CN118146284A - 一种GalNAc化合物、其与寡核苷酸缀合物及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种GalNAc化合物、其与寡核苷酸缀合物及制备方法。所述GalNAc化合物包括式I所示的化合物或其化学上可接受的盐。本发明设计新型GalNAc化合物，可通过固相方法合成在任意位置GalNAc修饰的寡核苷酸，动物实验结果表明，相比于现有技术缀合到3’端，本发明缀合到5’端及中间任意位点的GalNAc缀合siRNA，对小鼠血清和肝脏中PCSK9基因的抑制作用、对小鼠血清LDL‑C水平的影响，以及在动物体内的半衰期、药峰浓度和药‑时曲线下面积，均显著提升。

Description

一种GalNAc化合物、其与寡核苷酸缀合物及制备方法

技术领域

本发明属于化学合成技术领域，涉及一种GalNAc亚磷酰胺化合物、其合成及其与寡核苷酸缀合方法。

背景技术

小核酸药物（寡核苷酸）凭借其自身独特的性质正逐步发展成为传统小分子药物的替代物，用以调控与疾病相关蛋白的功能。寡核苷酸可用于沉默或激活特定疾病的基因表达，从而防止或促进特定蛋白的形成，起到治疗疾病的作用。寡核苷酸包括但不限于反义寡核苷酸（ASO），小干扰RNA（siRNA）、小激活RNA（saRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）。由于寡核苷酸药物疗效较好，技术取得突破，成为当前最受关注的一类技术，目前全球已有数款药物获批上市。

尽管siRNA分子具有较好的治疗效用，但siRNA在体内的递送仍然是一个重大挑战，因为它会被核酸酶快速降解、细胞摄取不良以及全身给药后肾脏清除速度很快。因此需要运载工具将siRNA分子运输到靶组织细胞中的作用位点，开发一种安全可靠的方法来选择性地靶向患病器官和组织仍然是将其转化为临床的关键需求。早期方法侧重于脂质纳米粒子（LNP）和合成纳米粒子，以解决siRNA递送问题，而N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）和siRNA缀合物的递送平台因其针对肝靶向性肝素递送的效力和安全性受到广泛的关注和研究。研究发现去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）是肝细胞表面特异性表达的一种内吞性受体，主要存在于肝脏实质细胞朝向窦状隙一侧的细胞膜表面，可以特异性的结合糖类。半乳糖（Gal）和N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalgactosamine，GalNAc），是一种与肝表面去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）结合的配体。其中，GalNAc与ASGPR结合的亲和性比Gal高约50倍。研究发现，其亲和力的次序依次为：四触角>三触角>>双触角 >>单触角半乳糖苷。近年来，利用ASGPR的高亲和性配体N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）作为靶向分子，在核酸药物的肝靶向递送方面取得了一定的进展。多种GalNAc可以实现与siRNA和ASO的缀合，利用这种技术已经开展了淀粉样病变、血友病、高胆固醇血症、乙型肝炎等疾病的药物开发。

综上所述，GalNAc与寡核苷酸的缀合取得了一定的进展，主要包括GalNAc亚磷酰胺方法和后期修饰的方法，但是目前的缀合对反应的基团存在一定的限制（比如空间位阻效应，序列位点等），因此相对比较局限。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种GalNAc化合物、其与寡核苷酸缀合物及制备方法，设计特定GalNAc化合物，可实现与寡核苷酸任意位置进行缀合，推动小核酸药物的应用。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种GalNAc化合物，所述GalNAc化合物包括式I所示的化合物或其化学上可接受的盐；

式I

其中，L₁为-HNC(O)-或-C(O)NH-；L₂为-(CH₂)_n1-，其中n1为1-7的整数；Z₁为O或C；L₃为-(CH₂)_n2-，其中n2为1-4的整数；Z₂为O或C；n为0-10的整数；L₄为-(CH₂)_n3-，其中n3为1-7的整数；A的结构式为式II或式III，其中B为核苷酸的碱基部分，包括天然存在的核碱基和核碱基类似物；R₁为亚磷酰胺化合物或氢；R₂为羟基保护基团；R₃为氢、烷氧基或卤素及其类似物；

式II />式III

G的结构式为式IV；

式IV

其中，X₁为-(CH₂)_a-或-(CH₂CH₂O)_aCH₂-，a为1-5的整数；X₂为-(CH₂)_b-，b为1-6的整数；Y₁为0或1；Y₂为0、1或2；Y₃为1、2或3。

本发明中，设计新型的GalNAc化合物，可实现与寡聚核酸任意位置连接，且够结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，可有效应用于寡聚核酸的递送，增强递送效果，提高寡聚核酸作用效果以及在体内的半衰期、药峰浓度和药-时曲线下面积等，推动寡聚核酸药物的发展。

在一种实施方案中，L₁为-HNC(O)-。

在一种实施方案中，L₂为-(CH2)₄-。

在一种实施方案中，Z₁为C。

在一种实施方案中，L₃为-(CH2)₂-。

在一种实施方案中，Z₂为C。

在一种实施方案中，n为1。

在一种实施方案中，L₄为-(CH2)₂-。

在一种实施方案中，所述亚磷酰胺化合物的结构式为式V。

式V。

可选地，所述R₂为4, 4'-二甲氧基三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基或异丙基二甲基甲硅烷基中任意一种。

可选地，所述A的结构式为式VI或式VII。

式VI />式VII。

可选地，所述G的结构式为式VIII。

式VIII。

在一实施方案中，所述GalNAc化合物的结构式如式IX（命名为YK-GAL-101）、式X（命名为YK-GAL-102）或式XI（命名为YK-GAL-103）所示。

式IX

式X

式XI。

第二方面，本发明提供一种缀合物，所述缀合物由寡核苷酸和第一方面所述的GalNAc化合物缀合得到，结构式包括式XII所示结构。

式XII

式XII中，Oligo代表寡核苷酸，其余部分代表GalNAc化合物部分，所述GalNAc化合物部分中的G、L₁、L₂、Z₁、L₃、Z₂、n和L₄同权利要求1，所述GalNAc化合物部分与所述寡核苷酸的5’端、中间位置或3’端缀合。

可选地，所述寡核苷酸包括非硫代寡核苷酸和硫代寡核苷酸。

可选地，所述寡核苷酸包括小干扰核苷酸、DNA、微小RNA、小激活RNA、小向导RNA、转运RNA、反义核苷酸或适配体中任意一种或至少两种的组合。

可选地，所述寡核苷酸调节靶基因的表达。

可选地，所述寡核苷酸和所述GalNAc化合物部分通过键或可切割的连接体连接。

本发明中，利用设计的GalNAc化合物与寡聚核酸任意位置缀合，可构建递送平台，实现良好地递送，可以理解，所述中间位置指寡聚核酸链上除5’端和3’端外的中间的任意位置。

第三方面，本发明提供第二方面所述缀合物的制备方法，所述方法包括：

将第一方面所述的GalNAc化合物与固相支持物相连，得到偶联物；利用所述偶联物为固相载体，采用化学固相合成法合成寡核苷酸，得到所述缀合物。

本发明中，基于设计的新型GalNAc化合物，开发化学固相合成方法进行缀合，可实现快速、高效制备缀合物。

可以理解，化学固相合成法包括粗品合成、脱保护、纯化等步骤。

可选地，在粗品合成步骤中，涉及GalNAc化合物的偶合时间为15~25 min，包括但不限于16、17、18、19、20、21、22、23或24 min等等。

可选地，在粗品合成步骤中，涉及GalNAc化合物的抽液配制循环3~8次。

可选地，在粗品合成步骤中，涉及GalNAc化合物的抽液配制循环4-5次。

可选地，在粗品合成步骤中，涉及GalNAc化合物的使用量相比固相支持物的载量为15-30倍摩尔比例，包括但不限于16、17、18、19、20、21、22、25、26、28或29倍摩尔比例等等。

可选地，在粗品合成步骤中，涉及GalNAc化合物的使用量相比固相支持物的载量为18-25倍摩尔比例。

可选地，所述寡核苷酸包括非硫代寡核苷酸和硫代寡核苷酸。

可选地，要制备GalNAc化合物与所述寡核苷酸的3’端缀合物，所述GalNAc化合物中R₁为H；要制备GalNAc化合物与所述寡核苷酸的5’端缀合物，所述GalNAc化合物中A的结构式为式III；要制备GalNAc化合物与所述寡核苷酸的中间位置缀合物，所述GalNAc化合物中A的结构式为式II。

第四方面，本发明提供第二方面所述的缀合物在制备药物中的应用。

本发明中，利用设计的GalNAc化合物与寡聚核酸任意位置缀合，可构建递送平台，实现良好地递送，进而可有效应用于寡聚核酸药物等的开发，包括降血脂药物，治疗乙肝及高血压的药物等。

第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第二方面所述的缀合物以及药学上可接受的辅料。

可选地，所述辅料包括载体、防腐剂、抑菌剂或抗氧化剂等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1．本发明设计新型的GalNAc化合物，可与寡核苷酸序列的任意位置连接，而现有技术（例如将GalNAc配体修饰到寡核苷酸3’端上（US20150119444A1, US20150119445A1）；通过液相合成方法将GalNAc配体连接到寡核苷酸5’端上（US20150126718A1））只是将GalNAc化合物连接到寡核苷酸两端（3’或5’端）；

本发明将GalNAc化合物与核糖环2’端进行连接，然后合成GalNAc亚磷酰胺单体化合物，再利用固相方法合成GalNAc修饰的寡核苷酸，此方法可以将一个或多个GalNAc化合物修饰到寡核苷酸序列的任意位置；

2．本发明能够通过固相合成方法，实现GalNAc化合物与寡核苷酸序列的任意位置连接，如制备得到5’端GalNAc修饰的寡核苷酸，相比于现有液相方法（如US20150126718A1），减少了反应步骤，缩短了反应时间，并且实验后处理更加简单，收率可以达到70%以上，纯度可以达到98%以上；

3. 由本发明GalNAc化合物缀合到siRNA的5’端或中间任意位点的GalNAc-siRNA缀合物，与现有技术3’端GalNAc缀合的siRNA相比，对肝组织递送效果、靶标蛋白表达的抑制率、靶标mRNA的抑制率和LDL-C的降低水平，以及对药物肝脏中的半衰期、药峰浓度和药-时曲线下面积等指标均有显著提升；

例如本发明具体实施例中，与D51-DV26P-G10相比，D51-DV26P-G101对小鼠血清中PCSK9蛋白抑制率提高了22.3%，对小鼠肝脏中PCSK9 mRNA抑制率提高了23.4%，小鼠血清中的LDL-C降低水平提高了14.2%，肝脏中半衰期增长了26.03%，药峰浓度提高了14.05%，药-时曲线下面积增加了20.26%；

与D5-DV26P-G302相比，D5-DV26P-G103m8对小鼠血清中PCSK9蛋白抑制率提高了27.0%，对小鼠肝脏中PCSK9 mRNA抑制率提高了23.4%，小鼠血清中LDL-C降低水平提高了17.2%，肝脏中半衰期增长了21.43%，药峰浓度提高了8.82%，药-时曲线下面积增加了14.27%；

4．与现有技术GalNAc配体化学结构不同，本发明将GalNAc配体制备成亚磷酰胺单体，然后通过固相合成方法将修饰的GalNAc配体直接连接到寡核苷酸序列上，与现有技术（如US20150119444A1, US20150119445A1、US20150126718A1等）相比，操作更简单、高效。

附图说明

图1为hPCSK9转基因小鼠在给药后7天和给药后14天，不同实验组（D51-DV26P-G10、D51-DV26P-G101、D51-DV26P-G103m21、D51-DV26P-G103m8、D51-DV26P-G103m7和D51-DV26P-G103m1）小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率结果图。

图2为hPCSK9转基因小鼠在给药后7天和给药后14天，不同实验组（D5-DV26P-G302、D5-DV26P-G103m8、D5-DV26P-G103m6和D5-DV26P-G103m1）小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率结果图。

图3为hPCSK9转基因小鼠在给药后14天，不同实验组（D51-DV26P-G10、D51-DV26P-G101、D51-DV26P-G103m21、D51-DV26P-G103m8、D51-DV26P-G103m7和D51-DV26P-G103m1）小鼠肝脏中PCSK9 mRNA抑制率结果图。

图4为hPCSK9转基因小鼠在给药后14天，不同实验组（D5-DV26P-G302、D5-DV26P-G103m8、D5-DV26P-G103m6和D5-DV26P-G103m1）小鼠肝脏中PCSK9 mRNA抑制率结果图。

图5为hPCSK9转基因小鼠在给药后7天和给药后14天，不同实验组（D51-DV26P-G10、D51-DV26P-G101、D51-DV26P-G103m21、D51-DV26P-G103m8、D51-DV26P-G103m7和D51-DV26P-G103m1）小鼠血清LDL-C降低水平结果图。

