CN105473611B - 人凝血因子轻链蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明通过体外抑菌活性检测了人凝血因子轻链蛋白抗不同革兰氏阴性菌的最低抑菌浓度，通过体内抑菌活性检测了人凝血因子轻链蛋白对革兰氏阴性菌的抑制作用，证明了人凝血因子轻链蛋白对革兰氏阴性菌具有明显的抑制作用，以便开发出一类治疗革兰氏阴性菌感染的新型药物。通过质谱及银染检测证明了人凝血因子轻链蛋白对内毒素的水解及清除作用，以便开发出一类治疗内毒素血症的新型药物。所述人凝血因子轻链蛋白为人凝血因子Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ轻链蛋白，以及与它们具有50％以上同源性的蛋白。

Description

人凝血因子轻链蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及人凝血因子轻链蛋白及其在制药中的应用。
背景技术
革兰氏阴性菌泛指在革兰氏染色反应中呈现红色的细菌。由于细胞壁结构的不同，在革兰氏染色过程中，不同的染料造成了其与革兰氏阳性菌着色的不同(阳性菌为紫色)。革兰氏阴性菌以大肠杆菌为代表，还有变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌、布氏杆菌、流感(嗜血)杆菌、副流感(嗜血)杆菌、卡他(摩拉)菌、不动杆菌属等等。该类细菌的致病能力往往与其细胞壁的特殊组分——脂多糖(又叫内毒素)相关。在人体当中，脂多糖会诱导机体产生大量细胞因子并激活免疫系统，最终形成有机体对病原菌的先天性免疫应答。例如红肿就是细胞因子大量产生并释放导致的。
在革兰氏阴性菌感染的治疗中，除了清除感染灶及用相应的支持对症治疗外，还需使用抗生素。目前主要采用的是氨基糖苷类、β-内酰胺类等抗生素。这些抗生素对各种革兰氏阴性菌有强大杀菌作用，而且对于铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌等常见革兰氏阴性杆菌都具有较长时间的抗生素后效应。除了抗生素以外，如前列腺素合成酶抑制剂、左旋咪唑、吞噬肽等也被用于革兰氏阴性菌感染的治疗。然而，随着抗生素的广泛应用，临床出现的抗生素滥用现象导致细菌的耐药性已经从单类耐药发展成为多重耐药，使大量原本能够有效替代的二线抗生素无效。其次，抗菌药物在杀/抑菌的同时会诱导内毒素的产生，增加了疾病的治疗难度，所以尽管不断有新的杀伤力强的抗生素问世及先进的支持疗法出现，革兰氏阴性菌感染所致的内毒素血症的处理仍是临床上棘手的问题，尤其是其20～30％的死亡率更是令人难以接受。据报道脂多糖是导致革兰氏阴性菌感染后发生的一系列毒性反应的主要病源物。虽然抗生素对清除细菌具有较好的效果，但对已游离于血液中的脂多糖以及由其持续刺激靶细胞产生的多种有害细胞因子无能为力，所以临床选用抗菌药物时应对药敏实验结果及其诱导内毒素释放的特性进行综合考虑。第三，因为脂多糖在革兰氏阴性菌的细胞壁表面，使得很多旧型抗生素不能有效抑制此类细菌。基于这些原因，近年来人们正在积极开拓治疗革兰氏阴性菌感染的新领域。
抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是指具有抗菌活性的短肽，这类活性肽多数具有热稳定性、强碱性及广谱抗菌等特点。目前人们已经从不同的生物体中鉴定出约2000多个AMPs，这些AMPs经诱导而合成，在机体抵抗病原体的入侵方面起着重要的作用，被认为是生物非特异性免疫功能的重要防御成分。因此寻找新型抗革兰氏阴性菌的APMs成为研究的热点与难点。
人凝血因子VII(human factor VII，hFVII)是人体内天然存在的蛋白质，其分子量约为50kD。其分子包含四个结构域：N末端膜结合的γ羧基谷氨酸结构域(Gla结构域)，两个表皮生长因子样结构域(EGF1、EGF2)和一个C端丝氨酸蛋白酶结构域。它在人体内还存在一些序列同源性较高的类似物，如人凝血因子IX(human factor IX，hFIX)、人凝血因子X(human factor X，hF X)等。迄今为止，尚未见以人凝血因子VII、人凝血因子IX、人凝血因子X三者的轻链作为抑菌药物治疗细菌感染的相关报道及制备治疗革兰氏阴性菌所致的内毒素血症的药物的报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供人工制备的人凝血因子轻链蛋白，本发明的另一目的是证明所述人凝血因子轻链蛋白对革兰氏阴性菌具有抑制作用，以便开发出一类治疗革兰氏阴性菌感染的新型药物及治疗革兰氏阴性菌所致的内毒素血症的药物。
本发明所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQ IDNO：1所述，或与SEQ ID NO：1所述氨基酸序列具有50％以上的同源性的蛋白。与序列表中SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列具有50％以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQID NO：2或SEQ ID NO：3所述。
或本发明所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQID NO：2所述，或与SEQ ID NO：2所述氨基酸序列具有50％以上的同源性的蛋白。与序列表中SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列具有50％以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所述。
或本发明所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中SEQID NO：3所述，或与SEQ ID NO：3所述氨基酸序列具有50％以上的同源性的蛋白。与序列表中SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列具有50％以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所述。
氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所述列的人凝血因子轻链蛋白命名为LhFVII，氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所述的人凝血因子轻链蛋白命名为LhFIX，氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：3所述的人凝血因子轻链蛋白命名为LhF X。
