KR20190088062A - 과량의 폴리알콕시화 시약의 회수 및 재순환을 위한 핵산의 폴리알콕시화 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제1 반응물 및 제2 반응물을 반응시킴으로써 핵산 모이어티(moiety) 및 비-핵산 모이어티를 포함하는 변형 핵산 분자의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 제1 반응물은 비-핵산 모이어티 및 카복실기를 포함하고, 상기 제2 반응물은 핵산 모이어티 및 상기 핵산 모이어티에 결합되는 아미노기를 포함하는 아미노 변형을 포함하는 아미노-변형 핵산 분자이며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 상기 제1 반응물, 바람직하게는 제1 반응물의 카르복실기를 수혼화성 유기 용매(water miscible organic solvent)에서 응축제(condensation reagent)에 의해 활성화시키는 단계, 및 b) 상기 단계 a)의 활성화된 제1 반응물, 바람직하게는 제1 반응물의 활성화된 카르복실기, 및 제2 반응물, 바람직하게는 물 또는 수혼화성 유기 용매와 물의 혼합물에 용해된 아미노-변형 핵산 분자의 아미노 변형의 아미노기를 반응시키는 단계로서, 이에 의해 변형된 핵산 분자가 형성된다.

Description

과량의 폴리알콕시화 시약의 회수 및 재순환을 위한 핵산의 폴리알콕시화 방법
본 발명은 제1 반응물 및 제2 반응물을 반응시킴으로써 핵산 모이어티(moiety) 및 비-핵산 모이어티를 포함하는 변형된 핵산 분자의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 제1 반응물은 비-핵산 모이어티 및 카복실기를 포함하고, 상기 제2 반응물은 핵산 모이어티 및 상기 핵산 모이어티에 결합되는 아미노기를 포함하는 아미노 변형을 포함하는 아미노-변형 핵산 분자이고, 상기 방법에 의해 수득된 변형 핵산 분자, 치료에 사용하기 위한 상기 방법에 의해 수득된 변형 핵산 분자, 진단에 사용하기 위한 상기 방법에 의해 수득된 변형 핵산 분자, 샘플을 분석하기 위한 시험관 내(in vitro) 방법에서 상기 방법에 의해 수득된 변형 핵산 분자의 용도에 관한 것이다.
핵산, 펩타이드, 단백질 및 나노 입자와 같은 약물과 폴리알콕시 화합물과 같은 다른 모이어티의 컨쥬게이션(conjuagation)은 치료적 이용에서 생체이용률, 안정성, 안전성 및 효능을 증가시키기 위해 널리 사용된다. 올리고뉴클레오타이드 치료제 분야에서, 압타머(aptamer) 및 스피에겔머(spiegelmers)(거울-이미지 압타머로 지칭)는 일반적으로 폴리알콕시화된다. 폴리에틸렌 글리콜(약칭 PEG)은 정맥 내, 구강 및 피부로 투여되는 약물의 일부로서 식품 의약품 안전청(Food and Drug Administration)에 의해 승인된 일반적으로 사용되는 폴리알콕시 화합물이다.
일반적으로 폴리알콕시화된 핵산은 반응기를 함유하고 있는 핵산을 고상에서 조립하는 방법으로 처음 제조된다(Hoffmann et. al, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry 2011, 4:4.46.1-4.46.30). 고상으로부터의 절단 및 탈보호 후, 합성된 핵산을 역상 고성능 액체 크로마토 그래피 (약칭 RP-HPLC) 또는 이온 교환 크로마토그래피 고성능 액체 크로마토 그래피 (약칭 IEX-HPLC) 또는 초미세여과(약칭 UF)와 같은 방법으로 정제한다. 이어서, 핵산의 반응성 기는 적합한 일치하는 반응기를 갖는 폴리알콕시 화합물과 반응하여 폴리알콕시 화합물과 핵산의 컨쥬게이트를 형성할 수 있다. 접합 후, 폴리알콕시화 핵산 분자 및 비-폴리알콕시화 핵산 분자로 이루어진 조생성물(crude product)은 HPLC, 특히 RP- 또는 IEX-HPLC 및 초미세여과를 조합한 방법에 의해 정제된다.
폴리알콕시화 반응의 수율은 폴리알콕시화되는 핵산의 성질 및 순도, 폴리 알콕시화 반응의 유형 및 반응 조건 자체에 의존한다. 핵산의 폴리알콕시화에 사용되는 가장 일반적인 반응 유형은 다음과 같다:
a) 염기의 존재하에서 아미노-변형 올리고뉴클레오타이드에 의한 폴리알콕시 카르복실 산 활성 에스테르의 아미노분해(aminolysis);
b) 말레이미드기를 갖는 폴리알콕시 화합물에 티올-변형 올리고뉴클레오타이드의 첨가; 및
c) 알킨기를 갖는 폴리알콕시 화합물과 아지드-변형 올리고뉴클레오타이드 또는 아지드기를 갖는 폴리알콕시 화합물과 알킨-변형 올리고뉴클레오타이드의 1,3-양극성 고리화첨가반응(1,3-dipolar cycloaddition).
가장 널리 사용되는 폴리알콕시화 반응은 염기의 존재하에 아미노-변형 올리고뉴클레오타이드에 의한 폴리알콕시카르복실 산 활성 에스테르의 아미노분해이다. 이 반응은 빠르고 확장시키기가 용이하다. 말레이미드-티올 첨가는 임의의 염기를 필요로 하지 않으며 빠르고 선택적 반응이지만, 티올은 DTT와 같은 환원제와 별도의 반응 단계에서 이황화물 전구체로부터 유리될 필요가 있다. 과량의 DTT는 또한 말레이미드에 첨가되어 수율을 감소시킬 것이므로 컨쥬게이션 반응 전에 완전히 제거되어야 한다. DTT의 제거는 방출된 티올이 산화될 수 있기 때문에 신속히 해야한다. 이것은 대규모 생산에 대한 사용을 복잡하게 한다. "클릭 반응(click-reaction)"이라고도 불리는 1,3-양극성 고리화첨가반응은 촉매 또는 입체적으로 제한된(sterically constrained) 알킨 종으로서 구리의 존재를 필요로 한다. 금속이 없는 "클릭 반응(click-reaction)"을 위해 아지드 또는 입체적으로 제한된 알킨은 올리고뉴클레오타이드의 절단 및 탈보호에 사용되는 메틸아민/암모니아와 같은 친핵성 염기에 대해 민감하기 때문에, 둘다 합성적으로 올리고뉴클레오타이드 포스트에 도입할 필요가 있다.
말레이미드-티올 첨가 및 "클릭-반응"의 한계를 고려하여, 폴리알콕시화 된 올리고뉴클레오타이드의 대규모 제조는 아미노-변형 올리고뉴클레오타이드에 의한 폴리알콕시카르복실 산 활성 에스테르의 아미노 분해에 의해 가장 잘 수행된다. 전형적으로, 폴리알콕시카르복실 산은 별도의 반응으로 제조된 N-히드록시 숙신이미드 에스테르로서 활성화되고, 정제되어 이용전까지 저장된다. 이들의 반응성 성질로 인해, 상술한 에스테르는 상응하는 유리 폴리알콕시카르복실 산 및 N-히드록시 숙신이미드로 가수 분해되기 쉽다. 이는 필연적으로 이러한 물질의 취급, 저장 또는 선적시 예방 조치를 요구한다.
본 발명의 근본적인 문제는 변형된 핵산 분자, 보다 구체적으로는 PEG화된 핵산 분자와 같은 폴리알콕시화된 핵산 분자의 제조 방법을 제공하는 것이다.
이러한 문제 및 기타 문제는 첨부된 독립항의 주제에 의해 해결된다. 바람직한 실시예는 첨부된 종속항으로부터 취해질 수 있다.
본 발명의 기초가 되는 문제점은 제1 양태의 제1 구현예인 제1 양태에서 보다 구체적으로 해결되며, 이는 제1 반응물(reactant) 및 제2 반응물을 반응시킴으로써 핵산 모이어티(moiety) 및 비-핵산 모이어티를 포함하는 변형된 핵산 분자의 제조 방법으로서, 상기 제1 반응물은 비-핵산 모이어티 및 카복실기를 포함하고, 상기 제2 반응물은 핵산 모이어티 및 상기 핵산 모이어티에 결합되는 아미노기를 포함하는 아미노 변형을 포함하는 아미노-변형 핵산 분자이며, 상기 방법은 다음 단계를 포함하며:
a) 상기 제1 반응물, 바람직하게는 제1 반응물의 카르복실기를 수혼화성 유기 용매(water miscible organic solvent)에서 응축제(condensation reagent)에 의해 활성화시키는 단계, 및
b) 상기 단계 a)의 활성화된 제1 반응물, 바람직하게는 제1 반응물의 활성화된 카르복실기, 및 제2 반응물, 바람직하게는 물 또는 수혼화성 유기 용매와 물의 혼합물에 용해된 아미노-변형 핵산 분자의 아미노 변형의 아미노기를 반응시키는 단계로서, 이에 의해 변형된 핵산 분자가 형성된다.
또한, 제1 양태의 제1 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제2 구현예에서, 상기 아미노-변형 핵산 분자는 4차 암모늄 염의 존재하에서 물 및 수혼화성 유기 용매의 혼합물에 용해된다.
또한, 제1 양태의 제1 및 제2 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제3 구현예에서, 상기 단계 a)의 활성화된 제1 반응물은 물 또는 수혼화성 유기 용매와 물의 혼합물에 용해된 아미노-변형 핵산 분자에 첨가된다.
또한, 제1 양태의 제1, 제2 및 제3 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제4 구현예에서, 상기 제1 반응물 및/또는 상기 비-핵산 모이어티는 폴리알콕시 화합물, 펩타이드, 단백질, 당 단백질, 핵산, 탄수화물 모이어티 및 펩타이드, 단백질, 당 단백질, 핵산 및/또는 탄수화물-기반 모이어티와 상이한 화학적 모이어티를 포함하는 그룹으로부터 선택되며, 바람직하게는 상기 제1 반응물 및/또는 상기 비-핵산 모이어티는 폴리알콕시 화합물이다.
또한, 제1 양태의 제1, 제2, 제3 및 제4 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제5 구현예에서, 상기 아미노-변형 핵산 분자는 분석 방법, 진단 및/또는 치료에서의 사용에 적합하다.
또한, 제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제6 구현예에서, 상기 아미노-변형 핵산 분자는 아미노-변형 압타머, 아미노-변형 스피에겔머, 아미노-변형 면역자극 핵산, 아미노-변형 siRNA, 아미노-변형 miRNA 분자 및 아미노-변형 핵산 안티센스 분자를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 압타머는 L- 및/또는 D-뉴클레오타이드로 구성된 압타머이고 및/또는
상기 핵산 모이어티는 압타머, 스피에겔머, 면역자극 핵산, siRNA, miRNA 분자 및 핵산 안티센스 분자를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 압타머는 L- 및/또는 D-뉴클레오타이드로 구성된 압타머이다.
또한, 제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제7 구현예에서, 상기 단계 b)에서 아미노-변형 핵산 분자에 대해 활성화된 제1 반응물의 과량의 분자가 사용된다.
또한, 제1 양태의 제7 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제8 구현예에서, 상기 과량은 활성화된 제1 반응물 및 아미노-변형 핵산 분자의 분자 몰비(molar ratio)로 표현되고, 상기 몰비는 약 1.1 내지 약 10, 바람직하게는 약 1.5 내지 약 3.5이다.
