TWI785719B - 豬腎水解產物、其製備方法及其用於治療或預防腎病變之用途 - Google Patents

Abstract

本發明係揭露一種豬腎水解產物、其製備方法及其用於治療或預防腎病變之用途，其中，該豬腎水解產物係將豬腎依據經由萃取及水解之程序所製得者，具有抗發炎及降低細胞氧化壓力之活性，因而能夠作為治療或預防腎臟發炎或其相關腎病變之組合物的活性成分。

Description

豬腎水解產物、其製備方法及其用於治療或預防腎病變之用途

本發明係有關於一種水解產物及其用途，特別係指一種豬腎水解產物、其製備方法及其用於治療或預防腎病變之用途。

按，根據統計，台灣罹患慢性腎臟病之人口比例將近12％，為全世界之前三名，而每年因為腎臟疾病進行透析治療之人數將近7萬人，顯然腎臟疾病已成為台灣國病之一種，並且對於國家及個人醫療都產生極大之負擔。除了人類會罹患腎臟病外，寵物罹患腎臟病之比例更是高居不下，如報導指出90％以上之貓咪都會罹患腎臟疾病；而寵物與人類不一樣，通常腎臟損傷要達70％以上時，才會出顯明顯之症狀，因此，當寵物被發現罹患腎臟病時大多屬於中晚期，多數僅能靠著飲食控制來延緩疾病之惡化。

雖然對於人類或寵物來說都可以透過藥物來達到延緩腎臟病惡化之功效，但對於寵物來說，藥物之花費長期下來十分可觀，並且藥物對於寵物身體仍會造成負擔，因而目前對於寵物來說最好之方式乃係為控制飲食。許多飼主除了飲食控制外，會選擇投予保健食品之方式來延緩寵物之腎臟病，惟，目前市面上多數寵物用保健食品之效果或成分不明，因此，仍有造成腎臟病無法控制或惡化之風險存在。

本發明之主要目的係在於提供一種豬腎水解產物、其製備方法及其用於治療或預防腎病變之用途，透過本發明所揭製備方法係能夠獲得具有抗發炎及抗氧化壓力之豬腎水解產物，而能夠有效地達到治療或預防腎臟發炎或其相關腎臟疾病之功效。

本發明之另一目的係在於提供一種豬腎水解產物、其製備方法及其用於治療或預防腎病變之用途，其係能夠將豬內臟進行再利用，不僅能夠有效地減少豬隻處理之廢棄物，更能夠提升豬內臟之經濟價值。

緣是，為能達成上述目的，本發明係揭露一種豬腎水解產物及其用於治療或預防腎臟發炎或其相關腎臟疾病之用途，其中，該豬腎水解產物係具有於腎臟組織內抗發炎及抗氧化之活性。

於本發明之一實施例中，該豬腎水解產物係依序經由萃取及水解步驟所製成者，具體來說，包含有下列步驟：

步驟a：取一豬腎，以一醋酸進行萃取，得到一萃取產物；

步驟b：以一腸系膜芽孢桿菌（ Bacillus mesentericus）水解該萃取產物，得到該豬腎水解產物。

於本發明之另一實施例中揭露該豬腎水解產物經由LC管柱於一預定條件下進行定量分析後，於滯留時間為122、983、1105分鐘時出現波峰；其中，該預定條件包含有樣品流速為0.8 mL/min、洗脫緩衝液為30％甲醇。

更進一步來說，本發明所揭豬腎水解產物係能夠作為一組合物之活性成分，而用於治療或/及預防腎臟發炎或是與其相關之腎臟疾病，其中，該組合物係得為一食品、一營養補充品、一醫藥組合物、一寵物食品，並且，該組合物之劑型係得依據需求而做變化，而劑型變化乃為本發明所屬技術領域之通常知識，故於此不加以贅述。

於本發明之另一實施例中，藉由投予含有有效量之本發明所揭豬腎水解產物之組合物至一個體，係能夠有效地降低該個體血中尿素氮及/或肌酸酐之濃度。

於本發明之又一實施例中，藉由投予含有有效量之本發明所揭豬腎水解產物之組合物至一個體，係能夠有效地調控該個體腎臟組織蛋白之表現，以有效地降低細胞內之氧化壓力，具體來說，該組合物係能夠降低腎臟內4-HNE蛋白及/或HO-1蛋白之表現，亦得提升腎臟內Nrf-2蛋白之表現。

