KR20210024582A - 신경세포 전구 세포의 확장 및 분화 - Google Patents

신경세포 전구 세포의 확장 및 분화 Download PDF

Info

Publication number
KR20210024582A
KR20210024582A KR1020217002200A KR20217002200A KR20210024582A KR 20210024582 A KR20210024582 A KR 20210024582A KR 1020217002200 A KR1020217002200 A KR 1020217002200A KR 20217002200 A KR20217002200 A KR 20217002200A KR 20210024582 A KR20210024582 A KR 20210024582A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
sample
skin
hair follicle
cell
Prior art date
Application number
KR1020217002200A
Other languages
English (en)
Inventor
마이클 발렌수엘라
톰 던컨
안 쯔엉
Original Assignee
스킨2뉴런 피티와이 엘티디
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2018902237A external-priority patent/AU2018902237A0/en
Application filed by 스킨2뉴런 피티와이 엘티디 filed Critical 스킨2뉴런 피티와이 엘티디
Publication of KR20210024582A publication Critical patent/KR20210024582A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1841—Transforming growth factor [TGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4826—Trypsin (3.4.21.4) Chymotrypsin (3.4.21.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/09—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from epidermal cells, from skin cells, from oral mucosa cells
    • C12N2506/092—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from epidermal cells, from skin cells, from oral mucosa cells from hair cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1376—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from mesenchymal stem cells derived from hair follicles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 신경세포 전구 세포의 제조, 이를 포함하는 조성물 및 치료적 용도에 관한 것이다.

Description

신경세포 전구 세포의 확장 및 분화
본 발명은 신경 전구 세포의 제조, 이를 포함하는 조성물 및 이의 치료적 용도에 관한 것이다.
명세서에 표시된 이전의 기술을 참조하는 것은 이전 기술이 어느 영역에서든지 통상의 지식의 일부를 형성하거나 또는 이 분야 기술 전문가에 의해 이전 기술이 다른 이전의 기술과 상관관계가 있고, 및/또는 조합될 수 있다고 합리적으로 이해되기를 기대할 수 있다고 인정하거나 또는 제시하는 것은 아니다.
다 기능성 줄기세포는 신경 세포를 새로이 (de novo) 제조하는 관례적인 시작점이다-이들의 초기 복제 상태 (primitive replicative state)에 있는 세포의 확장에 이어 성숙 된 신경표현형으로 분화되게 한다. 다 기능성 줄기세포는 배아 기원한 세포 (즉, 배아 줄기세포) 또는 성인 줄기세포 저장소 (즉, 간엽줄기 세포와 같은 성인 줄기세포)로부터 분리될 수 있거나, 또는 좀 더 최근에 발견된 대로, 성숙 된 분화-후 세포 (예를 들어, 섬유아세포)를 배아-유사 줄기세포 (embryonic-like stem cells)로 재프로그램 (reprogramming) 에 의해 분리될 수 있다 ((즉, 유도된 다 기능성 줄기세포 (pluripotential stem cell)).
이 방법 각각은 정의상, 다양한 세포 운명이 될 수 있는 (즉, 다 기능성) 일반적인 한계를 갖고 있다. 그러므로 신경 세포로의 수율은 낮고 및 가변적이며, 특별한 신경세포로의 분화 조건으로 처치한 후에도 비-신경 세포 표현형의 결과를 가져온다. 예를 들어, 그러한 처치 후에, 교질 세포 (glial cell) 분화가 흔한 제한이다. 생물학적 연구, 상업적 응용 또는 치료적 용도 목적을 위해, 단 분화능 신경 전구 세포의 균일한 집단을, 즉, 일정하고, 일시적으로 복제가능하고, 및 신경 세포 계통으로 운명이-결정된 집단을, 생산할 수 있는 것은 유용할 것이다.
오늘날 가장 가까운 접근은 주요 신경세포 유도 유전자의 상향 조절을 통해 증식적인 줄기세포 또는 전구 세포 단계를 거치치 않고 성숙 된 분화-후 세포를 (예를 들어, 섬유아세포) 유사분열-후 신경 세포로의 직접적인 유전적 재프로그래밍이다 ((Vierbuchen et al., 2010, Pang et al., 2011, Son et al., 2011, Zhou et al., 2014, Tsunemoto et al., 2018)). 그러나, 이 방법은 유전적인 조작에 의존하며 및 확장 가능한 집단을 생산하지는 않으며, 및 모든 다른 방법들과 같이 허용가능 하지 않는 높은 세포주에서-세포주 간의 가변성의 문제점을 암시한다 (Truong et al., 2016).
이를 감안하여, 인간 피부 및 중추신경계가, 외배엽 생식 계통인, 같은 배아세포 기원을 공유하는 것은 흥미롭다. 이 두 기관에서 성인 줄기세포 및 전구 세포는 많은 같은 세포 마커들을 ((예를 들어, 네스틴 (nestin ), CD133, Sox2, 등)) 발현하고 및 많은 같은 세포주기 조절 인자들을 ((노긴 (Noggin), SHH , FGF , EGF , BDNF, 등)) 사용한다는 것을 거의 인식하지 않고 있다.
2001년에 토마 등은 (Toma et al. 2001) 처음으로 포유류 머리털 모낭 니치 (hair follicle niche) 에 있는 다기능 줄기세포가, 분화 후 낮은 수율이고 (15%), 대부분의 세포가 비-신경세포 유형으로 전개될지라도, 시험관 내에서 신경 세포 (neuron)를 생산할 수 있음을 정말로 보여 주었다. 이 기본적인 결과는 그 후 이 그룹 (Vierbuchen et al., 2010, Pang et al., 2011, Son et al., 2011, Zhou et al., 2014, Tsunemoto et al., 2018) 및 다른 그룹에 (Joannides et al., 2004, Yu et al., 2010, Yu et al., 2006, Belicchi et al., 2004) 의해 인간 피부를 사용하여 복제되었다. 흥미롭게도, 최근에는 역으로도 또한 보여주었다: 황 등은 ((Hwang et al. (2016)) 신경 줄기세포 추출액 (인간 태아 기원한)이 진짜로 디필레이트된 생쥐 (depilated mice) 생체 내에서 머리털의 재성장을 증가시킬 수 있음을 발견했다.
그러므로 이 두 기관 시스템이 구조 및 기능에서 광범위하게 다른 반면에, 이들은 줄기세포 및 전구 세포 증식을 관장하는 생물학적 기구의 많은 것들을 같이 보존하고 있다. 더 나아가, 한 니치 (niche) 의 줄기세포 및 전구 세포는 환경적 신호 단독에 의해서 다른 것의 역할 및 정체성을 추정할 수 있다. 생리적 니치 (뇌에서)로부터의 성인 인간 신경 줄기세포에의 접근이 어려운 것을 감안하면, 주어진 개인에서 유전적 조작을 위해 재분류하지 않고 신경 전구 세포가 그 개인 자체 머리털 모낭 전구 세포 집단으로부터 유래 될 수 있다는 것은 개념적으로 매력적이 있다.
지금까지, 이 전제는 실제로 실패해 왔다. 자연 인간 피부로부터의 세포 생존력 및 신경 세포의 수율은 너무 낮고 및 세포주에서 세포주 사이의 변이가 너무 컸다.
이 문맥에서의 전구 세포 소스는 - 성인 인간 머리털 모낭- 단일기능 전구 세포는 물론 다기능 줄기세포 둘 다를 함유한다. 단일기능 전구 세포는 단지 하나의 세포 계통으로 제한되는 운명이고 및 시험관 내에서 무 제한적인 복제를 할 수 없다는 이유로 근본적으로 다기능 줄기세포와 다르다. 최근에, 머리털 모낭에서 일시적으로 증폭된 전구 세포 중에 많은 이질성이 있다는 것이 드러나고 있으며, 및 이 변이는 다른 계통 운명을 갖는 아 집단 (subpopulations)의 전개를 가능하도록 하고 있다 (Yang et al., 2017). 더 나아가, 이 "계통 불확실성 (lineage infidelity)"은 상처 수선, 종양발생적 형질전환 또는 시험관 내 세포 배양 조건하에서 최대로 일어나고 있다 (Ge et al., 2017, Fuchs, 2018).
지금까지 인식되지 않은 것은 인간 머리털 모낭의 아-집단 또는 전구 세포가 잠재적인 신경세포 운명의 제한을 함유하는 능력이 있다는 것이다.
성숙 된 피부로부터 그러한 단일기능 신경세포 전구체를 분리하고 및 확장하는 기능은 종 사이에서 널리 다양하다. 예를 들어, 우리는 이전에 다 자란 고양이 피부에서 이 과정을 개발했으나 (Valenzuela et al. (2008), 이 방법은 개인-간 및 개인-내에서의 머리털 모낭의 양 및 질이 많은 다르기 때문에 일반적으로 성인 피부에는 적용될 수 없다.
한 실시 예에서, 신경세포 전구 세포의 조성물, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 방법을 제공하며 여기에는:
- 머리털 모낭 세포가 성장상 (growth phase)으로 전이될 수 있는 컨디션에서 머리털 모낭 세포 샘플을 처치하여, 이로써 컨디션 된 세포 샘플을 형성하고;
- 샘플에 신경세포 계통 바이오마커를 함유하는 세포의 수가 강화될 수 있는 컨디션에서 컨디션 된 세포 샘플을 처치하고;
이로써 신경세포 전구 세포의 조성물, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 방법을 포함한다.