또한, 제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 및 제8 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제9 구현예에서, 상기 단계 a)에 따른 제1 반응물을 활성화시키기 위해 상기 제1 반응물은 수혼화성 유기 용매, 및 응축제 및 염기, 바람직하게는 먼저 응축제 및 후속으로 염기가 첨가되어 용해되고, 상기 응축제는 바람직하게는 수혼화성 유기 용매에 용해된다.
또한, 제1 양태의 제9 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제10 구현예에서, 상기 염기는 비-친핵성(non-nucleophilic) 염기이다.
또한, 제1 양태의 제9 및 제10 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제11 구현예에서, 상기 염기 첨가 후 0.25 분 내지 60 분, 바람직하게는 0.5 분 내지 20 분, 보다 바람직하게는 1.0 분 내지 5.0 분 사이에, 수득된 용액을 아미노-변형 핵산 분자를 함유하는 용액에 첨가하고, 바람직하게는 염기 첨가 후 1.0 분 내지 5.0 분 사이에 응축제 및 염기를 포함하는 용액을 아미노-변형 핵산 분자를 함유하는 용액에 첨가한다.
또한, 제1 양태의 제9, 제10 및 제11 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제12 구현예에서, 상기 응축제는
a) BOP, PyBOP, PyBrop, AOP, PyAOP, BrOP 및 PyClOP와 같은 포스포늄 염,
b) HCTU, TCTU, TBTU, HBTU, HATU, TOTU 및 COMU와 같은 우로늄 염 및
c) 카르보디이미드(carbodiimides),
를 포함하는 그룹으로부터 선택되고,
상기에서 바람직하게는 응축 용매는 PyBOP, TBTU, COMU, HBTU, 더욱 바람직하게는 HBTU이다.
또한, 제1 양태의 제12 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제13 구현예에서, 상기 카르보디이미드는 DCC (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide), EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid) 및 DIC (N,N'-diisopropylcarbodiimide)를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
또한, 제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12 및 제13 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제14 구현예에서, 상기 수혼화성 유기 용매는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, sec-부탄올, tert-부탄올, 디메틸 술폭시드, 디에틸 술폭시드, 메틸 에틸 술폭시드, 포름아미드, 메틸 포름아미드, 디메틸 포름아미드, 에틸 포름아미드, 에틸 메틸 포름아미드, 디에틸 포름아미드, 2-피롤리돈, N-메틸피롤리돈, N-에틸피 롤리돈, 아세토니트릴, 아세톤, 에틸 메틸 케톤, 메틸 프로필 케톤, 디에틸 케톤, 메틸 이소프로필 케톤, 메틸 포르메이트, 에틸 포르메이트, 프로필 포르메이트, 이소프로필 포르메이트, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 메틸 프로파노에이트, 테트라히드로푸란 및 디옥산, 바람직하게는 디메틸 포름아미드, 아세토니트릴 및 디메틸 술폭시드를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
또한, 제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13 및 제14 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제15 구현예에서, 상기 염기는 DIPEA(diisopropylethylamine), 트리메틸아민(trimethylamine) 및 DBU을 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 DIPEA(diisopropylethylamine)이다.
또한, 제1 양태의 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14 및 제15 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제16 구현예에서, 상기 염기 대 제1 반응물의 몰비는 1 이상이다.
또한, 제1 양태의 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15 및 제16 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제17 구현예에서, 상기 아미노-변형 핵산 분자의 용액은 염기, 바람직하게는 비-친핵성 염기를 함유하고, 이에 따라 바람직하게는 아미노-변형 핵산 분자에서 비-친핵성 염기 대 포스포디에스테르의 수의 몰비는 3 보다 크다.
또한, 제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16 및 제17 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제18 구현예에서, 상기 단계 a)는 5℃ 내지 60℃의 온도, 바람직하게는 10℃ 내지 40℃의 온도, 보다 바람직하게는 15℃ 내지 30℃의 온도, 가장 바람직하게는 주위 온도(ambient temperature)에서 수행된다.
또한, 제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17 및 제18 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제19 구현예에서, 상기 단계 b)는 5℃ 내지 60℃의 온도, 바람직하게는 10℃ 내지 40℃의 온도, 보다 바람직하게는 15℃ 내지 30℃의 온도, 가장 바람직하게는 주위 온도(ambient temperature)에서 수행된다.
또한, 제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18 및 제19 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제20 구현예에서, 상기 아미노-변형 핵산 분자의 아미노기와 제1 반응물의 활성화된 카르복시기의 반응은 5 분 내지 6 시간 후, 바람직하게는 15 분 내지 45 분 후, 보다 바람직하게는 15 내지 30 분 후에 완료된다.
또한, 제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19 및 제20 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제21 구현예에서, 상기 단계 b)는 7.5 내지 10의 pH 범위, 바람직하게는 7.5 내지 9의 pH 범위, 보다 바람직하게는 7.5 내지 8.5의 pH 범위에서 수행된다.
또한, 제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20 및 제21 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제22 구현예에서, 상기 단계 b)에서 활성화된 제1 반응물은 아미노-변형 분자의 80 % 내지 100 %가 제1 반응물과 반응할 때까지, 바람직하게는 아미노-변형 핵산 분자의 90 % 내지 100 %가 제 1 반응물과 반응할 때까지 아미노-변형 핵산 분자의 용액에 첨가된다.
또한, 제1 양태의 제1, 제2, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21 및 제22 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제23 구현예에서, 상기 단계 b)의 완료 후 반응으로부터 임의의 비-반응 제1 반응물을 초미세여과 및/또는 크로마토그래피, 바람직하게는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리한다.
또한, 제1 양태의 제23 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제24 구현예에서, 상기 분리된 제1 반응물은 단계 a)에서 재순환되고 사용된다.
또한, 제1 양태의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21 및 제22, 제23 및 제24 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제25 구현예에서, 상기 폴리알콕시 화합물은 직쇄 또는 분지쇄의 폴리알콕시 화합물이다.
또한, 제1 양태의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21 및 제22, 제23, 제24 및 제25 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제26 구현예에서, 상기 폴리알콕시 화합물이 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜, 폴리글리세롤을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
또한, 제1 양태의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21 및 제22, 제23, 제24, 제25 및 제26 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제27 구현예에서, 상기 폴리알콕시 화합물은 폴리에틸렌 글리콜이다.
또한, 제1 양태의 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10, 제11, 제12, 제13, 제14, 제15, 제16, 제17, 제18, 제19, 제20, 제21 및 제22, 제23, 제24, 제25, 제26 및 제27 구현예의 일 구현예인 제1 양태의 제28 구현예에서, 상기 폴리알콕시 화합물은 5,000 Da 내지 100,000 Da, 바람직하게는 20,000 Da 내지 80,000 Da, 보다 바람직하게는 40,000 Da의 분자량을 갖는다.
본 발명의 기초가 되는 문제점은 임의의 구현예를 포함하는, 제1 양태에 따른 방법으로 수득된 변형 핵산 분자에 의해 제2 양태에서 해결된다.
본 발명의 기초가 되는 문제점은 임의의 구현예를 포함하는, 치료에 사용하기 위한, 제1 양태에 따른 방법으로 수득된 변형 핵산 분자에 의해 제3 양태에서 해결된다.
본 발명의 기초가 되는 문제점은 임의의 구현예를 포함하는, 진단에 사용하기 위한, 제1 양태에 따른 방법으로 수득된 변형 핵산 분자에 의해 제4 양태에서 해결된다.
본 발명의 기초가 되는 문제점은 임의의 구현예를 포함하는, 샘플을 분석하기 위한 시험 관내 (in vitro) 방법에서, 제1 양태에 따른 방법으로 수득된 변형 핵산 분자에 의해 제5 양태에서 해결된다.
본 발명은 당업계에서 공지된 바와 같이 폴리알콕시화된 핵산의 보다 효율적인 생산을 가능하게 하는 아미노-변형 올리고뉴클레오타이드의 폴리알콕시화에 대한 개선된 프로토콜의 놀랄만한 확인을 기반으로 한다(Hoffmann et. al, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry 2011, 4:4.46.1-4.46.30). 본 발명은 특히 콘쥬게이션 반응 직전에 응축제로 활성화된 폴리알콕시카르복실 산과 아미노-변형 핵산을 반응시키는 단계를 포함하는 폴리알콕시화된 핵산의 제조 방법을 제공한다. 또한, 놀랍게도, 반응을 완료시키기 위해 과량으로 사용된 폴리알콕시카르복실 산이 조 폴리알콕시화 생성물의 UF 및/또는 HPLC 정제와 같은 다운-스트림 처리 중에 회수될 수 있음이 발견되었다. 건조 후, 재순환된 폴리알콕시카르복실 산을 또 다른 폴리알콕시화 반응에 재사용할 수 있었다.
본 발명의 방법은 종래 기술 방법에 비해 다양한 이점을 갖는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 방법은 덜 노동집약적이며, 과량으로 사용되는 카르복실기를 갖는 제1 반응물의 재순환을 가능하게 하는 보다 환경 친화적인 제조 공정이다. 또한, 카르복실기를 갖는 제1 반응물의 제조는 적은 제조 단계를 요구하며, 따라서 종래 기술에 기재된 활성화된 카르복시 반응물의 제조 및 단리보다 덜 노동집약적이다. 또한, 카르복실기를 갖는 제1 반응물은 종래 기술에 기재된 활성화된 카르 복실 모이어티보다 더욱 안정적이고 특별한 저온 저장 조건을 필요로 하지 않으므로 본 발명의 방법의 이점이 있다.
상술한 관점 및 본 발명에 따라, 폴리알콕시카르복실 산 자체는 아미노-변형 올리고뉴클레오타이드와 같은 아미노-변형 핵산 분자와의 반응을 위한 출발 물질로서 사용되어 변형된 핵산 분자 및 변형된 올리고뉴클레오타이드를 각각 형성할 수 있으며, 이에 따라 변형은 바람직하게는 폴리알콕시 모이어티 및 보다 바람직하게는 PEG 모이어티이다.
본 발명의 방법의 구현예에서, 본 발명의 방법의 단계 a)에서 제조된 활성화 된 제1 반응물을 아미노-변형 핵산 분자와 반응시켜, 반응을 용액 중에서 발생시키고; 상기 용액의 원소는 상기 활성화된 제1 반응물 및 상기 아미노-변형 핵산 분자 및 용매를 포함하며, 용매는 물 및 수혼화성 유기 용매와 물의 혼합물을 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게는, 활성화된 제1 반응물 및/또는 아미노 변형 핵산 분자는 용매 또는 상기 용매의 일부에 용해되거나 분산된다. 본 명세서에서 바람직하게 사용되는 바와 같이, 용매의 일부는 용매의 제1 상(phase) 또는 용매에 의해 형성된 상 중 하나이다.
본 발명의 방법의 구현예에서, 활성화된 제1 반응물을 아미노-변형 핵산에 첨가함으로써, 바람직하게는 아미노-변형 핵산이 용액에 존재한다. 대안적인 구현예에서, 바람직하게는 용액 중에 존재하는 아미노-변형 핵산을 제1 활성화된 반응물, 바람직하게는 단계 a)의 제1 활성화된 반응물에 첨가한다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 핵산 모이어티는 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 비-핵산 모이어티는 카르복실기를 갖는다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 아미노-변형 핵산 분자는 핵산 모이어티 및 상기 핵산 모이어티에 결합된 아미노 변형을 포함한다.