上述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，由原核重组质粒表达而成，或真核重组质粒表达而成，或通过化学合成制备。
本发明所述人凝血因子轻链的原核重组质粒、真核重组质粒，由序列表中SEQ IDNO：4所述的核苷酸序列或与序列表中SEQ ID NO：4所述的核苷酸序列具有50％以上同源性的基因分别与原核载体或真核载体构建而成。与序列表中SEQ ID NO：4所述的核苷酸序列具有50％以上同源性的基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所述。所述原核载体为pET质粒系统，包括pET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、pET-42a(+)；所述真核载体为pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)。
本发明所述人凝血因子轻链的原核重组质粒、真核重组质粒，由序列表中SEQ IDNO：5所述的核苷酸序列或与序列表中SEQ ID NO：5所述的核苷酸序列具有50％以上同源性的基因分别与原核载体或真核载体构建而成。与序列表中SEQ ID NO：5所述的核苷酸序列具有50％以上同源性的基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所述。所述原核载体为pET质粒系统，包括pET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、pET-42a(+)；所述真核载体为pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)。
本发明所述人凝血因子轻链的原核重组质粒、真核重组质粒，由序列表中SEQ IDNO：6所述的核苷酸序列或与序列表中SEQ ID NO：6所述的核苷酸序列具有50％以上同源性的基因分别与原核载体或真核载体构建而成。与序列表中SEQ ID NO：6所述的核苷酸序列具有50％以上同源性的基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所述。所述原核载体为pET质粒系统，包括pET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、pET-42a(+)；所述真核载体为pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)。
本发明所使用的方法：
(1)通过PCR反应，获取编码重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白的基因或与它们具有50％以上同源性的基因；
(2)将上述扩增的各基因片段分别插入到原核载体或真核载体构建原核重组质粒或真核重组质粒，再将原核重组质粒或真核重组质粒转化至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的重组质粒测序；
(3)将测序结果正确的原核重组质粒转化入工程菌中进行表达，分离纯化表达的蛋白即获得重组LhFVII蛋白、LhFIX蛋白、LhF X蛋白或与它们具有50％以上同源性的蛋白；或将真核重组质粒转染至哺乳动物细胞进行培养，建立稳定细胞系进行真核表达，然后分离纯化的蛋白即获得重组LhFVII蛋白、LhFIX蛋白、LhF X蛋白或与它们具有50％以上同源性的蛋白；
(4)重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白或与它们具有50％以上同源性的蛋白的体外抑菌活性检测；
(5)重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白或与它们具有50％以上同源性的蛋白的体内抑菌活性检测；
(6)重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白或与它们具有50％以上同源性的蛋白水解脂多糖的质谱检测；
(7)重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白或与它们具有50％以上同源性的蛋白水解脂多糖的银染检测；
所述原核载体为pET质粒系统，所述pET质粒系统包括pET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、pET-42a(+)等原核表达质粒；所述真核载体为pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)等。
人凝血因子轻链蛋白的化学合成通常委托专业公司。
本发明所述LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白能够水解革兰氏阴性菌的脂多糖(又称内毒素，为革兰氏阴性菌外膜的主要成分)，破坏细胞结构的稳定性，进而起到杀菌的作用。同时，研究表明轻链蛋白与组织因子具有很强的结合作用。当有机体受到创伤时，组织因子会大量暴露于伤口处，使得轻链蛋白随之聚集在伤口处，起到对伤口的靶向抑菌作用。体外抑制革兰氏阴性菌活性检测表明：LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白体对革兰氏阴性菌具有明显的抑制作用，它们对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、嗜水气单胞菌、异型枸橼酸杆菌、卡他莫拉菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、粘质沙雷氏杆菌的最低抑菌浓度(MIC)如下：
Figure GPA0000199999970000061
LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白在动物体内的抑菌活性检测表明：LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白对动物体内的革兰氏阴性菌具有明显的抑制作用，可以使受到致死剂量绿脓杆菌感染的小鼠在14天保持100％的存活率，并且未感染绿脓杆菌的小鼠在注射所述蛋白后，全部存活，说明本发明所述LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白本身免疫原性低，毒性小。
