CN114848833A - 一种脱细胞基质胶辅助细胞递送扭转视功能的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脱细胞基质胶辅助细胞递送扭转视功能的方法，包括，步骤S1，制备猪眼葡萄膜来源脱细胞基质胶；步骤S2，制备hiPSC‑RPE细胞；步骤S3，鉴定脱细胞基质胶体外细胞生物相容性；步骤S4，当脱细胞基质胶体外细胞生物相容性符合预设标准，将脱细胞基质胶辅助细胞体内移植，用以辅助递送药物。解决细胞体内移植后存活率低的问题。其中，葡萄膜组织脱细胞基质来源的水凝胶(Uvea‑Gel)包含大量的活性细胞基质分子，可以更好地模拟天然RPE的生长环境，因此通过注射水凝胶辅助递送细胞到视网膜内，可以保护移植细胞避免遭受免疫细胞攻击，同时活性生物分子促细胞在供体内存活和分化，并整合到宿主的视网膜，提高了细胞治疗效果。

Description

一种脱细胞基质胶辅助细胞递送扭转视功能的方法
技术领域
本发明涉及辅助细胞递送领域，尤其涉及一种脱细胞基质胶辅助细胞递送扭转视功能的方法。
背景技术
视网膜退行性疾病，例如老年性黄斑病变和视网膜色素病变，导致失明而且视觉损伤不可逆转，然而该类疾病目前尚无有效治疗方法。随着多能干细胞诱导生成RPE细胞或视网膜前体细胞(RPC)技术的发展，基于干细胞的移植治疗为该类疾病带来了希望。然而，尽管临床前研究和临床I/II期试验，证实干细胞体内移植治疗的安全性和可行性，但仍面临细胞体内存活率低，存活时间短以及视力改善难维持等难题。
迄今为止，视网膜细胞体内移植的方式有单细胞悬液，RPE膜片，生物材料辅助移植等，单细胞悬液体内存活率低，RPE膜片可以改善细胞体内存活率，但存在手术过程复杂性和要求高等缺陷。因此，可注射型的生物材料辅助递送细胞模式，成为细胞治疗视网膜疾病的最有应用前景的治疗手段。目前，在视网膜应用领域，研究报道的辅助递送生物材料多为人工合成的天然或化学的水凝胶，尚没有脱细胞基质来源的水凝胶作为辅助细胞递送的介质。
中国专利ZL201480027662.6公开了用于细胞递送的生物相容性水凝胶聚合物基体，该生物相容性水凝胶聚合物基体是可生物吸收的并且在目标部位释放细胞，从而实现控制递送，但该方法仍然采用化学方法。
基于此，我们制备了猪葡萄膜脱细胞基质水凝胶，包含大量的生物活性物质，可以更好地模拟天然的Brush’膜微环境，辅助提高递送的hiPSC-RPE细胞在体内的存活和分化，保护炎性环境中退行性光感受器细胞的退化，进而更持久地维持视力改善。
发明内容
为此，本发明提供一种脱细胞基质胶辅助细胞递送扭转视功能的方法，可以提供一种模拟天然微环境辅助提供递送的水凝胶，避免视力退行性光感受器细胞的退化。
为实现上述目的，本发明提供一种脱细胞基质胶辅助细胞递送扭转视功能的方法，包括：
步骤S1，制备猪眼葡萄膜来源脱细胞基质胶；
步骤S2，制备hiPSC-RPE细胞；
步骤S3，鉴定脱细胞基质胶体外细胞生物相容性；
步骤S4，当脱细胞基质胶体外细胞生物相容性符合预设标准，将脱细胞基质胶辅助细胞体内移植，用以辅助递送药物。
进一步地，在所述步骤S1中，所述制备猪眼葡萄膜来源的脱细胞基质胶方法包括将预处理后的猪眼葡萄膜经两轮浸泡后冷冻干燥形成脱细胞基质粉末，脱细胞基质粉末用胃蛋白酶酶解后，与0.1N氢氧化钠溶液中和形成脱细胞基质胶。
进一步地，在所述步骤S1中，制备的脱细胞基质胶判定降解性符合预设标准后进行步骤S2，其中，将制备的脱细胞基质胶稀释成0.5％的浓度的水凝胶，取1ul注射至C57小鼠视网膜下腔，注射后5天，对视网膜进行染色,染色后，经过5-7天后，若视网膜下腔基质颜色完全消失，判定脱细胞基质胶降解性符合预设标准。