본 발명의 방법의 구현예에서, 아미노-변형 핵산 분자를 제1 반응물과 반응시키기 전에 아미노-변형 핵산 분자를 물 또는 수혼화성 유기 용매와 물의 혼합물에 용해시켰다. 따라서, 제1 반응물과의 반응 전후에 아미노-변형 핵산 분자가 존재하는 용액은 상이하고, 상기 용액 및 상기 용액을 형성하는 용매에 대해서도 마찬가지이다.
일 구현예 및 바람직하게는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 탄수화물 모이어티는 탄수화물 또는 탄수화물의 중합체를 포함하는 모이어티이다. 탄수화물 모이어티는 탄수화물, 탄수화물의 중합체, 당단백질, 뉴클레오타이드 및 핵산을 포함 하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 아미노-변형 면역자극(immunostimulatory) 핵산은 아미노-변형 면역자극 핵산이다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 면역자극 핵산은 면역자극 핵산이다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 압타머는 바람직하게는 왓슨-크릭 염기쌍 또는 후그스틴(Hoogsteen) 염기쌍과 상이한 결합을 통해 표적에 결합하는 표적 결합 핵산이다. 바람직하게는, 상기 압타머는 D-뉴클레오타이드로 구성된다. 대안적인 구현예에서, 상기 압타머는 D-뉴클레오타이드 및 적어도 하나의 L-뉴클레오티드모두를 포함하는 혼합된 압타머이며, 이에 따라 바람직하게는 상기 압타머 중의 L-뉴클레오타이드의 수가 D-뉴클레오타이드의 수보다 적다.
본 발명의 방법의 구현예에서, 스피에겔머(Spiegelmer)는 바람직하게는 왓슨 -크릭 염기쌍 또는 후그스틴 염기쌍과 상이한 결합을 통해 표적에 결합하는 L-뉴클레오타이드의 표적 결합 핵산이다. 바람직하게는 스피어겔머는 L-뉴클레오타이드로 구성된다. 대안적인 구현예에서, 스피에겔머는 L-뉴클레오타이드 및 적어도 하나의 D-뉴클레오타이드 모두를 포함하는 혼합된 스피에겔머이며, 이에 따라 바람직하게는 상기 압타머 중의 D-뉴클레오타이드의 수가 L-뉴클레오타이드의 수보다 적다.
압타머 및 스피에겔머 모두 변형될 수 있다. 이러한 변형은 상기 압타머 및 스피에겔머의 뉴클레오타이드 서열의 단일 뉴클레오티드와 관련될 수 있으며 당업계에 잘 공지되어있다. 이러한 변형에 대한 예는, 특히 Venkatesan 그룹 (Venkatesan, N., Kim, S.J., et al., Curr. Med. Chem. 10, 1973 (2003)) 및 Kusser 그룹(Kusser, W., J. Biotechnol. 74, 27 (2000))에 기술된다. 이러한 변형은 압타머가 구성되는 개별 뉴클레오타이드의 2' 위치의 H 원자, F 원자 또는 OCH3 기 또는 NH2-기일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 압타머는 하나 이상의 LNA(locked nucleotide) 또는 UNA(unlocked nucleotide)를 포함할 수 있다.
일 구현예 및 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 바람직하게는 주위 온도는 20℃ 내지 22℃를 의미한다.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, 아미노-변형 핵산 분자는 아미노기를 포함하고; 바람직하게는, 아미노기는 카르복실기, 바람직하게는 활성화된 카르복시기와 반응할 수 있다.
본 발명의 방법의 구현예에서, 활성화된 제1 반응물은 응축제에 의해 활성화되는 제1 반응물이고; 바람직하게는, 활성화된 제1 반응물은 활성화된 카르복실기를 포함하는 제1 반응물이고, 이에 의해 활성화된 카르복실기는 응축제에 의해 활성화된 제1 반응물의 카르복실기로부터 유래된다.
본 발명의 방법의 구현예에 사용된 4차 암모늄 염은 물과 수혼화성 유기 용매의 혼합물에서 아미노-변형 핵산 분자의 용해도를 향상시키는 데 사용된다. 이는 테트라알킬 암모늄 클로라이드, 테트라알킬 암모늄 브로마이드, 테트라알킬 암모늄 테트라플루오로 보레이트, 테트라알킬 헥사플루오로 포스페이트, 테트라알킬 하이드로겐 설페이트, 테트라알킬 하이드로겐 포스페이트를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 상기 알킬은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 개의 C-원자를 포함하며, 바람직하게는 4차 암모늄 화합물은 테트라부틸 암모늄 브로마이드이다.
본 발명의 방법의 구현예에서, 지방산은 하나 또는 수 개의 이중 결합을 갖는 포화 및 불포화 지방산을 포함한다. 포화 및 불포화 지방산은 8 내지 30 탄소 원자의 사슬 길이, 즉, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 개의 탄소 원자를 가질 수 있다.
본 발명의 방법의 구현예에서, 스테로이드는 콜레스테롤과 같은 코르티코스테로이드, 콜산 및 리톨콜산과 같은 담즙산, 코르티솔 또는 프로게스테론과 같은 스테로이드 호르몬, 디곡시게닌과 같은 스테로이드 배당체 및 상기 스테로이드의 대사 산물을 포함한다.
본 발명의 방법의 구현예에서, 염기 및 바람직하게는 비-친핵성 염기는 DIPEA(diisopropylethylamine), 트리메틸아민, 트리이소프로필아민과 같은 트리알킬아민, t-Bu-P4, 1,8-디아자바이시클로운덱-7-엔(DBU)과 같은 퍼알킬화된 입체 장애 아민, 2,6-디-tert-부틸피리딘, 1,8-비스(디메틸아미노)나프탈렌, 리튬 테트라 메틸피페리다이드, 포타슘 tert-부톡시드, 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 2,2,6,6- 테트라메틸피페리딘을 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 염기는 DIPEA(diisopropylethylamine)이다.
본 발명의 폴리알콕시화 방법은 천연 당 모이어티, 예컨대, 2'-데옥시리보 핵산(이하, "DNA") 및 리보핵산(이하 "RNA")을 함유하는 핵산 및 변형 당 모이어티, 변형 포스페이트 모이어티, 또는 변형 핵염기를 함유하는 핵산에 적용할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 RNA 및 DNA의 천연 입체 이성질체에 제한되지 않는다. 또한 D/L-하이브리드 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 당-, 포스페이트- 또는 뉴클레오티드-변형 L-DNA 또는 L-RNA 뿐만 아니라 거울상 DNA (L-DNA) 또는 RNA (L-RNA)를 포함하는 폴리알콕시화 핵산 및 이의 변형은 본 발명에 따른 방법에 의해 제조될 수 있다. 당 모이어티에 대한 변형은 고리 크기(예를 들어, 푸라노즈, 헥소오스)의 변경, 단일 고리 원자(예를 들어, 카바 당, 아자 당)의 대체, 도입 또는 제거, 측쇄 그룹 또는 원자(예를 들어, 2'-F, 2'OMe)의 대체, 도입 또는 제거, 에이사이클릭 또는 폴리 사이클릭 유도체(예를 들어, 언락 핵산, 아미노산 핵산, 락 핵산, 트리사이클릭 핵산)에 의한 고리의 교체, 핵염기(α-아노머릭 방향, 헥시톨 핵산)의 방향 또는 위치를 포함한다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 천연 또는 비-천연 비염기성(abasic) 모이어티(예를 들어, 테트라하이드로푸란, 에틸렌글리콜)로 이루어질 수 있다. 변형된 포스페이트 모이어티는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스페이트, 포스포로아미데이트 및 포스포로티오아미데이트를 포함한다. 핵염기의 변형은 이노신, 크산틴, 5,6- 디하이드로우라실 또는 5-메틸시토신과 같은 자연 발생적 변형이거나 또는 C5-알키닐피리미딘, N-알킬화된 퓨린 및 피리미딘, 피리미딘 및 퓨린의 C6- 및/또는 C5-유도체 및 기타와 같은 인공적 변형일 수 있다. 또한, 핵산은 상기 명명된 변형 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
핵산의 조립 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 구현예에서, 핵산은 보호된 빌딩 블록을 고체 지지체상의 발생기 핵산에 단계적으로 커플링시키는 포스포라미디트 방법에 의해 조립될 것이다 (Beaucage et. al., Tetrahedron 1992, 48(12), 2223-2311). 바람직한 구현예에서, 합성 방향은 3'에서 5' 방향이지만, 5'에서 3'방향으로의 역합성도 가능하다(Srivastava et. al. Nucleic Acids Symposium Series 2008, 52, 103-104). 원하는 핵산 서열이 조립되고 다운스트림 프로세싱에 필요한 모든 변형이 도입되면, 핵산은 고체 지지체로부터 절단되고 탈보호된다. 핵산은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 정제될 수 있다.
일반적으로, 절단 및 탈보호 단계는 암모니아 및/또는 알킬아민 또는 암모니아 염의 사용을 포함한다. 예를 들어, RNA는 NH3/MeNH2로 절단된 후 NEt3·HF 또는 Bu4NF로 절단된다. 후속의 폴리알콕시화의 경우, 이들 아민 및 암모늄 염은 폴리알콕시화 동안 커플링 효능을 저하시키는 원치 않는 부반응을 야기하기 때문에 제거되어야 한다. 아민 종의 제거는 다량의 소디윰 염을 첨가한 후 침전 또는 초미세여과하거나, 용출을 위해 소디윰 염 구배를 사용하여 IEX-HPLC 동안 수행할 수 있는 염 교환에 의해 달성된다. IEX-HPLC 정제 후, 폴리알콕시화 전에 과량의 염을 제거하는 것이 또한 필요하다. 필요한 경우, 복수의 상이한 기술이 적용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 폴리알콕시화 전에 염 교환 후 초미세여과가 사용된다. 제2 반응물 및 바람직하게는 아미노-변형 핵산 분자, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드에서 아미노-변형의 위치는, 3'-말단 및/또는 5'-말단 및/또는 제2 반응물 및 바람직하게는 아미노-변형 핵산 분자, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 뉴클레오티드와 5' 말단 뉴클레오타이드 사이의 임의의 위치일 수 있다. 본 발명을 설명하기 위해 실시예에 사용된 아미노 변형 핵산을 실시예 1 내지 3에 따라 합성하고 정제하였다.
