JP5584875B2 - 成体膵由来膵幹細胞の製造方法 - Google Patents
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(1)胚性幹細胞を未分化な状態で移植すると腫瘍(teratoma)が発生しやすい。
(2)ヒト胚性幹細胞株は染色体異常を起こしやすい。
(3)2001年以前に確立された胚性幹細胞株はマウス細胞(Feeder cells)とともに培養されており、マウスの細胞とのコンタミネーションが生じる可能性がある。
(4)完全に分化した細胞を作製するには多くのステップとコストが必要となる、という課題を有している。
Miyamotoら、Cancer Cell、2003年、3(6)、pp565−576
(1)コラーゲンゲル三次元培養は、コラーゲンゲル中で培養するため手間とコストがかかる。
(2)この実験系において出現する成体膵由来膵幹細胞は、約5日でほぼ全て管上皮細胞様細胞(duct like cell)に変化してしまう。この途中第3日頃に現れるNestin陽性細胞は連続的に変化し、Duct like cellになってしまう。つまり、上記非特許文献1に記載の技術では、この実験系は成体膵由来膵幹細胞を安定にしかも大量に得る点において課題を残している。
(1)膵腺房細胞の分離
本実施形態に係る成体膵由来膵幹細胞の誘導に先立ち、まず膵腺房細胞の分離を行う。膵腺房細胞の分離については常法を用いることができ、例えば膵臓から手術による摘出、細切とコラゲネース処理、フィルター処理の後遠心分離によって行うことができる。これに要する期間としては概ね一日程度である。
本実施形態ではゼラチンコート処理をした細胞培養皿を用い、この細胞培養皿に膵腺房細胞を加えた完全細胞培養液を塗布することにより行う。この成体膵由来膵幹細胞は概ね4〜7日で製造することができる。
実施形態1では血清を必須成分とした完全細胞培養液を用いているのに対し、本実施形態では血清を含まない無血清の完全細胞培養液を用いることが本実施形態の特徴のひとつである。それ以外の要素については実施形態1とほぼ同様であり、本実施形態では主として異なる要素についてのみ説明する。
次に、上記した実施形態1の例について図面を用いて更に詳細に説明する。なお本実施例ではマウスから採取した膵腺房細胞を用いて実験対象として用いているが、人体から採取した膵腺房細胞に対しても応用が可能であろうと考えられる。
CD1マウス(4週齢)をisoflurenによる全身麻酔下で開腹し、膵臓を摘出した。膵臓は鋏を用いて約2ミリ角に細切した後collagenaseP(Rosche社)を0.2mg/mlの濃度で37度で10分間処理した。
あらかじめゼラチン(0.1%、Sigma)で細胞培養皿をコーティングした。そして上記の工程により得た腺房細胞を、IMDM培地90ml、FBS10ml、EGF50ng/ml含む完全細胞培養液に加え、上記細胞培養皿に塗布して培養を開始した。この開始時点における腺房細胞の状態を図1に示す。なお、腺房細胞の濃度は1×104acni cluster for 100mm dish程度とし、37度のCO2 incubaterで培養した。
本実施例では上記の方法により製造された成体膵由来膵幹細胞について、増殖及び他の細胞種への分化を行った。
膵内分泌細胞への分化は、無血清培地中で7−14日間培養することによって行った。なおこの場合において無血清培地は、DMEM/F12倍地(invitrogen社)を100ml、HGF500ng、ActibinAを500ng、Nicotanimide(NIC Sigma社)を1M溶液を1mlml含むものを用いた。この結果を図4に示す。なお図4はこの、無血清培地に移した後9日後(計15日後)の結果を示す図である。
なお、本実施例においては神経細胞への分化についても試みた。神経細胞への再分化における無血清培地としては、DMEM/F12倍地(Iinvitrogen社)を100ml、N2 1ml、B27(Iinvitrogen社)1ml、Nicotinamideの1M溶液を1mlを含むものを用い、成体膵由来膵幹細胞は上記の方法により得られたものを用いた。
本実施例では、TFGαの代わりにFGF10を用いた以外は実施例1とほぼ同じ条件で行った。FGF10も50ng/mlとなるように完全細胞培養液に加えている。なお、先ほどと同様、腺房細胞を培養6日後の結果を図8に示す。また本実施例においても免疫細胞染色法によりほぼ100%Nestin陽性であることを確認した。この結果を図9に示す。
本実施例では、無血清培地による実施例である。
あらかじめゼラチン(0.1%、Sigma社)で細胞培養皿をコーティングした。そして上記の工程により得た腺房細胞を、DMEM/F12培地100ml、アルブミン(Sigma社)1g、EGF50ng/ml、BMP2 50ng/ml含む完全細胞培養液に加え、上記細胞培養皿に塗布して培養を開始した。なお、腺房細胞の濃度は1×104acni cluster for 100mm dish程度とし、37度のCO2 incubaterで培養した。
Claims (3)
- 血清と、TGFα、EGF、FGF10の少なくともいずれかを含む増殖因子と、を含有する完全細胞培養液を、ゼラチンを含んでなる細胞外器質がコーティングされた細胞培養皿に塗布し、膵腺房細胞を脱分化させてNestin陽性の成体膵由来膵幹細胞を製造する方法。
- 前記血清は、前記完全培養液に対して1〜20%の範囲内で含有されていることを特徴とする請求項1記載の成体膵由来膵幹細胞を製造する方法。
- 前記増殖因子は、前記完全培養液に対し1ng/ml〜100ng/mlの範囲内で含有されていることを特徴とする請求項1記載の成体膵由来幹細胞を製造する方法。
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