＲＮＡ １２、ｃｒＲＮＡ １３、ｃｒＲＮＡ １４、ｃｒＲＮＡ １５、ｃｒＲＮＡ １６、ｃｒＲＮＡ １７、ｃｒＲＮＡ １８、ｃｒＲＮＡ １９、ｃｒＲＮＡ ２０、ｃｒＲＮＡ ２１、ｃｒＲＮＡ ２２、ｃｒＲＮＡ ２３、ｃｒＲＮＡ ２４、ｃｒＲＮＡ ２５、ｃｒＲＮＡ ２６、ｃｒＲＮＡ ２７、ｃｒＲＮＡ ２８、ｃｒＲＮＡ ２９、ｃｒＲＮＡ ３０、ｃｒＲＮＡ ３１、ｃｒＲＮＡ ３２、ｃｒＲＮＡ ３３、ｃｒＲＮＡ ３４、ｃｒＲＮＡ ３５、ｃｒＲＮＡ ３６、ｃｒＲＮＡ ３７、ｃｒＲＮＡ ３８、ｃｒＲＮＡ ３９、ｃｒＲＮＡ ４０、ｃｒＲＮＡ ４１、ｃｒＲＮＡ ４２、ｃｒＲＮＡ ４３、ｃｒＲＮＡ ４４、ｃｒＲＮＡ ４５、ｃｒＲＮＡ ４６、ｃｒＲＮＡ ４７、ｃｒＲＮＡ ４８、ｃｒＲＮＡ ４９、ｃｒＲＮＡ ５０、ｃｒＲＮＡ ５１、ｃｒＲＮＡ ５２、ｃｒＲＮＡ ５３、ｃｒＲＮＡ ５４、ｃｒＲＮＡ ５５、ｃｒＲＮＡ ５６、ｃｒＲＮＡ ５７、ｃｒＲＮＡ ５８、ｃｒＲＮＡ ５９、ｃｒＲＮＡ ６０、ｃｒＲＮＡ ６１、ｃｒＲＮＡ ６２、ｃｒＲＮＡ ６３、ｃｒＲＮＡ ６４、ｃｒＲＮＡ ６５、ｃｒＲＮＡ ６６、ｃｒＲＮＡ ６７、ｃｒＲＮＡ ６８、ｃｒＲＮＡ ６９、ｃｒＲＮＡ ７０、ｃｒＲＮＡ ７１、ｃｒＲＮＡ ７２、ｃｒＲＮＡ ７３、ｃｒＲＮＡ ７４、ｃｒＲＮＡ ７５、ｃｒＲＮＡ ７６、ｃｒＲＮＡ ７７、ｃｒＲＮＡ ７８、ｃｒＲＮＡ ７９、ｃｒＲＮＡ ８０、ｃｒＲＮＡ ８１、ｃｒＲＮＡ ８２、ｃｒＲＮＡ ８３、ｃｒＲＮＡ ８４、ｃｒＲＮＡ ８５、ｃｒＲＮＡ ８６、ｃｒＲＮＡ ８７、ｃｒＲＮＡ ８８、ｃｒＲＮＡ ８９、ｃｒＲＮＡ ９０、ｃｒＲＮＡ ９１、ｃｒＲＮＡ ９２、ｃｒＲＮＡ ９３、ｃｒＲＮＡ ９４、ｃｒＲＮＡ ９５、ｃｒＲＮＡ ９６、ｃｒＲＮＡ ９７、ｃｒＲＮＡ ９８、ｃｒＲＮＡ ９９、ｃｒＲＮＡ １００、ｃｒＲＮＡ １０１、ｃｒＲＮＡ １０２、ｃｒＲＮＡ １０３、ｃｒＲＮＡ １０４、ｃｒＲＮＡ １０５、ｃｒＲＮＡ １０６、ｃｒＲＮＡ １０７、ｃｒＲＮＡ １０８、ｃｒＲＮＡ １０９、ｃｒＲＮＡ １１０、ｃｒＲＮＡ １１１、ｃｒＲＮＡ １１２、ｃｒＲＮＡ １１３、ｃｒＲＮＡ １１４、ｃｒＲＮＡ １１５、ｃｒＲＮＡ １１６、ｃｒＲＮＡ １１７、ｃｒＲＮＡ １１８、ｃｒＲＮＡ １１９、ｃｒＲＮＡ １２０、ｃｒＲＮＡ １２１、ｃｒＲＮＡ １２２、ｃｒＲＮＡ １２３、ｃｒＲＮＡ １２４、ｃｒＲＮＡ １２５、ｃｒＲＮＡ １２６、ｃｒＲＮＡ １２７、ｃｒＲＮＡ １２８、ｃｒＲＮＡ １２９、ｃｒＲＮＡ １３０、ｃｒＲＮＡ １３１、ｃｒＲＮＡ １３２、ｃｒＲＮＡ １３３、またはｃｒＲＮＡ １３４）からなる群から選択される修飾パターンを含む。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡにコンジュゲートされた少なくとも１つの部分を含む。ある実施形態において、少なくとも１つの部分は、ｃｒＲＮＡ部分の５’末端、ｃｒＲＮＡ部分の３’末端、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端、またはｔｒａｃｒＲＮＡ部分の３’末端のうちの少なくとも１つにコンジュゲートされる。
ある実施形態において、少なくとも１つの部分は、ガイドＲＮＡの細胞取り込みを増加させる。ある実施形態において、少なくとも１つの部分は、ガイドＲＮＡの特定の組織分布を促進する。
ある実施形態において、少なくとも１つの部分は、脂肪酸、ステロイド、セコステロイド、脂質、ガングリオシド類似体、ヌクレオシド類似体、エンドカンナビノイド、ビタミン、受容体リガンド、ペプチド、アプタマー、及びアルキル鎖からなる群から選択される。
ある実施形態において、少なくとも１つの部分は、コレステロール、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ドコサン酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＡ）、ＧａｌＮＡｃ、両親媒性ブロックコポリマー（ＡＢＣ）、親水性ブロックコポリマー（ＨＢＣ）、ポロキサマー、Ｃｙ５、及びＣｙ３からなる群から選択される。
ある実施形態において、少なくとも１つの部分は、リンカーを介して少なくとも１つのガイドＲＮＡにコンジュゲートされる。ある実施形態において、リンカーは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ポリペプチド、多糖、及びブロックコポリマーからなる群から選択される。
ある実施形態において、少なくとも１つの部分は、修飾された脂質である。ある実施形態において、修飾された脂質は分枝状脂質である。
ある実施形態において、修飾された脂質は、式Ｉ、式Ｉ：Ｘ－ＭＣ（＝Ｙ）Ｍ－Ｚ－［Ｌ－ＭＣ（＝Ｙ）Ｍ－Ｒ］ｎ（式中、Ｘは、脂質をガイドＲＮＡに連結する部分であり、各Ｙは、独立して、酸素または硫黄であり、各Ｍは、独立して、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり、Ｚは、２本または３本（「ｎ」）の鎖の化学修飾されたガイドＲＮＡへの連結を可能にする分岐基であり、Ｌは、任意選択のリンカー部分であり、各Ｒは、独立して、長さが２～３０原子の飽和、一価不飽和もしくは多価不飽和の直鎖もしくは分岐鎖部分、ステロール、または他の疎水性基）の分岐状脂質である。ある実施形態において、修飾された脂質は、頭部基修飾された脂質である。
ある実施形態において、修飾された脂質は、式ＩＩ、式ＩＩ：Ｘ－ＭＣ（＝Ｙ）Ｍ－Ｚ－［Ｌ－ＭＣ（＝Ｙ）Ｍ－Ｒ］ｎ－Ｌ－Ｋ－Ｊ、（式中、Ｘは、脂質をガイドＲＮＡに連結する部分であり、各Ｙは、独立して、酸素または硫黄であり、各Ｍは、独立して、ＣＨ２、ＮＨ、Ｎ－アルキル、ＯまたはＳであり、Ｚは、２本または３本（「ｎ」）の鎖の化学修飾されたガイドＲＮＡへの連結を可能にする分岐基であり、各Ｌは、独立して、任意選択のリンカー部分であり、Ｒは、長さ２～３０原子の飽和、一価不飽和もしくは多価不飽和の直鎖もしくは分岐鎖部分、ステロール、または他の疎水性基であり、Ｋは、ホスフェート、スルフェート、またはアミドであり、Ｊは、アミノアルカンまたは四級アミノアルカン基である）の頭部基修飾された脂質である。
ある実施形態において、ガイドＲＮＡは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｓ９（ＧｅｏＣａｓ９）からなる群から選択されるＣａｓ９ヌクレアーゼに結合する。
ある実施形態において、Ｃａｓ９は、活性が変化したバリアントＣａｓ９である。
ある実施形態において、バリアントＣａｓ９は、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、触媒失活（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｄｅａｄ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、超正確（ｈｙｐｅｒ ａｃｃｕｒａｔｅ）Ｃａｓ９（ＨｙｐａＣａｓ９）、高忠実度Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－ＨＦ）、特異性強化型（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）Ｃａｓ９（ｅＣａｓ９）、及び拡張ＰＡＭ Ｃａｓ９（ｘＣａｓ９）からなる群から選択される。
ある実施形態において、Ｃａｓ９のオフターゲット活性は、修飾されていないガイドＲＮＡと比較して低下する。
ある実施形態において、Ｃａｓ９のオンターゲット活性は、修飾されていないガイドＲＮＡと比較して増加する。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ部分の３’末端をｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端に連結するヌクレオチドまたは非ヌクレオチドループまたはリンカーを更に含む。
ある実施形態において、非ヌクレオチドリンカーは、エチレングリコールオリゴマーリンカーを含む。ある実施形態において、ヌクレオチドループは、化学修飾される。ある実施形態において、ヌクレオチドループは、ＧＡＡＡのヌクレオチド配列を含む。
ある実施形態において、修飾されたガイドＲＮＡは、修飾されていないガイドＲＮＡと比較して、リピート及びアンチリピート領域内のＧＣヌクレオチド含量が増加する。
ある実施形態において、修飾されたガイドＲＮＡは、リピート及びアンチリピート領域にリボース修飾を含む。
ある実施形態において、リピート及びアンチリピート修飾は、ｃｒＲＮＡ部分とｔｒａｃｒＲＮＡ部分との間の対形成の安定性を増強する。
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣ（配列番号３）のガイドＲＮＡ修飾パターンを含み、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ＧＣＧＣＵＣＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号４）のガイドＲＮＡ修飾パターンを含み、ここでＮ＝任意のヌクレオチドである。
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡ部分は、１～２０個のホスホロチオエート修飾（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のホスホロチオエート修飾）を含む。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、修飾されていないガイドＲＮＡに対して少なくとも約５０％の活性（例えば、修飾されていないガイドＲＮＡに対して５０％の活性、６０％の活性、７０％の活性、８０％の活性、９０％の活性、９５％の活性、または１００％の活性）を含む。
特定の態様において、本開示は、
（ａ）
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３９）を含むｃｒＲＮＡ部分、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵ＃ｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ４１）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、
（ｂ）
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４０）を含むｃｒＲＮＡ部分、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵ＃ｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ４１）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、
（ｃ）
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２０）を含むｃｒＲＮＡ部分、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵ＃ｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ４１）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、
（ｄ）
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３９）を含むｃｒＲＮＡ部分、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｓＵｓＵｍＡｒＡｍＡｍＡｓＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｓＵｍＡｒＧｓＵｒＣｍＣｒＧｓＵｓＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０７）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、
（ｅ）
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４０）を含むｃｒＲＮＡ部分、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｓＵｓＵｍＡｒＡｍＡｍＡｓＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｓＵｍＡｒＧｓＵｒＣｍＣｒＧｓＵｓＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０７）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、または
（ｆ）
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２０）を含むｃｒＲＮＡ部分、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｓＵｓＵｍＡｒＡｍＡｍＡｓＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｓＵｍＡｒＧｓＵｒＣｍＣｒＧｓＵｓＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０７）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含む、化学修飾されたガイドＲＮＡを提供する。
（ａ）
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３９）を含むｃｒＲＮＡ部分、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵ＃ｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ４１）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、
（ｂ）
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４０）を含むｃｒＲＮＡ部分、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵ＃ｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ４１）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、
（ｃ）
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２０）を含むｃｒＲＮＡ部分、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵ＃ｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ４１）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、
（ｄ）
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３９）を含むｃｒＲＮＡ部分、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｓＵｓＵｍＡｒＡｍＡｍＡｓＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｓＵｍＡｒＧｓＵｒＣｍＣｒＧｓＵｓＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０７）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、
（ｅ）
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４０）を含むｃｒＲＮＡ部分、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｓＵｓＵｍＡｒＡｍＡｍＡｓＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｓＵｍＡｒＧｓＵｒＣｍＣｒＧｓＵｓＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０７）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、または
（ｆ）
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２０）を含むｃｒＲＮＡ部分、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｓＵｓＵｍＡｒＡｍＡｍＡｓＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｓＵｍＡｒＧｓＵｒＣｍＣｒＧｓＵｓＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０７）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含む、化学修飾されたガイドＲＮＡを提供する。
一態様において、本開示は、細胞における標的遺伝子の発現を変化させる方法であって、上に列挙される実施形態のいずれかに記載の化学修飾されたガイドＲＮＡと、ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼまたはＲＮＡガイドされたヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含むゲノム編集システムを当該細胞に投与することを含む、方法を提供する。
ある実施形態において、標的遺伝子は、生物における細胞に存在する。
ある実施形態において、標的遺伝子の発現は、ノックアウトされるか、またはノックダウンされる。
ある実施形態において、標的遺伝子の配列は、修飾、編集、修正または増強される。
ある実施形態において、ガイドＲＮＡ及びＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む。
ある実施形態において、ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｓ９（ＧｅｏＣａｓ９）からなる群から選択される。
ある実施形態において、Ｃａｓ９は、活性が変化したバリアントＣａｓ９である。ある実施形態において、バリアントＣａｓ９は、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、触媒失活Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、超正確Ｃａｓ９（ＨｙｐａＣａｓ９）、高忠実度Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－ＨＦ）、特異性強化型Ｃａｓ９（ｅＣａｓ９）、及び拡張ＰＡＭ Ｃａｓ９（ｘＣａｓ９）からなる群から選択される。
ある実施形態において、ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、ベクターを含む。ある実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。ある実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルス（ＬＶ）ベクターである。ある実施形態において、ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、合成ｍＲＮＡを含む。
ある実施形態において、標的遺伝子の発現は少なくとも約２０％（例えば、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または１００％）低下する。
一態様において、本開示は、上記の実施形態のいずれかに記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ及びＲＮＡガイドされたヌクレアーゼまたはＲＮＡガイドされたヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集システムを提供する。ある実施形態において、ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｓ９（ＧｅｏＣａｓ９）からなる群から選択される。ある実施形態において、Ｃａｓ９は、活性が変化したバリアントＣａｓ９である。ある実施形態において、バリアントＣａｓ９は、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、触媒失活Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、超正確Ｃａｓ９（ＨｙｐａＣａｓ９）、高忠実度Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－ＨＦ）、特異性強化型Ｃａｓ９（ｅＣａｓ９）、及び拡張ＰＡＭ Ｃａｓ９（ｘＣａｓ９）からなる群から選択される。ある実施形態において、Ｃａｓ９のオフターゲット活性は、修飾されていないガイドＲＮＡと比較して低下する。ある実施形態において、Ｃａｓ９のオンターゲット活性は、修飾されていないガイドＲＮＡと比較して増加する。
本発明の前述の特徴及び他の特徴ならびに利点は、添付の図面と以下の例示的な実施形態の詳細な説明とを併せることにより、より完全に理解される。本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願公開の複写は、要請かつ必要な料金の支払により特許庁より提供される。
重度または完全に化学修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む、新規の化学修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが本明細書で提供される。ある特定の実施形態において、５’及び／または３’コンジュゲート部分を有するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが提供される。更に他の実施形態において、ｃｒＲＮＡのリピート領域またはｔｒａｃｒＲＮＡのアンチリピート領域における修飾を有するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡが提供される。本開示のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによるゲノム編集に使用する方法、ならびにそれを行うためのキットもまた提供される。
本明細書で別途定義されない限り、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質及び核酸化学、及びハイブリダイゼーションと関連して使用される専門用語は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されている。本明細書で提供される方法及び技術は、通常、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、及び別段の指示がない限り、本明細書全体を通して引用及び議論される種々の一般的及びより具体的な参考文献に記載されるように実行される。酵素反応及び精製技術は、別段の指示がない限り製造業者の仕様書に従って、当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように実行される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、及び医薬品化学及び製薬化学に関連して利用される命名法、ならびにその研究室手順及び技術は、別段の指示がない限り、周知であり、一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化、及び送達、及び患者の治療には、標準的な技術が使用される。
本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。潜在的な曖昧さがある場合、本明細書で提供される定義が、辞書または外在的な定義よりも優先される。別段文脈が要求しない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書で使用されるとき、「または」の使用は、別途記述されない限り、「及び／または」を意味する。更に、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（～を含む）」という用語、ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（～を含む）」及び「ｉｎｃｌｕｄｅｄ（含まれる）」等の他の形態の使用は、限定的なものではない。
本開示がより容易に理解できるように、特定の用語が最初に定義される。
