CN115925986A - 一种重组融合弹性蛋白、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术与医用材料领域，具体涉及一种重组融合弹性蛋白、制备方法及应用。所述重组融合弹性蛋白包括弹性蛋白序列与Sc12蛋白折叠结构域，弹性蛋白的氨基酸序列完全来自于人弹性蛋白；所述重组融合弹性蛋白在大肠杆菌工程菌中高效表达，易于实现规模化生产；所述重组融合弹性蛋白具有与天然弹性蛋白相似的可逆相变特性；所述重组融合弹性蛋白交联形成具有良好力学强度的水凝胶，具有高生物相容性和生物活性；所述重组融合弹性蛋白水凝胶对皮肤光损伤具有显著的修复功效，在皮肤修复敷料、植入剂、人工皮肤、生物材料、医疗器械等领域有广泛的应用前景。

Description

一种重组融合弹性蛋白、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及到基因工程技术与医用材料领域，具体涉及到一种重组融合弹性蛋白、制备方法及应用。

背景技术

弹性蛋白是人体中广泛存在的一种结构蛋白，赋予血管、韧带、皮肤等重要器官弹性和柔韧性。不同于其他的蛋白质，弹性蛋白具有独特的可逆相变性质，即在受热时聚集形成沉淀，冷却后重新溶解。天然弹性蛋白中的赖氨酸在酶催化作用下发生交联，形成有序的网孔结构。弹性蛋白交联凝胶可以作为组织再生支架，为细胞生长提供有益的微环境，在医用材料领域备受关注。

动物组织提取是目前弹性蛋白制备的主要手段之一。发明专利CN 104710635B公开了一种动物源弹性蛋白的提取方法，通过对牛颈部韧带中的弹性蛋白进行降解，制备得到α弹性蛋白碎片，破坏了天然弹性蛋白的结构和功能。同时，动物来源的弹性蛋白存在免疫原性、疾病传播风险等问题。

基因工程技术具有成本低、易于规模化生产、无病毒传播隐患等优点，因此被尝试用来制备弹性蛋白。在发明专利CN102241747A中，构建了以(VAPGVG)₃S为基本单元并高度重复的弹性蛋白序列，实现了该序列在大肠杆菌ER2566中的表达；但该弹性蛋白序列只是VAPGVG的简单重复，与天然弹性蛋白的氨基酸序列存在巨大差异，并且不具备形成凝胶的能力。

为了解决上述问题，本发明提供了一种重组融合弹性蛋白(Recombinant FusionElastin，RFE)、制备方法及应用，所述重组融合弹性蛋白包括弹性蛋白序列与Sc12蛋白折叠结构域，弹性蛋白的氨基酸序列完全来自于人弹性蛋白，Sc12蛋白折叠结构域能够促进弹性蛋白的表达，并有助于稳定弹性蛋白聚合物的结构；所述重组融合弹性蛋白在大肠杆菌工程菌中高效表达，易于实现规模化生产；所述重组融合弹性蛋白具有与天然弹性蛋白相似的可逆相变特性；所述重组融合弹性蛋白交联形成具有良好力学强度的水凝胶，具有高生物相容性和生物活性。所述重组融合弹性蛋白水凝胶对皮肤光损伤具有显著的修复功效，在皮肤修复敷料、植入剂、人工皮肤、生物材料、医疗器械等领域有广泛的应用前景。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种重组融合弹性蛋白、制备方法及应用，具体方案包括：

第一方面，本发明提供了一种重组融合弹性蛋白，所述重组融合弹性蛋白的主体由如SEQ ID NO.1所示的人源全长弹性蛋白氨基酸序列中的一个或多个弹性蛋白结构域构成；同时，在序列中两末端添加调控蛋白结构与功能的氨基酸序列，以调控蛋白的结构、表达和功效；所述调控蛋白结构与功能的氨基酸序列不具有弹性蛋白序列特征。

优选地，所述调控蛋白结构与功能的氨基酸序列为Sc12蛋白折叠结构域，所述Sc12蛋白折叠结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述重组融合弹性蛋白包括如SEQ ID NO.1所示的人源全长弹性蛋白中的至少一个弹性蛋白结构域，并在N端添加Sc12蛋白折叠结构域；所述Sc12蛋白折叠结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述弹性蛋白结构域由人弹性蛋白序列中编号为20-24的结构域连接或周期性重复组成。