本发明所述LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白能够水解革兰氏阴性菌的脂多糖(又称内毒素，见实施例12、13)，而脂多糖是导致内毒素血症的主要病源物，因而本发明所述LhFVII、LhF IX、LhF X蛋白可在制备治疗革兰氏阴性菌所致的内毒素血症的药物中应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的人工制备的人凝血因子轻链蛋白，能够水解革兰氏阴性菌的外膜、破坏其细胞结构的稳定性，对革兰氏阴性菌具有明显的抑制作用，因而为革兰氏阴性菌感染所致疾病提供了一类新型治疗药物。
2、本发明提供的人工制备的人凝血因子轻链蛋白，能够水解革兰氏阴性菌的脂多糖(又称内毒素)，因而为革兰氏阴性菌所致的内毒素血症提供了一类新型治疗药物。
3、本发明提供的人工制备的人凝血因子轻链蛋白，能够通过与TF的结合靶向定位在有机体伤口部位，对伤口部位的革兰氏阴性菌具有良好的靶向杀菌效果，有望用于制备新型的靶向抗菌药物。
4、人凝血因子VII、IX、X轻链蛋白是人体中固有的天然成分，本发明以其为抑菌结构域可以有效降低药物的免疫源性。
5、由于可以直接通过基因工程技术在大肠杆菌工程菌细胞内准确表达重组人凝血因子轻链蛋白，因而生产成本较低，有利于工业化生产。
附图说明
图1是实施例1所述编码重组蛋白LhFVII基因序列PCR扩增电泳图，图中，1泳道：DNA分子量标记(Marker1，购自天根公司)；2泳道：编码LhFVII的序列。
图2是实施例2所述编码重组蛋白LhFIX基因序列PCR扩增电泳图，图中，1泳道：DNA分子量标记(Marker1，购自天根公司)；2泳道：编码LhFIX的序列。
图3是实施例3所述编码重组蛋白LhF X基因序列PCR扩增电泳图，图中，1泳道：DNA分子量标记(Marker1，购自天根公司)；2泳道：编码LhF X的序列。
图4是实施例4所述原核重组质粒pET19blhfVII的示意图，其中，逆时针序列为正向基因片段，顺时针为反向基因片段。
图5是实施例4所述原核重组质粒pET19blhfIX的示意图，其中，逆时针序列为正向基因片段，顺时针为反向基因片段。
图6是实施例4所述原核重组质粒pET19blhfX的示意图，其中，逆时针序列为正向基因片段，顺时针为反向基因片段。
图7是实施例4中重组质粒pET19blhfVII的限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，1泳道：DNA分子量标记(Marker1+1 kb Marker，购自天根公司)；2泳道：用限制性内切酶双酶切重组质粒pET19blhfVII后所得的pET19b载体片段和编码重组LhFVII蛋白的DNA片段。
图8是实施例4中重组质粒pET19blhfIX的限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，1泳道：DNA分子量标记(1kb Marker，购自天根公司)；泳道2：DNA分子量标记(Marker 1，购自天根公司)；3泳道：用限制性内切酶双酶切重组质粒pET19blhfIX后所得的pET19b载体片段和编码重组LhFIX蛋白的DNA片段。
图9是实施例4中重组质粒pET19blhfX的限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图，其中，1泳道：DNA分子量标记(Marker1，购自天根公司)；2泳道：DNA分子量标记(1Kb Marker，购自天根公司)；3泳道：用限制性内切酶双酶切重组质粒pET19blhfX后所得的pET19b载体片段和编码重组LhF X蛋白的DNA片段。
图10是实施例5中重组质粒pET19blhfVII在大肠杆菌中诱导表达重组LhF VII蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Unst.Protein Marker，购自ThemoScientific)；2泳道：诱导之前未表达重组LhFVII蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达重组LhFVII蛋白后的菌体总蛋白，箭头指示为表达出的重组LhFVII蛋白。
图11是实施例5中重组质粒pET19blhfIX在大肠杆菌中诱导表达重组LhFIX蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Unst.Protein Marker，购自ThemoScientific)；2泳道：诱导之前未表达重组LhFIX蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达重组LhFIX蛋白后的菌体总蛋白，箭头指示为表达出的重组LhFIX蛋白。
图12是实施例5中重组质粒pET19blhfX在大肠杆菌中诱导表达重组LhF X蛋白的SDS-PAGE分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Unst.Protein Marker，购自ThemoScientific)；2泳道：诱导之前未表达重组LhF X蛋白的菌体总蛋白；3泳道：诱导表达重组LhF X蛋白后的菌体总蛋白，箭头指示为表达出的重组LhF X蛋白。
图13是实施例5中诱导表达的重组LhFVII蛋白的western-blot鉴定分析图。
图14是实施例5中诱导表达的重组LhFIX蛋白的western-blot鉴定分析图。
图15是实施例5中诱导表达的重组LhF X蛋白的western-blot鉴定分析图。
图16是实施例6中经亲合层析法纯化的重组LhFVII蛋白的SDS-PAGE鉴定分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Unst.Protein Marker，购自Themo Scientific)；2泳道：纯化后重组LhFVII蛋白。
图17是实施例6中经亲合层析法纯化的重组LhFIX蛋白的SDS-PAGE鉴定分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Unst.Protein Marker，购自Themo Scientific)；2泳道：纯化后重组LhFIX蛋白。