한 실시 예에서, 신경세포 전구 세포의 조성물, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 방법을 제공하며 여기에는:
-머리털 모낭 세포가 성장상 (growth phase)으로 전이될 수 있는 컨디션에서 머리털 모낭 세포 샘플을 처치하여, 이로써 컨디션 된 세포 샘플을 형성하고;
-컨디션 된 세포 샘플의 세포로부터 신경구 세포가 형성될 수 있는 컨디션에서 컨디션 된 세포 샘플을 처치하여;
이로써 신경세포 전구 세포의 조성물, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 방법을 포함한다.
한 실시 예에서, 신경세포 전구 세포의 조성물, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 방법을 제공하며 여기에는:
-머리털 모낭 세포가 성장상 (growth phase)으로 전이될 수 있는 컨디션에서 머리털 모낭 세포 샘플을 처치하여, 이로써 컨디션 된 세포 샘플을 형성하고;
- 컨디션 된 세포 샘플의 세포로부터 신경구 세포가 형성될 수 있는 컨디션에서 이 컨디션 된 세포 샘플을 처치하여;
-신경구 세포의 샘플이 신경구 세포의 수를 확장하는 컨디션을 제공하고;
이로써 신경세포 전구 세포의 조성물, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 방법을 포함한다.
한 실시 예에서, 신경세포 전구 세포의 조성물, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 방법을 제공하며 여기에는:
-머리털 모낭 세포 샘플을 머리털 모낭 세포가 성장상 (growth phase)으로 전이될 수 있는 컨디션에서 처치하여, 이로써 컨디션 된 세포 샘플을 형성하고;
-컨디션 된 세포 샘플에 세포가 단일 세포로 분리되는 컨디션을 제공하고;
-컨디션 된 세포 샘플의 세포로부터 신경구 세포를 형성할 수 있는 컨디션에서 이 컨디션 된 세포 샘플을 처치하여;
-신경구 세포의 샘플이 신경구 세포의 수를 확장하는 컨디션을 제공하고;
이로써 신경세포 전구 세포의 조성물, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 방법을 포함한다.
한 실시 예에서, 신경세포 전구 세포의 조성물, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 방법을 제공하며 여기에는:
-피부 샘플을, 머리털 모낭 세포를 포함하는 피부를, 피부에 있는 머리털 모낭 세포가 성장상으로 전이될 수 있는 컨디션에서 처치하여, 이로써 컨디션 된 피부 샘플을 형성하고;
- 신경세포 계통 바이오마커를 함유하는 세포의 수가 샘플에 강화될 수 있는 컨디션에서 컨디션 된 피부 샘플을 처치하고;
이로써 신경세포 전구 세포의 조성물, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 방법을 포함한다.
한 실시 예에서, 신경세포 전구 세포의 조성물, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 방법을 제공하며 여기에는:
-피부 샘플을, 머리털 모낭 세포를 포함하는 피부를, 피부에 있는 머리털 모낭 세포가 성장상으로 전이될 수 있는 컨디션에서 처치하여, 이로써 컨디션 된 피부 샘플을 형성하고;
-컨디션 된 피부 샘플로부터 최종적으로 분화된 세포 또는 자가사멸 된 세포 또는 세포 조각을 고갈시켜, 이로써 비-최종적으로 분화된 세포 (non-terminally differentiated cell) 샘플을 형성하고;
- 신경세포 계통 바이오마커를 함유하는 세포의 수가 샘플에서 강화될 수 있는 컨디션에서 비-최종적으로 분화된 세포 샘플을 처치하고;
이로써 신경세포 전구 세포의 조성물, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 방법을 포함한다.
한 실시 예에서, 신경세포 전구 세포의 조성물, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 방법을 제공하며 여기에는:
-피부 샘플을, 머리털 모낭 세포를 포함하는 피부를, 피부에 있는 머리털 모낭 세포가 성장상으로 전이될 수 있는 컨디션에서 처치하여, 이로써 컨디션 된 피부 샘플을 형성하고;
-컨디션 된 피부로부터의 세포를 샘플로 방출시키고;
-컨디션 된 피부 샘플로부터 최종적으로 분화된 세포 또는 자가사멸 된 세포 또는 세포 조각을 고갈시켜, 이로써 비-최종적으로 분화된 세포 (non-terminally differentiated cell) 샘플을 형성하고;
-신경세포 계통 바이오마커를 함유하는 세포의 수가 샘플에서 강화될 수 있는 컨디션에서 비-최종적으로 분화된 세포 샘플을 처치하고;
이로써 신경세포 전구 세포의 조성물, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 방법을 포함한다.
더 나아간 실시 예에서, 상기 서술된 방법에 의해 생산된 세포의 조성물을 제공한다. 이 조성물은 치료적으로 효과 있는 양의 세포 및 약학적으로 허용할 만한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이 조성물의 세포 성분은 상기 서술된 방법으로 생산된 세포로 구성될 수 있거나, 또는 세포 성분은 상기 서술된 방법으로 생산된 세포를 포함할 수 있고 및 더 나아가 다른 세포를 포함할 수 있다. 이 조성물은 주사 (injection)로 또는 주입 (infusion)이 가능하도록 개조될 수 있다.
더 나아간 실시 예에서 이 세포 조성물은 치료, 예를 들어, 신경 조직의 컨디션 또는 질환 치료에의 용도를 제공한다. 그러므로 한 실시 예에서, 상기 치료를 필요로하는 개인에서 상기 서술된 조성물을 상기 치료를 요구하는 개인에게 투여를 포함하는 질환 또는 컨디션을, 바람직하게는 신경 조직의 질환 또는 컨디션을, 치료하는 방법을 제공하여, 그럼으로써 상기 개인의 상기 질환 또는 컨디션을 치료한다.
더 나아간 실시 예에서 상기 서술된 세포 조성물을 질환 또는 컨디션을, 바람직하게는 신경 조직의 질환 또는 컨디션을, 치료하는 용도를 제공한다.
더 나아간 실시 예에서 상기 서술된 세포 조성물을 질환 또는 컨디션을, 바람직하게는 신경 조직의 질환 또는 컨디션을 치료하는 의약품 제조하는 용도를 제공한다.
더 나아간 실시 예에서 질환 또는 컨디션을, 바람직하게는 신경 조직의 질환 또는 컨디션을 치료하는 상기 서술된 세포 조성물을 포함하는 하나 또는 그 이상의 장치를 제공한다.
여기서 사용된 대로, 문맥상 달리 요구하는 곳을 제외하고, "포함하다 (comprise)" 라는 용어 및 "포함하는 (comprising)", "포함하다 (comprises)" 및 포함한 (comprised)" 과 같은 이 용어의 변이는 더 나아가 첨가제, 성분, 정수 (integers) 또는 단계를 제외하려는 의도는 아니다.
현 발명의 더 나아간 관점 및 선행 구절에서 서술된 관점의 더 나아간 실시 예는, 실시 예시로서 주어진, 하기의 서술로부터 분명해질 것이다.
도 1. 소닉 헤지호그 (sonic hedge hog) (SHH) 로 6 또는 72시간 동안 미리 화학적 전처리로 또는 전처리 없이 신경구를 분리한 후의 머리털 모낭 당 전형적인 세포 수율. 데이터는 45-세의 남성으로부터의 데이터이다.
도 2. 머리털 모낭을 콜라게나제/디스파제 (collagenase/dispase) 처치로 바로 효소적으로 처치하고 및 분쇄한 후의 아주 우수한 세포 수율.
도 3. 45-세의 남성(상위 줄) 및 25-세 남성 (하위 줄)의 머리털 모낭으로부터 유래한 전형적인 신경구 세포의 명시야 현미경그래프 (Brightfield micrographs).
도 4. 일련의 전형적인 신경 전구 세포 바이오마커에 대해 염색된 신경구의 형광 현미경그래프. A) 아주 흔한 신경 줄기세포 마커 네스틴 (NESTIN) (>90%의 세포가 양성). B) 신경 전구 세포 마커 더불코틴 (DOUBLECORTIN) (DCX; >80%의 세포가 양성). C) 미성숙된 신경세포 마커 βIII-튜불린 (βIII-TUBULIN) (B3T; >50%의 세포가 양성). D) 음성 대조군 (no primary). 모든 신경구는 34-세 남성의 머리털 모낭으로부터 유래했다.
도 5. HFNs의 단층 (Monolayer) 확장. 25-세 남성으로부터 얻은 융합성 HFNs의 전형적인 모양의 명시야 현미경그래프. 형광 이미지는 흔한 (>90% 양성) 줄기세포 마커 CD133 단백질 발현 및 미성숙 신경세포 마커 βIII-튜불린 (βIII-TUBULIN) (B3T)을 보여준다. HFN 세포의 형광 이미지는 45-세 남성으로부터이다.
본 발명은 제한적인 세포주 및 세포주 간의 변이를 보여주고 및 상업적으로 유용한 세포 수로 빨리 확장하는 능력이 있는 신경 세포 전구 세포 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 그 방법에는:
-머리털 모낭 세포가 성장상 (growth phase)으로 전이될 수 있는 컨디션에서 머리털 모낭 세포 샘플을 처치하여, 이로써 컨디션 된 세포 샘플을 형성하고;
-샘플에서 신경세포 계통 바이오마커를 함유하는 세포의 수가 강화될 수 있는 컨디션에서 컨디션 된 세포 샘플을 처치하고;
이로써 신경세포 전구 세포의 조성물, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 방법을 포함한다.
