CN110960727A - 一种组织工程化尿道支架移植物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种组织工程化尿道支架移植物及其制备方法和应用，涉及组织工程技术领域，该组织工程化尿道支架移植物为接种有上皮细胞和平滑肌细胞的高分子可降解纳米纤维管，所述上皮细胞为含有单能分化潜能的上皮祖细胞的上皮细胞，该纳米纤维管的降解速率可与尿道修复的再生速率匹配，能有效修复尿道损伤。

Description

一种组织工程化尿道支架移植物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，具体而言，涉及一种组织工程化尿道支架移植物及其制备方法和应用。
背景技术
尿道下裂，尿道骑跨伤或摩托车等原因导致的婴幼儿尿道缺损是泌尿系统最常见的疾病。患儿无法进行正常排尿，必须进行尿道重建手术治疗。其中，先天性儿童尿道下裂发病率约3.2‰，目前临床主要使用自体组织移植(如阴茎阴囊皮瓣)来进行尿道重建。
尿道下裂或外伤性损伤的成形术历经百余年发展有了显著进步，方法多达数百种，但仍没有一个效果显著的优选方案，且术后尿道皮肤瘘、尿道狭窄、憩室形成和阴茎弯曲等并发症发生率仍较高，约有1/5的病人需进行二次，甚至多次手术修复，更有部分病人属于瘢痕体质，自体组织修复迁延难愈，从而形成阴茎和尿道残疾，给患儿身心发育带来严重不良影响。
现有的尿道移植支架的力学性能、生物相容性以及移植后坏死等众多因素的影响，其极大地影响了手术效果及术后长期的排尿及生殖功能。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种组织工程化尿道支架移植物、组织工程化尿道支架移植物的制备方法和上皮细胞和平滑肌细胞在制备组织工程化尿道支架移植物中的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物，所述组织工程化尿道支架移植物为接种有上皮细胞和平滑肌细胞的纳米纤维管，所述上皮细胞为含有单能分化潜能的上皮祖细胞的上皮细胞。
第二方面，实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，其包括将上皮细胞和平滑肌细胞接种于纳米纤维管上，所述上皮细胞为含有单能分化潜能的上皮祖细胞的上皮细胞。
第三方面，实施例提供上皮细胞和平滑肌细胞在制备组织工程化尿道支架移植物中的应用，所述上皮细胞为含有单能分化潜能的上皮祖细胞的上皮细胞。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供了一种组织工程化尿道支架移植物、组织工程化尿道支架移植物的制备方法和上皮细胞和平滑肌细胞在制备组织工程化尿道支架移植物中的应用，该组织工程化尿道支架移植物为接种有上皮细胞和平滑肌细胞的高分子可降解纳米纤维管，所述上皮细胞为含有单能分化潜能的上皮祖细胞的上皮细胞，该纳米纤维管的降解速率可与尿道修复的再生速率匹配，有效修复尿道损伤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明试验例中的检测结果图，其中，图1中A～D为支架植入石蟹猴尿道缺损处7天后的概貌组织染色图，图1中E～H为支架上框内放大的免疫荧光染色图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供了一种组织工程化尿道支架移植物，所述组织工程化尿道支架移植物为接种有上皮细胞和平滑肌细胞的纳米纤维管，所述上皮细胞为含有单能分化潜能的上皮祖细胞。
祖细胞是干细胞彻底分化前，转化的中间细胞，属于成体干细胞，是未完全分化的多能或转能干细胞。
在可选实施方式中，所述含有单能分化潜能的上皮祖细胞的尿上皮细胞由细胞分化培养基培养制得，所述细胞分化培养基中包括基础培养液，且所述细胞分化培养基中还含有以下组分：1ng/mL～25μg/mL表皮生长因子、2ng/mL～25μg/mL成纤维生长因子、1ng/mL～25μg/mL干细胞生长因子以及10ng/mL～50μg/mL胰岛素。需要说明的是，上述浓度值为组分在细胞分化培养基中的终浓度，例如表皮生长因子在细胞分化培养基中的终浓度为1ng/mL～25μg/mL，其他组分同。