本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は、Ｃａｓ９等のＲＮＡガイドされたヌクレアーゼの細胞内の標的配列（例えば、ゲノムまたはエピソーム配列）への特異的会合（または「標的化」）を促進する任意選択の核酸を指す。
本明細書で使用される場合、「モジュラー」または「デュアルＲＮＡ」ガイドは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）等の２つ以上、典型的には２つの別個のＲＮＡ分子を含み、これらは、通常、例えば、二本鎖形成によって互いに会合する。ｇＲＮＡ及びその構成要素部分は、文献全体を通して説明される（例えば、参照により組み込まれるＢｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，５６（２），３３３－３３９（２０１４）を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「単一分子ｇＲＮＡ」、「キメラｇＲＮＡ」、または「単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）」は、単一のＲＮＡ分子を含む。ｓｇＲＮＡは、一緒に連結されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡであり得る。例えば、ｃｒＲＮＡの３’末端は、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端に連結され得る。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、例えば、ｃｒＲＮＡ（その３’末端において）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（その５’末端において）の相補領域を架橋する４つのヌクレオチド（例えば、ＧＡＡＡ）「テトラループ」または「リンカー」配列によって、単一の単一分子ｇＲＮＡまたはキメラｇＲＮＡに結合してもよい。
本明細書で使用される場合、「リピート」配列または領域は、ｔｒａｃｒＲＮＡのアンチリピート配列に相補的である、ｃｒＲＮＡの３’末端またはその付近のヌクレオチド配列である。
本明細書で使用される場合、「アンチリピート」配列または領域は、ｃｒＲＮＡのリピート配列に相補的である、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端またはその付近のヌクレオチド配列である。
ゲノム編集のためのｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を含むガイドＲＮＡ構造及び機能に関する追加の詳細は、少なくとも、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９（６１２１），８２３－８２６（２０１３）、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）．２３３－２３９（２０１３）、及びＪｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６），８１６－８２１（２０１２）に見出すことができ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ガイド配列」または「標的化配列」は、単一分子またはモジュラーであってもそうでなくても、編集が所望される細胞のゲノム内のＤＮＡ配列内の標的ドメインまたは標的ポリヌクレオチドに完全にまたは部分的に相補的であるｇＲＮＡのヌクレオチド配列を指す。ガイド配列は、典型的には、１０～３０ヌクレオチド長、好ましくは１６～２４ヌクレオチド長（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長）であり、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡの５’末端またはその付近にある。
本明細書で使用される場合、「標的ドメイン」または「標的ポリヌクレオチド配列」は、ｇＲＮＡのガイド配列に相補的である細胞のゲノム内のＤＮＡ配列である。
標的化ドメインに加えて、ｇＲＮＡは、典型的には、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の形成または活性に影響を及ぼす複数のドメインを含む。例えば、上述のように、ｇＲＮＡの第１及び第２の相補性ドメイン（リピート：アンチリピート二本鎖とも称される）によって形成される二本鎖構造は、Ｃａｓ９の認識（ＲＥＣ）ローブと相互作用し、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の形成を媒介し得る（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５６：９３５－９４９（２０１４）；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６２（２），１１１３－１１２６（２０１５）、双方が参照により本明細書に組み込まれる）。第１及び／または第２の相補性ドメインは、１つ以上のポリＡトラクトを含有し得、これは、ＲＮＡポリメラーゼによって終止シグナルとして認識され得ることに留意されたい。したがって、第１及び第２の相補性ドメインの配列は、任意選択的に、これらのトラクトを排除し、ｇＲＮＡの完全なインビトロ転写を促進するように、例えば、Ｂｒｉｎｅｒ ２０１４に記載されるようなＡ－Ｇスワップ、またはＡ－Ｕスワップの使用を介して修飾される。これら及び第１及び第２の相補性ドメインに対するこれら及び他の同様の修飾は、本開示の範囲内である。
第１及び第２の相補性ドメインとともに、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡは、典型的には、インビボでのヌクレアーゼ活性に必要であるが、インビトロでは必ずしも必要ではない２つ以上の追加の二本鎖領域を含む（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１５、上記）。第２の相補性ドメインの３’部分付近の第１のステムループは、様々に、「近位ドメイン」、「ステムループ１」（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１４、上記；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ２０１５、上記）及び「ネクサス」（Ｂｒｉｎｅｒ ２０１４、上記）と称される。１つ以上の追加のステムループ構造は、一般に、ｇＲＮＡの３’末端付近に存在し、その数は種によって異なる：Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡは、典型的には、２つの３’ステムループ（リピート：アンチリピート二本鎖を含む合計４つのステムループ構造）を含むが、ｓ．ａｕｒｅｕｓ及び他の種は、１つのみ（合計３つ）を有する。種ごとに体系づけられる保存されたステムループ構造（及びより一般的にはｇＲＮＡ構造）の説明は、参照により本明細書に組み込まれるＢｒｉｎｅｒ ２０１４に提供される。ガイドＲＮＡに関する追加の詳細は、概して、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１８０２６９７６Ａ１に見出され得る。
代表的なガイドＲＮＡを図１に示す。
化学修飾されたガイドＲＮＡ
本開示の化学修飾されたガイドＲＮＡは、修飾されないまたは最小限に修飾されたガイドＲＮＡと比較して、改善されたインビボ安定性、改善されたゲノム編集効率、及び／または低減された免疫毒性を有する。
本開示の化学修飾されたガイドＲＮＡは、修飾されないまたは最小限に修飾されたガイドＲＮＡと比較して、改善されたインビボ安定性、改善されたゲノム編集効率、及び／または低減された免疫毒性を有する。
本開示の化学修飾されたガイドＲＮＡは、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組み合わせの修飾を含む１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む。
リボース基に対する化学修飾としては、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、２’－ＮＨ２（２’－アミノ）、４’－チオ、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－エチルアミン、２’－Ｏ－シアノエチル、２’－Ｏ－アセタールエステル、または二環式ヌクレオチド、例えば、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、または２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’、４’－ＢＮＡＮＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「４’－チオ」という用語は、リボースの糖環酸素が硫黄で置き換えられるリボース基修飾に対応する。
リン酸基への化学修飾は、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、またはホスホトリエステル修飾を含むが、これらに限定されない。
ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分は、１～２０個のホスホロチオエート修飾（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のホスホロチオエート修飾）を含む。ある実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分は、１～２０個のホスホロチオエート修飾（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のホスホロチオエート修飾）を含み、ホスホロチオエート修飾を含まないガイドＲＮＡと比較して、少なくとも約５０％の活性（例えば、ホスホロチオエート修飾を含まないガイドＲＮＡと比較して、５０％の活性、６０％の活性、７０％の活性、８０％の活性、９０％の活性、９５％の活性、または１００％の活性）を含む。
核酸塩基基への化学修飾は、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基を含むが、これらに限定されない。
化学修飾されたガイドＲＮＡは、モジュラーまたは二重ＲＮＡガイドについて、ｃｒＲＮＡ部分及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡ部分に１つ以上の化学修飾を有し得る。化学修飾されたガイドＲＮＡはまた、単分子ガイドＲＮＡの単一ガイドＲＮＡにおける１つ以上の化学修飾を有し得る。
化学修飾されたガイドＲＮＡは、少なくとも約５０％～少なくとも約１００％化学修飾されたヌクレオチド、少なくとも約６０％～少なくとも約１００％化学修飾されたヌクレオチド、少なくとも約７０％～少なくとも約１００％化学修飾されたヌクレオチド、少なくとも約８０％～少なくとも約１００％化学修飾されたヌクレオチド、少なくとも約９０％～少なくとも約１００％化学修飾されたヌクレオチド、及び少なくとも約９５％～少なくとも約１００％化学修飾されたヌクレオチドを含み得る。
化学修飾されたガイドＲＮＡは、少なくとも約５０％化学修飾されたヌクレオチド、少なくとも約６０％化学修飾されたヌクレオチド、少なくとも約７０％化学修飾されたヌクレオチド、少なくとも約８０％化学修飾されたヌクレオチド、少なくとも約９０％化学修飾されたヌクレオチド、少なくとも約９５％化学修飾されたヌクレオチド、少なくとも約９９％化学修飾されたヌクレオチド、または１００％（完全に）化学修飾されたヌクレオチドを含み得る。
化学修飾されたガイドＲＮＡは、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％化学修飾されたヌクレオチドを含んでよい。
本明細書で使用される場合、少なくとも約８０％化学修飾されたヌクレオチド～少なくとも約９９％化学修飾されたヌクレオチドを含むガイドＲＮＡは、「重度に」修飾されているとみなされる。
本明細書で使用される場合、１００％化学修飾されたヌクレオチドを含むガイドＲＮＡは、「完全に」修飾されるとみなされる。
特定の例示的な実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約５０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約６０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約７０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約８０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約９０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、及びガイドＲＮＡヌクレオチドの約９５％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、化学修飾されたリボース基を含んでもよい。
特定の例示的な実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約５０％、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約６０％、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約７０％、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約８０％、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約９０％、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約９５％、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約９９％、またはガイドＲＮＡヌクレオチドの１００％に、化学修飾されたリボース基を含んでもよい。
特定の例示的な実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％化学修飾されたリボース基を含み得る。
本明細書で使用される場合、少なくとも約８０％のリボース基が化学的に修飾された～少なくとも約９９％のリボース基が化学的に修飾されたガイドＲＮＡは、「重度に」修飾されているとみなされる。
本明細書で使用される場合、１００％のリボース基が化学的に修飾されたガイドＲＮＡは、「完全に」修飾されたものとみなされる。
特定の例示的な実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約５０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約６０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約７０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約８０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約９０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、及びガイドＲＮＡヌクレオチドの約９５％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、化学修飾されたリン酸基を含んでもよい。
特定の例示的な実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約５０％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約６０％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約７０％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約８０％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約９０％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約９５％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約９９％に、またはガイドＲＮＡヌクレオチドの１００％に、化学修飾されたリン酸基を含んでもよい。
特定の例示的な実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％に化学修飾されたリン酸基を含み得る。
本明細書で使用される場合、少なくとも約８０％のリン酸基が化学修飾された～少なくとも約９９％のリン酸基が化学修飾されたガイドＲＮＡは、「重度に」修飾されているとみなされる。
１００％のリン酸基が化学的に修飾されたガイドＲＮＡは、本明細書で使用される場合、「完全に」修飾されたものとみなされる。
特定の例示的な実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約５０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約６０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約７０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約８０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約９０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、及びガイドＲＮＡヌクレオチドの約９５％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、化学修飾された核酸塩基を含んでもよい。
特定の例示的な実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約５０％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約６０％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約７０％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約８０％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約９０％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約９５％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約９９％に、またはガイドＲＮＡヌクレオチドの１００％に、化学修飾された核酸塩基を含んでもよい。
特定の例示的な実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％に化学修飾された核酸塩基を含み得る。
本明細書で使用される場合、少なくとも約８０％の核酸塩基が化学修飾された～少なくとも約９９％の核酸塩基が化学修飾されたガイドＲＮＡは、「重度に」修飾されているとみなされる。
本明細書で使用される場合、１００％の核酸塩基が化学的に修飾されたガイドＲＮＡは、「完全に」修飾されたものとみなされる。
特定の例示的な実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約５０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約６０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約７０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約８０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約９０％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、及びガイドＲＮＡヌクレオチドの約９５％～ガイドＲＮＡヌクレオチドの約１００％に、化学修飾されたリボース基、化学修飾されたリン酸基、及び化学修飾された核酸塩基の任意選択の組み合わせを含んでもよい。
特定の例示的な実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約５０％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約６０％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約７０％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約８０％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約９０％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約９５％に、ガイドＲＮＡヌクレオチドの約９９％に、またはガイドＲＮＡヌクレオチドの１００％に、化学修飾されたリボース基、化学修飾されたリン酸基、及び化学修飾された核酸塩基の任意選択の組み合わせを含んでもよい。
特定の例示的な実施形態において、化学修飾されたガイドＲＮＡは、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のガイドＲＮＡヌクレオチドに、化学修飾されたリボース基、化学修飾されたリン酸基、及び化学修飾された核酸塩基の任意選択の組み合わせを含み得る。
本明細書で使用される場合、リボース基、リン酸基、及び化学修飾された核酸塩基のいずれかの組み合わせの少なくとも約８０％～少なくとも約９９％が化学修飾された核酸塩基を有するガイドＲＮＡは、「重度に」修飾されたものとみなされる。
本明細書で使用する場合、１００％のリボース基、リン酸基、及び核酸塩基の任意選択の組み合わせが化学修飾されたガイドＲＮＡは、「完全に」修飾されたものとみなされる。
本開示の重度に修飾及び完全に化学修飾されたガイドＲＮＡは、当該技術分野における最小限に修飾されたガイドＲＮＡよりもいくつかの利点を有する。重度かつ完全に化学修飾されたガイドＲＮＡは、化学合成を容易にし、インビボ安定性を更に増強し、ゲノム編集への臨床応用中の送達及び効力を促進する末端付加化学官能基の足場を提供すると予想される。
ガイドＲＮＡに使用される化学修飾パターンは、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９と対合したときに、ガイドＲＮＡの活性が維持されるようなものである。
ある実施形態において、本開示の化学修飾されたガイドＲＮＡは、修飾されていないガイドＲＮＡに対して少なくとも約５０％の活性（例えば、修飾されていないガイドＲＮＡに対して５０％の活性、６０％の活性、７０％の活性、８０％の活性、９０％の活性、９５％の活性、または１００％の活性）を含む。
ガイドＲＮＡの活性は、当該技術分野で既知の任意の手段によって容易に判定することができる。ある実施形態において、％活性は、以下に記載される、トラフィックライトレポーター（ＴＬＲ）マルチ－Ｃａｓバリアント１システム（ＴＬＲ－ＭＣＶ１）を用いて測定される。ＴＬＲ－ＭＣＶ１システムは、％活性の尺度である％蛍光細胞を提供する。
例示的な化学修飾パターンは、以下の表１及び表２に記載される。
上記表１に列挙される例示的なｃｒＲＮＡの最初の２０ヌクレオチドの塩基配列が特定の標的を対象とすることが、当業者に理解されるであろう。この２０ヌクレオチド塩基配列は、標的核酸に基づいて変更され得るが、化学修飾は同じままである。５’～３’の例示的な修飾されていないｃｒＲＮＡ配列は、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号１）であり、「Ｎ」は、任意のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｕ、Ｇ、またはＣ）に対応する。５’から～３’までの例示的な修飾されていないｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号２）である。
ガイド配列は、１０～３０ヌクレオチド長、好ましくは１６～２４ヌクレオチド長（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長）であってもよく、Ｃａｓ９ ｇＲＮＡの５’末端またはその付近であってもよいことが、当業者に更に理解されるであろう。
高親和性リピート／アンチリピートガイドＲＮＡ修飾
