CN115956120A - 用于crispr基因组编辑的修饰的指导rna - Google Patents

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Abstract

提供了化学修饰的crRNA和tracrRNA。提供了具有5′和/或3′缀合部分的crRNA和tracrRNA。提供了在所述crRNA的重复区或所述tracrRNA的反重复区具有修饰的crRNA和tracrRNA。提供了使用crRNA和tracrRNA用CRISPR核酸酶进行基因组编辑的方法，以及用于执行相同方法的试剂盒。

Description

用于CRISPR基因组编辑的修饰的指导RNA
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年5月12日提交的美国临时申请序列号63/023,313的权益，所述申请的全部公开内容以引用方式并入本文。
关于联邦政府赞助研究或开发的声明
本发明是根据美国国家卫生研究院(National Institutes ofHealth)授予的授权号TR002668在政府支持下进行的。政府对本发明具有一定的权利。
技术领域
本公开涉及用于CRISPR基因组编辑的修饰指导RNA的组合物和方法。
背景技术
CRISPR RNA指导的基因组工程化变革了人类遗传疾病和生物学的许多其他方面的研究。许多基于CRISPR的体内或体外基因组编辑治疗正在接近临床试验。这场变革的核心是在II类CRISPR-Cas系统中发现的微生物效应蛋白，诸如Cas9(II型)和Cas12a/Cpf1(V型)(Jinek等人Science 337,816-821(2012)；Gasiunas等人PNAS 109,E2579-E2586(2012)；Zetsche等人Cell 163,759-771(2015))。
最广泛使用的基因组编辑工具是来自化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)菌株SF370的II-A型Cas9(SpCas9)(Jinek等人，同上)。Cas9与CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)形成核糖核蛋白(RNP)复合物，用于在细菌和真核生物中有效切割DNA(图1)。crRNA含有经由与靶DNA碱基配对将Cas9RNP引导至特定基因座以形成R环的指导序列。这个过程需要预先识别原型间隔区相邻基序(PAM)，对于SpCas9来说，它是NGG。R环形成激活His-Asn-His(HNH)结构域和RuvC样核酸内切酶结构域，所述结构域分别切割DNA的靶链和非靶链，导致双链断裂(DSB)。
对于哺乳动物应用，Cas9及其指导RNA可以从DNA(例如病毒载体)、RNA(例如脂质纳米颗粒中的Cas9mRNA加指导RNA)表达，或作为核糖核蛋白(RNP)引入。Cas9的病毒递送引起有效编辑，但可能存在问题，因为Cas9及其指导的长期表达可能导致脱靶编辑，并且病毒载体可能引发强烈的宿主免疫反应(Mingozzi等人，Blood 122,23-36(2013))。Cas9的RNA和RNP递送平台是许多应用的病毒载体的合适替代品，并且最近已被证明是体内有效的基因组编辑工具(Yin等人Nature Biotechnology 35,1179(2017)；Lee等人eLife 6,e25312(2017))。Cas9的RNP递送也绕过了对Cas9表达的需求，从而加快了编辑。此外，作为mRNA或RNP递送的Cas9仅在细胞中短暂存在，因此表现出减少的脱靶编辑。例如，Cas9RNP已成功用于纠正人类胚胎中的肥厚型心肌病(HCM)，而没有可测量的脱靶效应(Ma等人Nature 548,413(2017))。
Cas9对基因组编辑的多功能性来源于其RNA指导的性质。SpCas9的crRNA通常包含20个核苷酸的指导区，然后是16个核苷酸的重复区(图1)。tracrRNA由与crRNA配对的反重复区组成，并且还包括三个茎环。在哺乳动物系统中的有效编辑需要所有这些二级结构元素(Hsu等人Nature Biotechnology 31,827(2013)。然而，现有的指导RNA存在一些局限性，这限制了它们在治疗应用中的效用。例如，现有的指导RNA可能会在循环中和细胞内快速降解。此外，指导RNA的化学修饰可能会降低稳定性和编辑效率。因此，本领域需要优化的指导RNA，当与CRISPR核酸酶(诸如Cas9)配对时，其在体内和离体保持有效的基因组编辑活性。
发明内容
本公开提供了用于CRISPR基因组编辑的化学修饰的指导RNA。在某些实施方案中，本公开的指导RNA被高度或完全化学修饰。本公开的指导RNA可以在体内或离体赋予若干优点，包括稳定性、提高的效力和/或减少的脱靶效应。此外，在某些实施方案中，本公开的修饰的RNA具有降低的免疫原性，例如降低的诱导先天免疫反应的能力。
在某些方面，本公开提供了一种化学修饰的指导RNA，所述指导RNA包含：(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，其中所述crRNA部分包含至少50％的修饰核苷酸；并且其中所述crRNA部分包含1至10个2'-脱氧修饰的核糖基团。
在一个实施方案中，修饰的核苷酸各自独立地包含核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。
在一个实施方案中，核糖基团的每个修饰独立地选自由2'-O-甲基、2'-氟、2'-脱氧、2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、2'-NH2(2'-氨基)、4'-硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2'-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE和2'-O,4'-C-氨基亚甲基桥联核酸(2',4'-BNANC)组成的组。
在一个实施方案中，至少80％的所述核糖基团被化学修饰。在一个实施方案中，至少90％的所述核糖基团被化学修饰。在一个实施方案中，100％的所述核糖基团被化学修饰。
在一个实施方案中，磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯和磷酸三酯修饰组成的组。
在一个实施方案中，核碱基的每个修饰独立地选自由2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
在一个实施方案中，指导RNA包含至少90％的修饰核苷酸。在一个实施方案中，指导RNA包含100％的修饰核苷酸。
在一个实施方案中，crRNA部分的至少一个核苷酸包含2'-脱氧化学修饰和硫代磷酸酯化学修饰中的每一种。
在一个实施方案中，从所述crRNA部分的5'端开始的位置4、5、6、12、15、16、19、22、23和24处的一个或多个核苷酸包含2'-脱氧化学修饰(例如，如SEQ ID NO:1所示的crRNA部分的5'端开始的位置4、5、6、12、15、16、19、22、23和24处的一个或多个核苷酸)。在一个实施方案中，从所述crRNA部分的5'端开始的位置4、5和6处的核苷酸包含2'-脱氧化学修饰和硫代磷酸酯化学修饰中的每一种。在一个实施方案中，从所述crRNA部分的5'端开始的位置12处的核苷酸包含2'-脱氧化学修饰和硫代磷酸酯化学修饰中的每一种。在一个实施方案中，从所述crRNA部分的5'端开始的位置15、16和19处的核苷酸包含2'-脱氧化学修饰和硫代磷酸酯化学修饰中的每一种。在一个实施方案中，从所述crRNA部分的5'端开始的位置22、23和24处的核苷酸包含2'-脱氧化学修饰和硫代磷酸酯化学修饰中的每一种。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA包含至少一个2'-脱氧修饰。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA包含以下crRNA部分修饰模式：crRNA 38、crRNA 40、crRNA 41、crRNA 42、crRNA 44、crRNA 52、crRNA 53、crRNA 54、crRNA 55、crRNA56、crRNA 57、crRNA 58、crRNA 59、crRNA 60、crRNA 61、crRNA 62、crRNA 63、crRNA 64、crRNA 65、crRNA 66、crRNA 67、crRNA 68、crRNA 69、crRNA 70、crRNA 71、crRNA 72、crRNA73、crRNA 74、crRNA 75、crRNA 76、crRNA 77、crRNA 78、crRNA 79、crRNA 80、crRNA 81、crRNA 82、crRNA 83、crRNA 84、crRNA 85、crRNA 86、crRNA 87、crRNA 88、crRNA 89、crRNA90、crRNA 91、crRNA 92或crRNA 93，如表1中所述。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA包含选自由以下组成的组的crRNA部分修饰模式：
mN#mN#mN#dN#dN#dN#mNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rU#mUmAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 38)；
mN#mN#mN#dN#dN#dN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA40)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNdN#dN#fNfNdN#mNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 41)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGdU#dU#dU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 42)；和
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNdN#fNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 44)，
其中rN＝RNA，mN＝2'-O-甲基RNA，fN＝2'-氟RNA，dN＝2'-脱氧RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA包含选自表2的tracrRNA 1-116中任何一个的tracrRNA部分修饰模式。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA包含选自由以下组成的组的tracrRNA部分修饰模式：
Figure BDA0004028928250000061
Figure BDA0004028928250000071
Figure BDA0004028928250000081
Figure BDA0004028928250000091
Figure BDA0004028928250000101
Figure BDA0004028928250000111
Figure BDA0004028928250000121
Figure BDA0004028928250000131
Figure BDA0004028928250000141
Figure BDA0004028928250000151
Figure BDA0004028928250000161
Figure BDA0004028928250000171
Figure BDA0004028928250000181
Figure BDA0004028928250000191
Figure BDA0004028928250000201
其中rN＝RNA，mN＝2'-O-甲基RNA，fN＝2'-氟RNA，dN＝2'-脱氧RNA，aN＝2'-NH2(2'-氨基RNA)，sN＝4'-硫代RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
在一个方面，本公开提供了一种化学修饰的指导RNA，所述指导RNA包含：(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，其中从所述crRNA部分的5'端开始的位置4、5和6处的核苷酸包含2'-氟化学修饰或硫代磷酸酯化学修饰。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA包含一种或多种其他化学修饰，其选自核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。
在一个实施方案中，核糖基团的每个修饰独立地选自由2'-O-甲基、2'-氟、2'-脱氧、2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、2'-NH2(2'-氨基)、4'-硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2'-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE或2'-O,4'-C-氨基亚甲基桥联核酸(2',4'-BNANC)组成的组。
在一个实施方案中，至少80％的所述核糖基团被化学修饰。在一个实施方案中，至少90％的所述核糖基团被化学修饰。在一个实施方案中，100％的所述核糖基团被化学修饰。
在一个实施方案中，磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯和磷酸三酯修饰组成的组。
在一个实施方案中，核碱基的每个修饰独立地选自由2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
在一个实施方案中，指导RNA包含至少90％的修饰核苷酸。在一个实施方案中，指导RNA包含100％的修饰核苷酸。
在一个实施方案中，从所述crRNA部分的5'端开始的位置4、5和6处的核苷酸包含2'-氟化学修饰。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA还包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置15、16、19、22、23和24中的一个或多个(例如，如从SEQ ID NO:1所示的crRNA部分的5'端开始的位置15、16、19、22、23和24中的一个或多个)处的2'-氟化学修饰。在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA还包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置15、16、19、22、23和24处的2'-氟化学修饰。
在一个实施方案中，从所述crRNA部分的5'端开始的位置4、5和6处的核苷酸包含硫代磷酸酯化学修饰。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA还包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置15、16、19、22、23和24中的一个或多个处的2'-氟化学修饰。在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA还包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置15、16、19、22、23和24处的2'-氟化学修饰。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA包含选自由以下组成的组的crRNA部分修饰模式：
mN#mN#mN#rN#rN#rN#mNmNmNmNrN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#mNmGrU#rU#rU#rU#rA#mGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 33)；
mN#mN#mN#rN#rN#rN#mNmNmNmNrN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#mNmGrUrUrUrUrAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 34)；
mN#mN#mN#rN#rN#rN#mNmNmNmNrN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#mNmGrUrUrUmUmAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 36)；
mN#mN#mN#rN#rN#rN#mNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rU#mUmAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 37)；
mN#mN#mN#rN#rN#rN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 39)；和
mN#mN#mN#fNfNfNmNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 45)，
其中rN＝RNA，mN＝2'-O-甲基RNA，fN＝2'-氟RNA，dN＝2'-脱氧RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA包含选自表2的tracrRNA 1-116中任何一个的tracrRNA部分修饰模式。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA包含选自由以下组成的组的tracrRNA部分修饰模式：
Figure BDA0004028928250000231
Figure BDA0004028928250000241
Figure BDA0004028928250000251
Figure BDA0004028928250000261
Figure BDA0004028928250000271
Figure BDA0004028928250000281
Figure BDA0004028928250000291
Figure BDA0004028928250000301
Figure BDA0004028928250000311
Figure BDA0004028928250000321
Figure BDA0004028928250000331
Figure BDA0004028928250000341
Figure BDA0004028928250000351
Figure BDA0004028928250000361
Figure BDA0004028928250000371
其中rN＝RNA，mN＝2'-O-甲基RNA，fN＝2'-氟RNA，dN＝2'-脱氧RNA，sN＝4'-硫代RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
在另一个方面，本公开提供了一种化学修饰的指导RNA，所述指导RNA包含：(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，其中所述crRNA部分包含选自由以下组成的组的修饰模式：
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNmNrN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 23)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#fNfNfNrN#mNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 24)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNfNmNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 25)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGfUrU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 26)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#fUrU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 27)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 28)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#fNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 29)；
mN#mN#mN#rNrNrNmNmNmNmNrNrNrNrNrNrNrNrNrNmNmGrUrUrUrUrAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 30)；
mN#mN#mN#rNrNrNmNmNmNmNmNrNrNrNrNrNrNrNrNmNmGrUrUrUrUrAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 31)；
mN#mN#mN#rNrNrNmNmNmNmNmNrNmNmNrNrNrNrNrNmNmGrUrUrUrUrAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 32)；
mN#mN#mN#rNrNrNmNmNmNmNrNrNrNrNrNrNrNrNrNmNmGrUrUrUmUmAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 35)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNrN#fNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 43)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNmNrN#fNfNrN#mNmGrU#rUrU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 46)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#mNfNfNrN#mNmGrU#rUrU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 47)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#mNfNfNmNmNmGrU#rUrU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 48)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGmUrU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 49)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#mUrU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 50)；和
mG#mG#mU#mGmAmGmCmUmCmUfUfAfUfUrU#rG#fCfGrU#mAmGrU#rU#mUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 51)，
其中rN＝RNA，mN＝2'-O-甲基RNA，fN＝2'-氟RNA，dN＝2'-脱氧RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
在一个实施方案中，tracr部分包含一个或多个修饰的核苷酸，所述核苷酸各自独立地选自核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。
在一个实施方案中，核糖基团的每个修饰独立地选自由2'-O-甲基、2'-氟、2'-脱氧、2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、2'-NH2(2'-氨基)、4'-硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2'-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE和2'-O,4'-C-氨基亚甲基桥联核酸(2',4'-BNANC)组成的组。
在一个实施方案中，至少50％的所述核糖基团被化学修饰。在一个实施方案中，至少80％的所述核糖基团被化学修饰。在一个实施方案中，100％的所述核糖基团被化学修饰。
在一个实施方案中，磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯和磷酸三酯修饰组成的组。
在一个实施方案中，核碱基的每个修饰独立地选自由2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
在一个实施方案中，tracrRNA部分包含至少50％的修饰核苷酸。在一个实施方案中，tracrRNA部分包含至少80％的修饰核苷酸。在一个实施方案中，tracrRNA部分包含至少90％的修饰核苷酸。在一个实施方案中，tracrRNA部分包含100％化学修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA包含选自表2的tracrRNA 1-116中任何一个的tracrRNA部分修饰模式。