图6为hPCSK9转基因小鼠在给药后7天和给药后14天，不同实验组（D5-DV26P-G302、D5-DV26P-G103m8、D5-DV26P-G103m6和D5-DV26P-G103m1）小鼠血清LDL-C降低水平结果图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买获得的常规产品。

本发明具体实施例中以下缩写字母或英文单词或化学式分别代表如下试剂：

DMF：N, N-二甲基甲酰胺；DBU：1, 8-二氮双环[5.4.0]十一-7-烯；BOMCl：苄基(氯甲基)醚；Py：吡啶；DCM：二氯甲烷；MeOH：甲醇；DMTrCl：4, 4'-二甲氧基三苯基氯甲烷；EA：乙酸乙酯；TFA：三氟乙酸；NMI：N-甲基咪唑；THF：四氢呋喃；DIEA：N, N-二异丙基乙胺；HBTU：O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐；MTBE：甲基叔丁基醚；DCI：4, 5-二氰基咪唑；imidazole：咪唑；TBSCl：叔丁基二甲基氯硅烷；C₁₂H₂₅SH：十二烷-1-硫醇；NaH：氢化钠；Grubbs II catalyst：二氯(1,3-二(2，4，6-三甲苯基)2-imidazolidinylidene](苯亚甲基)(三环己基膦)钌(II)；DMAP：3-双(二异丙基氨基)膦酰氧基丙腈；succianteanhydride：琥珀酸酐；CPG-NH₂：氨基改性的可控微孔玻璃珠；Ac₂O：乙酸酐。

实施例1

本实施例进行GalNAc化合物的合成。

1．YK-GAL-101的合成

合成路线如下：

1）化合物G1-2的合成

将化合物G1-1（10.0 g, 43.8 mmol）和DMF（100 mL）加入250 mL反应瓶中，搅拌至溶解，降温至0℃，依次加入DBU（3.3 g, 87.6 mmol）和BOMCl (10.2 g, 65.7 mmol)。25℃搅拌约3 h。TLC检测原料完全反应。降温至0℃，用甲醇（30 mL）淬灭，并减压浓缩除去溶剂得残留物。残留物过硅胶柱（PE/EA）纯化，得无色油状物16.6 g，收率84.5%。得到G1-2，¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.93 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.34-7.26 (m, 5 H), 6.16(t, J = 6.4 Hz, 1 H), 5.76 (t, J = 4.0 Hz, 1 H), 5.31-5.27 (m, 3 H), 5.05 (t,J = 5.2 Hz, 1 H), 4.58 (s, 2 H), 4.25-4.22 (m, 1 H), 3.82-3.80 (m, 1 H),3.59-3.55 (m, 2 H), 2.15-2.07 (m, 2 H)。MS:371.2 [M+Na]⁺。

2）化合物G1-3的合成

将化合物G1-2（7.20 g, 20.6 mmol）和超干吡啶（50 mL）加入250 mL反应瓶中，减压浓缩除去溶剂，并重复2次。再次加入吡啶（72 mL）并降温至0℃，最后加入DMTr-Cl (8.40g, 24.8 mmol)，20℃搅拌约4 h。TLC检测原料完全反应。降温至0℃，用饱和NaHCO₃溶液（100 mL）淬灭，并加入H₂O（150 mL）稀释，EA萃取（150 mL）2次。合并有机相，用NaCl溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩除去溶剂得残留物。残留物过硅胶柱（PE/EA）纯化，得无色油状物15.1 g，收率85.2%。得到G1-3，¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.68 (d, J = 8.4 Hz,1 H), 7.35-7.22 (m, 14 H), 6.88 (d, J = 8.8 Hz, 4 H), 6.14 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 5.47 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 5.36-5.29 (m, 3 H), 4.57 (s, 2 H), 4.28 (t, J= 4.8 Hz, 1 H), 3.89-3.88 (m, 1 H), 3.72 (s, 6 H), 3.26-3.16 (m, 2 H), 2.21-2.15 (m, 2 H)。MS:1300.7 [2M-H]^-。

3）化合物G1-4的合成

将化合物G1-3（9.90 g, 15.2 mmol）和吡啶（100 mL）加入250 mL反应瓶，搅拌至溶解，降温至0℃，依次加入咪唑(3.11 g, 45.6 mmol)和TBSCl (4.59 g, 30.4 mmol)，30℃搅拌16 h。TLC检测原料完全反应。降温至0℃，用饱和NaHCO₃溶液（100 mL）淬灭，并加入H₂O（200 mL）稀释，EA萃取（200 mL）2次。合并有机相，用NaCl溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩除去溶剂得淡黄色油状物15.0 g，得到G1-4，无需纯化直接用于下一步投料。

4）化合物G1-5的合成

将化合物G1-4（15.0 g, 14.3 mmol）和DCM（100 mL）加入250 mL反应瓶中，搅拌溶解，加入十二烷-1-硫醇(5.82 g, 28.7 mmol)和TFA (8.20 g, 71.9 mmol)，降温至0℃并搅拌2h。TLC检测原料完全反应。降温至0℃，用NMI（7 mL）淬灭，减压浓缩除去溶剂得残留物。残留物过硅胶柱（PE/EA）纯化，得淡黄色油状物6.80 g，收率96.0%。得到G1-5，¹HNMR(400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.93 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.32-7.26 (m, 5 H), 6.16-6.13(m, 1 H), 5.79-5.75 (m, 1 H), 5.31-5.30 (m, 2 H), 5.09 (t, J = 5.2 Hz, 1 H),4.58 (s, 2 H), 4.42-4.39 (m, 1 H), 3.89-3.87 (m, 1 H), 3.58-3.33 (m, 2 H),2.16-2.12 (m, 2 H), 0.87 (s, 9 H), 0.85 (s, 6 H)。MS:232.2 [M+2 H]²⁺。

5）化合物G1-6的合成

将化合物G1-5(5.00 g, 10.8 mmol)和THF（70 mL）加入250 mL反应瓶中，搅拌溶解并降温至0℃，加入NaH (648 mg, 16.2 mmol, 纯度60.0%)，0℃搅拌10 min。加入烯丙基碘(3.63 g, 21.6 mmol)，30℃搅拌16 h。LC-MS检测原料完全反应。用NH₄Cl溶液（50 mL）淬灭，EA萃取（100 mL）2次。合并有机相，用NaCl溶液洗涤有机相2次，无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩除去溶剂得残留物，残留物过硅胶柱（PE/EA）纯化，得无色油状物4.46 g，收率82.0%。得到G1-6，¹HNMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 7.76 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.30-7.16 (m, 5H), 6.21 (t, J = 6.4 Hz, 1 H), 5.86-5.77 (m, 1 H), 5.61 (d, J = 8.0 Hz, 1 H),5.39 (s, 2 H), 5.21-5.13 (m, 2 H), 4.62 (s, 2 H), 4.37-4.33 (m, 1 H), 3.95(d, J = 5.6 Hz, 2 H)，3.92-3.89 (m, 1 H), 3.64-3.60 (m, 1 H), 3.53-3.49 (m, 1H), 2.26-2.20 (m, 1 H), 2.04-1.96 (m, 1 H), 0.81 (s, 9 H), 0.01 (s, 6 H)。MS:525.2 [M+Na]⁺。

6）化合物G1-7的合成

将化合物G1-6（3.90 g, 7.76 mmol），9-癸烯酸（2.64 g, 15.5 mmol）和DCM（40mL）加入反应瓶，搅拌溶解，加入Grubbs II catalyst (658 mg, 775 μmol)。40℃搅拌16h。LC-MS检测原料完全反应。将反应液减压浓缩得残留物，残留物过硅胶柱（PE/EA）纯化，得黄色油状物5.05 g，收率80.5%。得到G1-7，¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.91 (d, J = 7.8Hz, 1 H), 7.38-7.30 (m, 5 H), 6.30 (t, J = 5.7 Hz, 1 H), 5.79-5.67 (m, 2 H),5.48 (s, 2 H), 5.30 (s, 1 H), 4.70 (s, 2 H), 3.98-3.96 (m, 2 H), 3.68 (d, J =10.4 Hz, 1 H), 3.64 (d, J = 10.9 Hz, 1 H), 2.33-2.33 (m, 3 H), 2.13-2.06 (m,3 H), 1.33-1.24 (m, 12 H), 0.89 (s, 9 H), 0.08 (s, 6 H)。MS:645.3 [M+H]⁺。

7）化合物G1-8的合成

将化合物G1-7（1.50 g, 2.33 mmol），TFA（95 mg, 6.98 mmol）和THF（15 mL）加入反应釜，搅拌至溶解，加入Pd/C（900 mg, 10%）。H₂（15 psi）环境下，35℃搅拌16 h。LC-MS检测原料完全反应。过滤反应液并用THF（150 mL）淋洗，减压浓缩除去溶剂得残留物。残留物用制备HPLC纯化。得黄色油状物757 mg，收率78.0%。得到G1-8，¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ9.20 (s, 1 H), 7.95 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 6.34 (t, J = 7.2 Hz, 1 H), 5.74 (d,J = 8.0 Hz, 1 H), 4.53-4.51 (m, 1 H), 4.12 (d, J = 3.2 Hz, 1 H), 3.74-3.71(m, 1 H), 3.61-3.58 (m, 1 H), 3.52-3.43 (m, 2 H), 2.46-2.39 (m, 1 H), 2.36(t, J = 7.1 Hz, 2 H), 2.24-1.17 (m, 1 H), 1.63 (t, J = 7.1 Hz, 2 H), 1.56 (t,J = 6.7 Hz, 2 H),1.36-1.28 (m, 12 H)。MS:413.2 [M+H]⁺。

8）化合物G1-10的合成

将化合物G1-8 (600 mg, 1.45 mmol)和DMF (9.0 mL)加入反应瓶，搅拌至溶解，依次加入DIEA (564 mg, 4.36 mmol)和HBTU (827 mg, 2.18 mmol)。随后将化合物G1-9（外购，药明康德）（1.39 g, 727 μmol）加入反应体系中，15℃搅拌2 h。LC-MS检测化合物G1-8还有剩余。分批补加化合物G1-9(1.52 g, 797 μmol)和DIEA (376 mg, 2.91 mmol)，15℃共搅拌4 h。LC-MS检测化合物G1-8基本反应完全。将反应液直接浓缩得残留物。残留物用制备HPLC纯化。得白色固体2.71g，收率85.4%。得到G1-10，¹H NMR (400 MHz, CD₃CN) δppm 9.66 (s, 1 H), 7.80 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.17 (t, J = 5.6 Hz, 3 H), 6.98(t, J = 7.0 Hz, 3 H), 6.89 (d, J = 8.0 Hz, 3 H), 6.66 (s, 1 H), 6.22 (t, J =6.8 Hz, 1 H), 5.63 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 5.31 (d, J = 2.8 Hz, 3 H), 5.07-5.03(m, 3 H), 4.66 (d, J = 3.2 Hz, 3 H), 4.38 (s, 1 H), 4.16-4.06 (m, 7 H), 4.01-3.96 (m, 6 H), 3.86-3.80 (m, 3 H), 3.67-3.64 (m, 12 H), 3.67-3.46 (m, 7 H),3.24-3.17 (m, 12 H), 2.37 (t，J = 5.7 Hz，6 H), 2.26 (s, 3 H), 2.19-2.16 (m, 8H), 2.12 (s, 9 H), 2.01 (s, 9 H),1.98-1.96 (m, 7 H), 1.88 (s, 9 H), 1.66-1.62(m, 24 H), 1.33-1.28 (m, 12 H)。MS:1095.1 [M + 2 H]²⁺。

9）YK-GAL-101的合成

将化合物G1-10(2.00 g, 913 μmol)和DCM(20 mL)加入反应瓶，搅拌至溶解，依次加入3-双(二异丙基氨基)膦酰氧基丙腈(688 mg, 2.28 mmol)和4,5-二氰基咪唑(215 mg,1.83 mmol)，10℃搅拌2 h。LC-MS检测化合物G1-10完全反应。反应液用DCM(100 mL)稀释并用NaHCO₃ (100 mL)洗涤2次。有机相用无水Na₂SO₄干燥，并浓缩去除溶剂得残留物。将残留物溶于DCM(30 mL)，于10-15℃条件下用正庚烷/MTBE打浆10min，共打浆3次。得白色固体1.98 g，收率91.0%。¹H NMR (400 MHz, CD₃CN) δ ppm 9.76 (s, 1 H), 7.88 (d, J = 8.0Hz, 1 H), 7.22 (t, J = 5.6 Hz, 3 H), 7.02 (t, J = 5.5 Hz, 3 H), 6.96 (d, J =9.3 Hz, 3 H), 6.65 (s, 1 H), 6.22 (t, J = 6.8 Hz, 1 H), 5.64-5.62 (m, 1 H),5.31 (d, J = 2.8 Hz, 3 H), 5.07-5.04 (m, 3 H), 4.56(d, J = 3.2 Hz, 4 H),4.19-4.06 (m, 8 H), 4.03-3.96 (m, 6 H), 3.86-3.76 (m, 5 H), 3.71-3.64 (m, 17H), 3.56-3.46 (m, 6 H), 3.24-3.17 (m, 12 H), 2.69 (t, J = 7.0 Hz, 2 H), 2.41-2.36 (m, 7 H), 2.30-2.29 (m, 1 H), 2.19-2.16 (m, 7 H), 2.12 (s, 9 H), 2.01(s, 9 H), 1.98-1.96 (m, 3 H), 1.88 (s, 9 H),1.64-1.46 (m, 24 H), 1.40-1.28(m, 14 H)，1.21-1.20 (m, 12 H)。³¹P NMR (162 MHz, CD₃CN) δ 147.96, 148.08。MS:1194.4 [M + 2 H]²⁺。