이 방법에 의해 생산되는 조성물의 세포는 신경 전구 세포이거나 또는 좀 더 일반적으로 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식하는 세포이다. 신경세포 계통 바이오마커들에는 (가장 원초적으로) 신경 줄기세포-유사 마커 네스틴 (nestin), 방사 신경아교 세포 마커 (radial glial cell marker)) GFAP, 신경아세포 마커 (neuroblastic markers) 더불코틴 (doublecortin) (DCX) 및 NCAM 및 미성숙 신경 마커 (immature neuron marker) 베타III-튜블린(betaIII-tubulin)을 포함할 수 있는 발생 스펙트럼 (developmental spectrum)을 커버한다. CD133, Sox2 및 OCT4와 같은 좀 더 일반적인 줄기세포-유사 마커도 또한 발현될 수 있다. 이러한 마커들에 대하여 양성인 세포들은 신경구에 강화되어 있으며 및 최종적으로 분화된 신경세포(뉴론)를 형성할 잠재력을 가진다. 일반적으로 이런 세포들은 다기능성이다, 즉 신경세포 (뉴론) 및 신경교세포 (glia)와 같은, 신경세포 계통의 최종 분화된 세포를 생성하는 효능을 가진다.
일반적으로 이 방법의 시작 단계는 머리털 모낭 세포의 처치가 관여된다. 하기에 설명 된 대로, 이 세포들은 머리털 모낭을 가진 피부 샘플의 형태로 얻어질 수 있다. 다른 한편으로는, 이 세포들은 머리털 모낭 분리체 (isolate)로부터 얻어질 수 있다. 일반적으로 알려진 대로, 머리털 모낭 세포는 성장의 맥락에서 상 (phase) 범위 내로 ((성장기 (anagen), 모발퇴행기 (catagen) 및 휴지기 (telogen)) 존재할 수 있다. 텔로겐 (telogen)은 휴지하고 있는 상 (즉, 성장이 없는) 이고, 아나겐 (anagen)은 성장상이고 및 카타겐 (catagen)은 아나겐과 텔로겐 사이의 중간상이다. 처치 단계는 성장상 (growth phase) 또는 아나겐 상 (anagen phase)에 있는 머리털 모낭 세포의 강화의 결과를 가져온다. 이 강화는 머리털 모낭 세포를 자극하여 휴지기 (telogen phase)에 있는 세포들이 성장상 (anagen phase)으로 전이되게 하고, 및/또는 성장기에 있는 세포가 모발 퇴행기 (catagen phase)로 전이되는 것을 방지하여 일어날 수 있다. 처치 단계의 결과로서 성장상에 있는 신경세포 계통 바이오마커가 발달하는 잠재력을 소유하는 머리털 모낭 세포가 특별히 강화가 된다.
더 나아간 단계에서, 세포는 신경 세포 계통 바이오마커 (neuronal lineage biomarkers)를 함유하는 세포의 수를 강화, 또는 달리, 증가시키기 위하여 처치된다. 이는 신경 세포 계통 바이오마커를 함유하는 세포의 수가 증가하게 처치하거나 및/또는 신경 세포 계통 바이오마커를 함유하지 않는 세포의 수를 감소시켜 달성할 수 있다. 특별히 바람직한 단계에서는, 세포는 신경구를 형성할 수 있게 하는 컨디션에서 처치된다. 신경구 세포를 형성하는 방법은 이 분야 기술에서 잘 알려졌으며 및 여기서 더 나아가 예시적으로 보여준다. 한 실시 예에서, 세포는 신경 세포 계통 바이오마커를 함유하는 세포의 수를 강화, 또는 달리, 증가시키기 위하여 처치되거나, 또는 생물반응기에서 세포를 배양하여 신경구 형성을 할 수 있게 처치된다. 생물반응기는 신경구 형성을 위해 개선된 컨디션을 제공하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 첫 번째 실시 예가 지금 서술되며 여기서 머리털 모낭을 포함하는 피부 샘플이 신경세포 전구 세포의 조성물을 유도하기 위하여 사용되며, 이에 따라 머리털 모낭을 포함하는 피부 샘플은 피부에 있는 머리털 모낭 세포가 성장상 (growth phase)으로 전이될 수 있게 하는 컨디션에서 처치되고, 이로써 컨디션화된 피부를 형성하며; 및 그 후 컨디션화된 세포 샘플은 샘플에 신경 세포 계통 바이오마커를 함유하는 세포의 수가 강화될 수 있도록 하는 컨디션에서 처치되며, 이로써 신경세포 전구 세포의 조성물을 생산한다.
이 방법의 첫 번째 단계는 머리털 모낭 세포를 함유하는 피부 샘플의 수확이 관여될 수 있다. 샘플은 가장 높고 및 균일한 머리털 모낭 밀도를 함유하는 인간 두피로부터, 바람직하게는 정중선 후두골 두피로부터 얻는 것이 바람직하다. 이 피부는 일반적으로 개인에 따라 좀 더 밀도가 높은 활성적인 머리털 모낭을 함유하고 있다. 우리는 밀도가 더 높은 활성적인 머리털 모낭을 함유하고 있는 피부 부위가, 더 낮은 밀도의 머리털 모낭을 함유하고 있는 피부 부위에 비교하여, 이 방법으로 좀 더 나은 양 및 질의 세포를 생산할수 있게 함을 발견했다.
머리털 모낭 세포는 일반적으로, 집합적으로 머리털 모낭 전구 세포라고 불리는, 팽창영역 (bulge area), 세균 지대 (germ zone) 및 피부유듀 (dermal papillae)를 포함하는, 다른 니치 (niches)로부터의 전구 세포 및 줄기세포를 포함한다. 머리털 모낭 전구 세포는 신경-외배엽 바이오마커를 발현할 수 있다.
수확된 피부 샘플은 그 후 상당히 모든 머리털 모낭 전구 세포가 성장상으로 전이될 수 있는 컨디션에서 처치된다. 이 단계는 매우 중요하다 왜냐하면 이는 신경 전구 세포의 증가한 수율에 기여하기 때문이다. 이 단계의 예시는 여기 실시 예시에서 상세히 서술된다.
이 단계는 일반적으로 인간 피부 샘플의 시험관 내 컨디셔닝이 관여되며, 이의 목표는 피부 샘플 세포의 세포 생존을 지지하는 컨디션 및 세포를 성장상으로 (또는 모낭 세포주기의 활성적인 성장기) 전이될 수 있도록 하는 컨디션을 제공하는 것이다.
이 단계 이전에, 피부 샘플의 세포는 성장기 (anagen), 휴지기 (telogen) 또는 모낭 사이클의 어떤 다른 상 (phase)) 일 수 있다. 대부분의 머리털 모낭 전구 세포는, 반드시 필요한 것은 아닐지라도, 수확할 당시에 성장기에 있는 것이 바람직하다. 왜냐하면, 시험관 내 배양의 최종 결과는 대부분의 머리털 모낭 전구 세포가 성장상으로 전이되는 것이기 때문이다.
항-난치성 머리털 모낭 인자 (Anti-refractory hair follicle factors) 및/또는 친-성장 인자 (pro-growth factors)는 머리털 모낭 전구 세포 및 줄기세포가 성장상 (anagen phase)으로 전이 되는 것을 촉진하는데 사용될 수 있으며, 이로써 피부에 있는 머리털 모낭 세포가 성장상으로 전이될 수 있게 한다. 항-난치성 머리털 모낭 인자의 예에는 노긴 (noggin) 또는 소닉 헤지호그 (sonic hedgehog) (SHH)를 포함하거나 또는 Wnt1 신호 전달 경로를 활성화하는 인자들을 포함하거나, 또는 골 형성 단백질 ((친-난치성 (pro-refractory)) 자극을 억제하는 인자들을 포함한다. 항-난치성 머리털 모낭 인자의 다른 예에는 WNTs 는 물론 Grem 1 및 Bambi 와 같은 BMP 길항제가 포함된다. TGF-β2 는 주요 친-성장 (pro-growth) 인자이며, 다른 친-성장 인자에는 FGF7, FGF10 및 혈소판-유래한 성장인자 (platelet-derived growth factor) (PDGF)가 포함된다.
피부 샘플의 시험관 내 컨디셔닝은 일반적으로 시험관 내 표피 세포 생존력 및 머리털 모낭 기관발생을 지지하는 배양 배지를 사용한다. 윌리암 배지 E (Williams medium E)가 한 예다. 다른 예들에는 둘베코의 수정된 이글 배지 (Dulbecco's modified eagle medium) (DMEM) 플러스 F-12의 다른 조합, F12 플러스 포유류 혈청의 다른 조합 및 다르게 보충된 인산염 버퍼 생리 식염수 조합이 포함된다.
어떤 경우에서는, 더 오랫동안 배양이 가능할 수도 있지만, 일반적으로 시험관 내 컨디셔닝은 12 에서 100시간 동안 한다.
배양기간 동안 시험관 내 배양 과정을 모니터하는 것이 가능하다. 예를 들어, 분리된 머리털 모낭 내에 머리털 줄기의 성장으로 세포 또는 배양의 특징을 평가할 수 있다.
시험관 내 세포 배양이 완료되었을 때에, 적어도 80%의 세포가 성장상 (anagen phase) 에 있는 것이 바람직하다.
