CN107937335B - 用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基及方法，培养基为含有1～85ng/mL NGF、1～100ng/mL bFGF、1～45ng/mL EGF、50～200pM胰岛素、1～20μg/mL粘连蛋白、10～100μg/mL VC的细胞基础培养基。本发明方法是通过培养基配方的优化(采用无血清配方培养基)诱导间充质干细胞转化为成纤维细胞并对其进行培养，在能够避免动物病原菌的污染的同时，够达到与含血清培养基培养相近甚至更高的成纤维细胞活力。

Description

用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基及方法
技术领域
本发明涉及干细胞分化技术领域，涉及用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基及方法。
背景技术
成纤维细胞存在于皮肤真皮层，是皮肤创面愈合中的主要修复细胞，是构成肉芽组织的主要成分之一，可合成和分泌胶原纤维、连接蛋白、透明质酸等细胞外基质，也可通过分泌多种细胞因子参与创伤愈合，各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。在机体不发生损伤的前提下，如何获得更多地成纤维细胞，是人们广泛关注和亟待解决的问题。
目前，现有技术多基于含血清培养基制备成纤维细胞，但是在使用过程中容易出现污染等问题，是获取大量的成纤维细胞的障碍。无血清培养基的出现虽在一定程度上能够避免污染，但是培养效果却不及于含血清培养基。
发明内容
基于此，提供一种用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基，用该培养基获得的成纤维细胞活力高。
一种用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基，为含有1～85ng/mL NGF、1～100ng/mL bFGF、1～45ng/mL EGF、50～200pM胰岛素、1～20μg/mL粘连蛋白、10～100μg/mLVC的细胞基础培养基。
在其中一些实施例中，所述用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基为含有50～60ng/mL NGF、20～30ng/mL bFGF、20～30ng/mL EGF、90～110pM胰岛素、8～12μg/mL粘连蛋白、40～50μg/mLVC的细胞基础培养基。
在其中一些实施例中，所述用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基为含有55ng/mL NGF、25ng/mL bFGF、25ng/mL EGF、100pM胰岛素、10μg/mL粘连蛋白、45μg/mLVC的细胞基础培养基。
在其中一些实施例中，所述的细胞基础培养基为DMEM基础培养基。
本发明的目的还在于提供一种用间充质干细胞制备成纤维细胞的方法。
一种用间充质干细胞制备成纤维细胞的方法，包括如下步骤：
获取间充质干细胞；
将所述间充质干细胞加入上述诱导间充质干细胞向成纤维细胞转化的培养基中，诱导培养至间充质干细胞发生形变，获得成纤维细胞。
在其中一些实施例中，所述间充质干细胞是由诱导多功能干细胞诱导、培养获得。
在其中一些实施例中，所述诱导、培养所采用的培养基为：含有10～20％FBS、50～200ug/L bFGF、1～160pM胰岛素、1～10mM L-谷氨酰胺、5～50ug/L SCF、2～5×10-8mol/L地塞米松的L-DMEM基础培养基。
在其中一些实施例中，所述诱导、培养所采用的培养基为：含有10％FBS、150ug/LbFGF、80pM胰岛素、8mM L-谷氨酰胺、35ug/L SCF、3.5×10-8mol/L地塞米松的L-DMEM基础培养基。
在其中一些实施例中，所述的诱导多功能干细胞是将转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28共同导入尿细胞培养获得的。