2．YK-GAL-102的合成

合成路线如下：

1）化合物G2-2的合成

将化合物G2-1(5.00 g, 20.4 mmol)和DMF(60mL)加入250mL反应瓶，搅拌至溶解，依次加入DBU(6.23 g, 40.9 mmol)和BOMCl(4.81 g, 30.7 mmol)，25℃搅拌2 h。反应结束后用NaHCO₃ (300 mL)溶液淬灭，水相用EA (100 mL)萃取，有机相用饱和NaCl(200 mL)溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥，并浓缩除去溶剂得残留物。过硅胶柱纯化得到白色固体8.64 g，收率88.0%。¹H NMR（DMSO-d₆, 400 MHz）δ8.00 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.36-7.28 (m, 5 H),5.82-5.78 (m, 2 H), 5.44 (d, J = 4.6 Hz, 1 H), 5.35-5.30 (m, 2 H), 5.15-5.10(m, 2 H), 4.60 (s, 2 H), 4.05-3.96 (m, 2 H), 3.89-3.87 (m, 1 H), 3.66-3.58(m, 2 H) ppm。MS:387.3 [M + Na]⁺。

2）化合物G2-3的合成

将化合物G2-2(15.0 g, 41.1 mmol)和DMF (300 mL)加入反应瓶，搅拌至溶解。加入KOH (4.62 g, 82.3 mmol)，25℃搅拌0.5 h。随后加入11-溴十一酸甲酯(17.2 g, 61.7mmol)，25℃搅拌16h。反应结束后用饱和NH₄Cl溶液(15.0 mL)淬灭，减压除去溶剂得残留物。残留物用制备HPLC纯化，得到白色固体(14.40 g, 28.03 mmol)，收率62.0%。并对得到的固体用同样条件进行二次纯化，得到白色固体10.80 g，收率46.5%。¹H NMR（DMSO-d₆, 400MHz）δ 8.04 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.34-7.26 (m, 5 H), 5.85 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 5.78 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 5.35-5.30 (m, 2 H), 5.17-5.05 (m, 2 H), 4.58(s, 2 H), 4.08-4.06 (m, 1 H), 3.89-3.83 (m, 2 H), 3.69-3.66 (m, 2 H), 3.61-3.56 (s, 3 H), 3.52-3.46 (m, 2 H), 2.26 (t, J = 7.6 Hz, 2 H), 1.50-1.45 (m, 4H), 1.19 (m, 12 H) ppm。MS:563.4 [M + H]⁺。

3）化合物G2-4的合成

将化合物G2-3 (2.70 g, 4.80 mmol)，THF (20.0 mL)和水(20.0 mL)加入反应瓶，搅拌至溶解。加入LiOH·H₂O (402 mg, 9.60 mmol)，50℃搅拌6 h。再次加入LiOH·H₂O(402 mg, 9.60 mmol)，50℃搅拌16 h。反应结束后用1.0 M HCl调节溶液至中性，减压浓缩除去溶剂得残留物。将残留物溶于水(20 mL)中，用1.0 M HCl调节溶液pH约1.0，用DCM(20.0 mL)萃取5次。合并有机相，浓缩得到黄色油状物1.76 g，收率85.3%，无需纯化直接用于下一步反应。MS:429.3 [M + H]⁺。

4）化合物G2-5的合成

将化合物G2-4(1.20 g, 2.80 mmol)和超干吡啶(20 mL)加入反应瓶，搅拌至溶解，浓缩除去溶剂，并重复约4次。再次加入超干吡啶(13 mL)，搅拌至溶解后加入DMTrCl(1.71 g, 5.04 mmol)，15 ℃搅拌6 h。反应结束后用饱和NaHCO₃ (10 mL)溶液淬灭，并用EA(30 mL)萃取2次。有机相用饱和NaCl (50 mL)溶液洗涤，无水Na₂SO₄干燥。减压浓缩除去溶剂得到残留物。残留物先过硅胶柱纯化(EA/PE)，然后再制备HPLC进一步纯化，得到白色固体1.65 g，收率80.3%。¹H NMR（DMSO-d₆, 400 MHz）δ 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 1 H),7.43-7.20 (m, 9 H), 6.91-6.86 (m, 4 H), 5.80 (d, J = 3.6 Hz, 1 H), 5.28 (d, J= 8.0 Hz, 1 H), 4.23-4.11 (m, 1 H), 3.95-3.88 (m, 2 H), 3.73 (s, 6 H), 3.61-3.39 (m, 3 H), 3.31-3.20 (m, 2 H), 2.16 (t, J = 7.2 Hz, 2 H), 1.50-1.46 (m, 4H), 1.24-1.22 (m, 12 H) ppm。MS:729.5 [M - H]^-。

5）YK-GAL-102的合成

将化合物G2-5 (350 mg, 420 μmol)和DMF (4.5 mL)加入反应瓶，搅拌至溶解。加入DIEA (163 mg, 1.26 mmol)和HBTU (239 mg, 630 μmol)，然后加入化合物G1-9 (0.40g, 210 μmol)，氮气保护下，15 ℃搅拌1 h。分批补加化合物G1-9(0.40 g, 210 μmol)和DIEA (54.3 mg, 420 μmol)，15℃共搅拌6 h。反应液直接减压浓缩至干得残留物，残留物用制备HPLC纯化，得到白色固体1.04 g，收率88.3%。¹H NMR（CD₃CN, 400 MHz）δ9.87 (s, 1H), 7.82 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.57-7.50 (m, 2 H), 7.44-7.30 (m, 9 H),7.22-7.19 (m, 4 H),7.02-6.91 (m, 9 H), 6.71-6.69 (m, 1 H), 5.95 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 5.37 (d, J = 3.2 Hz, 4 H), 5.13-5.10 (m, 4 H), 4.62 (d, J = 8.4 Hz, 4 H),4.43-4.39 (s, 1 H), 4.21-4.01 (m, 8 H), 3.94-3.85 (m, 6 H), 3.81-3.70 (m, 18H), 3.59-3.40 (m, 7 H), 3.33-3.23 (m, 12 H), 2.42 (t, J = 7.2 Hz, 6 H), 2.27-2.12 (m, 20 H), 2.06-1.96 (m, 22 H), 1.71-1.59 (m, 24 H), 1.33-1.28 (m, 12 H)ppm。MS:1251.9 [M - 2H]^2-。

3．YK-GAL-103的合成

合成路线如下：

将化合物YK-GAL-102 (700 mg, 279 μmol)和DCM (7 mL)加入反应瓶，搅拌至溶解。加入双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦 (210 mg, 697 μmol)和DCI (66 mg, 558 μmol)，10 ℃搅拌2 h。用DCM (7 mL)稀释反应液，用饱和NaHCO₃ (13 mL)溶液洗涤2次，有机相用无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩除去溶剂得残留物。将残留物溶于DCM (11 mL)，10-15℃下在正庚烷/MTBE中析晶，重复操作3次。得到白色固体525 mg，收率59.03%，纯度85.0%。取300mg用制备HPLC纯化，得到蓝色固体272 mg，收率90.7%，纯度95.0%。

¹H NMR（CD₃CN, 400 MHz）δ9.65 (s, 1 H), 7.83-7.73 (m, 1 H), 7.47 (t, J =8.0 Hz, 2 H)，7.44-7.30 (m, 9 H),7.22-7.19 (m, 4 H), 6.92-6.88 (m, 7 H), 6.79(d, J = 9.6 Hz, 3 H), 5.91-5.88 (m, 1 H), 5.31-5.25 (m, 4 H), 5.07-5.03 (m, 4H), 4.56-4.42 (m, 4 H), 4.20-4.04 (m, 10 H), 4.02-3.95 (m, 6 H), 3.81-3.70(m, 18 H), 3.59-3.40 (m, 7 H), 3.33-3.23 (m, 14 H), 2.72-2.68 (m, 1 H), 2.55(t, J = 7.0 Hz, 1 H)，2.36 (t, J = 5.6 Hz, 6 H), 2.27-2.12 (m, 20 H), 2.06-1.96 (m, 22 H), 1.65-1.53 (m, 24 H), 1.33-1.28 (m, 12 H)，1.27-1.17 (m, 9 H),1.08 (d, J = 4.0 Hz, 3 H) ppm。 ³¹P NMR（CD₃CN, 176 MHz）δ149.6, 149.2 ppm。MS:2705.2 [M - H]^-。

4．对照品YK-GAL-302的合成

按照CN116854754B第37-39页中化合物YK-GAL-302的合成方法合成，得到产物714mg。

5．对照品GAL-10的合成

按照WO2013033230A1第144页中化合物10的合成方法合成GAL-10，得到产物641mg，MS (ESI) m/z [M + H]⁺ = 2848.7。

实施例2

本实施例进行GalNAc化合物与固相载体的偶联。

合成路线如下：

“●”表示固相载体。

1．化合物G3-1的合成

将化合物YK-GAL-102（300 mg, 120 μmol）和DMF(1.3 mL)加入反应瓶，搅拌至溶解，依次加入DIEA (30.9 mg, 239 μmol), DMAP (29.24 mg, 239 μmol)和琥珀酸酐（59.9mg, 598 μmol），20 ℃搅拌12 h。补加DIEA (3.09 mg, 23.9 μmol), DMAP (2.92 mg,23.94 μmol)和琥珀酸酐(5.99 mg, 59.8 μmol)，20℃继续搅拌，LC-MS监测，化合物YK-GAL-102完全反应，减压浓缩除去溶剂得残留物，残留物进行制备HPLC纯化得白色固体0.24g，收率78.0%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.84-7.82 (m, 1 H), 7.37-7.24 (m, 16H), 7.27-7.16 (m, 7 H), 7.08-7.05 (m, 3 H), 6.93-6.91 (m, 3 H), 6.86-6.83 (m,4 H), 6.67-6.65 (m, 1 H), 6.01-6.00 (d, J = 4.40 Hz, 1 H), 5.41-5.32(m, 5 H),5.25-5.38 (m, 3 H), 4.68-4.65 (m, 3 H), 4.31-4.30 (m, 1 H), 4.23-4.09 (m, 10H), 4.01-3.93 (m, 6 H), 3.83 (s, 6 H), 3.75-3.72 (m, 13 H), 3.54-3.37 (m, 6H), 3.24-3.17 (m, 13 H), 3.61-3.48 (m, 7 H), 3.33-3.24 (m,13 H), 2.79-2.47(m, 24 H), 1.29-1.26 (m, 12 H),1.17-1.13 (m, 20 H) ppm。

2．化合物G3的合成

将化合物G3-1(0.093 g, 32.5 μmol)和DMF (5 mL) 加入反应瓶，搅拌至溶解，依次加入DIEA (33.6 mg, 260 μmol) , HBTU (61.6 mg, 162 μmol) 和DMAP (3.97 mg,32.5 μmol)。20℃搅拌5 min，随后加入固相支持物CPG-NH₂ (500Å) (570 mg)，40℃搅拌16h。LC-MS检测化合物G3-1完全反应，过滤，过滤物依次用MeOH (5 mL)洗涤4次，DCM (5mL)洗涤4次，干燥。再向过滤物中加入乙酸酐/吡啶溶液（5 mL），40 ℃搅拌0.5 h，过滤。过滤物再依次用MeOH (5 mL)洗涤4次，DCM (5 mL)洗涤4次，真空条件下干燥12 h，得黄色固体（540 mg）。

实施例3

本实施例进行GalNAc缀合的寡核苷酸的合成。

本实施例中使用两个siRNA序列进行合成，缀合的siRNA序列为编号分别为D51-DV26P和D5-DV26P的序列，其中D51-DV26P序列如下：

正义链（D51-DV26P-SS，SEQ ID NO.1）：

5’-Ums-Gms-Gm-Am-Gm-Gm-Cf-Um-Uf-Af-Gf-Cm-Um-Um-Um-Cm-Uf-Gm-Gm-Am-Um-3’

反义链（D51-DV26P-AS，SEQ ID NO.2）：

5’-AmEVPs-Ufs-Cf-Cf-Am-Gf-Am-Am-Am-Gm-Cm-Um-Am-Af-Gm-Cf-Cm-Um-Cm-Cm-Ams-Ums-Um-3’