进一步地，所述步骤S2，包括步骤S21，将hiPSCs接种于脱细胞基质胶包被的培养板，于mTeSR1(Stem Cell)培养基中维持培养4-5天，选取克隆密度长至约80％-90％底面积时进行传代。
进一步地，所述步骤S2,包括步骤S22，将维持培养后的hiPSCs采用0.5mM的EDTA消化为小细胞团，向小细胞团内加入含有10μM的Blebbistatin的培养液，并将其转移至低吸附皿中，于37℃培养过夜，24h后可见EBs形成，将形成的EBs连续保持悬浮培养6天后诱导分化，其中，EBs培养第一天培养液替换为25％NIM和75％mTeSR1，EBs培养第二天培养液替换为50％NIM和50％mTeSR1，EBs培养第三天，将EBs转移到到含有NIM培养液培养3天，EBs培养第6-7天，将EBs重新接种在用脱细胞基质胶包被的培养皿中，开始贴壁培养诱导分化，诱导分化25天，富集形成RPE球。
进一步地，所述步骤S2包括步骤S23，将富集的RPE球悬浮培养8周后分成若干小块，将小块RPE球于37℃条件下，用dispase II孵育5-10min，解离成单细胞悬液，将单细胞悬液接种在0.1％的Uvea-Gel包被的培养板中进行扩增。
进一步地，在所述步骤S3中，hiPSC-RPE细胞分别接种到常规的Matrigel和新制备的Uvea-Gel包被板上，细胞贴壁生长3-5天后，加入FDA和PI后，获取活细胞与死细胞比例，当活细胞与死细胞比例符合预设标准，判定Uvea-Gel的细胞相容性合格。
进一步地，当判定Uvea-Gel的细胞相容性合格时，将获得的hiPSC-RPE细胞溶解到0.5％浓度的Uvea-Gel中，将细胞浓度调整为1×105细胞/μL，用33G的微量注射器吸取1μL细胞悬液，注射到视网膜下腔，当观察到视网膜下腔鼓起一个空泡，代表细胞注射成功。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于，本发明提供一种具有辅助细胞递送功能的水凝胶，其根据猪葡萄膜制备脱细胞基质胶，解决细胞体内移植后存活率低的问题。葡萄膜组织脱细胞基质来源的水凝胶(Uvea-Gel)包含大量的活性细胞基质分子(例如，胶原，层粘连蛋白等)，可以更好地模拟天然RPE的生长环境；同时其具有可注射性。因此通过注射水凝胶辅助递送细胞到视网膜内，可以保护移植细胞避免遭受免疫细胞攻击，同时活性生物分子促细胞在供体内存活和分化，并整合到宿主的视网膜，提高了细胞治疗效果。
尤其，本发明通过对实验小鼠视网膜下腔注射水凝胶，经过一段时间后染色严重制备的Uvea-Gel的体内可降解性，以及体外良好的生物相容性，证明本发明的水凝胶适用于体内移植载体用。
尤其，采用Uvea-Gel辅助细胞递送模式，能够有效地提高了细胞的体内存活率，分化和整合能力，并进一步保护供体光感受器细胞的退化。
尤其，本发明制备的Uvea-Gel具有很好的安全性，可以开发为临床级别应用的细胞递送剂，或者实现更大的应用价值，开发药物辅助递送系统。
尤其，猪葡萄膜脱细胞基质水凝胶(Uvea-Gel)辅助细胞递送体内，为治疗视网膜退行性疾病提供了一种新方式。
附图说明
图1为发明实施例天然组织和脱细胞基质组织示意图；
图2为发明实施例Uvea-Gel胶扫描电镜下观察示意图；
图3为发明实施例Uvea-Gel在小鼠体内降解示意图；
图4为发明实施例Uvea-Gel辅助细胞移植示意图；