图18是实施例6中经亲合层析法纯化的重组LhF X蛋白的SDS-PAGE鉴定分析图，其中，1泳道：蛋白质分子量标记(Unst.Protein Marker，购自Themo Scientific)；2泳道：纯化后重组LhF X蛋白。
图19是实施例7所述真核重组质粒pcDNA3.1-LhFVII的示意图，其中，逆时针序列为正向基因片段，顺时针为反向基因片段。
图20是实施例7所述真核重组质粒pcDNA3.1-LhFIX的示意图，其中，逆时针序列为正向基因片段，顺时针为反向基因片段。
图21是实施例7所述真核重组质粒pcDNA3.1-LhF X的示意图，其中，逆时针序列为正向基因片段，顺时针为反向基因片段。
图22是实施例10所述重组LhF VII蛋白对大肠杆菌DH5α作用的生长曲线，其中，
Figure GPA0000199999970000081
未添加蛋白的对照组；
Figure GPA0000199999970000082
添加12.5μg/mL重组LhFVII蛋白的实验组；
Figure GPA0000199999970000083
添加25μg/mL重组LhFVII蛋白的实验组；
Figure GPA0000199999970000084
添加50μg/mL重组LhFVII蛋白的实验组。
图23是实施例10所述重组LhF IX蛋白对大肠杆菌DH5α作用的生长曲线，其中，
Figure GPA0000199999970000085
未添加蛋白的对照组；
Figure GPA0000199999970000086
添加12.5μg/mL重组LhFIX蛋白的实验组；
Figure GPA0000199999970000087
添加25μg/mL重组LhFIX蛋白的实验组；
Figure GPA0000199999970000088
添加50μg/mL重组LhFIX蛋白的实验组。
图24是实施例10所述重组LhF X蛋白对大肠杆菌DH5α作用的生长曲线，其中，
Figure GPA0000199999970000089
未添加蛋白的对照组；
Figure GPA00001999999700000810
添加12.5μg/mL重组LhF X蛋白的实验组；
Figure GPA00001999999700000811
添加25μg/mL重组LhF X蛋白的实验组；
Figure GPA00001999999700000812
添加50μg/mL重组LhF X蛋白的实验组。
图25是实施例11所述重组LhFVII蛋白提高感染致死剂量绿脓杆菌小鼠存活率的曲线，其中，
Figure GPA00001999999700000813
未注射药物的感染小鼠；
Figure GPA00001999999700000814
注射美罗培南的感染小鼠；
Figure GPA00001999999700000815
注射盘尼西林的感染小鼠；
Figure GPA00001999999700000816
注射重组LhFVII蛋白的感染小鼠。
图26是实施例11所述重组LhFIX蛋白提高感染致死剂量绿脓杆菌小鼠存活率的曲线，其中，
Figure GPA00001999999700000817
未注射药物的感染小鼠；
Figure GPA00001999999700000818
注射盘尼西林的感染小鼠；
Figure GPA0000199999970000091
注射美罗培南的感染小鼠；
Figure GPA0000199999970000092
注射重组LhFIX蛋白的感染小鼠。
图27是实施例11所述重组LhF X蛋白提高感染致死剂量绿脓杆菌小鼠存活率的曲线，其中，
Figure GPA0000199999970000093
未注射药物的感染小鼠；
Figure GPA0000199999970000094
注射盘尼西林的感染小鼠
Figure GPA0000199999970000095
注射美罗培南的感染小鼠；
Figure GPA0000199999970000096
注射重组LhF X蛋白的感染小鼠。
图28是实施例12所述重组LhFVII蛋白水解LPS的质谱检测图谱，其中上层图谱为LhFVII蛋白质谱图；中层为未处理的LPS质谱图；下层为LhFVII蛋白处理LPS后的质谱图。
图29是实施例13所述重组LhFVII蛋白水解LPS的银染检测图谱，其中1泳道：蛋白预染marker；2泳道：重组LhFVII蛋白；3泳道：未经处理的E.coli K12 LPS；4泳道：LhFVII处理后的E.coli K12 LPS。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。下属实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等著的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，实验动物常规手册(国家实验动物规范中心，2004年11月)：基本技术指南第五版(John Wiley&Sons，Inc，2005)中所述的条件及实验步骤，或按照制造厂商所建议的条件及实验步骤。
实施例1：获取重组LhFVII蛋白编码的基因
1、合成如下所示PCR扩增引物(由英俊生物技术有限公司合成)：
引物1：
Figure GPA0000199999970000097
引物2：
Figure GPA0000199999970000098
2、PCR扩增体系
以含有人凝血因子VII CDS区的质粒(广州复能基因有限公司)为模板，用引物1和引物2进行PCR扩增。引物1序列中引入Nco I酶切位点以及His×6蛋白纯化标签，引物2序列中入Xho I酶切位点。扩增后得到长497bp、含有人凝血因子VII轻链编码序列的DNA片段。PCR反应体系(50μL)如下：
Figure GPA0000199999970000099
3、PCR扩增反应条件
参照PrimeStar DNA聚合酶(购自Takara公司)的说明书设置PCR扩增反应条件：98℃预变性2min，98℃变性10sec、55℃复性15sec、72℃延伸50sec，30个循环后72℃延伸4min。
4、扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析(见图1)，并按胶回收试剂盒(购自Omega公司)的说明回收片段。
实施例2：获取重组LhFIX蛋白的编码基因
1、合成如下所示PCR扩增引物(由英俊生物技术有限公司合成)：
引物1：
Figure GPA0000199999970000101
引物2：