在可选实施方式中，所述细胞分化培养基中还含有以下组分：5～25μg/mL表皮生长因子、10～25μg/mL成纤维生长因子、5～25μg/mL干细胞生长因子以及20～50μg/mL胰岛素。
在可选实施方式中，所述基础培养液包括DMEM和/或DMEM/F12。
在可选实施方式中，所述单能分化潜能的祖细胞来源于以下至少一种上皮组织的基底层：皮肤上皮层、尿道上皮层、口腔上皮层以及角膜缘上皮层。
在可选实施方式中，所述平滑肌细胞选自肾平滑肌细胞、膀胱平滑肌细胞和尿道平滑肌细胞中的至少一种。
在可选实施方式中，所述纳米纤维管由第一高分子材料和第二高分子材料以共纺比为(1～9):(1～9)共纺制得。
所述第一高分子材料选自左旋聚乳酸(PLLA)、右旋聚乳酸(PDLA)、聚己内酯(PCL)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚乙烯醇(PVA)中的至少一种。
在可选实施方式中，所述左旋聚乳酸、右旋聚乳酸、聚己内酯、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乙烯醇的分子量均为3000～300000Da。
所述第二高分子材料选自胶原蛋白(Collagen)、明胶(gelatin)和透明质酸(HA)中的至少一种。
在可选实施方式中，所述第一高分子材料和第二高分子材料的共纺比为(8～9):1。
在可选实施方式中，所述纳米纤维管为分层管状或者单层管状；
在可选实施方式中，所述纳米纤维管的长度为5～20cm，外经为1～4cm，厚度为50～500μm。
在可选实施方式中，所述含有单能分化潜能的上皮祖细胞的尿上皮细胞接种于所述纳米纤维管的内壁，所述平滑肌细胞接种于所述纳米纤维管的外壁。
本发明实施例还提供了一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，该制备方法包括将上皮细胞和平滑肌细胞接种于纳米纤维管上，所述上皮细胞为含有单能分化潜能的上皮祖细胞的上皮细胞。
上皮细胞和平滑肌细胞同上述实施方式所述，不再赘述。
在可选实施方式中，所述制备方法包括所述纳米纤维管的制备：将上述第一高分子材料和上述第二高分子材料以共纺比为(1～9):(1～9)共纺。
在可选实施方式中，所述制备方法包括在共纺时加入有机溶剂，所述有机溶剂选自四氢呋喃、1,4-二氧六环、三氯甲烷、二氯甲烷和N,N-二甲基二酰胺中的至少一种。
在可选实施方式中，在电纺时，每1g第一高分子材料和第二高分子材料的混合物，加入8～12mL所述有机溶剂，以形成电纺液。
本发明实施例还提供了上述上皮细胞和平滑肌细胞在制备组织工程化尿道支架移植物中的应用，所述上皮细胞为含有单能分化潜能的上皮祖细胞的上皮细胞。
在该应用中，上皮细胞、平滑肌细胞以及组织工程化尿道支架移植物均同前述实施方式所述，不再赘述。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
组织工程化尿道支架移植物的制备方法。
称取0.9g的第一高分子材料(左旋聚乳酸，分子量30000Da)，再称取0.1g的第二高分子材料(胶原蛋白)，置于一个15ml玻璃烧瓶中，10ml加入有机溶剂(四氢呋喃)，充分溶解，得到电纺液。
用移液器将溶解好电纺液转移至静电纺丝针筒内，接好纺丝喷头(内径22G)，设定高压为15kV，低压为-5kV，流速为3.0mL/h，旋转接收装置距离喷头12cm，接收装置为外径为2.0cm长度为18cm的圆柱形不锈钢管。调节接收装置转速为900rpm，电纺48h收集管状纳米纤维。
收获电纺成功的管状纳米纤维支架经真空干燥，液氮冷冻切割成合适长度的管状支架(纳米纤维管)，置于无菌培养皿中，封口膜封口，12kGyCo60辐射灭菌后备用。
移植前一个月，从患儿体内分别取0.5mm3的膀胱组织和皮肤上皮组织，从膀胱组织中分离出来平滑肌细胞，体外扩增培养7天后，将扩增的膀胱平滑肌细胞接种于管状纳米纤维支架的外壁上。
接种步骤为：无菌条件下沿管状支架切开，获得一张有厚度的纳米纤维薄膜，将外壁平铺在培养皿中，内壁贴培养皿底部，外壁朝上，沿纤维膜接种平滑肌细胞，然后置于培养箱内静置约12h，再添加大量的细胞培养液持续7天，每2天更换培养基一次。