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡのリピート領域とｔｒａｃｒＲＮＡのアンチリピート領域との間で二本鎖を形成することによって一緒にハイブリダイゼーションする（図１参照）。ある特定の実施形態において、モジュラーまたは二重ＲＮＡガイドＲＮＡは、２つの領域間の親和性を増強し、より強力な二本鎖を形成するために、リピート領域及びアンチリピート領域において修飾される。
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡのリピート領域とｔｒａｃｒＲＮＡのアンチリピート領域との間で二本鎖を形成することによって一緒にハイブリダイゼーションする（図１参照）。ある特定の実施形態において、モジュラーまたは二重ＲＮＡガイドＲＮＡは、２つの領域間の親和性を増強し、より強力な二本鎖を形成するために、リピート領域及びアンチリピート領域において修飾される。
高親和性相互作用は、リピート領域及びアンチリピート領域によって形成される二本鎖におけるＧＣヌクレオチド含量を増加させることによって増強され得る。二本鎖の融解温度（Ｔｍ）を増加させる、２’－フルオロ及び２’－Ｏ－メチル修飾等のヌクレオチド修飾も導入してもよい。更なる修飾は、直交ヌクレオチド及び天然に存在しないヌクレオチドの使用を含む。本明細書に記載される様々なリピート領域／アンチリピート領域修飾は、二本鎖の安定性を増強し、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの最適以下の構造へのフォールディングを防止するのに役立ち、したがって、より高いゲノム編集効力を促進する。
単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）アプローチに対するモジュラーまたは二重ＲＮＡガイドＲＮＡアプローチの使用は、より長いｓｇＲＮＡと比較して短いｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを作製する容易さ、及びｓｇＲＮＡと比較して二重ＲＮＡを製造するコストを削減することを含む、いくつかの利点を有する。高いＧＣ含量及び２’－フルオロ修飾を含む、リピート領域及びアンチリピート領域における修飾を有する例示的なｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを、以下の表３及び表４に示す。
上記の高ＧＣリピートｃｒＲＮＡは、上記の表１に列挙される任意のｃｒＲＮＡ化学修飾パターンを更に含むことができることが理解されるであろう。
上記の高ＧＣアンチリピートｔｒａｃｒＲＮＡが、上記の表２に列挙されるような任意のｔｒａｃｒＲＮＡ化学修飾パターンを更に含んでもよいことが理解されるであろう。
ガイドＲＮＡコンジュゲート
本開示の化学修飾されたガイドＲＮＡは、末端コンジュゲート部分で修飾され得る。本明細書で使用される場合、「末端コンジュゲート部分」または「部分」は、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡの５’及び／または３’末端に連結されていてもよく、または結合されていてもよい化合物を指す。末端コンジュゲート部分は、安定性の増加、細胞膜を貫通する能力の増加、細胞取り込みの増加、インビボでの循環時間の増加、細胞特異的指向性試薬として作用を提供することができ、及び／または細胞または組織特異的取り込みを監視する手段を提供することができる。
本開示の化学修飾されたガイドＲＮＡは、末端コンジュゲート部分で修飾され得る。本明細書で使用される場合、「末端コンジュゲート部分」または「部分」は、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡの５’及び／または３’末端に連結されていてもよく、または結合されていてもよい化合物を指す。末端コンジュゲート部分は、安定性の増加、細胞膜を貫通する能力の増加、細胞取り込みの増加、インビボでの循環時間の増加、細胞特異的指向性試薬として作用を提供することができ、及び／または細胞または組織特異的取り込みを監視する手段を提供することができる。
ある特定の実施形態において、末端コンジュゲート部分は、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分の５’末端にコンジュゲートされる。ある特定の実施形態において、末端コンジュゲート部分は、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分の３’末端にコンジュゲートされる。ある特定の実施形態において、末端コンジュゲート部分は、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端にコンジュゲートされる。ある特定の実施形態において、末端コンジュゲート部分は、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分の３’末端にコンジュゲートされる。
特定の例示的な実施形態において、末端コンジュゲート部分は、限定されないが、脂肪酸、ステロイド、セコステロイド、脂質、ガングリオシド類似体、ヌクレオシド類似体、エンドカンナビノイド、ビタミン、受容体リガンド、ペプチド、アプタマー、アルキル鎖、フルオロフォア、抗体、核局在化シグナル等を含む。
特定の例示的な実施形態において、末端結合部分は、限定されないが、コレステロール、コレステロール－トリエチレングリコール（ＴＥＧＣｈｏｌ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ドコサン酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＡ）、ＧａｌＮＡｃ、両親媒性ブロックコポリマー（ＡＢＣ）、親水性ブロックコポリマー（ＨＢＣ）、ポロキサマー、Ｃｙ５、Ｃｙ３等を含む。
特定の例示的な実施形態において、少なくとも１つの末端結合部分は、分枝状脂質（例えば、式Ｉに示される構造）または頭部基修飾された脂質（例えば、式ＩＩに示される構造）を含む修飾された脂質である。
式Ｉ：Ｘ－ＭＣ（＝Ｙ）Ｍ－Ｚ－［Ｌ－ＭＣ（＝Ｙ）Ｍ－Ｒ］ｎ
式中、Ｘは、脂質をガイドＲＮＡに連結する部分であり、各Ｙは、独立して、酸素または硫黄であり、各Ｍは、独立して、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり、Ｚは、２本または３本（「ｎ」）の鎖の構造の残部への連結を可能にする分岐基であり、Ｌは、任意選択のリンカー部分であり、各Ｒは、独立して、長さが２～３０原子の飽和、一価不飽和もしくは多価不飽和の直鎖もしくは分岐鎖部分、ステロール、または他の疎水性基である。
式中、Ｘは、脂質をガイドＲＮＡに連結する部分であり、各Ｙは、独立して、酸素または硫黄であり、各Ｍは、独立して、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり、Ｚは、２本または３本（「ｎ」）の鎖の構造の残部への連結を可能にする分岐基であり、Ｌは、任意選択のリンカー部分であり、各Ｒは、独立して、長さが２～３０原子の飽和、一価不飽和もしくは多価不飽和の直鎖もしくは分岐鎖部分、ステロール、または他の疎水性基である。
式ＩＩ：Ｘ－ＭＣ（＝Ｙ）Ｍ－Ｚ－［Ｌ－ＭＣ（＝Ｙ）Ｍ－Ｒ］ｎ－Ｌ－Ｋ－Ｊ
式中、Ｘは、脂質をガイドＲＮＡに連結する部分であり、各Ｙは、独立して、酸素または硫黄であり、各Ｍは、独立して、ＣＨ２、ＮＨ、Ｎ－アルキル、ＯまたはＳであり、Ｚは、２本または３本（「ｎ」）の鎖の構造の残部への連結を可能にする分岐基であり、各Ｌは、独立して、任意選択のリンカー部分であり、Ｒは、長さ２～３０原子の飽和、一価不飽和もしくは多価不飽和の直鎖もしくは岐鎖部分、ステロール、または他の疎水性基であり、Ｋは、ホスフェート、スルフェート、またはアミドであり、Ｊは、アミノアルカンまたは四級アミノアルカン基である。
式中、Ｘは、脂質をガイドＲＮＡに連結する部分であり、各Ｙは、独立して、酸素または硫黄であり、各Ｍは、独立して、ＣＨ２、ＮＨ、Ｎ－アルキル、ＯまたはＳであり、Ｚは、２本または３本（「ｎ」）の鎖の構造の残部への連結を可能にする分岐基であり、各Ｌは、独立して、任意選択のリンカー部分であり、Ｒは、長さ２～３０原子の飽和、一価不飽和もしくは多価不飽和の直鎖もしくは岐鎖部分、ステロール、または他の疎水性基であり、Ｋは、ホスフェート、スルフェート、またはアミドであり、Ｊは、アミノアルカンまたは四級アミノアルカン基である。
この部分は、リンカーを介してガイドＲＮＡの末端ヌクレオチドに結合し得る。例示的なリンカーには、限定されないが、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ポリペプチド、多糖類、ブロックコポリマー等が含まれる。
ある特定の実施形態では、この部分は、ｃｒＲＮＡ ２３～ｃｒＲＮＡ １３４（すなわち、ｃｒＲＮＡ ２３、ｃｒＲＮＡ ２４、ｃｒＲＮＡ ２５、ｃｒＲＮＡ ２６、ｃｒＲＮＡ ２７、ｃｒＲＮＡ ２８、ｃｒＲＮＡ ２９、ｃｒＲＮＡ ３０、ｃｒＲＮＡ ３１、ｃｒＲＮＡ ３２、ｃｒＲＮＡ ３３、ｃｒＲＮＡ ３４、ｃｒＲＮＡ ３５、ｃｒＲＮＡ ３６、ｃｒＲＮＡ ３７、ｃｒＲＮＡ ３８、ｃｒＲＮＡ ３９、ｃｒＲＮＡ ４０、ｃｒＲＮＡ ４１、ｃｒＲＮＡ ４２、ｃｒＲＮＡ ４３、ｃｒＲＮＡ ４４、ｃｒＲＮＡ ４５、ｃｒＲＮＡ ４６、ｃｒＲＮＡ ４７、ｃｒＲＮＡ ４８、ｃｒＲＮＡ ４９、ｃｒＲＮＡ ５０、ｃｒＲＮＡ ５１、ｃｒＲＮＡ ５２、ｃｒＲＮＡ ５３、ｃｒＲＮＡ ５４、ｃｒＲＮＡ ５５、ｃｒＲＮＡ ５６、ｃｒＲＮＡ ５７、ｃｒＲＮＡ ５８、ｃｒＲＮＡ ５９、ｃｒＲＮＡ ６０、ｃｒＲＮＡ ６１、ｃｒＲＮＡ ６２、ｃｒＲＮＡ ６３、ｃｒＲＮＡ ６４、ｃｒＲＮＡ ６５、ｃｒＲＮＡ ６６、ｃｒＲＮＡ ６７、ｃｒＲＮＡ ６８、ｃｒＲＮＡ ６９、ｃｒＲＮＡ ７０、ｃｒＲＮＡ ７１、ｃｒＲＮＡ ７２、ｃｒＲＮＡ ７３、ｃｒＲＮＡ ７４、ｃｒＲＮＡ ７５、ｃｒＲＮＡ ７６、ｃｒＲＮＡ ７７、ｃｒＲＮＡ ７８、ｃｒＲＮＡ ７９、ｃｒＲＮＡ ８０、ｃｒＲＮＡ ８１、ｃｒＲＮＡ ８２、ｃｒＲＮＡ ８３、ｃｒＲＮＡ ８４、ｃｒＲＮＡ ８５、ｃｒＲＮＡ ８６、ｃｒＲＮＡ ８７、ｃｒＲＮＡ ８８、ｃｒＲＮＡ ８９、ｃｒＲＮＡ ９０、ｃｒＲＮＡ ９１、ｃｒＲＮＡ ９２、ｃｒＲＮＡ ９３、ｃｒＲＮＡ ９４、ｃｒＲＮＡ ９５、ｃｒＲＮＡ ９６、ｃｒＲＮＡ ９７、ｃｒＲＮＡ ９８、ｃｒＲＮＡ ９９、ｃｒＲＮＡ １００、ｃｒＲＮＡ １０１、ｃｒＲＮＡ １０２、ｃｒＲＮＡ １０３、ｃｒＲＮＡ １０４、ｃｒＲＮＡ １０５、ｃｒＲＮＡ １０６、ｃｒＲＮＡ １０７、ｃｒＲＮＡ １０８、ｃｒＲＮＡ １０９、ｃｒＲＮＡ １１０、ｃｒＲＮＡ １１１、ｃｒＲＮＡ １１２、ｃｒＲＮＡ １１３、ｃｒＲＮＡ １１４、ｃｒＲＮＡ １１５、ｃｒＲＮＡ １１６、ｃｒＲＮＡ １１７、ｃｒＲＮＡ １１８、ｃｒＲＮＡ １１９、ｃｒＲＮＡ １２０、ｃｒＲＮＡ １２１、ｃｒＲＮＡ １２２、ｃｒＲＮＡ １２３、ｃｒＲＮＡ １２４、ｃｒＲＮＡ １２５、ｃｒＲＮＡ １２６、ｃｒＲＮＡ １２７、ｃｒＲＮＡ １２８、ｃｒＲＮＡ １２９、ｃｒＲＮＡ １３０、ｃｒＲＮＡ １３１、ｃｒＲＮＡ １３２、ｃｒＲＮＡ １３３、またはｃｒＲＮＡ １３４）のいずれか１つの５’末端及び／または３’末端にコンジュゲートされる。
ある特定の実施形態において、部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２１～ｔｒａｃｒＲＮＡ １１６（すなわち、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ２９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ３９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ４９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ５９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ６９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ７９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ８９、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９０、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９１、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９２、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９３、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９４、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９５、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９６、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９７、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９８、ｔｒａｃｒＲＮＡ ９９、ｔｒａｃｒＲＮＡ １００、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０１、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０２、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０３、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０４、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０５、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０６、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０７、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０８、ｔｒａｃｒＲＮＡ １０９、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１０、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１１、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１２、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１３、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１４、ｔｒａｃｒＲＮＡ １１５、またはｔｒａｃｒＲＮＡ １１６）のいずれか１つの５’末端及び／または３’末端にコンジュゲートされる。
コンジュゲート部分を有する例示的なｃｒＲＮＡは、以下の表５に見出され得る。
化学修飾単一ガイドＲＮＡ
本明細書に記載されるように、本開示の化学修飾されたガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端をｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端に連結することによって、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として構築され得る。リンカーは、化学修飾されたオリゴヌクレオチドループを含むオリゴヌクレオチドループであってもよい。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドループは、ＧＡＡＡテトラループを含む。リンカーは、エチレングリコールオリゴマーを含むがこれらに限定されない、非ヌクレオチド化学リンカーであってもよい（例えば、Ｐｉｌｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（９）：１８５９－１８６３（２０００）を参照されたい）。
本明細書に記載されるように、本開示の化学修飾されたガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端をｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端に連結することによって、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として構築され得る。リンカーは、化学修飾されたオリゴヌクレオチドループを含むオリゴヌクレオチドループであってもよい。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドループは、ＧＡＡＡテトラループを含む。リンカーは、エチレングリコールオリゴマーを含むがこれらに限定されない、非ヌクレオチド化学リンカーであってもよい（例えば、Ｐｉｌｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（９）：１８５９－１８６３（２０００）を参照されたい）。
ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼ
本開示によるＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、Ｃａｓ９等の天然に存在するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ならびにそれらから誘導されるかまたは得られる他のヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。本開示で使用され得る例示的なＣａｓ９ヌクレアーゼには、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｓ９（ＧｅｏＣａｓ９）が含まれるが、これらに限定されない。機能的な表現では、ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、（ａ）ｇＲＮＡと相互作用（例えば、複合体形成）する、及び（ｂ）ｇＲＮＡとともに、（ｉ）ｇＲＮＡの標的化ドメインに相補的である配列、及び任意選択的に、（ｉｉ）以下でより詳細に記述される「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「ＰＡＭ」と称される追加の配列を含む、ＤＮＡの標的領域と会合し、任意選択的に切断または修飾するヌクレアーゼとして定義される。以下の実施例が例証するように、同じＰＡＭ特異性または切断活性を共有する個々のＲＮＡガイドされたヌクレアーゼ間にばらつきが存在し得るが、ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、広義には、それらのＰＡＭ特異性及び切断活性によって定義することができる。当業者は、本開示のいくつかの態様が、特定のＰＡＭ特異性及び／または切断活性を有する任意の好適なＲＮＡガイドされたヌクレアーゼを使用して実施することができるシステム、方法、及び組成物に関することを理解するであろう。このため、別段の定めのない限り、ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼという用語は、任意の特定のタイプ（例えば、Ｃａｓ９対Ｃｐｆｌ）、種（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ対Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または変異（例えば、全長対切断または分割、天然に存在するＰＡＭ特異性対操作されたＰＡＭ特異性）に限定されないが、一般的な用語として理解されるべきである。
本開示によるＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、Ｃａｓ９等の天然に存在するＩＩ型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ならびにそれらから誘導されるかまたは得られる他のヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。本開示で使用され得る例示的なＣａｓ９ヌクレアーゼには、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｓ９（ＧｅｏＣａｓ９）が含まれるが、これらに限定されない。機能的な表現では、ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、（ａ）ｇＲＮＡと相互作用（例えば、複合体形成）する、及び（ｂ）ｇＲＮＡとともに、（ｉ）ｇＲＮＡの標的化ドメインに相補的である配列、及び任意選択的に、（ｉｉ）以下でより詳細に記述される「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「ＰＡＭ」と称される追加の配列を含む、ＤＮＡの標的領域と会合し、任意選択的に切断または修飾するヌクレアーゼとして定義される。以下の実施例が例証するように、同じＰＡＭ特異性または切断活性を共有する個々のＲＮＡガイドされたヌクレアーゼ間にばらつきが存在し得るが、ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、広義には、それらのＰＡＭ特異性及び切断活性によって定義することができる。当業者は、本開示のいくつかの態様が、特定のＰＡＭ特異性及び／または切断活性を有する任意の好適なＲＮＡガイドされたヌクレアーゼを使用して実施することができるシステム、方法、及び組成物に関することを理解するであろう。このため、別段の定めのない限り、ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼという用語は、任意の特定のタイプ（例えば、Ｃａｓ９対Ｃｐｆｌ）、種（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ対Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または変異（例えば、全長対切断または分割、天然に存在するＰＡＭ特異性対操作されたＰＡＭ特異性）に限定されないが、一般的な用語として理解されるべきである。
様々なＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、ＰＡＭとプロトスペーサーとの間の異なる配列の関係を必要とし得る。概して、Ｃａｓ９は、プロトスペーサーの５’であるＰＡＭ配列を、トップ鎖または相補鎖に対して可視化されるものとして認識する。
ＰＡＭ及びプロトスペーサーの特定の配列の配向を認識することに加えて、ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、一般に、特定のＰＡＭ配列を認識する。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９は、例えば、ＮＮＧＲＲＴのＰＡＭ配列を認識し、Ｎ配列は、ｇＲＮＡ標的化ドメインによって認識される領域の３’直近である。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９は、ＮＧＧ ＰＡＭ配列を認識する。また、操作されたＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、類似のヌクレアーゼ（ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼが由来する天然に存在するバリアント、または操作されたＲＮＡガイドされたヌクレアーゼに対して最大のアミノ酸配列相同性を有する天然に存在するバリアント等）のＰＡＭ特異性とは異なるＰＡＭ特異性を有し得ることに留意すべきである。代替のＰＡＭ配列を認識する修飾されたＣａｓ９を以下に記載する。
ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼはまた、それらのＤＮＡ切断活性を特徴とする：天然に存在するＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、通常、標的核酸中にＤＳＢを形成するが、ＳＳＢのみを生成する（上述、参照により本明細書に組み込まれるＲａｎ ２０１３も参照されたい）、または全く切断しない遺伝子操作されたバリアントが作製されている。
ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼＣａｓ９は、活性が変化したＣａｓ９のバリアントであり得る。例示的なバリアントＣａｓ９ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、触媒失活Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、超正確Ｃａｓ９（ＨｙｐａＣａｓ９）（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，５５０（７６７６），４０７－４１０（２０１７））、高忠実度Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－ＨＦ）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５２９（７５８７），４９０－４９５（２０１６））、特異性強化型Ｃａｓ９（ｅＣａｓ９）（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１（６２６８），８４－８８（２０１６）、及び拡張ＰＡＭ Ｃａｓ９（ｘＣａｓ９））（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２６１５５（２０１８））を含むが、これらに限定されない。
ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、本開示の化学修飾されたガイドＲＮＡと組み合わされて、ゲノム編集システムを形成することができる。ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、化学修飾されたガイドＲＮＡと組み合わせられて、ゲノム編集が所望される細胞に送達され得るＲＮＰ複合体を形成し得る。ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、別々に送達される化学修飾されたガイドＲＮＡを用いてゲノム編集が所望される細胞において発現されてもよい。例えば、ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼは、ベクターまたは合成ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドから発現することができる。ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルス（ＬＶ）ベクターを含むが、これらに限定されないウイルスベクターであってもよい。
本明細書に開示される実施形態の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される方法の他の好適な修正及び適合が、好適な等価物を用いて行われ得ることは、当業者には容易に明白であろう。ここである特定の実施形態を詳細に説明したので、以下の実施例を参照することにより、同様のことがより明確に理解されるであろう。以下の実施例は、例示のためにのみ含まれ、限定することを意図するものではない。
実施例１－化学修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの合成
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９４ ＤＮＡシンセサイザー上で、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを１μｍｏｌスケールで合成した。ＢＴＴ（アセトニトリル中０．２５Ｍ、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を活性化剤として使用した。ピリジン：水（９：１）中の０．０５Ｍのヨウ素（ＴＥＤＩＡ）を酸化剤として使用した。ＤＤＴＴ（０．１Ｍ、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を硫化剤として使用した。ＤＣＭ（ＴＥＤＩＡ）中の３％ＴＣＡをデブロック溶液として使用した。ＲＮＡを、Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ（約４２μｍｏｌ／ｇ）で官能化した１０００ÅのＣＰＧ上で成長させた。ＲＮＡ及び２’－ＯＭｅホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）をアセトニトリル中に０．１５Ｍとなるように溶解し、カップリング時間は各塩基について１０分であった。核酸塩基を、３：１のＮＨ４ＯＨ：ＥｔＯＨ溶液で４８時間、室温で脱保護した。ＴＢＤＭＳ基の脱保護は、ＤＭＳＯ：ＮＥｔ３・３ＨＦ（４：１）溶液（５００μＬ）を用いて６５℃で３時間でなされた。次いで、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを３ＭのＮａＯＡｃ（２５μＬ）及びｎ－ＢｕＯＨ（１ｍＬ）中の沈殿によって回収し、ペレットを冷７０％ＥｔＯＨで洗浄し、１ｍＬのＲＮａｓｅを含まない水中に再懸濁した。
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９４ ＤＮＡシンセサイザー上で、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを１μｍｏｌスケールで合成した。ＢＴＴ（アセトニトリル中０．２５Ｍ、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を活性化剤として使用した。ピリジン：水（９：１）中の０．０５Ｍのヨウ素（ＴＥＤＩＡ）を酸化剤として使用した。ＤＤＴＴ（０．１Ｍ、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を硫化剤として使用した。ＤＣＭ（ＴＥＤＩＡ）中の３％ＴＣＡをデブロック溶液として使用した。ＲＮＡを、Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ（約４２μｍｏｌ／ｇ）で官能化した１０００ÅのＣＰＧ上で成長させた。ＲＮＡ及び２’－ＯＭｅホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）をアセトニトリル中に０．１５Ｍとなるように溶解し、カップリング時間は各塩基について１０分であった。核酸塩基を、３：１のＮＨ４ＯＨ：ＥｔＯＨ溶液で４８時間、室温で脱保護した。ＴＢＤＭＳ基の脱保護は、ＤＭＳＯ：ＮＥｔ３・３ＨＦ（４：１）溶液（５００μＬ）を用いて６５℃で３時間でなされた。次いで、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを３ＭのＮａＯＡｃ（２５μＬ）及びｎ－ＢｕＯＨ（１ｍＬ）中の沈殿によって回収し、ペレットを冷７０％ＥｔＯＨで洗浄し、１ｍＬのＲＮａｓｅを含まない水中に再懸濁した。
ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの精製は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＬ－ＳＡＸ １０００Åカラム（１５０ｘ７．５ｍｍ、８μｍ）を用いた１２６０ ｉｎｆｉｎｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍを用いた高速液体クロマトグラフィーによって行った。緩衝液Ａ：水中の３０％アセトニトリル、緩衝液Ｂ：１ＭのＮａＣｌＯ４（水性）中の３０％アセトニトリル。過剰の塩を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｎａｐ－１０カラムで除去した。
ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを、エレクトロスプレーイオン化及び負イオン化モードでの飛行時間イオン分離を有するＡｇｉｌｅｎｔ ６５３０ Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳシステム上で分析した。データを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒソフトウェアを使用して解析した。緩衝液Ａ：水中の９ｍＭのトリエチルアミンを有する１００ｍＭのヘキサフルオロイソプロパノール、緩衝液Ｂ：メタノール中の９ｍＭのトリメチルアミンを有する１００ｍＭのヘキサフルオロイソプロパノール。
本実施例において使用されたｃｒＲＮＡを以下の表６に列挙する。上記の表２は、実施例において使用されるｔｒａｃｒＲＮＡを列挙している。
実施例２－化学修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡのゲノム編集効率
先行研究は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡのいくつかの化学修飾パターンが、血清安定性を増加させながら活性であることが可能であることを実証した（ＷＯ２０１９／１８３０００ Ａ１、参照により本明細書に組み込まれる）。以前に作製した修飾ｃｒＲＮＡは、Ｃ１～Ｃ２２であり、以前に作製した修飾ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｔ１～Ｔ２０であった（上記表１及び表２を参照されたい）。図２Ａ～図２Ｃは、修飾ｔｒａｃｒＲＮＡと対合した初期ｃｒＲＮＡのうちのいくつかの活性を示す。図３Ａ～図３Ｃは、Ｃ０（修飾されていない）、Ｃ２０、及びＣ２１と対合した初期ｔｒａｃｒＲＮＡのいくつかの活性を示す。この以前の研究から、特定の重度に修飾されたパターンと完全修飾パターンがゲノム編集効率の低下を有していることが指摘された。本明細書に記載の研究は、高いゲノム編集効率を保持する、新規の重度に修飾及び完全に化学修飾されたガイドＲＮＡパターンの同定につながった。
先行研究は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡのいくつかの化学修飾パターンが、血清安定性を増加させながら活性であることが可能であることを実証した（ＷＯ２０１９／１８３０００ Ａ１、参照により本明細書に組み込まれる）。以前に作製した修飾ｃｒＲＮＡは、Ｃ１～Ｃ２２であり、以前に作製した修飾ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｔ１～Ｔ２０であった（上記表１及び表２を参照されたい）。図２Ａ～図２Ｃは、修飾ｔｒａｃｒＲＮＡと対合した初期ｃｒＲＮＡのうちのいくつかの活性を示す。図３Ａ～図３Ｃは、Ｃ０（修飾されていない）、Ｃ２０、及びＣ２１と対合した初期ｔｒａｃｒＲＮＡのいくつかの活性を示す。この以前の研究から、特定の重度に修飾されたパターンと完全修飾パターンがゲノム編集効率の低下を有していることが指摘された。本明細書に記載の研究は、高いゲノム編集効率を保持する、新規の重度に修飾及び完全に化学修飾されたガイドＲＮＡパターンの同定につながった。
化学修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡのスクリーニング方法
細胞培養
スクリーニングを、トラフィックライトレポーター（ＴＬＲ）マルチ－Ｃａｓバリアント１システム（ＴＬＲ－ＭＣＶ１）を発現するＨＥＫ２９３Ｔ安定細胞株において行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ダルベッコ改変イーグルの最小必須培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。ＤＭＥＭには、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ）も補充した。細胞を、加湿された３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター中で増殖させた。
細胞培養
スクリーニングを、トラフィックライトレポーター（ＴＬＲ）マルチ－Ｃａｓバリアント１システム（ＴＬＲ－ＭＣＶ１）を発現するＨＥＫ２９３Ｔ安定細胞株において行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ダルベッコ改変イーグルの最小必須培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した。ＤＭＥＭには、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ）も補充した。細胞を、加湿された３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーター中で増殖させた。
トラフィックライトレポーター（ＴＬＲ）システム
トラフィックライトレポーター（ＴＬＲ）システムは、ＧＦＰ（挿入を含む）とそれに続くフレーム外ｍＣｈｅｒｒｙを含む。二本鎖切断誘導の際、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復イベントのサブセットは、フレーム内にｍＣｈｅｒｒｙを配置し、赤色蛍光をもたらすインデルを生成する。したがって、赤色蛍光の検出は、編集効率の読み取りである。このシステムが開発され、Ｃｅｒｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８，６７１（２０１１））によって更に記述された。このシステムは、本開示の修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを試験するために更に発展された。ＴＬＲマルチ－Ｃａｓバリアント１システム（ＴＬＲ－ＭＣＶ１）を作成して、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を複数の代替ＣＲＩＳＰＲ酵素（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐｙＣａｓ９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ（Ｎｍｅ１Ｃａｓ９及びＮｍｅ２Ｃａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊｅＣａｓ９），Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａｕＣａｓ９）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＧｅｏＣａｓ９）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂａＣａｓ１２ａ）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、（ＡｓｐＣａｓ１２ａ）、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ （ＦｎｏＣａｓ１２））に導入した。追加のＳｐｙＣａｓ９編集部位も導入し、編集部位ＭＣＶ１ａ及びＭＣＶ１ｂを生成した。ＭＣＶ１ａの標的はＧＡＧＡＣＡＡＡＵＣＡＣＣＵＧＣＣＵＣＧであり、ＭＣＶ１ｂの標的はＵＵＵＡＣＣＧＵＡＵＵＣＣＡＣＧＡＧＧＣである。これらの重複するＳｐｙＣａｓ９切断部位は、同じ位置を標的とする２つの異なるｃｒＲＮＡ配列の評価を可能にする。
トラフィックライトレポーター（ＴＬＲ）システムは、ＧＦＰ（挿入を含む）とそれに続くフレーム外ｍＣｈｅｒｒｙを含む。二本鎖切断誘導の際、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復イベントのサブセットは、フレーム内にｍＣｈｅｒｒｙを配置し、赤色蛍光をもたらすインデルを生成する。したがって、赤色蛍光の検出は、編集効率の読み取りである。このシステムが開発され、Ｃｅｒｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８，６７１（２０１１））によって更に記述された。このシステムは、本開示の修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを試験するために更に発展された。ＴＬＲマルチ－Ｃａｓバリアント１システム（ＴＬＲ－ＭＣＶ１）を作成して、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を複数の代替ＣＲＩＳＰＲ酵素（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐｙＣａｓ９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ（Ｎｍｅ１Ｃａｓ９及びＮｍｅ２Ｃａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ（ＣｊｅＣａｓ９），Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳａｕＣａｓ９）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＧｅｏＣａｓ９）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６（ＬｂａＣａｓ１２ａ）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、（ＡｓｐＣａｓ１２ａ）、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ （ＦｎｏＣａｓ１２））に導入した。追加のＳｐｙＣａｓ９編集部位も導入し、編集部位ＭＣＶ１ａ及びＭＣＶ１ｂを生成した。ＭＣＶ１ａの標的はＧＡＧＡＣＡＡＡＵＣＡＣＣＵＧＣＣＵＣＧであり、ＭＣＶ１ｂの標的はＵＵＵＡＣＣＧＵＡＵＵＣＣＡＣＧＡＧＧＣである。これらの重複するＳｐｙＣａｓ９切断部位は、同じ位置を標的とする２つの異なるｃｒＲＮＡ配列の評価を可能にする。
ｍＴｍＧレポーターシステム
ｍＴｍＧレポーターシステムは、Ｃｒｅ媒介性切除前に膜標的化タンデム二量体Ｔｏｍａｔｏ（ｍＴ）を発現し、切除後に膜標的化緑色蛍光タンパク質（ｍＧ）を発現する二重蛍光Ｃｒｅレポーターである。代替として、ｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子は、隣接位置に２つのＣＲＩＳＰＲ媒介性切断を導入することによって切除されてもよい。２つの切断部位は同一であり、したがって、単一のガイドＲＮＡ－Ｃａｓ９ ＲＮＰで切断することができる。レポーターシステムは、トランスジェニックマウスにおいてインビボで、または細胞株においてインビトロで使用することができる。ここで、レポーターを、インビトロ実験のためのマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、及びインビボ実験のためのトランスジェニックマウスで使用した。レポーターが編集されていない（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ編集なし）場合、ｔｄＴｏｍａｔｏが発現し、赤色蛍光をもたらす。ｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の編集に成功すると、ＧＦＰ遺伝子が発現する。したがって、ｍＴｍＧレポーターシステムにおいて、より高いレベルのＧＦＰ蛍光は、ＣＲＩＳＰＲによる成功裏な編集を示す。本明細書に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分は、ガイド配列ＣＧＡＡＧＵＵＡＵＡＵＵＡＡＧＧＧＵＵＣを有する。レポーターは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｕｚｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅｓｉｓ．４５（９）：５９３－６０５．２００７）に詳述される。
ｍＴｍＧレポーターシステムは、Ｃｒｅ媒介性切除前に膜標的化タンデム二量体Ｔｏｍａｔｏ（ｍＴ）を発現し、切除後に膜標的化緑色蛍光タンパク質（ｍＧ）を発現する二重蛍光Ｃｒｅレポーターである。代替として、ｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子は、隣接位置に２つのＣＲＩＳＰＲ媒介性切断を導入することによって切除されてもよい。２つの切断部位は同一であり、したがって、単一のガイドＲＮＡ－Ｃａｓ９ ＲＮＰで切断することができる。レポーターシステムは、トランスジェニックマウスにおいてインビボで、または細胞株においてインビトロで使用することができる。ここで、レポーターを、インビトロ実験のためのマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、及びインビボ実験のためのトランスジェニックマウスで使用した。レポーターが編集されていない（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ編集なし）場合、ｔｄＴｏｍａｔｏが発現し、赤色蛍光をもたらす。ｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子の編集に成功すると、ＧＦＰ遺伝子が発現する。したがって、ｍＴｍＧレポーターシステムにおいて、より高いレベルのＧＦＰ蛍光は、ＣＲＩＳＰＲによる成功裏な編集を示す。本明細書に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分は、ガイド配列ＣＧＡＡＧＵＵＡＵＡＵＵＡＡＧＧＧＵＵＣを有する。レポーターは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｕｚｕｍｄａｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅｓｉｓ．４５（９）：５９３－６０５．２００７）に詳述される。
Ｓｐｙ－Ｃａｓ９の発現及び精製
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９を発現するｐＭＣＳＧ７ベクターを用いた。この構築物においてＣａｓ９は、３つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）も含む。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＲｏｓｅｔｔａ ＤＥ３株を、３×ＮＬＳ－ＳｐｙＣａｓ９構築物で形質転換した。３×ＮＬＳ－ＳｐｙＣａｓ９の発現及び精製のために、前述のプロトコルを使用した（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６（２０１２））。細菌培養物を、０．６のＯＤ６００に達するまで３７℃で増殖させた。次に、細菌培養物を１８℃に冷却し、１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；Ｓｉｇｍａ）を添加してタンパク質発現を誘導した。細胞を終夜１６～２０時間成長させた。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９を発現するｐＭＣＳＧ７ベクターを用いた。この構築物においてＣａｓ９は、３つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）も含む。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＲｏｓｅｔｔａ ＤＥ３株を、３×ＮＬＳ－ＳｐｙＣａｓ９構築物で形質転換した。３×ＮＬＳ－ＳｐｙＣａｓ９の発現及び精製のために、前述のプロトコルを使用した（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６（２０１２））。細菌培養物を、０．６のＯＤ６００に達するまで３７℃で増殖させた。次に、細菌培養物を１８℃に冷却し、１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；Ｓｉｇｍａ）を添加してタンパク質発現を誘導した。細胞を終夜１６～２０時間成長させた。
