CN105641750A - 一种具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架及其制备方法 - Google Patents

一种具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架及其制备方法。它是将GFP基因转染进入hiPSc中，得到携带GFP基因的hiPSc，命名为GFP-hiPSc，然后将GFP-hiPSc诱导形成的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞经诱导分化培养基重悬后接入包被基质胶Matrigel的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上，于诱导分化培养基中进行诱导分化，形成具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架。将GFP-iRP植入动物眼内，根据其特异性细胞示踪标记追踪移植细胞，可有效观察GFP-iRP与视网膜的整合情况，为后续进一步研究生物工程视网膜神经支架在体内的迁移、增殖、分化和转归提供了依据和基础。

Description

一种具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架及其制备方法
技术领域：
本发明属于干细胞组织工程领域及分子生物学和分子影像学领域，具体涉及一种具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架及其制备方法。
背景技术：
青光眼是一组威胁和损害视神经及其视觉通路，最终导致视觉功能损害，主要与病理性眼压升高有关的临床征群或眼病。其视神经病变的特征是视网膜神经节细胞(RGC)的渐进性丧失以及其轴突与大脑中枢连接的损害。目前临床上降低眼内压的主要治疗，虽可以减缓疾病进展，但并不能完全阻止病情的进一步发展，尤其是对于晚期青光眼的患者更是收效甚微。因此，有必要寻找一种新的治疗策略，减缓或阻止进行性的RGC损害。
现已有许多研究通过运用干细胞及组织工程学技术，对青光眼神经保护和细胞替代两方面进行了积极的尝试并取得了较大进展。但干细胞移植中存在诸多复杂和关键的问题：如细胞生长部位难以精确控制；移植细胞不能完全生长分化且难以与宿主细胞有效整合，形成功能性突触链接；移植入眼内的细胞存活率较低等等。将干细胞和组织工程学有机结合，可增进或改善视网膜受损组织修复的形态及功能为确保移植体系的质量，有必要对接种于组织支架进行体外培养分化的细胞进行形态及功能的评估和检测。
发明内容：
本发明目的是提供一种生物工程视网膜神经支架细胞示踪方法，利用该方法可以直接标记追踪生物工程视网膜神经支架细胞，从而检测细胞在体内的迁移、增殖、分化和转归情况，可作为生物工程视网膜神经支架细胞移植评估的一项重要指标。
本发明的具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架是通过以下方法制备的：
将GFP基因转染进入hiPSc中，得到携带GFP基因的hiPSc，命名为GFP-hiPSc，然后将GFP-hiPSc诱导形成的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞经诱导分化培养基重悬后接入包被基质胶Matrigel的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上，于诱导分化培养基中进行诱导分化，形成具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子和维持浓度的视网膜分化营养液组成的培养基。
优选，所述的诱导分化培养基为：每ml含有bFGF10ng、BDNF20ng、CNTF20ng、N2supplement1ng、非必须氨基酸1ng、肝素2μg，余量为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基是由DMEM培养基和F12培养基按照体积比1：1混合而成。
优选，所述的诱导分化是在37℃、5％CO2，饱和湿度下进行诱导分化。
优选，所述的将神经纤维层消化为单细胞是将神经纤维层放入D-Hanks液中，分离组织，离弃视网膜组织中色素沉着部分，保留金黄色的组织部分的神经纤维层，将分离的神经纤维层组织用PBS冲洗，吸除PBS后用accutase细胞消化液消化细胞团成单细胞后加入诱导分化培养基终止消化，混悬液离心去上清后，得到种子细胞。
优选，所述的将GFP基因转染进入hiPSc中是用携带GFP基因的逆转率病毒载体转染hiPSc。
优选，所述的用携带GFP基因的逆转率病毒载体转染hiPSc是将逆转录GFP包装的PT67细胞用含有300μg/mlG418的DMEM培养基筛选5天，去除含G418的DMEM培养基，再加10％胎牛血清培养液，待细胞达到95-100％融合后收集上清，将上清联合3000Reagent加入hiPSc中，感染24小时后，获得GFP-hiPSc。
本发明人团队前期已成功将人源性的iPSc细胞(hiPSc)诱导分化为人iPSc源性的3D视网膜(XiufengZhong,etal.Generationofthree-dimensionalretinaltissuewithfunctionalphotoreceptorsfromhumaniPSCs,NatCommun.2014Jun10；5:4047)。本发明将GFP-hiPSc-3D视网膜神经纤维层的神经细胞接种于PLGA组织膜片，构建了一个具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架(GFP-iRP)。通过前期实验观察发现，选择合适的细胞标记方法是成功追踪种子细胞移植效果并对其研究的基础。因此对生物工程视网膜神经支架细胞进行特异性示踪，根据其特异性细胞标记追踪移植细胞，更加真实的反映细胞的移植状态，提供生物工程视网膜神经支架细胞在体内的迁移、增殖、分化和转归的有效数据。
附图说明：
图1是本发明对人iPSc(A)细胞进行GFP转染，细胞(B)在荧光激发下呈绿色荧光(C)，可显示细胞的位置及形态；
图2是本发明的GFP-hiPSc-3D视网膜，视网膜在荧光激发下呈绿色荧光，可显示网膜的形态；