图5为发明实施例Uvea-Gel促进hiPSC-RPE细胞体内分化示意图；
图6发明实施例Uvea-Gel辅助细胞递送减少宿主光感受器细胞退化示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明作进一步描述；应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
下面参照附图来描述本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解的是，这些实施方式仅仅用于解释本发明的技术原理，并非在限制本发明的保护范围。
需要说明的是，在本发明的描述中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方向或位置关系的术语是基于附图所示的方向或位置关系，这仅仅是为了便于描述，而不是指示或暗示所述装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，还需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域技术人员而言，可根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
请参阅图1所示，其为本发明实施例脱细胞基质胶辅助细胞递送扭转视功能的方法示意图，包括，
步骤S1，制备猪眼葡萄膜来源脱细胞基质胶；
步骤S2，制备hiPSC-RPE细胞；
步骤S3，鉴定脱细胞基质胶体外细胞生物相容性；
步骤S4，当脱细胞基质胶体外细胞生物相容性符合预设标准，将脱细胞基质胶辅助细胞体内移植，用以辅助递送药物。
在所述步骤S1中，所述制备猪眼葡萄膜来源的脱细胞基质胶方法包括将预处理后的猪眼葡萄膜经两轮浸泡后冷冻干燥形成脱细胞基质粉末，脱细胞基质粉末用胃蛋白酶酶解后，与0.1N氢氧化钠溶液中和形成脱细胞基质胶。
在所述步骤S1中，制备的脱细胞基质胶判定降解性符合预设标准后进行步骤S2，其中，将制备的脱细胞基质胶稀释成0.5％的浓度的水凝胶，取1ul注射至C57小鼠视网膜下腔，注射后5天，对视网膜进行染色,经过5-7天后，若视网膜下腔基质颜色完全消失，判定脱细胞基质胶降解性符合预设标准。
尤其，本发明脱细胞基质胶经稀释后注射的水凝胶在体内可以快速形成胶状，由于含有各种细胞外基质成分，可以通过采用HE染色，观察视网膜下腔中红色基质染色情况，当视网膜下腔内红色基质完全消失说明胶化的细胞基质已经完全降解，用以评价细胞基质的降解性符合标准。
所述步骤S2，包括步骤S21，将hiPSCs接种于脱细胞基质胶包被的培养板，于mTeSR1(Stem Cell)培养基中维持培养4-5天，选取克隆密度长至约80％-90％底面积时进行传代。
所述步骤S2,包括步骤S22，将维持培养后的hiPSCs采用0.5mM的EDTA消化为小细胞团，向小细胞团内加入含有10μM的Blebbistatin的培养液，并将其转移至低吸附皿中，于37℃培养过夜，24h后可见EBs形成，将形成的EBs连续保持悬浮培养6天后诱导分化，其中，EBs培养第一天培养液替换为25％NIM和75％mTeSR1，EBs培养第二天培养液替换为50％NIM和50％mTeSR1，EBs培养第三天，将EBs转移到到含有NIM培养液培养3天，EBs培养第6-7天，将EBs重新接种在用脱细胞基质胶包被的培养皿中，开始贴壁培养诱导分化，诱导分化25天，富集形成RPE球。
