WO2021125176A1 - 増殖性肝オルガノイド、代謝活性化肝オルガノイド、及びそれらの使用 - Google Patents

増殖性肝オルガノイド、代謝活性化肝オルガノイド、及びそれらの使用 Download PDF

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hepatic
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範生 増田
俊朗 佐藤
亮 五十嵐
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the present invention relates to proliferative hepatic organoids, metabolically activated hepatic organoids, and their use.
  • the present application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2019-226717 filed in Japan on December 16, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • hepatocytes hepatoparenchymal cells
  • cytochrome P450 cytochrome P450
  • CYP cytochrome P450
  • CYP is one of the major enzymes that metabolize xenobiotics present in the human body.
  • a human liver tumor-derived cell line developed by the French National Institute of Health Sciences (INSERM) called HepaRG (registered trademark, hereinafter the description of "registered trademark” is omitted) Used.
  • HepaRG cells are believed to have the average activity of human hepatocytes for CYP.
  • HepaRG cells require culture time to restore CYP activity and are costly to purchase.
  • human-derived liver cancer cell lines such as HepG2 cells have low CYP activity, and toxicity related to metabolism by CYP cannot be evaluated.
  • pluripotent stem cell-derived hepatocytes such as human iPS cells (induced pluripotent stem cells) has also been studied.
  • human iPS cell-derived hepatocytes have low CYP activity, similar to human-derived liver cancer cell lines, and their cell maturity is also inferior to that of primary (frozen) hepatocytes.
  • human-derived hepatocytes liver organoids
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and includes a proliferative hepatic organoid having excellent proliferative properties and a method for producing the same, and metabolic activation having excellent metabolic activity differentiated from the proliferative hepatic organoid.
  • a proliferative hepatic organoid having excellent proliferative properties and a method for producing the same, and metabolic activation having excellent metabolic activity differentiated from the proliferative hepatic organoid.
  • a liver organoid and a method for producing the same.
  • the present invention includes the following embodiments.
  • a method for producing a proliferative liver organoid Including culturing hepatic stem cells or tissue pieces containing hepatic stem cells in a growth medium to obtain proliferative liver organoids.
  • the production method wherein the growth medium contains interleukin-6 family cytokines.
  • the interleukin-6 family cytokine selected from the group consisting of interleukin-6, interleukin-11, oncostatin M, leukemia inhibitory factor, cardiotropin-1, and ciliary neurotrophic factor.
  • the production method according to (1) above which is one type.
  • the growth medium further contains a growth factor.
  • the growth factor is at least one selected from the group consisting of epidermal growth factor, fibroblast growth factor, hepatocyte growth factor, ampphiregulin, and heparin-binding EGF-like growth factor (4).
  • (6) The production method according to any one of (1) to (5) above, wherein the growth medium further contains a Wnt agonist.
  • the Wnt agonist is at least one selected from the group consisting of Wnt family members, R-spondin 1, R-spondin 2, R-spondin 3, R-spondin 4, norin, and glycogen synthase inhibitors.
  • Rho kinase inhibitor is Y-27632, Fasdil, Y39983, Wf-536, SLx-2119, Azabenzimidazole-aminoflazan, DE-104, H-1152P, Rho kinase ⁇ inhibitor, XD-4000, Selected from the group consisting of HMN-1152, 4- (1-aminoalkyl) -N- (4-pyridyl) cyclohexane-carboxamide, Rhostatin, BA-210, BA-207, Ki-23595, and VAS-012.
  • the production method according to (8) above which is at least one type.
  • the transforming growth factor- ⁇ inhibitor is at least one selected from the group consisting of A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY364497, SD-208, and SJN2511.
  • the growth medium further contains a bone morphogenetic protein inhibitor.
  • the bone morphogenetic protein inhibitor is at least one selected from the group consisting of noggin, differential screening-selected gene Aberrative in Neuroblastoma, Cerberus, and gremlin.
  • the growth medium further contains forskolin.
  • the growth medium further contains at least one selected from the group consisting of gastrin, a neurobiological supplement, and N-acetylcysteine. Manufacturing method.
  • a proliferative hepatic organoid produced by the production method according to any one of (1) to (18) above in a differentiation medium to obtain a metabolite-activated hepatic organoid.
  • the differentiation medium further contains a Wnt agonist.
  • the Wnt agonist is at least one selected from the group consisting of Wnt family members, R-spondin 1, R-spondin 2, R-spondin 3, R-spondin 4, norin, and glycogen synthase inhibitors.
  • the differentiation medium further contains a Rho kinase inhibitor.
  • Rho-kinase inhibitor is Y-27632, Fasdil, Y39983, Wf-536, SLx-2119, Azabenzimidazole-aminoflazan, DE-104, H-1152P, Rho-kinase ⁇ inhibitor, XD-4000, Selected from the group consisting of HMN-1152, 4- (1-aminoalkyl) -N- (4-pyridyl) cyclohexane-carboxamide, Rhostatin, BA-210, BA-207, Ki-23595, and VAS-012.
  • the production method according to (25) above which is at least one type.
  • the transforming growth factor- ⁇ inhibitor is at least one selected from the group consisting of A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY364497, SD-208, and SJN2511.
  • the differentiation medium further contains a bone morphogenetic protein inhibitor.
  • the bone morphogenetic protein inhibitor is at least one selected from the group consisting of noggin, differential screening-selected gene Aberrative in Neuroblastoma, Cerberus, and gremlin.
  • the differentiation medium further contains forskolin.