优选地，所述弹性蛋白结构域由至少一个SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列串联组成。

优选地，所述弹性蛋白结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，所述重组融合弹性蛋白由弹性蛋白的结构域和Sc12蛋白折叠结构域组成，所述Sc12蛋白折叠结构域位于弹性蛋白结构域的N端。

优选地，所述重组融合弹性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

第二方面，本发明提供了一种编码上述第一方面所述重组融合弹性蛋白的核苷酸。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

第三方面，本发明提供了一种含有上述第二方面所述核苷酸的重组质粒、重组载体或重组细胞。

优选地，所述载体包括pCold III。

优选地，所述重组细胞为重组大肠杆菌BL21。

第四方面，本发明提供了一种上述第一方面所述重组融合弹性蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)合成编码上述第一方面所述重组融合弹性蛋白的核苷酸序列；

(2)将步骤(1)所述基因与载体/质粒连接，转化细菌，构建重组基因工程菌；

(3)表达步骤(2)构建的重组基因工程菌，收集菌体沉淀，破碎得上清液，纯化获得重组融合弹性蛋白。

优选地，所述方法包括如下步骤：

(1)合成SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；

(2)将步骤(1)所述核苷酸序列插入pColdIII质粒，构建重组载体；并导入大肠杆菌BL21中，筛选获得重组细菌；

(3)将重组细菌转入LB培养基中，37℃扩大培养10-12h，当OD₆₀₀到达0.8-1.0时，加入1mM IPTG，同时降温至25℃，诱导表达12-18h；离心收集发酵菌体沉淀，破碎得上清液，纯化获得重组融合弹性蛋白。

第五方面，本发明提供了上述第一方面所述的重组融合弹性蛋白在制备护肤品、皮肤修复敷料、植入剂、人工皮肤、医疗器械、保健食品中的应用。

第六方面，本发明提供了一种重组融合弹性蛋白材料，所述重组融合弹性蛋白材料包括以下质量分数的组分：上述第一方面所述重组融合弹性蛋白1-50％；交联剂0-5％，其余成分为水或者赋型剂。

优选地，交联剂包括戊二醛、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)、四羟甲基氯化磷、京尼平。

优选地，所述交联剂为四羟甲基氯化磷。

优选地，赋形剂包括透明质酸、琼脂糖、壳聚糖。

第七方面，本发明提供了上述第六方面所述重组融合弹性蛋白材料在制备皮肤损伤修复产品中的应用。

第八方面，本发明提供了一种重组融合弹性蛋白凝胶，所述重组融合弹性蛋白凝胶包括以下组份：上述第一方面所述重组融合弹性蛋白1-50％，四羟甲基氯化磷0.5-5％，其余成分为去离子水或生理盐水。

第九方面，本发明提供了上述第八方面所述重组融合弹性蛋白凝胶在制备皮肤损伤修复产品中的应用。

本发明的有益效果是：

(1)本发明构建并制备了一种重组融合弹性蛋白，其序列包括人弹性蛋白序列与Sc12折叠结构域；所述Sc12折叠结构域能够促进弹性蛋白的表达，同时增加弹性蛋白二级结构的有序程度，并有助于稳定弹性蛋白聚合物的结构。

(2)所述重组融合弹性蛋白具有与天然弹性蛋白相似的可逆相变特性，相变温度接近人弹性蛋白。

(3)所述重组融合弹性蛋白克服了动物组织提取弹性蛋白病毒传播隐患、免疫原性等问题。

(4)所述重组弹性融合蛋白具有良好的生物相容性和水溶性，方便在化妆品以及皮肤修复敷料中添加使用；

(5)所述重组弹性融合蛋白在大肠杆菌工程菌中高效表达，易于实现规模化生产。

(6)本发明开发了一种重组融合弹性蛋白凝胶。所述凝胶制备方法简单，条件温和，适于大规模批量化生产。

(7)所述重组融合弹性蛋白凝胶对于皮肤的紫外损伤具有显著的修复作用，可以明显减轻光损伤皮肤的炎症症状；将所述凝胶制备成敷料、贴片等易于贴敷于皮肤表面使用的药品、医疗器械或化妆品，可方便保存及使用。