所述步骤S2包括步骤S23，将富集的RPE球悬浮培养8周后分成若干小块，将小块RPE球于37℃条件下，用dispase II孵育5-10min，解离成单细胞悬液，将单细胞悬液接种在0.1％的Uvea-Gel包被的培养板中进行扩增。
在所述步骤S3中，hiPSC-RPE细胞分别接种到常规的Matrigel和新制备的Uvea-Gel包被板上，细胞贴壁生长3-5天后，加入FDA和PI后，获取活细胞与死细胞比例，当活细胞与死细胞比例符合预设标准，判定Uvea-Gel的细胞相容性合格。
当判定Uvea-Gel的细胞相容性合格时，将获得的hiPSC-RPE细胞溶解到0.5％浓度的Uvea-Gel中，将细胞浓度调整为1×105细胞/μL，用33G的微量注射器吸取1μL细胞悬液，注射到视网膜下腔，当观察到视网膜下腔鼓起一个空泡，代表细胞注射成功。
本发明实施例中，采用新鲜猪眼组织制备猪葡萄膜脱细胞基质胶，试剂包括PBS、Triton X-100、SDS、胃蛋白酶、2.5％戊二醛、氢氧化钠，仪器包括冷冻干燥仪、冰箱、摇床以及SEM电镜，具体而言，制备猪葡萄膜脱细胞基质胶(Uvea-Gel)方法包括，解剖猪眼组织，剥离出有色素的葡萄膜；无菌的PBS清洗浸泡2次，每次15min；第一轮洗涤：5％Triton X-100浸泡4h，5％SDS浸泡4h，4M尿素浸泡4h，用去离子水浸泡1.5h；第二轮洗涤：用1％Triton X-100浸泡3h，PBS洗15min，1％Triton X-100浸泡18h，PBS洗15min，0.1％SDS浸泡3h，PBS清洗2洗，每次15min；把组织转移到去离子水中，浸泡2次，每次30min；冷冻干燥，-20℃，48h；脱细胞基质粉末用胃蛋白酶进行酶解，用0.1N的氢氧化钠溶液中和，备用。水凝胶样本用2.5％的戊二醛固定后，送电镜室进行SEM检测。
请参阅图1所示，其为本发明实施例天然组织和脱细胞基质组织示意图，经本发明实施例分离出有色素的葡萄膜组织，经过化学洗涤过程，获得脱细胞基质组织，用HE染色观察可看出脱细胞基质组较天然组织，相对松散。
请参阅图2所示，其为本发明实施例Uvea-Gel胶扫描电镜下观察示意图，猪葡萄膜脱细胞基质粉末，经胃蛋白酶水解后制备成水凝胶，获得的Uvea-Gel胶颜色呈棕褐色，扫描电镜(SEM)下观察，可以看到随机排列的基质纤维和多孔样结构。
具体而言，本发明实施例鉴定Uvea-Gel体内降解性，以C57小鼠为实验对象，将实验小鼠用水合氯醛麻醉；稀释Uvea-Gel为0.5％浓度的溶液；用显微注射器吸取1ul的Uvea-Gel注射入小鼠的视网膜下腔；注射后5天和2周，对小鼠取材，眼球用4％PFA固定过夜；组织切片；切片组织用H&E试剂盒染色；光学显微镜下观察和拍照。
请参阅图3所示，其为本发明实施例Uvea-Gel在小鼠体内降解示意图，Uvea-Gel注射到小鼠视网膜下腔，观察体内降解情况，体内注射后5天，HE染色可以看到视网膜下腔存在明显的红色基质，而注射后的2-3周，如图3所示，注射2周后小鼠视网膜下腔未发现红色基质，说明注射的水凝胶基质已经降解。
具体而言，本发明验证了制备的Uvea-Gel的体内可降解性，体外良好的生物相容性，适用于体内移植载体用。
