JP7113825B2 - 過剰のポリアルコキシル化試薬の回収及び再使用を可能にする核酸のポリアルコキシル化法 - Google Patents

Description

本発明は、第１の反応物質と第２の反応物質を反応させることにより、核酸部分及び非核酸部分を含む改変された核酸分子を調製する方法であって、第１の反応物質が、前記非核酸部分とカルボキシル基とを含み、第２の反応物質が、前記核酸部分と前記核酸部分に連結したアミノ基を含むアミノ修飾部とを含むアミノ修飾核酸分子である前記方法、前記方法により取得される改変された核酸分子、治療で使用される、前記方法により取得される改変された核酸分子、診断で使用される、前記方法により取得される改変された核酸分子、及びサンプルを分析するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法における、前記方法により取得される改変された核酸分子の使用に関する。

薬物、例えば核酸、ペプチド、タンパク質、及びナノ粒子等と、ポリアルコキシ化合物等のその他の部分とのコンジュゲーションは、治療用途におけるバイオアベイラビリティー、安定性、安全性、及び有効性を高めるために幅広く使用されている。オリゴヌクレオチド治療薬の分野において、アプタマー及びシュピーゲルマー（Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）（ミラーイメージアプタマーとも呼ばれる）は、一般的にポリアルコキシル化される。ポリエチレングリコール（略称ＰＥＧ）は、静脈内、経口、及び経皮投与される薬物の一部として食品医薬品局により承認された、一般的に使用されているポリアルコキシ化合物である。

一般的に、ポリアルコキシル化核酸は、反応性の基を含有する核酸を固相上にまずアセンブルする方法により調製される（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ．ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１，４：４．４６．１－４．４６．３０）。固相から切断及び脱保護された後、合成された核酸は、逆相高速液体クロマトグラフィー（略称ＲＰ－ＨＰＬＣ）、又はイオン交換クロマトグラフィー・高速液体クロマトグラフィー（略称ＩＥＸ－ＨＰＬＣ）、又は限外濾過（略称ＵＦ）等の方法により精製される。核酸の反応性の基は、次にポリアルコキシ化合物と核酸からなるコンジュゲートを形成するために、ふさわしい適合する反応性の基を有するポリアルコキシ化合物と反応し得る。コンジュゲーション後、ポリアルコキシル化核酸分子と非ポリアルコキシル化核酸分子からなる粗生成物は、ＨＰＬＣ、特にＲＰ－又はＩＥＸ－ＨＰＬＣ、及び限外濾過の併用であり得る方法により精製される。

ポリアルコキシル化反応の収量は、ポリアルコキシル化される核酸の性質及び純度、ポリアルコキシル化反応の種類、及び反応条件そのものに依存する。核酸のポリアルコキシル化で使用される最も一般的に使用される反応の種類として、
ａ）塩基存在下でのアミノ修飾オリゴヌクレオチドによるポリアルコキシカルボン酸活性エステルのアミノリシス；
ｂ）チオール修飾オリゴヌクレオチドの、マレイミド基を担持するポリアルコキシ化合物への付加；及び
ｃ）アジド修飾オリゴヌクレオチドとアルキン基を担持するポリアルコキシ化合物との、又はアルキン修飾オリゴヌクレオチドとアジド基を担持するポリアルコキシ化合物との１，３－双極子環化付加
が挙げられる。

最も幅広く用いられているポリアルコキシル化反応は、塩基存在下でのアミノ修飾オリゴヌクレオチドによるポリアルコキシカルボン酸活性エステルのアミノリシスである。反応は迅速で、容易にスケールアップ可能である。マレイミド－チオール付加は塩基を一切必要とせず、また迅速で選択的な反応であるが、しかし別の反応ステップにおいて、ＤＴＴ等の還元剤を用いて、チオールをジスルフィド前駆体から放出する必要がある。過剰のＤＴＴはマレイミドにやはり付加し、したがって収量を低下させるので、コンジュゲーション反応前にそれを完全に除去しなければならない。放出されたチオールは酸化を受けるので、ＤＴＴの除去は迅速でなければならない。これは大スケール製造での使用を複雑にする。１，３－双極子環化付加は「クリック反応」とも呼ばれ、触媒としての銅、又は立体的に制約されたアルキン種が存在する必要がある。金属を含まない「クリック反応」の場合、アジド及び立体的に制約されたアルキンは、いずれも求核的な塩基、例えばオリゴヌクレオチドの切断及び脱保護で使用されるメチルアミン／アンモニア等に対して敏感なので、アジド又は立体的に制約されたアルキンは合成後にオリゴヌクレオチドに導入される必要がある。

マレイミド－チオール付加及び「クリック反応」の制約を考慮すれば、大スケールでのポリアルコキシル化オリゴヌクレオチドの形成は、アミノ修飾オリゴヌクレオチドによるポリアルコキシカルボン酸活性エステルのアミノリシスにより最良に実施される。一般的に、ポリアルコキシカルボン酸は、別の反応において調製されるＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステルとして活性化され、精製され、そして利用まで保管される。その反応上の性質に起因して、上記エステルは、加水分解して対応するフリーのポリアルコキシカルボン酸とＮ－ヒドロキシスクシンイミドになりやすい。これは、そのような物質を取り扱い、保管し、又は輸送する際、注意する必要が不可欠である。

本発明に潜在する問題として、改変された核酸分子、より具体的にはポリアルコキシル化核酸分子、例えばＰＥＧ化された核酸分子等を調製する方法の提供が挙げられる。

この問題とその他の問題は、添付の独立請求項の主題により解決される。好ましい実施形態は、添付の従属請求項に由来し得る。

本発明に潜在する問題は、第１の反応物質と第２の反応物質を反応させることにより、核酸部分と非核酸部分とを含む改変された核酸分子を調製する方法により、第１の態様の第１の実施形態でもある第１の態様においてより具体的に解決されるが、第１の反応物質は、前記非核酸部分とカルボキシル基とを含み、第２の反応物質は、前記核酸部分と該核酸部分に連結したアミノ基を含むアミノ修飾部とを含むアミノ修飾核酸分子であり、該方法は下記のステップ
ａ）水混和性有機溶媒中の縮合試薬により、第１の反応物質、好ましくは第１の反応物質のカルボキシル基を活性化させるステップと
ｂ）ステップａ）の活性化した第１の反応物質、好ましくは活性化した第１の反応物質のカルボキシル基と、水中に、又は水混和性有機溶媒と水からなる混合物中に溶解した第２の反応物質、好ましくは前記アミノ修飾核酸分子のアミノ修飾部のアミノ基とを反応させるステップと
を含み、それによって改変された核酸分子が形成される。

第１の態様の第１の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２の実施形態では、アミノ修飾核酸分子は、四級アンモニウム塩の存在下で、水と水混和性有機溶媒からなる混合物中に溶解している。

第１の態様の第１及び第２の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第３の実施形態では、ステップａ）の活性化した第１の反応物質は、水中に、又は水混和性有機溶媒と水からなる混合物中に溶解したアミノ修飾核酸分子に添加される。

第１の態様の第１、第２、及び第３の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第４の実施形態では、第１の反応物質及び／又は非核酸部分は、ポリアルコキシ化合物、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、核酸、炭化水素部分、及びペプチド、タンパク質、糖タンパク質、核酸、及び／又は炭化水素に基づく部分とは異なる化学的部分を含む群から選択され、好ましくは第１の反応物質及び／又は非核酸部分は、ポリアルコキシ化合物である。

第１の態様の第１、第２、第３、及び第４の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第５の実施形態では、アミノ修飾核酸分子は、分析法、診断、及び／又は治療における使用に適する。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、及び第５の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第６の実施形態では、アミノ修飾核酸分子が、アミノ修飾アプタマー、アミノ修飾シュピーゲルマー、アミノ修飾免疫賦活性核酸、アミノ修飾ｓｉＲＮＡ、アミノ修飾ｍｉＲＮＡ分子、及びアミノ修飾核酸アンチセンス分子を含む群から選択され、好ましくは、アプタマーは、Ｌ－及び／又はＤ－ヌクレオチドからなるアプタマーであり、並びに／或いは核酸部分が、アプタマー、シュピーゲルマー、免疫賦活性核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ分子、及び核酸アンチセンス分子を含む群から選択され、好ましくは、アプタマーは、Ｌ－及び／又はＤ－ヌクレオチドからなるアプタマーである。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、及び第６の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第７の実施形態では、ステップｂ）において、活性化した第１の反応物質について、アミノ修飾核酸分子よりも過剰の分子が使用される。

第１の態様の第７の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第８の実施形態では、過剰は、活性化した第１の反応物質の分子とアミノ修飾核酸分子とのモル比として表わされ、該モル比は、約１．１～約１０、好ましくは約１．５～約３．５である。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、及び第８の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第９の実施形態では、ステップａ）に基づき第１の反応物質を活性化させるために、第１の反応物質が水混和性有機溶媒に溶解され、縮合性剤及び塩基、好ましくは、最初に縮合性剤、その後に塩基が添加され、好ましくは、前記縮合性剤は水混和性有機溶媒に溶解される。

第１の態様の第９の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１０の実施形態では、塩基は、非求核塩基である。

第１の態様の第９及び第１０の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１１の実施形態では、塩基を添加した後、０．２５分～６０分の間、好ましくは０．５分～２０分の間、及びより好ましくは１．０分～５．０分の間、このようにして得られた溶液が、アミノ修飾核酸分子を含有する溶液に添加され、好ましくは塩基を添加した後１．０分～５．０分の間、縮合性剤及び塩基を含む溶液が、アミノ修飾核酸分子を含有する溶液に添加される。

第１の態様の第９、第１０、及び第１１の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１２の実施形態では、縮合性剤は、
ａ）ホスホニウム塩、例えばＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＰｙＢｒｏｐ、ＡＯＰ、ＰｙＡＯＰ、ＢｒＯＰ、及びＰｙＣｌＯＰ等、
ｂ）ウロニウム塩、例えばＨＣＴＵ、ＴＣＴＵ、ＴＢＴＵ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＴＯＴＵ、及びＣＯＭＵ等、並びに
ｃ）カルボジイミド、
を含む群から選択され、好ましくは、縮合溶媒は、ＰｙＢＯＰ、ＴＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＨＢＴＵ、より好ましくはＨＢＴＵである。

第１の態様の第１２の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１３の実施形態では、カルボジイミドは、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、及びＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド）を含む群から選択される。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、及び第１３の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１４の実施形態では、水混和性有機溶媒は、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、メチルエチルスルホキシド、ホルムアミド、メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、エチルホルムアミド、エチルメチルホルムアミド、ジエチルホルムアミド、２－ピロリドン、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ－エチルピロリドン、アセトニトリル、アセトン、エチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、ジエチルケトン、メチルイソプロピルケトン、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、酢酸メチル、酢酸エチル、メチルプロパノエート、テトラヒドロフラン、及びジオキサン、好ましくはジメチルホルムアミド、アセトニトリル、及びジメチルスルホキシドを含む群から選択される。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、及び第１４の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１５の実施形態では、塩基は、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリメチルアミン、及びＤＢＵを含む群、好ましくはジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）から選択される。

第１の態様の第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、及び第１５の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１６の実施形態では、第１の反応物質に対する塩基のモル比は、１に等しい又はそれを上回る。