  • the differentiation medium further comprises at least one selected from the group consisting of gastrin, a neurobiological supplement, and N-acetylcysteine. Manufacturing method.
  • the differentiation medium further contains vitamin D.
  • a method for inducing a metabolically activated hepatic organoid into a proliferative hepatic organoid is cultured in an induction medium, and the metabolically activated hepatic organoid is induced into a proliferative hepatic organoid. Including doing The induction medium, which comprises an interleukin-6 family of cytokines.
  • a metabolism-activated liver organoid produced by the production method according to any one of (19) to (34).
  • a growth medium for culturing proliferative liver organoids which comprises interleukin-6 family cytokines.
  • (39) Contacting the metabolically activated hepatic organoid according to (37) above with the test substance, and To evaluate the response of the metabolically activated hepatic organoid and A method for evaluating a test substance, including.
  • the method for producing a proliferative hepatic organoid according to the above aspect it is possible to provide a proliferative hepatic organoid having excellent proliferative properties.
  • the method for producing a metabolically activated hepatic organoid according to the above aspect it is possible to provide a metabolically activated hepatic organoid having excellent metabolic activity, which is differentiated from the proliferative hepatic organoid.
  • FIG. 1 is a microscopic image of a proliferative liver organoid in Experimental Example 1.
  • the scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 2 is a microscopic image of a liver organoid in Experimental Example 2.
  • the scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 3 is a microscopic image of a metabolically activated hepatic organoid in Experimental Example 5.
  • FIG. 4A is a graph showing a comparison of the number of passages when using Matrigel, a mixture of collagen and Matrigel, and collagen as the extracellular matrix in Experimental Example 13. In FIG. 4A, P indicates the number of passages.
  • FIG. 4A indicates the number of passages.
  • FIG. 4B is a microscopic image of a proliferative hepatic organoid after 14 passages and 190 days after culturing when a mixture of collagen and Matrigel was used as the extracellular matrix in Experimental Example 13.
  • FIG. 4C is a magnified image of FIG. 4B. The scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 4D is a graph showing a comparison of proliferative ability when Matrigel, a mixture of collagen and Matrigel, and collagen are used as the extracellular matrix in Experimental Example 13.
  • each component exemplified in the present specification for example, in a growth medium or a differentiation medium, may be contained alone or in combination of two or more. You can also do it.
  • the present invention is a method for producing a proliferative hepatic organoid, in which hepatic stem cells or a tissue piece containing hepatic stem cells is cultured in a growth medium to obtain a proliferative hepatic organoid (hereinafter, "step”).
  • the growth medium also referred to as "A”
  • A provides a method of production comprising interleukin-6 (IL-6) family cytokines.
  • a proliferative hepatic organoid having excellent proliferative properties can be obtained.
  • hepatic stem cells such as human primary (frozen) hepatocytes or a tissue piece containing hepatic stem cells. It can. Therefore, it is possible to stably supply high-quality hepatocytes required for pharmacokinetic tests.
  • a metabolically activated hepatic organoid having excellent metabolic activity can be obtained.
  • the term "metalytically activated liver organoid” means a cell population having characteristics similar to those of hepatocytes constituting the liver tissue of a living body.
  • the metabolically activated hepatic organoid include albumin expression level of 50% or more, CYP2E1 expression level of 300% or more, and UGT1A1 expression level of 300% or more with respect to the expression level in human primary frozen hepatocytes.
  • Examples include hepatic organoids in which the expression level of NRP2 is 500% or more. Further, in the present specification, “differentiating” and “inducing differentiation” mean working to cause at least one of complication and isomerization. In the method for producing a metabolically activated hepatic organoid of the present embodiment, which will be described later, the proliferative hepatic organoid is induced to differentiate into a metabolically activated hepatic organoid.
  • proliferative hepatic organoid produced by the production method of the present embodiment and the “metabolic activity” produced by differentiating from the proliferative hepatic organoid by the production method of the metabolically activated hepatic organoid of the present embodiment described later.
  • Metabolized liver organoids may be collectively referred to as “hepatocyte clumps”.
  • step A hepatic stem cells or tissue pieces containing hepatic stem cells are cultured in a growth medium to obtain proliferative liver organoids.
  • the liver is composed of hepatic parenchymal cells, which are responsible for the essence of liver function, and hepatic nonparenchymal cells, which support the proliferation and survival of these hepatic parenchymal cells.
  • Hepatic parenchymal cells are also called hepatocytes.
  • the hepatic nonparenchymal cell group is composed of hepatic stellate cells, sinusoidal endothelial cells, Kupffer cells, bile duct epithelial cells and the like.
  • Hepatocytes are cells that retain the ability to differentiate into hepatocytes and biliary epithelial cells, and are present in both hepatocytes and nonparenchymal cells in the liver, and are a group of stem cells responsible for liver regeneration during tissue damage.
  • a tissue piece containing hepatocyte is a tissue piece of hepatocyte.
  • step A it is preferable to culture the extracellular matrix (ECM) in contact with the hepatic stem cells or a tissue piece containing the hepatic stem cells.
  • ECM extracellular matrix
  • a tissue piece containing hepatic stem cells or hepatic stem cells and an extracellular matrix precursor are mixed to obtain an extracellular matrix precursor. It can be gelled to form ECMs, which can then be immersed in growth medium for culture.
  • an ECM containing at least two types of specific glycoproteins is preferable.
  • it may be an ECM containing two different types of collagen, for example an ECM containing collagen and laminin.
  • the ECM may be a synthetic hydrogel extracellular matrix or a native ECM.