컨디션 된 피부 샘플이 얻어진 배양 완료시에, 많은 세포가 세포 외 매티릭스 (extra cellular matrix) 및 피부 조직의 비-세포성 성분 (non-cellular components)에 의해 컨디션 된 피부 내에 갇혀 (entrapped) 남아 있을 것이다. 이 세포들은 피부 조직으로부터 방출될 것이다. 방법에 따라, 컨디션 된 피부의 세포 외 매트릭스를 분해할 수 있는 조건에서 하나 또는 그 이상의 효소로 피부를 접촉시켜 세포를 샘플로 방출시킴으로써 세포는 컨디션 된 피부로부터 방출된다. 일반적으로 효소는 트립신 (trypsin), DNase, 디스파제 (dispase), 콜라게나제 (collagenase), 및 아큐스타제 (Accustase) 및 TrypLE의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상이다.
컨디션 된 피부의 성질에 따라, 다른 한편으로 컨디션 된 조직을 분열시켜 더 작은 조각의 조직으로 잘게 갈거나 또는 분리하는 기계적인 수단에 의해 컨디션 된 피부로부터 세포를 방출하는 것도 가능할 수 있다.
어떤 실시 예에서, 세포는 효소적 또는 기계적 처치의 조합에 의해 컨디션 된 피부로부터 방출될 수 있다. 일반적으로 효소적 처치가 기계적 처치가 시작되기 이전에 시작되지만, 효소적 또는 기계적 처치는 동시에 일어날 수 있다.
컨디션 된 피부 조직 샘플로부터 세포를 방출시키는 단계가 완료되었을 때, 세포 배지에 현탁 시킬 수 있는 방출된 세포 및 세포 외 매트릭스 (extra cellular matrix)의 비 세포성 성분 및 피부 조직의 비-세포성 성분이 제공된다. 이들은 일반적으로 후속 단계의 시작 전에 제거된다. 원심분리 및 여과가 사용될 수 있다. 이 방식의 실시 예는 여기 실시 예시에서 서술된다.
컨디션 된 피부로부터 방출되는 세포의 조성물은 이질적이며, 조직이 어디에서부터 수확되느냐에 따라, 신경 세포 전구 세포, 다른 다기능 세포, 및 섬유아세포 (fibroblasts), 각질형성세포 (keratinocytes) 및 피부 조직의 상피 및 피부층의 다른 세포를 포함하는 최종적으로 분화된 세포를 포함한다. 다음 단계는 신경 세포 전구 세포가 대부분 포함되는 세포 샘플을 얻는 것이 요구된다. 이는 그 후 컨디션 된 인간 피부 세포로부터 방출된 세포의 조성물로부터 비-신경세포 전구 세포인 세포의 제거를 요구한다. 제거될 세포는 전형적으로 최종적으로 분화된 세포이다 (즉, 각질형성세포, 섬유아세포, 다른 피부 및 상피 세포 및 사멸 세포).
한 실시 예에서, 최종적으로 분화된 세포는 샘플로부터 최종적으로 분화된 세포를 선택적으로 고갈시키는 컨디션에서 샘플로부터 최종적으로 분화된 세포를 선택적으로 고갈시키는 시약을 샘플과 접촉시켜 샘플로부터 고갈시킨다. 바람직하게, 시약은 최종적으로 분화된 세포에는 결합하나 최종적으로 분화되지 않은 세포에는 결합하지 않는 항체이다. 신경세포 전구 세포에는 결합하지 않는 단일 클론 항체인 항체가 바람직하게 이 단계에서는 효과적이다. 바람직하게 항체는 각질형성세포, 또는 섬유아세포와 같은 상피 또는 피부 세포에 결합한다. 항체의 예에는 신경세포 전구 세포의 표면에서 발견된 항원이 아닌, 섬유아세포-특이 항원 1 (fibroblast-specific antigen 1), 또는 CD45에 선택적으로 결합하는 것들이 포함된다.
이 고갈 단계가 완료되었을 때, 샘플은 최종적으로 분화된 세포의 수가 5% 미만을 함유한다.
그러므로 본 발명의 첫 번째 실시 예에 따라 신경세포 전구 세포의 조성물을 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 성장 능력이 있는 세포의 조성물을 생산하는 방법을 제공하며 여기에는:
- 머리털 모낭 세포를 포함하는 피부인, 피부 샘플을, 피부에 있는 머리털 모낭 세포가 성장상 (growth phase)으로 전이될 수 있는 컨디션에서 처치하여, 이로써 컨디션 된 피부 샘플을 형성하고;
-컨디션 된 피부로부터 샘플로 세포를 방출하고;
-최종적으로 분화된 세포 또는 사멸된 세포 또는 세포 부스러기를 샘플로부터 고갈시키고, 이로써 최종적으로 분화되지 않은 세포의 샘플을 형성하고; 및 선택적으로
- 샘플에 최종적으로 분화되지 않은 세포의 수가 확장될 수 있게 하는 컨디션에서 최종적으로 분화되지 않은 세포의 샘플을 처치하고;
그럼으로써, 신경세포 전구 세포의 조성물의 생산을 포함한다.
이 방법은 컨디션 된 피부로부터 세포를 방출하는 별도의 단계 없이 수행될 수도 있다. 예를 들어, 세포는 머리털 모낭 세포가 성장상으로 전이되는 처리 단계의 컨디션에서 피부로부터 샘플로 방출될 수 있다. 그러므로 이 방법은 널리 신경세포 전구 세포가 강화되거나, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포의 조성물의 생산을 포함할 수 있으며 이는;
-머리털 모낭 세포를 포함하는 피부인, 피부 샘플을, 피부에 있는 머리털 모낭 세포가 성장상 (growth phase)으로 전이될 수 있는 컨디션에서 처치하여, 이로써 컨디션 된 피부 샘플을 형성하고;
-최종적으로 분화된 세포 또는 사멸된 세포 또는 세포 부스러기를 컨디션 된 샘플로부터 고갈시키고, 이로써 최종적으로 분화되지 않은 세포의 샘플을 형성하고;
-샘플에 신경세포 계통 바이오마커를 함유하는 세포의 수가 강화될 수 있게 하는 컨디션에서 최종적으로 분화되지 않은 세포의 샘플 처치에 의하며;
이로써 신경세포 전구 세포 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포의 조성물을 생산하게 한다.
그렇지 않다면, 컨디션 된 피부로부터 세포를 방출하는 별도의 과정 단계를 시행할 필요가 있을 수 있으며 그 방법에는:
-머리털 모낭 세포를 포함하는 피부인, 피부 샘플을, 피부에 있는 머리털 모낭 세포가 성장상 (growth phase)으로 전이될 수 있는 컨디션에서 처치하여, 이로써 컨디션 된 피부의 샘플을 형성하고;
-컨디션 된 피부로부터 샘플로 세포를 방출하고;
-최종적으로 분화된 세포 또는 사멸된 세포 또는 세포 부스러기를 컨디션 된 피부 샘플로부터 고갈시키고, 이로써 최종적으로 분화되지 않은 세포의 샘플을 형성하고;
-샘플에 신경세포 계통 바이오마커를 함유하는 세포의 수가 강화될 수 있게 하는 컨디션에서 최종적으로 분화되지 않은 세포의 샘플을 처치하고;
이로써 신경세포 전구 세포 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포의 조성물을 생산하게 하는 것을 포함하는 것과 같다.
어떤 실시 예에서, 컨디션 된 피부 샘플로부터 최종적으로 분화된 세포를 고갈시키는 단계는 신경세포 계통 바이오마커를 함유하는 세포의 수가 강화될 수 있게 하는 컨디션에서 최종적으로 분화되지 않은 세포 (non-terminally differentiated cells) 의 샘플을 처치하는 동안 - 또는 이 단계의 한 부분으로서 수행될 수 있다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 신경세포 계통 바이오마커를 함유하는 세포의 수가 강화되는 결과를 가져오는 컨디션은 최종적으로 분화된 세포, 다기능 세포, 또는 신경세포 계통 세포의 발생보다는 다른 세포로 발생할 가능성이 있는 세포의 손실이 좀 더 유리한 컨디션을 포함할 수 있다. 그러므로 한 실시 예에서 그 방법은:
-머리털 모낭 세포를 포함하는 피부인, 피부 샘플을, 피부에 있는 머리털 모낭 세포가 성장상 (growth phase)으로 전이될 수 있는 컨디션에서 처치하여, 이로써 컨디션 된 피부의 샘플을 형성하고;
-선택적으로, 컨디션 된 피부로부터 샘플로 세포를 방출하고;
-샘플에 신경세포 계통 바이오마커를 함유하는 세포의 수가 강화될 수 있게 하는 컨디션에서 컨디션 된 피부로부터 세포의 샘플을 처치하고;
이로써 신경세포 전구 세포 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포의 조성물을 생산하는 방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 두 번째 실시 예는 지금 서술되며 여기서 자연 상태에서 이들에 붙어 있는 피부 조직으로부터 분리되거나, 또는 달리 피부 조직에 붙지 않도록 분리시킨, 머리털 모낭 샘플이 신경세포 전구 세포의 조성물을 유도하기 위하여 사용된다. 분리된 머리털 모낭을 사용하는 한 특별한 장점은 이 방법은 그렇지 않으면 주변의 피부 조직으로부터 머리털 모낭 세포의 방출을 요구하는 효소 또는 기계적인 수단의 상당한 사용 없이 시행될 수 있다는 점이다. 더 나아가 이는 또한 이어지는 배양에서 최종적으로 분화된 피부 세포 및 비-신경세포 계통 세포로의 오염을 피할 수 있다. 실시 예에 따르면, 이 방법은 신경세포 전구 세포, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식 가능한 세포가 강화된 조성물을 생산하며 및 다음의 단계가 포함된다:
-머리털 모낭 세포를 샘플을, 머리털 모낭 세포가 성장상 (growth phase)으로 전이될 수 있는 컨디션에서 처치하여, 이로써 컨디션 된 세포의 샘플을 형성하고;
-컨디션 된 세포의 샘플을 컨디션 된 세포의 샘플의 세포로부터 신경구의 형성이 가능할 수 있는 컨디션에서 처치하고;
이로써 신경세포 전구 세포 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식 가능한 세포를 생산한다.