附图说明

图1重组融合弹性蛋白的SDS-PAGE；

图2Sc12蛋白折叠结构域对重组融合弹性蛋白表达与聚集行为的影响；其中a为重组融合弹性蛋白RFE和不含有Scl2蛋白折叠结构域的重组弹性蛋白RE的SDS-PAGE；b为不同温度下重组融合弹性蛋白RFE与重组弹性蛋白RE的天然电泳对比；

图3重组融合弹性蛋白RFE不同温度的圆二色谱图；

图4重组融合弹性蛋白RFE的可逆相变；其中a为不同浓度的重组融合弹性蛋白RFE的可逆相变曲线；b为相变点T_t与蛋白浓度对数的关系曲线；

图5重组融合弹性蛋白RFE凝胶的性质表征；其中a为重组融合弹性蛋白RFE交联凝胶的实物照片；b为重组融合弹性蛋白凝胶的扫描电子显微镜图像；c为重组融合融合蛋白凝胶的频率扫描流变力学，d为重组融合弹性蛋白凝胶的应变扫描流变力学；

图6重组融合弹性蛋白RFE凝胶的细胞活性；其中a为重组融合弹性蛋白RFE凝胶的细胞毒性；b为重组融合弹性蛋白RFE凝胶的细胞增殖；c为重组融合弹性蛋白RFE凝胶的细胞黏附染色成像；

图7为重组融合弹性蛋白RFE凝胶对小鼠紫外损伤皮肤的修复功能；其中a为对照组，空白组、实验组小鼠第1、3、5、7天皮肤宏观拍照；b为空白组、对照组、实验组小鼠第1、3、5、7天皮肤组织的HE染色结果；c为空白组、对照组、实验组小鼠第1、3、5、7天皮肤组织的Masson染色结果。

具体实施方式

以下具体结合实施例进一步描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

以下实施中所述的重组融合弹性蛋白，是利用转基因技术和基因重组技术在微生物表达体系中获得的，弹性蛋白与具有其他功能类型的蛋白所构成的融合蛋白。该蛋白保留了弹性蛋白的特征性质。

以下实施例中所述的重组融合弹性蛋白为大肠杆菌发酵获得的重组融合弹性蛋白，但不局限于上述方法，也可以为其他方法制备的、以弹性蛋白为序列主要构成部分的融合蛋白，包括毕赤酵母发酵的重组融合弹性蛋白、无细胞(Cell-Free)体外表达的重组融合弹性蛋白等。

具体的，以下实施例中所述重组融合弹性蛋白的制备方法包括：构建大肠杆菌工程菌进行发酵生产，发酵结束后离心取上清液，分离、纯化获得重组融合弹性蛋白。

以下实施例中所述的重组融合弹性蛋白凝胶的方法包括：加热一定浓度的重组融合弹性蛋白溶液，使蛋白发生弹性蛋白特征的可逆相变进行预聚，趁热加入交联剂THPC(四羟甲基氯化磷，下同)，一定条件下反应后，去除反应残留物，获得具有一定机械强度的弹性蛋白凝胶；但不局限于上述方法，也可以为其他的交联方法，包括光交联，热交联，以及京尼平交联、BDDE交联、EDC-NHS交联为代表的化学交联等。

实施例1重组融合弹性蛋白的制备

1.重组融合弹性蛋白序列的表达载体构建

合成编码如SEQ ID NO.5所示重组融合弹性蛋白核苷酸序列，构建导入上述核酸的pCold III重组质粒，通过DNA测序确认质粒成功合成；将重组质粒转化至大肠杆菌BL21-DE3菌株，获得重组融合弹性蛋白表达菌株，转化成功的菌株加入甘油后，保存于-80℃冰箱。

2.重组融合弹性蛋白大肠杆菌的诱导表达

将包含重组融合弹性蛋白表达基因的大肠杆菌接种至包含有50mg/L硫酸卡那霉素的固体LB培养基上对重组大肠杆菌进行预表达和筛选，筛选出的单菌落接种到液体LB培养基(200mL添加50mg/L硫酸卡那霉素)中，恒温摇床37℃，250rpm培养12h，然后将菌种转入4×1L的LB培养基，37℃，250rpm扩大培养10-12h，通过取样测量培养基在波长600nm处的吸光度(OD₆₀₀)，用以监测菌种生长密度，当OD₆₀₀到达0.8-1.0时，加入终浓度为1mM IPTG，同时降温至25℃，250rpm诱导表达12-18h。离心收集发酵菌体。