Figure GPA0000199999970000102
2、PCR扩增体系
以含有人凝血因子IX CDS区的质粒(广州复能基因有限公司)为模板，用引物1和引物2进行PCR扩增。引物1序列中引入Nco I酶切位点以及His×6蛋白纯化标签，引物2序列中引入Xho I酶切位点。扩增后得到长476bp、含有人凝血因子IX轻链编码序列的DNA片段。PCR反应体系(50μL)如下：
Figure GPA0000199999970000103
3、PCR扩增反应条件
参照PrimeStar DNA聚合酶的说明书设置PCR扩增反应条件：98℃预变性2min，98℃变性10sec、55℃复性15sec、72℃延伸50sec，30个循环后72℃延伸4min。
4、扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析(见图2)，并按胶回收试剂盒(购自Omega公司)的说明回收片段。
实施例3：获取重组LhF X蛋白的编码基因
1、合成如下所示PCR扩增引物，(由英俊生物技术有限公司合成)：
引物1：
Figure GPA0000199999970000104
Figure GPA0000199999970000111
引物2：
Figure GPA0000199999970000112
2、PCR扩增体系
以含有人凝血因子X CDS区的质粒(广州复能基因有限公司)为模板，用引物1和引物2进行PCR扩增。引物1序列中引入Nco I酶切位点以及His×6蛋白纯化标签，引物2序列中引入Xho I酶切位点。扩增后得到长458bp、含有人凝血因子X轻链编码序列的DNA片段。PCR反应体系(50μL)如下：
Figure GPA0000199999970000113
3、PCR扩增反应条件
参照PrimeStar DNA聚合酶说明书设置PCR扩增反应条件：98℃预变性2min，98℃变性10sec、55℃复性15sec、72℃延伸50sec，30个循环后72℃延伸4min。
4、扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析(见图3)，并按胶回收试剂盒(购自Omega公司)的说明回收片段。
实施例4：表达重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白的原核重组质粒的构建
1、基因片段与原核表达载体的预处理
用限制性内切酶Nco I及Xho I(均购自TaKaRaFermentas公司)分别双酶切实施例1克隆的LhFVII基因片段、实施例2克隆的LhFIX基因片段、实施例3克隆的LhF X基因片段以及原核表达载体pET19b(Novagen公司产品)，37℃过夜，反应体系如下：
Figure GPA0000199999970000114
双酶切结束后，反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统的紫外灯下，按胶回收试剂盒(购自Omega公司)的说明回收片段。
2、LhF VII、LhF IX、LhF X基因与pET19b原核表达载体的连接与转化
(1)将上述步骤中所获得的LhF VII、LhF IX、LhF X基因片段及原核载体片段粗略定量后，按基因片段与原核载体的分子数比为3：1的连接反应原则进行连接实验，反应体系如下：
Figure GPA0000199999970000121
(2)整个反应过程在T4DNA连接酶(购自Fermentas公司)作用下在16℃反应过夜。使上述扩增的3种基因片段分别插入到pET19b原核表达载体中，所构建的原核重组质粒结构图见图4-图6。
(3)将连接产物分别转化大肠杆菌Top10(购自Invitrogen公司)的感受态细胞(按《分子克隆操作指南》自制)。连接产物的转化方法主要步骤如下：
1)取连接产物5μL加入大肠杆菌Top10的感受态细胞100μL置于1.5mL Ep管中，阴性对照为大肠杆菌Top10的感受态细胞100μL置于1.5mL Ep管中；
2)置于冰上30min；
3)42℃循环金属浴90s；
4)快速将管转至冰浴中，冷却2min；
5)加900μL SOC培养基(蛋白胨10g，酵母浸出物5g，NaCl 0.5g，KCl 0.186g，MgCl20.95g，用ddH2O溶解后定容于980ml，高压灭菌，待冷却至室温后加入无菌20％葡萄糖20mL)，置于冰上；
6)37℃，180rpm振摇培养1h；
7)将菌液4000×g离心3min，留200μL上清，倒去多余培养基后，用余下的200μL重悬细菌；
8)将重悬的转化细菌均匀涂布于含0.1g/mL氨苄青霉素的固体LB培养基上，置37℃恒温培养箱培养过夜。
3、重组质粒的鉴定
挑取上述转化的大肠杆菌Top单克隆小量培养后用质粒提取试剂盒(购自OMEGA)提取质粒，进行Nco I/Xho I双酶切鉴定。双酶切产物经凝胶电泳鉴定后，3种重组质粒的限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图如图7-图9所示。酶切产物所形成的两条带，与预期产物大小相符，说明质粒构建成功。
将双酶切鉴定无误的质粒送北京华大基因研究中心对插入的融合基因片段进行测序，最后将测序结果正确的含LhFVII基因的原核重组质粒命名为pET19blhfVII，含LhFIX基因的原核重组质粒命名为pET19blhfIX，含LhF X基因的原核重组质粒命名为pET19blhfX。
实施例5：原核重组质粒在大肠杆菌中的表达
1、将实施例4构建的重组质粒pET19blhfVII、pET19blhfIX、pET19blhfX分别转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自Invitrogen)，挑取单克隆于含0.1g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃185rpm振荡培养至OD600≈0.6，取1mL菌液冻于-20℃。然后在剩余的菌液中加入终浓度0.8mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)继续培养6h，取1mL菌液冻于-20℃。
2、将上述IPTG诱导前、诱导后的样品在5％的浓缩胶和12％的分离胶中进行SDS-PAGE电泳检测，分析目的蛋白的表达情况，3种重组质粒在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白的SDS-PAGE分析图分别见图10-图12。结果显示蛋白正常表达。