在其中一些实施例中，还包括采用采用上述的培养基对所述成纤维细胞进行增殖培养和/或传代培养。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明方法是通过培养基配方的优化(采用无血清配方培养基)诱导间充质干细胞转化为成纤维细胞并对其进行培养，在能够避免动物病原菌的污染的同时，够达到与含血清培养基培养相近甚至更高的成纤维细胞活力。
进一步地，本发明还对培养基每个组分含量范围的优化，获得较优的培养基配方，用该配方的培养基培养成纤维细胞，能够增加传代代数。
另外，本发明实施例方法采用的间充质干细胞是经诱导多能干细胞分化出的，有效回避了胚胎干细胞所面临的伦理学困扰，为干细胞的研究指明了方向，奠定了基础；同时，本发明实施例采用的诱导多能干细胞是经尿液细胞重编程获得的，取材方便，不会给人带来不必要的痛苦。
附图说明
图1为实施例1所得成纤维细胞的免疫荧光鉴定图；
图2为实施例1所得成纤维细胞中Vimentin蛋白、CK15蛋白表达量结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基及方法作进一步详细的说明。
实施例1
一、培养基的制备
培养基A(IPS诱导培养基)：REGM(肾脏上皮细胞生长培养基)与MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)培养基按体积比1：1的比例混合；
培养基B(间充质干细胞诱导培养基及维持培养基)：450mL低糖DMEM基础培养基、50mL FBS，150ug/L bFGF、80pM胰岛素、8mM L-谷氨酰胺、35ug/L SCF、3.5×10-8mol/L地塞米松；
培养基C(成纤维细胞培养基及维持培养基)：为含55ng/mL NGF、25ng/mLbFGF、25ng/mL EGF、100pM胰岛素、10μg/mL粘连蛋白、45μg/mLVC的H-DMEM基础培养基，500mL。
二、尿液细胞的获取及培养
1)收集杯每个加2mL青霉素/链霉素双抗(市购)；
2)收集尿液，如不立刻进行后续操作，则将尿液存储于4℃冰箱并于当天完成后续操作；
3)每份尿液准备六孔板1个，将此孔用0.1wt％明胶包被20min以上，使用前吸去孔内液体(即0.1wt％明胶)；
4)把尿液倒到合适数量的50mL离心管里，400g离心10min；
5)吸去上清，每管留下约1～5mL，混合到一个离心管内；
6)加入含有青霉素/链霉素的PBS(PBS 95mL加入5mL青霉素/链霉素混匀)约10～30mL，轻轻混匀；
7)400g离心10min；
8)吸去上清至留剩余0.5～1mL液体；
9)把步骤8)所得液体加入步骤3)包被好的孔中，再加入含有Primocin的REGM培养基，每2mL REGM培养基中含有3μL Primocin(原代细胞抗生素)；
10)将六孔板放置于37℃培养箱内培养，待尿液细胞贴壁后，吸去培养基，用PBS洗一遍，再进行换液处理(即更换新鲜的培养基)。
11)当尿液细胞融合度达到80％，则可进行传代培养。
三、Ips细胞(诱导多能干细胞)的诱导及培养
1)将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28共同导入尿细胞，再将所得尿细胞分至预先用matrigel(基质胶)包被的六孔板中，用培养液A培养；
2)转染后第2天，将培养液A更换为IPS培养基mTesR，培养过程中每天更换新鲜培养基，使克隆继续增殖；
3)转染后第7天，镜下观察形态与人胚胎干细胞相近的挑取单克隆，并接种于用matrigel包被的十二孔板中，mTesR培养基培养获得诱导多能干细胞(ips细胞)。
四、间充质干细胞的诱导及培养
1)将制备好的ips细胞，用0.25％的胰酶进行消化，收集细胞按1：3的比例接种至mTesR培养基于Matrigel包被好六孔板中进行培养；
2)待六孔板中的ips细胞融合度达到70％时，PBS清洗将ips培养基清除干净，加入培养基B进行诱导培养，每天更换培养液；