細菌細胞を採取し、溶解緩衝液［５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭのイミダゾール］中に再懸濁した。次いで、１０μｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）を混合物に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。続いて、これに１×ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加した。次いで、細菌細胞を超音波処理し、１８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。次いで、上清をニッケルアフィニティクロマトグラフィーに供した。次いで、ＳｐｙＣａｓ９を含有する溶出画分を、５ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｓ ＨＰカラム（ＧＥ）を使用して、カチオン交換クロマトグラフィーを使用して更に精製した。続いて、これにＳｕｐｅｒｄｅｘ－２００カラム（ＧＥ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによる最終ラウンドの精製を行った。精製したタンパク質を濃縮し、その後の使用のためにフラッシュ凍結させた。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、製造業者のプロトコルに従って、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してヌクレオフェクションした。簡潔に述べると、２０ピコモルの３×ＮＬＳ－ＳｐｙＣａｓ９を、２５ピコモルの緩衝液Ｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡと混合し、室温で２０～３０分間インキュベートした。次いで、このＣａｓ９ ＲＮＰ複合体を、緩衝液Ｒ中にすでに再懸濁した約１００，０００個の細胞と混合した。この混合物を１０μＬのＮｅｏｎチップでヌクレオフェクションし、次いで、５００μＬのＤＭＥＭ及び１０％のＦＢＳを含有する２４ウェルプレートにプレーティングした。細胞を加湿した３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーターに２～３日間保管した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、製造業者のプロトコルに従って、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してヌクレオフェクションした。簡潔に述べると、２０ピコモルの３×ＮＬＳ－ＳｐｙＣａｓ９を、２５ピコモルの緩衝液Ｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡと混合し、室温で２０～３０分間インキュベートした。次いで、このＣａｓ９ ＲＮＰ複合体を、緩衝液Ｒ中にすでに再懸濁した約１００，０００個の細胞と混合した。この混合物を１０μＬのＮｅｏｎチップでヌクレオフェクションし、次いで、５００μＬのＤＭＥＭ及び１０％のＦＢＳを含有する２４ウェルプレートにプレーティングした。細胞を加湿した３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーターに２～３日間保管した。
フローサイトメトリー分析
ヌクレオフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ 製のＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標） ＶＹＢで分析した。ｍＣｈｅｒｒｙ検出には、黄色のレーザー（５６１ｎｍ）を励起に使用し、６１５／２０ｎｍフィルターを発光の検出に使用した。少なくとも２０，０００件の事象を記録し、その後の解析はＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ｖ１０．４．１を使用して行った。細胞をまず、前方及び側方散乱（ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ）に基づいて選別し、破片を除去した。次いで、細胞を、ＦＳＣ－Ａ及びＦＳＣ－Ｈを使用してゲート化し、単一細胞を選択した。最後に、ｍＣｈｅｒｒｙシグナルを使用して、ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞を選択した。ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞のパーセントを計算し、Ｃａｓ９ベースのゲノム編集の尺度として本出願で報告した。
ヌクレオフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ 製のＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標） ＶＹＢで分析した。ｍＣｈｅｒｒｙ検出には、黄色のレーザー（５６１ｎｍ）を励起に使用し、６１５／２０ｎｍフィルターを発光の検出に使用した。少なくとも２０，０００件の事象を記録し、その後の解析はＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ｖ１０．４．１を使用して行った。細胞をまず、前方及び側方散乱（ＦＳＣ－Ａ対ＳＳＣ－Ａ）に基づいて選別し、破片を除去した。次いで、細胞を、ＦＳＣ－Ａ及びＦＳＣ－Ｈを使用してゲート化し、単一細胞を選択した。最後に、ｍＣｈｅｒｒｙシグナルを使用して、ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞を選択した。ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞のパーセントを計算し、Ｃａｓ９ベースのゲノム編集の尺度として本出願で報告した。
ＴＩＤＥによるインデル解析
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのゲノムＤＮＡは、製造業者の推奨に従ってＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して採取した。約５０ｎｇのゲノムＤＮＡを使用して、約７００塩基対の断片をＰＣＲ増幅し、続いてＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。次いで、ＰＣＲ断片をＳａｎｇｅｒ配列決定によって配列決定し、トレースファイルをＴＩＤＥウェブツールを使用してインデル分析に供した（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４２：ｅ１６８（２０１４））。結果は、％インデル割合として報告される。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのゲノムＤＮＡは、製造業者の推奨に従ってＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して採取した。約５０ｎｇのゲノムＤＮＡを使用して、約７００塩基対の断片をＰＣＲ増幅し、続いてＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。次いで、ＰＣＲ断片をＳａｎｇｅｒ配列決定によって配列決定し、トレースファイルをＴＩＤＥウェブツールを使用してインデル分析に供した（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４２：ｅ１６８（２０１４））。結果は、％インデル割合として報告される。
新規化学修飾パターンのスクリーニング
構造ガイドされたシステマティックな手法を使用して、ガイドＲＮＡ全体に２’－ＯＭｅ－ＲＮＡ、２’－Ｆ－ＲＮＡ、２’－デオキシ及びＰＳ修飾を導入した。これらの修飾は、ＲＮＡに関連する安定性、有効性、及び免疫毒性を改善することが示されているために選択された。本明細書に記載の戦略は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの広範かつ完全に修飾されたバージョンの両方を有する活性ＲＮＰ複合体をもたらした。図４及び図５は、ＭＣＶ１ａ部位及びＭＣＶ１ｂ部位の両方を標的とする、Ｃ２３～Ｃ４４のｃｒＲＮＡパターンのスクリーニングを示す。ｃｒＲＮＡ Ｃ２９、Ｃ３９及びＣ４０は、以前に開発されたｃｒＲＮＡであるＣ２０の有効性と同様の有効性を示す。ｃｒＲＮＡ Ｃ２０、Ｃ２９、及びＣ３９は、リボース修飾を有しない全てのヌクレオチドがホスホジエステル結合修飾を有するという意味で完全に修飾される。しかしながら、Ｃ２０は依然として６つの未修飾リボース残基を含有しているが、新しいｃｒＲＮＡ Ｃ３９は３つの未修飾リボースのみを有し、Ｃ２９は１つの未修飾リボースのみを有している。Ｃ４０は、その組成中に修飾されていないリボースがない、新たに開発された完全に修飾されたｃｒＲＮＡである。Ｃ４５もまた、修飾されていないリボース部分を有しない完全に修飾された分子である。Ｃ４０と同様に、この組成物は、インビボで非常に安定であると予想されるが、その活性は、ｃｒＲＮＡ Ｃ２０と比較して、ある程度減少する。
構造ガイドされたシステマティックな手法を使用して、ガイドＲＮＡ全体に２’－ＯＭｅ－ＲＮＡ、２’－Ｆ－ＲＮＡ、２’－デオキシ及びＰＳ修飾を導入した。これらの修飾は、ＲＮＡに関連する安定性、有効性、及び免疫毒性を改善することが示されているために選択された。本明細書に記載の戦略は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの広範かつ完全に修飾されたバージョンの両方を有する活性ＲＮＰ複合体をもたらした。図４及び図５は、ＭＣＶ１ａ部位及びＭＣＶ１ｂ部位の両方を標的とする、Ｃ２３～Ｃ４４のｃｒＲＮＡパターンのスクリーニングを示す。ｃｒＲＮＡ Ｃ２９、Ｃ３９及びＣ４０は、以前に開発されたｃｒＲＮＡであるＣ２０の有効性と同様の有効性を示す。ｃｒＲＮＡ Ｃ２０、Ｃ２９、及びＣ３９は、リボース修飾を有しない全てのヌクレオチドがホスホジエステル結合修飾を有するという意味で完全に修飾される。しかしながら、Ｃ２０は依然として６つの未修飾リボース残基を含有しているが、新しいｃｒＲＮＡ Ｃ３９は３つの未修飾リボースのみを有し、Ｃ２９は１つの未修飾リボースのみを有している。Ｃ４０は、その組成中に修飾されていないリボースがない、新たに開発された完全に修飾されたｃｒＲＮＡである。Ｃ４５もまた、修飾されていないリボース部分を有しない完全に修飾された分子である。Ｃ４０と同様に、この組成物は、インビボで非常に安定であると予想されるが、その活性は、ｃｒＲＮＡ Ｃ２０と比較して、ある程度減少する。
新しいｔｒａｃｒＲＮＡ化学修飾パターンも開発した。図６は、新しいパターンＴ３８、Ｔ３９、及びＴ４１と比較した、前述のｔｒａｃｒＲＮＡパターンＴ２、Ｔ９、Ｔ１２、Ｔ１７、及びＴ１８のスクリー二ングを示す。異なるｔｒａｃｒＲＮＡを、Ｃ２１、Ｃ３９、Ｃ４０、またはＣ４５と対合させた。新しいｃｒＲＮＡ Ｃ３９、Ｃ４０、及びＣ４５は、古いＣ２１パターンと比較して、全てのｔｒａｃｒＲＮＡと対合したときに、より高い編集効率を示した。
いくつかの新しいｔｒａｃｒＲＮＡは、以前のｔｒａｃｒＲＮＡ Ｔ２よりも重度に修飾される。ＴｒａｃｒＲＮＡ Ｔ４１、Ｔ１２及びＴ１７は、Ｔ２よりも高い活性を示す。ＴｒａｃｒＲＮＡ Ｔ９、Ｔ１８、Ｔ３７、Ｔ３８及びＴ９２は、Ｔ２と同様の効率性を示すが、Ｔ４９及びＴ９５は、Ｔ２よりもわずかに減少した活性を示す（図７及び図８）。
以前に開発されたｃｒＲＮＡ Ｃ２０またはｔｒａｃｒＲＮＡ Ｔ２と比較した、完全に修飾されたｃｒＲＮＡ Ｃ４５及び重度に修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡ Ｔ４９及びＴ９５を有するヒト細胞において見られる有効性の損失は、より高いインビボ安定性によって相殺され得る。新規に開発されたＲＮＡは全て、ヒト細胞において試験された場合、複数の組み合わせで機能している。
実施例３－内因性ヒト遺伝子を標的とするコンジュゲートを有する及び有しない、化学修飾されたｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ対
本開示のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ設計が、内因性ヒト遺伝子を標的とするものを含む異なるガイド配列と適合することを検証するために、設計Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ４０、Ｃ４２、及びＣ４５を、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とすることによって試験した（図９）。ｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡ Ｔ２またはＴ６と対合させ、Ｔ２を非コンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃコンジュゲート形態で更に使用した。Ｃ２９、Ｃ３９、Ｃ４０、及びＣ４２もまた、非コンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃコンジュゲート形態で試験した。ＲＮＡ設計は、マウスＨｅｐａ１－６細胞株におけるＣａｓ９ＲＮＰのエレクトロポレーションによって試験された。グラフは、遺伝子座のＰＣＲ及びサンガー配列決定データのＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ（ＩＣＥ）分析の推論に基づくインデルの割合を示す。データは３つの独立した生物学的複製からの平均を表し、エラーバーはｓｅｍを表す
本開示のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ設計が、内因性ヒト遺伝子を標的とするものを含む異なるガイド配列と適合することを検証するために、設計Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ４０、Ｃ４２、及びＣ４５を、ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とすることによって試験した（図９）。ｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡ Ｔ２またはＴ６と対合させ、Ｔ２を非コンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃコンジュゲート形態で更に使用した。Ｃ２９、Ｃ３９、Ｃ４０、及びＣ４２もまた、非コンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃコンジュゲート形態で試験した。ＲＮＡ設計は、マウスＨｅｐａ１－６細胞株におけるＣａｓ９ＲＮＰのエレクトロポレーションによって試験された。グラフは、遺伝子座のＰＣＲ及びサンガー配列決定データのＣＲＩＳＰＲ Ｅｄｉｔｓ（ＩＣＥ）分析の推論に基づくインデルの割合を示す。データは３つの独立した生物学的複製からの平均を表し、エラーバーはｓｅｍを表す
これらの結果は、修飾されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ設計が内因性標的部位にも適用可能であり、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方のコンジュゲートとともに機能することを示す。
実施例４－様々なホスホロチオエート含量を有する化学修飾されたｃｒＲＮＡ
追加の化学的に修飾されたｃｒＲＮＡを設計し、合成し、ゲノム編集効率について試験した。ｃｒＲＮＡ Ｃ５２～Ｃ９３を、ＭＣＶ１ａ標的部位を用いたＴＬＲアッセイにおいて試験した。各ｃｒＲＮＡは、Ｔ４１ ＴｒａｃｒＲＮＡと対合した。様々なｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを有するＣａｓ９を含有する２ｐｍｏｌのＲＮＰを上述のＴＬＲ－ＭＣＶ１株にトランスフェクトし、％ｍＣｈｅｒｒｙ発現をゲノム編集効率のためのプロキシとして検出した。ｃｒＲＮＡ Ｃ５２～Ｃ９３は、ホスホロチオエート配置に関するものを除いて、Ｃ４０と同じ化学修飾パターンを含有した。ｃｒＲＮＡ配列を表６に示す。スクリーニングにより、少なくとも最大２０個のホスホロチオエート修飾を含有するｃｒＲＮＡが許容されることが明らかとなった（図１０）。
追加の化学的に修飾されたｃｒＲＮＡを設計し、合成し、ゲノム編集効率について試験した。ｃｒＲＮＡ Ｃ５２～Ｃ９３を、ＭＣＶ１ａ標的部位を用いたＴＬＲアッセイにおいて試験した。各ｃｒＲＮＡは、Ｔ４１ ＴｒａｃｒＲＮＡと対合した。様々なｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを有するＣａｓ９を含有する２ｐｍｏｌのＲＮＰを上述のＴＬＲ－ＭＣＶ１株にトランスフェクトし、％ｍＣｈｅｒｒｙ発現をゲノム編集効率のためのプロキシとして検出した。ｃｒＲＮＡ Ｃ５２～Ｃ９３は、ホスホロチオエート配置に関するものを除いて、Ｃ４０と同じ化学修飾パターンを含有した。ｃｒＲＮＡ配列を表６に示す。スクリーニングにより、少なくとも最大２０個のホスホロチオエート修飾を含有するｃｒＲＮＡが許容されることが明らかとなった（図１０）。
実施例５－２’－アミノＲＮＡ及び／または４’－チオＲＮＡ修飾を含有する化学修飾されたｃｒＲＮＡ
２’－アミノＲＮＡまたは４’－チオＲＮＡ（すなわち、リボース糖中の糖環酸素が硫黄で置き換えられる）修飾のいずれかを含有する追加の化学修飾されたｃｒＲＮＡを設計し、合成し、遺伝子編集効率について試験した。ｃｒＲＮＡ Ｃ１１４～Ｃ１３４を、ＭＣＶ１ａ標的部位またはＭＣＶ１ｂ標的部位を用いたＴＬＲアッセイにおいて、またはｍＴｍＧレポーターシステムにおいて試験し、これらの各々は上記に記載される。図１１Ａに示すように、ｃｒＲＮＡ Ｃ１１６～Ｃ１１８及びＣ１２２～Ｃ１３４をＴ２ ｔｒａｃｒＲＮＡと対合させた。様々なｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを有するＣａｓ９を含有する５ｐｍｏｌのＲＮＰを上述のＴＬＲ－ＭＣＶ１株にトランスフェクトし、％ｍＣｈｅｒｒｙ発現を検出した。図１１Ｂに示すように、ｃｒＲＮＡ Ｃ１１６～Ｃ１１８及びＣ１２２～Ｃ１３４を、修飾されていないｔｒａｃｒＲＮＡ及びＳｐＣａｓ９もまた同様に安定して発現された修飾ＴＬＲ－ＭＣＶ１アッセイで使用した。１００ｐｍｏｌの各ｃｒＲＮＡを細胞株にトランスフェクトし、％ｍＣｈｅｒｒｙ発現を検出した。最後に、図１１Ｃに示すように、ｃｒＲＮＡ Ｃ１１４～Ｃ１２７を、上述のｍＴｍＧレポーターアッセイにおいて、種々のＣｒＲＮＡ及びＴ２ ｔｒａｃｒＲＮＡを含むＣａｓ９を含有する５ｐｍｏｌのＲＮＰで試験した。ｃｒＲＮＡ配列を表６に示す。試験した各ｃｒＲＮＡは、１つ以上の２’－アミノリボース修飾または１つ以上の４’－チオＲＮＡ修飾のいずれかを有した。スクリー二ングは、１つ以上の２’－アミノリボース修飾または１つ以上の４’－チオＲＮＡ修飾を含有するｃｒＲＮＡが、安定性を向上させることができる追加の化学修飾を有する一方で、有効な遺伝子編集活性を維持することを明らかにした。
２’－アミノＲＮＡまたは４’－チオＲＮＡ（すなわち、リボース糖中の糖環酸素が硫黄で置き換えられる）修飾のいずれかを含有する追加の化学修飾されたｃｒＲＮＡを設計し、合成し、遺伝子編集効率について試験した。ｃｒＲＮＡ Ｃ１１４～Ｃ１３４を、ＭＣＶ１ａ標的部位またはＭＣＶ１ｂ標的部位を用いたＴＬＲアッセイにおいて、またはｍＴｍＧレポーターシステムにおいて試験し、これらの各々は上記に記載される。図１１Ａに示すように、ｃｒＲＮＡ Ｃ１１６～Ｃ１１８及びＣ１２２～Ｃ１３４をＴ２ ｔｒａｃｒＲＮＡと対合させた。様々なｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを有するＣａｓ９を含有する５ｐｍｏｌのＲＮＰを上述のＴＬＲ－ＭＣＶ１株にトランスフェクトし、％ｍＣｈｅｒｒｙ発現を検出した。図１１Ｂに示すように、ｃｒＲＮＡ Ｃ１１６～Ｃ１１８及びＣ１２２～Ｃ１３４を、修飾されていないｔｒａｃｒＲＮＡ及びＳｐＣａｓ９もまた同様に安定して発現された修飾ＴＬＲ－ＭＣＶ１アッセイで使用した。１００ｐｍｏｌの各ｃｒＲＮＡを細胞株にトランスフェクトし、％ｍＣｈｅｒｒｙ発現を検出した。最後に、図１１Ｃに示すように、ｃｒＲＮＡ Ｃ１１４～Ｃ１２７を、上述のｍＴｍＧレポーターアッセイにおいて、種々のＣｒＲＮＡ及びＴ２ ｔｒａｃｒＲＮＡを含むＣａｓ９を含有する５ｐｍｏｌのＲＮＰで試験した。ｃｒＲＮＡ配列を表６に示す。試験した各ｃｒＲＮＡは、１つ以上の２’－アミノリボース修飾または１つ以上の４’－チオＲＮＡ修飾のいずれかを有した。スクリー二ングは、１つ以上の２’－アミノリボース修飾または１つ以上の４’－チオＲＮＡ修飾を含有するｃｒＲＮＡが、安定性を向上させることができる追加の化学修飾を有する一方で、有効な遺伝子編集活性を維持することを明らかにした。
実施例６－４’－チオＲＮＡ修飾を含有する化学修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡ
４’－チオＲＮＡ修飾を含有する追加の化学修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡを設計し、合成し、遺伝子編集効率について試験した。ｔｒａｃｒＲＮＡ Ｔ１０７～Ｔ１１６を、それぞれ上記ＴＬＲアッセイまたはｍＴｍＧレポーターシステムにおいて試験した。Ｔ１０７～Ｔ１１６のそれぞれは、４’－チオＲＮＡ修飾が１つ以上の修飾されていない残基に導入されたことを除いて、Ｔ２と同じ化学修飾パターンを有した。種々のｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣ２０ ｃｒＲＮＡを有するＣａｓ９を含有する５ｐｍｏｌのＲＮＰをＴＬＲ－ＭＣＶ１系またはｍＴｍＧ系にトランスフェクトし、蛍光を検出した。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を表２に示す。図１２に示す通り、試験した全てのｔｒａｃｒＲＮＡが有効な遺伝子編集活性を保持した。以前に修飾されていなかった位置での４’－チオＲＮＡ修飾の包含は、１００％化学修飾により近いｔｒａｃＲＮＡを提供する。例えば、Ｔ１０７は、５個のヌクレオチドを除く全てのヌクレオチドで修飾を有する。
４’－チオＲＮＡ修飾を含有する追加の化学修飾されたｔｒａｃｒＲＮＡを設計し、合成し、遺伝子編集効率について試験した。ｔｒａｃｒＲＮＡ Ｔ１０７～Ｔ１１６を、それぞれ上記ＴＬＲアッセイまたはｍＴｍＧレポーターシステムにおいて試験した。Ｔ１０７～Ｔ１１６のそれぞれは、４’－チオＲＮＡ修飾が１つ以上の修飾されていない残基に導入されたことを除いて、Ｔ２と同じ化学修飾パターンを有した。種々のｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣ２０ ｃｒＲＮＡを有するＣａｓ９を含有する５ｐｍｏｌのＲＮＰをＴＬＲ－ＭＣＶ１系またはｍＴｍＧ系にトランスフェクトし、蛍光を検出した。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を表２に示す。図１２に示す通り、試験した全てのｔｒａｃｒＲＮＡが有効な遺伝子編集活性を保持した。以前に修飾されていなかった位置での４’－チオＲＮＡ修飾の包含は、１００％化学修飾により近いｔｒａｃＲＮＡを提供する。例えば、Ｔ１０７は、５個のヌクレオチドを除く全てのヌクレオチドで修飾を有する。
実施例７－インビボ遺伝子編集
種々の化学修飾されたガイドＲＮＡは、インビトロで、強化された安定性（例えば、血清安定性）を有しながら、かなりの遺伝子編集活性を示している。次に、ｍＴｍＧトランスジェニックマウスにおいて、選択された化学修飾されたガイドＲＮＡのインビボ活性を決定した。選択されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡから構成されるＲＮＰを、Ｃａｓ９とともに、１５０～２００ｐｍｏｌの用量でマウスに線条体内（ＩＳ）注入した。注射の６日後、マウス脳組織を染色して、ＧＦＰの発現を検出した。以下のガイドＲＮＡ ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ対を使用した：Ｃ２０／Ｔ２、Ｃ２９／Ｔ２、Ｃ２０／Ｔ４１、及びＣ２９／Ｔ４１。図１３に示すように、ＲＮＰを含有するＣ２０／Ｔ２を受けたマウスからの脳組織において、ＧＦＰが発現された。図１４に示すように、ＧＦＰは、ＲＮＰを含有するＣ２０／Ｔ４１を受けたマウスからの脳組織で発現された。データは、化学修飾されたガイドＲＮＡがインビボで遺伝子編集活性が可能であることを示す。
種々の化学修飾されたガイドＲＮＡは、インビトロで、強化された安定性（例えば、血清安定性）を有しながら、かなりの遺伝子編集活性を示している。次に、ｍＴｍＧトランスジェニックマウスにおいて、選択された化学修飾されたガイドＲＮＡのインビボ活性を決定した。選択されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡから構成されるＲＮＰを、Ｃａｓ９とともに、１５０～２００ｐｍｏｌの用量でマウスに線条体内（ＩＳ）注入した。注射の６日後、マウス脳組織を染色して、ＧＦＰの発現を検出した。以下のガイドＲＮＡ ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ対を使用した：Ｃ２０／Ｔ２、Ｃ２９／Ｔ２、Ｃ２０／Ｔ４１、及びＣ２９／Ｔ４１。図１３に示すように、ＲＮＰを含有するＣ２０／Ｔ２を受けたマウスからの脳組織において、ＧＦＰが発現された。図１４に示すように、ＧＦＰは、ＲＮＰを含有するＣ２０／Ｔ４１を受けたマウスからの脳組織で発現された。データは、化学修飾されたガイドＲＮＡがインビボで遺伝子編集活性が可能であることを示す。
Claims (181)
- 化学修飾されたガイドＲＮＡであって、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに
（ｂ）前記リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含み、
前記ｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも５０％修飾されたヌクレオチドを含み、