第１の態様の第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、及び第１６の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１７の実施形態では、アミノ修飾核酸分子の溶液は、塩基、好ましくは非求核塩基を含有し、その場合、好ましくはアミノ修飾核酸分子内のホスホジエステルの数に対する非求核塩基のモル比が３を上回る。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、及び第１７の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１８の実施形態では、ステップａ）は、５℃～６０℃の温度、好ましくは１０℃～４０℃の温度、より好ましくは１５℃～３０℃の温度、最も好ましくは周囲温度で実施される。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、及び第１８の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第１９の実施形態では、ステップｂ）は、５℃～６０℃の温度、好ましくは１０℃～４０℃の温度、より好ましくは１５℃～３０℃の温度、最も好ましくは周囲温度で実施される。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、及び第１９の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２０の実施形態では、活性化した第１の反応物質のカルボキシル基とアミノ修飾核酸分子のアミノ基との反応は、５分～６時間後、好ましくは１５分～４５分後、より好ましくは１５～３０分後に完了する。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、及び第２０の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２１の実施形態では、ステップｂ）は、７．５～１０のｐＨ範囲、好ましくは７．５～９のｐＨ範囲、及びより好ましくは７．５～８．５のｐＨ範囲で実施される。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、及び第２１の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２２の実施形態では、ステップｂ）において、アミノ修飾分子の８０％～１００％が第１の反応物質と反応するまで、好ましくはアミノ修飾核酸分子の９０％～１００％が第１の反応物質と反応するまで、活性化した第１の反応物質は、アミノ修飾核酸分子の溶液に添加される。

第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、及び第２２の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２３の実施形態では、ステップｂ）の終了後に、未反応の第１の反応物質のすべてが限外濾過及び／又はクロマトグラフィーにより、好ましくはイオン交換クロマトグラフィーにより反応から分離される。

第１の態様の第２３の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２４の実施形態では、分離された第１の反応物質は、ステップａ）においてリサイクル及び使用される。

第１の態様の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、及び第２４の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２５の実施形態では、ポリアルコキシ化合物は、直鎖状又は分岐状のポリアルコキシ化合物である。

第１の態様の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、及び第２５の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２６の実施形態では、ポリアルコキシ化合物は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリグリセロールを含む群から選択される。

第１の態様の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、及び第２６の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２７の実施形態では、ポリアルコキシ化合物は、ポリエチレングリコールである。

第１の態様の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、及び第２７の実施形態の実施形態でもある第１の態様の第２８の実施形態では、ポリアルコキシ化合物は、５，０００Ｄａ～１００，０００Ｄａ、好ましくは２０，０００Ｄａ～８０，０００Ｄａ、より好ましくは４０，０００Ｄａの分子量を有する。

本発明に潜在する問題は、第１の態様、そのいずれかの実施形態を含め、それに基づく方法により取得される改変された核酸分子により、第２の態様において解決される。

本発明に潜在する問題は、治療で使用される、第１の態様、そのいずれかの実施形態を含め、それに基づく方法により取得される改変された核酸分子により、第３の態様において解決される。

本発明に潜在する問題は、診断で使用される、第１の態様、そのいずれかの実施形態を含め、それに基づく方法により取得される改変された核酸分子により、第４の態様において解決される。

本発明に潜在する問題は、サンプルを分析するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法において、第１の態様、そのいずれかの実施形態を含め、それに基づく方法により取得される改変された核酸分子の使用により、第５の態様において解決される。

本発明は、アミノ修飾オリゴヌクレオチドのポリアルコキシル化について、そのプロトコールを改善することで、最新技術分野において公知のポリアルコキシル化核酸のより効率的な製造が可能になるという驚くべき認識に基づく（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ．ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１，４：４．４６．１－４．４６．３０）。本発明は、コンジュゲーション反応直前に、アミノ修飾核酸と、縮合試薬を用いて活性化させたポリアルコキシカルボン酸との反応を含む、ポリアルコキシル化核酸を調製する方法を特に提供する。更に、完了するまで反応を推進するために過剰に使用されたポリアルコキシカルボン酸が、例えば未精製ポリアルコキシル化生成物のＵＦ及び／又はＨＰＬＣ精製等によって下流処理期間中に回収され得ることが驚くべきことに判明した。乾燥後、リサイクルされたポリアルコキシカルボン酸は、別のポリアルコキシル化反応に再利用可能であった。

本発明の方法には、先行技術の方法と比較して様々な長所が付随する。より具体的には、本発明の方法は、より労力を必要とせず、また環境にもなじみやすい製造プロセスであり、カルボキシル基を担持する第１の反応物質が過剰に使用されても、そのリサイクリングを可能にする。また、カルボキシル基を担持する第１の反応物質の調製は、それが必要とする製造ステップがより少なく、したがって先行技術に記載されている活性化したカルボキシル反応物質の調製及び単離よりも労力を必要としない。また、カルボキシル基を担持する第１の反応物質は、先行技術に記載されている活性化したカルボキシル部分よりも安定であり、また特別な冷却保管条件を必要とせず、本発明の方法の長所に加えられる。

上記に照らし及び本発明に基づき、ポリアルコキシカルボン酸そのものは、改変された核酸分子及び改変されたオリゴヌクレオチドをそれぞれ形成するために、アミノ修飾核酸分子、例えばアミノ修飾オリゴヌクレオチド等との反応用の出発物質として使用可能であり、それ場合の改変は、好ましくはポリアルコキシ部分、より好ましくはＰＥＧ部分である。

本発明の方法の一実施形態では、本発明の方法のステップａ）において調製される活性化した第１の反応物質は、アミノ修飾核酸分子と反応し、それによって溶液中で反応が生ずる。そのような溶液の要素は、前記活性化した第１の反応物質、及び前記アミノ修飾核酸分子、及び溶媒を含み、その場合、溶媒は水及び水混和性有機溶媒と水からなる混合物を含む群から選択される。好ましくは、活性化した第１の反応物質及び／又はアミノ修飾核酸分子は、溶媒又はそのような溶媒の一部に溶解又は分散される。本明細書において好適に使用される場合、溶媒の一部は、溶媒の１つの相又は溶媒により形成された相のうちの１つである。

本発明の方法の一実施形態では、活性化した第１の反応物質が、アミノ修飾核酸に添加され、その場合、アミノ修飾核酸は溶液中に存在するのが好ましい。代替的実施形態では、溶液中に好適に存在するアミノ修飾核酸が、第１の活性化した反応物質、好ましくはステップａ）の第１の活性化した反応物質に添加される。

本発明の方法の一実施形態では、核酸部分は、核酸分子を含む。

本発明の方法の一実施形態では、非核酸部分は、カルボキシル基を担持する。

本発明の方法の一実施形態では、アミノ修飾核酸分子は、核酸部分及び該核酸部分に連結したアミノ修飾部を含む。

本発明の方法の一実施形態では、アミノ修飾核酸分子は、アミノ修飾核酸分子が第１の反応物質と反応する前に、水中に、又は水混和性有機溶媒と水からなる混合物中に溶解している。したがって、アミノ修飾核酸分子が第１の反応物質と反応する前及びその後において存在する溶液は、溶液及びそのような溶液を形成する溶媒に関してやはり異なる。

一実施形態では、本明細書で好適に使用される場合、炭化水素部分は、炭化水素又は炭化水素のポリマーを含む部分である。炭化水素部分として、炭化水素、炭化水素のポリマー、糖タンパク質、ヌクレオチド、及び核酸が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。

本発明の方法の一実施形態では、アミノ修飾免疫賦活性核酸は、ある一つのアミノ修飾免疫賦活性核酸である。

本発明の方法の一実施形態では、免疫賦活性核酸は、ある一つの免疫賦活性核酸である。

本発明の方法の一実施形態では、アプタマーは、ワトソン・クリック塩基対形成又はフーグスティーン塩基対形成とは異なる結合を通じて標的と好ましくは結合する標的結合核酸である。好ましくは、アプタマーは、Ｄ－ヌクレオチドから構成される。代替的実施形態では、アプタマーは、複数のＤ－ヌクレオチドと少なくとも１つのＬ－ヌクレオチドの両方を含む混合型アプタマーであり、その場合、アプタマー内のＬ－ヌクレオチドの数は、Ｄ－ヌクレオチドの数よりも小さいのが好ましい。

本発明の方法の一実施形態では、シュピーゲルマーは、Ｌ－ヌクレオチドの標的結合核酸であり、同核酸は、ワトソン・クリック塩基対形成又はフーグスティーン塩基対形成とは異なる結合を通じて標的と結合するのが好ましい。好ましくは、シュピーゲルマーは、複数のＬ－ヌクレオチドから構成される。代替的実施形態では、シュピーゲルマーは、複数のＬ－ヌクレオチドと少なくとも１つのＤ－ヌクレオチドの両方を含む混合型シュピーゲルマーであり、その場合、アプタマー内のＤ－ヌクレオチドの数は、Ｌ－ヌクレオチドの数よりも小さいのが好ましい。

アプタマー及びシュピーゲルマーは、いずれも改変され得る。そのような改変は、そのようなアプタマー及びシュピーゲルマーのヌクレオチド配列の単一のヌクレオチドと関連し得るが、また当技術分野において周知されている。そのような改変の例は、とりわけ、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ等の（Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ，Ｎ．，Ｋｉｍ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１０，１９７３（２００３））及びＫｕｓｓｅｒの（Ｋｕｓｓｅｒ，Ｗ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４，２７（２０００））により記載されている。そのような改変は、アプタマーを構成する個々のヌクレオチドの２’位に位置するＨ原子、Ｆ原子、又はＯＣＨ_３基、又はＮＨ_２基であり得る。また、本発明によるアプタマーは、少なくとも１つのロックされたヌクレオチド（ＬＮＡ）又はロック解除されたヌクレオチド（ＵＮＡ）を含み得る。

一実施形態では、本明細書で好ましく使用される場合、周囲温度とは２０℃～２２℃を意味する。

本発明の方法の一実施形態では、アミノ修飾核酸分子は、アミノ基を含む；好ましくは、アミノ基は、カルボキシル基、好ましくは活性化したカルボキシル基と反応することができる。

本発明の方法の一実施形態では、活性化した第１の反応物質は、縮合試薬によって活性化した第１の反応物質である；好ましくは、活性化した第１の反応物質は、活性化したカルボキシル基を含む第１の反応物質であり、その場合、活性化したカルボキシル基は、縮合試薬によって活性化した第１の反応物質のカルボキシル基に起因する。

本発明の方法の実施形態で使用される四級アンモニウム塩が、水と水混和性有機溶媒からなる混合物中のアミノ修飾核酸分子の溶解度を増強するのに使用される。該四級アンモニウム塩は、テトラアルキルアンモニウム塩化物、テトラアルキルアンモニウム臭化物、テトラアルキルアンモニウムテトラフルオロボレート、テトラアルキル（アンモニウム）ヘキサフルオロホスフェート、テトラアルキル（アンモニウム）硫酸水素塩、テトラアルキル（アンモニウム）リン酸水素塩を含む群から選択され、アルキルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、１５、１６、１７、又は１８個のＣ原子からなるアルキル鎖であり、好ましくは、四級アンモニウム化合物は、テトラブチルアンモニウムブロミドである。

本発明の方法の一実施形態では、脂肪酸として、飽和脂肪酸、及び１つ又はいくつかの二重結合を含む不飽和脂肪酸が挙げられる。飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸のいずれも、長さ８～３０個の炭素原子、すなわち長さ８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個の炭素原子の鎖を有し得る。

本発明の方法の一実施形態では、ステロイドとして、コルチコステロイド、例えばコレステロール等、胆汁酸、例えばコール酸及びリトコール酸等、ステロイドホルモン、例えばコルチゾール又はプロゲステロン等、ステロイドグリコシド、例えばジゴキシゲニン等、及び上記ステロイドの代謝物が挙げられる。

本発明の方法の一実施形態では、塩基及び好ましくは非求核塩基が、トリアルキルアミン、例えばジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリメチルアミン、トリイソプロピルアミン等、過アルキル化立体障害型ポリアミノホスファゼン塩基、例えばｔ－Ｂｕ－Ｐ４、１，８－ジアザビシクロウンデセン－７－エン（ＤＢＵ）、２，６－ジ－ｔｅｒｔ－ブチルピリジン、１，８－ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、リチウムテトラメチルピペリジド、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド、１，１，３，３－テトラメチルグアニジン、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン等を含む群から選択される。好ましい実施形態では、塩基は、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）である。