以下，為能說明本發明之技術特徵及其功效，將茲舉若干實驗例並搭配圖式做進一步說明如後。

以下實例所使用之C57BL/6（B6）公鼠皆購於財團法人國家實驗動物中心（National Laboratory Animal Center, NLAC, Taipei, Taiwan），購入時為5週齡，待適應3週後為8週齡公鼠即開始進行實驗，各供鼠之體重為22-25克。

以下實例中所述「顯著差異」，代表經統計分析後，具有統計上之差異，其中，以One-way ANOVA分析，並以Duncan's Multiple Range Test進行事後檢定。

以下實例之數據係以mean±SD之方式表示。

以下實例中所揭HO-1（Heme oxygenase-1）蛋白為一種小分子量之熱休克蛋白（heat shock protein，HSP32），其分子量為32 kDa，研究指出當細胞遭受氧化壓力表現時會被誘導表現HO-1蛋白。

以下實例中所揭Nrf-2（Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2）蛋白係為bZIP（basic leucine zipper）之轉錄因子，可調節抗氧化路徑基因的活化，並維持細胞內氧化還原的平衡。在氧化壓力下會使Nrf-2蛋白進入細胞核，結合至抗氧化基因的ARE（antioxidant response element ）啟動抗氧化基因之轉錄活性以移除氧化壓力。

實例一：製備豬腎水解產物

取一豬腎，以醋酸萃取其膠原蛋白後，再以腸系膜芽孢桿菌（ Bacillus mesentericus）進行水解後於90ºC加熱5分鐘，使酵素失活後，經冷凍乾燥後製備成本發明所揭豬腎水解產物粉末，再進行總蛋白質含量分析並定量之。

將豬腎水解產物測定乾物重後，取不同體積之豬腎水解產物溶液濃縮至50m（含乾物重2g），進行離心（10000 xg，15分鐘），分別取上清液1 mL（乾物重0.04g）過濾後，保存於-20℃；將500 mL去離子水打入管柱Sephadex LH-20（Amersham Pharmasia Biotech, Tokyo, Japan）中，流速1mL/min，以置換管柱中20％乙醇，將30%甲醇打入管柱中，而後再將各上清液打入管柱，流速為0.8 mL/min；以30% 甲醇洗脫，流速0.5 ml/min，使用在線分光光度計測量，波長280 nm，結果如圖1所示。

由圖1之結果可知，本發明所揭豬腎水解產物主要之波峰的滯留時間為122、983、1105分鐘。

實例二：動物試驗

取8週齡C57BL/6（B6）公鼠複數隻，依體重隨機分組，致組間平均體重無顯著差異，飲水與飼料滅菌後任飼，每週紀錄其體重與攝食量及飲水量，給予小鼠光照循環為12小時亮、12小時暗；以順鉑（Cisplatin）誘導急性腎損傷小鼠，其係將順鉑以食鹽水製備為濃度1mg/mL，於犧牲前3天開始以腹腔注射方式至各小鼠，劑量為20 mg/kg。

其中：

A組為正常小鼠；

B組係以順鉑（Cisplatin）誘導急性腎損傷小鼠；

C組係為低劑量組，投予本發明所揭豬腎水解產物，劑量為50 mg/kg，並且以順鉑誘導急性腎損傷；

D組係為中劑量組，投予本發明所揭豬腎水解產物，劑量為100 mg/kg，並且以順鉑誘導急性腎損傷；

E組係為高劑量組，投予本發明所揭豬腎水解產物，劑量為200 mg/kg，並且以順鉑誘導急性腎損傷；

F組係為綠茶萃取物組，投予市售綠茶萃取物（漢馨科技，台灣），劑量為61.5 mg/kg，並且以順鉑誘導急性腎損傷。

述各組小鼠分別以其條件飼養4週，並於試驗結束後量測各組小鼠之體重，而後於犧牲各組小鼠後取其腎臟，測量腎臟重量，結果如表1所示。

由表1之結果可知，B組小鼠之腎臟重量及腎重比皆高於A組，顯示B組小鼠確實有被誘導成功而形成腎臟發炎（腎臟損傷）模式；而相較於B組小鼠來說，C至E組小鼠之腎臟重及腎重比皆明顯低於B組，並具有顯著差異，顯示C至E組小鼠腎臟損傷或發炎情形係較為減緩。