3.重组融合弹性蛋白的镍柱纯化

将上述步骤2中所得大肠杆菌菌体以1:15的体积比重悬于磷酸盐缓冲液(phosphate Buffer，0.02M，pH＝7.4)，在低温水冷却循环条件下，利用高压均质机破碎细胞，使大肠杆菌内部的重组蛋白释放到缓冲溶液中，4℃，10000rpm离心20min分离细胞碎片沉淀，保留上清，微孔滤膜过滤去除残留不溶性杂质；His-trap镍离子亲和层析柱(25mL)中加入等体积的样品，振荡柱体使带有6×His标签的目的蛋白与柱填料充分结合，然后用洗脱缓冲液(0.02M PB，0.5M NaCl，咪唑)冲洗5-8个柱体积，洗脱缓冲液中咪唑的含量呈阶梯状(20mM、50mM和500mM)增加，以洗脱蛋白质。收集500mM咪唑浓度下的出峰蛋白。所得到的蛋白溶液，于4℃下用0.02M PB缓冲或超纯水透析，截留分子量大于8000的目的蛋白，除去蛋白溶液中的咪唑、NaCl等成分，并冻干。

纯化所得蛋白样品的SDS-PAGE检测结果如图1所示，呈现单一条带，表明制备得到高纯度的蛋白样品。根据Marker指示，目的蛋白分子量在25-35kDa之间，与理论分子量相符。这些结果表明，成功制备高纯度的重组融合弹性蛋白(RFE)。

实施例2 Sc12蛋白折叠结构域对重组融合弹性蛋白的性质影响

1.Sc12蛋白折叠结构域对蛋白表达量的影响

按照实施例1中的大肠杆菌培养方法，在相同条件下，对导入了重组质粒RFE的大肠杆菌与RE(Recombinant Elastin，仅含有弹性蛋白结构域)的大肠杆菌进行培养、诱导表达与纯化。对诱导后两种大肠杆菌的总蛋白，以及通过相同的纯化方法后所得的高纯度重组弹性蛋白进行SDS-PAGE分析，以比较两种重组蛋白的表达量差异。

结果如图2中a所示，重组融合弹性蛋白(RFE)的表达量明显高于不含有Sc12蛋白折叠结构域的重组弹性蛋白(RE)，表明Sc12蛋白折叠结构域对于弹性蛋白的表达具有显著的促进作用。

2.重组融合弹性蛋白的天然电泳

采用天然凝胶电泳(Native-PAGE)对不同温度下孵育并恢复至室温的重组融合弹性蛋白RFE进行分析。同时以相同条件下的重组弹性蛋白RE作为对比，通过比较二者的不同温度下分子量的变化来确认Sc12蛋白折叠结构域对于调控重组融合弹性蛋白聚集行为的影响。

Native-PAGE结果见图2中b所示，重组融合弹性蛋白RFE在低温孵育并恢复至室温后呈现单一条带，与单链的分子量相符；随着孵育温度升高，RFE开始出现一个新的大分子量的条带，与三聚体的分子量相符，并同时出现更高分子量的多聚物条带，三聚体和多聚物对应条带的强度随着孵育温度的升高而不断增大，与此同时，RFE的单分子量条带强度不断减弱。与此相反，不含有Sc12蛋白折叠结构域的弹性蛋白RE在不同温度下孵育并恢复至室温后，均维持单分子条带。这些结果表明，重组融合弹性蛋白在加热过程中形成了三聚体和其他聚合物，恢复至室温，这些聚集体能够稳定存在，说明Scl2蛋白折叠结构域具有稳定重组融合弹性蛋白聚集体的作用。

实施例3重组融合弹性蛋白的性质研究

1.重组融合弹性蛋白的圆二色谱

将实施例1中所得的重组融合弹性蛋白固体，配置成1.0mg/mL的水溶液，然后4℃静置24h以上，用1mm的比色皿，在4、25、30、37、50℃下进行圆二色谱全波长扫描，波长从190nm到260nm，波长间隔1nm，每个波长下停留5s。

结果如图3所示，在较低的温度下，所设计的重组融合弹性蛋白在200nm附近有一强烈负峰，而在220nm附近有一中等强度的正峰，随着温度升高，两个特征吸收峰强度均不断减弱。通过软件分析谱峰中各类二级结构的占比(见表1)。