前記ｃｒＲＮＡ部分が、１～１０個の２’デオキシ修飾リボース基を含む、前記化学修飾されたガイドＲＮＡ。 - 前記修飾されたヌクレオチドがそれぞれ独立して、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組み合わせの修飾を含む、請求項１に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の各修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、２’－ＮＨ２（２’－アミノ）、４’－チオ、二環式ヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）からなる群から独立して選択される、請求項２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の少なくとも８０％が化学修飾されている、請求項２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の少なくとも９０％が化学修飾されている、請求項２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の１００％が化学修飾されている、請求項２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リン酸基の各修飾が、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、及びホスホトリエステル修飾からなる群から独立して選択される、請求項２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 核酸塩基基の各修飾が、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基からなる群から独立して選択される、請求項２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ガイドＲＮＡが、少なくとも９０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ガイドＲＮＡが、１００％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分の少なくとも１つのヌクレオチドが、２’－デオキシ化学修飾及びホスホロチオエート化学修飾のそれぞれを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から４、５、６、１２、１５、１６、１９、２２、２３、及び２４位の前記ヌクレオチドのうちの１つ以上が、２’－デオキシ化学修飾を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から４、５、及び６位の前記ヌクレオチドが、２’－デオキシ化学修飾及びホスホロチオエート化学修飾のそれぞれを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から１２位の前記ヌクレオチドが、２’－デオキシ化学修飾及びホスホロチオエート化学修飾のそれぞれを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から１５、１６、及び１９位の前記ヌクレオチドが、２’－デオキシ化学修飾及びホスホロチオエート化学修飾のそれぞれを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から２２、２３、及び２４位の前記ヌクレオチドが、２’－デオキシ化学修飾及びホスホロチオエート化学修飾のそれぞれを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｍＵｍＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３８）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４０）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｄＮ＃ｄＮ＃ｆＮｆＮｄＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４１）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｄＵ＃ｄＵ＃ｄＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４２）、及び
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｄＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４４）からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである、先行請求項のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。 - 表２のｔｒａｃｒＲＮＡ ２～１１６のうちのいずれかから選択されるｔｒａｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 化学修飾されたガイドＲＮＡであって、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに
（ｂ）前記リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含み、
前記ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から４、５、及び６位の前記ヌクレオチドが、２’－フルオロ化学修飾またはホスホロチオエート化学修飾を含む、前記化学修飾されたガイドＲＮＡ。 - リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組み合わせの修飾から選択される１つ以上の追加の化学修飾を含む、請求項１９に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の各修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、２’－ＮＨ２（２’－アミノ）、４’－チオ、二環式ヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）からなる群から独立して選択される、請求項２０に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の少なくとも８０％が化学修飾されている、請求項２０に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の少なくとも９０％が化学修飾されている、請求項２０に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の１００％が化学修飾されている、請求項２０に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リン酸基の各修飾が、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、及びホスホトリエステル修飾からなる群から独立して選択される、請求項２０に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 核酸塩基基の各修飾が、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基からなる群から独立して選択される、請求項２０に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ガイドＲＮＡが、少なくとも９０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１９～２６のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ガイドＲＮＡが、１００％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１９～２６のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から４、５、及び６位の前記ヌクレオチドが、２’－フルオロ化学修飾を含む、請求項１９～２８のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から１５、１６、１９、２２、２３、または２４位のうちの１つ以上に、２’－フルオロ化学修飾を更に含む、請求項２９に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から１５、１６、１９、２２、２３、及び２４位に、２’－フルオロ化学修飾を更に含む、請求項２９に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から４、５、及び６位の前記ヌクレオチドが、ホスホロチオエート化学修飾を含む、請求項１９～２８のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から１５、１６、１９、２２、２３、または２４位のうちの１つ以上に、２’－フルオロ化学修飾を更に含む、請求項３２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から１５、１６、１９、２２、２３、及び２４位に、２’－フルオロ化学修飾を更に含む、請求項３２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｒＡ＃ｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３３）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３４）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｍＵｍＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３６）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｍＵｍＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３７）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３９）、及び
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｆＮｆＮｆＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４５）からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである、請求項１９～３４のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。 - 表２のｔｒａｃｒＲＮＡ ２～１１６のうちのいずれかから選択されるｔｒａｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含む、請求項１９～３５のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 化学修飾されたガイドＲＮＡであって、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに
（ｂ）前記リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含み、
前記ｃｒＲＮＡ部分が、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２３）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２４）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２５）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｆＵｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２６）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｆＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２７）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２８）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２９）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮｒＮｒＮｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３０）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮｒＮｒＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３１）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮｒＮｒＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮｍＮｍＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３２）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮｒＮｒＮｍＮｍＮｍＮｍＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｍＮｍＧｒＵｒＵｒＵｍＵｍＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３５）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４３）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ ｃｒＲＮＡ ４６）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ （ｃｒＲＮＡ ４７）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｆＮｆＮｍＮｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４８）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｍＵｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４９）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｍＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ５０）、及び
ｍＧ＃ｍＧ＃ｍＵ＃ｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＣｍＵｆＵｆＡｆＵｆＵｒＵ＃ｒＧ＃ｆＣｆＧｒＵ＃ｍＡｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｍＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ５１）からなる群から選択される修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである、前記化学修飾されたガイドＲＮＡ。 - ｔｒａｃｒ部分が、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組み合わせの修飾からそれぞれ独立して選択される１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項３７に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の各修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、２’－ＮＨ２（２’－アミノ）、４’－チオ、二環式ヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）からなる群から独立して選択される、請求項３８に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の少なくとも５０％が化学修飾されている、請求項３８に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の少なくとも８０％が化学修飾されている、請求項３８に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の１００％が化学修飾されている、請求項３８に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リン酸基の各修飾が、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、及びホスホトリエステル修飾からなる群から独立して選択される、請求項３８に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 核酸塩基基の各修飾が、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基からなる群から独立して選択される、請求項３８に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも５０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項３８に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも８０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項３８に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも９０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項３８に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、１００％化学修飾されたヌクレオチドを含む、請求項３８に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 表２のｔｒａｃｒＲＮＡ ２～１１６のうちのいずれか１つから選択されるｔｒａｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含む、請求項３７に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 化学修飾されたガイドＲＮＡであって、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに
（ｂ）前記リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含み、
前記ｃｒＲＮＡ部分が、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２０）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ２９）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｒＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ３９）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４０）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｆＮｆＮｆＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ４５）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮ＃ｆＮ＃ｆＮｆＮｆＮ＃ｍＮｍＧｆＵ＃ｆＵ＃ｆＵ＃ｆＵ＃ｆＡ＃ｍＧｍＡｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＡ＃ｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ８１）、及び
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｄＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＧｆＵｆＵｆＵｆＵｆＡ＃ｍＧ＃ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ＃ｍＡ＃ｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ ８５）からなる群から選択される修飾パターンを含み、
前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｆＵｆＵｍＡｆＡｍＡｍＡｆＵｍＡｍＡｍＧｍＧｆＣｆＵｍＡｆＧｆＵｆＣｍＣｆＧｆＵｆＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｆＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ９）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｆＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １２）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｆＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １７）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｆＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １８）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵ＃ｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ３７）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣ＃ｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ３８）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵ＃ｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ４１）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｆＣｆＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ４９）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧ＃ｒＵ＃ｒＣ＃ｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ９２）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣ＃ｒＵ＃ｍＡｒＧ＃ｒＵ＃ｒＣ＃ｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ９５）、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｓＵｓＵｍＡｒＡｍＡｍＡｓＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｓＵｍＡｒＧｓＵｒＣｍＣｒＧｓＵｓＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ （ｔｒａｃｒＲＮＡ １０７）からなる群から選択される修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、ａＮ＝２’－ＮＨ２（２’－アミノＲＮＡ）、ｓＮ＝４’－チオＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである、前記化学修飾されたガイドＲＮＡ。 - 化学修飾されたガイドＲＮＡであって、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに
（ｂ）前記リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含み、
前記ｃｒＲＮＡ部分及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分がそれぞれ独立して、少なくとも１つの化学修飾ヌクレオチドを含み、
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が少なくとも１つの２’－デオキシ修飾リボース基を含む、前記化学修飾されたガイドＲＮＡ。 - 前記修飾されたヌクレオチドがそれぞれ独立して、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組み合わせの修飾を含む、請求項５１に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の各修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、２’－ＮＨ２（２’－アミノ）、４’－チオ、二環式ヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）からなる群から独立して選択される、請求項５２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の少なくとも８０％が化学修飾されている、請求項５２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の少なくとも９０％が化学修飾されている、請求項５２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の１００％が化学修飾されている、請求項５２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リン酸基の各修飾が、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、及びホスホトリエステル修飾からなる群から独立して選択される、請求項５２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 核酸塩基基の各修飾が、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基からなる群から独立して選択される、請求項５２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ガイドＲＮＡが、少なくとも９０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項５１に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ガイドＲＮＡが、１００％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項５１に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｄＵｄＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７４）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｄＡｍＡｍＡｄＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７５）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｄＵｄＵｍＡｄＡｍＡｍＡｄＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７６）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７７）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｄＧｄＵｄＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７８）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｄＧｄＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ７９）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｄＧｄＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８０）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｄＧｄＵｄＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８１）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｄＧｄＵｄＣｍＣｄＧｄＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８２）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｄＧｒＵｄＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８３）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｄＧｒＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８４）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｄＧｒＵｄＣｍＣｄＧｒＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８５）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｄＧｒＵｄＣｍＣｄＧｒＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８６）、ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｒＵｍＡｄＧｒＵｄＣｍＣｄＧｒＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ ８７）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｄＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｒＧｄＵｄＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０４）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｄＵｍＡｒＡｍＡｍＡｄＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｄＧｄＵｄＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０５）、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｄＵｄＵｍＡｄＡｍＡｍＡｄＵｍＡｍＡｍＧｍＧｄＣｄＵｍＡｄＧｄＵｄＣｍＣｄＧｄＵｄＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０６）からなる群から選択されるｔｒａｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである、請求項５１～６０のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。 - 表１のｃｒＲＮＡ １～１３４のうちのいずれか１つから選択される、ｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含む、請求項５１～６１のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 化学修飾されたガイドＲＮＡであって、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに
（ｂ）前記リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含み、
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、表２のｔｒａｃｒＲＮＡ ２１～１１６のうちのいずれか１つから選択される修飾パターンを含む、前記化学修飾されたガイドＲＮＡ。 - 前記ｃｒＲＮＡ部分が、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組み合わせの修飾からそれぞれ独立して選択される１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項６３に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の各修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、２’－ＮＨ２（２’－アミノ）、４’－チオ、二環式ヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）からなる群から独立して選択される、請求項６４に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の少なくとも５０％が化学修飾されている、請求項６４に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の少なくとも８０％が化学修飾されている、請求項６４に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の１００％が化学修飾されている、請求項６４に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リン酸基の各修飾が、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、またはホスホトリエステル修飾からなる群から独立して選択される、請求項６４に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 核酸塩基基の各修飾が、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基からなる群から独立して選択される、請求項６４に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも５０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項６４に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも８０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項６４に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも９０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項６４に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｃｒＲＮＡ部分が、１００％化学修飾されたヌクレオチドを含む、請求項６４に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 表１のｃｒＲＮＡ １～１３４のうちのいずれか１つから選択されるｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含む、請求項６３に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 化学修飾されたガイドＲＮＡであって、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに
（ｂ）前記リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含み、
前記ｃｒＲＮＡ部分が少なくとも１つの２’－ＮＨ２（２’－アミノＲＮＡ）修飾を含む、前記化学修飾されたガイドＲＮＡ。 - ピリミジンヌクレオチドが、前記２’－ＮＨ２修飾を含む、請求項７６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- プリンヌクレオチドが、前記２’－ＮＨ２修飾を含む、請求項７６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１６、１９、２２、２３、及び２４位のうちの１つ以上に２’－ＮＨ２（２’－アミノＲＮＡ）修飾を含む、請求項７６～７８のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から１６位に２’－ＮＨ２（２’－アミノ）修飾を含む、請求項７６～７９のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から１９位に２’－ＮＨ２（２’－アミノ）修飾を含む、請求項７６～７９のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から２２位に２’－ＮＨ２（２’－アミノ）修飾を含む、請求項７６～７９のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から２３位に２’－ＮＨ２（２’－アミノ）修飾を含む、請求項７６～７９のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から２４位に２’－ＮＨ２（２’－アミノ）修飾を含む、請求項７６～７９のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から２２、２３、及び２４位に２’－ＮＨ２（２’－アミノ）修飾を含む、請求項７６～７９のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から１９、２２、２３、及び２４位に２’－ＮＨ２（２’－アミノ）修飾を含む、請求項７６～７９のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端から１６位及び１９位に２’－ＮＨ２（２’－アミノ）修飾を含む、請求項７６～７９のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組み合わせの修飾からそれぞれ独立して選択される１つ以上の追加の修飾されたヌクレオチドを更に含む、請求項７６～８７のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の各修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、４’－チオ、二環式ヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）からなる群から独立して選択される、請求項８８に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リン酸基の各修飾が、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、またはホスホトリエステル修飾からなる群から独立して選択される、請求項８８に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 核酸塩基基の各修飾が、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基からなる群から独立して選択される、請求項８８に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも５０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項７６～９１のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも８０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項７６～９１のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも９０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項７６～９１のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｃｒＲＮＡ部分が、１００％化学修飾されたヌクレオチドを含む、請求項７６～９１のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮａＮｍＮｍＧａＵａＵａＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１４）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮａＮｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１５）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧａＵｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１６）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ａＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１７）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ａＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１８）、及び
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧａＵａＵａＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２８）からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｄＮ＝２’－デオキシＲＮＡ、ａＮ＝２’－ＮＨ２（２’－アミノＲＮＡ）、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである、請求項７６～９１のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。 - 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組み合わせの修飾からそれぞれ独立して選択される１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項７６～９６のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の各修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、２’－ＮＨ２（２’－アミノ）、４’－チオ、二環式ヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）からなる群から独立して選択される、請求項９７に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リン酸基の各修飾が、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、またはホスホトリエステル修飾からなる群から独立して選択される、請求項９７に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記核酸塩基基の各修飾が、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基からなる群から独立して選択される、請求項９７に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも５０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項７６～１００のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも８０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項７６～１００のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも９０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項７６～１００のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、１００％化学修飾されたヌクレオチドを含む、請求項７６～１００のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、表２のｔｒａｃｒＲＮＡ １～ｔｒａｃｒＲＮＡ １１６からなる群から選択される修飾パターンを含む、請求項７６～１００のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 化学修飾されたガイドＲＮＡであって、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズできるガイド配列、及び（ｉｉ）リピート配列を含むｃｒＲＮＡ部分、ならびに
（ｂ）前記リピート配列に相補的であるアンチリピートヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分、を含み、