  • Matrigel registered trademark (BD Bioscience) containing laminin, entactin and collagen IV.
  • a mixture of collagen I and Matrigel may be used, and at this time, the mixing ratio is preferably 1: 1 in volume ratio.
  • the extracellular matrix may be in a coated state on a cell culture vessel or in a lysed state.
  • the conditions generally adopted in the culture of animal cells can be used.
  • it can be carried out in a temperature of about 30 ° C. or higher and 40 ° C. or lower (preferably about 37 ° C.) and a CO 2 concentration environment of about 5% volume fraction (1 atm).
  • the culture time can be appropriately adjusted according to the number of cells, the state of cells, and the like.
  • Proliferative liver organoids can be formed after a period of about 1 week or more and 2 weeks or less from the start of culturing. Above all, from the viewpoint of proliferation of proliferative liver organoids and formation of organoids, it is preferable to carry out culturing for at least 2 weeks.
  • the growth medium is a medium for culturing proliferative liver organoids and contains IL-6 family cytokines.
  • the growth medium preferably contains substantially no nicotinamide.
  • the growth medium can usually be prepared by adding each component to the basal medium.
  • the basal medium include Dalbeco's modified Eagle's medium (DMEM), basal medium (MEM), knockout-DMEM (KO-DMEM), Grasgo's basal medium (G-MEM), Eagle's basal medium (BME), and DMEM / ham.
  • DMEM Dalbeco's modified Eagle's medium
  • MEM basal medium
  • KO-DMEM knockout-DMEM
  • G-MEM Grasgo's basal medium
  • BME Eagle's basal medium
  • DMEM / ham examples thereof include F12, Advanced DMEM / Ham F12 (Advanced DMEM / F12), Iskoff-modified Dalbeco medium, Ham F-10, Ham F-12, 199 medium, and RPMI1640 medium.
  • DMEM / F12 and RPMI1640 supplemented with HEPES, glutamine, and penicillin / streptomycin are preferable.
  • Advanced DMEM / F12 or Advanced RPMI which is optimized for serum-free culture and contains GlutaMAX (L-alanyl-L-glutamine, manufactured by GIBCO) instead of glutamine, is preferable. It is preferable to add glutamine and penicillin / streptomycin to Advanced DMEM / F12 or Advanced RPMI medium.
  • IL-6 family cytokines which are inflammatory cytokines, among various factors such as cytokines and growth factors involved in the transition from G0 phase to G1 phase in the cell cycle, and the IL-6 family. It has been found that a proliferative hepatic organoid that can be cultured for a long period of time can be obtained by using a growth medium containing cytokines while maintaining high proliferative capacity.
  • IL-6 Family Cytokine examples include interleukin-6 (IL-6), interleukin-11 (IL-11), oncostatin M (OSM), and leukemia inhibitory factor (LIF). ), Cardiotropin-1 (CT-1), and hairy neurotrophic factor (CNTF), with IL-6 being preferred.
  • IL-6 interleukin-6
  • IL-11 interleukin-11
  • OSM oncostatin M
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • CT-1 Cardiotropin-1
  • CNTF hairy neurotrophic factor
  • the origin of IL-6 family cytokines is not particularly limited, and those derived from various organisms can be used. Of these, it is preferably derived from mammals. Examples of mammals include humans, mice, rats, cows, pigs, rabbits, etc. Among them, humans are preferable.
  • amino acid sequences of various components contained in the growth medium including IL-6 family cytokines of major mammals and the base sequences of genes encoding them can be obtained from a known database such as GenBank, for example. ..
  • GenBank the amino acid sequence of human IL-6 is registered with accession numbers XP_011513692 and XP_005249802.
  • the concentration of IL-6 family cytokines contained in the growth medium is usually 10 ng / mL to 1.0 ⁇ g / mL, preferably 50 ng / mL to 500 ng / mL, and more preferably 80 ng / mL to 200 ng / mL.
  • the nicotinamide proliferation medium is preferably substantially free of nicotinamide from the viewpoint of improving and maintaining the cell proliferation ability during long-term culture.
  • substantially free of nicotinamide means that the growth medium does not contain nicotinamide at all (0 mM with respect to the total volume of the growth medium), or the cell proliferation ability is improved during long-term culture. And it means that it contains only a trace amount that does not interfere with maintenance, for example, a concentration of 9 mM or less, preferably 5 mM or less, more preferably 1 mM or less.
  • the growth medium preferably further contains a growth factor from the viewpoint of improving cell proliferation.
  • Growth factors refer to diffusive signaling proteins that stimulate cell growth, differentiation, survival, inflammation, and tissue remodeling.
  • growth factors examples include epithelial growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF), ampphiregulin, heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF), and the like. Be done.
  • EGF epithelial growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • ampphiregulin heparin-binding EGF-like growth factor
  • HB-EGF heparin-binding EGF-like growth factor
  • EGF is a member of the EGF family and is a growth factor that activates the epidermal growth factor receptor (EGFR or ErbB1).
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • the activated EGFR mainly activates the MAPK signaling pathway, and also activates the PI3K signaling pathway and the Jak / stat signaling pathway.
  • the concentration of EGF contained in the growth medium is usually 10 ng / mL to 1,000 ng / mL, preferably 50 ng / mL to 500 ng / mL, and more preferably 80 ng / mL to 200 ng / mL.
  • HGF is a growth factor that activates the Met receptor, and the activated Met receptor activates the HGF-Met signaling pathway. Activation of the HGF-Met signaling pathway promotes activation of the ⁇ -catenin pathway, promoting angiogenesis and metalloprotease production.