D5-DV26P序列如下：

正义链（D5-DV26P-SS，SEQ ID NO.3）：

5’-Ams-Ams-Gm-Am-Um-Cm-Cf-Um-Gf-Cf-Af-Um-Gm-Um-Cm-Um-Uf-Cm-Cm-Am-Um-3’

反义链（D5-DV26P-AS，SEQ ID NO.4）：

5’-AmsEVP-Ufs-Gf-Gf-Am-Af-Gm-Am-Cm-Am-Um-Gm-Cm-Af-Gm-Gf-Am-Um-Cm-Um-Ums-Gms-Gm-3’

其中，A、U、C、G代表核苷酸的碱基组成；m代表m左侧相邻的核苷酸为2’-OMe修饰；f代表f左侧相邻的核苷酸为2’-F修饰；s代表s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。EVP代表EVP左侧相邻的核苷酸为5'-(E)-VP修饰。

1. 中间位置GalNAc缀合的寡核苷酸的固相合成

制备中间位置GalNAc缀合的siRNA的正义链

使用通用CPG固相载体进行固相合成，在合成时通过将正义链中间不同位置的Um单体替换为实施例1中合成的YK-GAL-103，每条正义链仅替换一个中间位置的Um单体，得到在不同中间位置GalNac缀合的siRNA的正义链，分别编号如下：

正义链（D51-DV26P- G103m8-SS）：

5’-Ums-Gms-Gm-Am-Gm-Gm-Cf-Um-Uf-Af-Gf-Cm-Um-U_L2-Um-Cm-Uf-Gm-Gm-Am-Um-3’

正义链（D51-DV26P- G103m7-SS）：

5’-Ums-Gms-Gm-Am-Gm-Gm-Cf-Um-Uf-Af-Gf-Cm-Um-Um-U_L2-Cm-Uf-Gm-Gm-Am-Um-3’

正义链（D5-DV26P- G103m8-SS）：

5’-Ams-Ams-Gm-Am-Um-Cm-Cf-Um-Gf-Cf-Af-Um-Gm-U_L2-Cm-Um-Uf-Cm-Cm-Am-Um-3’

正义链（D5-DV26P- G103m6-SS）：

5’-Ams-Ams-Gm-Am-Um-Cm-Cf-Um-Gf-Cf-Af-Um-Gm-Um-Cm-U_L2-Uf-Cm-Cm-Am-Um-3’

U_L2表示三触角的N-乙酰半乳糖胺修饰的尿嘧啶核苷酸（与核糖环2’位相连）

具体操作如下所述：

1）试剂和单体准备

取100 nmol规格的通用Frits柱，商业化通用的2’-OMe核苷单体（Am, Gm, Cm,Um），2’-F核苷单体（Af, Gf, Cf, Uf），5'-(E)-VP单体和GalNAc亚磷酰胺单体（YK-GAL-103，实施例1中合成）溶于超干无水乙腈制备成浓度约0.1-0.2 M的溶液，并加入3Å分子筛。以5-乙硫基四氮唑（5-ETT）的乙腈溶液为活化剂（0.25 M），0.05 M碘的吡啶/水/THF溶液为氧化剂，氢化黄原素（ADTT）的吡啶溶液为硫代试剂（0.2 M），3%三氯乙酸（TCA）二氯甲烷溶液为脱保护剂，乙酸酐/THF为CAP A试剂，吡啶/N-甲基咪唑/THF为CAP B试剂，并装入192 P型号DNA/RNA自动合成仪中指定的试剂位置中。

2）粗品合成

输入指定的寡核苷酸序列，并设定好合成程序，检查无误后，开始循环寡核苷酸的合成，偶联阶段通用2’-OMe核苷单体，2’-F核苷单体和5’-(E)-VP单体偶合时间2-3 min，涉及GalNAc亚磷酰胺单体的偶合时间20 min（抽液配制循环4次），GalNAc亚磷酰胺单体使用量为18倍摩尔比例；氧代时间约30-45秒；硫代时间约2 min；脱保护时间约30-45秒；盖帽时间约30-45秒。循环结束后，完成寡核苷酸的固相合成。

3）脱保护

合成结束后，将带有寡核苷酸的Frits柱转移到玻璃杯中，加入200 mL乙醇氨水溶液（乙醇：浓氨水 = 2: 5），55℃保温24h。保温结束后冷却至25℃，过滤并用适量纯化水洗涤残留Frits柱，溶液低温浓缩得残留物。或者将带有寡核苷酸的Frits柱从合成仪中取出，用200 μL 90%乙腈溶液冲洗1次，离心抽干，放入气相氨解仪内，95℃氨解2 h，氨解结束后降温至60℃以下，取出降至25℃，用200 μL纯化水洗涤1次，溶液低温浓缩得残留物。

4）纯化

将脱保护后的粗品残留物用纯化水溶解上样，并进行HPLC纯化，收集产物峰并用酶标仪测含量，将溶液冻干并进行HPLC和MS检测，得到在不同中间位置GalNAc缀合的siRNA的正义链，其中：

得到正义链（D51-DV26P-G103m8-SS）约13.0 OD，收率71.0%，纯度为98.2%，MS：8541.5 Da。

得到正义链（D51-DV26P-G103m7-SS）约13.2 OD，收率72.4%，纯度为98.4%，MS：8541.6 Da。

得到正义链（D5-DV26P-G103m8-SS）约13.1 OD，收率71.9%，纯度为98.1%，MS：8428.6 Da。

得到正义链（D5-DV26P-G103m6-SS）约13.2 OD，收率72.3%，纯度为98.4%，MS：8428.4 Da。

实验结果：

以GalNAc配体与核糖环2’位相连的GalNAc亚磷酰胺单体化合物为原料，通过固相方法，合成得到了中间位置GalNAc缀合的寡核苷酸，收率均超过70%，纯度均超过98%。而现有技术常规方法，由于GalNAc配体与核糖环5’位相连，因此用固相方法仅能制备得到在寡核苷酸末端（3’端或5’端）进行GalNAc修饰的序列，无法得到中间位置GalNAc缀合的寡核苷酸。按此方法获得了4种中间位置偶联GalNAc的siRNA正义链，与相应反义链配对后形成的siRNA如表1所示。

寡核苷酸一般具有几个到二十几个核苷酸残基，具有复杂的三维结构，GalNAc修饰的寡核苷酸在与ASGPR结合的过程中，会受到寡核苷酸结构的影响，因此仅将GalNAc配体缀合到寡核苷酸的末端（3’端或5’端），会使GalNAc递送寡核苷酸的效果受到一定的限制。本发明通过合成出与核糖环2’位相连的GalNAc亚磷酰胺单体化合物，可以实现GalNAc配体缀合到寡核苷酸的任意位置，突破了GalNAc配体仅能缀合到寡核苷酸3’端或5’端的限制，因此可根据不同寡核苷酸的三维结构，选择GalNAc配体缀合到哪个核苷酸残基上，大大扩展了GalNAc配体可修饰寡核苷酸的位置范围，进一步提高了其递送效率。

2．3’端GalNAc修饰的寡核苷酸的固相合成

制备3’端GalNAc缀合的siRNA的正义链

使用GalNAc-CPG化合物作为固相载体进行固相合成，得到在3’端GalNAc缀合的siRNA的正义链，其中使用实施例2中所合成的G3作为固相载体，使用两个siRNA序列分别得到正义链（D51-DV26P-G103m1-SS）和正义链（D5-DV26P-G103m1-SS）；使用实施例2中所合成的YK-GAL-302作为固相载体，使用D5-DV26P序列得到正义链（D5-DV26P-G302-SS）；使用通用CPG固相载体进行固相合成，使用D51-DV26P序列，在合成时将正义链第一个单体替换为实施例1中合成的GAL-10，得到正义链（D51-DV26P-10-SS）。3’端GalNAc缀合的siRNA的正义链序列信息如下：

正义链（D51-DV26P-G103m1-SS）：

5’-Ums-Gms-Gm-Am-Gm-Gm-Cf-Um-Uf-Af-Gf-Cm-Um-Um-Um-Cm-Uf-Gm-Gm-Am-U_L2-3’

正义链（D51-DV26P-G10-SS）：

5’-Ums-Gms-Gm-Am-Gm-Gm-Cf-Um-Uf-Af-Gf-Cm-Um-Um-Um-Cm-Uf-Gm-Gm-Am-U_L3-3’

正义链（D5-DV26P-G103m1-SS）：

5’-Ams-Ams-Gm-Am-Um-Cm-Cf-Um-Gf-Cf-Af-Um-Gm-Um-Cm-Um-Uf-Cm-Cm-Am-U_L2-3’

正义链（D5-DV26P-G302-SS）：

5’-Ams-Ams-Gm-Am-Um-Cm-Cf-Um-Gf-Cf-Af-Um-Gm-Um-Cm-Um-Uf-Cm-Cm-Am-Um-G302-3’

U_L2表示三触角的N-乙酰半乳糖胺修饰的尿嘧啶核苷酸（与核糖环2’位相连）

G302表示G302左侧的核苷酸用三触角的N-乙酰半乳糖胺YK-GAL-302修饰（与核糖环3’位相连）

U_L3表示三触角的N-乙酰半乳糖胺修饰的5-甲基尿嘧啶核苷酸（与核糖环2’位相连）

具体操作如下所述

1）试剂和单体准备

分别取一定量的G3固相载体和YK-GAL-302固相载体，并分别装填为100 nmol的合成柱，取100 nmol规格的通用Frits柱，商业化通用的2’-OMe核苷单体（Am, Gm, Cm, Um），2’-F核苷单体（Af, Gf, Cf, Uf）、5'-(E)-VP单体和GalNAc亚磷酰胺单体（GAL-10，实施例1中合成）溶于超干无水乙腈制备成浓度约0.1-0.2 M的溶液，并加入3A分子筛。以5-乙硫基四氮唑（5-ETT）的乙腈溶液为活化剂（0.25 M），0.05 M碘的吡啶/水/THF溶液为氧化剂，氢化黄原素（ADTT）的吡啶溶液为硫代试剂（0.2 M），3%三氯乙酸（TCA）二氯甲烷溶液为脱保护剂，乙酸酐/THF为CAP A试剂，吡啶/N-甲基咪唑/THF为CAP B试剂，并装入192 P型号DNA/RNA自动合成仪中指定的试剂位置中。

2）粗品合成

输入指定的寡核苷酸序列，并设定好合成程序，检查无误后，开始循环寡核苷酸的合成，偶联阶段通用2’-OMe核苷单体，2’-F核苷单体和5’-(E)-VP单体偶合时间2-3 min，涉及GalNAc亚磷酰胺单体的偶合时间20 min（抽液配制循环4次），GalNAc亚磷酰胺单体使用量为18倍摩尔比例；氧代时间约30-45秒；硫代时间约2 min；脱保护时间约30-45秒；盖帽时间约30-45秒。循环结束后，完成寡核苷酸的固相合成。

3）脱保护

合成结束后，需要将寡核苷酸从Frits柱上脱离和单体上的保护基脱离，因此需要将带有寡核苷酸的Frits柱转移到玻璃杯中，加入200 mL乙醇氨水溶液（乙醇：浓氨水=2:5），55℃保温24h，保温结束后冷却至25℃，过滤并用适量纯化水洗涤残留Frits柱，溶液低温浓缩得残留物。或者将带有寡核苷酸的Frits柱从合成仪中取出，用200 μL 90%乙腈溶液冲洗1次，离心抽干，放入气相氨解仪内，95℃氨解2 h，氨解结束后降温至60℃以下，取出降至25℃，用200 μL纯化水洗涤1次，溶液低温浓缩得残留物。

4）纯化

将脱保护后的粗品残留物用纯化水溶解上样，并进行HPLC纯化，收集产物峰并用酶标仪测含量，将溶液冻干并进行HPLC和MS检测，得到在3’端GalNAc缀合的siRNA的正义链，其中：

得到正义链（D51-DV26P-G103m1-SS）约13.4 OD，收率73.2%，纯度为98.1%，MS：8541.5 Da。

得到正义链（D51-DV26P-G10-SS）约13.0 OD，收率70.9 %，纯度为98.0%，MS：8682.8 Da。

得到正义链（D5-DV26P-G103m1-SS）约13.1 OD，收率71.8%，纯度为98.3%，MS：8428.3 Da。

得到正义链（D5-DV26P-G302-SS）约13.9 OD，收率75.8 %，纯度为98.3%，MS：8644.4 Da。

实验结果：

本实验中所用GalNAc化合物与固相载体的偶联物G3，是在实施例2中，将三触角的N-乙酰半乳糖胺修饰的尿嘧啶核苷酸（2’位）YK-GAL-102与固相载体偶联得到。通过固相合成方法，得到了3’端GalNAc修饰的寡核苷酸，在两个不同的正义链序列中，收率均超过70%，纯度均超过98.0%。使用实施例2中根据现有技术合成的固相载体或GalNAc亚磷酰胺单体也得到了相近的合成效果。按此方法获得了4种3’端位置偶联GalNAc的siRNA正义链，与相应反义链配对后形成的siRNA如表1所示。