本発明のポリアルコキシル化法は、天然の糖部分を含有する核酸、例えば２’－デオキシリボ核酸（以後「ＤＮＡ」）及びリボ核酸（以後「ＲＮＡ」）、並びに改変された糖部分、改変されたリン酸部分、又は改変された核酸塩基を含有する核酸に適用され得る。本発明による方法は、ＲＮＡ及びＤＮＡの天然の立体異性体に限定されない。また、鏡像ＤＮＡ（Ｌ－ＤＮＡ）又はＲＮＡ（Ｌ－ＲＮＡ）、並びに糖－、リン酸－、又はヌクレオチド－改変型Ｌ－ＤＮＡ又はＬ－ＲＮＡ、並びにＤ／Ｌ－ハイブリッドオリゴヌクレオチド及びその改変体を含むポリアルコキシル化核酸は、本発明による方法により調製され得る。糖部分に対する改変には、環サイズの変更（例えば、フラノース、ヘキソース）、単環原子の置換、導入、又は除去（例えば、カルバ糖、アザ糖）、側鎖基又は側鎖原子の置換、導入、又は除去（例えば、２’－Ｆ、２’ＯＭｅ）、非環式誘導体又はポリ環状誘導体（例えばロック解除された核酸、アミノ酸核酸、ロックされた核酸、三環式核酸）による環の置換、核酸塩基の配向又は位置（α－アノマー配向、ヘキシトール核酸）が含まれる。オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の天然又は非天然の脱塩基部分（ａｂａｓｉｃ ｍｏｉｅｔｙ）（例えば、テトラヒドロフラン、エチレングリコール）から構成される可能性もある。改変されたリン酸部分として、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスフェート、ホスホロアミデート、及びホスホロチオアミデートが挙げられる。核酸塩基の改変は、自然発生的な、例えばイノシン、キサンチン、５，６－ジヒドロウラシル、又は５－メチルシトシン等、又は人工的な改変、例えばＣ５－アルキニルピリミジン、Ｎ－アルキル化プリン及びピリミジン、ピリミジン及びプリンのＣ６－及び／又はＣ５－誘導体等であり得る。核酸は、１つ又は複数の上記命名の改変も含み得る又はそれから構成される。

核酸をアセンブルする方法は当技術分野において周知されている。複数の実施形態において、核酸は、固体支持体上の出発核酸に対する、保護された構成ブロックのステップワイズカップリングを利用するアミド亜リン酸法によりアセンブルされる（Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２，４８（１２），２２２３－２３１１）。好ましい実施形態では、合成方向は、３’から５’方向であるが、しかし５’から３’方向の逆合成も適用可能である（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ．ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ２００８，５２，１０３－１０４）。所望の核酸配列がアセンブルされ、そして下流処理するためのすべての必要な改変が導入されたら、核酸は、固体支持体から切り離され、脱保護される。核酸は、次に当技術分野において公知の任意の手段により精製され得る。

一般的に、切断及び脱保護ステップは、アンモニア及び／又はアルキルアミン又はアンモニア塩の利用と関係する。例えば、ＲＮＡは、ＮＨ_３／ＭｅＮＨ_２とその後のＮＥｔ_３・ＨＦ又はＢｕ_４ＮＦにより切り離される。ポリアルコキシル化が後続する場合、このようなアミン及びアンモニウム塩はポリアルコキシル化期間中にカップリング効率を低下させる望ましくない副反応を引き起こすので、除去されなければならない。アミン種の除去は、大量のナトリウム塩の添加、その後の沈殿若しくは限外濾過により実施可能である塩交換により、又はＩＥＸ－ＨＰＬＣ期間中にナトリウム塩グラジエントを使用して溶出させることにより達成される。ＩＥＸ－ＨＰＬＣ精製後、ポリアルコキシル化前に過剰の塩を除去することも必要である。必要な場合には、複数の異なる技術が適用可能である。好ましい実施形態では、塩交換とその後の限外濾過は、ポリアルコキシル化前に使用される。第２の反応物質内の、好ましくはアミノ修飾核酸分子、例えばオリゴヌクレオチド等内のアミノ修飾の位置は、第２の反応物質の、好ましくはアミノ修飾核酸分子、例えば、オリゴヌクレオチド等の３’末端、及び／又は５’末端上、及び／又は３’末端ヌクレオチドと５’末端ヌクレオチドの間の任意の位置であり得る。本発明を説明する実施例で使用されるアミノ修飾核酸を実施例１～３に基づき合成及び精製した。

本発明で使用可能であるポリアルコキシ化合物として、ポリ（酸化エチレン）、ポリ（酸化プロピレン）、及び混合型のポリ（酸化エチレン）／ポリ（酸化プロピレン）化合物が挙げられる。ポリアルコキシ化合物は、好ましくは式：Ｐ_ｒＯ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ－）_ｘ－（ＣＨ_２ＣＨＲＯ－）_ｙ－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ－）_ｚＱの化合物であり、式中ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立してゼロ又は正の整数であるが、ただし、ｘ、ｙ、及びｚのうちの少なくとも１つはゼロでない；Ｒは、Ｈ又はアルキル、例えばＣ１、Ｃ２、Ｃ３、又はＣ４アルキル等、好ましくはメチル基であり、Ｐ_ｒは、キャッピング基又はラベリング基であり、及びＱは、オリゴヌクレオチドとのカップリングを可能にする基である。ｘ、ｙ、又はｚがゼロではないとき、それらは一般的に最大１０００である。いくつかの実施形態では、ｘは３～１０００、例えば１００～５００であり、及びｙとｚのいずれもゼロである。その他の実施形態では、ｘ及びｙは、それぞれ独立して３～１０００、例えば１００～５００あり、及びｚはゼロである。なおもその他の実施形態では、ｘ及びｚは、それぞれ独立して３～５００、例えば１００～３００であり、及びｙは、３～１０００、例えば１００～５００である。好ましくは、ポリアルコキシ化合物は、例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、又はＣ４アルキル、好ましくはメチル基によりキャップ化される。Ｐ_ｒにより表され得るラベリング基として、フルオレセイン及びビオチンが挙げられ、又は例えば、チオール、マレイミド、アジド、又はアルキン等の任意のその他の反応性の基もやはり挙げられ得る。使用されるポリアルコキシ化合物は、そのおよその平均分子量及び省略された化学的名称により一般的に識別される（例えば、ＰＥＧ＝ポリ（エチレングリコール）；ＰＰＧ＝ポリ（プロピレングリコール））。ポリアルコキシ化合物は、直鎖状又は分岐状であり得るが、また約０．２ｋＤ～約６０ｋＤ、好ましくは約２ｋＤ～約４０ｋＤの平均分子量を一般的に有する。ポリアルコキシ化合物が分岐状であるとき、オリゴヌクレオチドとのカップリングを可能にする基Ｑは、２つ又はそれ超のポリアルコキシ部分を担持し得る。例えば、Ｑは、２つのポリアルコキシ部分及び反応性の基を担持するリジン又は同等の部分に該当し得る。本発明の方法の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドとのカップリングを可能にする基Ｑはカルボン酸部分を含む。好ましくは、ポリアルコキシ化合物はＰＥＧである。

カルボン酸とアミンとの間のアミド結合形成は、カルボキシル基を含む第１の反応物質と、第２の反応物質、すなわちアミノ基を含むアミノ修飾核酸分子の間で、本発明の方法において好適に実現されるが、そのようなアミド結合の形成は１６０～１８０℃で達成され得る縮合反応である（Ｊｕｒｓｉｃ，Ｂ．Ｓ．；Ｚｄｒａｖｋｏｖｓｋｉ，Ｚ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９３，２３，２７６１－２７７０）。ただし、高温はオリゴヌクレオチドにとって不適である。したがって、カルボン酸は、例えばエステルとして活性化される。電子求引性アルコール、例えばｐ－ニトロフェノール（ｐＮＰ）、ペンタフルオロフェノール、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）等からなるエステルは、カルボニル中心において求電子性の増加を示し、したがってこれらのエステルと多種多様な求核試薬との反応を容易にする。本明細書によれば、この種類のアルコールが本発明の方法の複数の実施形態において好ましい。カルボン酸は穏和な条件下でアミンと反応して所望のアミドを生み出す。ポリアルコキシカルボン酸が生体分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質等とコンジュゲーションする場合、最も一般的には、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ－エステル）が使用される。

好ましくは、アミノ修飾オリゴヌクレオチドとＰＥＧ－ＮＨＳ－エステルとの反応は、水性の有機溶媒、又は水及び水混和性有機溶媒を含む溶液中で実施される。好ましい有機溶媒は、非プロトン性、極性であり、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＮＭＰ、又はアセトニトリルが挙げられる。水混和性有機溶媒を含む溶液中の有機溶媒の濃度は、約１０％から約７５％まで変化し得る。核酸、例えば、オリゴヌクレオチド等は、第２の反応物質に同様に適用されるのが一般的である、わずかにアルカリ性の水溶液中で通常使用される又はその中に存在する。わずかにアルカリ性のｐＨバッファーを実現するために、例えば重炭酸ナトリウム又はホウ酸ナトリウム等の他、非求核性三級アミン塩基、例えばＮＥｔ_３又はＤＩＰＥＡ等が使用可能である。好ましくは、オリゴヌクレオチド溶液のｐＨは、８．５～９．５に調整される。緩衝化するために非求核性アミンを使用する場合、これは、存在するオリゴヌクレオチドにより提供されるホスホジエステル架橋の合計数に対して２～５倍過剰の塩基を添加することにより達成され得る。ＰＥＧ－ＮＨＳ－エステルは、水混和性有機溶媒中の溶液として使用され、そしてオリゴヌクレオチドの水溶液に添加された際には、なおも溶液の状態に留まる。ＰＥＧ－ＮＨＳ－エステルのモル比及びオリゴヌクレオチドのモル比は、オリゴヌクレオチドにより提供される反応性のアミノ基１つに対して、スケール及び反応性に応じて１：１から５：１まで変化し得る。ＰＥＧ－ＮＨＳ－エステルの添加は、反応が終了するまで継続するのが好ましい。反応は、当業者にとって利用可能なあらゆる分析技法により追跡可能である。本発明の複数の実施形態において、ＲＰ－ＨＰＬＣが、ＰＥＧ化反応を追跡するのに適用される。最良の変換を実現するために、温度は周囲温度から４５℃まで変化し得る。

上記ポリアルコキシカルボン酸－ＮＨＳエステル、又はより具体的にはＰＥＧ－ＮＨＳエステルは、別の反応において事前形成されるのが好ましく、その後精製され、本発明の方法でそれを利用するまで保管される。ＮＨＳ－エステルは、例として、縮合剤、例えばカルボジイミド、例えば、ＤＣＣ、ＥＤＣ、又はＤＩＣ等の存在下で、カルボン酸とＮＨＳを反応させることにより調製される。ペプチド化学では、過剰の縮合剤は、カルボン酸とアミンの間のアミド結合形成において利用可能である。縮合剤の群は、ホスホニウム塩、例えばＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＰｙＢｒｏｐ、ＡＯＰ、ＰｙＡＯＰ、ＢｒＯＰ、及びＰｙＣｌＯＰ等、ウロニウム塩、例えばＨＣＴＵ、ＴＣＴＵ、ＴＢＴＵ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＴＯＴＵ、及びＣＯＭＵ等、並びに多くのその他（Ｃ．Ａ．Ｇ．Ｎ．Ｍｏｎｔａｌｂｅｔｔｉ，Ｖ．Ｆａｌｑｕｅ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００５，６１，１０８２７－１０８５２，Ａｙｍａｎ Ｅｌ－Ｆａｈａｍ ａｎｄ Ｆｅｒｎａｎｄｏ Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，２０１１，１１１，（１１），６５５７－６６０２）を含み、そのすべてが本発明の実施形態で使用され得る。縮合剤は、カルボン酸と反応して、アミン又はその他の求核試薬に対して高い反応性を有するエステルを形成する試薬であり、これにより穏和な条件下で所望の縮合反応を可能にする。溶液中でのアミド結合形成及び固相ペプチド合成は、含水量が低い有機溶媒、例えばＤＭＦ、ＮＭＰ、ＤＭＳＯ、ＡＣＮ、又はＣＨ_２Ｃｌ_２等の中で実施される。しかし、オリゴヌクレオチドは、水を含まない有機溶媒中に溶解しない。