  • the concentration of HGF contained in the growth medium is usually 10 ng / mL to 1,000 ng / mL, preferably 50 ng / mL to 500 ng / mL, and more preferably 80 ng / mL to 200 ng / mL.
  • FGF those capable of binding to FGF receptor 2 (FGFR2) or FGF receptor 4 (FGFR4) are preferable, FGF2, FGF4, FGF7 or FGF10 is preferable, and FGF10 is particularly preferable.
  • the concentration of FGF contained in the growth medium is usually 20 ng / mL to 500 ng / mL, preferably 50 ng / mL to 300 ng / mL, and more preferably 80 ng / mL to 150 ng / mL or less.
  • Amphiregulin and HB-EGF are members of the EGF family and, like EGF, activate EGFR to activate the MAPK signaling pathway, PI3K signaling pathway, or Jak / stat signaling pathway.
  • the concentration of Amphiregulin contained in the growth medium is usually 10 ng / mL to 1,000 ng / mL, preferably 50 ng / mL to 500 ng / mL, and more preferably 80 ng / mL to 200 ng / mL.
  • the final concentration of HB-EGF contained in the growth medium is usually 10 ng / mL to 1,000 ng / mL, preferably 50 ng / mL to 500 ng / mL, and more preferably 80 ng / mL to 200 ng / mL.
  • the growth medium preferably further contains a Wnt agonist from the viewpoint of maintaining hepatic stem cells and improving cell proliferation.
  • a Wnt agonist is an agonist that activates the Wnt signaling pathway.
  • Wnt agonists include, for example, Wnt family members, the R-sponge family, Nolin, and glycogen synthase (GSK) inhibitors.
  • Wnt family members include Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, and Wnt16.
  • Wnt3a is preferable.
  • the complex of Wnt family member and afamin can be used as an aging culture medium (condition medium) containing the complex having a concentration of Wnt family member of 18 ng / mL to 900 ng / mL.
  • Afamin means a glycoprotein belonging to the albumin family.
  • GenBank the amino acid sequence of human afamin is registered as AAA21612, and the amino acid sequence of usiafamin is registered as DAA28569.
  • the content of the condition medium contained in the growth medium is usually 1 volume with respect to the total volume of the growth medium. (V / v)% to 50 volumes (v / v)%, preferably 10 volumes (v / v)% to 30 volumes (v / v)%, 15 volumes (v / v)% to 25 volumes (v / v) v)%.
  • R-spondin family examples include R-spondin 1, R-spondin 2, R-spondin 3, and R-spondin 4, and among them, R-spondin 1 is preferable.
  • R-spondin family binds to Lgr5 on the cell membrane, it is removed from the cell membrane by self-ubiquitination, and as a result, Frezzled, which induces activation of the Wnt signaling pathway, stabilizes and activates the ⁇ -catenin pathway on the cell membrane. ..
  • the R-spongen family member can be used as an aging culture medium containing the complex having a concentration of 0.13 ⁇ g / mL to 6.5 ⁇ g / mL.
  • the content of the condition medium contained in the growth medium is based on the total volume of the growth medium. Usually, 1 volume (v / v)% to 50 volume (v / v)%, preferably 5 volume (v / v)% to 25 volume (v / v)%, 8 volume (v / v)%. ⁇ 20 volumes (v / v)%.
  • the GSK inhibitor indicates an inhibitor of glycogen synthase 3 ⁇ (GSK3 ⁇ ). Since GSK3 ⁇ phosphorylates ⁇ -catenin and promotes its decomposition reaction, the GSK inhibitor acts as a Wnt agonist.
  • GSK inhibitors examples include CHIR99021 (CAS number: 252917-06-9), SB216763 (CAS number: 280744-09-4), SB415286 (CAS number: 264218-23-7), CHIR98014 (CAS number: 252935-). 94-7), AZD1080 (CAS number: 61247-72-6), LY2090314 (CAS number: 603288-22-8), and among them, CHIR99021 is preferable.
  • the Wnt agonist it is preferable to use the Wnt family member and the R-spondin family in combination, more preferably to use Wnt3a and R-spondin 1 in combination, and the complex of Wnt3a and afamin and R-spondin 1 are used. It is more preferable to use them in combination.
  • Rho Kinase Inhibitor The growth medium preferably further contains a Rho kinase (ROCK) inhibitor from the viewpoint of suppressing apoptosis.
  • ROCK inhibitors act as antagonists of IGF-1 signaling.
  • ROCK inhibitor examples include Y-27632 (CAS number: 146986-50-7), Fasudil (CAS number: 105628-07-7), Y39983 (CAS number: 203911-26-6), Wf. -536 (CAS number: 539857-64-2), SLx-2119 (CAS number: 91417-87-3), azabenzoimidazole-aminofurazans (CAS number: 850664-21-0), DE- 104, H-1152P (CAS Number: 872543-07-6), Rho-kinase ⁇ inhibitor (ROK ⁇ inhibitor), XD-4000, HMN-1152, 4- (1-aminoalkyl) -N- (4-pyridyl) Cyclohexane-carboxamides (4- (1-aminoalkyl) -N- (4-pyridyl) cyclohexane-carboxamides), Rhostatin, BA-210, BA-207, Ki-23095, and VAS-012. ....
  • the concentration of the ROCK inhibitor contained in the growth medium is usually 1 ⁇ M to 20 ⁇ M, preferably 5 ⁇ M to 15 ⁇ M, and more preferably 8 ⁇ M to 12 ⁇ M.