表1不同温度下重组融合弹性蛋白中各类二级结构占比

Temperature(℃)	α-helix(％)	β-spiral(％)	β-turn(％)	Disordered(％)
					4	9.1±3.5	14.2±0.3	32.0±3.7	43.2±6.7
25	8.4±2.1	22.6±3.1	25.8±6.4	45.4±5.8
					30	7.4±2.9	28.7±1.5	18.3±1.8	46.1±4.0
37	6.9±2.0	31.8±4.6	13.8±5.8	48.1±5.2
					50	6.7±3.5	33.7±2.9	11.4±1.9	51.1±4.3

由构象分析结果可知，当温度在4-50℃范围内，随温度升高，重组融合弹性蛋白构象中的无序结构占比基本保持不变，β转角占比由32％减小至11％。β螺旋构象占比从14％增加至34％。与文献报道结果相比，有序结构(β折叠，β转角)的占比明显高于天然弹性蛋白。这表明Sc12蛋白折叠结构域增加了重组融合弹性蛋白二级结构的有序性。

2.重组融合弹性蛋白可逆相变

将实施例1中所制得的重组融合弹性蛋白RFE溶于相变缓冲溶液(0.5M NaCl，0.1MCaCl₂，50m M tris，0.02M PB，pH＝7.4)，使蛋白终浓度分别为5、25、50、75、100mM，将重组融合弹性蛋白相变溶液置于恒温水浴槽中，以室温(25℃)为起始温度加热，待溶液升温达到稳定后，以室温下的蛋白溶液为参比，测量到达恒温后的蛋白溶液在波长350nm下的吸光度，之后将温度升高，升温间隔2.5℃，平衡5min，直至吸光度基本不再增加。将加热后的溶液冷却降温，蛋白重新溶解，恢复至加热前的状态，完成一次可逆相变循环。

不同浓度的重组融合弹性蛋白溶液吸光度-温度的关系曲线如图4中a所示，相变过程中溶液吸光度达到最大时对应温度为可逆相变温度(T_t)，100μM的重组融合弹性蛋白可逆相变温度约为34℃，50μM的重组融合弹性蛋白可逆相变温度约为38℃，25μM的重组融合弹性蛋白可逆相变温度约为41℃，10μM的重组融合弹性蛋白可逆相变温度为45℃，5μM的重组融合弹性蛋白可逆相变温度为46℃。对相变温度和蛋白浓度的对数作图(图4中b所示)，二者呈线性负相关，符合弹性蛋白相变聚集的理论模型。以上结果表明，该重组融合弹性蛋白与天然弹性蛋白具有相似的热变温特性。

实施例4重组融合弹性蛋白凝胶的制备与应用

1.凝胶的制备

称取一定质量的实施例1所得重组融合弹性蛋白，溶解于0.02M PBS缓冲，配置成终浓度100μM的弹性蛋白水溶液，37℃下孵育，使弹性蛋白受热聚集，溶液整体吸光度增加；振荡该浊液，使蛋白分散均匀后，注入模具，趁热加入终浓度为0.75％的THPC，室温下静置，形成凝胶，将凝胶浸泡于超纯水中，静置12h，并换液3-5次，除去残余未反应的交联剂与蛋白。制备得到的凝胶宏观实物图如图5中a所示。

2.凝胶的SEM

将上述步骤1中制备的凝胶，冻干后切片，粘附在样品盘上，置于Hitachi S-4800扫描电子显微镜下观察，结果如图5中b所示，凝胶呈有序排列的纤维网孔状结构，孔径约50-100μm，为细胞提供有益的生长环境。

3.凝胶的流变力学

将反应后的凝胶从模具中谨慎取出，将其置于安东帕流变仪的样品台上。频率扫描：设置流变仪的应变参数为1％，应力设置为1N。测试随扫描频率变化的凝胶的储能模量G’(Pa)及损耗模量G”(Pa)大小。应变扫描：固定扫描频率为1rad/s，测试随剪切应变变化的储能模量G’(Pa)。