在一个方面，本公开提供了一种化学修饰的指导RNA，所述指导RNA包含：(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，其中：所述crRNA部分包含选自由以下组成的组的修饰模式：
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#fNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 29)；
mN#mN#mN#rN#rN#rN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 39)；
mN#mN#mN#dN#dN#dN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 40)；和
mN#mN#mN#fNfNfNmNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 45)；并且
所述tracrRNA部分包含选自由以下组成的组的修饰模式：
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGfUfUmAfAmAmAfUmAmAmGmGfCfUmAfGfUfCmCfGfUfUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 8)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGfUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 9)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmAfUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 12)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUfCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 17)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCfGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 18)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArU#mAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 37)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrC#rUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 38)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrU#rCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 41)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGfCfUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 49)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArG#rU#rC#mCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 92)；和
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrC#rU#mArG#rU#rC#mCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 95)，
其中rN＝RNA，mN＝2'-O-甲基RNA，fN＝2'-氟RNA，dN＝2'-脱氧RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
在一个方面，本公开提供了一种化学修饰的指导RNA，所述指导RNA包含：(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，其中：所述crRNA部分和所述tracrRNA部分各自独立地包含至少一个化学修饰核苷酸；并且所述tracrRNA部分包含至少一个2'-脱氧修饰的核糖基团。
在一个实施方案中，修饰的核苷酸各自独立地包含核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。
在一个实施方案中，核糖基团的每个修饰独立地选自由2'-O-甲基、2'-氟、2'-脱氧、2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、2'-NH2(2'-氨基)、4'-硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2'-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE和2'-O,4'-C-氨基亚甲基桥联核酸(2',4'-BNANC)组成的组。
在一个实施方案中，至少80％的所述核糖基团被化学修饰。在一个实施方案中，至少90％的所述核糖基团被化学修饰。在一个实施方案中，100％的所述核糖基团被化学修饰。
在一个实施方案中，磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯和磷酸三酯修饰组成的组。
在一个实施方案中，核碱基的每个修饰独立地选自由2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
在一个实施方案中，指导RNA包含至少90％的修饰核苷酸。在一个实施方案中，指导RNA包含100％的修饰核苷酸。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA包含选自由以下组成的组的tracrRNA部分修饰模式：
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGdUdUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 74)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmAdAmAmAdUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 75)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGdUdUmAdAmAmAdUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 76)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGdCdUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 77)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmAdGdUdCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 78)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCdGdUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 79)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGdCdUmArGrUrCmCdGdUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 80)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGdCdUmAdGdUdCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 81)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmAdGdUdCmCdGdUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 82)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmAdGrUdCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 83)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCdGrUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 84)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGdCdUmAdGrUdCmCdGrUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 85)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmAdGrUdCmCdGrUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 86)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGdCrUmAdGrUdCmCdGrUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 87)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmAdUmAmAmGmGdCdUmArGdUdCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 104)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUdUmArAmAmAdUmAmAmGmGdCdUmAdGdUdCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 105)；和
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGdUdUmAdAmAmAdUmAmAmGmGdCdUmAdGdUdCmCdGdUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 106),
其中rN＝RNA，mN＝2'-O-甲基RNA，fN＝2'-氟RNA，dN＝2'-脱氧RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA包含选自表1的crRNA1-134中任何一个的crRNA部分修饰模式。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA包含选自由以下组成的组的crRNA部分修饰模式：
Figure BDA0004028928250000461
Figure BDA0004028928250000471
Figure BDA0004028928250000481
Figure BDA0004028928250000491
Figure BDA0004028928250000501
Figure BDA0004028928250000511
Figure BDA0004028928250000521
Figure BDA0004028928250000531
Figure BDA0004028928250000541
Figure BDA0004028928250000551
Figure BDA0004028928250000561
其中rN＝RNA，mN＝2'-O-甲基RNA，fN＝2'-氟RNA，dN＝2'-脱氧RNA，aN＝2'-NH2(2'-氨基RNA)，sN＝4'-硫代RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
在一个方面，本公开提供了一种化学修饰的指导RNA，所述指导RNA包含：(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，其中所述tracrRNA部分包含选自表2的tracrRNA 21-116中任何一个的修饰模式。
在一个方面，本公开提供了一种化学修饰的指导RNA，所述指导RNA包含：(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，其中所述tracrRNA部分包含选自由以下组成的组的修饰模式：
Figure BDA0004028928250000562
Figure BDA0004028928250000571
Figure BDA0004028928250000581
Figure BDA0004028928250000591
Figure BDA0004028928250000601
Figure BDA0004028928250000611
Figure BDA0004028928250000621
Figure BDA0004028928250000631
Figure BDA0004028928250000641
Figure BDA0004028928250000651
Figure BDA0004028928250000661
Figure BDA0004028928250000671
Figure BDA0004028928250000681
其中rN＝RNA，mN＝2'-O-甲基RNA，fN＝2'-氟RNA，dN＝2'-脱氧RNA，sN＝4'-硫代RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
在一个实施方案中，核糖基团的每个修饰独立地选自由2'-O-甲基、2'-氟、2'-脱氧、2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、2'-NH2(2'-氨基)、4'-硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2'-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE和2'-O,4'-C-氨基亚甲基桥联核酸(2',4'-BNANC)组成的组。
在一个实施方案中，至少50％的所述核糖基团被化学修饰。在一个实施方案中，至少80％的所述核糖基团被化学修饰。在一个实施方案中，100％的所述核糖基团被化学修饰。
在一个实施方案中，磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯和磷酸三酯修饰组成的组。
在一个实施方案中，核碱基的每个修饰独立地选自由2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
在一个实施方案中，crRNA部分包含至少50％的修饰核苷酸。在一个实施方案中，crRNA部分包含至少80％的修饰核苷酸。在一个实施方案中，crRNA部分包含至少90％的修饰核苷酸。在一个实施方案中，crRNA部分包含100％化学修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA包含选自表1的crRNA1-134中任何一个的crRNA部分修饰模式。
在一个方面，本公开提供了一种化学修饰的指导RNA，所述指导RNA包含：(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，其中所述crRNA部分包含至少一个2’-NH2(2’-氨基RNA)修饰。
在另一个方面，本公开提供了一种化学修饰的crRNA，其包含至少一个2'-NH2(2'-氨基RNA)修饰。
在某些实施方案中，嘧啶核苷酸包含2'-NH2修饰。在某些实施方案中，嘌呤核苷酸包含2'-NH2修饰。
在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5’端开始的位置16、19、22、23和24中的一个或多个(例如，从SEQ IDNO:1所示的crRNA部分的5'端开始的位置16、19、22、23和24中的一个或多个)处的2’-NH2(2’-氨基RNA)修饰。在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置16处的2'-NH2(2'-氨基)修饰。在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置19处的2'-NH2(2'-氨基)修饰。在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置22处的2'-NH2(2'-氨基)修饰。在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置23处的2'-NH2(2'-氨基)修饰。在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置24处的2'-NH2(2'-氨基)修饰。在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置22、23和24处的2'-NH2(2'-氨基)修饰。在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置19、22、23和24处的2'-NH2(2'-氨基)修饰。在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置16和19处的2'-NH2(2'-氨基)修饰。
在某些实施方案中，crRNA部分还包含一个或多个其他修饰的核苷酸，其各自独立地选自核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。
在某些实施方案中，核糖基团的每个修饰独立地选自由2'-O-甲基、2'-氟、2'-脱氧、2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、4'-硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2'-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE和2'-O,4'-C-氨基亚甲基桥联核酸(2',4'-BNANC)组成的组。
在某些实施方案中，磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯或磷酸三酯修饰组成的组。
在某些实施方案中，核碱基的每个修饰独立地选自由2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
在某些实施方案中，crRNA部分包含至少50％的修饰核苷酸(例如，50％的修饰核苷酸、55％的修饰核苷酸、60％的修饰核苷酸、65％的修饰核苷酸、70％的修饰核苷酸、75％的修饰核苷酸、80％的修饰核苷酸、85％的修饰核苷酸、90％的修饰核苷酸、95％的修饰核苷酸或100％的修饰核苷酸)。
在某些实施方案中，化学修饰的指导RNA包含选自由以下组成的组的crRNA部分修饰模式：
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNaNmNmGaUaUaUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 114)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNaNmNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 115)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGaUrU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 116)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#aUrU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 117)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#aUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 118)；和
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGaUaUaUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 128)，
其中rN＝RNA，mN＝2'-O-甲基RNA，fN＝2'-氟RNA，dN＝2'-脱氧RNA，aN＝2’-NH2(2’-氨基RNA)，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
在某些实施方案中，tracrRNA部分包含一个或多个修饰的核苷酸，其各自独立地选自核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。
在某些实施方案中，核糖基团的每个修饰独立地选自由2'-O-甲基、2'-氟、2'-脱氧、2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、2'-NH2(2'-氨基)、4'-硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2'-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE和2'-O,4'-C-氨基亚甲基桥联核酸(2',4'-BNANC)组成的组。
在某些实施方案中，磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯或磷酸三酯修饰组成的组。
在某些实施方案中，核碱基的每个修饰独立地选自由2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
在某些实施方案中，tracrRNA部分包含至少50％的修饰核苷酸(例如，50％的修饰核苷酸、55％的修饰核苷酸、60％的修饰核苷酸、65％的修饰核苷酸、70％的修饰核苷酸、75％的修饰核苷酸、80％的修饰核苷酸、85％的修饰核苷酸、90％的修饰核苷酸、95％的修饰核苷酸或100％的修饰核苷酸)。
在某些实施方案中，tracrRNA部分包含选自由以下组成的组的修饰模式：表2的tracrRNA 1至tracrRNA 116(例如，tracrRNA 1、tracrRNA 2、tracrRNA 3、tracrRNA 4、tracrRNA 5、tracrRNA 6、tracrRNA 7、tracrRNA 8、tracrRNA 9、tracrRNA 10、tracrRNA11、tracrRNA 12、tracrRNA 13、tracrRNA 14、tracrRNA 15、tracrRNA 16、tracrRNA 17、tracrRNA 18、tracrRNA 19、tracrRNA 20、tracrRNA 21、tracrRNA 22、tracrRNA 23、tracrRNA 24、tracrRNA 25、tracrRNA 26、tracrRNA 27、tracrRNA 28、tracrRNA 29、tracrRNA 30、tracrRNA 31、tracrRNA 32、tracrRNA 33、tracrRNA 34、tracrRNA 35、tracrRNA 36、tracrRNA 37、tracrRNA 38、tracrRNA 39、tracrRNA 40、tracrRNA 41、tracrRNA 42、tracrRNA 43、tracrRNA 44、tracrRNA 45、tracrRNA 46、tracrRNA 47、tracrRNA 48、tracrRNA 49、tracrRNA 50、tracrRNA 51、tracrRNA 52、tracrRNA 53、tracrRNA 54、tracrRNA 55、tracrRNA 56、tracrRNA 57、tracrRNA 58、tracrRNA 59、tracrRNA 60、tracrRNA 61、tracrRNA 62、tracrRNA 63、tracrRNA 64、tracrRNA 65、tracrRNA 66、tracrRNA 67、tracrRNA 68、tracrRNA 69、tracrRNA 70、tracrRNA 71、tracrRNA 72、tracrRNA 73、tracrRNA 74、tracrRNA 75、tracrRNA 76、tracrRNA 77、tracrRNA 78、tracrRNA 79、tracrRNA 80、tracrRNA 81、tracrRNA 82、tracrRNA 83、tracrRNA 84、tracrRNA 85、tracrRNA 86、tracrRNA 87、tracrRNA 88、tracrRNA 89、tracrRNA 90、tracrRNA 91、tracrRNA 92、tracrRNA 93、tracrRNA 94、tracrRNA 95、tracrRNA 96、tracrRNA 97、tracrRNA 98、tracrRNA 99、tracrRNA 100、tracrRNA 101、tracrRNA 102、tracrRNA 103、tracrRNA 104、tracrRNA 105、tracrRNA106、tracrRNA 107、tracrRNA 108、tracrRNA 109、tracrRNA 110、tracrRNA 111、tracrRNA 112、tracrRNA113、tracrRNA 114、tracrRNA 115，或tracrRNA 116)。