3)培养5～7d细胞发生形变，获得间充质干细胞，培养基B继续培养。
五、成纤维细胞的诱导及培养
1)将制备好的间充质干细胞，0.25％的胰酶进行消化，收集细胞按1：3的比例接种至培养基B于六孔板中进行培养；
2)待六孔板中的间充质干细胞融合度达到70％时，PBS清洗将培养基B清除干净，加入培养基C进行诱导培养，每天更换培养液；
3)培养10～15d细胞发生形变，培养基C继续培养并保存备用。
实施例2
一、培养基的制备
培养基A(IPS诱导培养基)：REGM与MEF培养基按体积比1：1的比例混合；
培养基B(间充质干细胞诱导培养基及维持培养基)：450mL低糖DMEM基础培养基、50mL FBS、50ug/L bFGF、1pM胰岛素、1mM L-谷氨酰胺、5ug/L SCF、2×10-8mol/L地塞米松；
培养基C(成纤维细胞培养基及维持培养基)：含1ng/mL NGF、1ng/mL bFGF、1ng/mLEGF、50pM胰岛素、1μg/mL粘连蛋白、10μg/mLVC的H-DMEM基础培养基，500mL。
二、尿液细胞的获取及培养(同实施例1)
1)收集杯每个加2mL青霉素/链霉素双抗；
2)收集尿液，如不立刻进行后续操作，则将尿液存储于4℃冰箱并于当天完成后续操作；
3)每份尿液准备六孔板1孔，将此孔用0.1％明胶包被20min以上，使用前吸去孔内液体；
4)把尿液倒到合适数量的50mL离心管里，离心400g，10min；
5)吸去上清，每管留下约1～5mL，混合到一个离心管内；
6)加入含有青霉素/链霉素的PBS(PBS 95mL加入5mL青霉素/链霉素混匀)约10～30mL。轻轻混匀；
7)400g离心10min；
8)吸去上清至剩余0.5～1mL液体；
9)把剩余的液体加入包被好的孔中，再加入含有Primocin的REGM培养基，每2mLREGM培养基中含有3μL Primocin(原代细胞抗生素)；
10)将培养皿放置于37℃培养箱内培养，待尿液细胞贴壁后，吸去培养基，用PBS洗一遍，再进行换液处理；
11)当尿液细胞融合度达到80％，则可进行传代培养。
三、Ips细胞的诱导及培养
1)将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28共同导入尿细胞，将细胞分至预先用matrigel包被的6孔板中，用培养液A培养；
2)转染后第2天，将培养液A更换为IPS培养基mTesR，每天更换新鲜培养基，使克隆继续增殖；
3)转染后第7天，镜下观察形态与人胚胎干细胞相近的挑取单克隆，并接种于用matrigel包被的十二孔板中，培养基mTesR培养获得诱导多能干细胞。
四、间充质干细胞的诱导及培养
1)将制备好的ips细胞，0.25％的胰酶进行消化，收集细胞按1：3的比例接种至mTesR培养基于Matrigel包被好六孔板中进行培养；
2)待六孔板中的ips细胞融合度达到70％时，PBS清洗将ips培养基清除干净，加入培养基B进行诱导培养，每天更换培养液；
3)培养5～7d细胞发生形变，获得间充质干细胞，培养基B继续培养。
五、成纤维细胞的诱导及培养
1)将制备好的间充质干细胞，0.25％的胰酶进行消化，收集细胞按1：3的比例接种至培养基B于六孔板中进行培养；
2)待六孔板中的间充质干细胞融合度达到70％时，PBS清洗将培养基B清除干净，加入培养基C进行诱导培养，每天更换培养液；
3)培养10～15d细胞发生形变，培养基C继续培养并保存备用。
实施例3
一、培养基的制备
培养基A(IPS诱导培养基)：REGM与MEF培养基按体积比1：1的比例混合；
培养基B(间充质干细胞诱导培养基及维持培养基)：450mL低糖DMEM基础培养基、50mL BS、200ug/L bFGF、160pM胰岛素、10mM L-谷氨酰胺、50ug/L SCF、5×10-8mol/L地塞米松；
培养基C(成纤维细胞培养基及维持培养基)：500mL H-DMEM基础培养基、85ng/mLNGF、100ng/mL bFGF、45ng/mL EGF、200pM胰岛素、20μg/mL粘连蛋白、100μg/mLVC。
二、尿液细胞的获取及培养(同实施例1)
1)收集杯每个加2mL青霉素/链霉素双抗；