3．5’端GalNAc修饰的寡核苷酸的固相合成（本发明方法）

制备5’端GalNAc缀合的siRNA的正义链

使用通用CPG固相载体，将实施例1中合成的GalNAc亚磷酰胺化合物（YK-GAL-101或YK-GAL-103）替换最后一个单体进行固相合成，得到5’端GalNAc缀合的siRNA的正义链，分别编号如下：

正义链（D51-DV26P-G101-SS）：

5’-U_L1s-Gms-Gm-Am-Gm-Gm-Cf-Um-Uf-Af-Gf-Cm-Um-Um-Um-Cm-Uf-Gm-Gm-Am-Um-3’

正义链（D51-DV26P-G103m21-SS）：

5’-U_L2s-Gms-Gm-Am-Gm-Gm-Cf-Um-Uf-Af-Gf-Cm-Um-Um-Um-Cm-Uf-Gm-Gm-Am-Um-3’

U_L1表示三触角的N-乙酰半乳糖胺修饰的脱氧尿嘧啶核苷酸（与核糖环5’位相连）

U_L2表示三触角的N-乙酰半乳糖胺修饰的尿嘧啶核苷酸（与核糖环2’位相连）

具体操作如下所述：

1）试剂和单体准备

取100 nmol规格的通用Frits柱，商业化通用的2’-OMe核苷单体（Am, Gm, Cm,Um），2’-F核苷单体（Af, Gf, Cf, Uf），5'-(E)-VP单体和GalNAc亚磷酰胺单体（YK-GAL-101，YK-GAL-103，实施例1中合成）溶于超干无水乙腈制备成浓度约0.1-0.2 M的溶液，并加入3A分子筛。以5-乙硫基四氮唑（5-ETT）的乙腈溶液为活化剂（0.25 M），0.05 M碘的吡啶/水/THF溶液为氧化剂，氢化黄原素（ADTT）的吡啶溶液为硫代试剂（0.2 M），3%三氯乙酸（TCA）二氯甲烷溶液为脱保护剂，乙酸酐/THF为CAP A试剂，吡啶/N-甲基咪唑/THF为CAP B试剂，并装入192 P型号DNA/RNA自动合成仪中指定的试剂位置中。

2）粗品合成

输入指定的寡核苷酸序列，并设定好合成程序，检查无误后，开始循环寡核苷酸的合成，偶联阶段通用2’-OMe核苷单体，2’-F核苷单体和5’-(E)-VP单体偶合时间2-3 min，涉及GalNAc亚磷酰胺单体的偶合时间25 min（抽液配制循环5次），GalNAc亚磷酰胺单体使用量为25倍摩尔比例；氧代时间约30-45秒；硫代时间约2 min；脱保护时间约30-45秒；盖帽时间约30-45秒。循环结束后，完成寡核苷酸的固相合成。

3）脱保护

合成结束后，需要将寡核苷酸从Frits柱上脱离和单体上的保护基脱离，因此需要将带有寡核苷酸的Frits柱转移到玻璃杯中，加入200 mL乙醇氨水溶液（乙醇：浓氨水 = 2:5），55℃保温24h，保温结束后冷却至25℃，过滤并用适量纯化水洗涤残留Frits柱，溶液低温浓缩至残留物。或者将带有寡核苷酸的Frits柱从合成仪中取出，用200 μL 90%乙腈溶液冲洗1次，离心抽干，放入气相氨解仪内，95℃氨解2 h，氨解结束后降温至60℃以下，取出降至25℃，用200 μL纯化水洗涤1次，溶液低温浓缩至残留物。

4）纯化

将脱保护后的粗品残留物用纯化水溶解上样，并进行HPLC纯化，收集产物峰并用酶标仪测含量，将溶液冻干并进行HPLC和MS检测，得到在5’端GalNAc缀合的siRNA的正义链，其中：

得到正义链（D51-DV26P-G101-SS）约13.7 OD，收率75.0%，纯度为98.3%，MS：8525.5 Da。

得到正义链（D51-DV26P-G103m21-SS）约13.4 OD，收率73.9%，纯度为98.8%，MS：8541.4 Da。

按此方法获得了2种5’端位置偶联GalNAc的siRNA正义链，与相应反义链配对后形成的siRNA如表1所示。

由本发明化合物制备的GalNAc修饰的寡核苷酸收率及纯度见表1。

表1

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备注：表1中siRNA的反义链序列，序号1~6均为5’-AmEVPs-Ufs-Cf-Cf-Am-Gf-Am-Am-Am-Gm-Cm-Um-Am-Af-Gm-Cf-Cm-Um-Cm-Cm-Ams-Ums-Um-3’ ，序号7-10均为5’-AmsEVP-Ufs-Gf-Gf-Am-Af-Gm-Am-Cm-Am-Um-Gm-Cm-Af-Gm-Gf-Am-Um-Cm-Um-Ums-Gms-Gm-3’。

正义链序列中U_L1表示三触角的N-乙酰半乳糖胺修饰的脱氧尿嘧啶核苷酸（与核糖环5’位相连）；UL2表示三触角的N-乙酰半乳糖胺修饰的尿嘧啶核苷酸（与核糖环2’位相连）；UL3表示三触角的N-乙酰半乳糖胺修饰的5-甲基尿嘧啶核苷酸（与核糖环2’位相连）；G302表示G302左侧的核苷酸用三触角的N-乙酰半乳糖胺YK-GAL-302修饰（与核糖环3’位相连）。

从表1中可以看出，由本发明化合物可以制备缀合到寡核苷酸3’端、5’端及中间任意位置，收率均可达到70%以上，纯度均可达到98%以上。

4.对比例

进行5’端GalNAc修饰的寡核苷酸的固相合成（现有技术方法）

本对比例中使用与实施例3中相同的序列，即缀合的siRNA序列为编号为D51-DV26P和D5-DV26P的序列，其中D51-DV26P序列如下：

正义链（D51-DV26P-SS）：

5’-Ums-Gms-Gm-Am-Gm-Gm-Cf-Um-Uf-Af-Gf-Cm-Um-Um-Um-Cm-Uf-Gm-Gm-Am-Um-3’

反义链（D51-DV26P-AS）：

5’-AmEVPs-Ufs-Cf-Cf-Am-Gf-Am-Am-Am-Gm-Cm-Um-Am-Af-Gm-Cf-Cm-Um-Cm-Cm-Ams-Ums-Um-3’

其中，A、U、C、G代表核苷酸的碱基组成；m代表m左侧相邻的核苷酸为2’-OMe修饰；f代表f左侧相邻的核苷酸为2’-F修饰；s代表s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。EVP代表EVP左侧相邻的核苷酸为5'-(E)-VP修饰。

本对比例采用现有技术固相方法合成5’端GalNAc修饰的寡核苷酸，方法参照ISIS制药公司所用固相合成方法（Nucleic Acids Res. 2014, 13(42), 8796−8807）。使用通用CPG固相载体，将实施例1中合成的GalNAc亚磷酰胺化合物（YK-GAL-101或YK-GAL-103）替换最后一个单体进行固相合成，制备5’端GalNAc缀合的siRNA的正义链，分别编号如下：

正义链（D51-DV26P-G101-SS）：

5’-U_L1s-Gms-Gm-Am-Gm-Gm-Cf-Um-Uf-Af-Gf-Cm-Um-Um-Um-Cm-Uf-Gm-Gm-Am-Um-3’

正义链（D51-DV26P-G103m21-SS）：

5’-U_L2s-Gms-Gm-Am-Gm-Gm-Cf-Um-Uf-Af-Gf-Cm-Um-Um-Um-Cm-Uf-Gm-Gm-Am-Um-3’

U_L1表示三触角的N-乙酰半乳糖胺修饰的脱氧尿嘧啶核苷酸（与核糖环5’位相连）

U_L2表示三触角的N-乙酰半乳糖胺修饰的尿嘧啶核苷酸（与核糖环2’位相连）

具体操作如下：

1）试剂和单体准备

取100 nmol规格的通用Frits柱，商业化通用的2’-OMe核苷单体（Am, Gm, Cm,Um），2’-F核苷单体（Af, Gf, Cf, Uf），5'-(E)-VP单体和GalNAc亚磷酰胺单体（YK-GAL-101，YK-GAL-103实施例1中合成）溶于超干无水乙腈制备成浓度约0.1-0.2 M的溶液，并加入3A分子筛。以5-乙硫基四氮唑（5-ETT）的乙腈溶液为活化剂（0.25 M），0.05 M碘的吡啶/水/THF溶液为氧化剂，氢化黄原素（ADTT）的吡啶溶液为硫代试剂（0.2 M），3%三氯乙酸（TCA）二氯甲烷溶液为脱保护剂，乙酸酐/THF为CAP A试剂，吡啶/N-甲基咪唑/THF为CAP B试剂，并装入192 P型号DNA/RNA自动合成仪中指定的试剂位置中。

2）粗品合成

输入指定的寡核苷酸序列，并设定好合成程序，检查无误后，开始循环寡核苷酸的合成，偶联阶段通用2’-OMe核苷单体，2’-F核苷单体和5’-(E)-VP单体偶合时间3 min，涉及GalNAc亚磷酰胺单体的偶合时间12 min（抽液配制循环2次），GalNAc亚磷酰胺单体使用量为4倍摩尔比例；氧代时间约30-45秒；硫代时间约2 min；脱保护时间约30-45秒；盖帽时间约30-45秒。循环结束后，完成寡核苷酸的固相合成。

3）脱保护

合成结束后，需要将寡核苷酸从Frits柱上脱离和单体上的保护基脱离，因此需要将带有寡核苷酸的Frits柱转移到玻璃杯中，加入200 mL浓氨水，55℃保温12 h，保温结束后冷却至25℃，过滤并用适量纯化水洗涤残留Frits柱，溶液低温浓缩至残留物。对粗品进行MS检测，无目标分子量。

实验结果：

采用现有技术固相方法合成5’端GalNAc修饰的寡核苷酸，对粗品进行MS检测，结果显示无目标分子量。这表明按照现有技术常规方法，无法将修饰后的GalNAc亚磷酰胺单体化合物YK-GAL-101和YK-GAL-103直接连接到寡核苷酸的5’端。其原因是三触角的GalNAc亚磷酰胺单体化合物，具有较大的空间位阻，导致在偶联过程中，活化的3′端与上一个亚磷酰胺核苷的游离5′-羟基无法接近，因此不能缩合。

本发明实施例3中实验3，通过对现有技术方法的改进，通过固相方法能够将GalNAc亚磷酰胺单体化合物与寡核苷酸5’端连接。与现有技术相比，本发明有以下改进：

1）增加GalNAc亚磷酰胺单体使用量。对比例中采用现有技术常规方法，单体使用量为4倍摩尔比例，无法反应。本发明通过对实验条件的优化，最终确定的三触角的GalNAc亚磷酰胺单体化合物使用量为25倍摩尔比例，通过增加反应物的浓度，能够克服其反应壁垒，使反应顺利发生；

2）涉及GalNAc亚磷酰胺单体偶联时间的延长。对比例中涉及GalNAc亚磷酰胺单体的偶合时间12 min，本发明方法为25 min。通过对偶联时间进行延长，使GalNAc亚磷酰胺单体化合物之间有充分的接触时间，从而使反应可以发生；

3）增加涉及GalNAc亚磷酰胺单体偶联抽液配制的间隔次数。对比例中抽液配制采用常规方法循环2次，本发明中涉及GalNAc亚磷酰胺单体偶联时，抽液配制循环5次，通过增加抽液配制的次数，能够使GalNAc亚磷酰胺单体偶联实现少量多次的反应效果，该方式能够最大程度的减少副产物对偶联的影响，从而实现寡核苷酸的5’端偶联。

本发明通过对GalNAc亚磷酰胺单体使用量、GalNAc亚磷酰胺单体偶联时间和抽液配制循环这3个反应条件的优化，使5’端GalNAc修饰的寡核苷酸能够完全通过固相方法进行合成。相比于现有技术，例如US20150126718A1（第383-388页，实施例39）中用液相方法将GalNAc修饰的配体连接到寡核苷酸5’端的方法，减少了反应步骤，缩短了反应时间，并且实验后处理更加简单。