본 발명에 사용될 수 있는 폴리알콕시 화합물은 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(프로필렌 옥사이드) 및 혼합된 폴리(에틸렌 옥사이드)/폴리(프로필렌 옥사이드) 화합물을 포함한다. 폴리알콕시 화합물은 바람직하게는 하기 화학식을 갖는다: PrO-(CH2CH2O-)x-(CH2CHRO-)-y-(CH2CH2O-)zQ, 상기에서, x, y 및 z는 각각 독립적으로 0 또는 양의 정수이고, x, y 및 z 중 적어도 하나는 0이 아니며; R은 H 또는 알킬, 예컨대 C1, C2, C3 또는 C4 알킬, 바람직하게는 메틸기이고, Pr은 캡핑기 또는 표지기이고, Q는 올리고뉴클레오타이드와 커플링을 허용하는 기이다. x, y 또는 z가 0이 아닌 경우, 이들은 전형적으로 1000 이하이다. 일부 구현예에서, x는 3 내지 1000, 예를 들어 100 내지 500이고, y 및 z는 모두 0이다. 다른 구현예에서, x 및 y는 각각 독립적으로 3 내지 1000, 예를 들어 100 내지 500이고, z는 0이다. 또 다른 구현예에서, x 및 z는 각각 독립적으로 3 내지 500, 예를 들어 100 내지 300이고, y는 3 내지 1000, 예를 들어 100 내지 500이다. 바람직하게는, 폴리알콕시 화합물은 캡핑되며, 예를 들어 C1, C2, C3 또는 C4 알킬, 바람직하게는 메틸기이다. Pr로 나타낼 수 있는 표지기는 플루오레세인 및 비오틴 또는 임의의 다른 반응기, 예를 들어 티올, 말레이미드, 아지드 또는 알킨을 포함한다. 사용된 폴리알콕시 화합물은 일반적으로 평균 분자량 및 약칭 화학 이름(예를 들어, PEG=폴리(에틸렌 글리콜); PPG=폴리(프로필렌 글리콜))으로 식별된다. 폴리알콕시 화합물은 선형 또는 분지형일 수 있고, 일반적으로 약 0.2 kD 내지 약 60 kD, 바람직하게는 약 2 kD 내지 약 40 kD의 평균 분자량을 갖는다. 폴리알콕시 화합물이 측쇄인 경우, 올리고 뉴클레오타이드와의 커플링을 허용하는 기 Q는 2 개 이상의 폴리알콕시 모이어티를 가질 수 있다. 예를 들어, Q는 2 개의 폴리알콕시 모이어티 및 반응성 기를 갖는 라이신 또는 등가의 모이어티를 나타낼 수 있다. 본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드와의 커플링을 허용하는 기 Q는 카르복실 산 모이어티를 포함한다. 바람직하게는, 폴리알콕시 화합물은 PEG이다.
카르복실기를 포함하는 제1 반응물과 제2 반응물, 즉, 아미노기를 포함하는 아미노-변형 핵산 분자 사이에서 본 발명의 방법에서 바람직하게 실현되는 카르복실 산과 아민 간의 아미드 결합 형성은 160-180℃에서 달성될 수 있는 응축 반응이다 (Jursic, BS; Zdravkovski, Z. Synth. Commun., 1993, 23, 2761-2770). 그러나, 고온은 올리고뉴클레오타이드와 양립할 수 없다. 따라서, 카르복실 산은 예를 들어 에스테르로서 활성화된다. p-니트로페놀 (pNP), 펜타플루오로페놀, N-히드록시 숙신이미드 (NHS), 히드록시벤조트리아졸 (HOBt) 및 기타와 같은 전자 흡인 알콜의 에스테르는 카르보닐 중심에서 증가된 친전자성을 나타내어 다양한 친핵체와 반응하기 쉽다. 이에 따라, 이러한 종류의 알콜이 본 발명의 방법의 구현예에서 바람직하다. 이것들은 온화한 조건 하에서 아민과 반응하여 원하는 아미드를 얻는다. DNA, RNA 또는 단백질과 같은 생체 분자에 폴리알콕시카르복실 산을 접합시키는 데 가장 보편적으로 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (NHS-ester)가 사용된다.
바람직하게는, 아미노-변형 올리고뉴클레오타이드와 PEG-NHS-에스테르의 반응은 물 및 수혼화성 유기 용매를 포함하는 수성 유기 용매 또는 용액에서 수행된다. 바람직한 유기 용매는 비양성자성, 극성이고, 예를 들어 DMF, DMSO, NMP 또는 아세토니트릴을 포함한다. 수혼화성 유기 용매를 포함하는 용액 중의 유기 용매의 농도는 약 10% 내지 약 75%로 다양할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드와 같은 핵산은 일반적으로 제2 반응물에 동등하게 적용되는 약 알칼리성 수용액에서 사용되거나 존재한다. 중탄산 나트륨 또는 붕산 나트륨과 같은 약 알칼리성 pH 완충액뿐만 아니라 NEt3 또는 DIPEA와 같은 비-친핵성 3차 아민 염기를 달성하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 용액의 pH를 8.5 내지 9.5로 조정한다. 완충을 위해 비-친핵성 아민을 사용하는 경우, 이는 존재하는 올리고뉴클레오타이드에 의해 제공되는 포스포디에스테르 브릿지의 총 수에 대하여 2 내지 5 배 과량으로 염기를 첨가함으로써 달성될 수 있다. PEG-NHS-에스테르는 수혼화성 유기 용매에서 용액으로 사용되며 올리고뉴클레오티드의 수용액에 첨가될 때 용액에 남는다. PEG-NHS-에스테르 및 올리고뉴클레오타이드의 몰비는 스케일 및 반응성에 따라 올리고 뉴클레오타이드에 의해 제공된 반응성 아미노기 당 1:1 내지 5:1로 다양 할 수 있다. PEG-NHS-에스테르의 첨가는 바람직하게는 반응이 완료될 때까지 계속된다. 반응은 당업자가 이용할 수 있는 모든 분석 기술에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 구현예에서, RP-HPLC는 PEG화 반응을 따르기 위해 적용된다. 최적의 전환율을 달성하기 위해서는, 온도가 주위 온도 내지 45℃까지 다양할 수 있다.
상술한 폴리알콕시카르복실 산-NHS 에스테르, 또는 보다 구체적으로는 PEG-NHS 에스테르는 바람직하게는 별도의 반응으로 사전-형성되고, 후속으로 정제되어 본 발명의 방법에 이들이 사용될 때까지 저장된다. NHS-에스테르는 예를 들어 카르 보디이미드와 같은 응축제, 예컨대, DCC, EDC 또는 DIC의 존재하에 카르복실 산과 NHS의 반응에 의해 제조된다. 펩타이드 화학에서, 과량의 응축제는 카르복실 산과 아민 사이의 아미드 결합 형성에 이용가능하다. 응축제의 그룹은 BOP, PyBOP, PyBrop, AOP, PyAOP, BrOP 및 PyClOP와 같은 포스포늄 염, HCTU, TCTU, TBTU, HBTU, HATU, TOTU 및 COMU와 같은 우로늄 염 및 기타를 포함하고(C. A. G. N. Montalbetti, V. Falque Tetrahedron, 2005, 61, 10827-10852, Ayman El-Faham and Fernando Albericio, Chem. Rev., 2011, 111, (11), 6557-6602) 이들 모두는 본 발명의 구현예들에서 사용될 수 있다. 응축제는 카르복실 산과 반응하여 아민 또는 다른 친핵체에 대해 높은 반응성을 갖는 에스테르를 형성하여, 온화한 조건 하에서 원하는 응축 반응을 가능하게 하는 시약이다. DMF, NMP, DMSO, ACN 또는 CH2Cl2와 같은 수분 함량이 낮은 유기 용매에서 용액 및 고체상 펩티드 합성에서 아미드 결합 형성이 수행된다. 그러나, 올리고뉴클레오타이드는 물이 없는 유기 용매에 용해되지 않는다.
본 발명자는 추가로 놀랍게도, 응축제와 함께 PEG-COOH의 활성화를 0.5 분 내지 60 분, 바람직하게는 1 내지 20 분의 기간에 걸쳐 수혼화성 유기 용매에서 수행한 다음, 활성화된 PEG를 물 중 아미노-변형 올리고뉴클레오타이드에 첨가하는 경우, 상기 언급된 일반적인 응축제가 PEG화된 올리고뉴클레오티드를 제조하는 맥락에서 PEG카르복시산(PEG-COOH)의 활성화를 위해 매우 효율적으로 사용될 수 있음을 발견했다(실시예 4-10 참조). 도 3은 A) IEX-HPLC 및 C) RP-HPLC로 분석한 경우, PEG화 전에 조 5'-아미노변형 L-RNA 스피에겔머 NOX-E36 (5'-NH2-NOX-E36, 표 1, entry 1)의 전형적인 크로마토그램을 보여준다. 40 kDa PEG-COOH 및 응축제 HBTU로 PEG화한 후의 조 5'-NH2-NOX-E36의 전형적인 크로마토그램을 도 3B 및 3D에 각각 나타내었다(실시예 9). 실시예들에 나타난 바와 같이, RP-HPLC 분석은 나중에 용리되는 생성물 피크의 UV 영역의 백분율이 IEX-HPLC에 의해 발견된 5'-아미노 변형 올리고뉴클레오타이드의 전체 길이의 생성물 함량의 백분율과 동일하거나 약간 더 높은 경우, 완전한 전환을 나타낸다. 예를 들어, 실시예 4 내지 10에서 사용된 조 5'-NH2-NOX-E36은 IEX-HPLC에 의한 47% 전체 길이의 생성물의 순도를 나타낸다. 조 생성물은 실패 및 부가 서열과 같은 원하는 뉴클레오타이드 서열을 가지지 않는 아미노 변형 종을 최대 15% 함유하고, 또한 PEG화 될 수 있다. 따라서, 이 경우 RP-HPLC에 의한 생성물 피크의 최대 60% UV-영역까지 완전한 전환으로 인한 것일 수 있다(실시예 5).
비교 가능한 결과는 PyBOP, TBTU 또는 COMU를 사용했을 때 달성되었다(실시예 4-7). 또한, 저분자의 카르복실 산은 아미노-변형 올리고뉴클레오타이드에 효율적으로 커플링되는 것으로 입증되었다. 실시예 11에 나타난 바와 같이, 비오틴은 매우 높은 효능으로 활성화되고 5'-NH2-NOX-A12 (표 1, entry 2)에 커플링되었다. 사전 활성화를 위해 HBTU를 사용하는 비오틴화 이전의 조 5'-NH2-NOX-A12의 IEX-HPLC 분석을 도 4A에 나타내었다. 결과물인 조 5'-비오틴(biotin)-NOX-A12의 LC-MS 및 IEX-HPLC 분석은 도 4B 및 4C에 나타냈으며 비오틴화 생성물에 대한 정확한 분자량 및 예상되는 잔류 시간의 변화를 확인한다.
또한, 본 발명자는 놀랍게도, PEG화 반응을 완료시키는 데 사용되는 40 kDa PEG-COOH와 같은 과량의 PEG-COOH가 조 PEG화된 올리고뉴클레오타이드의 초미세여과(실시예 12) 또는 IEX-정제(실시예 15)에 의해 조 반응 혼합물로부터 회수될 수 있음을 발견하였다. 응축제, 유기 용매 또는 UF에 의한 염과 같은 반응에 함유된 저분자의 제거 및 후속 건조(실시예 16) 후, 회수된 PEG-COOH는 아미노-변형 올리고뉴클레오티드의 PEG화에 재사용될 수 있다(실시예 18, 19 및 22). PEG화 전에 조 5'-NH2-NOX-A12의 IEX-HPLC 분석을 도 5A에 나타내었다. "신선한" PEG-COOH를 사용한 PEG화 후의 조 NOX-A12의 전형적인 IEX-크로마토그램을 도 5B에 나타내었다. 생성된 정제 PEG화된 NOX-A12 생성물의 전형적인 IEX-크로마토그램을 도 5C에 나타내었다. 재순환된 40 kDa PEG-COOH는 "신선한" PEG-COOH (각각 실시예 18, 19 및 17)와 비교하여 유사한 높은 컨쥬게이션 효율을 나타냈다. PEG화된 생성물의 수율 및 품질은 "신선한" 및 재순환된 40 kDa PEG에 대해 동등하게 높았다. 도 5C 및 5E는 각각 "신선한" 및 "재순환" 40 kDa PEG-COOH를 사용한 PEG화 후 정제된 PEG화 NOX-A12의 전형적인 IEX-HPLC 분석을 나타낸다.