凝胶流变力学的频率扫描测试结果如图5中c所示，随着剪切频率的不断增大，重组融合弹性蛋白RFE凝胶的储能模量(G’)和压缩模量(G”)均逐渐上升，且模量增长速率不断增大，呈现典型的水凝胶类材料的应变特征。在90rad/s或更高的剪切频率下，储能模量可达2×10³pa，证明该凝胶有着良好的力学强度。应变扫描实验结果如图5中d所示，重组融合弹性蛋白RFE凝胶的储能模量逐渐降低，当剪切应变超过60％以后，储能模量趋于平稳。结果表明，随应变增加，材料的黏度不断降低，符合凝胶所具有的剪切稀释行为的典型特征。

4.凝胶的细胞活性

(1)细胞毒性

称取一定量的重组融合弹性蛋白RFE冻干粉末，溶于少量无菌水，配置成蛋白浓溶液，再将蛋白浓溶液通过0.22μm水相滤膜过滤，之后加入一定量的DMEM细胞培养基稀释，使蛋白终浓度为100μM，将该重组融合弹性蛋白溶液加入TC处理的96孔板中，使溶液均匀覆盖孔板底部，再加入THPC无菌水溶液进行交联，使THPC终浓度为0.1-2.0％，孔板放置于超净台内室温下交联，待孔板底层蛋白完全凝固成凝胶后，100μL 0.067M PBS浸洗凝胶3次后待用。加入DMEM细胞培养液浸润3h后，加入100μL 5000个/mL经胰蛋白酶消化并分散均匀的HFF-1细胞，孔板放入细胞培养箱，37℃下培养24h。加入CCK-8孵育30min后，通过酶标仪测定每孔的吸光度对细胞数目进行定量。空白组为不加入细胞的凝胶，对照组为底部不含有凝胶的等量细胞培养液(含细胞)。

细胞毒性结果见图6中a，相比于对照组，不同浓度THPC交联的凝胶表面，各组的细胞存活率均大于95％，表明重组融合弹性蛋白凝胶无细胞毒性，具有良好的生物相容性。

(2)细胞增殖

取一定量的重组融合弹性蛋白冻干粉末，溶于少量无菌水，配置成蛋白浓溶液，再将蛋白浓溶液通过0.22μm水相滤膜过滤，之后加入一定量的DMEM细胞培养基稀释，使蛋白终浓度为100μM，将100μL该重组弹性蛋白溶液加入TC处理的96孔板中，使溶液均匀覆盖孔板底部，再加入THPC无菌水溶液进行交联，使THPC终浓度为0.75％分次加入去离子水、0.02M PBS、TEMED培养基浸润凝胶，以除去残留未反应的蛋白和交联剂；每孔内接种500个HFF细胞，置于培养箱内37℃培养，每48h更换一次细胞培养液，防止细胞代谢产物累积。每24h加入CCK-8，对每组凝胶表面的活细胞数目进行定量。

细胞增殖结果如图6中b所示，相比于未加入凝胶的对照组，加入了重组融合弹性蛋白凝胶的实验组第1-2天增殖率略大于100％，第3-4天，细胞增殖率增加至150％以上，第5-7天细胞增殖率超过200％。这表明重组融合弹性蛋白凝胶对于细胞的增殖有显著的促进作用。

(3)细胞黏附染色

将包含100μM重组融合弹性蛋白的DMEM培养基溶液倒入若干个未TC处理的玻底培养皿中，使蛋白溶液完全覆盖培养皿底部，加入终浓度为0.75％的THPC溶液，超净台中静置3h；待交联完毕后，加入PBS润洗三遍，再加入DMEM培养基浸润待用。加入100μL 5000个/mL经胰蛋白酶消化并分散均匀的HFF-1细胞。细胞培养箱37℃培养，每48h更换一次细胞培养液，防止细胞代谢产物累积。分别在第1、4、7天取出，加入4％甲醛固定10min后吸出，0.1％Triton-X通透5min，1％BSA封闭30min，加入鬼笔环肽对细胞质进行染色，再加入Hoechest33258染色细胞核；凝胶表层涂覆封片剂，于荧光显微镜下观察凝胶表面所黏附的HFF-1细胞数目与形态。

细胞黏附染色结果如图6中c所示，在凝胶上层加入细胞后第1天，成纤维细胞在凝胶表面正常黏附伸展。培养至第4天，细胞数量较第1天有明显增加，细胞分布较为均匀，形态完整。第7天，凝胶表面细胞密度进一步增大，基本全部被细胞覆盖。这些结果表明，重组融合弹性蛋白凝胶具有良好的生物活性。