实施例4

本实施例考察GalNAc缀合siRNA对小鼠血清和肝脏中PCSK9基因的抑制作用及对小鼠血清LDL-C水平的影响。

将表1中的siRNA-GalNAc缀合物对小鼠血清及肝脏中PCSK9基因的抑制率及对LDL-C水平影响进行考察。所考察的siRNA-GalNAc缀合物进入血液后，通过GalNAc与肝细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）进行结合，从而进入肝细胞内。siRNA-GalNAc缀合物进入肝细胞后，与RNA诱导沉默复合体（RISC）结合，并在反义链的介导下与编码PCSK9蛋白的mRNA结合，会抑制PCSK9蛋白的产生。肝脏中PCSK9蛋白的减少促进LDL-R的循环，增加肝细胞表面LDL-R受体数量，进一步能够降低血浆LDL-C水平。因此递送至肝脏的siRNA-GalNAc缀合物越多，即GalNAc递送效率越高，则肝脏中和血清中PCSK9蛋白量越低，肝脏中LDL-C的水平也越低。

实验结果表明，与现有技术GalNAc寡核苷酸缀合物相比，小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率、肝脏中PCSK9 mRNA抑制率和LDL-C降低水平均显著提升。例如，与 D51-DV26P-G10相比，D51-DV26P-G101对小鼠血清中PCSK9蛋白抑制率可提高22.3%，对肝脏中PCSK9mRNA抑制率可提高23.4%，LDL-C降低水平可提高14.2%。

实验内容

1.动物准备

首先将hPCSK9转基因小鼠（等级SPF，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司）适应性饲养后，按血清PSCK9蛋白含量随机分为阴性对照组（不给药）、siRNA受试药组，每组5只，均为雄性。

2.给药方式及给药剂量

通过皮下单次注射给药，给药剂量为6 mg/kg，给药体积为1 mL/kg，给药浓度为6mg/mL，给药当天记为第0天。

3.实验过程

（1）血清中PCSK9蛋白和LDL-C水平的检测

实验动物给药前（D0）、给药后7天（D7）和给药后14天（D14），眼眶静脉丛取血约200μL（不抗凝）。全血样品离心前冰盒中暂存，于4℃条件下4000 r/min离心10 min分离血清，采用 ELISA kit（Sino Biological公司）检测血清中PCSK9蛋白水平，并对血清LDL-C的水平进行检测。

（2）小鼠肝脏中PCSK9 mRNA的检测

实验动物给药后第14天（D14）将试验动物麻醉处死后进行灌流，收集肝脏。

按组织重量：RNA裂解液（trizol，Ambion公司）=100 mg：1 mL，快速放入准备好盛有1 mL RNA裂解液（trizol）的1.5 mL无RNA酶的塑料离心管（EP管）中，向管中加入3颗3 mm钢珠（经无RNA处理），放入组织匀浆仪中，50 Hz运行30秒，间停10秒，运行3次，可以制备成组织匀浆。

4℃，12,000 × g离心3 min，将400 μL匀浆上清转移至1.5 mL无RNA酶的塑料离心管（EP管）中，置于冰上。每管加入80 μL氯仿，剧烈振荡15秒，25℃静置5 min。4℃，12,000× g离心15 min，取上清150 μL至新塑料离心管（EP管）中。

加入等体积异丙醇，将管中液体上下颠倒轻轻混匀，-20 ℃静置10 min，4℃，12,000 × g离心15 min，弃上清。

加入1 mL 75%乙醇，轻轻洗涤RNA沉淀，4℃，7,500 × g离心5 min，吸去上清。重复漂洗一次，4℃，7,500 × g离心5 min，用微量枪头将残留乙醇去除干净。

25℃晾干残留乙醇10 min，加入150 μL RNase-free ddH₂O，溶解。使用微量紫外分光光度计对RNA浓度进行检测。通过qPCR检测PCSK9基因表达情况。

4.实验结果

阴性对照组和各受试药组给药后7天和给药后14天对血清中PCSK9蛋白抑制率如表2和表3，图1和图2所示，对血清LDL-C水平检测结果如表6和表7所示。利用GraphPadPrism 9软件进行数据统计及分析。对肝脏中PCSK9 mRNA抑制率的计算，通过对qPCR结果（Mean±SD）统计，利用GraphPad Prism 9软件进行绘图及数据分析，具体结果见表4和表5。

结果显示，与现有技术GalNAc寡核苷酸缀合物相比，小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率、肝脏中PCSK9 mRNA抑制率和LDL-C降低水平均显著提升。例如，与D51-DV26P-G10相比，D51-DV26P-G101对血清中PCSK9蛋白抑制率，第7天提高了22.3%，第14天提高了21.0%；对小鼠肝脏中PCSK9 mRNA抑制率提高了23.4%；LDL-C降低水平第7天提高了14.2%，14天提高了13.4%。与 D5-DV26P-G302相比，D5-DV26P-G103m8对血清中PCSK9蛋白抑制率，第7天提高了27.0%，第14天提高了24.0%；对小鼠肝脏中PCSK9 mRNA抑制率提高了23.4%；LDL-C降低水平第7天提高了17.2%，14天提高了15.4%。

（1）本发明GalNAc化合物，缀合到siRNA正义链5’端，及缀合到siRNA中间位置，相比于现有技术缀合到3’端（点位1），递送效率和对靶标蛋白表达的抑制率均显著提升。例如，对小鼠血清中PCSK9蛋白抑制率，D51-DV26P-G101比D51-DV26P-G10提高22.3%，D5-DV26P-G103m8比D5-DV26P-G302提高27.0%。

表2小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率-1

表3 小鼠血清中PCSK9蛋白表达抑制率-2

I. 本发明GalNAc化合物，例如YK-GAL-101，缀合到siRNA正义链5’端（点位21），相比于现有技术缀合到3’端（点位1），递送效率和对靶标蛋白表达的抑制率均显著提升。例如，D51-DV26P-G101对小鼠血清中PCSK9蛋白抑制率，比D51-DV26P-G10可提高22.3%。

从表2可以看出，本发明GalNAc化合物YK-GAL-101缀合到siRNA正义链5’端（点位21），得到的GalNAc缀合siRNA（D51-DV26P-G101），对hPCSK9小鼠血清中PCSK9蛋白抑制率最高，在第7天和第14天抑制率分别达到了82.4%和84.6%（见图1）。

D51-DV26P-G10由是现有技术GalNAc化合物GAL-10缀合到siRNA正义链3’端（点位1）的GalNAc-siRNA缀合物，D51-DV26P-G101与D51-DV26P-G10相比，对hPCSK9小鼠血清中PCSK9蛋白抑制效率显著提升，第7天和第14天抑制率分别提高了22.3%和21.0%。

D51-DV26P-G103m1是由YK-GAL-103缀合到siRNA正义链3’端（点位1）的GalNAc-siRNA缀合物，D51-DV26P-G101与D51-DV26P-G103m1相比，对hPCSK9小鼠血清中PCSK9蛋白抑制效率也显著提升，第7天和第14天抑制率分别提高了11.7%和11.5%。

此结果表明，由本发明GalNAc化合物YK-GAL-101缀合到siRNA正义链的5’端(点位21)，得到的GalNAc缀合siRNA，与现有技术3’端(点位1)缀合GalNAc的siRNA相比，将siRNA递送至肝脏的效率，以及对靶标蛋白表达的抑制率，均显著提升。

II. 本发明GalNAc化合物，例如YK-GAL-103，缀合到siRNA中间位置，相比于现有技术缀合到3’端（点位1），递送效率和对靶标蛋白表达的抑制率均显著提升。例如，D5-DV26P-G103m8的抑制率比D5-DV26P-G302可提高27.0%（见图2）。

从表2和表3可以看出，本发明的GalNAc化合物YK-GAL-103，缀合到siRNA的中间点位，得到的GalNAc缀合siRNA，与现有技术将GalNAc化合物缀合到siRNA正义链3’端（点位1）得到的GalNAc缀合siRNA相比，对hPCSK9小鼠血清中PCSK9蛋白抑制效率显著提升。

例如，D51-DV26P-G103m7是YK-GAL-103缀合到siRNA正义链的中间点位7，与GalNAc化合物缀合到3’端(点位1)的D51-DV26P-G10和D51-DV26P-G103m1相比，对hPCSK9小鼠血清中PCSK9蛋白抑制效率显著提升，D51-DV26P-G103m7在第7天分别提高了20.1%和9.5%，在第14天分别提高了19.1%和9.6%。

D5-DV26P-G103m8是YK-GAL-103缀合到siRNA正义链的中间点位8，与GalNAc化合物缀合到3’端(点位1)的D5-DV26P-G302和D5-DV26P-G103m1相比，D5-DV26P-G103m8在第7天分别提高了27.0%和9.7%，在第14天分别提高了24.0%和8.6%。

此结果表明，本发明GalNAc化合物能够缀合到siRNA的中间位点，由此得到的GalNAc缀合siRNA，与现有技术GalNAc缀合到3’端（点位1）的 GalNAc缀合siRNA相比，将siRNA递送至肝脏的效率，和对靶标蛋白表达的抑制率，均显著提升。

III. 具有不同序列，但修饰方式相同的siRNA，与本发明GalNAc化合物YK-GAL-103缀合，在siRNA序列中间不同的点位缀合对PCSK9蛋白抑制效率提升存在一定差异，但均比现有技术GalNAc缀合到3’端（点位1）的 GalNAc缀合siRNA抑制率显著提高。

从表2和表3可以看出，对不同序列的siRNA用同样的修饰模板进行修饰，再使用本发明的GalNAc化合物YK-GAL-103与模板修饰siRNA的中间点位缀合，不同的缀合位点对hPCSK9小鼠血清中PCSK9蛋白抑制效率提升存在一定差异，但均比现有技术GalNAc缀合到3’端（点位1）的 GalNAc缀合siRNA抑制率显著提高。

D5-DV26P和D51-DV26P（具体序列见实施例3）序列不同，但修饰方式相同，在YK-GAL-103与D5-DV26P和D51-DV26P不同位点缀合的GalNAc-SiRNA缀合物中，不同的缀合位点对小鼠血清中PCSK9蛋白抑制效率提升作用存在一定的差异。

例如，在YK-GAL-103与D51-DV26P的不同中间位点缀合物中，缀合到点位7的D51-DV26P-G103m7抑制率最高，在第7天和第14天抑制率分别为80.2%和82.7%，比D51-DV26P-G10分别提高了20.1%和19.1%，显著提升；缀合到点位8的D51-DV26P-G103m8在第7天和第14天抑制率分别为76.5%和80.3%，比D51-DV26P-G10分别提高了16.4%和16.7%，显著提升。

在YK-GAL-103与D5-DV26P的不同中间位点缀合物中，缀合到点位8的D5-DV26P-G103m8抑制率最高，在第7天和第14天抑制率分别为78.6%和81.3%，比D5-DV26P-G10分别提高了27.0%和24.0%，显著提升。

此结果表明，本发明的GalNAc化合物YK-GAL-103与不同序列的siRNA缀合，在序列中间不同的缀合点位对生物活性的影响存在一定的差异，但与现有技术GalNAc缀合到3’端（点位1）的 GalNAc缀合siRNA相比，对小鼠血清中PCSK9蛋白抑制效率均显著提升。通过与siRNA缀合点位的灵活调整，对于调控siRNA-GalNAc缀合物的生物活性，寻找最佳缀合点位具有重要作用。

（2）本发明GalNAc化合物，缀合到siRNA正义链5’端，及缀合到siRNA中间位置，相比于现有技术缀合到3’端（点位1），递送效率和对靶标mRNA的抑制率均显著提升。例如，对小鼠肝脏中PCSK9 mRNA抑制率，D51-DV26P-G101比D51-DV26P-G10提高23.4%，D5-DV26P-G103m8比D5-DV26P-G302提高23.4%。

表4 小鼠肝脏中PCSK9 mRNA表达抑制率-1

表5 小鼠肝脏中PCSK9 mRNA表达抑制率-2

I. 本发明GalNAc化合物，例如YK-GAL-101，缀合到siRNA正义链5’端（点位21），相比于现有技术缀合到3’端（点位1），递送效率和对靶标mRNA的抑制率均显著提升。例如，D51-DV26P-G101对小鼠肝脏中PCSK9 mRNA抑制率，比D51-DV26P-G10提高23.4%。

从表4可以看出，本发明GalNAc化合物YK-GAL-101缀合到siRNA正义链5’端（点位21），得到的GalNAc缀合siRNA（D51-DV26P-G101），对hPCSK9小鼠肝脏中PCSK9具有非常显著的抑制作用，抑制率达到了80.3%（见图3）。

与由现有技术GalNAc化合物GAL-10缀合到siRNA正义链3’端（点位1）得到的GalNAc缀合siRNA（D51-DV26P-G10）相比，D51-DV26P-G101对hPCSK9小鼠肝脏中PCSK9蛋白抑制效率提高了23.4%，显著提升。

与由YK-GAL-103缀合到siRNA正义链3’端（点位1）得到的GalNAc缀合siRNA（D51-DV26P-G103m1）相比，D51-DV26P-G101对hPCSK9小鼠肝脏中PCSK9蛋白抑制效率提高了9.6%，显著提升。

此结果表明，由本发明GalNAc化合物YK-GAL-101缀合到siRNA正义链的5’端(点位21)，得到的GalNAc缀合siRNA，与现有技术3’端(点位1)缀合GalNAc的siRNA相比，将siRNA递送至肝脏的效率，以及对靶标mRNA的抑制率，均显著提升。