前記ｃｒＲＮＡ部分及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の一方または両方が、少なくとも１つの４’－チオＲＮＡ修飾を含む、前記化学修飾されたガイドＲＮＡ。 - 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１９、２２、２３、及び２４位のうちの１つ以上に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１９位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２２位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２３位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２４位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２２位及び２３位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２２位及び２４位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２３位及び２４位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１９、２２、２３、及び２４位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１２、１３、１８、２４、２７、３１、及び３２位のうちの１つ以上に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１２位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１３位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１８位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２４位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２７位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から３１位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から３２位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１２、１３、及び１８位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から２４位、２７位、３１位、及び３２位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の５’末端から１２、１３、１８、２４、２７、３１、及び３２位に４’－チオＲＮＡ修飾を含む、請求項１０６に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分及び／または前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、リボース基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの組み合わせの修飾からそれぞれ独立して選択される１つ以上の更なる修飾されたヌクレオチドを更に含む、請求項１０６～１２６のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リボース基の各修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、２’－ＮＨ２（２’－アミノ）、二環式ヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’－（Ｓ）－拘束エチル（Ｓ－ｃＥｔ）、拘束ＭＯＥ、及び２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸（２’，４’－ＢＮＡＮＣ）からなる群から独立して選択される、請求項１２７に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リン酸基の各修飾が、ホスホロチオエート、ホスホノアセテート（ＰＡＣＥ）、チオホスホノアセテート（チオＰＡＣＥ）、アミド、トリアゾール、ホスホネート、またはホスホトリエステル修飾からなる群から独立して選択される、請求項１２７に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 核酸塩基基の各修飾が、２－チオウリジン、４－チオウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、シュードウリジン、２，６－ジアミノプリン、イノシン、チミジン、５－メチルシトシン、５－置換ピリミジン、イソグアニン、イソシトシン、及びハロゲン化芳香族基からなる群から独立して選択される、請求項１２７に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分及び／または前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも５０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１０６～１３０のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分及び／または前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも８０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１０６～１３０のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分及び／または前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、少なくとも９０％修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１０６～１３０のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分及び／または前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、１００％化学修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１０６～１３０のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｓＮ＃ｍＮｍＧｓＵ＃ｓＵ＃ｓＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １１９）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｓＮｍＮｍＧｓＵｓＵｓＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２０）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｓＮｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２１）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｓＵｒＵ＃ｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２２）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｓＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２３）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｒＵ＃ｓＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２４）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｓＵｒＵ＃ｓＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２５）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｓＵｓＵｒＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２６）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｒＵ＃ｓＵｓＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２７）、
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｓＵ＃ｓＵ＃ｓＵ＃ｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １２９）、及び
ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮ＃ｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｆＮｒＮ＃ｒＮ＃ｆＮｆＮｒＮ＃ｍＮｍＧｓＵｓＵｓＵｆＵｆＡｍＧｍＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＵ（ｃｒＲＮＡ １３０）からなる群から選択されるｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｓＮ＝４’－チオＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである、請求項１０６～１３４のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。 - 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、表２のｔｒａｃｒＲＮＡ １～ｔｒａｃｒＲＮＡ １１６からなる群から選択される修飾パターンを含む、請求項１３５に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｓＵｓＵｍＡｒＡｍＡｍＡｓＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｓＵｍＡｒＧｓＵｒＣｍＣｒＧｓＵｓＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０７）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｓＵｓＵｍＡｒＡｍＡｍＡｓＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０８）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｓＵｍＡｒＧｓＵｒＣｍＣｒＧｓＵｓＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １０９）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｓＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１０）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｓＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１１）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｓＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１２）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｓＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１３）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｓＵｒＣｍＣｒＧｒＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１４）、
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｓＵｒＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１５）、及び
ｍＡ＃ｍＧ＃ｍＣ＃ｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＧｒＵｒＵｍＡｒＡｍＡｍＡｒＵｍＡｍＡｍＧｍＧｒＣｒＵｍＡｒＧｒＵｒＣｍＣｒＧｒＵｓＵｍＡｍＵｍＣｍＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣ＃ｍＵ＃ｍＵ＃ｍＵ（ｔｒａｃｒＲＮＡ １１６）からなる群から選択されるｔｒａｃｒＲＮＡ部分修飾パターンを含み、
ここで、ｒＮ＝ＲＮＡ、ｍＮ＝２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ｆＮ＝２’－フルオロＲＮＡ、ｓＮ＝４’－チオＲＮＡ、Ｎ＃Ｎ＝ホスホロチオエート結合、及びＮ＝任意のヌクレオチドである、請求項１０６～１３４のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。 - 前記ｃｒＲＮＡ部分が、表１のｃｒＲＮＡ １～ｃｒＲＮＡ １３４からなる群から選択される修飾パターンを含む、請求項１３７に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ガイドＲＮＡにコンジュゲートされた少なくとも１つの部分を更に含む、請求項１～１３８のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記少なくとも１つの部分が、前記ｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端、前記ｃｒＲＮＡ部分の３’末端、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端、及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の３’末端のうちの少なくとも１つにコンジュゲートされる、請求項１３９に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記少なくとも１つの部分が、前記ガイドＲＮＡの細胞取り込みを増加させる、請求項１３９に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記少なくとも１つの部分が、前記ガイドＲＮＡの特定の組織分布を促進する、請求項１３９に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記少なくとも１つの部分が、脂肪酸、ステロイド、セコステロイド、脂質、ガングリオシド類似体、ヌクレオシド類似体、エンドカンナビノイド、ビタミン、受容体リガンド、ペプチド、アプタマー、及びアルキル鎖からなる群から選択される、請求項１３９に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記少なくとも１つの部分が、コレステロール、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ドコサン酸（ＤＣＡ）、リトコール酸（ＬＡ）、ＧａｌＮＡｃ、両親媒性ブロックコポリマー（ＡＢＣ）、親水性ブロックコポリマー（ＨＢＣ）、ポロキサマー、Ｃｙ５、及びＣｙ３からなる群から選択される、請求項１３９に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記少なくとも１つの部分が、リンカーを介して前記ガイドＲＮＡにコンジュゲートされる、請求項１３９に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記リンカーが、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ポリペプチド、多糖、及びブロックコポリマーからなる群から選択される、請求項１４５に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記少なくとも１つの部分が、修飾された脂質である、請求項１４５に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 修飾された脂質が分枝状脂質である、請求項１４７に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 修飾された脂質が、式Ｉ、
式Ｉ：Ｘ－ＭＣ（＝Ｙ）Ｍ－Ｚ－［Ｌ－ＭＣ（＝Ｙ）Ｍ－Ｒ］ｎ、
（式中、Ｘは、前記脂質を前記ガイドＲＮＡに連結する部分であり、各Ｙは、独立して、酸素または硫黄であり、各Ｍは、独立して、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり、Ｚは、２本または３本（「ｎ」）の鎖の化学修飾されたガイドＲＮＡへの連結を可能にする分岐基であり、Ｌは、任意選択のリンカー部分であり、各Ｒは、独立して、長さが２～３０原子の飽和、一価不飽和もしくは多価不飽和の直鎖もしくは分岐鎖部分、ステロール、または他の疎水性基である）の分枝状脂質である、請求項１４７に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。 - 修飾された脂質が、頭部基修飾された脂質である、請求項１４７に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 修飾された脂質が、式ＩＩ、
式ＩＩ：Ｘ－ＭＣ（＝Ｙ）Ｍ－Ｚ－［Ｌ－ＭＣ（＝Ｙ）Ｍ－Ｒ］ｎ－Ｌ－Ｋ－Ｊ、
（式中、Ｘは、前記脂質を前記ガイドＲＮＡに連結する部分であり、各Ｙは、独立して、酸素または硫黄であり、各Ｍは、独立して、ＣＨ２、ＮＨ、Ｎ－アルキル、ＯまたはＳであり、Ｚは、２本または３本（「ｎ」）の鎖の化学修飾されたガイドＲＮＡへの連結を可能にする分岐基であり、各Ｌは、独立して、任意選択のリンカー部分であり、Ｒは、長さ２～３０原子の飽和、一価不飽和もしくは多価不飽和の直鎖もしくは分岐鎖部分、ステロール、または他の疎水性基であり、Ｋは、ホスフェート、スルフェート、またはアミドであり、Ｊは、アミノアルカンまたは四級アミノアルカン基である）の頭部基修飾された脂質である、請求項１４７に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。 - 前記ガイドＲＮＡが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｓ９（ＧｅｏＣａｓ９）からなる群から選択されるＣａｓ９ヌクレアーゼに結合する、請求項１～１５１のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記Ｃａｓ９が、活性が変化したバリアントＣａｓ９である、請求項１５２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記バリアントＣａｓ９が、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、触媒失活（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｄｅａｄ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、超正確（ｈｙｐｅｒ ａｃｃｕｒａｔｅ）Ｃａｓ９（ＨｙｐａＣａｓ９）、高忠実度Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－ＨＦ）、特異性強化型（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）Ｃａｓ９（ｅＣａｓ９）、及び拡張ＰＡＭ Ｃａｓ９（ｘＣａｓ９）からなる群から選択される、請求項１５３に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- Ｃａｓ９のオフターゲット活性が、修飾されていないガイドＲＮＡと比較して低下する、請求項１５２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- Ｃａｓ９のオンターゲット活性が、修飾されていないガイドＲＮＡと比較して増加する、請求項１５２に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分の前記３’末端を前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の前記５’末端に連結するヌクレオチドまたは非ヌクレオチドループまたはリンカーを更に含む、請求項１～１５７のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記非ヌクレオチドリンカーは、エチレングリコールオリゴマーリンカーを含む、請求項１５７に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ヌクレオチドループが化学修飾される、請求項１５７に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ヌクレオチドループが、ＧＡＡＡのヌクレオチド配列を含む、請求項１５７に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 前記ｃｒＲＮＡ部分が、１～２０個のホスホロチオエート修飾を含む、請求項１～１６０のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 修飾されていないガイドＲＮＡに対して、少なくとも約５０％の活性を含む、請求項１～１６０のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ。
- 細胞に、
先行請求項のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ、及び
ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼまたはＲＮＡガイドされたヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むゲノム編集システムを投与することを含む、前記細胞内の標的遺伝子の発現を変化させる、方法。 - 前記標的遺伝子が生物内の細胞内にある、請求項１６３に記載の方法。
- 前記標的遺伝子の発現がノックアウトされるか、またはノックダウンされる、請求項１６３に記載の方法。
- 前記標的遺伝子の配列が修飾、編集、修正、または増強される、請求項１６３に記載の方法。
- 前記ガイドＲＮＡ及び前記ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼが、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む、請求項１６３に記載の方法。
- 前記ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｓ９（ＧｅｏＣａｓ９）からなる群から選択される、請求項１６３に記載の方法。
- 前記Ｃａｓ９が、活性が変化したバリアントＣａｓ９である、請求項１６８に記載の方法。
- 前記バリアントＣａｓ９が、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、触媒失活（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｄｅａｄ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、超正確（ｈｙｐｅｒ ａｃｃｕｒａｔｅ）Ｃａｓ９（ＨｙｐａＣａｓ９）、高忠実度Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－ＨＦ）、特異性強化型（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）Ｃａｓ９（ｅＣａｓ９）、及び拡張ＰＡＭ Ｃａｓ９（ｘＣａｓ９）からなる群から選択される、請求項１６９に記載の方法。
- 前記ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドがベクターを含む、請求項１６３に記載の方法。
- 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１７１に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルス（ＬＶ）ベクターである、請求項１７２に記載の方法。
- 前記ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが合成ｍＲＮＡを含む、請求項１６３に記載の方法。
- 前記標的遺伝子の発現が少なくとも約２０％低減される、請求項１６３～１７４のいずれか１項に記載の方法。
- 先行請求項のいずれか１項に記載の化学修飾されたガイドＲＮＡ、及び
ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼまたはＲＮＡガイドされたヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集システム。 - 前記ＲＮＡガイドされたヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、及びＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｓ９（ＧｅｏＣａｓ９）からなる群から選択される、請求項１７６に記載のＣＲＩＳＰＲゲノム編集システム。
- 前記Ｃａｓ９が、活性が変化したバリアントＣａｓ９である、請求項１７６に記載のＣＲＩＳＰＲゲノム編集システム。
- 前記バリアントＣａｓ９が、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、触媒失活（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｄｅａｄ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、超正確（ｈｙｐｅｒ ａｃｃｕｒａｔｅ）Ｃａｓ９（ＨｙｐａＣａｓ９）、高忠実度Ｃａｓ９（Ｃａｓ９－ＨＦ）、特異性強化型（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）Ｃａｓ９（ｅＣａｓ９）、及び拡張ＰＡＭ Ｃａｓ９（ｘＣａｓ９）からなる群から選択される、請求項１７８に記載のＣＲＩＳＰＲゲノム編集システム。
- Ｃａｓ９のオフターゲット活性が、修飾されていないガイドＲＮＡと比較して低下する、請求項１７６に記載のＣＲＩＳＰＲゲノム編集システム。
- Ｃａｓ９のオンターゲット活性が、修飾されていないガイドＲＮＡと比較して増加する、請求項１７６に記載のＣＲＩＳＰＲゲノム編集システム。
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