本発明者は、縮合試薬を用いたＰＥＧ－ＣＯＯＨの活性化が、水混和性有機溶媒中で０．５分～６０分間、好ましくは１～２０分間実施され、その後に水中のアミノ修飾オリゴヌクレオチドに対して活性化したＰＥＧの添加が後続する場合、ＰＥＧ化されたオリゴヌクレオチドの調製という文脈において、上記のような一般的な縮合試薬が、ＰＥＧカルボン酸（ＰＥＧ－ＣＯＯＨ）の活性化に対して非常に効率的に使用可能であることを驚くべきことに更に見出した（実施例４～１０を参照）。図３は、ＰＥＧ化前の未精製５’－アミノ修飾Ｌ－ＲＮＡシュピーゲルマーＮＯＸ－Ｅ３６（５’－ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６、表１、エントリー１）を、Ａ）ＩＥＸ－ＨＰＬＣにより、及びＣ）ＲＰ－ＨＰＬＣにより分析した際の代表的なクロマトグラムを示す。４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ及び縮合化試薬ＨＢＴＵを用いたＰＥＧ化後の未精製５’－ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６の代表的なクロマトグラムを、図３Ｂ及び図３Ｄにそれぞれ示す（実施例９）。提示する実施例において、遅れて溶出する生成物のピークのＵＶ領域の割合（％）が、ＩＥＸ－ＨＰＬＣにより判明した５’－アミノ修飾オリゴヌクレオチドの完全長生成物含有量の割合（％）に等しい又はそれよりわずかに高い場合には、ＲＰ－ＨＰＬＣ分析は完全変換を示唆する。例えば、実施例４～１０で使用した未精製５’－ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６は、ＩＥＸ－ＨＰＬＣにより完全長生成物について４７％の純度を示す。粗生成物は、所望のヌクレオチド配列を有さないアミノ修飾種、例えば欠陥及び付加配列等を最大１５％含有し、それもやはりＰＥＧ化可能である。したがって、この場合、ＲＰ－ＨＰＬＣによる生成物ピークのＵＶ領域のうち、その最大６０％が完全変換に帰属し得る（実施例５）。

ＰｙＢＯＰ、ＴＢＴＵ、又はＣＯＭＵを使用したとき、同等の結果を実現した（実施例４～７）。また、小分子のカルボン酸は、アミノ修飾オリゴヌクレオチドと効率的にカップリングすることが実証された。実施例１１に示すように、ビオチンは非常に高い効率で活性化され、５’－ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２とカップリングした（表１、エントリー２）。事前活性化するためにＨＢＴＵを使用してビオチン化を行う前の、未精製５’－ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２のＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析結果を、図４Ａに示す。得られた未精製５’－ビオチン－ＮＯＸ－Ａ１２のＬＣ－ＭＳ及びＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析結果を図４Ｂ及び図４Ｃに示すが、ビオチン化された生成物について正しい分子量及び期待されるリテンションタイム変化が検証される。

更に、本発明者は、完了するまでＰＥＧ化反応を推進するのに使用される過剰のＰＥＧ－ＣＯＯＨ、例えば４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ等は、未精製のＰＥＧ化されたオリゴヌクレオチドの限外濾過（実施例１２）により、又はＩＥＸ－精製期間中に、未精製の反応混合物から回収され得ることを驚くべきことに見出した（実施例１５）。反応に含まれる小分子、例えば縮合試薬、有機溶媒、又は塩等をＵＦ及び後続する乾燥ステップにより除去した後（実施例１６）、回収されたＰＥＧ－ＣＯＯＨはアミノ修飾オリゴヌクレオチドのＰＥＧ化において再使用可能であった（実施例１８、１９、及び２２）。ＰＥＧ化前の未精製５’－ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２のＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析結果を図５Ａに示す。「新鮮な」ＰＥＧ－ＣＯＯＨによるＰＥＧ化後の未精製ＮＯＸ－Ａ１２の代表的なＩＥＸ－クロマトグラムを、図５Ｂに示す。得られた精製後のＰＥＧ化されたＮＯＸ－Ａ１２生成物の代表的なＩＥＸ－クロマトグラムを、図５Ｃに示す。「新鮮な」ＰＥＧ－ＣＯＯＨと比較して、リサイクルされた４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨは、類似した高いコンジュゲーション効率を示した（それぞれ実施例１８、１９、及び１７）。ＰＥＧ化された生成物の収量及び品質は、「新鮮な」及びリサイクルされた４０ｋＤａのＰＥＧについて同じように高かった。図５Ｃ及び図５Ｅは、「新鮮な」及び「リサイクルされた」４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨでＰＥＧ化した後の精製後のＰＥＧ化されたＮＯＸ－Ａ１２の代表的なＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析結果をそれぞれ示す。

本発明は、アミノ修飾核酸分子、例えばオリゴヌクレオチド等のポリアルコキシル化において、ポリアルコキシカルボン酸ＮＨＳ－エステルの代わりにポリアルコキシカルボン酸を使用することで、本発明が優れていることを証明する。中間体の生成及びポリアルコキシカルボン酸からの活性化したすべてのＮＨＳ－エステルの単離を一切必要とせず、これにより全体的な反応ステップの数を低下させるので、この方法は優れている。また、ポリアルコキシカルボン酸は、湿気に敏感なポリアルコキシカルボン酸ＮＨＳエステルよりも安定であり、また保管が容易である。更に、本発明の方法は、完了するまで反応を推進するために過剰に使用されるのが一般的である試薬の経済的な再使用を可能にする。

本明細書によれば、また本発明の方法の一実施形態では、その様々な実施形態において、ステップｂ）の終了後、未反応の第１の反応物質は、好ましくは限外濾過及び／又はクロマトグラフィー、好ましくはイオン交換クロマトグラフィーによって反応からすべて分離される。過剰の第１の反応物質の性質に応じて、未反応の物質、すなわち未反応の第１の反応物質は、限外濾過（ＵＦ）又はクロマトグラフィーにより、核酸分子から、より具体的には改変された核酸分子から、好ましくは所望の改変された核酸分子から分離され得る。第１の反応物質と非改変型及び改変型核酸分子の間で、分子量と関連する流体力学的容積に十分に大きな差異が存在する場合、ＵＦが最良の方法である。或いは、第１の反応物質と非改変型及び改変型核酸分子の間の電荷又は親油性の差異の場合、イオン交換（ＩＥＸ ＨＰＬＣ）又は逆相（ＲＰ ＨＰＬＣ）クロマトグラフィーが使用され得る。非電荷（中性）の第１の反応物質、例えばポリアルコキシ化合物、ステロイド、炭化水素、及び脂肪酸等の場合、樹脂は核酸に対するよりも第１の反応物質に対して弱い親和性を有するので、ＩＥＸ－ＨＰＬＣが最良の方法である。両親媒性のペプチド、タンパク質、又は糖タンパク質の場合、ＩＥＸ－ＨＰＬＣ又はＲＰ－ＨＰＬＣが採用され得る。

核酸が核酸分子であることは本発明の範囲内である。別途記載のない限り、核酸及び核酸分子という用語は、本明細書において同義で使用される。更に、そのような核酸（複数可）は、本明細書において、本発明による核酸分子（複数可）、本発明による核酸（複数可）、本発明の核酸（複数可）、又は本発明の核酸分子（複数可）も好ましくは意味する。更に、核酸がオリゴヌクレオチドであるということも本発明の範囲内である。それに照らせば、本出願の本開示は、明確に換言されない限り、オリゴヌクレオチドを意味する範囲において、あらゆる核酸に同じように適用され、またその逆も成り立つものと理解される。また、本発明の方法におけるオリゴヌクレオチドの使用と関連して本明細書に提示する論説は、いずれも本発明の方法における第１の反応物質及びその使用に対して同じように適用される

別の態様では、本発明は、本発明の方法により取得される改変された核酸分子と関連する。

更なる態様では、本発明は、治療で使用される、本発明の方法により取得される改変された核酸分子と関連する。治療におけるそのような使用は、それを必要としている対象に対する改変された核酸分子の投与を含む。そのような対象は、疾患に罹患している、又は疾患に罹患するリスクを有するヒトであるのが好ましい。そのような使用では、改変された核酸分子は、そのような疾患を治療する、又はそのような疾患を予防する能力を有する。

なおも更なる態様では、本発明は、診断で使用される、本発明の方法により取得される改変された核酸分子と関連する。そのような診断は、ｉｎ ｖｉｖｏ診断又はｉｎ ｖｉｔｒｏ診断であり得る。Ｉｎ ｖｉｖｏ診断の場合、改変された核酸分子は、診断される対象に投与される。そのような対象は、疾患に罹患している、疾患に罹患するリスクを有する、又はそのような疾患の罹患若しくは発症が疑われるヒトであるのが好ましい。そのような使用では、改変された核酸分子は、疾患と関連するバイオマーカーに結合する能力を有する。

最後に、別の態様において、本発明は、サンプルを分析するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法における、本発明の方法により取得される改変された核酸分子の使用と関連する。そのようなサンプルの分析は、アナライトの有無を検出するように意図されている。そのように使用される場合、核酸分子はアナライトに結合する能力を有する。

本発明の方法により取得される改変された核酸分子の分析上及び診断上のアプリケーションは、核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏでハイブリダイゼーションする方法、又はアプタマーの場合、核酸を標的分子とｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏで結合させる方法、及び放射能、光の吸収又は放射率によってハイブリダイズした又は結合した核酸を検出する方法を包含し得ることを、当業者は理解するであろう。

合成アプリケーションには、不整触媒、核酸コード化ライブラリー、及びアフィニティークロマトグラフィーにおける核酸の使用が含まれる。

本発明に基づく核酸は、好ましくはホスホジエステルリンク又は結合を通じて、相互に共有結合したヌクレオチドから構成されるのが好ましいものと当業者は理解するであろう。本発明が主題とする核酸分子中に存在するその他のリンク又は結合は、それぞれホスホチオエートリンク及び結合、並びにそれぞれホスホアミデートリンク及び結合である。

縮合化剤及び縮合性剤という用語は、本明細書では同義的に使用されるものと理解される。

用語「本発明の（of the invention）」及び「本発明の（of the present invention）」は、本明細書では同義的に使用されるものと理解される。

本明細書で示される割合（％）は、いずれも容積／容積（ｖ／ｖ）であると理解される。

本発明は、表、図、及び実施例によって更に例証されるが、それらから更なる特性、実施形態、及び利点が把握され得る。

本発明に基づく方法の概略的な図表現を示す図である。 反応性のアミノ基の核酸への導入を可能にする試薬を示す図である。 ＰＥＧ化前の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６について、その代表的な未精製合成生成物のＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。 ＰＥＧ化後の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６について、その代表的な未精製合成生成物のＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。 ＰＥＧ化前の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６について、その代表的な未精製合成生成物のＲＰ－ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。 ＰＥＧ化後の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６について、その代表的な未精製合成生成物のＲＰ－ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。 コンジュゲーション前の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２について、その代表的な未精製合成生成物のＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。 ビオチンコンジュゲーション後の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２について、その代表的な未精製合成生成物のＬＣＭＳ分析結果を示す図である。 ビオチンコンジュゲーション後の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２について、その代表的な未精製合成生成物のＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。 ＰＥＧ化前の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２について、その代表的な未精製合成生成物のＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。 「新鮮な」ＰＥＧを用いてＰＥＧ化した後の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２について、その代表的な粗生成物のＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。 「新鮮な」ＰＥＧを用いてＰＥＧ化した後の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２について、その代表的な精製後生成物のＩＥＸ分析結果を示す図である。 「リサイクルされた」ＰＥＧを用いてＰＥＧ化した後の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２について、その代表的な粗生成物のＩＥＸ－ＨＰＬＣ分析結果を示す図である。 「リサイクルされた」ＰＥＧを用いてＰＥＧ化した後の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２について、その代表的な精製後生成物のＩＥＸ分析結果を示す図である。