II. 本发明GalNAc化合物，例如YK-GAL-103，缀合到siRNA中间位置，相比于现有技术缀合到3’端（点位1），递送效率和对靶标mRNA的抑制率均显著提升。例如，D5-DV26P-G103m8对小鼠肝脏中PCSK9 mRNA抑制率，比D5-DV26P-G302提高23.4%（见图4）。

从表4和表5可以看出，本发明的GalNAc化合物YK-GAL-103，缀合到siRNA的中间点位，得到的GalNAc缀合siRNA，与现有技术将GalNAc化合物缀合到siRNA正义链3’端（点位1）得到的GalNAc缀合siRNA相比，对hPCSK9小鼠肝脏中PCSK9 mRNA的抑制效率显著提升。

例如，D51-DV26P-G103m7是YK-GAL-103缀合到siRNA正义链的中间点位7，与GalNAc化合物(GAL-10或YK-GAL-103)缀合到3’端(点位1)的D51-DV26P-G10和D51-DV26P-G103m1相比，D51-DV26P-G103m7对hPCSK9小鼠肝脏中PCSK9 mRNA抑制效率分别提高了20.0%和6.2%，显著提升。

D5-DV26P-G103m8是YK-GAL-103缀合到siRNA正义链的中间点位8，与GalNAc化合物(YK-GAL-302或YK-GAL-103)缀合到3’端(点位1)的D5-DV26P-G302和D5-DV26P-G103m1相比，D5-DV26P-G103m8对hPCSK9小鼠肝脏中PCSK9 mRNA抑制效率提高了23.4%和10.1%，显著提升。

此结果表明，本发明GalNAc化合物能够缀合到siRNA的中间位点，由此得到的GalNAc缀合siRNA，与现有技术GalNAc缀合到3’端（点位1）的 GalNAc缀合siRNA相比，将siRNA递送至肝脏的效率，和对靶标mRNA表达的抑制率，均显著提升。

III. 具有不同序列，但修饰方式相同的siRNA，与本发明GalNAc化合物YK-GAL-103缀合，在siRNA序列中间不同的点位缀合对PCSK9 mRNA抑制效率提升存在一定差异，但均比现有技术GalNAc缀合到3’端（点位1）的 GalNAc缀合siRNA抑制率显著提高。

从表4和表5可以看出，对不同序列的siRNA用同样的修饰模板进行修饰，再使用本发明的GalNAc化合物YK-GAL-103与模板修饰siRNA的中间点位缀合，不同的缀合位点对hPCSK9小鼠肝脏中PCSK9 mRNA抑制效率提升存在一定差异，但均比现有技术GalNAc缀合到3’端（点位1）的 GalNAc缀合siRNA抑制率显著提高。

D5-DV26P和D51-DV26P（具体序列见实施例3）序列不同，但修饰方式相同，在YK-GAL-103与D5-DV26P和D51-DV26P不同位点缀合的GalNAc-SiRNA缀合物中，不同的缀合位点对小鼠肝脏中PCSK9 mRNA抑制效率提升作用存在一定的差异。

例如，在YK-GAL-103与D51-DV26P的不同中间位点缀合物中，缀合到点位7的D51-DV26P-G103m7对PCSK9 mRNA的抑制率最高，达到了76.9%，比D51-DV26P-G10提高了20.0%，显著提升；缀合到点位8的D51-DV26P-G103m8抑制率达到了73.5，比D51-DV26P-G10提高了16.6%，显著提升。

在YK-GAL-103与D5-DV26P的不同中间位点缀合物中，缀合到点位8的D5-DV26P-G103m8抑制率最高，达到了73.2%，比D5-DV26P-G10提高了23.4%，显著提升。

此结果表明，本发明的GalNAc化合物YK-GAL-103与不同序列的siRNA缀合，在序列中间不同的缀合点位对生物活性的影响存在一定的差异，但与现有技术GalNAc缀合到3’端（点位1）的 GalNAc缀合siRNA相比，对小鼠肝脏中PCSK9 mRNA的抑制效率均显著提升。通过与siRNA缀合点位的灵活调整，对于调控siRNA-GalNAc缀合物的生物活性，寻找最佳缀合点位具有重要作用。

（3）本发明GalNAc化合物，缀合到siRNA正义链5’端，及缀合到siRNA中间位置，相比于现有技术缀合到3’端（点位1），递送效率和小鼠血清中LDL-C降低水平显著提升。例如D5-DV26P-G103m8组小鼠血清中LDL-C的降低水平，可比D5-DV26P-G302组提高17.2%。

表6 各实验组血清中LDL-C降低水平-1（见图5）

表7 各实验组血清中LDL-C降低水平-2（见图6）

I. 本发明GalNAc化合物，例如YK-GAL-101，缀合到siRNA正义链5’端（点位21），相比于现有技术缀合到3’端（点位1），递送效率和对hPCSK9小鼠血清中LDL-C降低水平均显著提升。例如，D51-DV26P-G101组小鼠血清中LDL-C降低水平，比D51-DV26P-G10组提高14.2%。

从表6可以看出，本发明GalNAc化合物YK-GAL-101缀合到siRNA正义链5’端（点位21），得到的GalNAc缀合siRNA（D51-DV26P-G101），与由现有技术GalNAc化合物GAL-10缀合到siRNA正义链3’端（点位1）得到的GalNAc缀合siRNA（D51-DV26P-G10）相比，hPCSK9小鼠血清中LDL-C降低水平显著提升，第7天和第14天抑制率分别提高了14.2%和13.4%(见图5)。

此结果表明，由本发明GalNAc化合物YK-GAL-101缀合到siRNA正义链的5’端(点位21)，得到的GalNAc缀合siRNA，与现有技术3’端(点位1)缀合GalNAc的siRNA相比，小鼠血清中LDL-C的降低水平显著提升。

II. 本发明GalNAc化合物，例如YK-GAL-103，缀合到siRNA中间位置，相比于现有技术缀合到3’端（点位1），小鼠血清中LDL-C降低水平显著提升。例如，D5-DV26P-G103m8的降低水平比D5-DV26P-G302可提高17.2%。

从表6和表7可以看出，本发明的GalNAc化合物YK-GAL-103，缀合到siRNA的中间点位，得到的GalNAc缀合siRNA，与现有技术将GalNAc化合物缀合到siRNA正义链3’端（点位1）得到的GalNAc缀合siRNA相比，小鼠血清中LDL-C降低水平显著提升。

例如，D51-DV26P-G103m7是YK-GAL-103缀合到siRNA正义链的中间点位7，与GalNAc化合物(GAL-10或YK-GAL-103)缀合到3’端(点位1)的D51-DV26P-G10和D51-DV26P-G103m1相比，D51-DV26P-G103m7组hPCSK9小鼠血清中LDL-C降低水平，在第7天分别提高了12.9%和5.6%，在第14天分别提高了12.3%和5.6%，显著提升。

D5-DV26P-G103m8是YK-GAL-103缀合到siRNA正义链的中间点位8，与GalNAc化合物(YK-GAL-302或YK-GAL-103)缀合到3’端(点位1)的D5-DV26P-G302和D5-DV26P-G103m1相比，D5-DV26P-G103m8组hPCSK9小鼠血清中LDL-C降低水平，在第7天分别提高了17.2%和5.9%，在第14天分别提高了15.4%和5.3%，显著提升。

此结果表明，本发明GalNAc化合物能够缀合到siRNA的中间位点，由此得到的GalNAc缀合siRNA，与现有技术GalNAc缀合到3’端（点位1）的 GalNAc缀合siRNA相比，对小鼠血清中LDL-C的降低水平显著提升。

III. 具有不同序列，但修饰方式相同的siRNA，与本发明GalNAc化合物YK-GAL-103缀合，在siRNA序列中间不同的点位缀合对小鼠血清中LDL-C的降低水平存在一定差异，但均比现有技术GalNAc缀合到3’端（点位1）的 GalNAc缀合siRNA降低水平显著提高。

从表6和表7可以看出，对不同序列的siRNA用同样的修饰模板进行修饰，再使用本发明的GalNAc化合物YK-GAL-103与模板修饰siRNA的中间点位缀合，不同的缀合位点对hPCSK9小鼠血清中LDL-C降低水平存在一定差异，但均比现有技术GalNAc缀合到3’端（点位1）的 GalNAc缀合siRNA降低水平显著提高。

D5-DV26P和D51-DV26P（具体序列见实施例3）序列不同，但修饰方式相同，在YK-GAL-103与D5-DV26P和D51-DV26P不同位点缀合的GalNAc-SiRNA缀合物中，不同的缀合位点对小鼠血清中LDL-C降低水平存在一定的差异。

例如，在YK-GAL-103与D51-DV26P的不同中间位点缀合物中，缀合到点位7的D51-DV26P-G103m7降低水平最高，在第7天和第14天降低水平分别为38.2%和39.7%，比D51-DV26P-G10分别提高了12.9%和12.3%，显著提升；缀合到点位8的D51-DV26P-G103m8在第7天和第14天降低水平分别为36.1%和38.3%，比D51-DV26P-G10分别提高了10.8%和10.9%，显著提升。

在YK-GAL-103与D5-DV26P的不同中间位点缀合物中，缀合到点位8的D5-DV26P-G103m8降低水平最高，在第7天和第14天抑制率分别为37.5%和39.1%，比D5-DV26P-G10分别提高了17.2%和15.4%，显著提升。

此结果表明，本发明的GalNAc化合物YK-GAL-103与不同序列的siRNA缀合，在序列中间不同的缀合点位对生物活性的影响存在一定的差异，但与现有技术GalNAc缀合到3’端（点位1）的 GalNAc缀合siRNA相比，小鼠血清中LDL-C降低水平均显著提升。通过与siRNA缀合点位的灵活调整，对于调控siRNA-GalNAc缀合物的生物活性，寻找最佳缀合点位具有重要作用。

实施例5

本实施例进行不同GalNAc缀合的siRNA在动物肝脏中的药代动力学测试。

本实施例将表1中的siRNA-GalNAc缀合物在SD雄性大鼠中的药代动力学特征进行考察。所考察的siRNA-GalNAc缀合物进入血液后，通过GalNAc与肝细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）进行结合，从而进入肝细胞内。GalNAc-siRNA缀合物的稳定性越高，药物的半衰期就越长，药物在系统和肝脏（靶器官）中的暴露量会越高。

结果表明，本发明GalNAc化合物YK-GAL-101和YK-GAL-103制备的寡核苷酸缀合物与现有技术GalNAc相比，对药物肝脏中的半衰期、药峰浓度和药-时曲线下面积等指标均有显著提升。例如，与D51-DV26P-G10相比，D51-DV26P-G101 的半衰期增长了26.03%；药峰浓度提高了14.05%；药-时曲线下面积增加了20.26%。与D5-DV26P-G302相比, D5-DV26P-G103m8 的半衰期增长了21.43%；药峰浓度提高了8.82%；药-时曲线下面积增加了14.27%。

实验过程：

实验动物采用6-9周的SD雄性大鼠（购自集萃药康），每组30只大鼠。每组分别给予siRNA缀合物。大鼠称重后按照5 mg/kg剂量给药，皮下注射给药，给药浓度为1 mg/mL，给药体积为5 mL。取给药后6、24、72、168、336、504、672、1008和1344 h共9个时间点进行组织样品收集：将试验动物用二氧化碳处死后，取肝脏并用预冷的生理盐水冲洗后用滤纸擦干，称重后转移至贴有标签的管中，在冰冷条件下按照1: 9（1 g组织加入9 mL匀浆液）匀浆（匀浆液：100mM Tris，10mMEDTA，pH8.0），匀浆后的样品取约800 μL储存在-80℃中，之后用LC-MS/MS检测肝脏中药物浓度。

实验结果：半衰期、药峰浓度和药-时曲线下面积数据见表8和表9。

表8 半衰期、药峰浓度和药-时曲线下面积数据-1

表9 半衰期、药峰浓度和药-时曲线下面积数据-2

对6-9周的SD雄性大鼠肝脏组织检测结果表明，本发明GalNAc化合物YK-GAL-101和YK-GAL-103制备的寡核苷酸缀合物，与现有技术GalNAc相比，对药物肝脏中的半衰期、药峰浓度和药-时曲线下面积等指标均有显著提升。

例如，与D51-DV26P-G10相比，D51-DV26P-G101 的半衰期从73 h增长到92 h，增长了26.03%；药峰浓度从3601 ng/mL提高到4107 ng/mL，提高了14.05%；药-时曲线下面积从249317 h×ng/mL增加到299839 h×ng/mL，增加了20.26%。

与D5-DV26P-G302相比，D5-DV26P-G103m8 的半衰期从70 h增长到85 h，增长了21.43%；药峰浓度从3479 ng/mL提高到3786 ng/mL，提高了8.82%；药-时曲线下面积从239856 h×ng/mL增加到274100 h×ng/mL，增加了14.27%。