본 발명은 올리고뉴클레오타이드와 같은 아미노-변형 핵산 분자의 폴리알콕시화를 위해 폴리알콕시카르복실 산 NHS-에스테르 대신 폴리알콕시카르복실 산을 사용하는 것이 우수하다는 것을 입증한다. 상기 방법은 폴리알콕시카르복실 산으로부터 임의의 활성화된 NHS-에스테르의 중간 생성 및 단리를 필요로 하지 않아서 전체 반응 단계의 수를 감소시키기 때문에 우수하다. 또한, 상기 폴리알콕시카르복실 산은 습기-민감성 폴리알콕시카르복실 산 NHS 에스테르보다 더 안정하고 저장하기 쉽다. 또한, 본 발명의 방법은 반응을 완결시키기 위해 일반적으로 과량으로 사용되는 시약의 경제적 재사용을 가능하게 한다.
본 명세서 및 본 발명의 방법의 일 구현예에 따라, 다양한 구현예에서 단계 b)의 완료 후, 바람직하게는 초미세여과 및/또는 크로마토그래피, 바람직하게는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 임의의 미-반응 제1 반응물을 반응으로부터 분리한다. 과량의 제1 반응물의 성질에 따라, 미-반응 물질, 즉, 미-반응 제1 반응물은 핵산 분자로부터, 보다 구체적으로는 변형 핵산 분자로부터, 바람직하게는 원하는 변형 핵산 분자로부터 초미세여과(UF) 또는 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. UF는 분자량과 관련하여 제1 반응물과 비변형 및 변형 핵산 분자 사이의 유체 역학적 부피에서 충분히 큰 차이가 있을 때 선택되는 방법이다. 대안적으로, 이온 교환 (IEX HPLC) 또는 역상 (RP HPLC) 크로마토그래피는 제1 반응물과 비변형 및 변형 핵산 분자 사이의 전하 또는 친유성 차이의 경우에 사용될 수 있다. 폴리알콕시 화합물, 스테로이드, 탄수화물 및 지방산과 같은 비충전(중성) 제1 반응물의 경우, IEX-HPLC는 레진이 핵산보다 제1 반응물에 대한 친화력이 약하기 때문에 선택하는 방법이다. 양친매성 펩타이드, 단백질 또는 당단백질의 경우, IEX-HPLC 또는 RP-HPLC가 사용될 수 있다.
핵산이 핵산 분자인 것이 본 발명의 범위 내에 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 핵산 및 핵산 분자는, 반대로 표시하지 않는 한, 동의어이다. 더욱이, 상기 핵산(들)은 또한, 바람직하게는 본 명세서에서 본 발명에 따른 핵산 분자(들), 본 발명에 따른 핵산(들), 본 발명의 핵산(들) 또는 본 발명의 핵산 분자(들)를 지칭한다. 또한, 핵산은 올리고뉴클레오타이드인 것이 본 발명의 범위 내에 있다. 이에 비추어, 다르게 명시적으로 언급되지 않는 한, 본원의 개시가 올리고뉴클레오타이드를 언급하는 범위까지, 임의의 핵산에 동일하게 적용되며, 그 반대도 마찬가지이다. 또한, 본 발명의 방법에서 올리고뉴클레오타이드의 사용과 관련하여 본 명세서에 제시된 담론은 본 발명의 방법에서의 제1 반응물 및 이의 용도에 동일하게 적용된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득된 변형 핵산 분자에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 치료에 사용하기 위해 본 발명의 방법에 의해 수득된 변형 핵산 분자에 관한 것이다. 치료에서의 이러한 용도는 변형 핵산 분자를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 대상은 바람직하게는 질병으로 고통받고 있거나 질병으로 고통받을 위험성이 있는 인간이다. 이러한 용도에서, 변형 핵산 분자는 이러한 질병을 치료하거나 예방할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 진단에 사용하기 위해 본 발명의 방법에 의해 수득된 변형 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 진단은 생체 내 진단 또는 시험 관내 진단일 수 있다. 생체 내 진단의 경우, 변형 핵산 분자를 진단 대상에 투여한다. 이러한 대상은 바람직하게는 질병으로 고통받고 있거나, 질병으로 고통받을 위험성이 있거나, 또는 상기 질병으로 고통받고 있거나 발병한 것으로 의심되는 인간이다. 이러한 용도에서, 변형 핵산 분자는 질병과 관련된 바이오마커에 결합할 수있다.
마지막으로, 본 발명은 또 다른 양태에서, 샘플을 분석하기 위한 시험관 내 방법에서 본 발명의 방법에 의해 수득된 변형 핵산 분자의 용도에 관한 것이다. 이러한 샘플의 분석은 분석물의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 것이다. 이러한 용도를 위해, 핵산 분자는 분석물에 결합할 수 있다.
당업계의 당업자라면 이 사실을 인정할 것이다. 본 발명의 방법에 의해 수득 된 변형 핵산 분자의 분석 및 진단 적용은 시험관내 또는 생체 내 핵산의 혼성화 방법, 또는 시험관내 또는 생체 내 압타머의 경우 표적 분자에 대한 핵산의 결합 방법, 및 방사능, 흡광도 또는 발산도(emittance)에 의한 혼성화 또는 결합된 핵산의 검출 방법을 포함할 수 있다.
합성 응용에는 비대칭 촉매 작용, 핵산 암호화 라이브러리 및 친화성 크로마토그래피에서의 핵산의 사용이 포함된다.
본 발명에 따른 핵산은 바람직하게는 서로 공유 결합된 뉴클레오티드, 바람직하게는 포스포디에스테르 링크 또는 결합을 통해 이루어지는 것으로 당업자에 의해 인정될 것이다. 본 발명에 따라 핵산 분자에 존재하는 다른 링크 또는 결합은 각각 포스포티오에이트 링크 및 결합이고, 각각 포스포아미데이트 링크 및 결합이다.
응축제 및 응축 제제라는 용어는 본 명세서에서 동의어로 사용되었음을 인정해야 한다.
"본" 및 "본 발명의"이라는 용어는 본 명세서에서 동의어로 사용되었음을 인정해야 한다.
본 명세서에 표시된 퍼센트는 부피/부피(v/v)임을 인정해야 한다.
본 발명은 추가적인 특징, 실시예 및 장점이 취해질 수 있는 표, 도면 및 실시예에 의해 더 설명된다.
도 1은 본 발명에 따른 방법의 개략도를 도시하며;
도 2는 반응성 아미노기를 핵산에 도입할 수 있는 시약을 도시하고;
도 3A는 PEG화 전의 5'NH2-NOX-E36의 전형적인 조 합성 생성물의 IEX-HPLC 분석을 도시하며;
도 3B는 PEG화 후의 5'NH2-NOX-E36의 전형적인 조 합성 생성물의 IEX-HPLC 분석을 도시하고;
도 3C는 PEG화 전의 5'NH2-NOX-E36의 전형적인 조 합성 생성물의 RP-HPLC 분석을 도시하며;
도 3D는 PEG화 후의 5'NH2-NOX-E36의 전형적인 조 합성 생성물의 RP-HPLC 분석을 도시하고;
도 4A는 컨쥬게이션 전의 5'NH2-NOX-A12의 전형적인 조 합성 생성물의 IEX-HPLC 분석을 도시하며;
도 4B는 비오틴 컨쥬게이션 후의 5'NH2-NOX-A12의 전형적인 조 합성 생성물의 LCMS 분석을 도시하고;
도 4C는 비오틴 컨쥬게이션 후의 5'NH2-NOX-A12의 전형적인 조 합성 생성물의 IEX-HPLC 분석을 도시하며;
도 5A는 PEG화 전의 5'NH2-NOX-A12의 전형적인 조 합성 생성물의 IEX-HPLC 분석을 도시하고;
도 5B는 "신선한" PEG를 사용한 PEG화 후의 5'NH2-NOX-A12의 전형적인 조 생성물의 IEX-HPLC 분석을 도시하며;
도 5C는 "신선한" PEG를 사용한 PEG화 후의 5'NH2-NOX-A12의 전형적인 정제 생성물의 IEX 분석을 도시하고;
도 5D는 "재순환된" PEG를 사용한 PEG화 후의 5'NH2-NOX-A12의 전형적인 조 생성물의 IEX-HPLC 분석을 도시하며; 및
도 5E는 "재순환된" PEG를 사용한 PEG화 후의 5'NH2-NOX-A12의 전형적인 정제 생성물의 IEX 분석을 도시한다.
[표 1] 본 발명에 따른 방법을 설명하기 위해 사용된 핵산 서열
Figure pct00001
실시예 1: RNA 합성
RNA 스피에겔머(Spiegelmer)는 2'-TBDMS RNA 포스포라미디트(phosphoramidite) 화학법을 사용하는 48 mL 고정 부피 컬럼에서 AktaPilot100 합성기(GE Healthcare, Freiburg)를 이용하여 고상 합성에 의해 생성되었다(Damha and Ogilvie, Methods in Molecular Biology, 1993, 81-114, The Humana Press Inc., Totowa, New Jersey.). L-rA(N-Bz)-, L-rC(Ac)-, L-rG(N-ibu)-, 및 L-rU-포스포라미디트를 ChemGenes(Wilmington, MA, USA)에서 구입하였다. 5'-아미노-변형제 amC6은 ChemGenes (Wilmington, MA, USA)로부터 구입하였다. L-riboG 또는 L-riboC 변형된 CPG 공극 크기 600Å(Prime Synthesis, Aston, PA, USA)에서 아미노-변형 스피에겔머의 합성을 시작하였다. 대안으로, 3'아미노(TFA) 변형된 CPG 공극 크기 1000Å(ChemGenes, Wilmington, MA, USA)이 사용될 수 있다. 커플링(사이클 당 12 분)을 위해, 아세토니트릴 중 0.6 M 에틸티오 테트라졸(Azide Chemical Co., Ltd, Anx, Wuxi, CN) 및 아세토니트릴 중 각각 0.2 M 포스포라미디트 용액의 1.5-4 당량을 사용하였다. 캡핑-산화 사이클이 사용되었다. 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 표준 용매 및 시약은 Biosolve (Valkenswaard, NL), Proligo (Hamburg, D), VWR (Karlsruhe, D) 또는 Sigma Aldrich (Taufkirchen, D)에서 구입하였다. 스피에겔머는 5'-MMT-ON으로 합성되었다. 절단 및 탈보호는 Wincott 그룹(Wincott, Nucleic Acids Research 1995, 23(14), 2677-2684)에 따라 약간의 변형과 함께 달성되었다. 구체적으로, 자동 합성의 완료시, CPG-결합된 올리고뉴클레오타이드(700μmol)를 잠시 건조시키고 유리병에 옮겼다. aq. MeNH2 (40%) 200 mL을 첨가하고, 현탁액을 실온에서 부드럽게 교반하였다. 90 분 후. 슬러리를 여과하고, 잔류 CPG를 aq. EtOH (50%)로 수회 세척하였다. 조합된 여과액을 농축시키고, 최종적으로 동결 건조하여 건조시켰다. 2'-TBDMS 기의 제거를 위해, 건조 조생성물을 120 mL의 DMSO에 용해시킨 후 60 mL의 NEt3 및 80 mL의 NEt3ㆍ3HF를 넣었다. 이 혼합물을 2 시간 동안 65℃에서 부드럽게 교반하였다. 2'-TBDMS 기의 절단 후, 얼음물 1L를 첨가하여 반응을 퀀칭시켰다. MMT-기의 제거는 아세트산(25 mL)의 첨가에 의해 보조되었다. 이어서, 스피에겔머는 2kDa 재생 셀룰로오스 멤브레인 (Sartorius, Gottingen, D)을 사용하여 접선-유동 여과에 의해 탈염되었다. 염 교환을 위해 0.25 M NaCl 용액 3L를 첨가하고 접선-유동 여과에 의해 용액을 탈염시켰다. 최종적으로, 생성물을 수확하고 동결 건조시켰다.