3、对目的蛋白进行Western-blot鉴定。将凝胶上的蛋白质电转移到硝酸纤维素滤膜(GE)上，电转移后的膜用封闭液(约5％的PBST脱脂奶粉)室温摇床震摇封闭处理2h；再分别加入小鼠抗FVII、小鼠抗FIX、小鼠抗F X单克隆抗体(Santa公司产品)反应液，4℃过夜；充分洗涤后再加入酶标二抗(羊抗鼠IgG)，室温摇床震摇作用2h；充分洗涤后加ECL(Thermo)反应液反应5min后，胶片曝光显色，诱导表达的3种重组蛋白的western-blot鉴定分析图分别如见图13-图15所示。
结果显示IPTG诱导后融合蛋白有明显表达，将表达LhF VII的菌株命名为LhFVII-pET19bBL21-(DE3)，表达LhFIX的菌株命名为LhFIX-pET19bBL21-(DE3)，表达LhF X的菌株命名为LhF X-pET19bBL21-(DE3)。
实施例6：重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白的亲和层析纯化
1、按照实施例5中的方法大规模培养LhF VII-pET19bBL21-(DE3)、LhF IX-pET19bBL21-(DE3)、LhF X-pET19bBL21-(DE3)细菌，并添加IPTG诱导，于18℃、175rpm震荡培养过夜。
2、将上述菌液4000×g离心3min收集菌体。用EW buffer(20mM磷酸钠，500mMNaCl，1mM DTT，0.1mM PMSF，pH7.4)重悬洗涤菌体沉淀。4000×g离心3min，弃上清。再用10mL EW buffer重悬菌体。
3、超声波破碎菌体(功率：300W；超声时间：10s；间隔时间：10s；总超声时间：3min；冰浴中进行)。超声结束后，将菌液于4℃，48400×g离心30min，收集上清，置于冰上。
3、按Co2+纯化系统(Talon Metal Affinity Resin，Clontech公司产品)说明书预装层析柱，并上样。10ml EW洗涤柱子两次，并用10mM咪唑溶液清洗杂蛋白。最后以100mM咪唑洗脱蛋白，经亲合层析法纯化的3种重组蛋白的SDS-PAGE鉴定分析图分别见图16-图18。
4、将含有目的蛋白的洗脱液用Tris-Cl缓冲液(pH 7.4)进行超滤，置换buffer并浓缩。超滤后可得高浓度重组蛋白——重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白。蛋白定量显示，每升表达菌液可得纯度在90％以上的目的蛋白约15mg。
实施例7：表达重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白的真核重组质粒的构建
1、合成如下所示PCR扩增引物，(由英俊生物技术有限公司合成)：
Figure GPA0000199999970000131
Figure GPA0000199999970000141
2、PCR扩增体系
以含有人凝血因子VII CDS区的质粒(广州复能基因有限公司)为模板，用引物1和引物2进行PCR扩增。引物1序列中引入BamH I酶切位点、cozak序列，引物2序列中引入Xho I酶切位点以及His蛋白纯化标签。以含有人凝血因子IX CDS区的质粒(广州复能基因有限公司)为模板，用引物3和引物4进行PCR扩增。引物3序列中引入BamHI酶切位点、cozak序列以及信号肽，引物4序列中引入Xho I酶切位点以及His蛋白纯化标签。以含有人凝血因子XCDS区的质粒(广州复能基因有限公司)为模板，用引物5和引物6进行PCR扩增。引物5序列中引入BamHI酶切位点、cozak序列以及信号肽，引物6序列中引入Xho I酶切位点以及His蛋白纯化标签。
PCR反应参照实施例1进行。
3、真核表达重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白的重组质粒的构建
用限制性内切酶BamH I及Xho I(均购自TaKaRaFermentas公司)分别双酶切实施例7克隆的LhFVII、LhFIX、LhF X基因片段以及真核表达载体pcDNA3.1(+)(Novagen公司产品)，反应体系参照实施例4。基因与真核表达载体的连接与转化以及重组质粒的鉴定步骤参照实施例4。
最后将测序结果正确的含LhFVII基因的重组质粒命名为pcDNA3.1-LhFVH，含LhFIX基因的重组质粒命名为pcDNA3.1-LhFIX，含LhF X基因的重组质粒命名为pcDNA3.1-LhF X。质粒图谱见图19-图21。
实施例8：表达重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白的稳定细胞系的构建
1、细胞准备
将DG44细胞(购自ATCC)培养于添加了10％FBS(胎牛血清，购自Hiclony)的α-MEM(含L-谷氨酰胺，核糖核酸及脱氧核糖核酸)完全培养基(购自Hiclony)中。转染前一天在六孔板中接种DG44细胞4×105个/mL，每孔2mL。
2、细胞转染
采用脂质体法转染细胞，方法按照LipofectamineTM2000试剂(购自Invitrogen)说明书进行。具体步骤如下：
1)细胞培养基换成无血清α-MEM培养基，2mL/孔。
2)将真核重组质粒pcDNA3.1-LhFVII、pcDNA3.1-LhFIX、pcDNA3.1-LhF X分别(总量为4.0μg)与250μL Opti-MEM混合，同时将10μL lipo2000与250μL Opti-MEM混合，静置5min。
3)将2种溶液充分混合，静置20min，将脂质体复合物加入细胞孔中，轻轻混匀，放入37℃培养箱培养。
4)5h后，将培养基更换为添加了10％FBS的α-MEM完全培养基；
3、阳性细胞克隆筛选及扩大
重组质粒转染24h后，细胞以1∶2000比例转入100mm培养皿中培养，加入终浓度为800μg/mL的G418(购自Gibco)筛选，以转染空载体和未转染组作对照。15天后挑取单克隆转入24孔板培养，待细胞长满后依次转入6孔板，100mm培养皿扩大培养，待细胞融合度达90％时1∶4冻存于含10％DMSO(购自Gibco)的FBS中。
4、阳性细胞克隆鉴定
对挑取的阳性细胞克隆进行基因组PCR和RT-PCR技术检测，均可扩增出目的片段，说明融合基因已整合在细胞基因组并有功能性mRNA转录，将获得的稳定细胞系分别命名为DG44-LhFVII、DG44-LhFIX、DG44-LhF X。
实施例9：真核重组质粒所表达的重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白的收集