  • the unit " ⁇ M” indicates a concentration that is 1/1000000 of the molecular weight (mol / L) in 1 liter of the growth medium, and the same concentration thereafter.
  • the growth medium preferably contains a transforming growth factor (TGF) - ⁇ inhibitor from the viewpoint of maintaining hepatic stem cells.
  • TGF transforming growth factor
  • the TGF- ⁇ inhibitor is preferably 50% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, particularly preferably 80% or more, as compared to the TGF- ⁇ activity level in the absence of this inhibitor. It has 90% or more inhibitory activity.
  • the TGF- ⁇ inhibitory activity can be evaluated by methods known to those skilled in the art. Such an evaluation system includes a cell assay in which cells are stably transfected using a human PAI-1 promoter that drives a luciferase reporter gene or a reporter construct containing a Smad2 / 3 binding site.
  • TGF- ⁇ inhibitor examples include A83-01 (CAS number: 909910-43-6), SB-431542 (CAS number: 301836-41-9), and SB-505124 (CAS number: 694433-59-5). ), SB-525334 (CAS number: 356559-20-1), LY364497 (CAS number: 396129-53-6), SD-208 (CAS number: 627536-09-8), and SJN2511 (CAS number: 446859-). 33-2), and among them, A83-01 is preferable.
  • the concentration of the TGF- ⁇ inhibitor contained in the growth medium is usually 0.05 ⁇ M to 50 ⁇ M, preferably 0.5 ⁇ M to 30 ⁇ M, and more preferably 1 ⁇ M to 15 ⁇ M or less.
  • the growth medium preferably further contains a bone morphogenetic protein (BMP) inhibitor from the viewpoint of regulating the amount of hepatic stem cells contained in the organoid.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • BMP binds as a dimeric ligand to a receptor complex consisting of two different receptor serine / threonine kinases, type I and type II receptors.
  • Type II receptors phosphorylate type I receptors, resulting in activation of this receptor kinase.
  • the type I receptor subsequently phosphorylates a specific receptor substrate (Smad 1/5/9), resulting in transcriptional activity induced by signaling pathways.
  • BMP inhibitors include Noggin, Differential screening-selected gene Aberrative in Neuroblastoma (DAN), and DAN-like protein.
  • DAN-like proteins include Cerberus and gremlin. Of these, nogin is preferable.
  • the concentration of the BMP inhibitor contained in the growth medium is usually 10 ng / mL to 100 ng / mL, preferably 15 ng / mL to 50 ng / mL, and more preferably 20 ng / mL to 30 ng / mL.
  • Forskolin proliferation medium preferably further contains Forskolin from the viewpoint of improving cell proliferation.
  • the concentration of forskolin contained in the growth medium is usually 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, and more preferably 5 ⁇ M to 15 ⁇ M.
  • the growth medium can further contain at least one selected from the group consisting of gastrin, neurobiological supplements, and N-acetylcysteine.
  • neurobiological supplements include insulin-containing supplements such as B27 supplement (Thermo Fisher Scientific) and N2 supplement (Thermo Fisher Scientific).
  • the content of gastrin contained in the growth medium is usually 5 nM to 15 nM or less.
  • the unit "nM” indicates a concentration that is 1/1000000000000 of the molecular weight (mol / L) in 1 liter of the growth medium, and the same concentration thereafter.
  • B27 supplements include biotin, cholesterol, linoleic acid, linolenic acid, progesterone, putresin, retinol, retinyl acetate, sodium selenite, triiodothyronine (T3), DL- ⁇ -tocopherol (vitamin E), albumin, insulin and It is a composition containing transferase and the like, and is commercially available as a 50-fold liquid concentrate.
  • the N2 supplement is a composition containing 500 ⁇ g / mL human transferase, 500 ⁇ g / mL bovine insulin, 0.63 ⁇ g / mL progesterone, 161 ⁇ g / mL putresin, 0.52 ⁇ g / mL sodium selenite and the like. It is commercially available as a 100-fold liquid concentrate.
  • the concentration of N-acetylcysteine contained in the growth medium is usually 150 ng / mL to 250 ng / mL.
  • the present invention cultivates a proliferative hepatic organoid produced by the above method for producing a proliferative hepatic organoid in a differentiation medium to obtain a metabolically activated hepatic organoid (hereinafter, also referred to as "step B"). ), And the differentiation medium is substantially free of IL-6 family cytokines.
  • a metabolically activated hepatic organoid having excellent metabolic activity which is differentiated from the proliferative hepatic organoid produced by the above method for producing a proliferative hepatic organoid, can be obtained. Be done. As shown in Examples described later, this metabolically activated hepatic organoid has improved expression of various metabolic enzymes to the extent that it can be used in pharmacokinetic tests.
  • step B the proliferative hepatic organoid produced by the above production method is differentiated into a metabolically activated hepatic organoid in a differentiation medium.
  • proliferative hepatic organoid used in step B those cultured for 2 weeks or more in step A are preferable from the viewpoint of proliferation of proliferative hepatic organoid and formation of organoid.
  • the culture period in step B is usually 5 to 15 days, preferably 7 to 12 days.
  • step B it is preferable to culture the proliferative liver organoid in contact with the extracellular matrix (ECM).
  • ECM extracellular matrix
  • a proliferative hepatic organoid obtained by superimposing a growth medium on a polymerized ECM and culturing it it is physically necessary to contain an appropriate number of proliferative hepatic organoids. After dissociation, a differentiation medium may be layered and cultured instead of the growth medium.
  • Examples of the ECM used in the step B include the same ECM used in the step A described above.
  • Examples of the culture conditions in step B include the same conditions as the culture conditions in step A.