5.凝胶的动物损伤修复实验

取45只20±2g的SPF级昆明小鼠，雄性，飞利浦理发器对小鼠背部进行剃毛，再涂敷脱毛膏进行脱毛，使背部表皮完全裸露，脱毛区域约为2×4cm，脱毛完成后，稳定24h，以排除脱毛膏对表皮损伤的影响。小鼠随机分为三组，空白组不做处理，实验组和对照组用连续波长的紫外灯A(320-440nm)和B(280-320nm)照射小鼠背部，紫外辐照计对辐射进行定量，为200mJ/cm²，紫外线照射后，小鼠背部褪毛部位出现大面积红肿，说明成功造成小鼠的急性皮肤炎症。将凝胶贴敷于实验组小鼠背部皮肤的紫外灯照射区域，覆盖纱布，再用绷带固定防止凝胶在小鼠活动过程中脱落，每48h更换一次凝胶贴片并重新固定；对照组对小鼠背部涂敷生理盐水后，覆盖纱布，绷带固定；空白组不进行紫外灯照射与纱布包覆。造模后第一天起每48h对小鼠进行脱臼处死，取背部褪毛处皮肤保存于福尔马林溶液。对皮肤切片分别进行HE染色与Masson染色。显微镜下观察皮肤损伤与恢复情况。

空白组、对照组、实验组的皮肤宏观实物照片如图7中a所示。空白组小鼠皮肤第1-7天皮肤始终保持健康状态，表面光滑平整，无红肿区域。对照组小鼠小鼠背部皮肤第1天产生局部不均匀红肿；第3-5天出现大量红色丘疹；第7天仍有少量的局部红肿，且伴随有局部干裂脱皮现象。实验组小鼠背部皮肤第1天出现部分红肿现象，第3天红肿区域面积减少，表面产生皱褶，同时伴随少量红斑状丘疹。第5天红肿基本消退，皮肤皱褶情况明显改善，同时伴随局部表皮脱落现象，第7天皮肤恢复状况良好，表面光滑平整，与正常组小鼠皮肤无明显差异。这些结果表明，重组融合弹性蛋白对小鼠的皮肤光损伤有明显的修复作用，能显著缩短光损伤皮肤的修复周期。

空白组、对照组、实验组的HE染色结果如图7中b所示，空白组小鼠在第1-7天，表皮与真皮层全层可见，结构完整，各附属器数目及形态正常，组织纤维分布均匀。对照组第1天，网织层产生部分炎症反应，表皮层明显受损变薄；第3天表皮层纤维明显增粗且数量减少，同时部分纤维出现不规则断裂；网织层局部水肿，伴随有大量的炎性细胞浸润；第5天开始缓慢恢复，但皮肤组织受损仍较为明显；第7天皮肤组织整体受损仍较为明显，同时伴有局部表皮层异常增生、局部纤维断裂与异常沉积。实验组小鼠的背部皮肤第1天，网织层炎症反应与表皮层受损程度相较于对照组均有所减轻；第3天小鼠表皮层损伤程度相比第1天进一步加深，结构不完整，局部基底层受损，真皮局部疏松水肿，少量炎性细胞浸润，毛囊受损；第5天表皮层受损减轻，结构完整度较第三天有所改善，真皮疏松程度有所降低，炎性细胞数目减少；第7天小鼠皮肤组织基本恢复正常，表皮与真皮层全层可见，结构完整，各附属器数目及形态正常，组织纤维分布均匀，与正常皮肤组织结构无显著性差异。