2)收集尿液，如不立刻进行后续操作，则将尿液存储于4℃冰箱并于当天完成后续操作；
3)每份尿液准备六孔板1孔，将此孔用0.1％明胶包被20min以上，使用前吸去孔内液体；
4)把尿液倒到合适数量的50mL离心管里，400g离心10min；
5)吸去上清，每管留下约1～5mL，混合到一个离心管内；
6)加入含有青霉素/链霉素的PBS(PBS 95mL加入5mL青霉素/链霉素混匀)约10～30mL，轻轻混匀；
7)400g离心10min；
8)吸去上清至剩余0.5～1mL液体；
9)把剩余的液体加入包被好的孔中，再加入含有Primocin的REGM培养基，每2mLREGM培养基中含有3μL Primocin(原代细胞抗生素)；
10)将培养皿放置于37℃培养箱内培养，待尿液细胞贴壁后，吸去培养基，用PBS洗一遍，再进行换液处理。
11)当尿液细胞融合度达到80％，则可进行传代培养。
三、Ips细胞的诱导及培养
1)将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28共同导入尿细胞，将细胞分至预先用matrigel包被的6孔板中，用培养液A培养；
2)转染后第2天，将培养基更换为IPS培养基mTesR，每天更换新鲜培养基；使克隆继续增殖
3)转染后第7天，镜下观察形态与人胚胎干细胞相近的挑取单克隆，并接种于用matrigel包被的12孔板中，培养基mTesR培养获得诱导多能干细胞。
四、间充质干细胞的诱导及培养
1)将制备好的ips细胞，0.25％的胰酶进行消化，收集细胞按1：3的比例接种至Matrigel包被好六孔板中，mTesR培养基进行培养。
2)待六孔板中的ips细胞融合度达到70％时，PBS清洗将ips培养基清除干净，加入培养基B进行诱导培养，每天更换培养液。
3)培养5～7d细胞发生形变，培养基B继续培养。
五、成纤维细胞的诱导及培养
1)将制备好的间充质干细胞，0.25％的胰酶进行消化，收集细胞按1：3的比例接种至六孔板中，培养基B进行培养。
2)待六孔板中的间充质干细胞融合度达到70％时，PBS清洗将培养基B清除干净，加入培养基C进行诱导培养，每天更换培养液。
3)培养10～15d细胞发生形变，培养基C继续培养并保存备用。
实施例4
本例是实施例1的变化例，变化之处仅在于，采用的培养基C的配方为：含有50ng/mL NGF、20ng/mL bFGF、20ng/mL EGF、90pM胰岛素、8μg/mL粘连蛋白、40μg/mLVC的H-DMEM基础培养基。
实施例5
本例是实施例1的变化例，变化之处仅在于，采用的培养基C的配方为：为含有60ng/mL NGF、30ng/mL bFGF、30ng/mL EGF、110pM胰岛素、12μg/mL粘连蛋白、50μg/mLVC的H-DMEM基础培养基。
本发明上述实施例中的细胞基础培养基也可以用L-DMEM基础培养基。
对比例1
一、培养基的制备
培养基A、培养基B同实施例1，培养基C：H-DMEM+10％FBS(即450ml DMEM、50mlFBS)
二、尿液细胞的获取及培养(同实施例1)
1)收集杯每个加2mL青霉素/链霉素双抗；
2)收集尿液，如不立刻进行后续操作，则将尿液存储于4℃冰箱并于当天完成后续操作；
3)每份尿液准备六孔板1孔，将此孔用0.1％明胶包被20min以上，使用前吸去孔内液体；
4)把尿液倒到合适数量的50mL离心管里，400g离心10min；
5)吸去上清，每管留下约1～5mL，混合到一个离心管内；
6)加入含有青霉素/链霉素的PBS(PBS 95mL加入5mL青霉素/链霉素混匀)约10～30mL，轻轻混匀；
7)400g离心10min；
8)吸去上清至剩余0.5～1mL液体；
9)把剩余的液体加入包被好的孔中，加入2mL含3μL Primocin的REGM培养基；
10)将培养皿放置于37℃培养箱内培养，待尿液细胞贴壁后，吸去培养基，用PBS洗一遍，再进行换液处理。
11)当尿液细胞融合度达到80％，则可进行传代培养。
三、Ips细胞的诱导及培养