실시예 2: 5'NH2-NOX-E36 (1 prePEG)의 합성
실시예 1에 상술된 방법을 적용하여, 10.2 g의 L-rG CPG (600 Å, 70 μmol/g, 711 μmol)를 뉴클레오타이드 커플링 사이클 당 2 eq.의 아미디트와 함께 5'NH2-NOX-E36 (1 prePEG)을 조립하는데 사용하였다. UF 후의 수율: 150732 OD, 순도: 47%, 질량: 12997 Da (발견), 12996 Da (계산).
실시예 3: 5'NH2-NOX-A12 (2 prePEG)의 합성
실시예 1에 상술된 방법을 적용하여, 1.7 g의 L-rG CPG (600 Å, 72 μmol/g, 123 μmol)를 뉴클레오타이드 커플링 사이클 당 2.5 eq.의 아미디트와 함께 5'NH2-NOX-E36 (1 prePEG)을 조립하는데 사용하였다. UF 후의 수율: 23985 OD, 순도: 52%, 질량: 14656 Da (발견), 14656 Da (계산).
실시예 4: 활성화를 위한 PyBOP 및 보조 용매로서 DMF를 사용한 5'NH2-NOX-E36의 PEG화(PEGylation)
1 mL 물 중 5'NH2-NOX-E36 (1 prePEG)의 1000 OD (40 mg, 1.54 μmol) 용액에 750 mL DMF 중 Bu4NBr 193 mg (600 μmol)의 용액을 넣은 후 69 μL(52 mg, 405 μmol)의 DIPEA를 첨가하였다. 다른 반응 용기에서 40kDa PEG-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) 92mg (2.31μmol)을 DMF 2.5 mL에 용해시켰다. PEG 용액에 60μL DMF 중 PyBOP 1.8mg (3.5μmol)을 넣고 DIPEA 6.0μL (4.6mg, 35μmol)을 넣었다. 이어서, PEG 용액을 완전히 볼텍싱하고, 2 분 후에 올리고뉴클레오타이드 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 부드럽게 교반하였다. RP-HPLC에 의한 반응 모니터링은 52%의 전환율을 나타냈다.
실시예 5: 활성화를 위한 PyBOP 및 보조 용매로서 DMSO를 사용한 5'NH2-NOX-E36의 PEG화
1 mL 물 중 5'NH2-NOX-E36 (1 prePEG)의 1000 OD (40 mg, 1.54 μmol) 용액에 2 mL DMSO 중 Bu4NBr 193 mg (600 μmol)의 용액을 넣은 후 69 μL(52 mg, 405 μmol)의 DIPEA를 첨가하였다. 다른 반응 용기에서 40kDa PEG-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) 92mg (2.31μmol)을 ACN 0.5 mL에 용해시켰다. PEG 용액에 60μL ACN 중 PyBOP 1.8mg (3.5μmol)을 넣고 DIPEA 6.0μL (4.6mg, 35μmol)을 넣었다. 이어서, PEG 용액을 완전히 볼텍싱하고, 2 분 후에 올리고뉴클레오타이드 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 부드럽게 교반하였다. RP-HPLC에 의한 반응 모니터링은 60%의 전환율을 나타냈다.
실시예 6: 활성화를 위한 TBTU를 사용한 5'NH2-NOX-E36의 PEG화
1 mL 물 중 5'NH2-NOX-E36 (1 prePEG)의 1000 OD (40 mg, 1.54) 용액에 2 mL DMSO 중 Bu4NBr 193 mg (600 μmol)의 용액을 넣은 후 69 μL(52 mg, 405 μmol)의 DIPEA를 첨가하였다. 다른 반응 용기에서 40kDa PEG-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) 92mg (2.31μmol)을 ACN 0.5 mL에 용해시켰다. PEG 용액에 60μL ACN 중 TBTU 1.1mg (3.5μmol)을 넣고 DIPEA 6.0μL (4.6mg, 35μmol)을 넣었다. 이어서, PEG 용액을 완전히 볼텍싱하고, 2 분 후에 올리고뉴클레오타이드 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 부드럽게 교반하였다. RP-HPLC에 의한 반응 모니터링은 59%의 전환율을 나타냈다.
실시예 7: 활성화를 위한 COMU를 사용한 5'NH2-NOX-E36의 PEG화
1 mL 물 중 5'NH2-NOX-E36 (1 prePEG)의 1000 OD (40 mg, 1.54 μmol) 용액에 2 mL DMSO 중 Bu4NBr 193 mg (600 μmol)의 용액을 넣은 후 69 μL(52 mg, 405 μmol)의 DIPEA를 첨가하였다. 다른 반응 용기에서 40kDa PEG-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) 92mg (2.31μmol)을 ACN 0.5 mL에 용해시켰다. PEG 용액에 60μL ACN 중 COMU 1.5mg (3.5μmol)을 넣고 DIPEA 6.0μL (4.6mg, 35μmol)을 넣었다. 이어서, PEG 용액을 2 분 동안 완전히 볼텍싱하고, 올리고뉴클레오타이드 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 부드럽게 교반하였다. RP-HPLC에 의한 반응 모니터링은 45%의 전환율을 나타냈다.
실시예 8: 활성화를 위한 HBTU를 사용한 Bu4NBr 존재하에서의 5'NH2-NOX-E36의 PEG화
1 mL 물 중 5'NH2-NOX-E36 (1 prePEG)의 1000 OD (40 mg, 1.54 μmol) 용액에 2 mL DMSO 중 Bu4NBr 193 mg (600 μmol)의 용액을 넣은 후 69 μL(52 mg, 405 μmol)의 DIPEA를 첨가하였다. 다른 반응 용기에서 40kDa PEG-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) 92mg (2.31μmol)을 ACN 0.5 mL에 용해시켰다. PEG 용액에 7.5 μL ACN 중 HBTU 1.3mg (3.5μmol)을 넣고 DIPEA 6.0μL (4.6mg, 35μmol)을 넣었다. 이어서, PEG 용액을 5 분 동안 완전히 볼텍싱하고, 올리고뉴클레오타이드 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 부드럽게 교반하였다. RP-HPLC에 의한 반응 모니터링은 42%의 전환율을 나타냈다.
실시예 9: 활성화를 위한 HBTU를 사용한 Bu4NBr 부재하에서의 5'NH2-NOX-E36의 PEG화
6 mL 물 중 5'NH2-NOX-E36 (1 prePEG)의 6000 OD (240 mg, 9.23 μmol) 용액에 12 mL DMSO를 넣은 후 414 μL(307 mg, 2.38 mmol)의 DIPEA를 첨가하였다. 다른 반응 용기에서 40kDa PEG-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) 554mg (13.8 μmol)을 ACN 2.5 mL에 용해시켰다. PEG 용액에 100 μL ACN 중 HBTU 7.85mg (20.7μmol)을 넣고 DIPEA 36.0μL (26.8mg, 207μmol)을 넣었다. 이어서, PEG 용액을 분 동안 완전히 볼텍싱하고, 올리고뉴클레오타이드 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 부드럽게 교반하였다. RP-HPLC에 의한 반응 모니터링은 45.5%의 전환율을 나타냈다.
실시예 10: 활성화를 위한 HBTU를 사용한 Bu4NBr 부재하에서의 5'NH2-NOX-A12의 PEG화
16 mL 물 중 5'NH2-NOX-A12 (2 prePEG)의 15966　OD (638　mg, 19.6 μmol, 50%FLP) 용액에 32 mL DMSO를 넣은 후 1.12 mL의 DIPEA를 첨가하였다. 다른 반응 용기에서 40kDa PEG-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) 1.97g (49.3　μmol)을 ACN 8 mL에 용해시켰다. PEG 용액에 200 μL ACN 중 HBTU 19.9　mg (52.5　μmol)을 넣고 DIPEA 83μL을 넣었다. 이어서, PEG 용액을 5 분 동안 완전히 볼텍싱하고, 올리고뉴클레오타이드 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 부드럽게 교반하였다. RP-HPLC에 의한 반응 모니터링은 58%의 전환율을 나타냈다.
실시예 11: 활성화를 위한 HBTU를 사용한 5'NH2-NOX-A12의 비오틴화(Biotinylation)
200 μL 물 중 5'NH2-NOX-A12 (2prePEG)의 200　OD (8　mg, 0.237　μmol, 50%FLP) 용액에 400 μL DMSO를 넣은 후 12.5 mL의 DIPEA를 첨가하였다. 다른 반응 용기에서 비오틴 0.167mg (0.683μmol)을 90 μL DMSO에 용해시켰다. 비오틴 용액에 10 μL ACN 중 HBTU 0.259mg (0.683　μmol)을 넣고 DIPEA 1.8μL를 넣었다. 이어서, 비오틴 용액을 1 분 동안 완전히 볼텍싱하고, 올리고뉴클레오타이드 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 부드럽게 교반하였다. RP-HPLC에 의한 반응 모니터링은 55%의 전환율을 나타냈다. 조 생성물에 20㎕의 3M 소디윰 아세테이트 용액 및 10㎖의 EtOH을 첨가하여 침전시킨 후 -20℃에서 2 시간 동안 보관하였다. 침전물을 원심 분리 (4000g) 및 경사 분리에 의해 수집하였다. 펠릿을 물에 용해시키고 크기 배제 크로마토그래피에 의해 탈염시켜서 IEX-HPLC로 45% 순도를 갖는 159OD (6.4mg, 0.192μmol)의 비오틴화된 NOX-A12를 수득하였다. MS: 14883Da (계산), 14883Da (발견).
실시예 12: 5'NH2-NOX-A12의 PEG화 후 과량의 40 kDa PEG-COOH의 UF-재순환(Recycling)
실시예 10에 따라 제조된 조(crude) NOX-A12 PEG화 생성물의 7983 OD의 분취 량을 30 kDa MWCO(molecular weight cut off) 재생 셀룰로오스 막(Sartorius, Gottingen, D)을 사용한 접선-유동 초미세여과(UF)에 적용하였다. 펌프 압력을 1 bar로 설정하고 10 L의 물을 공급물로 사용하였다. 잔류물(retentate)을 수확하고 동결 건조시켜 0.87 g (7264 OD)의 무색 고체를 수득하였다. 다음으로, 여과액은 2 kDa 컷 오프 재생 셀룰로오스 막(Sartorius, Gottingen, D)을 사용한 접선 유동 여과에 의해 농축 및 탈염되었다. 펌프 압력을 1bar로 설정하고 물을 공급물로 사용하였다. 이 방법은 여과액이 20μS/cm 미만의 전도도(conductivity)를 보일 때까지 계속되었다. 잔류물을 수거하고 동결 건조시켜 0.51 g의 40 kDa PEG-COOH를 무색 고체로서 수득 하였다.