由上述結果可推知，本發明所揭投予豬腎水解產物對於腎臟發炎或其所引發之相關腎病變具有預防或是延緩惡化之治療效果。

表1：各組小鼠之體重、腎臟重及兩者間之比例

項目	A組	B組	C組	D組	E組	F組
體重(g)	23.4±0.9	22.5±1.3	22.1±0.9	22.3±0.9	22.1±0.8	22.5±1.4
腎重 (g)	0.26±0.01	0.34±0.02	0.31±0.02	0.31±0.01	0.31±0.02	0.31±0.02
腎重比 (%)	1.09±0.06	1.50±0.08	1.39±0.07	1.39±0.05	1.39±0.08	1.36±0.06

實例三：血液生化值分析

分別於實例二各組小鼠於犧牲時採集其血液，離心後分離血清，利用血清生化全自動分析儀（CoBAS MIRA PLUS, Basel, Switzerland）進行分析測定血中尿素氮（blood urine nitrogen，BUN）與肌酸酐（creatinine，CRE），結果如表2所示。

由表2之結果顯示，B組小鼠之血中尿素氮及肌酸酐都高於A組小鼠，顯示B組小鼠處於腎臟發炎狀態；而C至E組小鼠之血中尿素氮及肌酸酐都比B組顯著降低，顯示投予本發明所揭豬腎水解產物係能夠達到有效地減緩或預防腎臟發炎或其引發相關疾病之功效，並且，隨著投予劑量增加而改善腎臟發炎之效果越佳。

表2：各組小鼠血液生化分析結果

項目	A組	B組	C組	D組	E組	F組
BUN (mg/dL)	22.2±2.9	116.8±21.4	64.0±13.1	72.0±11.3	49.6±11.8	51.2±6.7
CRE (mg/dL)	0.53±0.2	1.80±0.7	1.52±0.5	1.56±0.7	1.01±0.3	0.89±0.4

實例四：組織染色切片及免疫化學分析

將實例二各組小鼠犧牲後，分別取其腎臟，於10%福馬林液中固定後，進行組織石蠟包埋切片，再以蘇木紫與伊紅染劑進行染色，並且另藉由以4-HNE抗體、HO-1抗體及Nrf-2抗體進行免疫化學染色，分別以光學顯微鏡進行觀察，結果如圖2及圖3所示。

由圖2中以4-HNE抗體進行免疫化學染色之結果顯示，相較於A組來說，可以明顯看出B組小鼠之腎臟組織出現4-HNE蛋白大量表現；並由圖3之結果可知，相較於A組來說，明顯得知B組小鼠之腎臟組織中HO-1蛋白表現量增加，並且Nrf-2蛋白表現量減少。由圖2及圖3之結果顯示B組小鼠之腎臟組織確實已經被破壞，出現因過氧化傷害而產生腎臟損傷之情形。

相較於B組小鼠之腎臟組織來說，C組至E組之各組小鼠腎臟組織病變之情形明顯改善，意即C組至E組之各組小鼠腎臟組織中4-HNE與HO-1蛋白表現量明顯下降，且Nrf-2蛋白表現量係較高。由此結果顯示投予本發明所揭豬腎水解產物係能夠達到有效地減緩或預防腎臟發炎或其引發相關疾病之功效，並且，隨著投予劑量增加而改善腎臟發炎之效果越佳。

無

圖1係為本發明所揭豬腎水解產物以LC管柱進行分析之結果。 圖2係為各組小鼠腎臟經蘇木紫與伊紅及4-HNE抗體進行染色之結果，顯微鏡倍率為10X40。 圖3係為各組小鼠腎臟經HO-1抗體及Nrf-2抗體進行免疫化學染色分析之結果，顯微鏡倍率為10X40。

Claims (4)

1. 一種將豬腎水解產物用於製備治療或預防腎發炎之組合物之用途，其中，該豬腎水解產物係以下列步驟所製得者：步驟a：取一豬腎，以一醋酸進行萃取，得到一萃取產物；步驟b：以一腸系膜芽孢桿菌(Bacillus mesentericus)水解該萃取產物，得到該豬腎水解產物。
2. 如請求項1所述用途，其中，該組合物係能用以降低血中尿素氮及肌酸酐之濃度。
3. 如請求項1所述用途，其中，該組合物係能用以降低腎臟內4-HNE蛋白及/或HO-1蛋白之表現。
4. 如請求項1所述用途，其中，該組合物係能用以提升腎臟內Nrf-2蛋白之表現。

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