  • the differentiation of a proliferative hepatic organoid into a metabolically activated hepatic organoid can be determined or evaluated using the expression of hepatocyte markers, drug metabolism activity, etc. as indicators. it can.
  • hepatocyte markers include albumin (ALB), ⁇ -fetoprotein (AFP), tyrosine-aminotransferase (TAT), pregnane X receptor (PXR) and the like.
  • the expression level of the hepatocyte marker may be measured at the gene level or at the protein level.
  • metabolically activated hepatic organoids are selected and sorted using the presence of the hepatocyte marker as an index. The method can be mentioned.
  • Drug-metabolizing activity can be evaluated by detecting the expression of drug-metabolizing enzymes or by drug-metabolizing assay.
  • drug-metabolizing enzymes include cytochrome P450 1A2 (CYP1A2), cytochrome P450 2B (CYP2B), cytochrome P450 2C9 (CYP2C9), cytochrome P450 2C19 (CYP2C19), cytochrome P450 2D6 (CYP2D6), cytochrome P450 2D6 (CYP2D6).
  • cytochrome P450 3A4 cytochrome P450 3A4
  • cytochrome P450 3A7 cytochrome P450 3A7
  • UTT uridine diphosphate-glucuronic acid transfer enzyme
  • SULT sulfate transfer enzyme
  • the differentiation medium is substantially free of IL-6 family cytokines. This allows the differentiation of proliferative liver organoids into hepatocytes.
  • the differentiation medium preferably contains substantially no nicotine amide, preferably contains a growth factor, a Wnt agonist and a TGF- ⁇ inhibitor, and in addition to these, a ROCK inhibitor, a BMP inhibitor and a forskolin. Is preferably included.
  • the differentiation medium can usually be prepared by adding each component to the basal medium.
  • the basal medium include a basal medium similar to the growth medium.
  • IL-6 family cytokine differentiation medium is substantially free of IL-6 family cytokines.
  • “Substantially free of IL-6 family cytokines” means that the concentration of IL-6 family cytokines contained in the differentiation medium is 0 ng / mL or a very small amount, specifically, in the differentiation medium. It means that the concentration of IL-6 family cytokines contained is less than 10 ng / mL, preferably 1 ng / mL or less.
  • Examples of IL-6 family cytokines include those similar to those exemplified in the growth medium described above.
  • Nicotinamide Differentiation medium preferably contains substantially no nicotinamide from the viewpoint of improving and maintaining cell proliferation ability during long-term culture.
  • “Substantially free of nicotinamide” means that the concentration of nicotinamide contained in the differentiation medium is 0 mM or a very small amount, specifically, the concentration of nicotinamide contained in the differentiation medium is 9 mM. Hereinafter, it means that it is preferably 5 mM or less, more preferably 1 mM or less.
  • the differentiation medium preferably further contains a growth factor from the viewpoint of improving cell proliferation.
  • the type of growth factor and the concentration of the growth factor contained in the differentiation medium are the same as those in the growth medium described above.
  • the differentiation medium preferably further contains a Wnt agonist from the viewpoint of maintaining hepatic stem cells and improving cell proliferation.
  • the type of Wnt agonist and the concentration of the Wnt agonist contained in the differentiation medium are the same as those in the growth medium described above.
  • the differentiation medium preferably further contains a ROCK inhibitor from the viewpoint of suppressing cell apoptosis.
  • the type of ROCK inhibitor and the concentration of the ROCK inhibitor contained in the differentiation medium are the same as those in the growth medium described above.
  • the differentiation medium preferably further contains a TGF- ⁇ inhibitor from the viewpoint of maintaining hepatic stem cells.
  • the type of TGF- ⁇ inhibitor and the concentration of the TGF- ⁇ inhibitor contained in the differentiation medium are the same as those in the growth medium described above.
  • the differentiation medium preferably further contains a BMP inhibitor from the viewpoint of regulating the amount of hepatic stem cells contained in the organoid.
  • the type of BMP inhibitor and the concentration of the BMP inhibitor contained in the differentiation medium are the same as those in the growth medium described above.
  • Forskolin Differentiation medium preferably further contains forskolin from the viewpoint of improving cell proliferation.
  • the concentration of forskolin contained in the differentiation medium is the same as that of the growth medium described above.
  • the differentiation medium can further contain a Notch signal transduction inhibitor and can increase the expression level of the metabolically activated hepatic organoid CYP3A4. Notch signaling is responsible for signal transduction between cells and is a signal that controls cell differentiation.
  • Notch signal transduction inhibitors examples include L-685458 (CAS number: 292632-98-5), DAPT (CAS number: 208255-80-5), DBZ (CAS number: 209984-56-5), and MRK560 (MRK560).
  • CAS Number: 677772-84-8 3,5-bis (4-nitrophenoxy) benzoic acid, MRK003 (CAS Number: 623165-93-5), MK0752 (CAS Number: 471905-41-6), Fururubi Examples include profene and ⁇ -secretase inhibitors such as JLK6 (CAS Registry Number: 62252-26-0).
  • the concentration of the Notch signaling inhibitor contained in the differentiation medium is usually 10 ng / mL to 1,000 ng / mL, preferably 20 ng / mL to 500 ng / mL, and more preferably 30 ng / mL to 300 ng / mL. ..
  • Vitamin D The differentiation medium can further contain vitamin D and can increase the production of albumin, a metabolically activated hepatic organoid. Vitamin D receptor activation induces the expression of P21 and P27 proteins and arrests the G0 / G1 phase of the cell cycle.