可以看出，无论是由本发明GalNAc化合物YK-GAL-101缀合到siRNA的5’端，还是YK-GAL-103缀合到siRNA的中间位点，与现有技术GalNAc化合物缀合到siRNA的3’端相比，在动物体内的半衰期、药峰浓度和药-时曲线下面积等指标均有显著提升，可显著提高药物的作用效果。

综合上述结果，相比现有技术，本发明具有如下优势：

1.本发明方法可以实现用固相合成方法制备GalNAc化合物任意位置修饰的寡核苷酸。

1）同现有技术相比，本发明的GalNAc配体与寡核苷酸缀合的位点不同，本发明可将GalNAc化合物连接到寡核苷酸序列的任意位置，而现有技术只是将GalNAc化合物连接到寡核苷酸的两端（3’或5’端）。

本发明通过对核苷酸中核糖环2’端进行改变，将GalNAc化合物与核糖环2’端进行连接，然后合成GalNAc亚磷酰胺单体化合物，再利用固相方法合成GalNAc修饰的寡核苷酸。此方法可以将一个或多个GalNAc化合物修饰寡核苷酸序列的任意位置，突破了现有技术只连接到寡核苷酸的两端（3’或5’端）的限制。

2）与现有技术相比，本发明方法能够通过固相合成方法，制备得到5’端GalNAc修饰的寡核苷酸。

本发明方法，通过对反应条件的优化，能够将GalNAc亚磷酰胺单体化合物，通过固相方法直接连接到寡核苷酸的5’端。相比于液相方法，本发明方法减少了反应步骤，缩短了反应时间，并且实验后处理更加简单，收率均可以达到70%以上，纯度均可达98%以上。

3）GalNAc配体化学结构不同，本发明将GalNAc配体制备成亚磷酰胺单体，然后通过固相合成将修饰的GalNAc配体直接连接到寡核苷酸序列上。现有技术是将修饰后的GalNAc配体通过一定方式的连接臂（如吡咯环）先连接到固相支持物上，然后通过固相合成与后处理实现GalNAc配体与寡核苷酸序列的连接（US20150119444A1, US20150119445A1），或将修饰后的GalNAc配体先合成酯（如PFP），然后通过液相合成与寡核苷酸序列连接（US20150126718A1）。

2.本发明GalNAc化合物，缀合到siRNA正义链5’端，及缀合到siRNA中间位置，相比于现有技术缀合到3’端，递送效率和对靶标蛋白表达的抑制率均显著提升。例如，对小鼠血清中PCSK9蛋白抑制率，D51-DV26P-G101比D51-DV26P-G10提高22.3%，D5-DV26P-G103m8比D5-DV26P-G302提高27.0%。

1）本发明GalNAc化合物，例如YK-GAL-101，缀合到siRNA正义链5’端（点位21），相比于现有技术缀合到3’端（点位1），递送效率和对靶标蛋白表达的抑制率均显著提升。例如，D51-DV26P-G101对小鼠血清中PCSK9蛋白抑制率，比D51-DV26P-G10可提高22.3%。

2）本发明GalNAc化合物，例如YK-GAL-103，缀合到siRNA中间位置，相比于现有技术缀合到3’端（点位1），递送效率和对靶标蛋白表达的抑制率均显著提升。例如，D5-DV26P-G103m8的抑制率比D5-DV26P-G302可提高27.0%。

3）具有不同序列，但修饰方式相同的siRNA，与本发明GalNAc化合物YK-GAL-103缀合，在siRNA序列中间不同的点位缀合对PCSK9蛋白抑制效率提升存在一定差异，但均比现有技术GalNAc缀合到3’端（点位1）的 GalNAc缀合siRNA抑制率显著提高。

3. 本发明GalNAc化合物，缀合到siRNA正义链5’端，及缀合到siRNA中间位置，相比于现有技术缀合到3’端（点位1），递送效率和对靶标mRNA的抑制率均显著提升。例如，对小鼠肝脏中PCSK9 mRNA抑制率，D51-DV26P-G101比D51-DV26P-G10提高23.4%，D5-DV26P-G103m8比D5-DV26P-G302提高23.4%。

1）本发明GalNAc化合物，例如YK-GAL-101，缀合到siRNA正义链5’端（点位21），相比于现有技术缀合到3’端（点位1），递送效率和对靶标mRNA的抑制率均显著提升。例如，D51-DV26P-G101对小鼠肝脏中PCSK9 mRNA抑制率，比D51-DV26P-G10可提高23.4%。

2）本发明GalNAc化合物，例如YK-GAL-103，缀合到siRNA中间位置，相比于现有技术缀合到3’端（点位1），递送效率和对靶标mRNA的抑制率均显著提升。例如，D5-DV26P-G103m8的抑制率比D5-DV26P-G302可提高23.4%。

3）具有不同序列，但修饰方式相同的siRNA，与本发明GalNAc化合物YK-GAL-103缀合，在siRNA序列中间不同的点位缀合对PCSK9 mRNA抑制效率提升存在一定差异，但均比现有技术GalNAc缀合到3’端（点位1）的 GalNAc缀合siRNA抑制率显著提高。

4.本发明GalNAc化合物，缀合到siRNA正义链5’端，及缀合到siRNA中间位置，相比于现有技术缀合到3’端（点位1），递送效率和小鼠血清中LDL-C降低水平均显著提升。例如D5-DV26P-G103m8组小鼠血清中LDL-C的降低水平，可比D5-DV26P-G302组提高17.2%。

1）本发明GalNAc化合物，例如YK-GAL-101，缀合到siRNA正义链5’端（点位21），相比于现有技术缀合到3’端（点位1），递送效率和对hPCSK9小鼠血清中LDL-C降低水平均显著提升。例如，D51-DV26P-G101组小鼠血清中LDL-C降低水平，比D51-DV26P-G10组可提高14.2%。

2）本发明GalNAc化合物，例如YK-GAL-103，缀合到siRNA中间位置，相比于现有技术缀合到3’端（点位1），对小鼠血清中LDL-C的降低水平显著提升。例如，D5-DV26P-G103m8组降低水平比D5-DV26P-G302组可提高17.2%。

3）具有不同序列，但修饰方式相同的siRNA，与本发明GalNAc化合物YK-GAL-103缀合，在siRNA序列中间不同的点位缀合对小鼠血清中LDL-C降低水平存在一定差异，但均比现有技术GalNAc缀合到3’端（点位1）的 GalNAc缀合siRNA降低水平显著提高。

5. 本发明GalNAc化合物YK-GAL-101和YK-GAL-103制备的寡核苷酸缀合物与现有技术GalNAc相比，对药物肝脏中的半衰期、药峰浓度和药-时曲线下面积等指标均有显著提升。

例如，与D51-DV26P-G10相比, D51-DV26P-G101的半衰期增长了26.03%；药峰浓度提高了14.05%；药-时曲线下面积增加了20.26%。与D5-DV26P-G302相比，D5-DV26P-G103m8的半衰期增长了21.43%；药峰浓度提高了8.82%；药-时曲线下面积增加了14.27%。

综上所述，本发明GalNAc化合物可通过固相方法合成在中间任意位置及3’端GalNAc修饰的寡核苷酸，并通过对固相合成条件的优化，使5’端GalNAc修饰的寡核苷酸能够通过固相方法进行合成。动物实验结果表明，相比于现有技术缀合到3’端（点位1），本发明缀合到5’端及中间任意位点的GalNAc缀合siRNA，对小鼠血清和肝脏中PCSK9基因的抑制作用、对小鼠血清LDL-C水平的影响，以及在动物体内的半衰期、药峰浓度和药-时曲线下面积，均显著提升。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (27)

1.一种GalNAc化合物，其特征在于，所述GalNAc化合物包括式I所示的化合物或其化学上可接受的盐；

式I

其中，

L₁为-HNC(O)-或-C(O)NH-；

L₂为-(CH₂)_n1-，其中n1为1-7的整数；

Z₁为O或C；

L₃为-(CH₂)_n2-，其中n2为1-4的整数；

Z₂为O或C；

n为0-10的整数；

L₄为-(CH₂)_n3-，其中n3为1-7的整数；

A的结构式为式II或式III，其中B为核苷酸的碱基部分，包括天然存在的核碱基和核碱基类似物；R₁为亚磷酰胺化合物或H；R₂为羟基保护基团；R₃为氢、烷氧基或卤素及其类似物；

式II />式III

G的结构式为式IV；

式IV；

其中，X₁为-(CH₂)_a-或-(CH₂CH₂O)_aCH₂-，a为1-5的整数；

X₂为-(CH₂)_b-，b为1-6的整数；

Y₁为0或1；

Y₂为0、1或2；

Y₃为1、2或3。

2.根据权利要求1所述的GalNAc化合物，其特征在于，所述L₁为-HNC(O)-。

3.根据权利要求1所述的GalNAc化合物，其特征在于，所述L₂为-(CH₂)₄-。

4.根据权利要求1所述的GalNAc化合物，其特征在于，所述Z₁为C。

5.根据权利要求1所述的GalNAc化合物，其特征在于，所述L₃为-(CH₂)₂-。

6.根据权利要求1所述的GalNAc化合物，其特征在于，所述Z₂为C。

7.根据权利要求1所述的GalNAc化合物，其特征在于，所述n为1。

8.根据权利要求1所述的GalNAc化合物，其特征在于，所述L₄为-(CH₂)₂-。

9.根据权利要求1所述的GalNAc化合物，其特征在于，所述亚磷酰胺化合物的结构式为式V；

式V。

10.根据权利要求1所述的GalNAc化合物，其特征在于，所述R₁为H。

11.根据权利要求1所述的GalNAc化合物，其特征在于，所述R₂为4, 4'-二甲氧基三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、三苯甲基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基或异丙基二甲基甲硅烷基中任意一种。

12.根据权利要求1所述的GalNAc化合物，其特征在于，所述A的结构式为式VI；

式VI。

13.根据权利要求1所述的GalNAc化合物，其特征在于，所述A的结构式为式VII；

式VII。

14.根据权利要求中1所述的GalNAc化合物，其特征在于，所述G的结构式为式VIII；

式VIII。

15.根据权利要求1所述的GalNAc化合物，其特征在于，所述GalNAc化合物的结构式如式IX、式X或式XI所示；

式IX

式X

式XI。

16.一种缀合物，其特征在于，所述缀合物由寡核苷酸和权利要求1-15任一项所述的GalNAc化合物缀合得到，结构式包括式XII所示结构；

式XII；

式XII中，Oligo代表寡核苷酸，其余部分代表GalNAc化合物部分，所述GalNAc化合物部分中的G、L₁、L₂、Z₁、L₃、Z₂、n和L₄同权利要求1，所述GalNAc化合物部分与所述寡核苷酸的5’端、中间位置或3’端缀合；

所述寡核苷酸包括非硫代寡核苷酸和/或硫代寡核苷酸。

17.根据权利要求16所述的缀合物，其特征在于，所述寡核苷酸包括小干扰核苷酸、DNA、微小RNA、小激活RNA、小向导RNA、转运RNA、反义核苷酸或适配体中任意一种或至少两种的组合。

18.一种权利要求16或17所述缀合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

将权利要求1-15任一项所述的GalNAc化合物与固相支持物偶联，得到偶联物；

利用所述偶联物为固相载体，采用化学固相合成法合成寡核苷酸，得到所述缀合物。

19.根据权利要求18所述的缀合物的制备方法，其特征在于，要制备GalNAc化合物与所述寡核苷酸的3’端缀合物，所述GalNAc化合物中R₁为H；

要制备GalNAc化合物与所述寡核苷酸的5’端缀合物，所述GalNAc化合物中A的结构式为式III；

要制备GalNAc化合物与所述寡核苷酸的中间位置缀合物，所述GalNAc化合物中A的结构式为式II。

20.根据权利要求18所述的缀合物的制备方法，其特征在于，所述化学固相合成法包括粗品合成、脱保护和纯化。

21.根据权利要求20所述的缀合物的制备方法，其特征在于，所述粗品合成中GalNAc化合物的偶合时间为15~25 min。

22.根据权利要求20所述的缀合物的制备方法，其特征在于，所述粗品合成中GalNAc化合物的抽液配制循环3~8次。

23.根据权利要求22所述的缀合物的制备方法，其特征在于，所述粗品合成中GalNAc化合物的抽液配制循环4~5次。

24.根据权利要求20所述的缀合物的制备方法，其特征在于，所述粗品合成中GalNAc化合物的用量相比固相支持物的载量为15~30倍摩尔比例。

25.根据权利要求24所述的缀合物的制备方法，其特征在于，所述粗品合成中GalNAc化合物的用量相比固相支持物的载量为18~25倍摩尔比例。

26.权利要求16或17所述的缀合物在制备药物中的应用。

27.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求16或17所述的缀合物以及药学上可接受的辅料。