실시예 13: 조 NOX-A12 PEG화 혼합물의 초미세여과
실시예 10에 따라 제조된 조 NOX-A12 PEG화 생성물의 7983 OD의 또 다른 분취량을 2 kDa MWCO 재생 셀룰로오스 막 (Sartorius, Gottingen, D)을 사용한 접선-유동 초미세여과(UF)에 적용하였다. 펌프 압력을 1 bar로 설정하고 10 L의 물을 공급물로 사용하였다. 잔류물을 수거하고 동결 건조시켜 1.38g (7829 OD)의 무색 고체를 수득하였다.
실시예 14: PEG화된 NOX-A12의 IEX-HPLC 정제 및 후속 UF
실시예 12에서 수득된 0.87 g (7264 OD)의 조 NOX-A12 생성물을 IEX-HPLC 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 6000 OD 샘플의 수용액을 12 mL의 TOSOH Super Q5PW IEX-HPLC 컬럼 (500 OD/mL 레진, 50℃)에 충진시키고 버퍼 시스템(버퍼 A: 25 mM Na2HPO4, pH 7.5, 10% ACN; 버퍼 B: 25 mM Na2HPO4, 1 M NaBr, pH 7.5, 10% ACN; 구배: 5% B에서 35%B in 25CV)의 구배를 적용하여 50℃에서 용출시켰다. 분획물을 함유하는 모든 생성물(IEX-HPLC에 의한 >75% FLP)을 조합하여(842 OD), 5 kDa MWCO 재생 셀룰로오스 멤브레인 (Millipore, Bedford, MA)을 사용한 UF로 탈염시킨 후, 최종적으로 동결 건조시켰다. 수율: 801 OD, 76 % FLP.
실시예 15: 5'NH2-NOX-A12의 PEG화 후 과량의 40 kDa PEG-COOH의 IEX-HPLC- 재순환
실시예 13에서 수득된 조 NOX-A12 생성물(1.38g, 7829 OD)을 IEX-HPLC 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 6000 OD 샘플의 수용액을 12 mL의 TOSOH Super Q5PW IEX-HPLC 컬럼 (500 OD/mL 레진, 50℃)에 충진시키고 버퍼 시스템(버퍼 A: 25 mM Na2HPO4, pH 7.5, 10% ACN; 버퍼 B: 25 mM Na2HPO4, 1 M NaBr, pH 7.5, 10% ACN; 구배: 5% B에서 35%B in 25CV)의 구배를 적용하여 50℃에서 용출시켰다. 로딩 및 2CV 포스트 로드 세척 동안 유액(flow-through)을 수집하고, 2 kDa MWCO 재생 셀룰로오스 멤브레인 (Sartorius, Gottingen, D)에 의해 탈염시킨 후 동결 건조하여 410 mg의 40 kDa PEG-COOH의 무색 고체를 수득하였다. 분획물을 함유하는 모든 생성물(IEX-HPLC에 의한 >75% FLP)을 조합하여(1004 OD), 5 kDa MWCO 재생 셀룰로오스 멤브레인 (Millipore, Bedford, MA)을 사용한 UF로 탈염시킨 후, 최종적으로 동결 건조시켰다. 수율: 1042 OD, 76 % FLP.
실시예 16: 5'NH2-NOX-A12의 PEG화에서의 후속 사용을 위한 재순환된 40 kDa PEG-COOH의 건조
실시예 12 및 15에 예시된 바와 같은 IEX-HPLC 크로마토그래피 또는 접선 유동 여과에 의해 회수된 40 kDa PEG-COOH를 아세토니트릴 (20 mL/g)에 용해시키고 잔류물을 제거하기 위해 밤새 분자 체(sieve) 건조 패드 위에 저장하였다. 분자 체를 제거하고 PEG 용액을 감압하에 농축시켰다.
실시예 17: "신선한(fresh)" 40 kDa PEG-COOH 및 활성화를 위해 HBTU를 사용한 5'NH2-NOX-A12의 PEG화
100 μL 물 중 5'NH2-NOX-A12 (2 prePEG) 100　OD (4　mg, 0.14　μmol, 50% FLP) 용액에 200 μL DMSO를 넣은 후 7.5 mL의 DIPEA를 첨가하였다. 다른 반응 용기에서 "신선한" 40kDa PEG-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) 13.7 mg (0.34 μmol)을 ACN 60 μL에 용해시켰다. PEG-COOH 용액에 10 μL ACN 중 HBTU 0.13 mg (0.34　μmol)을 넣고 DIPEA 0.6μL을 넣었다. PEG 용액을 5 분 동안 완전히 볼텍싱하고, 올리고뉴클레오타이드 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 부드럽게 교반하였다. RP-HPLC에 의한 반응 모니터링은 43%의 전환율을 나타냈다.
실시예 18: "UF-회수된" 40 kDa PEG-COOH 및 활성화를 위해 HBTU를 사용한 5'NH2-NOX-A12의 PEG화
100 μL 물 중 5'NH2-NOX-A12 (2 prePEG) 100　OD (4　mg, 0.14　μmol, 50% FLP) 용액에 200 μL DMSO를 넣은 후 7.5 mL의 DIPEA를 첨가하였다. 다른 반응 용기에서 "UF-회수된" 및 건조된 40kDa PEG-COOH(실시예 12 및 16에서 수득) 13.7 mg (0.34 μmol)을 ACN 60 μL에 용해시켰다. PEG 용액에 10 μL ACN 중 HBTU 0.13 mg (0.340　μmol)을 넣고 DIPEA 0.6μL을 넣었다. PEG-COOH 용액을 5 분 동안 완전히 볼텍싱하고, 올리고뉴클레오타이드 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 부드럽게 교반하였다. RP-HPLC에 의한 반응 모니터링은 48%의 전환율을 나타냈다.
실시예 19: "IEX-HPLC 회수된" 40 kDa PEG-COOH 및 활성화를 위해 HBTU를 사용한 5'NH2-NOX-A12의 PEG화
100 μL 물 중 5'NH2-NOX-A12 (2 prePEG) 100　OD (4　mg, 0.14　μmol, 50% FLP) 용액에 200 μL DMSO를 넣은 후 7.5 mL의 DIPEA를 첨가하였다. 다른 반응 용기에서 "IEX-HPLC 회수" 및 건조된 40kDa PEG-COOH(실시예 15 및 16에서 수득) 13.7 mg (0.34 μmol)을 ACN 60 μL에 용해시켰다. PEG 용액에 10 μL ACN 중 HBTU 0.13 mg (0.340　μmol)을 넣고 DIPEA 0.6μL을 넣었다. PEG-COOH 용액을 5 분 동안 완전히 볼텍싱하고, 올리고뉴클레오타이드 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 부드럽게 교반하였다. RP-HPLC에 의한 반응 모니터링은 47%의 전환율을 나타냈다.
실시예 20: 5'NH2-NOX-A12의 고상 합성
실시예 1에 상술된 방법을 적용하여, 1.70 g의 L-rG CPG (600 Å, 72 μmol/g, 122 μmol)를 뉴클레오타이드 커플링 사이클 당 2.5 eq.의 아미디트와 함께 5'NH2-NOX-A12 (2 prePEG)을 조립하는데 사용하였다. 탈보호 및 UF 후 수율: 23378 OD, 순도: 49 %, 질량: 14656Da (발견), 14656Da (계산).
실시예 21: "신선한" 40 kDa PEG-COOH에 의한 5'NH2-NOX-A12의 PEG화 및 NOX-A12 생산을 위한 후속 다운-스트림 처리
6 mL 물 중 5'NH2-NOX-A12 (2 prePEG, 실시예 20에 따라 합성된) 6000　OD (240　mg, 7.86 μmol, 48% FLP) 용액에 12 mL DMSO를 넣은 후 0.42 mL의 DIPEA를 첨가하였다. 다른 반응 용기에서 40kDa PEG-COOH(JenKem Technology, Allen, TX, USA) 628 mg (15.7μmol)을 ACN 2.55 mL에 용해시켰다. PEG 용액에 50 μL ACN 중 HBTU 5.96　mg (15.7μmol)을 넣고 DIPEA 40μL을 넣었다. PEG 용액을 5 분 동안 완전히 볼텍싱하고, 올리고뉴클레오타이드 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 부드럽게 교반하였다. RP-HPLC에 의한 반응 모니터링은 39%의 전환율을 나타냈다. 0.5 eq PEG-COOH의 추가 분취량을 0.7 mL ACN 중 40 kDa PEG-COOH (JenKem Technology, Allen, TX, USA) 157 mg (1.97μmol)에 용해시킴으로써 제조하였다. PEG 용액에 12.5 μL ACN 중 HBTU 1.49　mg (1.97μmol)을 넣고 DIPEA 10μL을 넣었다. PEG 용액을 5 분 동안 완전히 볼텍싱하고, 올리고뉴클레오타이드 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 부드럽게 교반하였다. RP-HPLC에 의해 갱신된 반응의 모니터링은 52%의 전환율을 나타냈다. 0.5 eq의 활성화된 PEG-COOH를 또 첨가하면 추가 30 분 후에 58%의 전환율을 보였다. 물 500mL로 희석하여 반응을 중단시키고 30kDa MWCO 재생 셀룰로스 막 (Sartorius, Gottingen, D)을 사용한 접선-유동 여과에 적용하였다. 펌프 압력을 1 bar로 설정하고 20 L의 물을 공급물로 사용하였다. 잔류물이 5581 OD의 수율일 때 수득하였다. 조 NOX-A12 생성물을 IEX-HPLC 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 생성물을 12 ㎖ TOSOH Super Q5PW IEX-HPLC 컬럼 (500 OD/mL 레진, 50℃)에 충진시키고 버퍼 시스템(버퍼 A: 25 mM Tris, pH 7.5, 10% ACN; 버퍼 B: 25 mM Tris, 2 M NaCl, pH 7.5, 10% ACN; 구배: 5% B에서 35%B in 25CV)의 구배를 적용하여 50℃에서 용출시켰다. 분획물을 함유하는 모든 생성물(IEX-HPLC에 의한 >75% FLP)을 조합하여, 2 kDa MWCO 재생 셀룰로오스 멤브레인 (Millipore, Bedford, MA)을 사용한 UF로 탈염시킨 후, 최종적으로 동결 건조시켰다. 수율: 1474 OD, 75 % FLP.