1)将表达转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4和LIN28共同导入尿细胞，将细胞分至预先用matrigel包被的6孔板中，用培养液A培养；
2)转染后第2天，将培养基更换为IPS培养基mTesR，每天更换新鲜培养基，使克隆继续增殖；
3)转染后第7天，镜下观察形态与人胚胎干细胞相近的挑取单克隆，并接种于用matrigel包被的十二孔板中，培养基mTesR培养获得诱导多能干细胞。
四、间充质干细胞的诱导及培养
1)将制备好的ips细胞，0.25％的胰酶进行消化，收集细胞按1：3的比例接种至mTesR培养基于Matrigel包被好六孔板中，进行培养；
2)待六孔板中的ips细胞融合度达到70％时，PBS清洗将ips培养基清除干净，加入培养基B进行诱导培养，每天更换培养液；
3)培养5～7d细胞发生形变，培养基B继续培养。
五、成纤维细胞的诱导及培养
1)将制备好的间充质干细胞，0.25％的胰酶进行消化，收集细胞按1：3的比例接种至六孔板中，培养基B进行培养；
2)待六孔板中的间充质干细胞融合度达到70％时，PBS清洗将培养基B清除干净，加入培养基C进行诱导培养，每天更换培养液；
3)培养10～15d细胞发生形变，培养基C继续培养并保存备用。
对比例2
本例是实施例1的对比例，对比之处仅在于，采用的培养基C的培养不同，本例的培养基C为现有无血清培养基，具体为：
H-DMEM培养基为基础培养基，按10g/L加入葡聚糖搅拌溶解后，再分别加入三碘甲状腺氨酸1μM、氢化可的松0.05mg/L、地塞米松0.05μg/L、腺嘌呤30mg/L、亚硒酸钠2μg/L、2-巯基乙醇100μM、VE 5mg/L、VC 10mg/L、脂类浓缩剂1mL/L、谷氨酰胺2mM、乙醇胺20μM、bFGF10μg/L、EGF 5μg/L、TGF-β2μg/L、PDGF 2μg/L、胰岛素样生长因子5mg/L、转铁蛋白5mg/L；用HCl溶液调pH至7.2，定容后用0.2μm滤膜过滤除菌，得到无血清成纤维细胞培养基。
对比例3
本例是实施例1的对比例，对比之处仅在于，采用的培养基C的培养不同，本例的培养基C为不含有粘连蛋白的培养基，具体为：
含55ng/mL NGF、25ng/mL bFGF、25ng/mL EGF、100pM胰岛素、45μg/mLVC的H-DMEM基础培养基。
对比例4
本例是实施例1的对比例，对比之处仅在于，采用的培养基C的培养不同，本例的培养基C为不含有粘连蛋白而含有转铁蛋白的培养基，具体为：
含55ng/mL NGF、25ng/mL bFGF、25ng/mL EGF、100pM胰岛素、10μg/mL转铁蛋白、45μg/mLVC的H-DMEM基础培养基。
对比例5
本例是实施例1的对比例，对比之处仅在于，采用的培养基C的培养不同，本例的培养基C为不含有粘连蛋白且不含有NGF的培养基，具体为：
含25ng/mL bFGF、25ng/mL EGF、100pM胰岛素、45μg/mLVC的H-DMEM基础培养基。
验证例
1、免疫荧光鉴定
1)0.25％胰酶消化成纤维细胞(选自实施例1)，以1×105的接种量接种于十二孔板中，待其贴壁，4％的多聚甲醛固定2h，PBS洗三遍；
2)加200μL的一抗稀释液常温封闭1～2h；该处的一抗稀释液的组成为：含10％血清、0.3％TritonX-100的PBS，％是体积比；
3)弃去一抗稀释液，加入200μL鼠源CK15、Vimentin一抗抗体(一抗抗体均为100倍的稀释液)，4℃孵育过夜，PBS冲洗三次3次，每次5min；
4)加200μLFITC标记羊抗鼠二抗(1：400)，常温避光反应1h，PBS冲洗；上机检测前用PI染核；
5)结果判定：荧光下观察见绿色荧光为阳性。
结果见附图1，根据图1，本发明实施例细胞显示绿色荧光，为成纤维细胞标志分子Vimentin，呈阳性表达，CK15为阴性表达，符合成纤维细胞表面标记物的表达结果。
2、表型检测
1)0.25％胰酶消化成纤维细胞并收集细胞，细胞数为2×105个；
2)细胞胞重悬于1mL PBS中洗涤2次，200g，离心5min；
3)离心弃去上清液，加入200μL鼠源CK15、Vimentin一抗抗体(稀释度为1:100)常温下孵育30min；