컨디션 된 세포 샘플은 일반적으로 성장상 (growth phase)에 있는 머리털 모낭 세포가 강화되어 있고 및 신경세포 계통 바이오마커를 보여주는 세포를 함유한다.
신경구 (neurospheres) 의 형성이 완료되었을 때, 확장 단계에 의해 신경세포 전구 세포인 신경구 세포, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 세포의 수를 증가시키는 것이 유리할 것이다. 이 목적을 위해 알려진 다양한 기술들이 있다. 그러므로 다른 실시 예에서, 신경세포 전구 세포, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식 가능한 세포가 강화된 조성물을 생산하는 방법을 제공하며 그 방법에는:
- 머리털 모낭 세포의 샘플을 머리털 모낭 세포가 성장상 (growth phase)으로 전이될 수 있는 컨디션에서 처치하여, 이로써 컨디션 된 세포의 샘플을 형성하고;
-컨디션 된 세포의 샘플을 컨디션 된 세포의 샘플의 세포로부터 신경구 샘플 형성이 가능하도록 하는 컨디션에서 처치하고;
-신경구 샘플에 신경구 세포의 수가 확장되는 컨디션을 제공하고;
이로써 신경세포 전구 세포 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식 가능한 세포의 조성물 생산을 포함한다.
머리털 모낭 세포의 성장상으로의 전이 처치 단계가 완료되었을 때, 세포는 다른 세포 또는 재료와 뭉치거나 또는 그룹 지어질 수 있으며, 이 경우 세포는 단일 세포 현탁액을 형성하도록 분리될 수 있다. 이는 이 분야 기술에서 알려진 많은 기술에 의해 달성될 수 있다. 한 실시 예시에서는, 머리털 모낭 세포를 단일 세포로 분리시키는데 유용한 효소를 사용하는 효소적 분리가 사용된다. 그러므로 다른 실시 예에서, 신경세포 전구 세포, 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식 가능한 세포가 강화된 조성물을 생산하는 방법이 제공되며 그 방법에는;
-머리털 모낭 세포의 샘플을 머리털 모낭 세포가 성장상 (growth phase)으로 전이될 수 있는 컨디션에서 처치하여, 이로써 컨디션 된 세포의 샘플을 형성하고;
-컨디션 된 세포의 샘플이 세포의 분리가 가능하도록 하여 단일 세포로 분리되는 컨디션을 제공하고;
-컨디션 된 세포의 샘플을 컨디션 된 세포의 샘플의 세포로부터 신경구 샘플의 형성이 가능하도록 하는 컨디션에서 처치하고;
-신경구 샘플에 신경구 세포의 수가 확장되는 컨디션을 제공하고;
이로써 신경세포 전구 세포 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식 가능한 세포의 조성물 생산을 포함한다.
본 발명의 두 번째 실시 예에 따라, 정중선 후두 두피로부터 얻어진 약 200 머리털 모낭 샘플을 100시간까지의 기간 동안 친-성장기 (pro-anagenic) 환경의 컨디션에 있게 할 수 있다. 결과로 얻어진 세포는 효소적으로 단일 세포로 분리 시킬 수 있어 105 세포 정도로 제공된다. 이 세포들은 그 후 신경구 형성할 수 있는 조건에서 104 세포/ml 정도로 희석된 현탁액에서 배양될 수 있다. 이 현탁 배양액은 그 후 여과하여 신경구 만 수확하고, 효소 처리하여 세포를 분리하고, 단층으로 부착 확장 시킨다.
이 명세서에서 공개되고 및 정의된 본 발명은 언급된 개별적인 특징의 두 개 또는 그 이상의 다른 조합 모두에도 해당한다는 것을 이해할 것이다. 이 다른 조합 모두는 본 발명의 다른 여러 관점을 구성한다.
실시 예시
실시 예시 1 - 공여자 조직의 수확 (Harvest of donor tissue)
인간 성인 피부는 다음과 같이 후두골 두피로부터 수확하였다: 수확하기 전에 후두를 면도하고, 멸균하고 및 마취시켰다. 양면-날 수술용 가위 (dual-blade scalpel)를 사용하여 정중선 주변의 측면 둘레로, 10mm 넓이, 3cm 길이 샘플을 아래 지방 층까지 두께로 전부 얻었다.
실시 예시 2 - 공여자 조직의 머리털 사이클 조절 인자로의 배양 (Incubation of donor tissue with hair cycle regulatory factors)
공여자 피부 조직을 100시간 동안까지 항-난치성 (anti-refractory) 또는 친-증식성 (pro-proliferative) 머리털 모낭 조절 인자로의 컨디셔닝은 피부 샘플에 걸쳐 성장기: 휴지기 (anagen:telogen) 비율을 증가시킴은 물론이고 모낭 세포-간 신크로니 (inter-follicular synchrony)를 증가시키다. 그러한 인자로의 공여자 피부 조직의 전-처치는 그러므로 최종 세포 생존력, 수율 및 균일성을 증가시킨다. 피부의 배양은 증가한 자체 머리털 모낭 생존력을 생체 밖에서 제공하는 보충된 윌리엄의 E 배지 (supplemented Williams' E media) 환경 내에서 수행된다. 노긴 (Noggin) 또는 SHH는 항-난치성 머리털 모낭 세포 주기 인자 예로서 성장기: 휴지기 비율을 증가시키고 및 그러므로 최종 세포 생존력, 수율 및 균일성을 증가시킨다. TGF-β2 는 머리털 모낭 세포 주기 인자의 친-증식성 예로서 성장기: 휴지기 비율을 증가시키고 및 그러므로 최종 세포 생존력, 수율 및 균일성을 증가시킨다. 보충된 윌리엄의 E 배지 (supplemented Williams' E media)에서 노긴 (Noggin), SHH 및 TGF-β2 의 조합은 높은 세포 생존력, 수율 및 균일성을 제공한다. 실제로:
1. 과량의 피하 지방은 다듬어 제거하여, 피부 돌기가 어두운 점으로서 보일 수 있도록 하고 및 피부 샘플의 지방-쪽으로 유지하지도록 확실히 한다.
2. 나머지 피부는 더 나아가 PBS에 있는 1% 항-항 (anti-anti)으로 3번 세척하고
3. 샘플은 수술용 칼로 4mm X 10mm 조각으로 잘랐다.
4. 피부 조각은 보충된 윌리엄의 E 배지 ((11.1m M 글루코오스 (glucose) 및 2mM L-글루타민 (L-glutamine)을 함유))에 10밀리그램 (microgram)/ml 인슐린 (insulin) 플러스: 100-500ng/ml 노긴 (noggin (12-100 시간), 100-500ng/ml SHH (12-100 시간), 또는 50ng-200/ml TGF-β2 (Foitzik et al., 1999a) (12-100 시간), 또는 이의 조합으로 보충된 배지에서 배양 한다.
실시 예시 3 - 피부의 기계적 처리과정 및 소화 효소적 제제의 처치 (Mechanical processing of skin and digestive enzymatic agent treatment).
세포 외 매트릭스로부터 전구 세포의 방출을 위해 효소적인 소화와 함께 기계적인 장치로의 피부 분리는 세포의 생존력, 수율 및 균일성을 증가시킬 수 있다. 예시적인 조합은 밀테니 바이오텍 젠틀맥스 분리기 장치 (Miltenyi Biotec gentleMACS Dissociator device)를 젠틀맥스 (gentleMACS) 효소적 소화 키트 (enzymatic digestion kit)와 함께 사용하는 것이며, 이는 함께 세포의 생존력, 수율 및 균일성을 증가시킨다.
사용에 대한 독점적인 설명 이외에 세포 여과에 대한 맞춤형 접근 방식은 높은 생존력, 수율 및 균일성을 제공한다.
1. 젠틀맥스 분리 효소 (gentleMACS dissociation enzyme)를 제조한다 (하기의 부피는 4 x 4mm 피부 조각을 위한 것이다).
2. 조심스럽게 버퍼 L (Buffer L) (435ul) 및 효소 P (Enzyme P) (12.5ul)를 섞는다
3. 조심스럽게 효소 D (Enzyme D) (50 ul) 및 효소 A (Enzyme A)(2.5 ul)를 섞는다
4. C-튜브에 있는 L/P 혼합물에 D/A 혼합물을 첨가한다
5. 효소를 함유하고 있는 C-튜브에 4개의 피부 조각을 넣고 및 뚜껑을 돌려 닫는다.