［実施例１］
ＲＮＡの合成
ＲＮＡシュピーゲルマーを、ＡｋｔａＰｉｌｏｔ１００シンセサイザー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）を使用して、４８ｍＬの体積固定式のカラム内で２’－ＴＢＤＭＳ ＲＮＡホスホラミダイト化学を使用する固相合成法により生成した（Ｄａｍｈａ ａｎｄ Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９３，８１－１１４，Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）。Ｌ－ｒＡ（Ｎ－Ｂｚ）－、Ｌ－ｒＣ（Ａｃ）－、Ｌ－ｒＧ（Ｎ－ｉｂｕ）－、及びＬ－ｒＵ－ホスホラミダイトは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社からを購入した（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、米国）。５’－アミノ修飾剤ａｍＣ６をＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社から購入した（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、米国）。アミノ修飾シュピーゲルマーの合成を、Ｌ－ｒｉｂｏＧ、又はＬ－ｒｉｂｏＣ修飾ＣＰＧ、ポアサイズ６００Å上で開始した（Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社、Ａｓｔｏｎ、ＰＡ、米国）。代替法として、３’アミノ（ＴＦＡ）修飾ＣＰＧ、ポアサイズ１０００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、米国）も使用可能であった。カップリング（１サイクル当たり１２分）では、アセトニトリル中の０．６Ｍのエチルチオテトラゾール（Ａｚｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ社、Ａｎｚｈｅｎ、Ｗｕｘｉ、ＣＮ）、及びアセトニトリル中の０．２Ｍホスホラミダイト溶液について、それぞれ１．５～４等量を使用した。キャッピング－酸化サイクルを使用した。オリゴヌクレオチド合成用の標準的な溶媒及び試薬は、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ社（Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ、ＮＬ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ社（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｄ）、ＶＷＲ社（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｄ）、又はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｄ）からを購入した。シュピーゲルマーは、５’－ＭＭＴ－ＯＮで合成した。Ｗｉｎｃｏｔｔ等（Ｗｉｎｃｏｔｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９５，２３（１４），２６７７－２６８４）に基づき、ただし軽微な改変を施して切断及び脱保護を実現した。詳細には、自動的合成を終了したら、ＣＰＧ結合オリゴヌクレオチド（７００μｍｏｌ）を短時間乾燥し、そしてガラスボトルに移した。２００ｍＬのａｑ．ＭｅＮＨ_２（４０％）を添加し、そして懸濁物を室温で軽くかき混ぜた。９０分後、スラリーを濾過し、そして残留ＣＰＧをａｑ．ＥｔＯＨ（５０％）で数回洗浄した。一つにまとめた濾過液を濃縮し、そして最終的に乾燥するまで凍結乾燥した。２’－ＴＢＤＭＳ基の除去では、乾燥粗生成物を、１２０ｍＬのＤＭＳＯ、その後に６０ｍＬのＮＥｔ_３及び８０ｍＬのＮＥｔ_３・３ＨＦに溶解した。この混合物を６５℃で２時間軽くかき混ぜた。２’－ＴＢＤＭＳ基の切断後、１Ｌの氷水を添加することにより反応を急冷した。酢酸（２５ｍＬ）を添加してＭＭＴ基の除去を促進した。その後、２ｋＤａの再生セルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｄ）を使用するタンジェンシャルフロー濾過により、シュピーゲルマーを脱塩した。塩交換では、０．２５ＭのＮａＣｌ溶液、３Ｌを添加し、そして溶液をタンジェンシャルフロー濾過により脱塩した。最終的に、生成物を採取し、凍結乾燥により乾燥した。

［実施例２］
５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６の合成（１ｐｒｅＰＥＧ）
実施例１に記載されている手順を適用し、ヌクレオチドカップリング１サイクル当たり２ｅｑ．のアミダイトを用いて５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６（１ｐｒｅＰＥＧ）をアセンブルするのに、Ｌ－ｒＧ ＣＰＧ（６００Å、７０μｍｏｌ／ｇ、７１１μｍｏｌ）、１０．２ｇを使用した。ＵＦ後の収量：１５０７３２ＯＤ、純度：４７％、質量：１２９９７Ｄａ（観測値）、１２９９６Ｄａ（計算値）。

［実施例３］
５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２の合成（２ｐｒｅＰＥＧ）
実施例１に記載されている手順を適用し、ヌクレオチドカップリング１サイクル当たり２．５ｅｑ．のアミダイトを用いて５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２（２ｐｒｅＰＥＧ）をアセンブルするのに、Ｌ－ｒＣ ＣＰＧ（６００Å、７２μｍｏｌ／ｇ、１２３μｍｏｌ）、１．７ｇを使用した。ＵＦ後の収量：２３９８５ＯＤ、純度：５２％、質量：１４６５６Ｄａ（観測値）、１４６５６Ｄａ（計算値）。

［実施例４］
活性化用としてＰｙＢＯＰ及び共溶媒としてＤＭＦを使用した５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６のＰＥＧ化
水、１ｍＬに、１０００ＯＤ（４０ｍｇ、１．５４μｍｏｌ）の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６（１ｐｒｅＰＥＧ）を溶解した溶液に対して、ＤＭＦ、７５０ｍＬにＢｕ_４ＮＢｒ、１９３ｍｇ（６００μｍｏｌ）を溶解した溶液を、その後にＤＩＰＥＡ、６９μＬ（５２ｍｇ、４０５μｍｏｌ）を添加した。別の反応槽では、ＤＭＦ、２．５ｍＬに、４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、米国）、９２ｍｇ（２．３１μｍｏｌ）を溶解した。ＰＥＧ溶液に対して、ＤＭＦ、６０μＬに溶解したＰｙＢＯＰ、１．８ｍｇ（３．５μｍｏｌ）を、その後にＤＩＰＥＡ、６．０μＬ（４．６ｍｇ、３５μｍｏｌ）を添加した。ＰＥＧ溶液を、次に徹底的にボルッテックス撹拌し、そして２分後、オリゴヌクレオチド溶液に添加した。反応混合物を３０分間軽くかき混ぜた。ＲＰ－ＨＰＬＣにより反応をモニタリングすると、５２％の変換が明らかとなった。

［実施例５］
活性化用としてＰｙＢＯＰ及び共溶媒としてＤＭＳＯを使用した５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６のＰＥＧ化
水、１ｍＬに、１０００ＯＤ（４０ｍｇ、１．５４μｍｏｌ）の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６（１ｐｒｅＰＥＧ）を溶解した溶液に対して、ＤＭＳＯ、２ｍＬにＢｕ_４ＮＢｒ、１９３ｍｇ（６００μｍｏｌ）を溶解した溶液を、その後にＤＩＰＥＡ、６９μＬ（５２ｍｇ、４０５μｍｏｌ）を添加した。別の反応槽では、ＡＣＮ、０．５ｍＬに、４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、米国）、９２ｍｇ（２．３１μｍｏｌ）を溶解した。ＰＥＧ溶液に対して、ＡＣＮ、６０μＬに溶解したＰｙＢＯＰ、１．８ｍｇ（３．５μｍｏｌ）を、その後にＤＩＰＥＡ、６．０μＬ（４．６ｍｇ、３５μｍｏｌ）を添加した。ＰＥＧ溶液を、次に徹底的にボルッテックス撹拌し、そして２分後、オリゴヌクレオチド溶液に添加した。反応混合物を３０分間軽くかき混ぜた。ＲＰ－ＨＰＬＣにより反応をモニタリングすると、６０％の変換が明らかとなった。

［実施例６］
活性化用としてＴＢＴＵを使用した５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６のＰＥＧ化
水、１ｍＬに、１０００ＯＤ（４０ｍｇ、１．５４（μｍｏｌ））の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６（１ｐｒｅＰＥＧ）を溶解した溶液に対して、ＤＭＳＯ、２ｍＬにＢｕ_４ＮＢｒ、１９３ｍｇ（６００μｍｏｌ）を溶解した溶液を、その後にＤＩＰＥＡ、６９μＬ（５２ｍｇ、４０５μｍｏｌ）を添加した。別の反応槽では、ＡＣＮ、０．５ｍＬに、４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、米国）、９２ｍｇ（２．３１μｍｏｌ）を溶解した。ＰＥＧ溶液に対して、ＡＣＮ、６０μＬに溶解したＴＢＴＵ、１．１ｍｇ（３．５μｍｏｌ）を、その後にＤＩＰＥＡ、６．０μＬ（４．６ｍｇ、３５μｍｏｌ）を添加した。ＰＥＧ溶液を、次に徹底的にボルッテックス撹拌し、そして２分後、オリゴヌクレオチド溶液に添加した。反応混合物を、３０分間軽くかき混ぜた。ＲＰ－ＨＰＬＣにより反応をモニタリングすると、５９％の変換が明らかとなった。

［実施例７］
活性化用としてＣＯＭＵを使用した５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６のＰＥＧ化
水、１ｍＬに、１０００ＯＤ（４０ｍｇ、１．５４μｍｏｌ）の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６（１ｐｒｅＰＥＧ）を溶解した溶液に対して、ＤＭＳＯ、２ｍＬにＢｕ_４ＮＢｒ、１９３ｍｇ（６００μｍｏｌ）を溶解した溶液を、その後にＤＩＰＥＡ、６９μＬ（５２ｍｇ、４０５μｍｏｌ）を添加した。別の反応槽では、ＡＣＮ、０．５ｍＬに、４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、米国）、９２ｍｇ（２．３１μｍｏｌ）を溶解した。ＰＥＧ溶液に対して、ＡＣＮ、６０μＬに溶解したＣＯＭＵ、１．５ｍｇ（３．５μｍｏｌ）を、その後にＤＩＰＥＡ、６．０μＬ（４．６ｍｇ、３５μｍｏｌ）を添加した。ＰＥＧ溶液を、次に２分間徹底的にボルッテックス撹拌し、そしてオリゴヌクレオチド溶液に添加した。反応混合物を３０分間軽くかき混ぜた。ＲＰ－ＨＰＬＣにより反応をモニタリングすると、４５％の変換が明らかとなった。

［実施例８］
Ｂｕ_４ＮＢｒの存在下、活性化用としてＨＢＴＵを使用した５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６のＰＥＧ化
水、１ｍＬに、１０００ＯＤ（４０ｍｇ、１．５４μｍｏｌ）の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６（１ｐｒｅＰＥＧ）を溶解した溶液に対して、ＤＭＳＯ、２ｍＬにＢｕ_４ＮＢｒ、１９３ｍｇ（６００μｍｏｌ）を溶解した溶液を、その後にＤＩＰＥＡ、６９μＬ（５２ｍｇ、４０５μｍｏｌ）を添加した。別の反応槽では、ＡＣＮ、０．５ｍＬに、４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、米国）、９２ｍｇ（２．３１μｍｏｌ）を溶解した。ＰＥＧ溶液に対して、ＡＣＮ、７．５μＬに溶解したＨＢＴＵ、１．３ｍｇ（３．５μｍｏｌ）を、その後にＤＩＰＥＡ、６．０μＬ（４．６ｍｇ、３５μｍｏｌ）を添加した。ＰＥＧ溶液を、次に５分間徹底的にボルッテックス撹拌し、そしてオリゴヌクレオチド溶液に添加した。反応混合物を３０分間軽くかき混ぜた。ＲＰ－ＨＰＬＣにより反応をモニタリングすると、４２％の変換が明らかとなった。