1、在添加有400μg/mL G418的含10％FBS的α-MEM完全培养基中分别培养DG44-LhFVII、DG44-LhFIX、DG44-LhF X细胞并传代至10板。
2、当每板细胞融合度均达90％以上时将10％FBS的α-MDM完全培养基换为CHO无血清培养基，并添加终浓度1μg/mL Vitamin-K(Sigma)。
3、培养3天后，收集培养上清，离心弃去细胞沉淀，上清经PEG20000(Merck)浓缩5倍后，采用钴离子亲和层析法进行纯化并通过SDS-PAGE、Western Blot进行鉴定，步骤参照实施例6。
实施例10：重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白的抑菌活性检测
1、以大肠杆菌DH5α为例，将大肠杆菌DH5α在LB固体培养基上画线培养后，挑取典型菌落接种于普通LB液体培养基中，37℃，185rpm振荡培养直至达到对数生长期(OD600≈0.5)。4000×g离心3min，弃上清，用新鲜LB培养基重悬菌体。
2、将上述菌液稀释后接种在96孔板上，每孔总体积为100μL，菌量约为5×105CFU/mL。
3、分别将重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白添加至上述孔中，使最高浓度孔的蛋白终浓度为50μg/mL。以此浓度为基础，2倍梯度稀释，直至蛋白形成浓度为50、25、12.5μg/mL的浓度梯度。每个浓度梯度设3个平行孔。同时设无细菌空白孔以及无蛋白的细菌孔，每组3个平行孔。
4、将上述96孔板置于37℃，175rpm摇床振荡培养，每30min取样，在紫外分光光度计下检测600nm波长处的吸光值，做出抑菌曲线。MIC判定：培养8h后观察生长现象，肉眼观察或以紫外分光光度计在600nm波长下进行判定，以无细菌生长的最小重组蛋白浓度为最小抑制浓度MIC。
重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白对大肠杆菌DH5α作用的生长曲线见图22-图24，由图22-图24可知，重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白对DH5α的生长具有明显的抑制作用，重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白的MIC均为25μg/mL。
5、以与大肠杆菌DH5α相同的方法检测重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白对大肠杆菌BL21、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、嗜水气单胞菌、异型枸橼酸杆菌、卡他莫拉菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、粘质沙雷氏杆菌等革兰氏阴性菌的生长情况的影响，MIC如下表：
Figure GPA0000199999970000161
结论：从上述实验结果可知，本发明所述重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白对多种革兰氏阴性菌均具有抑制作用。
实施例11：重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白在动物体内的抑菌活性测定
1、实验动物为BAL B/C雄鼠(体重约为18-22g，来源于四川大学)，分为11组，每组8只，其中实验组为3组，其余为各种对照组。
2、将绿脓杆菌(来源于四川大学)的菌液在LB固体培养基上画线培养后，挑取典型菌落接种于普通LB液体培养基中，经过37℃过夜振荡培养约12h后4000×g离心3min，弃上清，生理盐水重悬菌体后待用。
3、将重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白按照无菌操作法，用生理盐水配制成浓度分别为100μg/mL的样品，冰上保存待用。
4、将青霉素、美罗培南分别用无菌生理盐水溶解，按照60kg成人表面积换算成BALB/C雄鼠的临床等效用药剂量。青霉素为9.1mg/只，美罗培南为1.5mg/只。
5、将致死剂量绿脓杆菌菌液按500μL/只的剂量腹腔注射各实验组和三个对照组中的BAL B/C雄鼠。
6、三个实验组的BAL B/C雄鼠感染菌体30min后，第一实验组尾静脉给药重组LhFVII蛋白(50μg/只)、第二实验组尾静脉给药重组LhFIX蛋白(100μg/只)、第三实验组尾静脉给药重组LhF X蛋白(100μg/只)；三个对照组的BAL B/C雄鼠感染菌体30min后，其中第一、第二对照组分别尾静脉给药青霉素(9.1mg/只)、美罗培南(1.5mg/只)，第三对照组不给药。余下的第四、第五、第六、第七、第八对照组不注射绿脓杆菌菌液，只分别注射与第一、第二、第三实验组等剂量的重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白，与第一、第二对照组等剂量的青霉素、美罗培南。
7、给药72h后，对各实验组和对照组的BAL B/C雄鼠进行二次给药，给药类型和剂量与第一次给药相同。
8、BAL B/C雄鼠给药后每24h观察一次，记录存活情况，第15天处死所有动物。
存活率＝存活小鼠/8×100％
实验结果：本发明所述重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白可以使受到致死剂量绿脓杆菌感染的小鼠在14天保持100％的存活。第二对照组(美罗培南组)小鼠在14后存活率为100％，而第一对照组(青霉素组)小鼠全部死亡，感染致死剂量绿脓杆菌小鼠存活率的情况如图25-图27所示。第四、第五、第六、第七、第八的小鼠全部存活。
实验结果表明，本发明所述重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白在动物体内对革兰氏阴性菌具有抑菌活性，且毒性小，不会导致动物死亡。
实施例12：质谱检测重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白对内毒素(LPS)的破坏作用
1、用实施例6获得的重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白处理1mg/mL的E.coli K12 LPS(Sigma)，体系设置为：
实验组： 0.5μg/μL LhFVII或LhFIX或LhF X 120μL