从皮肤上皮组织的基底层分离出具有单能分化潜能的祖细胞，分离出来的出上皮祖细胞采用祖细胞标志物P63，PAX6，Wnt7a的免疫荧光染色鉴定，染色阳性的即为具有单能分化潜能皮肤上皮祖细胞，然后用细胞分化培养基培养皮肤上皮祖细胞14天。
细胞分化培养基包括基础培养液，且所述细胞分化培养基中还含有以下组分：1μg/mL表皮生长因子、5μgmL成纤维生长因子、0.3μg/mL干细胞生长因子以及2μg/mL胰岛素。
培养后，进行尿道上皮特异性标志物上皮角蛋白20和尿路斑块蛋白UPKIII的免疫荧光染色鉴定，即可获得皮肤祖细胞定向分化的尿道上皮细胞。
把已接种尿路平滑肌细胞7天的组织工程化尿道支架移植物纤维膜翻转，内壁朝上，接种定向分化成尿道上皮细胞的上皮祖细胞，12h小时后，添加大量细胞培养液，体外共培养时间约持续7天，即可获得含有上皮祖细胞分化的尿上皮细胞和尿路平滑肌细胞的管状纳米纤维支架，可用于体内移植。
实施例2
本实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，大致与实施例1提供的制备方法相同，区别在于组织工程化尿道支架移植物组分的不同，区别如下：
采用的第一高分子材料为聚羟基乙酸(分子量30000Da)；第二高分子材料为明胶，有机溶剂为三氯甲烷。
实施例3
本实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，大致与实施例1提供的制备方法相同，区别在于组织工程化尿道支架移植物组分的不同和制备方法的不同。
组分的区别如下：
采用的第一高分子材料为聚己内酯(分子量30000Da)；第二高分子材料为明胶，有机溶剂为二氯甲烷。
制备方法的区别如下：
平滑肌细胞从患儿体内的肾组织中分离得到，体外培养后，将肾平滑肌细胞接种于管状纳米纤维支架上。
实施例4
本实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，大致与实施例1提供的制备方法相同，区别在于组织工程化尿道支架移植物组分的不同，区别如下：
采用的第一高分子材料为聚己内酯(分子量30000Da)；第二高分子材料为透明质酸；有机溶剂为1,4-二氧六环。
实施例5
本实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，大致与实施例1提供的制备方法相同，区别在于组织工程化尿道支架移植物组分的不同，区别如下：
采用的第一高分子材料为聚乳酸羟基共聚物(分子量30000Da)；第二高分子材料为透明质酸；有机溶剂为N,N-二甲基二酰胺。
实施例6
本实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，大致与实施例1提供的制备方法相同，区别在于组织工程化尿道支架移植物组分的不同，区别如下：
采用的第一高分子材料为聚乙烯醇(分子量30000Da)；第二高分子材料为透明质酸；有机溶剂为N,N-二甲基二酰胺。
实施例7
本实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，大致与实施例1提供的制备方法相同，区别在于组织工程化尿道支架移植物组分的不同，区别如下：
采用的第一高分子材料为聚乙烯醇(分子量30000Da)；第二高分子材料为透明质酸；有机溶剂为1,4-二氧六环。
实施例8
本实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，大致与实施例1提供的制备方法相同，区别在于组织工程化尿道支架移植物组分的不同，区别如下：
采用的第一高分子材料为右旋聚乳酸(分子量30000Da)；第二高分子材料为透明质酸；有机溶剂为三氯甲烷。
实施例9
本实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，大致与实施例1提供的制备方法相同，区别在于组织工程化尿道支架移植物组分的不同，区别如下：
采用的第一高分子材料为聚羟基乙酸(分子量30000Da)；第二高分子材料为明胶；有机溶剂为三氯甲烷。
实施例10
本实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，大致与实施例1提供的制备方法相同，区别在于组织工程化尿道支架移植物组分的不同和制备方法的不同。
组分的区别如下：
采用的第一高分子材料为聚羟基乙酸(分子量30000Da)；第二高分子材料为明胶；有机溶剂为三氯甲烷。