［実施例９］
Ｂｕ_４ＮＢｒの非存在下、活性化用としてＨＢＴＵを使用した５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６のＰＥＧ化
水、６ｍＬに、６０００ＯＤ（２４０ｍｇ、９．２３μｍｏｌ）の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ｅ３６（１ｐｒｅＰＥＧ）を溶解した溶液に対して、ＤＭＳＯ、１２ｍＬを、その後にＤＩＰＥＡ、４１４μＬ（３０７ｍｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を添加した。別の反応槽では、ＡＣＮ、２．５ｍＬに、４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、米国）、５５４ｍｇ（１３．８μｍｏｌ）を溶解した。ＰＥＧ溶液に対して、ＡＣＮ、１００μＬに溶解したＨＢＴＵ、７．８５ｍｇ（２０．７μｍｏｌ）を、その後にＤＩＰＥＡ、３６．０μＬ（２６．８ｍｇ、２０７μｍｏｌ）を添加した。ＰＥＧ溶液を、次に５分間徹底的にボルッテックス撹拌し、そしてオリゴヌクレオチド溶液に添加した。反応混合物を３０分間軽くかき混ぜた。ＲＰ－ＨＰＬＣにより反応をモニタリングすると、４５．５％の変換が明らかとなった。

［実施例１０］
Ｂｕ_４ＮＢｒの非存在下、活性化用としてＨＢＴＵを使用した５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２のＰＥＧ化
水、１６ｍＬに、１５９６６ＯＤ（６３８ｍｇ、１９．６μｍｏｌ、５０％ＦＬＰ）の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２（２ｐｒｅＰＥＧ）を溶解した溶液に対して、ＤＭＳＯ、３２ｍＬを、その後にＤＩＰＥＡ、１．１２ｍＬを添加した。別の反応槽では、ＡＣＮ、８ｍＬに、４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、米国）、１．９７ｇ（４９．３μｍｏｌ）を溶解した。ＰＥＧ溶液に対して、ＡＣＮ、２００μＬに溶解したＨＢＴＵ、１９．９ｍｇ（５２．５μｍｏｌ）を、その後にＤＩＰＥＡ、８３μＬを添加した。ＰＥＧ溶液を、次に５分間徹底的にボルッテックス撹拌し、そしてオリゴヌクレオチド溶液に添加した。反応混合物を３０分間軽くかき混ぜた。ＲＰ－ＨＰＬＣにより反応をモニタリングすると、５８％の変換が明らかとなった。

［実施例１１］
活性化用としてＨＢＴＵを使用した５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２のビオチン化
水、２００μＬに、２００ＯＤ（８ｍｇ、０．２３７μｍｏｌ、５０％ＦＬＰ）の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２（２ｐｒｅＰＥＧ）を溶解した溶液に対して、ＤＭＳＯ、４００μＬを、その後にＤＩＰＥＡ、１２．５ｍＬを添加した。別の反応槽では、ＤＭＳＯ、９０μＬに、ビオチン、０．１６７ｍｇ（０．６８３μｍｏｌ）を溶解した。ビオチン溶液に対して、ＡＣＮ、１０μＬに溶解したＨＢＴＵ、０．２５９ｍｇ（０．６８３μｍｏｌ）を、その後にＤＩＰＥＡ、１．８μＬを添加した。ビオチン溶液を、次に１分間徹底的にボルッテックス撹拌し、そしてオリゴヌクレオチド溶液に添加した。反応混合物を３０分間軽くかき混ぜた。ＲＰ－ＨＰＬＣにより反応をモニタリングすると、５５％の変換が明らかとなった。３Ｍの酢酸ナトリウム溶液、２０μＬ、及びＥｔＯＨ、１０ｍＬを添加して粗生成物を析出させ、そして－２０℃で２時間保管した。析出物を遠心分離（４０００ｇ）及びデカンテーションにより収集した。ペレットを水に溶解し、そしてサイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩して、１５９ＯＤ（６．４ｍｇ、０．１９２μｍｏｌ）のビオチン化されたＮＯＸ－Ａ１２が得られ、ＩＥＸ－ＨＰＬＣにより純度は４５％であった。ＭＳ：１４８８３Ｄａ（計算値）、１４８８３Ｄａ（観測値）。

［実施例１２］
５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２のペグ化後に過剰に存在する４０ｋＤａ ＰＥＧ－ＣＯＯＨのＵＦリサイクリング
実施例１０に基づき調製した７９８３ＯＤの未精製ＮＯＸ－Ａ１２ＰＥＧ化生成物の一定分量について、３０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）再生セルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｄ）を使用するタンジェンシャルフロー限外濾過（ＵＦ）を実施した。ポンプ圧力を１バールに設定し、そしてフィードとして水、１０Ｌを使用した。被保持液を採取し、そして凍結乾燥して無色の固形物、０．８７ｇ（７２６４ＯＤ）を得た。濾液をその後濃縮し、そして２ｋＤａカットオフ再生セルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｄ）を使用するタンジェンシャルフロー濾過により脱塩した。ポンプ圧力を１バールに設定し、そしてフィードとして水を使用した。この方法を、濾液の示す導電性が２０μＳ／ｃｍ未満となるまで継続した。被保持液を採取し、凍結乾燥して無色の固形物として４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ、０．５１ｇを得た。

［実施例１３］
未精製のＮＯＸ－Ａ１２ＰＥＧ化混合物の限外濾過
実施例１０に基づき調製した７９８３ＯＤの未精製ＮＯＸ－Ａ１２ＰＥＧ化生成物の別の一定分量について、２ｋＤａのＭＷＣＯ再生セルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｄ）を使用するタンジェンシャルフロー限外濾過（ＵＦ）を実施した。ポンプ圧力を１バールに設定し、そしてフィードとして水、１０Ｌを使用した。被保持液を採取し、凍結乾燥して無色の固形物、１．３８ｇ（７８２９ＯＤ）を得た。

［実施例１４］
ＰＥＧ化されたＮＯＸ－Ａ１２のＩＥＸ－ＨＰＬＣ精製及び後続するＵＦ
実施例１２で得られた未精製ＮＯＸ－Ａ１２生成物、０．８７ｇ（７２６４ＯＤ）を、ＩＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより更に精製した。６０００ＯＤのサンプルの水溶液を、１２ｍＬのＴＯＳＯＨ Ｓｕｐｅｒ Ｑ５ＰＷ ＩＥＸ－ＨＰＬＣカラム（樹脂１ｍＬ当たり５００ＯＤ、５０℃）にチャージし、そして５０℃で下記のバッファー系からなるグラジエントを適用することにより溶出させた（バッファーＡ：２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．５、１０％のＡＣＮ；バッファーＢ：２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、１ＭのＮａＢｒ、ｐＨ７．５、１０％のＡＣＮ；グラジエント：２５ＣＶにおいて５％Ｂ～３５％Ｂ）。生成物を含有する分画（ＩＥＸ－ＨＰＬＣにより７５％を超えるＦＬＰ）をすべて一つにまとめ（８４２ＯＤ）、５ｋＤａのＭＷＣＯ再生セルロース膜（ミリポア社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用するＵＦにより脱塩し、最終的に凍結乾燥した。収量：８０１ＯＤ、７６％ＦＬＰ。

［実施例１５］
５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２のＰＥＧ化後に過剰に存在する４０ｋＤａ ＰＥＧ－ＣＯＯＨのＩＥＸ－ＨＰＬＣリサイクリング
実施例１３で得られた未精製ＮＯＸ－Ａ１２生成物（１．３８ｇ、７８２９ＯＤ）を、ＩＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより更に精製した。６０００ＯＤのサンプルの水溶液を、１２ｍＬのＴＯＳＯＨ Ｓｕｐｅｒ Ｑ５ＰＷ ＩＥＸ－ＨＰＬＣカラム（樹脂１ｍＬ当たり５００ＯＤ、５０℃）にチャージし、そして５０℃で下記のバッファー系からなるグラジエントを適用することにより溶出させた（バッファーＡ：２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．５、１０％のＡＣＮ；バッファーＢ：２５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、１ＭのＮａＢｒ、ｐＨ７．５、１０％のＡＣＮ；グラジエント：２５ＣＶにおいて５％Ｂ～３５％Ｂ）。ローディング及び２ＣＶローディング後洗浄の期間中、通過画分を収集し、２ｋＤａのＭＷＣＯ再生セルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｄ）により脱塩し、そして凍結乾燥して無色の４０ｋＤａ ＰＥＧ－ＣＯＯＨの固形物、４１０ｍｇを得た。生成物を含有する分画（ＩＥＸ－ＨＰＬＣにより７５％を超えるＦＬＰ）をすべて一つにまとめ（１００４ＯＤ）、５ｋＤａのＭＷＣＯ再生セルロース膜（ミリポア社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用するＵＦにより脱塩し、そして最終的に凍結乾燥した。収量：１０４２ＯＤ、７６％ＦＬＰ。

［実施例１６］
５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２のＰＥＧ化において後続的に使用されるリサイクルされた４０ｋＤａ ＰＥＧ－ＣＯＯＨの乾燥
実施例１２及び１５に例示するように、ＩＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラフィー又はタンジェンシャルフロー濾過により回収した４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨを、アセトニトリル（２０ｍＬ／ｇ）に溶解し、そしてモレキュラーシーブ乾燥パッド上、オーバーナイトで保管して残留水分をすべて取り除いた。モレキュラーシーブを除去し、そしてＰＥＧ溶液を減圧濃縮した。

［実施例１７］
「新鮮な」４０ｋＤａ ＰＥＧ－ＣＯＯＨ、及び活性化用としてＨＢＴＵを使用する５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２のＰＥＧ化
水、１００μＬに、１００ＯＤ（４ｍｇ、０．１４μｍｏｌ、５０％ＦＬＰ）の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２（２ｐｒｅＰＥＧ）を溶解した溶液に対して、ＤＭＳＯ、２００μＬを、その後にＤＩＰＥＡ、７．５ｍＬを添加した。別の反応槽では、ＡＣＮ、６０μＬに、「新鮮な」４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、米国）、１３．７ｍｇ（０．３４μｍｏｌ）を溶解した。ＰＥＧ－ＣＯＯＨ溶液に対して、ＡＣＮ、１０μＬに溶解したＨＢＴＵ、０．１３ｍｇ（０．３４μｍｏｌ）を、その後にＤＩＰＥＡ、０．６μＬを添加した。ＰＥＧ溶液を、５分間徹底的にボルッテックス撹拌し、そしてオリゴヌクレオチド溶液に添加した。反応混合物を、３０分間軽くかき混ぜた。ＲＰ－ＨＰＬＣにより反応をモニタリングすると、４３％の変換が明らかとなった。

［実施例１８］
「ＵＦ回収した」４０ｋＤａ ＰＥＧ－ＣＯＯＨ、及び活性化用としてＨＢＴＵを使用する５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２のＰＥＧ化
水、１００μＬに、１００ＯＤ（４ｍｇ、０．１４μｍｏｌ、５０％ＦＬＰ）の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２（２ｐｒｅＰＥＧ）を溶解した溶液に対して、ＤＭＳＯ、２００μＬを、その後にＤＩＰＥＡ、７．５ｍＬを添加した。別の反応槽では、ＡＣＮ、６０μＬに、「ＵＦ回収」及び乾燥した（実施例１２及び１６と同様に取得した）４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ、１３．７ｍｇ（０．３４μｍｏｌ）を溶解した。ＰＥＧ溶液に対して、ＡＣＮ、１０μＬに溶解したＨＢＴＵ、０．１３ｍｇ（０．３４０μｍｏｌ）を、その後にＤＩＰＥＡ、０．６μＬを添加した。ＰＥＧ－ＣＯＯＨ溶液を、５分間徹底的にボルッテックス撹拌し、そしてオリゴヌクレオチド溶液に添加した。反応混合物を、３０分間軽くかき混ぜた。ＲＰ－ＨＰＬＣにより反応をモニタリングすると、４８％の変換が明らかとなった。