  • Vitamin D is synthesized and metabolized in vivo.
  • vitamin D includes vitamin D precursors, vitamin D metabolites and vitamin D sinuses.
  • Vitamin D includes vitamin D precursors such as vitamin D2 (ergocalciferol), vitamin D3 (choleciferol) and 7-dehydrocholesterol, vitamin D metabolites such as calcifediol and calcitriol, and calcipotoliol. , 24,25-Dihydroxyvitamin D3, ZK191784, and ZK2032788 and other vitamin D sinuses.
  • the concentration of vitamin D contained in the differentiation medium is usually 10 nM to 1,000 nM, preferably 50 nM to 800 nM, and more preferably 100 nM to 500 nM.
  • the differentiation medium can further contain a DNA demethylating agent and can increase the expression level of CYP3A4, which is a metabolically activated hepatic organoid.
  • Examples of the DNA demethylating agent include 5-aza-2-deoxycytidine, 5-azacitidine (azacitidine), zebraline, pseudoisocitidine, 5-fluoro-2-deoxycytidine, 5,6-dihydro-5-azacitidine, and the like.
  • Examples include cytidine analogs such as 2'-deoxy-5,6-dihydro-5-azacitidine, 6-azacitidine, 2', 2'-difluoro-deoxycytidine, and cytosine-beta-D-arabinofuranoside.
  • the concentration of the DNA demethylating agent contained in the differentiation medium is usually 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, and more preferably 5 ⁇ M to 15 ⁇ M.
  • the differentiation medium contains gastrin, B27 supplement (Thermo Fisher Scientific), N2 supplement (Thermo Fisher Scientific), or N-acetylcysteine. be able to.
  • the gastrin, B27 supplement (Thermo Fisher Scientific), N2 supplement (Thermo Fisher Scientific), and N-acetylcysteine are the same as those in the growth medium described above. Can be used at the concentration of.
  • the present invention cultivates the metabolically activated hepatic organoid produced by the above method for producing a metabolically activated hepatic organoid in an induction medium, and induces the metabolically activated hepatic organoid into a proliferative hepatic organoid ( Hereinafter, also referred to as “step C”), and the induction medium comprises an IL-6 family cytokine to provide an induction method.
  • the metabolically activated hepatic organoid can be returned to a proliferative hepatic organoid, and the proliferative ability of cells can be restored.
  • the culture conditions in step C are the same as the culture conditions in step A in the method for producing a proliferative liver organoid described above.
  • the induction medium to be used has the same composition as the growth medium described in the above-mentioned method for producing a proliferative hepatic organoid.
  • the present invention comprises contacting a test substance with a metabolically activated hepatic organoid produced by a method for producing a metabolically activated hepatic organoid, and evaluating the response of the metabolically activated hepatic organoid.
  • a method for evaluating the test substance is provided.
  • the metabolism, drug interaction, hepatotoxicity, transporter activity, etc. of the test substance can be evaluated in vitro, and a result close to the evaluation in vivo can be obtained.
  • test substance examples include a natural compound library, a synthetic compound library, an existing drug library, and a metabolite library.
  • Organic compounds or inorganic compounds of various molecular sizes can be used as the test substance.
  • organic compounds include nucleic acids, peptides, proteins, lipids (simple lipids, complex lipids (phosphoglycerides, sphingolipids, glycosylglycides, cerebrosides, etc.), prostaglandins, isoprenoids, terpenes, steroids, polyphenols, catechins, vitamins ( B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E, etc.) and the like.
  • test substances Existing ingredients or candidate ingredients such as pharmaceuticals and nutritional foods are also one of the test substances.
  • a plant extract, a cell extract, a culture supernatant and the like can be used as a test substance. Further, by adding two or more kinds of test substances at the same time, it is possible to investigate the interaction, synergistic action, etc. between the test substances.
  • the period of contact between the test substance and the metabolically activated hepatic organoid is usually 10 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 1 day. Contact between the test substance and the metabolically activated hepatic organoid can be performed in multiple steps.
  • Evaluation of the response of metabolically activated hepatic organoids can be performed, for example, by mass spectrometry, liquid chromatography, or immunological methods, depending on the metabolites produced.
  • immunological methods include fluorescence immunoassay (FIA method) and enzyme immunoassay (EIA method).
  • Metabolism of the test substance can also be measured using the expression of drug-metabolizing enzymes (for example, cytochrome, UGT, etc.) in the metabolically activated hepatic organoid as an index.
  • drug-metabolizing enzymes for example, cytochrome, UGT, etc.
  • Expression of drug-metabolizing enzymes includes mRNA level or protein level.
  • the evaluation method of this embodiment can also test the toxicity of the test substance.
  • the state of metabolically activated hepatic organoids after contact with the test substance is examined to evaluate the toxicity of the test substance.
  • the state of the metabolically activated liver organoid include survival rate, cell morphology, and the abundance of liver damage markers (for example, GOT, GPT, etc.) in the culture medium.
  • the present invention provides a proliferative hepatic organoid produced by the method for producing a proliferative hepatic organoid and a metabolically activated hepatic organoid produced by a method for producing a metabolically active hepatic organoid.
  • the metabolically activated hepatic organoid of the present embodiment can be suitably used for in vitro evaluation of metabolism of a test substance, drug interaction, hepatotoxicity, transporter activity and the like.
  • the present invention provides a growth medium and a differentiation medium.
  • the growth medium and the differentiation medium are as described in the growth medium described in the method for producing a proliferative hepatic organoid and the differentiation medium described in the method for producing a metabolically active hepatic organoid, respectively.