6. 37°C에서 12시간 동안 배양한다
다음날
7. 시작하기 전에, 적어도 50mL 찬 세척 배지 (COLD wash media) (DMEM/F12 3:1 + 1% anti-anti)를 제조하고 및 적어도 50mL 성장 배지 (DMEM/F12 3:1 20ng/mL EGF + 40ng/mL FGF2 +2% B27)를 따듯하게 한다
8. 각 C-튜브에 있는 내용물을 0.5mL 찬 세척 배지를 첨가하여 희석하고
9. C-튜브 뚜껑을 단단히 닫고 및 젠틀맥스 분리기 (gentleMACS Dissociator)의 소매에 이 튜브를 꺼꾸로 부착한다.
10. 젠틀맥스 (gentleMACS)에 h_skin_01　프로그램을 선택하고 및 시작을 누른다.
11. 튜브의 내용물을 원심분리기에서 300xG 에서 45초 동안 돌려 아래로 모은다.
12. C-튜브로부터 내용물을 6-웰 플레이트 웰(들) 위에 있는 철 매쉬 체 (wire mesh strainer)로 비우고
13. 세척 배지를 사용하여 내용물을 체에서 웰로 헹구고
14. 진행하면서 어느 커다란 방해적인 조직 조각을 체에서부터 제거한다. 주목: 찬 배지로 파이펫팅하여 철저히 세척한 후에 조직 조각만 제거한다.
15. 세척 배지를 사용하여 모든 C-튜브를 철저히 50mL 튜브로 헹군다.
16. 이를 체로부터 같은 6 웰(들)로 파이펫하고
17. 50mL 튜브에 40uM 체를 올려놓고, 및 체 매쉬를 세척 배지로 적신다.
18. 세포/배지 혼합물을 40uM 체를 통해 여과하고
19. 세포/배지 혼합물을 두 번째 40uM 체를 통해 여과시켜, 이전의 여과 단계를 반복한다.
20. 세포를 300Хg에서 10분 동안 원심분리한다. 상등액을 완전히 제거한다.
실시 예시 4 - 잠재적 오염된 세포의 고갈 (Depletion of potential contaminatory cells)
잠재적으로 오염된 세포를 고갈시키는 것은 그러한 고갈을 하지 않은 것과 비교하여 세포 생존력, 수율 및 균일성을 증가시킨다. 예시적인 접근 방법은 그러한 살아 있는 세포의 고갈을 위해 밀테니 MACS 자석 세포 분리 시스템 (Miltenyi MACS magnetic cell isolation system)을 사용하는 것이다. 이 장치를 사용하여, 최종적으로 분화된 세포 타입의 고갈은 세포 생존력, 수율 및 일관성을 증가시킨다. 하나 또는 그 이상의 마커들이: 섬유아세포 (fibroblasts) ((섬유아세포-특이 항원 1 (fibroblast-specific antigen1)) 또는 상피 세포 (epithelial cells) (CD45)와 같은, 성숙한, 비-신경구 형성 세포의 고갈에 사용될 수 있다. 이 장치를 사용하여, 밀테니 죽은 세포 제거 키트 (Miltenyi Dead Cell removal kit)로 사멸 세포 및 부스러기를 고갈시키는 것은 또한 세포 생존력, 수율 및 일관성을 증가시킨다.
사멸 세포의 고갈을 위해:
1. 107의 총 세포 당, 0.25 mL의 20Х 결합 버퍼 스톡 용액 (Binding Buffer Stock Solution) 을 4.75 mL의 멸균된, 이중 증류수로 희석시킨다.
2. 세포 펠릿을 약 107의 총 세포 당 100 μL의 죽은 세포 제거 마이크로비드 (Dead Cell Removal MicroBeads)에 재현탁시킨다.
3. 잘 섞고 및 상온에서 (20-25 °C) 15분 동안 배양한다.
4. 세포의 수에 따라 컬럼 타입을 선택하고 및 컬럼을 MACS 분리기 (MACS Separator)의 자기 장 (magnetic field)에 놓는다.
5. 1Х 결합 버퍼 (Binding Buffer) (MS: 500 μL; LS: 3 mL)로 헹구어 컬럼을 준비한다.
6. 적절한 양의 1X 결합 버퍼에 있는 세포 현탁액을 컬럼(MS: 500-1000 μL; LS: 1-10 mL)에 적용한다. 음성 (라벨 되지 않은) 세포 분획을 따듯하게 한 DMEM을 함유하는 15 mL 튜브에 통과하게 한다.
7. 컬럼을 적절한 양의 1X 결합 버퍼 (MS: 4Х500 μL; LS: 4Х3mL)로 헹구고 및 라벨되지 않은 세포를 수집한다
8. 세포를 300Хg 에서 10분 동안 원심분리 한다.
9. MACS BSA 스톡 용액(Stock Solution)을 자동 MACS 헹굼 용액 (autoMACS Rinsing Solution)으로 1:20으로 희석하여 버퍼를 제조한다. 버퍼를 차게 (2-8 °C)유지한다.
10. 세포로부터 상등액을 완전히 제거하고 및 세포 펠릿을 107의 세포 당 80 μL의 버퍼에 재현탁시킨다. 107의 세포 당 20 μL의 마이크로비드 (MicroBeads) ((예를 들어, 항-섬유아세포 비드 (Anti-Fibroblast beads))를 첨가한다.
11. 잘 섞고 및 30분 동안 실온에서 (19-25 °C) 배양한다.
12. 107의 세포 당 1-2 mL 버퍼를 첨가하여 세포를 세척하고 및 300Хg 에서 10분 동안 원심분리 한다.
13. 상등액을 완전히 빨아낸다. 500 μL 의 버퍼에 108 세포까지 재현탁시킨다,
14. 세포의 수에 따라 컬럼 타입을 선택하고 및 컬럼을 MACS 분리기의 자기 장에 놓아둔다. 버퍼로 헹구어 컬럼을 제조한다.
15. 컬럼에 세포 현탁액을 적용한다. 라벨 되지 않은 세포를 함유하는 통과액 (flow-through)을 수집한다. 컬럼을 적절한 양의 버퍼로 세척한다. 통과한 라벨 되지 않은 세포를 수집하고 및 유출된 세포 현탁액 (effluent cell suspension)과 혼합한다.
실시 예시 5 -3D 신경구 형성 (3D Neurosphere Formation)
1. 라벨 되지 않은 세포 분획을 350xG 에서 10분 동안 원심분리한다.
2. 상등액을 제거하고 및 펠릿을 5mL SKN 성장 배지 (((DMEM/F12 (3:1), 20ng/mL EGF, 40ng/mL bFGF 및 2% B27))에 재현탁 시킨다
3. 10 uL를 제거하여 마아크로바이알 (microvial)로 옮기고 및 10 uL 트리판 불루 (Trypan blue)와 혼합한다. 세포 수 및 생존력을 기록한다.
4. 세포 현탁액을 SKN 성장 배지로 희석하고 및 비-조직 배양 처리한 6 웰-플레이트에 웰 당 6mL에 1 x 106 세포로 접종한다. 접종한 웰의 수 및 정확한 밀도가 무었인지를 기록한다.
5. 37°C 5% CO2에서 배양한다 - 이는 배양 0일을 나타낸다.
6. 모두 기록과 이미지를 기록 보관소로 옮긴다.
7. 배양 1일: 오염의 징후를 평가하고 및 만약 필요하면 배양을 버린다.
8. 배양 5일 및 7일: 낮은 및 높은 배율 (mag) 에서 세포의 사진을 찍고 및 신경구의 크기를 측정한다. 배양 성장에 대해 관찰을 기록한다. 만약 대부분의 신경구가 그 직경이 >50 um 이면 (첫 번째 나타난 후 약 1일) 2D 단일층 (monolayer) 확장으로 진행한다. 7일 후에, 신경구 크기를 매일 모니터한다. 대부분의 신경구가 >100um 되기 전에 또는 부착하기 전에 분리 시켜야 한다.
실시 예시 6 - 2D 단일층 확장 (2D Monolayer Expansion)
구 (sphere)가 플레이트에 부착되기 시작하는 것을 피한다 왜냐하면 이들은 회수 및 분리하기 어렵게 될 것이기 때문이다. 대부분 구의 직경이 ~100μm인 것이 목표이다. 첫 1-2 일에 나타나는 큰 불규칙한 세포 덩어리는 세포 응집체 (cell aggreate)이며, 신경구는 아니다. 이들은 세포 밀도가 너무 높거나 또는 조직이 충분히 분리되지 않았음을 제시한다.
1. 시작하기 전에, T25 플라스크 (또는 그러나 많은 것이 요구된다.)를 0.5 μg/cm2 라미닌 511 (Laminin 511) 로 커버하고 및 4C에서 하룻밤 동안 중합시키고 및 7-14mL 성장 배지 (나눌 T25 세포 당 7mL이 필요하고) - 1% pen-strep, 20ng/mL EGF, 40ng/mL bFGF 및 2% B27를 가진 DMEM/F12 3:1을 따듯하게 하고, 1mL TrypLE을 4°C에서 녹인다.
2. 높은 및 낮은 배율 둘 다 하에서 구 (sphere)의 사진을 찍고
3. 구를 함유하는 모든 배양 배지를 배양 웰에서 원심분리 튜브로 옮긴다.
4. 300xG 에서 10분 동안 원심분리한다.