［実施例１９］
「ＩＥＸ－ＨＰＬＣ回収した」４０ｋＤａ ＰＥＧ－ＣＯＯＨ、及び活性化用としてＨＢＴＵを使用する５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２のＰＥＧ化
水、１００μＬに、１００ＯＤ（４ｍｇ、０．１４μｍｏｌ、５０％ＦＬＰ）の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２（２ｐｒｅＰＥＧ）を溶解した溶液に対して、ＤＭＳＯ、２００μＬを、その後にＤＩＰＥＡ、７．５ｍＬを添加した。別の反応槽では、ＡＣＮ、６０μＬに、「ＩＥＸ－ＨＰＬＣ回収した」及び乾燥した（実施例１５及び１６と同様に取得した）４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ、１３．７ｍｇ（０．３４μｍｏｌ）を溶解した。ＰＥＧ溶液に対して、ＡＣＮ、１０μＬに溶解したＨＢＴＵ、０．１３ｍｇ（０．３４μｍｏｌ）を、その後にＤＩＰＥＡ、０．６μＬを添加した。ＰＥＧ－ＣＯＯＨ溶液を、５分間徹底的にボルッテックス撹拌し、そしてオリゴヌクレオチド溶液に添加した。反応混合物を３０分間軽くかき混ぜた。ＲＰ－ＨＰＬＣにより反応をモニタリングすると、４７％の変換が明らかとなった。

［実施例２０］
５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２の固相合成
実施例１に記載されている手順を適用して、ヌクレオチドカップリング１サイクル当たり２.５ｅｑ．のアミダイトを用いて、５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２（２ｐｒｅＰＥＧ）をアセンブルするのに、Ｌ－ｒＣ ＣＰＧ、１．７０ｇ（６００Å、７２μｍｏｌ／ｇ、１２２μｍｏｌ）を使用した。脱保護及びＵＦ後の収量：２３３７８ＯＤ、純度：４９％、質量：１４６５６Ｄａ（観測値）、１４６５６Ｄａ（計算値）。

［実施例２１］
「新鮮な」４０ｋＤａ ＰＥＧ－ＣＯＯＨによる５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２のＰＥＧ化、及びＮＯＸ－Ａ１２を生成するための後続する下流処理
水、６ｍＬに、６０００ＯＤ（２４０ｍｇ、７．８６μｍｏｌ、４８％ＦＬＰ）の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２（２ｐｒｅＰＥＧ、実施例２０に基づき合成した）を溶解した溶液に対して、ＤＭＳＯ、１２ｍＬを、その後にＤＩＰＥＡ、０．４２ｍＬを添加した。別の反応槽では、ＡＣＮ、２．５５ｍＬに、４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、米国）、６２８ｍｇ（１５．７μｍｏｌ）を溶解した。ＰＥＧ溶液に対して、ＡＣＮ、５０μＬに溶解したＨＢＴＵ、５．９６ｍｇ（１５．７μｍｏｌ）、その後にＤＩＰＥＡ、４０μＬを添加した。ＰＥＧ溶液を、５分間徹底的にボルッテックス撹拌し、そしてオリゴヌクレオチド溶液に添加した。反応混合物を、３０分間軽くかき混ぜた。ＲＰ－ＨＰＬＣにより反応をモニタリングして、３９％の変換が明らかとなった。ＡＣＮ、０．７ｍＬに、４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ（ＪｅｎＫｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ａｌｌｅｎ、ＴＸ、米国）、１５７ｍｇ（１．９７μｍｏｌ）を溶解させることにより、０．５ｅｑのＰＥＧ－ＣＯＯＨについて、その追加の一定分量を調製した。ＰＥＧ溶液に対して、ＡＣＮ、１２．５μＬに溶解したＨＢＴＵ、１．４９ｍｇ（１．９７μｍｏｌ）、その後にＤＩＰＥＡ、１０μＬを添加した。ＰＥＧ溶液を、５分間徹底的にボルッテックス撹拌し、そしてオリゴヌクレオチド溶液に添加した。反応混合物を、３０分間軽くかき混ぜた。ＲＰ－ＨＰＬＣにより反応を改めてモニタリングして、５２％の変換が明らかとなった。０．５ｅｑの活性化したＰＥＧ－ＣＯＯＨを追加添加すると、更に３０分後、５８％の変換を実現した。水、５００ｍＬで希釈することにより反応を停止し、そして３０ｋＤａのＭＷＣＯ再生セルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｄ）を使用してタンジェンシャルフロー濾過を実施した。ポンプ圧力を１バールに設定し、そしてフィードとして水、２０Ｌを使用した。被保持液を採取し、５５８１ＯＤが得られた。未精製ＮＯＸ－Ａ１２生成物を、ＩＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより更に精製した。生成物を１２ｍＬのＴＯＳＯＨ Ｓｕｐｅｒ Ｑ５ＰＷ ＩＥＸ－ＨＰＬＣカラム（樹脂１ｍＬ当たり５００ＯＤ、５０℃）にチャージし、そして５０℃で下記のバッファー系からなるグラジエントを適用することにより溶出させた（バッファーＡ：２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１０％のＡＣＮ；バッファーＢ：２５ｍＭトリス、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５、１０％のＡＣＮ；グラジエント：２５ＣＶにおいて５％Ｂ～３５％Ｂ）。生成物を含有する分画（ＩＥＸ－ＨＰＬＣにより７５％を超えるＦＬＰ）をすべて一つにまとめ、２ｋＤａのＭＷＣＯ再生セルロース膜（ミリポア社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用するＵＦにより脱塩し、そして最終的に凍結乾燥した。収量：１４７４ＯＤ、７５％ＦＬＰ。

［実施例２２］
「ＩＥＸ－ＨＰＬＣ回収した」４０ｋＤａ ＰＥＧ－ＣＯＯＨによる５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２のＰＥＧ化、及びＮＯＸ－Ａ１２を生成するための後続する下流処理
水、６ｍＬに、６０００ＯＤ（２４０ｍｇ、７．８６μｍｏｌ、４８％ＦＬＰ）の５’ＮＨ_２－ＮＯＸ－Ａ１２（２ｐｒｅＰＥＧ、実施例２０に基づき合成した）を溶解した溶液に対して、ＤＭＳＯ、１２ｍＬを、その後にＤＩＰＥＡ、０．４２ｍＬを添加した。別の反応槽では、ＡＣＮ、２．５５ｍＬに、「ＩＥＸ－ＨＰＬＣ回収した」及び乾燥した４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ（実施例１５及び１６と同様に取得した）、６２８ｍｇ（１５．７μｍｏｌ）を溶解した。ＰＥＧ溶液に対して、ＡＣＮ、５０μＬに溶解したＨＢＴＵ、５．９６ｍｇ（１５．７μｍｏｌ）を、その後にＤＩＰＥＡ、４０μＬを添加した。ＰＥＧ溶液を、５分間徹底的にボルッテックス撹拌した後、それをオリゴヌクレオチド溶液に添加した。反応混合物を、３０分間軽くかき混ぜた。ＲＰ－ＨＰＬＣにより反応をモニタリングすると、２９％の変換が明らかとなった。０．５ｅｑ．のＰＥＧ－ＣＯＯＨについて、その追加の一定分量を、「ＩＥＸ回収した」及び乾燥した４０ｋＤａのＰＥＧ－ＣＯＯＨ、１５７ｍｇ（１．９７μｍｏｌ）をＡＣＮ、０．７ｍＬに溶解することにより調製した。ＰＥＧ溶液に対して、ＡＣＮ、１２．５μＬに溶解したＨＢＴＵ、１．４９ｍｇ（１．９７μｍｏｌ）を、その後にＤＩＰＥＡ、１０μＬを添加した。ＰＥＧ溶液を、５分間徹底的にボルッテックス撹拌し、そしてオリゴヌクレオチド溶液に添加した。反応混合物を３０分間軽くかき混ぜた。ＲＰ－ＨＰＬＣにより反応を改めてモニタリングすると、３７％の変換が明らかとなった。「ＩＥＸ回収した」及び乾燥した活性化ＰＥＧ－ＣＯＯＨについて、その第２及び第３回の０．５ｅｑ．を添加すると、更に３０分後、４５％及び５２％の変換を実現した。水、５００ｍＬ中で希釈することにより反応を停止し、そして３０ｋＤａのＭＷＣＯ再生セルロース膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｄ）を使用するタンジェンシャルフロー濾過を実施した。ポンプ圧力を１バールに設定し、フィードとして水、２０Ｌを使用した。被保持液を採取し、そして凍結乾燥して５７１１ＯＤを得た。未精製ＮＯＸ－Ａ１２生成物をＩＥＸ－ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより更に精製した。生成物を１２ｍＬのＴＯＳＯＨ Ｓｕｐｅｒ Ｑ５ＰＷ ＩＥＸ－ＨＰＬＣカラム（樹脂１ｍＬ当たり５００ＯＤ、５０℃）にチャージし、そして５０℃で下記のバッファー系からなるグラジエントを適用することにより溶出させた（バッファーＡ：２５ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１０％のＡＣＮ；バッファーＢ：２５ｍＭのトリス、２ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５、１０％のＡＣＮ；グラジエント：２５ＣＶにおいて５％Ｂ～３５％Ｂ）。生成物を含有する分画（ＩＥＸ－ＨＰＬＣにより７５％を超えるＦＬＰ）すべてを一つにまとめ、２ｋＤａのＭＷＣＯ再生セルロース膜（ミリポア社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用するＵＦにより脱塩し、そして最終的に凍結乾燥した。収量：１２４２ＯＤ、７０％ＦＬＰ。