具体而言，本发明实施例Uvea-Gel细胞相容性试验，采用试剂包括，mTeSR1培养基(STEM CELL,#05851，4℃)、EDTA：(Invitrogen，15575-038，常温)、PBS(1X)(：吉诺生物医药技术有限公司，14111202，常温)、Matrigel：Corning(354277，-20℃)、Uvea-Gel、DMEM培养基、F12培养基、胎牛血清、Blebbistatin、heparin、FDA以及PI，将hiPSC维持培养于mTeSR1培养基中，约4-5天克隆可生长至占满约80％底面积；hiPSC用EDTA消化后，加入含10mMBlebbistatin的mTeSR1培养液，促进细胞聚集，将细胞转移到10mm的低吸附皿中，37℃，培养过夜；EBs制备当天标记为第0天，次日记为第1天，以此类推。第1天，培养液替换为25％NIM+75％mTeSR1；第2天，培养液替换为50％NIM+50％mTeSR1，从第三天开始全部换成NIM培养液培养，连续悬浮培养至第6-7天；将悬浮培养的EBs按照2个EBs/cm2，重新接种在Matrigel包被的培养皿中；3D视网膜诱导分化，约25天左右，形成明显的视杯样结构和典型多边形结构的RPE细胞区域，用1ml注射器将这些结构区域挑起，悬浮培养，富集RPE细胞球；富集的hiPSC-RPE细胞球，用1ml注射器，剥离成小块，用dispse II孵育10min，37℃，用吸管轻轻吹打，知道组织块消失，PBS清洗，离心，弃上清，获得hiPSC-RPE；hiPSC-RPE分别接种到Matrigel和Uvea-Gel包被的培养板中，培养3-5天；加入FDA和PI染色，荧光显微镜观察结果和拍照，加入FDA(活细胞为绿色)和PI(死细胞为红色)，鉴定死活细胞的比例，结果可以看出98％上的细胞为FDA阳性的活细胞，说明Uvea-Gel具有良好细胞相容性。
具体而言，本发明实施例采用RCS大鼠作为实验对象进行Uvea-Gel辅助细胞体内递送实验，试剂包括PBS、生理盐水、CM-DiI、Uvea-Gel、ZO-1抗体、4％PFA、水合氯醛、Accuatuse消化液、OCT包埋剂，首先将hiPSC-RPE细胞用Accuatuse消化成单细胞；加入CM-DiI标记细胞；细胞溶于Uvea-Gel溶液中，调整细胞密度，1×105细胞/ul；用显微注射器注射1ul细胞悬液到RCS大鼠视网膜下腔；组织取材切片，荧光显微镜观察，评估细胞体内存活率；组织取材切片，免疫荧光染色，评估细胞体内分化和视网膜光感受器情况。
请参阅图4所示，其为本发明实施例Uvea-Gel辅助细胞移植示意图，将移植的细胞溶解在0.5％浓度的Uvea-Gel中，让Uvea-Gel作为一种介质辅助递送hiPSC-RPE细胞到视网膜下腔，组织取材结果显示Uvea-Gel辅助细胞递送组的细胞体内存活率高于无基质辅助递送组。
具体而言，本发明实施例的Uvea-Gel具有很好的安全性，可以开发为临床级别应用的细胞递送剂，或者实现更大的应用价值，开发药物辅助递送系统。
请参阅图5所示，其为本发明实施例Uvea-Gel促进hiPSC-RPE细胞体内分化示意图，组织学上观察到，Uvea-Gel辅助递送组中，hiPSC-RPE细胞在受体内分化，表达连接蛋白ZO-1。
请参阅图6所示，其为本发明实施例Uvea-Gel辅助细胞递送减少宿主光感受器细胞退化示意图，从组织学上观察带，Uvea-Gel辅助递送组中，视网膜退行性大鼠模型RCS大鼠的光感受器细胞减少退化，保留了相对较多的核层和Recoverin阳性的光感受器细胞。
具体而言，本发明实施例Uvea-Gel辅助细胞递送模式，有效地提高了细胞的体内存活率，分化和整合能力，并进一步保护供体光感受器细胞的退化；
至此，已经结合附图所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征做出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种脱细胞基质胶辅助细胞递送扭转视功能的方法，其特征在于，包括：