在一个方面，本公开提供了一种化学修饰的指导RNA，所述指导RNA包含：(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，其中所述crRNA部分和tracrRNA部分中的一者或两者包含至少一个4'-硫代RNA修饰。
在另一个方面，本公开提供了一种化学修饰的crRNA，其包含至少一个4'-硫代RNA修饰。
在另一个方面，本公开提供了一种化学修饰的tracrRNA，其包含至少一个4'-硫代RNA修饰。
在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5’端开始的位置19、22、23和24中的一个或多个(例如，从SEQ ID NO:1所示的crRNA部分的5'端开始的位置19、22、23和24中的一个或多个)处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置19处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置22处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置23处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置24处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置22和23处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置22和24处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置23和24处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置19、22、23和24处的4'-硫代RNA修饰。
在某些实施方案中，crRNA部分包含从所述crRNA部分的5’端开始的位置12、13、18、24、27、31和32中的一个或多个(例如，从SEQ ID NO:2所示的crRNA部分的5'端开始的位置12、13、18、24、27、31和32中的一个或多个)处的4’-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5'端开始的位置12处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5'端开始的位置13处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5'端开始的位置18处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5'端开始的位置24处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5'端开始的位置27处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5'端开始的位置31处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5'端开始的位置32处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5'端开始的位置12、13和18处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5'端开始的位置24、27、31和32处的4'-硫代RNA修饰。在某些实施方案中，tracrRNA部分包含从所述crRNA部分的5'端开始的位置12、13、18、24、27、31和32处的4'-硫代RNA修饰。
在某些实施方案中，crRNA部分和/或羧酸tracrRNA部分还包含一个或多个其他修饰的核苷酸，其各自独立地选自核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。
在某些实施方案中，核糖基团的每个修饰独立地选自由2'-O-甲基、2'-氟、2'-脱氧、2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、2'-NH2(2'-氨基)、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2'-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE和2'-O,4'-C-氨基亚甲基桥联核酸(2',4'-BNANC)组成的组。
在某些实施方案中，磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯或磷酸三酯修饰组成的组。
在某些实施方案中，核碱基的每个修饰独立地选自由2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
在某些实施方案中，crRNA部分和/或所述tracrRNA部分包含至少50％的修饰核苷酸(例如，50％的修饰核苷酸、55％的修饰核苷酸、60％的修饰核苷酸、65％的修饰核苷酸、70％的修饰核苷酸、75％的修饰核苷酸、80％的修饰核苷酸、85％的修饰核苷酸、90％的修饰核苷酸、95％的修饰核苷酸或100％的修饰核苷酸)。
在某些实施方案中，化学修饰的指导RNA包含选自由以下组成的组的crRNA部分修饰模式：
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNsN#mNmGsU#sU#sU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 119)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNsNmNmGsUsUsUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 120)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNsNmNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 121)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGsUrU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 122)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#sUrU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 123)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#sUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 124)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGsUrU#sUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 125)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGsUsUrU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 126)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#sUsUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 127)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGsU#sU#sU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 129)；和
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGsUsUsUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 130)，
其中rN＝RNA，mN＝2'-O-甲基RNA，fN＝2'-氟RNA，sN＝4'-硫代RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
在某些实施方案中，tracrRNA部分包含选自由以下组成的组的修饰模式：表2的tracrRNA 1至tracrRNA 116(例如，tracrRNA 1、tracrRNA 2、tracrRNA 3、tracrRNA 4、tracrRNA 5、tracrRNA 6、tracrRNA 7、tracrRNA 8、tracrRNA 9、tracrRNA 10、tracrRNA11、tracrRNA 12、tracrRNA 13、tracrRNA 14、tracrRNA 15、tracrRNA 16、tracrRNA 17、tracrRNA 18、tracrRNA 19、tracrRNA 20、tracrRNA 21、tracrRNA 22、tracrRNA 23、tracrRNA 24、tracrRNA 25、tracrRNA 26、tracrRNA 27、tracrRNA 28、tracrRNA 29、tracrRNA 30、tracrRNA 31、tracrRNA 32、tracrRNA 33、tracrRNA 34、tracrRNA 35、tracrRNA 36、tracrRNA 37、tracrRNA 38、tracrRNA 39、tracrRNA 40、tracrRNA 41、tracrRNA 42、tracrRNA 43、tracrRNA 44、tracrRNA 45、tracrRNA 46、tracrRNA 47、tracrRNA 48、tracrRNA 49、tracrRNA 50、tracrRNA 51、tracrRNA 52、tracrRNA 53、tracrRNA 54、tracrRNA 55、tracrRNA 56、tracrRNA 57、tracrRNA 58、tracrRNA 59、tracrRNA 60、tracrRNA 61、tracrRNA 62、tracrRNA 63、tracrRNA 64、tracrRNA 65、tracrRNA 66、tracrRNA 67、tracrRNA 68、tracrRNA 69、tracrRNA 70、tracrRNA 71、tracrRNA 72、tracrRNA 73、tracrRNA 74、tracrRNA 75、tracrRNA 76、tracrRNA 77、tracrRNA 78、tracrRNA 79、tracrRNA 80、tracrRNA 81、tracrRNA 82、tracrRNA 83、tracrRNA 84、tracrRNA 85、tracrRNA 86、tracrRNA 87、tracrRNA 88、tracrRNA 89、tracrRNA 90、tracrRNA 91、tracrRNA 92、tracrRNA 93、tracrRNA 94、tracrRNA 95、tracrRNA 96、tracrRNA 97、tracrRNA 98、tracrRNA 99、tracrRNA 100、tracrRNA 101、tracrRNA 102、tracrRNA 103、tracrRNA 104、tracrRNA 105、tracrRNA 106、tracrRNA107、tracrRNA 108、tracrRNA 109、tracrRNA 110、tracrRNA 111、tracrRNA 112、tracrRNA113、tracrRNA 114、tracrRNA 115，或tracrRNA 116)。
在某些实施方案中，化学修饰的指导RNA包含选自由以下组成的组的tracrRNA部分修饰模式：
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGsUsUmArAmAmAsUmAmAmGmGrCsUmArGsUrCmCrGsUsUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 107)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGsUsUmArAmAmAsUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 108)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCsUmArGsUrCmCrGsUsUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 109)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGsUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 110)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUsUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 111)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmAsUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 112)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCsUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 113)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGsUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 114)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGsUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 115)；和
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUsUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 116)，
其中rN＝RNA，mN＝2'-O-甲基RNA，fN＝2'-氟RNA，sN＝4'-硫代RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
在某些实施方案中，crRNA部分包含选自由以下组成的组的修饰模式：表1的crRNA1至crRNA 134(例如crRNA 1、crRNA 2、crRNA 3、crRNA 4、crRNA 5、crRNA 6、crRNA 7、crRNA 8、crRNA 9、crRNA 10、crRNA 11、crRNA 12、crRNA 13、crRNA 14、crRNA 15、crRNA16、crRNA 17、crRNA 18、crRNA 19、crRNA 20、crRNA 21、crRNA 22、crRNA 23、crRNA 24、crRNA 25、crRNA 26、crRNA 27、crRNA 28、crRNA 29、crRNA 30、crRNA 31、crRNA 32、crRNA33、crRNA 34、crRNA 35、crRNA 36、crRNA 37、crRNA 38、crRNA 39、crRNA 40、crRNA 41、crRNA 42、crRNA 43、crRNA 44、crRNA 45、crRNA 46、crRNA 47、crRNA 48、crRNA 49、crRNA50、crRNA 51、crRNA 52、crRNA 53、crRNA 54、crRNA 55、crRNA 56、crRNA 57、crRNA 58、crRNA 59、crRNA 60、crRNA 61、crRNA 62、crRNA 63、crRNA 64、crRNA 65、crRNA 66、crRNA67、crRNA 68、crRNA 69、crRNA 70、crRNA 71、crRNA 72、crRNA 73、crRNA 74、crRNA 75、crRNA 76、crRNA 77、crRNA 78、crRNA 79、crRNA 80、crRNA 81、crRNA 82、crRNA 83、crRNA84、crRNA 85、crRNA 86、crRNA 87、crRNA 88、crRNA 89、crRNA 90、crRNA 91、crRNA 92、crRNA 93、crRNA 94、crRNA 95、crRNA 96、crRNA 97、crRNA 98、crRNA 99、crRNA 100、crRNA 101、crRNA 102、crRNA 103、crRNA 104、crRNA 105、crRNA 106、crRNA 107、crRNA108、crRNA 109、crRNA 110、crRNA 111、crRNA 112、crRNA 113、crRNA 114、crRNA 115、crRNA 116、crRNA 117、crRNA 118、crRNA 119、crRNA 120、crRNA 121、crRNA 122、crRNA123、crRNA 124、crRNA 125、crRNA 126、crRNA 127、crRNA 128、crRNA 129、crRNA 130、crRNA 131、crRNA 132、crRNA 133，或crRNA 134)。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA还包含与所述指导RNA缀合的至少一个部分。在一个实施方案中，至少一个部分缀合至所述crRNA部分的5'端、所述crRNA部分的3'端、所述tracrRNA部分的5'端或所述tracrRNA部分的3'端中的至少一个。
在一个实施方案中，至少一个部分增加所述指导RNA的细胞摄取。在一个实施方案中，至少一个部分促进所述指导RNA的特定组织分布。
在一个实施方案中，至少一个部分选自由脂肪酸、类固醇、开环固醇类化合物、脂质、神经节苷脂类似物、核苷类似物、内源性大麻素、维生素、受体配体、肽、适体和烷基链组成的组。
在一个实施方案中，至少一个部分选自由胆固醇、二十二碳六烯酸(DHA)、二十二烷酸(DCA)、石胆酸(LA)、GalNAc、两亲嵌段共聚物(ABC)、亲水性嵌段共聚物(HBC)、泊洛沙姆、Cy5和Cy3组成的组。
在一个实施方案中，至少一个部分经由接头缀合至所述指导RNA。在一个实施方案中，接头选自由乙二醇链、烷基链、多肽、多糖和嵌段共聚物组成的组。
在一个实施方案中，至少一个部分是修饰的脂质。在一个实施方案中，修饰的脂质是支链脂质。
在一个实施方案中，修饰的脂质是式I的支链脂质，式I：X-MC(＝Y)M-Z-[L-MC(＝Y)M-R]n，其中X是将脂质连接到所述指导RNA的部分，每个Y独立地是氧或硫，每个M独立地是CH2、NH、O或S，Z是允许两个或三个(“n”)链连接到化学修饰的指导RNA的支链基团，L是任选的接头部分，并且每个R独立地是长度为2至30个原子的饱和、单不饱和或多不饱和直链或支链部分、甾醇或其他疏水基团。在一个实施方案中，修饰的脂质是首基修饰的脂质。
在一个实施方案中，修饰的脂质是式II的首基修饰的脂质，式II：X–MC(＝Y)M–Z–[L–MC(＝Y)M–R]n–L–K–J，其中X是将脂质连接到所述指导RNA的部分，每个Y独立地是氧或硫，每个M独立地是CH2、NH、N-烷基、O或S，Z是允许两个或三个(“n”)链连接到化学修饰的指导RNA的支链基团，每个L独立地是任选的接头部分，并且R是长度为2至30个原子的饱和、单不饱和或多不饱和直链或支链部分、甾醇或其他疏水基团，K是磷酸盐、硫酸盐或酰胺，并且J是氨基烷烃或季氨基烷烃基团。
在一个实施方案中，指导RNA结合至选自由化脓性链球菌Cas9(SpCas9)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)Cas9(SaCas9)、脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)Cas9(NmCas9)、空肠弯曲杆菌(C.jejuni)Cas9(CjCas9)、和地芽孢杆菌(Geobacillus)Cas9(GeoCas9)组成的组的Cas9核酸酶。
在一个实施方案中，Cas9是具有改变的活性的变体Cas9。
在一个实施方案中，变体Cas9选自由Cas9切口酶(nCas9)、催化死亡Cas9(dCas9)、超精确Cas9(HypaCas9)、高保真Cas9(Cas9-HF)、增强的特异性Cas9(eCas9)和扩展的PAMCas9(xCas9)组成的组。
在一个实施方案中，相对于未经修饰的指导RNA，所述Cas9脱靶活性降低。
在一个实施方案中，相对于未经修饰的指导RNA，所述Cas9靶向活性增加。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA还包含将所述crRNA部分的3'端连接到所述tracrRNA部分的5'端的核苷酸或非核苷酸环或接头。
在一个实施方案中，非核苷酸接头包括乙二醇低聚物接头。在一个实施方案中，核苷酸环被化学修饰。在一个实施方案中，核苷酸环包含核苷酸序列GAAA。
在一个实施方案中，相对于未经修饰的指导RNA，所述修饰的指导RNA在重复和反重复区中包含增加的GC核苷酸含量。
在一个实施方案中，修饰的指导RNA在重复和反重复区中包含核糖修饰。
在一个实施方案中，重复和反重复修饰增强所述crRNA部分和所述tracrRNA部分之间配对的稳定性。
在一个实施方案中，crRNA部分包含指导RNA修饰模式NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCGAGCGC(SEQ ID NO:3)并且所述tracrRNA部分包含指导RNA修饰模式GCGCUCGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(SEQ ID NO:4)，其中N＝任何核苷酸。
在一个实施方案中，crRNA部分包含1至20个硫代磷酸酯修饰(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个硫代磷酸酯修饰)。
在一个实施方案中，相对于未经修饰的指导RNA，所述化学修饰的指导RNA包括至少约50％的活性(例如，相对于未经修饰的指导RNA，50％的活性、60％的活性、70％的活性、80％的活性、90％的活性、95％的活性或100％的活性)。
在某些方面，本公开提供了一种化学修饰的指导RNA，所述指导RNA包含：
(a)crRNA部分，其包括
mN#mN#mN#rN#rN#rN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 39)；和
tracrRNA部分，其包括
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrU#rCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 41)；
(b)crRNA部分，其包括
mN#mN#mN#dN#dN#dN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 40)；和
tracrRNA部分，其包括
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrU#rCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 41)；
(c)crRNA部分，其包括
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 20)；和
tracrRNA部分，其包括
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrU#rCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 41)；
(d)crRNA部分，其包括
mN#mN#mN#rN#rN#rN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 39)；和
tracrRNA部分，其包括
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGsUsUmArAmAmAsUmAmAmGmGrCsUmArGsUrCmCrGsUsUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 107)；
(e)crRNA部分，其包括
mN#mN#mN#dN#dN#dN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 40)；和
tracrRNA部分，其包括
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGsUsUmArAmAmAsUmAmAmGmGrCsUmArGsUrCmCrGsUsUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 107)；或
(f)crRNA部分，其包括
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 20)；和
tracrRNA部分，其包括
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGsUsUmArAmAmAsUmAmAmGmGrCsUmArGsUrCmCrGsUsUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 107)。