图3是本发明GFP-iRP膜片上的神经细胞在荧光激发下呈绿色荧光，可显示细胞整体形态及在支架上的分布情况；
图4是本发明对移植了GFP-iRP的猴眼进行解剖取材(A)，其眼球组织在荧光显微镜下显示移植的GFP-iRP与视网膜贴附(B)，组织切片显示GFP-iRP膜片细胞与视网膜整合良好。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
一、重组逆转录GFP病毒制备及转染人iPSc细胞：
将逆转录GFP(绿色荧光蛋白)包装的PT67细胞(ATCC，CRL-12284TM)用含300ug/mlG418的DMEM培养基筛选5天，去除含G418的DMEM培养基，再加10％胎牛血清培养液培养，待细胞达到95-100％融合后收集上清，将GFP上清联合3000Reagent加入hiPSc(人源性的iPSc细胞)中，感染24小时后，获得GFP-hiPSc(图1)。
二、生物工程视网膜神经支架(iRP)的制作：
1、参照文献：XiufengZhong,etal.Generationofthree-dimensionalretinaltissuewithfunctionalphotoreceptorsfromhumaniPSCs,NatCommun.2014Jun10；5:4047中的培养方法，只是将hiPSc换成GFP-hiPSc，其他培养条件相同，将培养50-60天的GFP-hiPSc-3D视网膜(图2)的神经纤维层放入D-Hanks液中，于50倍正置显微镜下使用0.45mm针头分离组织，离弃视网膜组织中色素沉着部分(色素层)，保留金黄色的组织部分(神经纤维层)；将分离的神经纤维层组织使用移液管转移至3.5cm培养皿，使用PBS冲洗10分钟；吸除PBS后用accutase细胞消化液消化细胞，置于37℃培养箱中30min；过程后期可将细胞吸入离心管吹打，在10倍正置显微镜下见细胞团被消化成单细胞后加入2ml诱导分化培养基终止消化。将混悬液离心(1000转/5min)后吸出上清，得到种子细胞(沉淀)，将种子细胞中加入诱导分化培养基吹打混匀，将该含有种子细胞的诱导分化培养基分别移入预先底层铺有PLGA膜片并用基质胶Matrigel包被的96孔板中(种植密度：1×105个/cm2)，摇动孔板使细胞均匀，37℃、5％CO2饱和湿度下进行诱导分化，形成具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架(GFP-iRP，图3)。
所述的诱导分化培养基为：每ml含有bFGF10ng、BDNF20ng、CNTF20ng、N2supplement1ng、非必须氨基酸(essentialmedia-nonessentialaminoacidsNEAAs)1ng、肝素2μg，余量为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基是由DMEM培养基和F12培养基按照体积比1：1混合而成。其配制方法为：将DMEM培养基和F12培养基按照体积比1：1混合形成DMEM/F12培养基，然后按照上述成份的含量，在DMEM/F12培养基中添加bFGF、BDNF、CNTF、N2supplement、非必须氨基酸和肝素，混合均匀而得诱导分化培养基。
三、具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架(GFP-iRP)的眼内移植：
在气体环境下，于宿主神经视网膜纤维层暴露区域(约2*2mm)；基于内眼移植要求将具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架(GFP-iRP)注入玻璃体腔粘合视网膜，检查GFP-iRP粘合牢固后，使用气体充填宿主玻璃体腔；
四、具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架(GFP-iRP)的移植效果评估：
将GFP-iRP植入动物眼内后培养到一定时期，摘除动物眼球，冰冻包埋切片，1×PBS洗3遍，每遍5min，加入PB液(0.2％Triton100+10％驴血清)，室温下打孔及封闭，15-20min；孵育一抗(冰上操作)：弃0.5％Triton+驴血清，用ADS液(0.04％Tritonx-100with2％donkeyserum)稀释一抗anti-Brn3b(比例1:200)；37℃过夜后，弃一抗，用1×PBS洗3遍，每遍5min；ADS液稀释(比例1:500)二抗(LifeTechALEXAFLUOR555DONKEY，A31572)室温下孵育1h。弃二抗，用1×PBS洗3遍，每遍5min；DAPI染核5min,每个样品200μl，1×PBS洗1遍；对眼球移植切片滴一滴抗荧光猝灭剂，将盖玻片盖在猝灭剂上。活细胞显微镜下观察细胞示踪生物工程视网膜神经支架(GFP-iRP)的移植切片染色。
如图1所示，绿色荧光显示对人iPSc(A)细胞进行GFP转染，细胞(B)在荧光激发下呈绿色荧光(C)，两者同一视野下图像吻合，共同显示标记细胞的位置及形态；图2显示GFP-hiPSc诱导的GFP-3D视网膜，视网膜在荧光激发下呈绿色荧光，可显示网膜的形态；图3示GFP-iRP膜片上的神经细胞在荧光激发下呈绿色荧光，荧光与支架材料背景分界清楚，可清楚显示细胞形态及在支架上的分布情况；图4是对移植GFP-iRP的猴眼进行解剖取材(A)，其眼球组织在荧光显微镜下显示移植后的GFP-iRP与视网膜贴附(B)，组织切片显示GFP-iRP膜片细胞与视网膜整合良好。
绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)是一种用于标记目的基因表达和定位的报告分子，是为存在于海洋腔肠动物体内的发光蛋白。当受到紫外光或蓝光激发时，可发出绿色荧光。GFP具有荧光性质稳定、能长期表达、标记后对宿主细胞无毒害、检测方便、无种属特异性、可在体外或体内实时和动态观察等优点，可应用于细胞标记示踪。研究表明GFP表达对宿主细胞的生长、增殖和分化并无明显影响，可作为一种不影响活细胞正常功能的细胞生物学行为可视化报告基因。本发明用绿色荧光蛋白(GFP)转染的生物工程视网膜神经支架(GFP-iRP)进行细胞示踪，可有效观察GFP-iRP与视网膜的整合情况，为后续研究生物工程视网膜神经支架在体内的迁移、增殖、分化和转归提供了基础。