실시예 22: "IEX-HPLC 회수된" 40 kDa PEG-COOH에 의한 5'NH2-NOX-A12의 PEG 화 및 NOX-A12 생산을 위한 후속 다운-스트림 처리
6 mL 물 중 5'NH2-NOX-A12 (2 prePEG, 실시예 20에 따라 합성된) 6000　OD (240　mg, 7.86 μmol, 48% FLP) 용액에 12 mL DMSO 및 뒤이어 0.42 mL의 DIPEA를 첨가하였다. 다른 반응 용기에서 "IEX-HPLC 회수" 및 건조된 40kDa PEG-COOH(실시예 15 및 16에서 수득) 628 mg (15.7μmol)을 ACN 2.55 mL에 용해시켰다. PEG 용액에 50 μL ACN 중 HBTU 5.96　mg (15.7μmol)을 넣고 DIPEA 40μL을 넣었다. 올리고뉴클레오타이드 용액에 첨가하기 전에 PEG 용액을 5 분 동안 완전히 볼텍싱하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 부드럽게 교반하였다. RP-HPLC에 의한 반응 모니터링은 29%의 전환율을 나타냈다. 0.5 eq PEG-COOH의 추가 분취량을 0.7 mL ACN 중 "IEX-HPLC 회수" 및 건조된 40 kDa PEG-COOH 157 mg (1.97μmol)에 용해시킴으로써 제조하였다. PEG 용액에 12.5 μL ACN 중 HBTU 1.49　mg (1.97μmol)을 넣고 DIPEA 10μL을 넣었다. PEG 용액을 5 분 동안 완전히 볼텍싱하고, 올리고뉴클레오타이드 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 부드럽게 교반하였다. RP-HPLC에 의해 갱신된 반응의 모니터링은 37%의 전환율을 나타냈다. 활성화된 "IEX-HPLC 회수" 및 건조 PEG-COOH의 제2 및 제3의 0.5 eq 첨가는 추가 30 분 후에 45% 및 52%의 전환율을 보였다. 물 500mL로 희석하여 반응을 중단시키고 30kDa MWCO 재생 셀룰로스 막 (Sartorius, Gottingen, D)을 사용한 접선-유동 여과에 적용하였다. 펌프 압력을 1 bar로 설정하고 20 L의 물을 공급물로 사용하였다. 잔류물을 수거하고 동결 건조시켜서 5711 OD을 수득하였다. 조 NOX-A12 생성물을 IEX-HPLC 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 생성물을 12 ㎖ TOSOH Super Q5PW IEX-HPLC 컬럼 (500 OD/mL 레진, 50℃)에 충진시키고 버퍼 시스템(버퍼 A: 25 mM Tris, pH 7.5, 10% ACN; 버퍼 B: 25 mM Tris, 2 M NaCl, pH 7.5, 10% ACN; 구배: 5% B에서 35%B in 25CV)의 구배를 적용하여 50℃에서 용출시켰다. 분획물을 함유하는 모든 생성물(IEX-HPLC에 의한 >75% FLP)을 조합하여, 2 kDa MWCO 재생 셀룰로오스 멤브레인 (Millipore, Bedford, MA)을 사용한 UF로 탈염시킨 후, 최종적으로 동결 건조시켰다. 수율: 1242 OD, 70 % FLP.
본 명세서, 청구항 및/또는 도면에 개시된 본 발명의 특징은 모두 각각 개별적으로 및 조합되어 다양한 형태로 본 발명을 실현하기 위한 재료가 될 수 있을 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> NOXXON Pharma AG <120> A method for polyalkoxylation of nucleic acids that enables recovery and reuse of excess polyalkoxylation reagent <130> N 10118 PCT <150> EP 16 201 391.6 <151> 2016-11-30 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 40 <212> RNA <213> artifical <220> <221> misc_feature <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> nucleotides are L-nucleotides <400> 1 gcacgucccu caccggugca agugaagccg uggcucugcg 40 <210> 2 <211> 45 <212> RNA <213> artifical <220> <221> misc_feature <223> synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(45) <223> nucleotides are L-nucleotides <400> 2 gcguggugug aucuagaugu auuggcugau ccuagucagg uacgc 45

Claims (32)

  1. 제1 반응물(reactant) 및 제2 반응물을 반응시킴으로써 핵산 모이어티(moiety) 및 비-핵산 모이어티를 포함하는 변형 핵산 분자의 제조 방법으로서,
    상기 제1 반응물은 비-핵산 모이어티 및 카복실기를 포함하고,
    상기 제2 반응물은 핵산 모이어티 및 상기 핵산 모이어티에 결합되는 아미노기를 포함하는 아미노 변형을 포함하는 아미노-변형 핵산 분자이며,
    상기 방법은 다음 단계를 포함하는 것인, 방법:
    a) 상기 제1 반응물, 바람직하게는 제1 반응물의 카르복실기를 수혼화성 유기 용매(water miscible organic solvent)에서 응축제(condensation reagent)에 의해 활성화시키는 단계, 및
    b) 상기 단계 a)의 활성화된 제1 반응물, 바람직하게는 제1 반응물의 활성화된 카르복실기, 및 제2 반응물, 바람직하게는 물 또는 수혼화성(water miscible) 유기 용매와 물의 혼합물에 용해된 아미노-변형 핵산 분자의 아미노 변형의 아미노기를 반응시키는 단계로서, 이에 의해 변형 핵산 분자가 형성되는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아미노-변형 핵산 분자는 4차 암모늄 염의 존재하에서 물과 수혼화성 유기 용매의 혼합물에 용해되는 것인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단계 a)의 활성화된 제1 반응물은 물 또는 수혼화성 유기 용매와 물의 혼합물에 용해된 아미노-변형 핵산 분자에 첨가되는 것인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 반응물 및/또는 상기 비-핵산 모이어티는 폴리알콕시 화합물, 펩타이드, 단백질, 당 단백질, 핵산, 탄수화물 모이어티 및 펩타이드, 단백질, 당 단백질, 핵산 및/또는 탄수화물-기반 모이어티와 상이한 화학적 모이어티를 포함하는 그룹으로부터 선택되며, 바람직하게는 상기 제1 반응물 및/또는 상기 비-핵산 모이어티는 폴리알콕시 화합물인 것인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노-변형 핵산 분자는 분석 방법, 진단 및/또는 치료에서의 사용에 적합한 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노-변형 핵산 분자는 아미노-변형 압타머, 아미노-변형 스피에겔머, 아미노-변형 면역자극 핵산, 아미노-변형 siRNA, 아미노-변형 miRNA 분자 및 아미노-변형 핵산 안티센스 분자를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 압타머는 L- 및/또는 D-뉴클레오타이드로 구성된 압타머이고 및/또는
    상기 핵산 모이어티는 압타머, 스피에겔머, 면역자극 핵산, siRNA, miRNA 분자 및 핵산 안티센스 분자를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 압타머는 L- 및/또는 D-뉴클레오타이드로 구성된 압타머인 것인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 b)에서 아미노-변형 핵산 분자에 대해 활성화된 제1 반응물의 과량의 분자가 사용되는 것인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 과량은 활성화된 제1 반응물 및 아미노-변형 핵산 분자의 분자 몰비(molar ratio)로 표현되고, 상기 몰비는 약 1.1 내지 약 10, 바람직하게는 약 1.5 내지 약 3.5인 것인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 a)에 따른 제1 반응물을 활성화시키기 위해 상기 제1 반응물은 수혼화성 유기 용매, 및 응축제 및 염기, 바람직하게는 먼저 응축제 및 후속으로 염기가 첨가되어 용해되고, 상기 응축제는 바람직하게는 수혼화성 유기 용매에 용해되는 것인, 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 염기는 비-친핵성(non-nucleophilic) 염기인 것인, 방법.
  11. 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염기 첨가 후 0.25 분 내지 60 분, 바람직하게는 0.5 분 내지 20 분, 보다 바람직하게는 1.0 분 내지 5.0 분 사이에, 수득된 용액을 아미노-변형 핵산 분자를 함유하는 용액에 첨가하고, 바람직하게는 염기 첨가 후 1.0 분 내지 5.0 분 사이에 응축제 및 염기를 포함하는 용액을 아미노-변형 핵산 분자를 함유하는 용액에 첨가하는 것인, 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 응축제는
    a) BOP, PyBOP, PyBrop, AOP, PyAOP, BrOP 및 PyClOP와 같은 포스포늄 염,
    b) HCTU, TCTU, TBTU, HBTU, HATU, TOTU 및 COMU와 같은 우로늄 염 및
    c) 카르보디이미드(carbodiimides),
    를 포함하는 그룹으로부터 선택되고,
    상기에서 바람직하게는 응축 용매는 PyBOP, TBTU, COMU, HBTU, 더욱 바람직하게는 HBTU인 것인, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 카르보디이미드는 DCC (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide), EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid) 및 DIC (N,N'-diisopropylcarbodiimide)를 포함하는 그룹으로부터 선택된 것인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 수혼화성 유기 용매는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, sec-부탄올, tert-부탄올, 디메틸 술폭시드, 디에틸 술폭시드, 메틸 에틸 술폭시드, 포름아미드, 메틸 포름아미드, 디메틸 포름아미드, 에틸 포름아미드, 에틸 메틸 포름아미드, 디에틸 포름아미드, 2-피롤리돈, N-메틸피롤리돈, N-에틸피 롤리돈, 아세토니트릴, 아세톤, 에틸 메틸 케톤, 메틸 프로필 케톤, 디에틸 케톤, 메틸 이소프로필 케톤, 메틸 포르메이트, 에틸 포르메이트, 프로필 포르메이트, 이소프로필 포르메이트, 메틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 메틸 프로파노에이트, 테트라히드로푸란 및 디옥산, 바람직하게는 디메틸 포름아미드, 아세토니트릴 및 디메틸 술폭시드를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인, 방법.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염기는 DIPEA(diisopropylethylamine), 트리메틸아민(trimethylamine) 및 DBU을 포함하는 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 DIPEA(diisopropylethylamine)인 것인, 방법.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염기 대 제1 반응물의 몰비는 1 이상인 것인, 방법.
  17. 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노-변형 핵산 분자의 용액은 염기, 바람직하게는 비-친핵성 염기를 함유하고, 이에 따라 바람직하게는 아미노-변형 핵산 분자에서 비-친핵성 염기 대 포스포디에스테르의 수의 몰비는 3 보다 큰 것인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 a)는 5℃ 내지 60℃의 온도, 바람직하게는 10℃ 내지 40℃의 온도, 보다 바람직하게는 15℃ 내지 30℃의 온도, 가장 바람직하게는 주위 온도(ambient temperature)에서 수행되는 것인, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 b)는 5℃ 내지 60℃의 온도, 바람직하게는 10℃ 내지 40℃의 온도, 보다 바람직하게는 15℃ 내지 30℃의 온도, 가장 바람직하게는 주위 온도(ambient temperature)에서 수행되는 것인, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노-변형 핵산 분자의 아미노기와 제1 반응물의 활성화된 카르복시기의 반응은 5 분 내지 6 시간 후, 바람직하게는 15 분 내지 45 분 후, 보다 바람직하게는 15 내지 30 분 후에 완료되는 것인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 b)는 7.5 내지 10의 pH 범위, 바람직하게는 7.5 내지 9의 pH 범위, 보다 바람직하게는 7.5 내지 8.5의 pH 범위에서 수행되는 것인, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 b)에서 활성화된 제1 반응물은 아미노-변형 분자의 80 % 내지100 %가 제1 반응물과 반응할 때까지, 바람직하게는 아미노-변형 핵산 분자의 90 % 내지 100 %가 제 1 반응물과 반응할 때까지 아미노-변형 핵산 분자의 용액에 첨가되는 것인, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 b)의 완료 후 반응으로부터 임의의 비-반응 제1 반응물을 초미세여과 및/또는 크로마토그래피, 바람직하게는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리하는 것인, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 분리된 제1 반응물은 단계 a)에서 재순환되고 사용되는 것인, 방법.
  25. 제4항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리알콕시 화합물은 직쇄 또는 분지쇄의 폴리알콕시 화합물인 것인, 방법.
  26. 제4항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리알콕시 화합물이 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜, 폴리글리세롤을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것인, 방법.
  27. 제4항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리알콕시 화합물은 폴리에틸렌 글리콜인 것인, 방법.
  28. 제4항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리알콕시 화합물은 5,000 Da 내지 100,000 Da, 바람직하게는 20,000 Da 내지 80,000 Da, 보다 바람직하게는 40,000 Da의 분자량을 갖는 것인, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득된 변형 핵산 분자.
  30. 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득된 변형 핵산 분자.
  31. 진단에 사용하기 위한, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득된 변형 핵산 분자.
  32. 샘플을 분석하기 위한 시험 관내 (in vitro) 방법에서, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득된 변형 핵산 분자의 용도.

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