在一个方面，本公开提供了一种改变细胞中靶基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞施用基因组编辑系统，所述基因组编辑系统包含：上述任何实施方案的化学修饰的指导RNA；和RNA指导的核酸酶或编码RNA指导的核酸酶的多核苷酸。
在一个实施方案中，靶基因在生物体的细胞中。
在一个实施方案中，靶基因的表达被敲除或敲低。
在一个实施方案中，靶基因的序列被修饰、编辑、校正或增强。
在一个实施方案中，指导RNA和所述RNA指导的核酸酶组成核糖核蛋白(RNP)复合物。
在一个实施方案中，RNA指导的核酸酶选自由化脓性链球菌Cas9(SpCas9)、金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)、脑膜炎奈瑟菌Cas9(NmCas9)、空肠弯曲杆菌Cas9(CjCas9)、和地芽孢杆菌Cas9(GeoCas9)组成的组。
在一个实施方案中，Cas9是具有改变的活性的变体Cas9。在一个实施方案中，变体Cas9选自由Cas9切口酶(nCas9)、催化死亡Cas9(dCas9)、超精确Cas9(HypaCas9)、高保真Cas9(Cas9-HF)、增强的特异性Cas9(eCas9)和扩展的PAM Cas9(xCas9)组成的组。
在一个实施方案中，编码RNA指导的核酸酶的多核苷酸包含载体。在一个实施方案中，载体是病毒载体。在一个实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒(LV)载体。在一个实施方案中，编码RNA指导的核酸酶的多核苷酸包含合成mRNA。
在一个实施方案中，靶基因的表达降低至少约20％(例如，约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或100％)。
在一个方面，本公开提供了一种CRISPR基因组编辑系统，所述基因组编辑系统包含：上述任何实施方案的化学修饰的指导RNA；和RNA指导的核酸酶或编码RNA指导的核酸酶的多核苷酸。在一个实施方案中，RNA指导的核酸酶选自由化脓性链球菌Cas9(SpCas9)、金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)、脑膜炎奈瑟菌Cas9(NmCas9)、空肠弯曲杆菌Cas9(CjCas9)、和地芽孢杆菌Cas9(GeoCas9)组成的组。在一个实施方案中，Cas9是具有改变的活性的变体Cas9。在一个实施方案中，变体Cas9选自由Cas9切口酶(nCas9)、催化死亡Cas9(dCas9)、超精确Cas9(HypaCas9)、高保真Cas9(Cas9-HF)、增强的特异性Cas9(eCas9)和扩展的PAMCas9(xCas9)组成的组。在一个实施方案中，相对于未经修饰的指导RNA，所述Cas9脱靶活性降低。在一个实施方案中，相对于未经修饰的指导RNA，所述Cas9靶向活性增加。
附图说明
结合附图，根据以下说明性实施方案的详细描述，本公开的上述和其它特征和优点将得到更充分的理解。专利或申请文件含有至少一幅彩色绘图。专利局将根据请求和必要费用的支付提供有彩色附图的本专利或专利申请出版物副本。
图1A–图1C描绘了crRNA和tracrRNA的示意图。图1A是与靶基因组DNA配对时的crRNA(SEQ ID NO：1)和tracrRNA(SEQ ID NO：2)。图1B描绘了高度修饰的crRNA C20(SEQID NO:X)和高度修饰的tracrRNA T2(SEQ ID NO:X)。图1C描绘了完全修饰的crRNA C21(SEQ ID NO:X)和完全修饰的tracrRNA T8(SEQ ID NO:X)。
图2A-图2C描绘了与几种化学修饰的tracrRNA(T2、T6-T8)组合以形成化学修饰的crRNA：tracrRNA对的测试的几种其他化学修饰的crRNA(C10、C17-C22)。各种crRNA:tracrRNA对被用于HEK293T TLR测定以确定基因组编辑效率。C0和T0分别代表未经修饰的crRNA和未经修饰的tracrRNA。用20pmol(图2A)、100pmol(图2B)和8pmol(图2C)的Cas9、crRNA、tracrRNA RNP转染细胞。
图3A-图3C描绘了与最小修饰的crRNA C0(图3A)、高度修饰的crRNA C20(图3B)和完全修饰的crRNA C21(图3C)组合以形成化学修饰的crRNA:tracrRNA对的测试的几种其他化学修饰的tracrRNA(T9-T20)。各种crRNA:tracrRNA对被用于HEK293T TLR测定以确定基因组编辑效率。用20pmol的Cas9、crRNA、tracrRNA RNP转染细胞。
图4描绘了测试的几个crRNA(C23-C29)的编辑效率。TracrRNA T0、T2和T3与crRNA配对。使用了交通灯报告基因(Traffic Light Reporter)Multi-Cas变体1(TLR-MCV1)报告基因。此图示出了通过荧光激活细胞分选(FACS)分析获得的红色荧光(RF)细胞的百分比。数据是三个生物学平行测定的平均值，并且误差线代表s.e.m。
图5描绘了测试的几个crRNA(C30-C44)的编辑效率。TracrRNA T2与crRNA配对。使用了交通灯报告基因Multi-Cas变体1(TLR-MCV1)报告基因。此图示出了通过荧光激活细胞分选(FACS)分析获得的红色荧光(RF)细胞的百分比。数据是三个生物学平行测定的平均值，并且误差线代表s.e.m。
图6描绘了与tracrRNA T2、T9、T12、T17、T18、T38、T39和T41配对的crRNA C39、C40和C45的编辑效率。使用了交通灯报告基因Multi-Cas变体1(TLR-MCV1)报告基因。此图示出了通过荧光激活细胞分选(FACS)分析获得的红色荧光(RF)细胞的百分比。数据是三个生物学平行测定的平均值，并且误差线代表s.e.m。
图7描绘了与crRNA C40配对的几个tracrRNA的编辑效率。使用了交通灯报告基因Multi-Cas变体1a(TLR-MCV1a)报告基因。此图示出了通过荧光激活细胞分选(FACS)分析获得的红色荧光(RF)细胞的百分比。数据是三个生物学平行测定的平均值，并且误差线代表s.e.m。
图8描绘了与crRNA C40配对的tracrRNA T46至T106的编辑效率。使用了交通灯报告基因Multi-Cas变体1a(TLR-MCV1a)报告基因。此图示出了通过荧光激活细胞分选(FACS)分析获得的红色荧光(RF)细胞的百分比。数据是三个生物学平行测定的平均值，并且误差线代表s.e.m。
图9描绘了靶向内源性Pcsk9的修饰的crRNA的编辑效率。通过在小鼠Hepa 1-6细胞系中的Cas9RNP电穿孔测试RNA设计。此图示出了基于PCR的CRISPR编辑推理(ICE)分析和基因座的Sanger测序数据的插入缺失百分比。数据代表来自三个独立生物学平行测定的平均值，并且误差线代表s.e.m。
图10描绘了测试的几个crRNA(C52-C93)的编辑效率。TracrRNA T2与crRNA配对。使用了交通灯报告基因Multi-Cas变体1(TLR-MCV1)报告基因。每个crRNA靶向MCV1a序列。此图示出了通过荧光激活细胞分选(FACS)分析获得的红色荧光(RF)细胞的百分比。数据是三个生物学平行测定的平均值，并且误差线代表s.e.m。
图11A至图11C描绘了含有至少一个2'-氨基修饰或至少一个巯基修饰的几种crRNA的编辑效率。TracrRNA T2与crRNA配对。图11A中使用了TLR-MCV1报告基因。图11B中使用了稳定表达TLR-MCV1报告基因、SpCas9和未经修饰的tracrRNA的细胞系。图11C中使用了小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中的mTmG报告基因。此图示出了通过FACS分析获得的荧光细胞的百分比。数据是三个生物学平行测定的平均值，并且误差线代表s.e.m。
图12描绘了测试的几个tracrRNA(T107-T116)的编辑效率。CrRNA C20与tracrRNA配对。使用了TLR-MCV1报告基因或mTmG报告基因。此图示出了通过FACS分析获得的荧光细胞的百分比。数据是三个生物学平行测定的平均值，并且误差线代表s.e.m。
图13描绘了mTmG转基因小鼠在接受含有C20/T2对的RNP 6天后的GFP免疫组织化学染色。将注射了PBS的mTmG转基因小鼠用作阴性对照。
图14描绘了mTmG转基因小鼠在接受含有C20/T41对的RNP 6天后的GFP免疫组织化学染色。将注射了PBS的mTmG转基因小鼠用作阴性对照。
具体实施方式
本文提供了新的化学修饰的crRNA和tracrRNA，包括高度或完全化学修饰的crRNA和tracrRNA。在某些实施方案中，提供了具有5'和/或3'缀合部分的crRNA和tracrRNA。在其他实施方案中，提供了在crRNA的重复区或tracrRNA的反重复区中具有修饰的crRNA和tracrRNA。还提供了使用本公开的crRNA和tracrRNA用CRISPR核酸酶进行基因组编辑的方法以及用于执行相同方法的试剂盒。
除非本文另有定义，否则本文描述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学以及杂交结合使用的命名法是本领域众所周知的和常用的。本文提供的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法进行，并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述，除非另有说明。除非另有说明，否则酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域通常完成的或如本文所述。除非另有说明，否则与本文描述的分析化学、合成有机化学和医药化学结合使用的命名法和这些化学领域的实验室程序和技术是本领域众所周知的和常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送以及患者的治疗。
除非本文另有定义，否则本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。如果存在任何潜在的歧义，本文提供的定义优先于任何词典或外部定义。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。除非另行指出，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括(including)”以及其它形式诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。
为了使本公开可以更容易被理解，首先定义某些术语。
如本文所用，术语“指导RNA”或“gRNA”是指促进RNA指导的核酸酶(诸如Cas9)与靶序列(例如，基因组或游离基因序列)在细胞中的特异性缔合(或“靶向”)。
如本文所用，“模块化”或“双RNA”指导包含多于一个且通常是两个的单独的RNA分子，诸如CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)，它们通常例如通过形成双链体与彼此缔合。gRNA及其组成部分在整个文献中都有描述(参见，例如，Briner等人Mol.Cell,56(2),333-339(2014)，其以引用方式并入)。
如本文所用，“单分子gRNA”、“嵌合gRNA”或“单指导RNA(sgRNA)”包括单个RNA分子。sgRNA可以是连接在一起的crRNA和tracrRNA。例如，crRNA的3'端可以连接到tracrRNA的5'端。crRNA和tracrRNA可以例如通过桥接crRNA的互补区(在其3'端)和tracrRNA的互补区(在其5'端)的四核苷酸(例如GAAA)“四环”或“接头”序列连接成单个单分子或嵌合gRNA。
如本文所用，“重复”序列或区是在crRNA的3'端处或附近的核苷酸序列，其与tracrRNA的反重复序列互补。
如本文所用，“反重复”序列或区是在tracrRNA的5'端处或附近的核苷酸序列，其与crRNA的重复序列互补。
有关指导RNA结构和功能的更多细节，包括用于基因组编辑的gRNA/Cas9复合物，至少可以在Mali等人Science,339(6121),823-826(2013)；Jiang等人Nat.Biotechnol.31(3).233-239(2013)；和Jinek等人Science,337(6096),816-821(2012)中找到；所述文献以引用方式并入本文。
如本文所用，“指导序列”或“靶向序列”是指gRNA的核苷酸序列，无论是单分子的还是模块化的，所述核苷酸序列与需要编辑的细胞的基因组中的DNA序列内的靶结构域或靶多核苷酸完全或部分互补。指导序列通常长度为10-30个核苷酸，优选地长度为16-24个核苷酸(例如长度为16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸)，并且位于或接近Cas9gRNA的5'端。
如本文所用，“靶结构域”或“靶多核苷酸序列”是与gRNA的指导序列互补细胞基因组中的DNA序列。
除了靶向结构域之外，gRNA通常包含多个影响gRNA/Cas9复合物的形成或活性的结构域。例如，如上所述，由gRNA的第一和第二互补结构域形成的双链体结构(也称为重复:反重复双链体)与Cas9的识别(REC)叶相互作用并可能介导Cas9/gRNA复合物的形成(Nishimasu等人Cell 156:935-949(2014)；Nishimasu等人Cell 162(2),1113-1126(2015)，两者均以引用方式并入本文)。应该注意的是，第一和/或第二互补结构域可以含有一个或多个多聚腺苷酸区，其可以被RNA聚合酶识别为终止信号。因此，第一和第二互补结构域的序列被任选地修饰以消除这些区并促进gRNA的完全体外转录，例如通过使用Briner2014中描述的AG互换或AU互换。对第一和第二互补结构域的这些和其他类似修饰在本公开的范围内。
除了第一和第二互补结构域外，Cas9gRNA通常包括两个或更多个其他双链体区，这些区是体内核酸酶活性所必需的，但在体外则不一定(Nishimasu 2015，同上)。接近第二互补结构域的3'部分的第一个茎环被不同地称为“近端结构域”、“茎环1”(Nishimasu2014，同上；Nishimasu 2015，同上)和“纽带(nexus)”(Briner 2014，同上)。一个或多个其他茎环结构通常存在于gRNA的3'端附近，数量因物种而异：化脓性链球菌gRNA通常包含两个3'茎环(总共四个茎环结构，包括重复:反重复双链体)，而金黄色葡萄球菌和其他物种只具有一个(总共三个)。Briner2014中提供了按物种组织的保守茎环结构(和更普遍的gRNA结构)的描述，所述文献以引用方式并入本文。关于指导RNA的其他细节通常可以在WO2018026976A1中找到，其以引用方式并入本文。
图1示出了代表性指导RNA。
化学修饰的指导RNA
相对于未经修饰的或最小修饰的指导RNA，本公开的化学修饰的指导RNA具有提高的体内稳定性、提高的基因组编辑功效和/或降低的免疫毒性。
本公开的化学修饰的指导RNA含有一个或多个修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸包含核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合中的修饰。
核糖基团的化学修饰可包括但不限于2'-O-甲基、2'-氟、2'-脱氧、2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、2'-NH2(2'-氨基)、4'-硫代、2’-O-烯丙基、2’-O-氨基乙烷、2’-O-氰乙基、2’-O-乙缩醛酯，或双环核苷酸(诸如锁核酸(LNA))、2'-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE或2'-O,4'-C-氨基亚甲基桥联核酸(2',4'-BNANC)。
如本文所用，术语“4'-硫代”对应于核糖基团修饰，其中核糖的糖环氧被硫取代。
磷酸酯基团的化学修饰可包括但不限于硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯或磷酸三酯修饰。
在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA的crRNA部分包含1至20个硫代磷酸酯修饰(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个硫代磷酸酯修饰)。在一个实施方案中，化学修饰的指导RNA的crRNA部分包含1至20个硫代磷酸酯修饰(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个硫代磷酸酯修饰)并且相对于不包含硫代磷酸酯修饰的指导RNA包括至少约50％的活性(例如，相对于不包含硫代磷酸酯修饰的指导RNA，50％的活性、60％的活性、70％的活性、80％的活的性、90％的活性、95％的活性或100％的活性)。
核碱基的化学修饰可包括但不限于2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶或卤代芳族基团。
化学修饰的指导RNA可以在模块化或双RNA指导的crRNA部分和/或tracrRNA部分中具有一个或多个化学修饰。化学修饰的指导RNA还可以在单指导RNA中具有对单分子指导RNA的一个或多个化学修饰。
化学修饰的指导RNA可包含至少约50％至至少约100％化学修饰的核苷酸、至少约60％至至少约100％化学修饰的核苷酸、至少约70％至至少约100％化学修饰的核苷酸、至少约80％至至少约100％化学修饰的核苷酸、至少约90％至至少约100％化学修饰的核苷酸和至少约95％至至少约100％化学修饰的核苷酸。
化学修饰的指导RNA可包含至少约50％化学修饰的核苷酸、至少约60％化学修饰的核苷酸、至少约70％化学修饰的核苷酸、至少约80％化学修饰的核苷酸、至少约90％化学修饰的核苷酸、至少约95％化学修饰的核苷酸、至少约99％化学修饰的或100％(完全)化学修饰的核苷酸。
化学修饰的指导RNA可包含至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％化学修饰的核苷酸。
如本文所用，包含至少约80％化学修饰的核苷酸至至少约99％化学修饰的核苷酸的指导RNA被认为是“高度”修饰的。
如本文所用，包含100％化学修饰的核苷酸的指导RNA被认为是“完全”修饰的。
在某些示例性实施方案中，化学修饰的指导RNA可以在约50％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸处、在约60％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸处、在约70％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸处、在约80％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸处、在约90％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸处和在约95％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸处包含化学修饰的核糖基团。
在某些示例性实施方案中，化学修饰的指导RNA可以在约50％的指导RNA核苷酸处、在约60％的指导RNA核苷酸处、在约70％的指导RNA核苷酸处、在约80％的指导RNA核苷酸处、在约90％的指导RNA核苷酸处、在约95％的指导RNA核苷酸处、在约99％的指导RNA核苷酸处或在100％的指导RNA核苷酸处包含化学修饰的核糖基团。
在某些示例性实施方案中，化学修饰的指导RNA可以在约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的指导RNA核苷酸处包含化学修饰的核糖基团。
如本文所用，具有至少约80％化学修饰的核糖基团至至少约99％化学修饰的核糖基团的指导RNA被认为是“高度”修饰的。
如本文所用，具有100％化学修饰的核糖基团的指导RNA被认为是“完全”修饰的。
在某些示例性实施方案中，化学修饰的指导RNA可以在约50％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸、约60％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸、约70％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸、约80％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸、约90％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸和约95％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸处包含化学修饰的磷酸酯基团。
在某些示例性实施方案中，化学修饰的指导RNA可以在约50％的指导RNA核苷酸处、在约60％的指导RNA核苷酸处、在约70％的指导RNA核苷酸处、在约80％的指导RNA核苷酸处、在约90％的指导RNA核苷酸处、在约95％的指导RNA核苷酸处、在约99％的指导RNA核苷酸处或在100％的指导RNA核苷酸处包含化学修饰的磷酸基团。
在某些示例性实施方案中，化学修饰的指导RNA可以在约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的指导RNA核苷酸处包含化学修饰的磷酸基团。
如本文所用，具有至少约80％化学修饰的磷酸基团至至少约99％化学修饰的磷酸基团的指导RNA被认为是“高度”修饰的。
如本文所用，具有100％化学修饰的磷酸基团的指导RNA被认为是“完全”修饰的。
在某些示例性实施方案中，化学修饰的指导RNA可以在约50％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸、约60％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸、约70％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸、约80％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸、约90％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸和约95％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸处包含化学修饰的核碱基。
在某些示例性实施方案中，化学修饰的指导RNA可以在约50％的指导RNA核苷酸处、在约60％的指导RNA核苷酸处、在约70％的指导RNA核苷酸处、在约80％的指导RNA核苷酸处、在约90％的指导RNA核苷酸处、在约95％的指导RNA核苷酸处、在约99％的指导RNA核苷酸处或在100％的指导RNA核苷酸处包含化学修饰的核碱基。
在某些示例性实施方案中，化学修饰的指导RNA可以在约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的指导RNA核苷酸处包含化学修饰的核碱基。
如本文所用，具有至少约80％化学修饰的核碱基至至少约99％化学修饰的核碱基的指导RNA被认为是“高度”修饰的。
如本文所用，具有100％化学修饰的核碱基的指导RNA被认为是“完全”修饰的。
在某些示例性实施方案中，化学修饰的指导RNA可以在约50％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸、约60％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸、约70％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸、约80％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸、约90％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸和约95％的指导RNA核苷酸至约100％的指导RNA核苷酸处包含化学修饰的核糖基团、化学修饰的磷酸基团和化学修饰的核碱基的任何组合。
在某些示例性实施方案中，化学修饰的指导RNA可以在约50％的指导RNA核苷酸处、在约60％的指导RNA核苷酸处、在约70％的指导RNA核苷酸处、在约80％的指导RNA核苷酸处、在约90％的指导RNA核苷酸处、在约95％的指导RNA核苷酸处、在约99％的指导RNA核苷酸处或在100％的指导RNA核苷酸处包含化学修饰的核糖基团、化学修饰的磷酸基团和化学修饰的核碱基的任何组合。
在某些示例性实施方案中，化学修饰的指导RNA可以在约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的指导RNA核苷酸处包含化学修饰的核糖基团、化学修饰的磷酸基团和化学修饰的核碱基的任何组合。
如本文所用，具有至少约80％的化学修饰的核糖基团、磷酸基团和核碱基至至少约99％化学修饰的核碱基的指导RNA被认为是“高度”修饰的。
如本文所用，具有100％的化学修饰的核糖基团、磷酸基团和核碱基的指导RNA被认为是“完全”修饰的。
本公开的高度和完全化学修饰的指导RNA具有优于本领域中的最小修饰的指导RNA的几个优点。高度和完全化学修饰的指导RNA有望简化化学合成，进一步增强体内稳定性，并为末端附加的在基因组编辑的临床应用中促进递送和功效的化学功能提供支架。
指导RNA中使用的化学修饰模式使得指导RNA在与RNA指导的DNA核酸内切酶(例如Cas9)配对时的活性得以保持。
在一个实施方案中，相对于未经修饰的指导RNA，本公开的化学修饰的指导RNA包括至少约50％的活性(例如，相对于未经修饰的指导RNA，50％的活性、60％的活性、70％的活性、80％的活性、90％的活性、95％的活性或100％的活性)。
指导RNA的活性可以通过本领域已知的任何方法容易地确定。在一个实施方案中，用如下所述的交通灯报告基因(TLR)Multi-Cas变体1系统(TLR-MCV1)测量％活性。TLR-MCV1系统将提供％荧光细胞，其为％活性的量度。