4)1mLPBS洗涤，分别与FITC标记二抗IgG(稀释度为1:2000)常温避光孵育1h；
5)PBS洗两次后，弃去PBS，根据细胞量加入适量的PBS重悬细胞，利用流式细胞仪检测。
其中，对实施例1制得成纤维细胞的检测结果如图2。通过流式细胞仪分析显示，在成纤维细胞中Vimentin蛋白的阳性表达量为95％以上，CK15蛋白的阳性表达量为4％以下，为阴性表达。符合成纤维细胞表面标记物的表达结果。
实施例2～3制得成纤维细胞的检测结果与此相似。
3、成纤维细胞活力测试
MTT法检测上述各例所制得的成纤维细胞增殖情况。结果表明，实施例1至实施例5所得成纤维细胞的活力依次为95.77％、85％，80.23％、90.58％、89.68％。对比例1至对比例5的活力依次是80％、60％、58％、65％、42％。进一步地，采用实施例4和实施例5提供的培养基在传代细胞培养时，传35代依然能保持与采用血清培养基培养组相似的生长状况，细胞生长良好、形态为长梭形，分别均一，呈单层极性排列，特别是实施例1，用其培养基传40代培养依然生长良好。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基，其特征在于，由1～85ng/mL NGF、1～100ng/mL bFGF、1～45ng/mL EGF、50～200pM胰岛素、1～20μg/mL粘连蛋白、10～100μg/mL VC和细胞基础培养基组成；所述细胞基础培养基为DMEM基础培养基。
2.根据权利要求1所述的用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基，其特征在于，由50～60ng/mL NGF、20～30ng/mL bFGF、20～30ng/mL EGF、90～110pM胰岛素、8～12μg/mL粘连蛋白、40～50μg/mL VC和细胞基础培养基组成；所述细胞基础培养基为DMEM基础培养基。
3.根据权利要求2所述的用间充质干细胞制备成纤维细胞的培养基，其特征在于，由55ng/mL NGF、25ng/mL bFGF、25ng/mL EGF、100pM胰岛素、10μg/mL粘连蛋白、45μg/mL VC和细胞基础培养基组成；所述细胞基础培养基为DMEM基础培养基。
4.一种用间充质干细胞制备成纤维细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取间充质干细胞；
将所述间充质干细胞加入权利要求1至3任一项所述的培养基中，诱导培养至间充质干细胞发生形变，获得成纤维细胞。
5.根据权利要求4所述的用间充质干细胞制备成纤维细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞是由诱导多功能干细胞诱导、培养获得。
6.根据权利要求5所述的用间充质干细胞制备成纤维细胞的方法，其特征在于，所述诱导、培养所采用的培养基由10～20％FBS、50～200ug/L bFGF、1～160pM胰岛素、1～10mM L-谷氨酰胺、5～50ug/L SCF、2～5×10-8mol/L地塞米松和L-DMEM基础培养基组成。
7.根据权利要求6所述的用间充质干细胞制备成纤维细胞的方法，其特征在于，所述诱导、培养所采用的培养基由10％FBS、150ug/L bFGF、80pM胰岛素、8mM L-谷氨酰胺、35ug/LSCF、3.5×10-8mol/L地塞米松和L-DMEM基础培养基组成。
8.根据权利要求5所述的用间充质干细胞制备成纤维细胞的方法，其特征在于，所述的诱导多功能干细胞是将转录调控因子OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、LIN28共同导入尿细胞培养获得的。
9.根据权利要求4所述的用间充质干细胞制备成纤维细胞的方法，其特征在于，还包括采用权利要求1至3任一项所述的培养基对所述成纤维细胞进行增殖培养和/或传代培养。
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