5. 상등액을 제거하고 및 1mL TrypLE에 재현탁한다. 배양기에 5분 동안 놓아둔다.
6. 배양기에서 세포를 꺼내고 및 파이펫 (200 uL 파이펫으로)으로 100-200 번 위 및 아래로 파이펫팅하여 구를 떼어놓고
7. 2mL 성장 배지를 첨가하고 및 잘 섞고
8. 10 uL의 현탁액을 제거하여 작은 바이알에 10 uL 트리판 불루 (Trypan blue)와 함께 넣고 및 세포 수를 센다.
9. 총 생존 및 죽은 세포 수를 기록하고
10. 세포 현탁액을 필요한 대로 더 나아가 따듯한 성장 배지에 희석하고
11. T25 플라스크를 제조하기 위하여, 라미닌 511 (Laminin 511) 을 제거하고
12. 1x104세포/cm2 (=2.5x105 세포를 7mL에 한 T25 플라스크당)를 접종한다. 이는 PO이다.
13. 첫 24시간 동안 최소한의 움직임으로 세포를 배양기에 다시 넣는다.
14. 24시간 후에 신선한 성장 배지로 배지를 바꾼다
15. 성장 배지를 매 3일마다 바꾼다. 플라스크가 ~80%로 융합되었을 때 TryPLE로 세포를 계대배양하여, 1x104cells/cm2 로 재-접종한다.
참고문헌 (References)
BELICCHI, M., PISATI, F., LOPA, R., PORRETTI, L., FORTUNATO, F., SIRONI, M., SCALAMOGNA, M., PARATI, E. A., BRESOLIN, N. & TORRENTE, Y. 2004. Human skin-derived stem cells migrate throughout forebrain and differentiate into astrocytes after injection into adult mouse brain. J Neurosci Res, 77, 475-86.
BIERNASKIE, J. A., MCKENZIE, I. A., TOMA, J. G. & MILLER, F. D. 2007. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocols, 1, 2803.
FOITZIK, K., PAUS, R., DOETSCHMAN, T. & DOTTO, G. P. 1999a. The TGF-beta2 isoform is both a required and sufficient inducer of murine hair follicle morphogenesis. Dev Biol, 212, 278-89.
FUCHS, E. 2018. Skin Stem Cells in Silence, Action, and Cancer. Stem Cell Reports, 10, 1432-1438.
GE, Y., GOMEZ, N. C., ADAM, R. C., NIKOLOVA, M., YANG, H., VERMA, A., LU, C. P.-J., POLAK, L., YUAN, S., ELEMENTO, O. & FUCHS, E. 2017. Stem Cell Lineage Infidelity Drives Wound Repair and Cancer. Cell, 169, 636-650.e14.
HWANG, I., CHOI, K. A., PARK, H. S., JEONG, H., KIM, J. O., SEOL, K. C., KWON, H. J., PARK, I. H. & HONG, S. 2016. Neural Stem Cells Restore Hair Growth Through Activation of the Hair Follicle Niche. Cell Transplant, 25, 1439-51.
JOANNIDES, A., GAUGHWIN, P., SCHWIENING, C., MAJED, H., STERLING, J., COMPSTON, A. & CHANDRAN, S. 2004. Efficient generation of neural precursors from adult human skin: astrocytes promote neurogenesis from skin-derived stem cells. The Lancet, 364, 172-178.
PANG, Z. P., YANG, N., VIERBUCHEN, T., OSTERMEIER, A., FUENTES, D. R., YANG, T. Q., CITRI, A., SEBASTIANO, V., MARRO, S., SUDHOF, T. C. & WERNIG, M. 2011. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature, 476, 220-3.
SON, E. Y., ICHIDA, J. K., WAINGER, B. J., TOMA, J. S., RAFUSE, V. F., WOOLF, C. J. & EGGAN, K. 2011. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell, 9, 205-18.
TOMA, J. G., AKHAVAN, M., FERNANDES, K. J. L., BARNABE-HEIDER, F., SADIKOT, A., KAPLAN, D. R. & MILLER, F. D. 2001. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol, 3, 778-784.
TOMA, J. G., MCKENZIE, I. A., BAGLI, D. & MILLER, F. D. 2005. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells, 23, 727-37.
TRUONG, A., SI, E. S., DUNCAN, T. & VALENZUELA, M. 2016. Modeling neurodegenerative disorders in adult somatic cells: A critical review. Front. Biol., 11, 232-245.
TSUNEMOTO, R., LEE, S., SZUCS, A., CHUBUKOV, P., SOKOLOVA, I., BLANCHARD, J. W., EADE, K. T., BRUGGEMANN, J., WU, C., TORKAMANI, A., SANNA, P. P. & BALDWIN, K. K. 2018. Diverse reprogramming codes for neuronal identity. Nature.
VALENZUELA, M. J., DEAN, S. K., SACHDEV, P., TUCH, B. E. & SIDHU, K. S. 2008. Neural precursors from canine skin: a new direction for testing autologous cell replacement in the brain. Stem Cells Dev, 17, 1087-94.
VIERBUCHEN, T., OSTERMEIER, A., PANG, Z. P., KOKUBU, Y., SUDHOF, T. C. & WERNIG, M. 2010. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature, 463, 1035-1041.
YANG, H., ADAM, R. C., GE, Y., HUA, Z. L. & FUCHS, E. 2017. Epithelial-Mesenchymal Micro-niches Govern Stem Cell Lineage Choices. Cell, 169, 483-496.e13.
YU, H., FANG, D., KUMAR, S. M., LI, L., NGUYEN, T. K., ACS, G., HERLYN, M. & XU, X. 2006. Isolation of a Novel Population of Multipotent Adult Stem Cells from Human Hair Follicles. The American Journal of Pathology, 168, 1879-1888.
YU, H., KUMAR, S. M., KOSSENKOV, A. V., SHOWE, L. & XU, X. 2010. Stem Cells with Neural Crest Characteristics Derived from the Bulge Region of Cultured Human Hair Follicles. Journal of Investigative Dermatology, 130, 1227-1236.
ZHOU, D., ZHANG, Z., HE, L. M., DU, J., ZHANG, F., SUN, C. K., ZHOU, Y., WANG, X. W., LIN, G., SONG, K. M., WU, L. G. & YANG, Q. 2014. Conversion of fibroblasts to neural cells by p53 depletion. Cell Rep, 9, 2034-42.

Claims (31)

  1. 신경세포 전구 세포 (neuronal precursor cells)의 조성물, 또는 신경세포 계통 바이오마커 (neural lineage biomarkers)를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 방법으로:
    - 머리털 모낭 세포 (hair follicle cells)가 성장상 (growth phase)으로 전이될 수 있는 컨디션에서 머리털 모낭 세포 샘플을 처치하여, 이로써 컨디션 된 세포 샘플을 형성하고;
    - 샘플에 신경세포 계통 바이오마커를 함유하는 세포의 수가 강화될 수 있는 컨디션에서 컨디션 된 세포 샘플을 처치하고;
    이로써 신경세포 전구 세포의 조성물 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식할 수 있는 세포를 생산하는 것을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 머리털 모낭 세포는 머리털 모낭 전구 세포 (hair follicular precursor cells) 를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 머리털 모낭 전구 세포의 아집단 (subpopulation)은 신경- 외배엽 바이오마커 (neuro-ectodermal biomarkers)를 발현하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 머리털 모낭 세포는 피부의 샘플로 제공되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 머리털 모낭 세포는 대부분의 머리털 모낭 전구 세포가 성장상으로 전이될 수 있게 하는 컨디션에서 처치하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 머리털 모낭 세포가 휴지기 (telogen) 로부터 성장상 (anagen phase)으로 전이 되는 것을 촉진하기 위하여 머리털 모낭 세포를 항-난치성 머리털 모낭 인자 (Anti-refractory hair follicle factors)로 처치하고, 이로써 피부에 있는 머리털 모낭 세포가 성장상으로 유지되게 또는 전이될 수 있게 하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 인자는 노긴 (noggin) 또는 소닉 헤지호그 ( sonic hedgehog) (SHH)인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 머리털 모낭 세포가 휴지기 (telogen) 로부터 성장상 (anagen phase)으로 전이 되는 것을 촉진하기 위하여 머리털 모낭 세포를 친-성장 인자 (pro-growth factor)로 처치하고, 이로써 피부에 있는 머리털 모낭 세포가 성장상으로 유지되게 또는 전이될 수 있게 하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 친-성장 인자는 TGF-β2 인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 머리털 모낭 세포는 머리털 모낭 세포를 위한 배양 배지에서 배양되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 배지는 윌리암 배지 E (Williams medium E) 인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부는 인간 피부이거나, 또는 상기 머리털 모낭은 인간 머리털 모낭인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 또는 머리털 모낭은 두피인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 또는 머리털 모낭은 정중선 후두 두피인, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서:
    -머리털 모낭 세포를 포함하는 피부인, 피부 샘플을, 피부에 있는 머리털 모낭 세포가 성장상 (growth phase)으로 전이될 수 있는 컨디션에서 처치하여, 이로써 컨디션 된 피부 샘플을 형성하고;
    -컨디션 된 피부로부터 샘플로 세포를 방출하고;
    -최종적으로 분화된 세포 또는 사멸된 세포 또는 세포 부스러기를 샘플로부터 고갈시키고, 이로써 최종적으로 분화되지 않은 세포 (non-terminally differentiated cells) 의 샘플을 형성하고; 및 선택적으로
    - 샘플에 최종적으로 분화되지 않은 세포의 수가 확장될 수 있게 하는 컨디션에서 최종적으로 분화되지 않은 세포의 샘플을 처치하고;
    그럼으로써, 신경세포 전구 세포 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식가능한 세포의 조성물의 생산을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 세포를 샘플로 방출시키기 위하여 컨디션 된 피부의 세포 외 매트릭스 (extracellular matrix) 가 분해될 수 있는 컨디션에서 피부를 하나 또는 그 이상의 효소와 접촉시켜 세포가 피부로부터 방출되게 하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 효소는: 트립신 (trypsin), Dnase, 디스파제 (dispase), 및 콜라게나제 (collagenase)로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 세포를 샘플로 방출시키기 위하여 컨디션 된 피부의 세포 외 매트릭스를 기계적으로 파괴 시켜 컨디션 된 피부로부터 세포를 방출하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 기계적인 파괴에는 수동적인 분쇄 (manual trituration) 가 포함되는, 방법.