示例性化学修饰模式描述于下表1和表2中。
表1–crRNA的示例性化学修饰模式
Figure BDA0004028928250000991
Figure BDA0004028928250001001
Figure BDA0004028928250001011
Figure BDA0004028928250001021
Figure BDA0004028928250001031
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Figure BDA0004028928250001051
Figure BDA0004028928250001061
Figure BDA0004028928250001071
Figure BDA0004028928250001081
表2–tracrRNA的示例性化学修饰模式
Figure BDA0004028928250001082
Figure BDA0004028928250001091
Figure BDA0004028928250001101
Figure BDA0004028928250001111
Figure BDA0004028928250001121
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Figure BDA0004028928250001141
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Figure BDA0004028928250001161
Figure BDA0004028928250001171
Figure BDA0004028928250001181
Figure BDA0004028928250001191
Figure BDA0004028928250001201
Figure BDA0004028928250001211
Figure BDA0004028928250001221
本领域技术人员将理解上表1中所述的示例性crRNA的前20个核苷酸的碱基序列针对特定靶标。这一20个核苷酸的碱基序列可以根据靶核酸而改变，但化学修饰保持不变。从5'到3'的示例性未经修饰的crRNA序列是NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCU(SEQID NO:1)，其中“N”对应于任何核苷酸(例如，A、U、G或C)。从5'到3'的示例性未经修饰的tracrRNA序列是AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU(SEQ ID NO:2)。
本领域技术人员还将理解，指导序列长度可以为10-30个核苷酸，优选地长度为16-24个核苷酸(例如长度为16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸)，并且位于或接近Cas9gRNA的5'端。
高亲和力重复/反重复指导RNA修饰
crRNA和tracrRNA通过在crRNA的重复区和tracrRNA的反重复区之间形成双链体而杂交在一起(见图1)。在某些实施方案中，模块化或双RNA、指导RNA在重复区和反重复区中具有修饰以增强两个区之间的亲和力并形成更强的双链体。
可以通过增加由重复区和反重复区形成的双链体中的GC核苷酸含量来增强高亲和力相互作用。还可以引入核苷酸修饰，诸如2'-氟和2'-O-甲基修饰，这会提高双链体的解链温度(Tm)。进一步的修饰包括使用正交和非天然存在的核苷酸。本文所述的各种重复区/反重复区修饰增强了双链体的稳定性，有助于防止crRNA和tracrRNA折叠成次优结构，从而促进更高的基因组编辑效率。
相对于单指导RNA(sgRNA)方法，使用模块化或双RNA指导RNA方法具有几个优点，包括相对于较长的sgRNA，更容易制备较短的crRNA和tracrRNA，以及相对于sgRNA，制造双RNA的成本降低。在重复和反重复区中具有修饰(包括高GC含量和2'-氟修饰)的示例性crRNA和tracrRNA显示在下表3和表4中。
表3.示例性修饰的重复crRNA。
Figure BDA0004028928250001241
应当理解，上述hiGC重复crRNA还可包含如上表1中列举的任何crRNA化学修饰模式。
表4.示例性修饰的重复tracrRNA
Figure BDA0004028928250001242
应当理解，上述hiGC反重复tracrRNA还可包含如上表2中列举的任何tracrRNA化学修饰模式。
指导RNA缀合物
本公开的化学修饰的指导RNA可以用末端缀合的部分修饰。如本文所用，“末端缀合的部分”或“部分”是指可以连接或附接到指导RNA的crRNA和/或tracrRNA的5'和/或3'末端的化合物。末端缀合的部分可以提供增加的稳定性、增加的穿透细胞膜的能力、增加细胞摄取、增加体内循环时间、充当细胞特异性导向试剂和/或提供监测细胞或组织特异性摄取的方法。
在某些实施方案中，末端缀合的部分缀合至指导RNA的crRNA部分的5'端。在某些实施方案中，末端缀合的部分缀合至指导RNA的crRNA部分的3'端。在某些实施方案中，末端缀合的部分缀合至指导RNA的tracrRNA部分的5'端。在某些实施方案中，末端缀合的部分缀合至指导RNA的tracrRNA部分的3'端。
在某些示例性实施方案中，末端缀合的部分包括但不限于脂肪酸、类固醇、开环固醇类化合物、脂质、神经节苷脂类似物、核苷类似物、内源性大麻素、维生素、受体配体、肽、适体、烷基链、荧光团、抗体、核定位信号等。
在某些示例性实施方案中，末端缀合的部分包括但不限于胆固醇、胆固醇-三甘醇(TEGChol)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十二烷酸(DCA)、石胆酸(LA)、GalNAc、两亲嵌段共聚物(ABC)、亲水性嵌段共聚物(HBC)、泊洛沙姆、Cy5、Cy3等。
在某些示例性实施方案中，至少一个末端缀合的部分是修饰的脂质，包括支链脂质(诸如式I中所示的结构)或首基修饰的脂质(诸如式II中所示的结构)。
式I：X–MC(＝Y)M–Z–[L–MC(＝Y)M–R]n
其中X是将脂质连接到指导RNA的部分，每个Y独立地是氧或硫，每个M独立地是CH2、NH、O或S，Z是允许两个或三个(“n”)链连接到结构的其余部分的支链基团，L是任选的接头部分，并且每个R独立地是长度为2至30个原子的饱和、单不饱和或多不饱和直链或支链部分、甾醇或其他疏水基团。
式II：X–MC(＝Y)M–Z–[L–MC(＝Y)M–R]n–L–K–J
其中X是将脂质连接到所述指导RNA的部分，每个Y独立地是氧或硫，每个M独立地是CH2、NH、N-烷基、O或S，Z是允许两个或三个(“n”)链连接到结构的其余部分的的支链基团，每个L独立地是任选的接头部分，并且R是长度为2至30个原子的饱和、单不饱和或多不饱和直链或支链部分、甾醇或其他疏水基团，K是磷酸盐、硫酸盐或酰胺，并且J是氨基烷烃或季氨基烷烃基团。
这些部分可以经由接头连接到指导RNA的末端核苷酸。示例性接头包括但不限于乙二醇链、烷基链、多肽、多糖、嵌段共聚物等。
在某些实施方案中，部分缀合到crRNA 23至crRNA 134(即，crRNA 23、crRNA 24、crRNA 25、crRNA 26、crRNA 27、crRNA 28、crRNA 29、crRNA 30、crRNA 31、crRNA 32、crRNA33、crRNA 34、crRNA 35、crRNA 36、crRNA 37、crRNA 38、crRNA 39、crRNA 40、crRNA 41、crRNA 42、crRNA 43、crRNA 44、crRNA 45、crRNA 46、crRNA 47、crRNA 48、crRNA 49、crRNA50、crRNA 51、crRNA 52、crRNA 53、crRNA 54、crRNA 55、crRNA 56、crRNA 57、crRNA 58、crRNA 59、crRNA 60、crRNA 61、crRNA 62、crRNA 63、crRNA 64、crRNA 65、crRNA 66、crRNA67、crRNA 68、crRNA 69、crRNA 70、crRNA 71、crRNA 72、crRNA 73、crRNA 74、crRNA 75、crRNA 76、crRNA 77、crRNA 78、crRNA 79、crRNA 80、crRNA 81、crRNA 82、crRNA 83、crRNA84、crRNA 85、crRNA 86、crRNA 87、crRNA 88、crRNA 89、crRNA 90、crRNA 91、crRNA 92、crRNA 93、crRNA 94、crRNA 95、crRNA 96、crRNA 97、crRNA 98、crRNA 99、crRNA 100、crRNA 101、crRNA 102、crRNA 103、crRNA 104、crRNA 105、crRNA 106、crRNA 107、crRNA108、crRNA 109、crRNA 110、crRNA 111、crRNA 112、crRNA 113、crRNA 114、crRNA 115、crRNA 116、crRNA 117、crRNA 118、crRNA 119、crRNA 120、crRNA 121、crRNA 122、crRNA123、crRNA 124、crRNA 125、crRNA 126、crRNA 127、crRNA 128、crRNA 129、crRNA 130、crRNA 131、crRNA 132、crRNA 133或crRNA 134)中任一个的5'端和/或3'端。
在某些实施方案中，部分缀合到tracrRNA 21至tracrRNA 116(即，tracrRNA 21、tracrRNA 22、tracrRNA 23、tracrRNA 24、tracrRNA 25、tracrRNA 26、tracrRNA 27、tracrRNA 28、tracrRNA 29、tracrRNA 30、tracrRNA 31、tracrRNA 32、tracrRNA 33、tracrRNA 34、tracrRNA 35、tracrRNA 36、tracrRNA 37、tracrRNA 38、tracrRNA 39、tracrRNA 40、tracrRNA 41、tracrRNA 42、tracrRNA 43、tracrRNA 44、tracrRNA 45、tracrRNA 46、tracrRNA 47、tracrRNA 48、tracrRNA 49、tracrRNA 50、tracrRNA 51、tracrRNA 52、tracrRNA 53、tracrRNA 54、tracrRNA 55、tracrRNA 56、tracrRNA 57、tracrRNA 58、tracrRNA 59、tracrRNA 60、tracrRNA 61、tracrRNA 62、tracrRNA 63、tracrRNA 64、tracrRNA 65、tracrRNA 66、tracrRNA 67、tracrRNA 68、tracrRNA 69、tracrRNA 70、tracrRNA 71、tracrRNA 72、tracrRNA 73、tracrRNA 74、tracrRNA 75、tracrRNA 76、tracrRNA 77、tracrRNA 78、tracrRNA 79、tracrRNA 80、tracrRNA 81、tracrRNA 82、tracrRNA 83、tracrRNA 84、tracrRNA 85、tracrRNA 86、tracrRNA 87、tracrRNA 88、tracrRNA 89、tracrRNA 90、tracrRNA 91、tracrRNA 92、tracrRNA 93、tracrRNA 94、tracrRNA 95、tracrRNA 96、tracrRNA 97、tracrRNA 98、tracrRNA 99、tracrRNA 100、tracrRNA 101、tracrRNA 102、tracrRNA 103、tracrRNA 104、tracrRNA105、tracrRNA 106、tracrRNA 107、tracrRNA 108、tracrRNA 109、tracrRNA 110、tracrRNA111、tracrRNA 112、tracrRNA 113、tracrRNA 114、tracrRNA 115或tracrRNA 116)中任一个的5'端和/或3'端。
具有缀合部分的示例性crRNA可以在下表5中找到。
表5.具有缀合部分的示例性crRNA。
Figure BDA0004028928250001271
Figure BDA0004028928250001281
Figure BDA0004028928250001291
其中：GalNAc–(N-乙酰半乳糖胺)3-40个部分；以及Cy3–花青3荧光染料
化学修饰的单指导RNA
如本文所述，本公开的化学修饰的指导RNA可以通过将crRNA的3'端连接到tracrRNA的5'端而构建为单指导RNA(sgRNA)。接头可以是寡核苷酸环，包括化学修饰的寡核苷酸环。在某些实施方案中，寡核苷酸环包含GAAA四环。接头可以是非核苷酸化学接头，包括但不限于乙二醇寡聚体(参见例如Pils等人Nucleic Acids Res.28(9):1859-1863(2000))。
RNA指导的核酸酶
根据本公开的RNA指导的核酸酶包括但不限于天然存在的II型CRISPR核酸酶，诸如Cas9，以及衍生自其或从其获得的其他核酸酶。可以用于本公开的示例性Cas9核酸酶包括但不限于化脓性链球菌Cas9(SpCas9)、金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)、脑膜炎奈瑟菌Cas9(NmCas9)、空肠弯曲杆菌Cas9(CjCas9)和地芽孢杆菌Cas9(GeoCas9)。在功能方面，RNA指导的核酸酶被定义为那些核酸酶：(a)与gRNA相互作用(例如，复合)；和(b)和gRNA一起，与包括以下的DNA的靶区域相关并且任选地切割或修饰包括以下的DNA的靶区域：(i)与gRNA的靶向结构域互补的序列和任选地，(ii)被称为“原型间隔区相邻基序”或“PAM”的其他序列，这将在下面更详细地描述。正如以下示例将说明的，RNA指导的核酸酶可以广义地通过它们的PAM特异性和切割活性来定义，即使共享相同PAM特异性或切割活性的单个RNA指导的核酸酶之间可能存在差异。技术人员将理解，本公开的一些方面涉及可以使用具有特定PAM特异性和/或切割活性的任何合适的RNA指导的核酸酶来实施的系统、方法和组合物。出于这个原因，除非另有说明，否则术语RNA指导的核酸酶应理解为一个通用术语，并不限于任何特定类型(例如，Cas9与Cpfl)、菌种(例如，化脓性链球菌与金黄色葡萄球菌)或变型(例如，全长与截短或分裂；天然存在的PAM特异性与工程化PAM特异性)。
各种RNA指导的核酸酶可能需要PAM和原型间隔区之间的不同顺序关系。一般而言，相对于顶部或互补链，Cas9识别位于原型间隔区5'的PAM序列为可视的。
除了识别PAM和原型间隔区的特定顺序方向外，RNA指导的核酸酶通常识别特定的PAM序列。例如，金黄色葡萄球菌Cas9识别NNGRRT的PAM序列，其中N序列紧邻gRNA靶向结构域识别的区的3'。化脓性链球菌Cas9识别NGG PAM序列。还应注意，工程化RNA指导的核酸酶可以具有不同于类似核酸酶(诸如衍生RNA指导的核酸酶的天然存在的变体，或具有与工程化RNA指导的核酸酶有最大氨基酸序列同源性的天然存在的变体)的PAM特异性的PAM特异性。识别替代PAM序列的修饰的Cas9如下所述。
RNA指导的核酸酶的特征还在于它们的DNA切割活性：天然存在的RNA指导的核酸酶通常在靶核酸中形成DSB，但已经产生了仅生成SSB的工程化变体(上文讨论；另见Ran2013，以引用方式并入本文)，或者根本不切割的工程化变体。
RNA指导的核酸酶Cas9可能是具有改变的活性的Cas9的变体。示例性变体Cas9核酸酶包括但不限于Cas9切口酶(nCas9)、催化死亡Cas9(dCas9)、超精确Cas9(HypaCas9)(Chen等人Nature,550(7676),407-410(2017))、高保真Cas9(Cas9-HF)(Kleintiver等人Nature529(7587),490-495(2016))、增强特异性Cas9(eCas9)(Slaymaker等人Science 351(6268),84-88(2016))和扩增的PAM Cas9(xCas9)(Hu等人Nature doi:10.1038/nature26155(2018))。
RNA指导的核酸酶可以与本公开的化学修饰的指导RNA组合以形成基因组编辑系统。RNA指导的核酸酶可以与化学修饰的指导RNA结合形成RNP复合物，所述复合物可以被递送到需要基因组编辑的细胞。RNA指导的核酸酶可以在需要基因组编辑的细胞中与单独递送的化学修饰的指导RNA一起表达。例如，RNA指导的核酸酶可以由多核苷酸(诸如载体或合成的mRNA)表达。载体可以是病毒载体，包括但不限于腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒(LV)载体。
对于本领域的技术人员来说，在不脱离本文所公开的实施方案的范围的情况下，可以使用合适的等效物对本文所述的方法进行其他合适的修饰和修改，这将是显而易见的。现已详细描述某些实施方案，通过参考以下实施例将使实施方案得到更清楚的理解，包括所述实施例仅为说明目的而不旨在限制本发明。
实施例
实施例1–合成化学修饰的crRNA和tracrRNA
crRNA和tracrRNA在Applied Biosystems 394DNA合成装置上以1微摩尔规模合成。BTT(0.25M在乙腈中，ChemGenes)用作活化剂。在吡啶:水(9:1)(TEDIA)中的0.05M碘用作氧化剂。DDTT(0.1M,ChemGenes)用作硫化剂。在DCM(TEDIA)中的3％TCA用作解块溶液。RNA在用Unylinker(约42μmol/g)功能化的
Figure BDA0004028928250001311
CPG上生长。将RNA和2'-OMe亚磷酰胺(ChemGenes)溶解在乙腈中至0.15M；每个碱基的偶联时间为10min。在室温下将核碱基用3:1NH4OH:EtOH溶液脱保护48小时。在65℃下使用DMSO:NEt3·3HF(4:1)溶液(500μL)3小时实现TBDMS基团的脱保护。然后通过在3MNaOAc(25μL)和n-BuOH(1mL)中沉淀来回收RNA寡核苷酸，并用冷的70％EtOH洗涤沉淀并重悬在1mL无RNA酶的水中。
crRNA和tracrRNA的纯化通过使用1260infinity系统和Agilent PL-SAX
Figure BDA0004028928250001321
色谱柱(150x 7.5mm,8μm)的高效液相色谱法进行。缓冲液A：在水中的30％乙腈；缓冲液B：在1M NaClO4(aq)中的30％乙腈。过量的盐用SephadexNap-10柱去除。
在Agilent 6530Q-TOF LC/MS系统上用电喷雾电离和负电离模式下的飞行时间离子分离分析crRNA和tracrRNA。使用Agilent Mass Hunter软件分析数据。缓冲液A：在水中的100mM六氟异丙醇和9mM三乙胺；缓冲液B：在甲醇中的100mM六氟异丙醇和9mM三甲胺。
实施例中使用的crRNA列举在下表6中。上面的表2列举了实施例中使用的tracrRNA。
表6.示例性crRNA。
Figure BDA0004028928250001322
Figure BDA0004028928250001331
Figure BDA0004028928250001341
Figure BDA0004028928250001351
Figure BDA0004028928250001361
Figure BDA0004028928250001371
Figure BDA0004028928250001381
Figure BDA0004028928250001391
Figure BDA0004028928250001401
Figure BDA0004028928250001411
Figure BDA0004028928250001421
Figure BDA0004028928250001431
Figure BDA0004028928250001441
Figure BDA0004028928250001451
实施例2–化学修饰的crRNA和tracrRNA的基因组编辑效率
先前的工作表明，crRNA和tracrRNA的几种化学修饰模式能够在提高血清稳定性的同时发挥活性(WO 2019/183000A1，以引用方式并入本文)。先前创建的修饰crRNA是C1至C22，并且先前创建的修饰tracrRNA是T1-T20(参见上面的表1和表2)。图2A至图2C展示了与修饰的tracrRNA配对的几个初始crRNA的活性。图3A至图3C展示了与C0(未经修饰生物)、C20和C21配对的几个初始tracrRNA的活性。从之前的这项工作中来说，需注意某些高度修饰的模式和完全修饰的模式会降低基因组编辑效率。本文描述的工作已导致鉴定出新的高度和完全化学修饰的指导RNA模式，所述模式保持高基因组编辑效率。
化学修饰的crRNA和tracrRNA筛选方法
细胞培养
筛选在表达交通灯报告基因(TLR)Multi-Cas变体1系统(TLR-MCV1)的HEK293T稳定细胞系中进行。HEK293T细胞在Dulbecco修饰的Eagle最低必需培养基(DMEM；LifeTechnologies)中培养。DMEM还补充有10％胎牛血清(FBS；Sigma)。细胞在加湿的37℃、5％CO2培养箱中生长。
交通灯报告基因(TLR)系统
交通灯报告基因(TLR)系统包括GFP(含有插入)，然后是帧失位mCherry。在双链断裂诱导后，非同源末端连接(NHEJ)修复事件的子集生成将mCherry置于框架中的插入缺失，从而导致红色荧光。因此，红色荧光的检测是编辑效率的读出。这一系统开发并进一步描述于Certo等人(Nat.Methods 8,671(2011))。这一系统被进一步开发用于测试本公开的修饰的crRNA和tracrRNA。TLRMulti-Cas变体1系统(TLR-MCV1)被建立以将原型间隔区相邻基序(PAM)引入多种替代CRISPR酶(化脓性链球菌(SpyCas9)、脑膜炎奈瑟菌(Nme1Cas9和Nme2Cas9)、空肠弯曲杆菌(CjeCas9)、金黄色葡萄球菌(SauCas9)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)(GeoCas9)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)细菌ND2006(LbaCas12a)、氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.)(AspCas12a)和新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)(FnoCas12))。还引入了其他SpyCas9编辑位点，从而产生编辑位点MCV1a和MCV1b。MCV1a靶标是GAGACAAAUCACCUGCCUCG，并且MCV1b靶标是UUUACCGUAUUCCACGAGGC。这些重叠的SpyCas9切割位点允许评估靶向同一位置的两个不同crRNA序列。
mTmG报告基因系统
mTmG报告基因系统是双荧光Cre报告基因，其在Cre介导的切除之前表达膜靶向串联二聚体Tomato(mT)，在切除后表达膜靶向绿色荧光蛋白(mG)。作为替代方案，可以通过在侧翼位置引入两个CRISPR介导的切口来切除tdTomato基因。这两个切口位点是相同的，因此可以用单指导RNA-Cas9RNP切割。报告基因系统可以在转基因小鼠中体内使用，或在细胞系中体外使用。在这里，报告基因被用在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中用于体外实验，并用在转基因小鼠中用于体内实验。当报告基因未经编辑(即，没有CRISPR编辑)时，表达tdTomato，导致红色荧光。如果成功在编辑中删除tdTomato基因，则表达GFP基因。因此，在mTmG报告基因系统中，较高水平的GFP荧光表明CRISPR编辑成功。本文所述的化学修饰的指导RNA的crRNA部分具有指导序列CGAAGUUAUAUUAAGGGUUC。报告基因更详细地描述于Muzumdar等人(Genesis.45(9):593-605.2007)，以引用方式并入本文。
Spy-Cas9的表达和纯化
使用表达来自化脓性链球菌的Cas9的pMCSG7载体。在这一构建体中，Cas9还含有三个核定位信号(NLS)。用3xNLS-SpyCas9构建体转化大肠杆菌(Escherichia coli)的Rosetta DE3菌株。对于3xNLS-SpyCas9的表达和纯化，使用了先前描述的方案(Jinek等人Science,337:816(2012))。细菌培养物在37℃下生长，直到OD600达到0.6。然后，将细菌培养物冷却至18℃，并添加1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG；Sigma)以诱导蛋白质表达。细胞过夜生长16-20小时。
收获细菌细胞并重悬在裂解缓冲液[50mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM咪唑]中。然后将10μg/mL溶菌酶(Sigma)添加到混合物中并在4℃下温育30分钟。随后添加1x HALT蛋白酶抑制剂混合物(ThermoFisher)。然后对细菌细胞进行超声处理并以18,000rpm的速度离心30分钟。然后上清液经受镍亲和色谱。然后使用使用5mL HiTrap S HP柱(GE)的阳离子交换色谱法进一步纯化含有SpyCas9的洗脱部分。随后通过使用Superdex-200柱(GE)的尺寸排阻色谱法进行最后一轮纯化。将纯化的蛋白质浓缩并快速冷冻以备后续使用。
转染HEK293T细胞
根据制造商的方案，使用Neon转染系统(ThermoFisher)对HEK293T细胞进行核转染。简而言之，将20皮摩尔的3xNLS-SpyCas9与25皮摩尔的crRNA:tracrRNA在缓冲液R(ThermoFisher)中混合，并在室温下温育20-30分钟。然后将这种Cas9RNP复合物与大约100,000个细胞混合，所述细胞已经重悬在缓冲液R中。用10μL Neon尖端对此混合物进行核转染，然后铺种到含有500μL DMEM和10％FBS的24孔板中。将细胞在加湿的37℃和5％CO2培养箱中储存2-3天。