制备方法的区别如下：
上皮干细胞/祖细胞从患儿口腔上皮组织的基底层分离出来，体外培养后，将含有口腔上皮祖细胞的口腔上皮细胞接种于管状纳米纤维支架的内壁。
实施例11
本实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，大致与实施例1提供的制备方法相同，区别在于组织工程化尿道支架移植物组分的不同和制备方法的不同。
组分的区别如下：
采用的第一高分子材料为聚乳酸羟基乙酸共聚物(分子量30000Da)；第二高分子材料为明胶；有机溶剂为三氯甲烷。
制备方法的区别如下：
上皮干细胞/祖细胞从患儿口腔上皮组织的基底层分离出来，体外培养后，将含有口腔上皮祖细胞的口腔上皮细胞接种于管状纳米纤维支架的内壁。
实施例12
本实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，大致与实施例1提供的制备方法相同，区别在于组织工程化尿道支架移植物组分的不同和制备方法的不同。
组分的区别如下：
采用的第一高分子材料为聚乙烯醇(分子量30000Da)；第二高分子材料为明胶；有机溶剂为三氯甲烷。
制备方法的区别如下：
上皮干细胞/祖细胞从患儿口腔上皮组织的基底层分离出来，体外培养后，将含有口腔上皮祖细胞的口腔上皮细胞接种于管状纳米纤维支架的内壁。
实施例13
本实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，大致与实施例1提供的制备方法相同，区别在于组织工程化尿道支架移植物组分的不同和制备方法的不同。
组分的区别如下：
采用的第一高分子材料为聚羟基乙酸(分子量30000Da)；有机溶剂为三氯甲烷。
制备方法的区别如下：
上皮干细胞/祖细胞从患儿口腔上皮组织的基底层分离出来，体外培养后，将含有口腔上皮祖细胞的口腔上皮细胞接种于管状纳米纤维支架的内壁。
实施例14
本实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，大致与实施例1提供的制备方法相同，区别在于组织工程化尿道支架移植物组分的不同和制备方法的不同。
组分的区别如下：
采用的第一高分子材料为聚己内酯(分子量30000Da)；有机溶剂为三氯甲烷。
制备方法的区别如下：
上皮干细胞/祖细胞从患儿口腔上皮组织的基底层分离出来，体外培养后，将含有口腔上皮祖细胞的口腔上皮细胞接种于管状纳米纤维支架的内壁。
实施例15
本实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，大致与实施例1提供的制备方法相同，区别在于组织工程化尿道支架移植物组分的不同和制备方法的不同。
组分的区别如下：
采用的第一高分子材料为聚乳酸羟基乙酸共聚物(分子量30000Da)；有机溶剂为三氯甲烷。
制备方法的区别如下：
上皮干细胞/祖细胞从患儿口腔上皮组织的基底层分离出来，体外培养后，将含有口腔上皮祖细胞的口腔上皮细胞接种于管状纳米纤维支架的内壁。
实施例16
本实施例提供一种组织工程化尿道支架移植物的制备方法，大致与实施例1提供的制备方法相同，区别在于组织工程化尿道支架移植物组分的不同和制备方法的不同。
组分的区别如下：
采用的第一高分子材料为聚乙烯醇(分子量30000)；有机溶剂为三氯甲烷。
制备方法的区别如下：
上皮干细胞/祖细胞从患儿口腔上皮组织的基底层分离出来，体外培养后，将含有口腔上皮祖细胞的口腔上皮细胞接种于管状纳米纤维支架的内壁。
试验例
将本发明实施例1提供的制备方法制得的管状纳米纤维支架植入体内7天，7天后，对再生尿道横截面的组织进行化学染色和免疫荧光染色，结果请参照附图1。
图1中E显示管状支架内壁上具有干性特征的尿道上皮细胞标志物K5和Wnt7a表达阳性，图1中F显示管状支架内壁上尿道上皮细胞增殖标记物Ki67和尿道上皮组织外层角蛋白标志物K20表达阳性，图1中G显示管状支架内壁上新生的尿道上皮化层P63和内壁层面的尿道上皮特异性尿路斑块蛋白UPK1a表达阳性，图1中H显示管状组织工程化尿道支架移植物内壁上P63和PAX6表达阳性。