步骤S1，制备猪眼葡萄膜来源脱细胞基质胶；
步骤S2，制备hiPSC-RPE细胞；
步骤S3，鉴定脱细胞基质胶体外细胞生物相容性；
步骤S4，当脱细胞基质胶体外细胞生物相容性符合预设标准，将脱细胞基质胶辅助细胞体内移植，用以辅助递送药物。
2.根据权利要求1所述的脱细胞基质胶辅助细胞递送扭转视功能的方法，其特征在于，在所述步骤S1中，所述制备猪眼葡萄膜来源的脱细胞基质胶方法包括将预处理后的猪眼葡萄膜经两轮浸泡后冷冻干燥形成脱细胞基质粉末，脱细胞基质粉末用胃蛋白酶酶解后，与0.1N氢氧化钠溶液中和形成脱细胞基质胶。
3.根据权利要求2所述的脱细胞基质胶辅助细胞递送扭转视功能的方法，其特征在于，在所述步骤S1中，制备的脱细胞基质胶判定降解性符合预设标准后进行步骤S2，其中，将制备的脱细胞基质胶稀释成0.5％的浓度的水凝胶，取1ul注射至C57小鼠视网膜下腔，注射后5天，对视网膜进行染色,染色后，经过5-7天后，若视网膜下腔基质颜色完全消失，判定脱细胞基质胶降解性符合预设标准。
4.根据权利要求3所述的脱细胞基质胶辅助细胞递送扭转视功能的方法，其特征在于，所述步骤S2，包括步骤S21，将hiPSCs接种于脱细胞基质胶包被的培养板，于mTeSR1(StemCell)培养基中维持培养4-5天，选取克隆密度长至约80％-90％底面积时进行传代。
5.根据权利要求4所述的脱细胞基质胶辅助细胞递送扭转视功能的方法，其特征在于，所述步骤S2,包括步骤S22，制备RPE球，将维持培养后的hiPSCs采用0.5mM的EDTA消化为小细胞团，向小细胞团内加入含有10μM的Blebbistatin的培养液，并将其转移至低吸附皿中，于37℃培养过夜，24h后可见EBs形成，将形成的EBs连续保持悬浮培养6天后诱导分化，其中，EBs培养第一天培养液替换为25％NIM和75％mTeSR1，EBs培养第二天培养液替换为50％NIM和50％mTeSR1，EBs培养第三天，将EBs转移到到含有NIM培养液培养3天，EBs培养第6-7天，将EBs重新接种在用脱细胞基质胶包被的培养皿中，开始贴壁培养诱导分化，诱导分化25天，富集形成RPE球。
6.根据权利要求5所述的脱细胞基质胶辅助细胞递送扭转视功能的方法，其特征在于，所述步骤S2包括步骤S23，将富集的RPE球悬浮培养8周后分成若干小块，将小块RPE球于37℃条件下，用dispase II孵育5-10min，解离成单细胞悬液，将单细胞悬液接种在0.1％的Uvea-Gel包被的培养板中进行扩增。
7.根据权利要求1所述的脱细胞基质胶辅助细胞递送扭转视功能的方法，其特征在于，在所述步骤S3中，hiPSC-RPE细胞分别接种到常规的Matrigel和新制备的Uvea-Gel包被板上，细胞贴壁生长3-5天后，加入FDA和PI后，获取活细胞与死细胞比例，当活细胞与死细胞比例符合预设标准，判定Uvea-Gel的细胞相容性合格。
8.根据权利要求7所述的脱细胞基质胶辅助细胞递送扭转视功能的方法，其特征在于，当判定Uvea-Gel的细胞相容性合格时，将获得的hiPSC-RPE细胞溶解到0.5％浓度的Uvea-Gel中，将细胞浓度调整为1×105细胞/μL，用33G的微量注射器吸取1μL细胞悬液，注射到视网膜下腔，当观察到视网膜下腔鼓起一个空泡，代表细胞注射成功。
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