流式细胞术分析
在来自Miltenyi Biotec的
Figure BDA0004028928250001481
VYB上分析核转染的HEK293T细胞。对于mCherry检测，黄色激光(561nm)用于激发，并且615/20nm滤光片用于检测发射。记录了至少20,000个事件，并使用
Figure BDA0004028928250001482
v10.4.1进行了后续分析。首先根据前向和侧向散射(FSC-A与SSC-A)分类细胞以消除碎片。然后使用FSC-A和FSC-H对细胞进行门控以选择单个细胞。最后，使用mCherry信号以选择mCherry表达细胞。在此应用中计算并报告了表达mCherry的细胞百分比，作为基于Cas9的基因组编辑的量度。
TIDE的插入缺失分析
按照制造商的建议，使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)从HEK293T细胞中收获基因组DNA。大约50ng的基因组DNA用于PCR扩增约700个碱基对的片段，随后使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)对其进行纯化。然后通过Sanger测序对PCR片段进行测序，并使用TIDE网络工具对跟踪文件进行插入缺失分析(Brinkman等人Nucleic AcidsResearch,42:e168(2014))。结果报告为％插入缺失率。
筛选新的化学修饰模式
指导结构和系统性方法用于在整个指导RNA中引入2'-OMe-RNA、2'-F-RNA、2'-脱氧和PS修饰。选择这些修饰是因为它们已被证明可以提高与RNA相关的稳定性、功效和免疫毒性。本文描述的策略产生了具有广泛和完全修饰版本的crRNA和tracrRNA的活性RNP复合物。图4和图5描绘了靶向MCV1a位点和MCV1b位点的crRNA模式C23-C44的筛选。crRNA C29、C39和C40表现出与先前开发的crRNA C20的功效类似的功效。crRNA C20、C29和C39是完全修饰的，即每个没有核糖修饰的核苷酸都具有磷酸二酯键修饰。然而，C20仍然含有6个未经修饰的核糖残基，而新的crRNA C39只有3个未经修饰的核糖，并且C29只有1个未经修饰的核糖。C40是新开发的完全修饰的crRNA，其组成中没有未经修饰的核糖。C45也是没有未经修饰的核糖部分的完全修饰的分子。与C40一样，这种组合物预期在体内非常稳定，尽管与crRNA C20相比其活性有所减弱。
还开发了新的tracrRNA化学修饰模式。图6描绘了与新模式T38、T39和T41相比的先前描述的tracrRNA模式T2、T9、T12、T17和T18的筛选。不同的tracrRNA与C21、C39、C40或C45配对。与旧的C21模式相比，新的crRNA C39、C40和C45在与所有tracrRNA配对时显示出更高的编辑效率。
几个新的tracrRNA比先前的tracrRNA T2修饰得更多。TracrRNA T41、T12和T17显示出比T2更高的活性。TracrRNA T9、T18、T37、T38和T92显示出与T2类似的效率，而T49和T95显示出比T2略微减弱的活性(图7和图8)。
与先前开发的crRNA C20或tracrRNA T2相比，在具有完全修饰的crRNA C45和高度修饰的tracrRNA T49和T95的人类细胞中观察到的功效损失可以被更高的体内稳定性抵消。在人类细胞中测试时，所有新开发的RNA在多种组合中都具有功能。
实施例3–有和没有靶向内源性人类基因的缀合物的化学修饰的crRNA:tracrRNA对
为了验证本公开的crRNA和tracrRNA设计与不同的指导序列(包括靶向内源性人类基因的那些)相容，通过靶向PCSK9基因测试了设计C29、C30、C40、C42和C45(图9)。crRNA与tracrRNA T2或T6配对，并且T2进一步以非缀合物或GalNAc缀合物形式使用。C29、C39、C40和C42也以非缀合物或GalNAc缀合物形式进行测试。通过在小鼠Hepa 1-6细胞系中的Cas9RNP电穿孔测试RNA设计。此图示出了基于PCR的CRISPR编辑推理(ICE)分析和基因座的Sanger测序数据的插入缺失百分比。数据代表来自三个独立生物学平行测定的平均值，并且误差线代表s.e.m。
这些结果表明，修饰的crRNA和tracrRNA设计也适用于内源性靶位点，并与crRNA和tracrRNA上的缀合物一起发挥作用。
实施例4–具有不同硫代磷酸酯含量的化学修饰的crRNA
设计、合成了其他化学修饰的crRNA，并测试了其基因组编辑效率。crRNA C52-C93在TLR测定中用MCV1a靶位点进行了测试。每个crRNA都与T41tracrRNA配对。将2pmol含有Cas9和各种crRNA和tracrRNA的RNP转染到上述TLR-MCV1系中，并检测出作为基因组编辑效率的代表的％mCherry表达。crRNA C52-C93含有与C40相同的化学修饰模式，除了相对于硫代磷酸酯的位置。crRNA序列显示在表6中。筛选显示含有至少多达20个硫代磷酸酯修饰的crRNA是可耐受的(图10)。
实施例5–含有2'-氨基RNA和/或4'-硫代RNA修饰的化学修饰的crRNA
设计、合成其他含有2'-氨基RNA或4'-硫代RNA(即，核糖中的糖环氧被硫取代)修饰的化学修饰的crRNA，并测试其基因编辑效率。crRNA C114-C134在TLR测定中用MCV1a靶位点或MCV1b靶位点，或者在mTmG报告基系统中进行了测试，其中每一个都在上面进行了描述。如图11A所示，将crRNA C116-C118和C122-C134与T2tracrRNA配对。将5pmol含有Cas9和各种crRNA和tracrRNA的RNP转染到上述TLR-MCV1系中，并检测出％mCherry表达。如图11B所示，crRNA C116-C118和C122-C134用于修饰的TLR-MCV1测定中，其中未经修饰的tracrRNA和SpCas9也稳定表达。将100pmol的每个crRNA转染到细胞系中并检测出％mCherry表达。最后，如图11C所示，crRNA C114-C127在上述mTmG报告基因测定中用5pmol含有Cas9与各种crRNA和T2tracrRNA的RNP进行了测试。crRNA序列显示在表6中。测试的每个crRNA具有一个或多个2'-氨基核糖修饰或一个或多个4'-硫代RNA修饰。筛选显示，当具有可以提高稳定性的其他化学修饰时，含有一个或多个2'-氨基核糖修饰或一个或多个4'-硫代RNA修饰的crRNA保持有效的基因编辑活性。
实施例6–含有或4'-硫代RNA修饰的化学修饰的tracrRNA
设计、合成其他含有4'-硫代RNA修饰的化学修饰的tracrRNA，并测试其基因编辑效率。tracrRNA T107-T116在TLR测定中或在mTmG报告基因系统中进行了测试，其中每一个都在上面进行了描述。T107-T116中的每一个都具有与T2相同的化学修饰模式，除了在一个或多个未经修饰的残基处引入4'-硫代RNA修饰。将5pmol含有Cas9与各种tracrRNA和C20crRNA的RNP转染到TLR-MCV1系或mTmG系中并检测荧光。tracrRNA序列显示在表2中。如图12所示，所有测试的tracrRNA都保留了有效的基因编辑活性。在先前未经修饰的位置包含4'-硫代RNA修饰提供了更接近100％化学修饰的tracRNA。例如，T107具有除了5个核苷酸外的全部修饰。
实施例7–体内基因编辑
各种化学修饰的指导RNA在体外显示出显著的基因编辑活性，同时具有增强的稳定性(例如，血清稳定性)。接下来在mTmG转基因小鼠中确定了选择的化学修饰的指导RNA的体内活性。由选择的crRNA和tracrRNA以及Cas9组成的RNP以150-200pmol的剂量纹状体内(IS)注射到小鼠体内。注射后六天，对小鼠脑组织进行染色以检测GFP表达。使用了指导RNAcrRNA/tracrRNA对：C20/T2、C29/T2、C20/T41和C29/T41。如图13所示，GFP在接受含有C20/T2的RNP的小鼠的脑组织中表达。如图14所示，GFP在接受含有C20/T41的RNP的小鼠的脑组织中表达。数据显示化学修饰的指导RNA能够在体内进行基因编辑活动。

Claims (181)

1.一种化学修饰的指导RNA，其包含：
(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和
(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，
其中所述crRNA部分包含至少50％的修饰核苷酸；并且
其中所述crRNA部分包含1至10个2′-脱氧修饰的核糖基团。
2.如权利要求1所述的化学修饰的指导RNA，其中所述修饰的核苷酸各自独立地包含核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。
3.如权利要求2所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核糖基团的每个修饰独立地选自由2′-O-甲基、2′-氟、2′-脱氧、2′-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、2′-NH2(2′-氨基)、4′-硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2′-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE和2′-O，4′-C-氨基亚甲基桥联核酸(2′，4′-BNANC)组成的组。
4.如权利要求2所述的化学修饰的指导RNA，其中至少80％的所述核糖基团是化学修饰的。
5.如权利要求2所述的化学修饰的指导RNA，其中至少90％的所述核糖基团是化学修饰的。
6.如权利要求2所述的化学修饰的指导RNA，其中100％的所述核糖基团是化学修饰的。
7.如权利要求2所述的化学修饰的指导RNA，其中所述磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯和磷酸三酯修饰组成的组。
8.如权利要求2所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核碱基的每个修饰独立地选自由2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2，6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
9.如权利要求1所述的化学修饰的指导RNA，其中所述指导RNA包含至少90％的修饰核苷酸。
10.如权利要求1所述的化学修饰的指导RNA，其中所述指导RNA包含100％的修饰核苷酸。
11.如前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分的至少一个核苷酸包含2′-脱氧化学修饰和硫代磷酸酯化学修饰中的每一种。
12.如前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中从所述crRNA部分的5′端开始的位置4、5、6、12、15、16、19、22、23和24处的一个或多个核苷酸包含2′-脱氧化学修饰。
13.如前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中从所述crRNA部分的5′端开始的位置4、5和6处的核苷酸包含2′-脱氧化学修饰和硫代磷酸酯化学修饰中的每一种。
14.如前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中从所述crRNA部分的5′端开始的位置12处的核苷酸包含2′-脱氧化学修饰和硫代磷酸酯化学修饰中的每一种。
15.如前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中从所述crRNA部分的5′端开始的位置15、16和19处的核苷酸包含2′-脱氧化学修饰和硫代磷酸酯化学修饰中的每一种。
16.如前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中从所述crRNA部分的5′端开始的位置22、23和24处的核苷酸包含2′-脱氧化学修饰和硫代磷酸酯化学修饰中的每一种。
17.如前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自由以下组成的组的crRNA部分修饰模式：
mN#mN#mN#dN#dN#dN#mNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rU#mUmAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 38)；
mN#mN#mN#dN#dN#dN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 40)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNdN#dN#fNfNdN#mNmGrU#rU#rU＃fUfAmGmAmGmCmUmAmU＃mG#mC#mU(crRNA 41)；
mN#mN＃mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN＃rN#fNfNrN#mNmGdU#dU#dU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 42)；和
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNdN#fNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 44)，
其中rN＝RNA，mN＝2′-O-甲基RNA，fN＝2′-氟RNA，dN＝2′-脱氧RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
18.如前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自表2的tracrRNA2-116中任一个的tracrRNA部分修饰模式。
19.一种化学修饰的指导RNA，其包含：
(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和
(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，
其中从所述crRNA部分的5′端开始的位置4、5和6处的核苷酸包含2′-氟化学修饰或硫代磷酸酯化学修饰。
20.如权利要求19所述的化学修饰的指导RNA，其包含一种或多种其他化学修饰，所述修饰选自核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。
21.如权利要求20所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核糖基团的每个修饰独立地选自由2′-O-甲基、2′-氟、2′-脱氧、2′-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、2′-NH2(2′-氨基)、4′-硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2′-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE和2′-O，4′-C-氨基亚甲基桥联核酸(2′，4′-BNANC)组成的组。
22.如权利要求20所述的化学修饰的指导RNA，其中至少80％的所述核糖基团是化学修饰的。
23.如权利要求20所述的化学修饰的指导RNA，其中至少90％的所述核糖基团是化学修饰的。
24.如权利要求20所述的化学修饰的指导RNA，其中100％的所述核糖基团是化学修饰的。
25.如权利要求20所述的化学修饰的指导RNA，其中所述磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯和磷酸三酯修饰组成的组。
26.如权利要求20所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核碱基的每个修饰独立地选自由2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
27.如权利要求19-26中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述指导RNA包含至少90％的修饰核苷酸。
28.如权利要求19-26中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述指导RNA包含100％的修饰核苷酸。
29.如权利要求19-28中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中从所述crRNA部分的5′端开始的位置4、5和6处的核苷酸包含2′-氟化学修饰。
30.如权利要求29所述的化学修饰的指导RNA，其还包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置15、16、19、22、23和24中的一个或多个处的2′-氟化学修饰。
31.如权利要求29所述的化学修饰的指导RNA，其还包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置15、16、19、22、23和24处的2′-氟化学修饰。
32.如权利要求19-28中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中从所述crRNA部分的5′端开始的位置4、5和6处的核苷酸包含硫代磷酸酯化学修饰。
33.如权利要求32所述的化学修饰的指导RNA，其还包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置15、16、19、22、23和24中的一个或多个处的2′-氟化学修饰。
34.如权利要求32所述的化学修饰的指导RNA，其还包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置15、16、19、22、23和24处的2′-氟化学修饰。
35.如权利要求19-34中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自由以下组成的组的crRNA部分修饰模式：
mN#mN#mN#rN#rN#rN＃mNmNmNmNrN#rN#rN#rN＃rN＃rN#rN＃rN#rN#mNmGrU＃rU＃rU#rU#rA#mGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 33)；
mN#mN＃mN#rN#rN#rN#mNmNmNmNrN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#N#mNmGrUrUrUrUrAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#rmU(crRNA 34)；
mN#mN#mN#rN#rN#rN#mNmNmNmNrN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#rN#N#mNmGrUrUrUmUmAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 36)；
mN#mN#mN#rN#rN#rN#mNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU＃rU#mUmAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 37)；
mN#mN#mN#rN#rN＃rN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 39)；和
mN#mN#mN#fNfNfNmNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 45)，
其中rN＝RNA，mN＝2′-O-甲基RNA，fN＝2′-氟RNA，dN＝2′-脱氧RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
36.如权利要求19-35中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自表2的tracrRNA2-116中任一个的tracrRNA部分修饰模式。
37.一种化学修饰的指导RNA，其包含：
(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和
(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，
其中所述crRNA部分包含选自由以下组成的组的修饰模式：
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNmNrN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC＃mU(crRNA23)；
mN#mN＃mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#fNfNfNrN#mNmGrU#rU#rU＃fUfAmGmAmGmCmUmAmU＃mG#mC＃mU(，crRNA24)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNfNmNmGrU#rU＃rU＃fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA25)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN＃rN＃fNfNrN＃mNmGfUrU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA26)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#fUrU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA27)；
mN#mN#mN＃mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mGG#mC#mU(crRNA28)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#fNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 29)；
mN#mN#mN#NrNrNmNmNmNmNrNrNrNrNrNrNrNrNrNmNmGrUrUrUrUrAmGmAmGmCmUmAmU#mGG#mC#mU(crRNA 30)；
mN#mN#mN#rNrNrNmNmNmNmNmNrNrNrNrNrrNrNrNmNmGrUrUrUrUrAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 31)；
mN#mN#mN#rNrNrNmNmNmNmNmNrNmNmNrNrNrNrNrNmNmGrUrUrUrUrAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 32)；
mN#mN#mN#NrNrNmNmNmNmNrNrNrNrNrNrNrNrNrNmNmGrUrUrUmUmAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 35)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNrN#fNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 43)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNmNrN#fNfNrN#mNmGrU#rUrU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG＃mC#mU(crRNA 46)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN＃mNfNfNrN＃mNmGrU#rUrU＃fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA47)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN＃mNfNfNmNmNmGrU#rUrU＃fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA48)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN＃rN#fNfNrN#mNmGmUrU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 49)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#mUrU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU (crRNA 50)：和
mG#mG#mU#mGmAmGmCmUmCmUfUfAfUfUrU#rG#fCfGrU#mAmGrU#rU#mUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG＃mC＃mU(crRNA 51)，
其中rN＝RNA，mN＝2′-O-甲基RNA，fN＝2′-氟RNA，dN＝2′-脱氧RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
38.如权利要求37所述的化学修饰的指导RNA，其中所述tracr部分包含一个或多个修饰的核苷酸，其各自独立地选自核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。