由图1可知，实施例1提供的组织工程化尿道支架移植物内壁开始上皮化，内壁上的上皮干/祖细胞分化成的尿道上皮细胞仍具有干细胞特性，开始逐渐形成成熟上皮化组织。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种组织工程化尿道支架移植物，其特征在于，所述组织工程化尿道支架移植物为接种有上皮细胞和平滑肌细胞的纳米纤维管，所述上皮细胞为含有单能分化潜能的上皮祖细胞的上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的组织工程化尿道支架移植物，其特征在于，所述含有单能分化潜能的上皮祖细胞的上皮细胞由细胞分化培养基培养制得，所述细胞分化培养基包括基础培养液，且所述细胞分化培养基中还含有以下组分：1ng/mL～25μg/mL表皮生长因子、2ng/mL～25μg/mL成纤维生长因子、1ng/mL～25μg/mL干细胞生长因子以及10ng/mL～50μg/mL胰岛素；
优选地，所述基础培养液包括DMEM和/或DMEM/F12。
3.根据权利要求1所述的组织工程化尿道支架移植物，其特征在于，所述纳米纤维管由第一高分子材料和第二高分子材料以共纺比为(1～9):(1～9)共纺制得；
所述第一高分子材料选自左旋聚乳酸、右旋聚乳酸、聚己内酯、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乙烯醇中的至少一种；
所述第二高分子材料选自胶原蛋白、明胶和透明质酸中的至少一种；
优选地，在共纺时，在第一高分子材料和第二高分子材料中加入有机溶剂，所述有机溶剂选自四氢呋喃、1,4-二氧六环、三氯甲烷、二氯甲烷和N,N-二甲基二酰胺中的至少一种；
优选地，每1g第一高分子材料和第二高分子材料的混合物，加入8～12mL所述有机溶剂。
4.根据权利要求3所述的组织工程化尿道支架移植物，其特征在于，所述左旋聚乳酸、右旋聚乳酸、聚己内酯、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乙烯醇的分子量均为3000～300000Da；
优选地，所述第一高分子材料和第二高分子材料的共纺比为(8～9):1。
5.根据权利要求1～4任一项所述的组织工程化尿道支架移植物，其特征在于，所述纳米纤维管为分层管状或者单层管状；
优选地，所述纳米纤维管的长度为5～20cm，外经为1～4cm，厚度为50～500μm。
6.根据权利要求1～4任一项所述的组织工程化尿道支架移植物，其特征在于，所述含有单能分化潜能的上皮祖细胞来源于以下至少一种上皮层的基底层：皮肤上皮层、尿道上皮层、口腔上皮层以及角膜缘上皮层；
优选地，所述平滑肌细胞选自肾平滑肌细胞、膀胱平滑肌细胞和尿道平滑肌细胞中的至少一种；
优选地，将所述含有单能分化潜能的上皮祖细胞的尿上皮细胞接种于所述纳米纤维管的内壁，所述平滑肌细胞接种于所述纳米纤维管的外壁。
7.如权利要求1～6任一项所述的组织工程化尿道支架移植物的制备方法，其特征在于，其包括将上皮细胞和平滑肌细胞接种于纳米纤维管上，所述上皮细胞为含有单能分化潜能的上皮祖细胞的上皮细胞。
8.上皮细胞和平滑肌细胞在制备组织工程化尿道支架移植物中的应用，其特征在于，所述上皮细胞为含有单能分化潜能的上皮祖细胞的上皮细胞。
9.根据权利要求8所述的上皮细胞和平滑肌细胞在制备组织工程化尿道支架移植物中的应用，其特征在于，所述含有单能分化潜能的上皮祖细胞的尿上皮细胞由细胞分化培养基培养制得，所述细胞分化培养基包括基础培养液，且所述细胞分化培养基中还含有以下组分：
1ng/mL～25μg/mL表皮生长因子、2ng/mL～25μg/mL成纤维生长因子、1ng/mL～25μg/mL干细胞生长因子以及10ng/mL～50μg/mL胰岛素。
10.根据权利要求8所述的上皮细胞和平滑肌细胞在制备组织工程化尿道支架移植物中的应用，其特征在于，所述组织工程化尿道支架移植物为由第一高分子材料和第二高分子材料以共纺比为(1～9):(1～9)共纺制得的纳米纤维管；
所述第一高分子材料选自左旋聚乳酸、右旋聚乳酸、聚己内酯、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乙烯醇中的至少一种；
所述第二高分子材料选自胶原蛋白、明胶和透明质酸中的至少一种；
优选地，所述第一高分子材料和第二高分子材料的共纺比为(8～9):1。
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