空白组、对照组、实验组的Masson染色结果如图7中c所示，空白组小鼠皮肤第1-7天真皮乳头层胶原纤维纤长，相互交织成网，各分泌腺与血管被纤维网状胶原包裹环绕，网状层胶原纤维束粗大且呈现波浪状起伏，同一水平面上沿各向延伸，成纤维细胞均匀分布于胶原纤维间隙。对照组小鼠第1天真皮层胶原纤维排列紊乱、数目锐减、纤维变粗、卷曲扭结、部分聚集成团，同时大量产生断裂、破碎，炎性细胞浸润于纤维间隙；第3天真皮层损伤加剧，纤维进一步增粗且聚集成块，断裂更加严重，炎性细胞浸润数目进一步增加；第5天真皮层胶原纤维受损情况有所缓解，但依然存在部分聚集成块与断裂现象，纤维排列疏松，断裂部分开始修复，但整体仍严重缺损；第7天，真皮层胶原纤维数目开始增多，同一水平面上新生纤维开始沿各项延伸，但皮肤组织整体仍存在部分缺损。实验组小鼠第1天真皮层部分胶原纤维排列紊乱，数目减少，部分纤维变粗、卷曲扭结，部分聚集成团，同时大量产生断裂、破碎，炎性细胞浸润于纤维间隙；第3天真皮层损伤有所减轻，部分胶原纤维排列紊乱，少量存在胶原纤维增粗并聚集成块的现象，炎性细胞浸润程度与第1天基本相当；第5天，真皮层受损情况进一步减轻，胶原纤维断裂处出现纤细的新生胶原纤维并在同一水平面上各向延伸，炎性细胞数目减少，纤维排列疏松程度减轻；第7天，真皮乳头层胶原纤维纤长，相互交织成网，各分泌腺与血管被纤维网状胶原包裹环绕，网状层胶原纤维束粗大且呈现波浪状起伏，同一水平面上沿各向延伸，成纤维细胞均匀分布于胶原纤维间隙。

综上所述，本发明所述的重组融合弹性蛋白凝胶，能够抑制皮肤的炎症反应，促进损伤皮肤中胶原蛋白的再生，对于紫外光损伤皮肤具有良好的修复效果。本实验中的光损伤均为200mJ/cm²的紫外辐射造成的损伤，由此我们可以推论其他类型所造成的、至少是同等强度的损伤都可以应用本凝胶进行治疗，减轻损伤程度并加快皮肤组织恢复，比如激光、红光、蓝光等不同来源的电磁辐射。

以上所述仅为本发明的个别示范性实施案例的细节，对于本领域的相关技术人员，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组融合弹性蛋白，其特征在于，所述重组融合弹性蛋白的主体由如SEQ IDNO.1所示的人全长弹性蛋白氨基酸序列中的一个或多个弹性蛋白结构域构成；同时，在序列末端添加调控蛋白结构与功能的氨基酸序列，以调控蛋白的结构、表达和功效；所述调控蛋白结构与功能的氨基酸序列不具有弹性蛋白序列特征。

2.如权利要求1所述的重组融合弹性蛋白，其特征在于，所述调控蛋白结构与功能的氨基酸序列为Sc12蛋白折叠结构域，所述Sc12蛋白折叠结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述弹性蛋白结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.如权利要求2所述的重组融合弹性蛋白，其特征在于，所述重组融合弹性蛋白由弹性蛋白的结构域和Sc12蛋白折叠结构域组成，所述Sc12蛋白折叠结构域位于弹性蛋白结构域的N端；所述重组融合弹性蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.一种编码权利要求1-3任一所述重组融合弹性蛋白的核苷酸。

5.如权利要求4所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

6.一种含有权利要求4或5所述核苷酸的重组质粒、重组载体或重组细胞。

7.如权利要求1-3任一所述的重组融合弹性蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)合成编码权利要求1-3任一所述重组融合弹性蛋白的核苷酸序列；

(2)将步骤(1)所述基因与载体/质粒连接，转化细菌，构建重组基因工程菌；

(3)培养步骤(2)构建的重组基因工程菌，并诱导表达，收集菌体沉淀，破碎得上清液，纯化获得重组融合弹性蛋白。

8.一种重组融合弹性蛋白材料，其特征在于，所述重组融合弹性蛋白材料包括以下质量分数的组分：权利要求1-3任一所述重组融合弹性蛋白1-50％；交联剂0-5％，其余成分为水或赋形剂。

9.一种重组融合弹性蛋白凝胶，其特征在于，所述重组融合弹性蛋白凝胶包括以下组份：权利要求1-3任一所述重组融合弹性蛋白1-50％，四羟甲基氯化磷0.5-5％，其余成分为去离子水或生理盐水。

10.如权利要求1-2任一所述的重组融合弹性蛋白，或权利要求8所述的重组融合弹性蛋白材料，或权利要求9所述重组融合弹性蛋白凝胶在制备皮肤损伤修复产品中的应用。所述产品包括护肤品、皮肤修复敷料、植入剂、人工皮肤、医疗器械、生物材料。

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