39.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核糖基团的每个修饰独立地选自由2′-O-甲基、2′-氟、2′-脱氧、′-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、2′-NH2(2′-氨基)、4′-硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2′-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE和2′-O，4′-C-氨基亚甲基桥联核酸(2′,4′-BNANC)组成的组。
40.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中至少50％的所述核糖基团是化学修饰的。
41.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中至少80％的所述核糖基团是化学修饰的。
42.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中100％的所述核糖基团是化学修饰的。
43.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中所述磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯和磷酸三酯修饰组成的组。
44.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核碱基的每个修饰独立地选自由2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
45.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中tracrRNA部分包含至少50％的修饰核苷酸。
46.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中tracrRNA部分包含至少80％的修饰核苷酸。
47.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中tracrRNA部分包含至少90％的修饰核苷酸。
48.如权利要求38所述的化学修饰的指导RNA，其中tracrRNA部分包含100％的化学修饰核苷酸。
49.如权利要求37所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自表2的tracrRNA 2-116中任一个的tracrRNA部分修饰模式。
50.一种化学修饰的指导RNA，其包含：
(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和
(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，
其中：
所述crRNA部分包含选自由以下组成的组的修饰模式：
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNNfNNfNNrN#rN#fNNfNNrN#mNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU＃mG#mC#mU(crRNA 20)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#fNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 29)；
mN#mN#mN＃rN#rN#rN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 39)；
mN#mN＃mN#dN#dN#dN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 40)；
mN#mN#mN#fNfNfNmNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 45)；
mN#mN＃mN＃dN＃dN#dN#mNmNmNmNfNfNfNfNfN#fN#fNfNfN#NmGfU#fU#fU#fU#fA#mGmAmGmC#mU#mA#mU#mG#mC#mU(crRNA81)；和
mN#mN#mN#dN#dN#dN#mNmNmNmNfNfNfNfNfNfNfNfNfNmNmGfUfUfUfUfA＃mG＃mA#mG#mC#mU#mA#mU#mG#mC#mU(crRNA85)；并且
所述tracrRNA部分包含选自由以下组成的组的修饰模式：
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGfUfUmAfAmAmAfUmAmAmGmGfCfUmAfGfUfCmCfGfUfUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU＃mU#mU(tracrRNA 8)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGfUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA9)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmAfUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU＃mU#mU(tracrRNA 12)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUfCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA17)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCfGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA18)；
mA＃mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArU＃mAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 37)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrC#rUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 38)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrU#rCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 41)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGfCfUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA49)；
mA#mG＃mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArG#rU＃rC#mCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC＃mU＃mU#mU(tracrRNA 92)；
mA#mG＃mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrC#rU#mArG#rU#rC#mCrGrUrUmAmUmCmamAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 95)；和
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGsUsUmArAmAmAsUmAmAmGmGrCsUmArGsUrCmCrGsUsUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA107)，
其中rN＝RNA，mN＝2′-O-甲基RNA，fN＝2′-氟RNA，dN＝2′-脱氧RNA，aN＝2′-NH2(2′-氨基RNA)，sN＝4′-硫代RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
51.一种化学修饰的指导RNA，其包含：
(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和
(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，
其中：
所述crRNA部分和所述tracrRNA部分各自独立地包含至少一个化学修饰的核苷酸；并且
所述tracrRNA部分包含至少一个2′-脱氧修饰的核糖基团。
52.如权利要求51所述的化学修饰的指导RNA，其中所述修饰的核苷酸各自独立地包含核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。
53.如权利要求52所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核糖基团的每个修饰独立地选自由2′-O-甲基、2′-氟、2′-脱氧、2′-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、2′-NH2(2′-氨基)、4′-硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2′-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE和2′-O，4′-C-氨基亚甲基桥联核酸(2′，4′-BNANC)组成的组。
54.如权利要求52所述的化学修饰的指导RNA，其中至少80％的所述核糖基团是化学修饰的。
55.如权利要求52所述的化学修饰的指导RNA，其中至少90％的所述核糖基团是化学修饰的。
56.如权利要求52所述的化学修饰的指导RNA，其中100％的所述核糖基团是化学修饰的。
57.如权利要求52所述的化学修饰的指导RNA，其中所述磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯和磷酸三酯修饰组成的组。
58.如权利要求52所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核碱基的每个修饰独立地选自由2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2，6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
59.如权利要求51所述的化学修饰的指导RNA，其中所述指导RNA包含至少90％的修饰核苷酸。
60.如权利要求51所述的化学修饰的指导RNA，其中所述指导RNA包含100％的修饰核苷酸。
61.如权利要求51-60中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自由以下组成的组的tracrRNA部分修饰模式：
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGdUdUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA74)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmAdAmAmAdUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA75)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGdUdUmAdAmAmAdUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA76)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGdCdUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA77)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmAdGdUdCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA78)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCdGdUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU＃mU#mU(tracrRNA 79)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGdCdUmArGrUrCmCdGdUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA80)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGdCdUmAdGdUdCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA81)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmAdGdUdCmCdGdUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA82)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmAdGrUdCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA83)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCdGrUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA84)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGdCdUmAdGrUdCmCdGrUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmgmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA85)；
mA#mG#mC＃mAmUmAmgmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmAdGrUdCmCdGrUdUmAmUmCmAroamCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 86)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGdCrUmAdGrUdCmCdGrUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA87)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmAdUmAmAmGmGdCdUmArGdUdCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU＃mU(tracrRNA 104)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUdUmArAmAmAdUmAmAmGmGdCdUmAdGdUdCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC＃mU＃mU#mU(tracrRNA 105)；和
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGdUdUmAdAmAmAdUmAmAmGmGdCdUmAdGdUdCmCdGdUdUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA106)，
其中rN＝RNA，mN＝2′-O-甲基RNA，fN＝2′-氟RNA，dN＝2′-脱氧RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
62.如权利要求51-61中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自表1的crRNA 1-134中任一个的crRNA部分修饰模式。
63.一种化学修饰的指导RNA，其包含：
(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和
(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，
其中所述tracrRNA部分包含选自表2的tracrRNA21-116中任一个的修饰模式。
64.如权利要求63所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含一个或多个修饰的核苷酸，其各自独立地选自核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。
65.如权利要求64所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核糖基团的每个修饰独立地选自由2′-O-甲基、2′-氟、2′-脱氧、2′-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、2′-NH2(2′-氨基)、4′-硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2′-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE和2′-O,4′-C-氨基亚甲基桥联核酸(2′，4′-BNANC)组成的组。
66.如权利要求64所述的化学修饰的指导RNA，其中至少50％的所述核糖基团是化学修饰的。
67.如权利要求64所述的化学修饰的指导RNA，其中至少80％的所述核糖基团是化学修饰的。
68.如权利要求64所述的化学修饰的指导RNA，其中100％的所述核糖基团是化学修饰的。
69.如权利要求64所述的化学修饰的指导RNA，其中所述磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯或磷酸三酯修饰组成的组。
70.如权利要求64所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核碱基的每个修饰独立地选自由2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
71.如权利要求64所述的化学修饰的指导RNA，其中crRNA部分包含至少50％的修饰核苷酸。
72.如权利要求64所述的化学修饰的指导RNA，其中crRNA部分包含至少80％的修饰核苷酸。
73.如权利要求64所述的化学修饰的指导RNA，其中crRNA部分包含至少90％的修饰核苷酸。
74.如权利要求64所述的化学修饰的指导RNA，其中crRNA部分包含100％的化学修饰核苷酸。
75.如权利要求63所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自表1的crRNA 1-134中任一个的crRNA部分修饰模式。
76.一种化学修饰的指导RNA，其包含：
(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和
(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，
其中所述crRNA部分包含至少一个2′-NH2(2′-氨基RNA)修饰。
77.如权利要求76所述的化学修饰的指导RNA，其中嘧啶核苷酸包含所述2’-NH2修饰。
78.如权利要求76所述的化学修饰的指导RNA，其中嘌呤核苷酸包含所述2’-NH2修饰。
79.如权利要求76-78中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置16、19、22、23和24中的一个或多个处的2′-NH2(2′-氨基RNA)修饰。
80.如权利要求76-79中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置16处的2′-NH2(2′-氨基)修饰。
81.如权利要求76-79中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置19处的2′-NH2(2′-氨基)修饰。
82.如权利要求76-79中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置22处的2′-NH2(2′-氨基)修饰。
83.如权利要求76-79中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置23处的2′-NH2(2′-氨基)修饰。
84.如权利要求76-79中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置24处的2′-NH2(2′-氨基)修饰。
85.如权利要求76-79中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置22、23和24处的2′-NH2(2′-氨基)修饰。
86.如权利要求76-79中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置19、22、23和24处的2′-NH2(2′-氨基)修饰。
87.如权利要求76-79中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置16和19处的2′-NH2(2′-氨基)修饰。
88.如权利要求76-87中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分还包含一个或多个其他修饰的核苷酸，其各自独立地选自核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。
89.如权利要求88所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核糖基团的每个修饰独立地选自由2′-O-甲基、2′-氟、2′-脱氧、2′-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、4′-硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2′-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE和2′-O，4′-C-氨基亚甲基桥联核酸(2′，4′-BNANC)组成的组。
90.如权利要求88所述的化学修饰的指导RNA，其中所述磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯或磷酸三酯修饰组成的组。
91.如权利要求88所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核碱基的每个修饰独立地选自由2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
92.如权利要求76-91中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中crRNA部分包含至少50％的修饰核苷酸。
93.如权利要求76-91中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中crRNA部分包含至少80％的修饰核苷酸。
94.如权利要求76-91中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中crRNA部分包含至少90％的修饰核苷酸。
95.如权利要求76-91中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中crRNA部分包含100％的化学修饰核苷酸。
96.如权利要求76-91中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自由以下组成的组的crRNA部分修饰模式：
mN#mN#mN＃mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN＃rN＃fNfNaNmNmGaUaUaUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 114)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN＃rN＃fNfNaNmNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG＃mC#mU(crRNA 115)；
mN＃mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGaUrU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 116)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#aUrU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 117)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#aUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 118)；和