Claims (7)

1.一种具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将GFP基因转染进入hiPSc中，得到携带GFP基因的hiPSc，命名为GFP-hiPSc，然后将GFP-hiPSc诱导形成的3D视网膜的神经纤维层消化为单细胞，以该单细胞作为种子细胞经诱导分化培养基重悬后接入包被基质胶Matrigel的聚乳酸-羟基乙酸聚合物支架上，于诱导分化培养基中进行诱导分化，形成具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架，所述的诱导分化培养基为含有神经营养因子和维持浓度的视网膜分化营养液组成的培养基。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的诱导分化培养基为：每ml含有bFGF10ng、BDNF20ng、CNTF20ng、N2supplement1ng、非必须氨基酸1ng、肝素2μg，余量为DMEM/F12培养基，所述的DMEM/F12培养基是由DMEM培养基和F12培养基按照体积比1：1混合而成。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的诱导分化是在37℃、5％CO2，饱和湿度下进行诱导分化。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的将神经纤维层消化为单细胞是将神经纤维层放入D-Hanks液中，分离组织，离弃视网膜组织中色素沉着部分，保留金黄色的组织部分的神经纤维层，将分离的神经纤维层组织用PBS冲洗，吸除PBS后用accutase细胞消化液消化细胞团成单细胞后加入诱导分化培养基终止消化，混悬液离心去上清后，得到种子细胞。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的将GFP基因转染进入hiPSc中是用携带GFP基因的逆转率病毒载体转染hiPSc。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的用携带GFP基因的逆转率病毒载体转染hiPSc是将逆转录GFP包装的PT67细胞用含有300μg/mlG418的DMEM培养基筛选5天，去除含G418的DMEM培养基，再加10％胎牛血清培养液，待细胞达到95-100％融合后收集上清，将上清联合3000Reagent加入hiPSc中，感染24小时后，获得GFP-hiPSc。
7.一种按照权利要求1、2、3、4、5或6所述的制备方法制备得到的具有细胞示踪功能的生物工程视网膜神经支架。
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