1mg/mL LPS 250μL
生理盐水 30μL
对照组1： 0.5μg/μL LhFVII或LhFIX或LhF X 120μL
生理盐水 280μL
对照组2： TBS 120μL
1mg/mL LPS 250μL
生理盐水 30μL
2、按照上述体系将其放在37℃ 150rpm条件下孵育过夜。孵育结束后，最大转速17000g离心5分钟。离心结束后。收集上清。
3、将上清用100D的透析袋透析16小时，透析buffer为去离子水，透析结束以后用质谱MALDI-TOF分析处理后的样品；
4、首先取1μL的溶于33％乙醇中的10mg/mL的2，5-二羟基本甲酸(DHB)与1μL的样品混匀；
5将混合的了DHB的样品点在不锈钢MTP 384靶板上(Bruker Daltonics)，接着通过热气将靶板上的样品烘干；
6烘干后，用Autoflex TOF/TOF II仪器(Bruker)氮气377nm激光束，正离子模式条件下分析，通过FlexControl 2.2软件控制操作，整个质谱图通过使用反射器模式，加速电压19kV，反射器电压20kV，在阳离子模式下脉冲激发140ns，扫描范围从质荷比600到7000，数据收集时间平均为500激光脉冲，其最低的激光能量必需能够获得足够的信噪比，质谱中产生的各峰是通过使用Bruker Flex分析软件(Version 3.0)获得；
7、后源衰变(PSD)质谱使用Bruker Daltonics LIFT系统记录，在18.96kV先驱离子加速电压和碎片加速(LIFT电压4.37kV)。反射器电压1和2分别设置为23.49kV和9.69kV；
实验图谱以LhFVII为例，结果见图28。未经处理的LPS(中)存在明显的m/z 2318.4峰，而LhFVII处理LPS后(下)，质谱峰缺失m/z 2318.4，说明LPS被轻链蛋白水解。因此本发明所述LhFVII、LhFIX、LhF X具有水解LPS的作用，可用于治疗内毒素血症。
实施例13：银染检测重组LhFVII、LhFIX、LhF X蛋白水解的E.coli K12 LPS
1、用实施例6获得的LhFVII、LhFIX、LhF X分别处理LPS样品，对照组为TBS缓冲液作用LPS样品，孵育过夜，然后离心收集沉淀；
2、用LPS 1×loading buffer(0.05M的Tris-HCl，含10g/L SDS，100g/L蔗糖，0.5％β-巯基乙醇，10mg/L溴酚蓝，pH 6.8)与处理后处理后的沉淀样品混合，100℃金属浴上孵育5min；
3、15％分离胶(含4mol/L尿素，1.0mm厚Bio-Rad具体配置如下：去离子水1.15mL，30％丙烯酰胺2.5mL，1.5mol/L Tris-HCl(PH8.8，含10％SDS)1.3mL，10％过硫酸铵50μL，TEMED 4μL)混匀，制胶，水封压平分离胶；
4、5％浓缩胶配制：去离子水1.42mL，30％丙烯酰胺0.33mL，1mol/L Tris-HCl(PH6.8，含10％SDS)0.25mL，10％过硫酸铵20μL，TEMED 2μL)混匀，灌胶，迅速插上10孔梳子；
5、待胶制好后，点样，然后以120V的电压跑胶分离；跑胶结束后，开始银染，将胶剥下来到一个用去离子水洗净的盒子中，然后用去离子水将胶洗涤3次；
6、洗涤结束后，用50mL固定液(30％乙醇、10％冰乙酸、7g/L高碘酸)于室温固定氧化25min。固定结束后，用去离子水洗涤凝胶3次，5min/次；
7、洗涤结束后，于室温下，用100mL 1g/L的AgNO3染色40min。染色结束，用ddH2O涮洗一次；
8、用50mL在冰上预冷的30g/L Na2CO3，当在显色时加入0.02％甲醛，显色，当出现条带时或条带开始变黑时加入6mL的冰乙酸终止反应；待终止反应结束后，去掉终止液，用去离子水保存凝胶。
银染图谱以LhFVII为例，如图29。经过LhFVII处理后，LPS条带明显减少并变弱，说明轻链蛋白清除了大部分LPS。因此本发明所述LhFVII、LhFIX、LhF X具有水解LPS的作用，可用于治疗内毒素血症。
Figure IDA0000916078600000011
Figure IDA0000916078600000021
Figure IDA0000916078600000031
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Figure IDA0000916078600000051
Figure IDA0000916078600000061

Claims (7)

1.含有人凝血因子轻链基因所编码的蛋白的药物组合物在制备治疗革兰氏阴性菌所致疾病的药物中的用途，其中，所述蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3所述。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述蛋白由原核重组质粒表达而成，或真核重组质粒表达而成，或通过化学合成制备。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述革兰氏阴性菌所致疾病为内毒素血症。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、嗜水气单胞菌、异型枸橼酸杆菌、卡他莫拉菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、粘质沙雷氏杆菌中一种或多种。
5.人凝血因子轻链基因所编码的蛋白或含有人凝血因子轻链基因所编码的蛋白的组合物在制备水解革兰氏阴性菌的脂多糖的产品中的用途，其中，所述蛋白的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所述。
6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述蛋白由原核重组质粒表达而成，或真核重组质粒表达而成，或通过化学合成制备。
7.根据权利要求5所述的用途，其中，所述革兰氏阴性菌选自大肠杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、嗜水气单胞菌、异型枸橼酸杆菌、卡他莫拉菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、粘质沙雷氏杆菌中一种或多种。
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