本明細書で開示する本発明の特性、特許請求の範囲、及び／又は図面は、個別及びその任意の組み合わせの両方において、その様々な形態で本発明を実現するのに不可欠であり得る。
出願時の特許請求の範囲は、以下の通り。
［請求項１］
第１の反応物質と第２の反応物質を反応させることにより、核酸部分及び非核酸部分を含む改変された核酸分子を調製する方法であって、前記第１の反応物質が、前記非核酸部分とカルボキシル基とを含み、前記第２の反応物質が、前記核酸部分と前記核酸部分に連結したアミノ基を含むアミノ修飾部とを含むアミノ修飾核酸分子であり、
ａ）水混和性有機溶媒中の縮合試薬により、前記第１の反応物質、好ましくは前記第１の反応物質のカルボキシル基を活性化させるステップと、
ｂ）ステップａ）の前記活性化した第１の反応物質、好ましくは前記活性化した第１の反応物質のカルボキシル基と、水中に、又は水混和性有機溶媒と水からなる混合物中に溶解した前記第２の反応物質、好ましくは前記アミノ修飾核酸分子のアミノ修飾部のアミノ基とを反応させるステップと
を含み、それによって改変された核酸分子が形成される、前記方法。
［請求項２］
前記アミノ修飾核酸分子が、四級アンモニウム塩の存在下で、水と水混和性有機溶媒からなる混合物中に溶解している、請求項１に記載の方法。
［請求項３］
ステップａ）の前記活性化した第１の反応物質が、水中に、又は水混和性有機溶媒と水からなる混合物中に溶解した前記アミノ修飾核酸分子に添加される、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
［請求項４］
前記第１の反応物質及び／又は前記非核酸部分が、ポリアルコキシ化合物、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、核酸、炭化水素部分、及びペプチド、タンパク質、糖タンパク質、核酸、及び／又は炭化水素に基づく部分とは異なる化学的部分を含む群から選択され、好ましくは前記第１の反応物質及び／又は前記非核酸部分が、ポリアルコキシ化合物である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
［請求項５］
前記アミノ修飾核酸分子が、分析法、診断、及び／又は治療において使用するのに適する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
［請求項６］
前記アミノ修飾核酸分子が、アミノ修飾アプタマー、アミノ修飾シュピーゲルマー、アミノ修飾免疫賦活性核酸、アミノ修飾ｓｉＲＮＡ、アミノ修飾ｍｉＲＮＡ分子、及びアミノ修飾核酸アンチセンス分子を含む群から選択され、好ましくは、アプタマーは、Ｌ－及び／又はＤ－ヌクレオチドからなるアプタマーであり、並びに／或いは前記核酸部分が、アプタマー、シュピーゲルマー、免疫賦活性核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ分子、及び核酸アンチセンス分子を含む群から選択され、好ましくは、アプタマーは、Ｌ－及び／又はＤ－ヌクレオチドからなるアプタマーである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
［請求項７］
ステップｂ）において、前記活性化した第１の反応物質ついて、前記アミノ修飾核酸分子よりも過剰の分子が使用される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
［請求項８］
前記過剰が、前記活性化した第１の反応物質の分子と前記アミノ修飾核酸分子とのモル比として表わされ、前記モル比が、約１．１～約１０、好ましくは約１．５～約３．５である、請求項７に記載の方法。
［請求項９］
ステップａ）に基づき前記第１の反応物質を活性化させるために、前記第１の反応物質が水混和性有機溶媒に溶解され、縮合性剤及び塩基、好ましくは、最初に縮合性剤、その後に塩基が添加され、好ましくは、前記縮合性剤が水混和性有機溶媒に溶解される、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１０］
前記塩基が、非求核塩基である、請求項９に記載の方法。
［請求項１１］
前記塩基を添加した後、０．２５分～６０分の間、好ましくは０．５分～２０分の間、及びより好ましくは１．０分～５．０分の間、このようにして得られた溶液が、前記アミノ修飾核酸分子を含有する溶液に添加され、好ましくは前記塩基を添加した後、１．０分～５．０分の間、前記縮合性剤及び前記塩基を含む溶液が、前記アミノ修飾核酸分子を含有する溶液に添加される、請求項９または１０に記載の方法。
［請求項１２］
前記縮合性剤が、
ａ）ホスホニウム塩、例えばＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＰｙＢｒｏｐ、ＡＯＰ、ＰｙＡＯＰ、ＢｒＯＰ、及びＰｙＣｌＯＰ等、
ｂ）ウロニウム塩、例えばＨＣＴＵ、ＴＣＴＵ、ＴＢＴＵ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＴＯＴＵ、及びＣＯＭＵ等、並びに
ｃ）カルボジイミド、
を含む群から選択され、
好ましくは、縮合溶媒が、ＰｙＢＯＰ、ＴＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＨＢＴＵ、より好ましくはＨＢＴＵである、請求項９から１１のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１３］
前記カルボジイミドが、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、及びＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド）を含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
［請求項１４］
前記水混和性有機溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、メチルエチルスルホキシド、ホルムアミド、メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、エチルホルムアミド、エチルメチルホルムアミド、ジエチルホルムアミド、２－ピロリドン、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ－エチルピロリドン、アセトニトリル、アセトン、エチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、ジエチルケトン、メチルイソプロピルケトン、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、酢酸メチル、酢酸エチル、メチルプロパノエート、テトラヒドロフラン、及びジオキサン、好ましくはジメチルホルムアミド、アセトニトリル、及びジメチルスルホキシドを含む群から選択される、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１５］
前記塩基が、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリメチルアミン、及びＤＢＵを含む群、好ましくはジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）から選択される、請求項９から１４のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１６］
前記第１の反応物質に対する前記塩基のモル比が、１に等しい又はそれを上回る、請求項９から１５のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１７］
前記アミノ修飾核酸分子の溶液が、塩基、好ましくは非求核塩基を含有し、その場合、好ましくは、前記アミノ修飾核酸分子内のホスホジエステルの数に対する前記非求核塩基のモル比が３を上回る、請求項９から１６のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１８］
ステップａ）が、５℃～６０℃の温度、好ましくは１０℃～４０℃の温度、より好ましくは１５℃～３０℃の温度、最も好ましくは周囲温度で実施される、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１９］
ステップｂ）が、５℃～６０℃の温度、好ましくは１０℃～４０℃の温度、より好ましくは１５℃～３０℃の温度、最も好ましくは周囲温度で実施される、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２０］
前記活性化した第１の反応物質のカルボキシル基と前記アミノ修飾核酸分子のアミノ基との反応が、５分～６時間後、好ましくは１５分～４５分後、より好ましくは１５～３０分後に完了する、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２１］
ステップｂ）が、７．５～１０のｐＨ範囲、好ましくは７．５～９のｐＨ範囲、及びより好ましくは７．５～８．５のｐＨ範囲で実施される、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２２］
ステップｂ）において、前記アミノ修飾分子の８０％～１００％が前記第１の反応物質と反応するまで、好ましくは前記アミノ修飾核酸分子の９０％～１００％が前記第１の反応物質と反応するまで、前記活性化した第１の反応物質が、前記アミノ修飾核酸分子の溶液に添加される、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２３］
ステップｂ）の終了後に、未反応の第１の反応物質のすべてが限外濾過及び／又はクロマトグラフィーにより、好ましくはイオン交換クロマトグラフィーにより反応から分離される、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２４］
分離された第１の反応物質が、ステップａ）においてリサイクル及び使用される、請求項２３に記載の方法。
［請求項２５］
前記ポリアルコキシ化合物が、直鎖状又は分岐状のポリアルコキシ化合物である、請求項４から２４のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２６］
前記ポリアルコキシ化合物が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリグリセロールを含む群から選択される、請求項４から２５のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２７］
前記ポリアルコキシ化合物が、ポリエチレングリコールである、請求項４から２６のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２８］
前記ポリアルコキシ化合物が、５，０００Ｄａ～１００，０００Ｄａ、好ましくは２０，０００Ｄａ～８０，０００Ｄａ、より好ましくは４０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項４から２７のいずれか１項に記載の方法。
［請求項２９］
請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法により取得される改変された核酸分子。
［請求項３０］
治療における使用のための、請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法により取得される改変された核酸分子。
［請求項３１］
診断における使用のための、請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法により取得される改変された核酸分子。
［請求項３２］
サンプルを分析するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法における、請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法により取得される改変された核酸分子の使用。

Claims (12)

1. 第１の反応物質と第２の反応物質を反応させることにより、核酸部分及び非核酸部分を含む改変された核酸分子を調製する方法であって、前記第１の反応物質が、前記非核酸部分とカルボキシル基とを含み、当該非核酸部分がポリアルコキシ化合物であり、前記第２の反応物質が、前記核酸部分と前記核酸部分に連結したアミノ基を含むアミノ修飾部とを含むアミノ修飾核酸分子であり、
   ａ）水混和性有機溶媒中の縮合試薬により、前記第１の反応物質のカルボキシル基を活性化させるステップと、
   ｂ）ステップａ）の前記活性化した第１の反応物質のカルボキシル基と、水中に、又は水混和性有機溶媒と水からなる混合物中に溶解した前記アミノ修飾核酸分子のアミノ修飾部のアミノ基とを反応させるステップと
   を含み、それによって改変された核酸分子が形成される、前記方法。
2. 前記アミノ修飾核酸分子が、四級アンモニウム塩の存在下で、水と水混和性有機溶媒からなる混合物中に溶解している、及び／または、
   ステップａ）の前記活性化した第１の反応物質が、水中に、又は水混和性有機溶媒と水からなる混合物中に溶解した前記アミノ修飾核酸分子に添加される、請求項１に記載の方法。
3. 前記アミノ修飾核酸分子が、アミノ修飾アプタマー、アミノ修飾シュピーゲルマー、アミノ修飾免疫賦活性核酸、アミノ修飾ｓｉＲＮＡ、アミノ修飾ｍｉＲＮＡ分子、及びアミノ修飾核酸アンチセンス分子を含む群から選択され、好ましくは、アプタマーは、Ｌ－及び／又はＤ－ヌクレオチドからなるアプタマーであり、並びに／或いは前記核酸部分が、アプタマー、シュピーゲルマー、免疫賦活性核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ分子、及び核酸アンチセンス分子を含む群から選択され、好ましくは、アプタマーは、Ｌ－及び／又はＤ－ヌクレオチドからなるアプタマーである、請求項１または２に記載の方法。
4. ステップｂ）において、前記活性化した第１の反応物質ついて、前記アミノ修飾核酸分子よりも過剰の分子が使用され、好ましくは、前記過剰が、前記活性化した第１の反応物質の分子と前記アミノ修飾核酸分子とのモル比として表わされ、前記モル比が、約１．１～約１０、好ましくは約１．５～約３．５である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. ステップａ）に基づき前記第１の反応物質を活性化させるために、前記第１の反応物質が水混和性有機溶媒に溶解され、縮合試薬及び塩基、好ましくは、最初に縮合試薬、その後に塩基が添加され、好ましくは、前記縮合試薬が水混和性有機溶媒に溶解される、好ましくは、前記塩基が、非求核塩基であり、より好ましくは、前記塩基が、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリメチルアミン、及びＤＢＵを含む群、好ましくはジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）から選択される請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記縮合試薬が、
   ａ）ホスホニウム塩、例えばＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＰｙＢｒｏｐ、ＡＯＰ、ＰｙＡＯＰ、ＢｒＯＰ、及びＰｙＣｌＯＰ等、
   ｂ）ウロニウム塩、例えばＨＣＴＵ、ＴＣＴＵ、ＴＢＴＵ、ＨＢＴＵ、ＨＡＴＵ、ＴＯＴＵ、及びＣＯＭＵ等、並びに
   ｃ）カルボジイミド、好ましくは、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド）、ＥＤＣ（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、及びＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド）を含む群から選択されるカルボジイミド、
   を含む群から選択され、
   好ましくは、前記縮合試薬が、ＰｙＢＯＰ、ＴＢＴＵ、ＣＯＭＵ、ＨＢＴＵ、より好ましくはＨＢＴＵである、請求項５に記載の方法。
7. 前記水混和性有機溶媒が、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ジメチルスルホキシド、ジエチルスルホキシド、メチルエチルスルホキシド、ホルムアミド、メチルホルムアミド、ジメチルホルムアミド、エチルホルムアミド、エチルメチルホルムアミド、ジエチルホルムアミド、２－ピロリドン、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ－エチルピロリドン、アセトニトリル、アセトン、エチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、ジエチルケトン、メチルイソプロピルケトン、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、酢酸メチル、酢酸エチル、メチルプロパノエート、テトラヒドロフラン、及びジオキサン、好ましくはジメチルホルムアミド、アセトニトリル、及びジメチルスルホキシドを含む群から選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
8. ステップｂ）の終了後に、未反応の第１の反応物質のすべてが限外濾過及び／又はクロマトグラフィーにより、好ましくはイオン交換クロマトグラフィーにより反応から分離される、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
9. 分離された第１の反応物質が、ステップａ）においてリサイクル及び使用される、請求項８に記載の方法。
10. 前記ポリアルコキシ化合物が、直鎖状又は分岐状のポリアルコキシ化合物である、請求項３から９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記ポリアルコキシ化合物が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリグリセロールを含む群から選択される、請求項３から１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記ポリアルコキシ化合物が、５，０００Ｄａ～１００，０００Ｄａ、好ましくは２０，０００Ｄａ～８０，０００Ｄａ、より好ましくは４０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項３から１１のいずれか１項に記載の方法。

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