  20. 제15항에 있어서, 컨디션 된 피부로부터 샘플로 세포를 방출시킨 후에 및 샘플로부터 최종적으로 분화된 세포를 고갈시키기 전에 비-세포 성분을 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제15항에 있어서, 상기 최종적으로 분화된 세포를 샘플로부터 선택적으로 고갈하기 위하여 최종적으로 분화된 세포를 샘플로부터 선택적으로 고갈시킬 수 있게 하는 컨디션에서 샘플을 시약과 접촉시켜 최종적으로 분화된 세포를 샘플로부터 고갈시키는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 시약은 최종적으로 분화된 세포에는 붙으나 최종적으로 분화되지 않은 세포에는 붙지 않는 항체인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 시약은 신경세포 전구 세포에 결합하지 않는 항체인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 항체는 표피 (epidermis) 또는 피부 (dermis) 세포에 결합하는 항체인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 항체는 표피 세포 (epithelial cells) 또는 각질형성세포 (keratinocytes) 에, 또는 섬유아세포 (fibroblasts) 에 결합하는 항체인, 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 항체는 섬유아세포-특이 항원 1 (fibroblast-specific antigen 1) 또는 CD45에 결합하는 항체인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고갈 단계가 완료되었을 때, 샘플은 최종적으로 분화된 세포의 수가 약 5% 미만을 함유하는, 방법.
  28. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서:
    -머리털 모낭 세포의 샘플을 머리털 모낭 세포가 성장상 (growth phase)으로 전이될 수 있는 컨디션에서 처치하여, 이로써 컨디션 된 세포의 샘플을 형성하고;
    -컨디션 된 세포의 샘플이 세포의 분리가 가능하도록 하여 단일 세포로 분리되는 컨디션을 제공하고;
    -컨디션 된 세포의 샘플을 컨디션 된 세포의 샘플의 세포로부터 신경구 샘플의 형성이 가능하도록 하는 컨디션에서 처치하고;
    -신경구 샘플에 신경구 세포 (neurospheres)의 수가 확장되는 컨디션을 제공하고;
    이로써 신경세포 전구 세포 또는 신경세포 계통 바이오마커를 발현하는 증식 가능한 세포의 조성물 생산을 포함하는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이 방법에 의해 생산되는 조성물은 하기의 특성:
    <5%의 세포가 아교세포성 GFAP (astroglial GFAP), 아디포넥틴 (adiponectin), 올리고덴드로사이트 04 (oligodendrocyte 04), 근육섬유아세포 SMA (myofibroblast SMA)를 발현하고.
    >90%의 세포가 네스틴 (nestin), CD133 및 βIII-튜블린 (βIII-tubulin)에 대해 양성인 특성을 소유하는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이 방법에 의해 생산되는 조성물은 시험관 내 신경세포 분화 후 90 내지 100%의 신경세포 수율을 소유하는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 세포는 4주 이내에 107 수준으로 균질하고 및 단일기능의 신경세포 전구 세포를 생산하도록 확장 될 수 있는, 방법.






KR1020217002200A 2018-06-22 2019-06-21 신경세포 전구 세포의 확장 및 분화 KR20210024582A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2018902237 2018-06-22
AU2018902237A AU2018902237A0 (en) 2018-06-22 Cell therapy
PCT/AU2019/050637 WO2019241846A1 (en) 2018-06-22 2019-06-21 Expansion and differentiation of neuronal precursor cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210024582A true KR20210024582A (ko) 2021-03-05

Family

ID=68982558

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217002200A KR20210024582A (ko) 2018-06-22 2019-06-21 신경세포 전구 세포의 확장 및 분화

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20210269770A1 (ko)
EP (1) EP3810751A4 (ko)
JP (1) JP2021528102A (ko)
KR (1) KR20210024582A (ko)
CN (1) CN112384612A (ko)
AU (2) AU2019290037B2 (ko)
CA (1) CA3100577A1 (ko)
SG (1) SG11202011395RA (ko)
WO (1) WO2019241846A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112708610B (zh) * 2021-03-26 2021-07-09 上海伯豪生物技术有限公司 一种用于皮肤组织解离的混合酶及其制备方法、解离试剂盒、解离方法
CN115322961B (zh) * 2022-08-19 2023-10-20 北京全式金生物技术股份有限公司 一种离体培养心肌细胞的解离液及解离方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7015037B1 (en) * 1999-08-05 2006-03-21 Regents Of The University Of Minnesota Multiponent adult stem cells and methods for isolation
CN101407785B (zh) * 2001-09-20 2015-02-11 抗癌公司 表达巢蛋白的毛囊干细胞
EP1718732B1 (en) * 2004-01-27 2013-10-30 The Hospital for Sick Children Research Institute Methods of making and using skin-derived stem cells
KR100771171B1 (ko) * 2006-07-05 2007-10-29 재단법인서울대학교산학협력재단 모낭 줄기세포의 분리, 증식 및 분화 방법 및 대머리치료용 조성물
ES2739672T3 (es) * 2009-10-31 2020-02-03 Genesis Tech Limited Procedimientos de reprogramación de células y usos de los mismos
WO2011144901A1 (en) * 2010-05-20 2011-11-24 The University Of Newcastle Upon Tyne Expansion and directed differentiation of epidermal neural crest stem cells
NL2010222C2 (en) * 2013-02-01 2014-08-04 Conradus Ghosal Gho Composition and method for generating a desired cell type and/or tissue type from hair follicular stem cells.

Also Published As

Publication number Publication date
AU2019290037A1 (en) 2020-12-10
CN112384612A (zh) 2021-02-19
EP3810751A1 (en) 2021-04-28
WO2019241846A1 (en) 2019-12-26
EP3810751A4 (en) 2022-03-30
CA3100577A1 (en) 2019-12-26
AU2023200492A1 (en) 2023-03-02
US20210269770A1 (en) 2021-09-02
SG11202011395RA (en) 2020-12-30
AU2019290037B2 (en) 2022-11-03
JP2021528102A (ja) 2021-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Toma et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin
Achilleos et al. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy
Reynolds et al. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell
KR100449141B1 (ko) 간엽 간세포를 신경세포로 분화시키는 방법
Ma et al. Generation of neural stem cell-like cells from bone marrow-derived human mesenchymal stem cells
EP1718732B1 (en) Methods of making and using skin-derived stem cells
Hunt et al. Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation
Zhang et al. Sweat gland regeneration after burn injury: is stem cell therapy a new hope?
AU2023200492A1 (en) Expansion and differentiation of neuronal precursor cells
Batioglu–Karaaltin et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model
JP7370613B2 (ja) 毛包およびデノボ乳頭の作製方法ならびにインビトロ試験およびインビボ移植のためのそれらの使用
Gonmanee et al. Neuronal differentiation of dental pulp stem cells from human permanent and deciduous teeth following coculture with rat auditory brainstem slices
KR20070080561A (ko) 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 조성물
Dai et al. The Human Skin‐Derived Precursors for Regenerative Medicine: Current State, Challenges, and Perspectives
Vasyliev et al. Comparative analysis of biological properties of large‐scale expanded adult neural crest‐derived stem cells isolated from human hair follicle and skin dermis
Chan et al. A two-stepped culture method for efficient production of trichogenic keratinocytes
EP1801203A1 (en) Method of producing adaptation medium for astrocyte-like cells
KR101793722B1 (ko) 성상세포의 생산방법
Aquino Uncovering the in vivo source of adult neural crest stem cells
Inoue et al. Improvement of hind-limb paralysis following traumatic spinal cord injury in rats by grafting normal human keratinocytes: new cell-therapy strategy for nerve regeneration
EP1642965B1 (de) Verwendung von differenzierten Fibroblasten oder einer primären Fibroblastkultur zur Transdifferenzierung in Fett-, Knochen- und Knorpelzellen
Kamiya et al. Induction of Functional Mesenchymal Stem/Stromal Cells from Human iPCs Via a Neural Crest Cell Lineage Under Xeno-Free Conditions
Ohyama Strategies to utilize iPS cells for hair follicle regeneration and the treatment of hair loss disorders
JP5584875B2 (ja) 成体膵由来膵幹細胞の製造方法
KR100768533B1 (ko) 피부 진피로부터 신경전구세포를 유도하는 방법 및 중추또는 말초 신경계 손상 치료제