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGaUaUaUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC＃mU(crRNA 128)，
其中rN＝RNA，mN＝2′-O-甲基RNA，fN＝2′-氟RNA，dN＝2′-脱氧RNA，aN＝2’-NH2(2’-氨基RNA)，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
97.如权利要求76-96中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中tracrRNA部分包含一个或多个修饰的核苷酸，其各自独立地选自核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。
98.如权利要求97所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核糖基团的每个修饰独立地选自由2′-O-甲基、2′-氟、2′-脱氧、2′-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、2′-NH2(2′-氨基)、4′-硫代、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2′-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE和2′-O，4′-C-氨基亚甲基桥联核酸(2′,4′-BNANC)组成的组。
99.如权利要求97所述的化学修饰的指导RNA，其中所述磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯或磷酸三酯修饰组成的组。
100.如权利要求97所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核碱基的每个修饰独立地选自由2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2，6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
101.如权利要求76-100中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述tracrRNA部分包含至少50％的修饰核苷酸。
102.如权利要求76-100中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中tracrRNA部分包含至少80％的修饰核苷酸。
103.如权利要求76-100中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中tracrRNA部分包含至少90％的修饰核苷酸。
104.如权利要求76-100中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中tracrRNA部分包含100％的化学修饰核苷酸。
105.如权利要求76-100中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述tracrRNA部分包含选自由表2的tracrRNA 1至tracrRNA 116组成的组的修饰模式。
106.一种化学修饰的指导RNA，其包含：
(a)crRNA部分，其包含(i)能够与靶多核苷酸序列杂交的指导序列，和(ii)重复序列；和
(b)包含与所述重复序列互补的反重复核苷酸序列的tracrRNA部分，
其中所述crRNA部分和tracrRNA部分之一或两者包含至少一个4′-硫代RNA修饰。
107.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置19、22、23和24中的一个或多个处的4′-硫代RNA修饰。
108.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置19处的4′-硫代RNA修饰。
109.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置22处的4′-硫代RNA修饰。
110.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置23处的4′-硫代RNA修饰。
111.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置24处的4′-硫代RNA修饰。
112.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置22和23处的4′-硫代RNA修饰。
113.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置22和24处的4′-硫代RNA修饰。
114.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置23和24处的4′-硫代RNA修饰。
115.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含从所述crRNA部分的5′端开始的位置19、22、23和24处的4′-硫代RNA修饰。
116.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5′端开始的位置12、13、18、24、27、31和32中的一个或多个处的4′-硫代RNA修饰。
117.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5′端开始的位置12处的4′-硫代RNA修饰。
118.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5′端开始的位置13处的4′-硫代RNA修饰。
119.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5′端开始的位置18处的4′-硫代RNA修饰。
120.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5′端开始的位置24处的4′-硫代RNA修饰。
121.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5′端开始的位置27处的4′-硫代RNA修饰。
122.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5′端开始的位置31处的4′-硫代RNA修饰。
123.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5′端开始的位置32处的4′-硫代RNA修饰。
124.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5′端开始的位置12、13和18处的4′-硫代RNA修饰。
125.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5′端开始的位置24、27、31和32处的4′-硫代RNA修饰。
126.如权利要求106所述的化学修饰的指导RNA，其中所述tracrRNA部分包含从所述tracrRNA部分的5′端开始的位置12、13、18、24、27、31和32处的4′-硫代RNA修饰。
127.如权利要求106-126中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分和/或所述tracrRNA部分还包含一个或多个其他修饰的核苷酸，其各自独立地选自核糖基团、磷酸基团、核碱基或其组合的修饰。
128.如权利要求127所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核糖基团的每个修饰独立地选自由2′-O-甲基、2′-氟、2′-脱氧、2′-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)、2′-NH2(2′-氨基)、双环核苷酸、锁核酸(LNA)、2′-(S)-约束乙基(S-cEt)、约束MOE和2′-O，4′-C-氨基亚甲基桥联核酸(2′，4′-BNANC)组成的组。
129.如权利要求127所述的化学修饰的指导RNA，其中所述磷酸基团的每个修饰独立地选自由硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯(PACE)、硫代膦酰乙酸酯(硫代PACE)、酰胺、三唑、膦酸酯或磷酸三酯修饰组成的组。
130.如权利要求127所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核碱基的每个修饰独立地选自由2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、N6-甲基腺苷、假尿苷、2，6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代嘧啶、异鸟嘌呤、异胞嘧啶和卤代芳族基团组成的组。
131.如权利要求106-130中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分和/或所述tracrRNA部分包含至少50％的修饰核苷酸。
132.如权利要求106-130中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分和/或所述tracrRNA部分包含至少80％的修饰核苷酸。
133.如权利要求106-130中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分和/或所述tracrRNA部分包含至少90％的修饰核苷酸。
134.如权利要求106-130中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分和/或所述tracrRNA部分包含100％的化学修饰核苷酸。
135.如权利要求106-134中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自由以下组成的组的crRNA部分修饰模式：
mN#mN＃mN＃mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNsN#mNmGsU#sU#sU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU＃mG＃mC＃mU(crRNA 119)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNsNmNmGsUsUsUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC＃mU(crRNA 120)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNsNmNmGrU#rU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 121)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNNNNNrN#rN#NNfNrN#mNmGsUrU#rU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 122)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNNNNNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#sUrU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 123)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU#rU#sUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 124)；
mN#N#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGsUrU#sUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 125)；
mN#mN＃mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN＃fNfNrN＃mNmGsUsUrU＃fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG＃mC#mU(crRNA 126)；
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGrU＃sUsUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC＃mU(crRNA 127)；
mN#mN＃mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGsU#sU#sU#fUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC#mU(crRNA 129)；和
mN#mN#mN#mNmNmNmNmNmNmNfNfNfNfNrN#rN#fNfNrN#mNmGsUsUsUfUfAmGmAmGmCmUmAmU#mG#mC＃mU(crRNA 130)，
其中rN＝RNA，mN＝2′-O-甲基RNA，fN＝2′-氟RNA，sN＝4′-硫代RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
136.如权利要求135所述的化学修饰的指导RNA，其中所述tracrRNA部分包含选自由表2的tracrRNA 1至tracrRNA 116组成的组的修饰模式。
137.如权利要求106-134中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其包含选自由以下组成的组的tracrRNA部分修饰模式：
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGsUsUmArAmAmAsUmAmAmGmGrCsUmArGsUrCmCrGsUsUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA107)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGsUsUmArAmAmAsUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA108)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCsUmArGsUrCmCrGsUsUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA109)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGsUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU＃mU#mU(tracrRNA 110)；
mA#mG＃mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUsUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 111)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmAsUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA112)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCsUmArGrUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA113)；
mA#mG＃mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGsUrCmCrGrUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA 114)；
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGsUrUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU＃mU#mU(tracrRNA 115)；和
mA#mG#mC#mAmUmAmGmCmAmAmGrUrUmArAmAmArUmAmAmGmGrCrUmArGrUrCmCrGrUsUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC#mU#mU#mU(tracrRNA116)，
其中rN＝RNA，mN＝2′-O-甲基RNA，fN＝2′-氟RNA，sN＝4′-硫代RNA，N#N＝硫代磷酸酯键，并且N＝任何核苷酸。
138.如权利要求137所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含选自由表1的crRNA 1至crRNA 134组成的组的修饰模式。
139.如权利要求1-138中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其还包含至少一个缀合至所述指导RNA的部分。
140.如权利要求139所述的化学修饰的指导RNA，其中所述至少一个部分缀合至所述crRNA部分的5′端、所述crRNA部分的3′端、所述tracrRNA部分的5′端和所述tracrRNA部分的3′端中的至少一个。
141.如权利要求139所述的化学修饰的指导RNA，其中所述至少一个部分增加所述指导RNA的细胞摄取。
142.如权利要求139所述的化学修饰的指导RNA，其中所述至少一个部分促进所述指导RNA的特定组织分布。
143.如权利要求139所述的化学修饰的指导RNA，其中所述至少一个部分选自由脂肪酸、类固醇、开环固醇类化合物、脂质、神经节苷脂类似物、核苷类似物、内源性大麻素、维生素、受体配体、肽、适体和烷基链组成的组。
144.如权利要求139所述的化学修饰的指导RNA，其中所述至少一个部分选自由胆固醇、二十二碳六烯酸(DHA)、二十二烷酸(DCA)、石胆酸(LA)、GalNAc、两亲嵌段共聚物(ABC)、亲水性嵌段共聚物(HBC)、泊洛沙姆、Cy5和Cy3组成的组。
145.如权利要求139所述的化学修饰的指导RNA，其中所述至少一个部分经由接头缀合至所述指导RNA。
146.如权利要求145所述的化学修饰的指导RNA，其中所述接头选自由乙二醇链、烷基链、多肽、多糖和嵌段共聚物组成的组。
147.如权利要求145所述的化学修饰的指导RNA，其中所述至少一个部分是修饰的脂质。
148.如权利要求147所述的化学修饰的指导RNA，其中修饰的脂质是支链脂质。
149.如权利要求147所述的化学修饰的指导RNA，其中修饰的脂质是式I的支链脂质，
式I：X-MC(＝Y)M-Z-[L-MC(＝Y)M-R]n，
其中X是将脂质连接到所述指导RNA的部分，每个Y独立地是氧或硫，每个M独立地是CH2、NH、O或S，Z是允许两个或三个(“n”)链连接到化学修饰的指导RNA的支链基团，L是任选的接头部分，并且每个R独立地是长度为2至30个原子的饱和、单不饱和或多不饱和直链或支链部分、甾醇或其他疏水基团。
150.如权利要求147所述的化学修饰的指导RNA，其中修饰的脂质是首基修饰的脂质。
151.如权利要求147所述的化学修饰的指导RNA，其中修饰的脂质是式II的首基修饰的脂质，
式II：X-MC(＝Y)M-Z-[L-MC(＝Y)M-R]n-L-K-J，
其中X是将脂质连接到所述指导RNA的部分，每个Y独立地是氧或硫，每个M独立地是CH2、NH、N-烷基、O或S，Z是允许两个或三个(“n”)链连接到化学修饰的指导RNA的支链基团，每个L独立地是任选的接头部分，并且R是长度为2至30个原子的饱和、单不饱和或多不饱和直链或支链部分、甾醇或其他疏水基团，K是磷酸盐、硫酸盐或酰胺，并且J是氨基烷烃或季氨基烷烃基团。
152.如权利要求1-151中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述指导RNA结合至选自由化脓性链球菌Cas9(SpCas9)、金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)、脑膜炎奈瑟菌Cas9(NmCas9)、空肠弯曲杆菌Cas9(CjCas9)、和地芽孢杆菌Cas9(GeoCas9)组成的组的Cas9核酸酶。
153.如权利要求152所述的化学修饰的指导RNA，其中所述Cas9是具有改变的活性的变体Cas9。
154.如权利要求153所述的化学修饰的指导RNA，其中所述变体Cas9选自由Cas9切口酶(nCas9)、催化死亡Cas9(dCas9)、超精确Cas9(HypaCas9)、高保真Cas9(Cas9-HF)、增强的特异性Cas9(eCas9)和扩展的PAM Cas9(xCas9)组成的组。
155.如权利要求152所述的化学修饰的指导RNA，其中相对于未经修饰的指导RNA，Cas9脱靶活性降低。
156.如权利要求152所述的化学修饰的指导RNA，其中相对于未经修饰的指导RNA，Cas9靶向活性增加。
157.如权利要求1-157中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其还包含将所述crRNA部分的3′端连接到所述tracrRNA部分的5′端的核苷酸或非核苷酸环或接头。
158.如权利要求157所述的化学修饰的指导RNA，其中所述非核苷酸接头包括乙二醇低聚物接头。
159.如权利要求157所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核苷酸环是化学修饰的。
160.如权利要求157所述的化学修饰的指导RNA，其中所述核苷酸环包含核苷酸序列GAAA。
161.如权利要求1-160中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其中所述crRNA部分包含1至20个硫代磷酸酯修饰。
162.如权利要求1-160中任一项所述的化学修饰的指导RNA，其包含相对于未经修饰的指导RNA至少约50％的活性。
163.一种改变细胞中靶基因表达的方法，所述方法包括向所述细胞施用基因组编辑系统，所述基因组编辑系统包括：
前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA；和
RNA指导的核酸酶或编码RNA指导的核酸酶的多核苷酸。
164.如权利要求163所述的方法，其中所述靶基因在生物体的细胞中。
165.如权利要求163所述的方法，其中所述靶基因的表达被敲除或敲低。
166.如权利要求163所述的方法，其中靶基因的序列被修饰、编辑、校正或增强。
167.如权利要求163所述的方法，其中所述指导RNA和所述RNA指导的核酸酶组成核糖核蛋白(RNP)复合物。
168.如权利要求163所述的方法，其中RNA指导的核酸酶选自由化脓性链球菌Cas9(SpCas9)、金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)、脑膜炎奈瑟菌Cas9(NmCas9)、空肠弯曲杆菌Cas9(CjCas9)、和地芽孢杆菌Cas9(GeoCas9)组成的组。
169.如权利要求168所述的方法，其中所述Cas9是具有改变的活性的变体Cas9。
170.如权利要求169所述的方法，其中所述变体Cas9选自由Cas9切口酶(nCas9)、催化死亡Cas9(dCas9)、超精确Cas9(HypaCas9)、高保真Cas9(Cas9-HF)、增强的特异性Cas9(eCas9)和扩展的PAM Cas9(xCas9)组成的组。
171.如权利要求163所述的方法，其中所述编码RNA指导的核酸酶的多核苷酸包含载体。
172.如权利要求171所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
173.如权利要求172所述的方法，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体或慢病毒(LV)载体。
174.如权利要求163所述的方法，其中所述编码RNA指导的核酸酶的多核苷酸包含合成mRNA。
175.如权利要求163-174中任一项所述的方法，其中所述靶基因的表达降低至少约20％。
176.一种CRISPR基因组编辑系统，其包括：
前述权利要求中任一项所述的化学修饰的指导RNA；和
RNA指导的核酸酶或编码RNA指导的核酸酶的多核苷酸。
177.如权利要求176所述的CRISPR基因组编辑系统，其中所述RNA指导的核酸酶选自由化脓性链球菌Cas9(SpCas9)、金黄色葡葡球菌Cas9(SaCas9)、脑膜炎奈瑟菌Cas9(NmCas9)、空肠弯曲杆菌Cas9(CjCas9)、和地芽孢杆菌Cas9(GeoCas9)组成的组。
178.如权利要求176所述的CRISPR基因组编辑系统，其中所述Cas9是具有改变的活性的变体Cas9。
179.如权利要求178所述的CRISPR基因组编辑系统，其中所述变体Cas9选自由Cas9切口酶(nCas9)、催化死亡Cas9(dCas9)、超精确Cas9(HypaCas9)、高保真Cas9(Cas9-HF)、增强的特异性Cas9(eCas9)和扩展的PAM Cas9(xCas9)组成的组。
180.如权利要求176所述的CRISPR基因组编辑系统，其中相对于未经修饰的指导RNA，Cas9脱靶活性降低。
181.如权利要求176所述的CRISPR基因组编辑系统，其中相对于未经修饰的指导RNA，Cas9靶向活性增加。
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