  • hepatocytes were mixed with 50 ⁇ L of Matrigel (BD Biosciences), seeded on a 24-well tissue culture plate, and at 37 ° C. for 5 minutes or more and 10 minutes until the Matrigel was completely polymerized. Incubated to the following extent. Subsequently, after the Matrigel was polymerized, the growth medium shown in Table 1 was overlaid and cultured for 12 weeks to produce the proliferative hepatic organoid of Experimental Example 1.
  • Matrigel BD Biosciences
  • R-spondin 1 is used in the form of a condition medium containing R-spondin 1, and the concentration of R-spondin 1 with respect to the total volume of the condition medium is 1.3 ⁇ g / mL.
  • Wnt3a is also used in the form of a condition medium containing a complex of Wnt3a and afamin, and the concentration of Wnt3a with respect to the total volume of the condition medium is 360 ng / mL.
  • RNA total ribonucleic acid
  • Kit commercially available kit
  • the expression levels of mRNA of albumin, metabolic enzyme and transporter gene were measured by real-time quantitative PCR.
  • Real-time quantitative PCR was performed using a commercially available kit (trade name "SYBR (registered trademark) Premix Ex Taq (Perfect Real Time)", Takara Bio Inc.).
  • GPDH glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • Example 5 Production of Metabolic Activated Liver Organoids Using the method of Experimental Example 1, human proliferative hepatic organoids cultured for 2 weeks in a growth medium were diluted by mechanical dissociation and subcultured. At that time, the medium was changed from the growth medium to the differentiation medium and cultured for 1 week to produce a metabolically activated hepatic organoid.
  • As the differentiation medium a serum-free medium containing no IL-6 having the composition shown in Table 2 was used.
  • Cell morphology, maintenance and expansion culture, and measurement of metabolic enzyme, transporter, and albumin expression levels at the gene level were performed using the same method as in Experimental Example 1. The results are shown in Tables 2 and 3. Moreover, the microscope image of the obtained liver organoid is shown in FIG.
  • the proliferative hepatic organoid obtained by using a growth medium containing IL-6 has a hollow cell morphology, a high growth rate, and can be maintained and expanded. there were. Further, from the microscopic image of FIG. 1, it was observed that the organoid contained a red component.
  • the liver organoid (Experimental Example 2) obtained by using a growth medium containing no IL-6 has a solid cell morphology and a high growth rate, but should be maintained and expanded. I could't.
  • the liver organoids (Experimental Example 3 and Experimental Example 4) obtained by using a growth medium containing nicotinamide without containing IL-6 had a solid cell morphology, a low growth rate, and were maintained. Expansion culture could not be performed.
  • the metabolically activated hepatic organoid of Experimental Example 5 differentiated from the proliferative hepatic organoid of Experimental Example 1 using a differentiation medium containing no IL-6 has a hollow cell morphology. Although maintenance and expansion culture was not possible, the expression levels of metabolic enzymes, transporters, and albumin at the gene level were evenly improved, and could be used for pharmacokinetic tests. Further, from the microscopic image of FIG. 3, it was observed that the organoid contained a yellow component presumed to be bilirubin.
  • a proliferative hepatic organoid having excellent proliferative properties can be obtained.
  • a metabolically activated hepatic organoid differentiated from the proliferative hepatic organoid and having excellent metabolic activity can be obtained.

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Abstract

増殖性肝オルガノイドの製造方法は、肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片を増殖用培地中で培養し、増殖性肝オルガノイドを得ることを含み、前記増殖用培地は、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを含む。代謝活性化肝オルガノイドの製造方法は、前記増殖性肝オルガノイドの製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドを分化用培地中で培養し、代謝活性化肝オルガノイドを得ることを含み、前記分化用培地が、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない。

Description

増殖性肝オルガノイド、代謝活性化肝オルガノイド、及びそれらの使用
　本発明は、増殖性肝オルガノイド、代謝活性化肝オルガノイド、及びそれらの使用に関する。
　本願は、２０１９年１２月１６日に、日本に出願された特願２０１９－２２６７１７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　医薬品開発の薬物動態試験において、げっ歯類を用いたインビボ試験や、げっ歯類由来の初代（凍結）肝細胞（肝実質細胞）を用いたインビトロ試験が行われている。しかしながら、種差があるためヒト特異的に発生する毒性を予測することが困難である。一方、ヒト初代（凍結）肝細胞では、数に限りがあることから、良質の肝細胞を安定して入手することが難しい。
　薬物動態試験においては、特に肝細胞に多く存在するシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）に着目し、薬物の研究開発が進められている。ＣＹＰは、人体に存在する生体異物を代謝する主要な酵素の１つである。ＣＹＰによる薬物の代謝を解析する際に、ＨｅｐａＲＧ（登録商標、以降、「登録商標」との記載を省略する）というフランス国立衛生医学研究所（ＩＮＳＥＲＭ）で開発されたヒト肝腫瘍由来細胞株が用いられる。ＨｅｐａＲＧ細胞は、ＣＹＰについてヒト肝細胞の平均的な活性を有すると考えられている。しかしながら、ＨｅｐａＲＧ細胞はＣＹＰの活性を回復させるために、培養時間を要し、さらに、購入するためにコストがかかる。また、ＨｅｐＧ２細胞等のヒト由来の肝癌細胞株はＣＹＰの活性が低く、ＣＹＰによる代謝に関連した毒性を評価できない。また、安定した細胞数を確保する観点からヒトｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）等の多能性幹細胞由来の肝細胞を用いることも検討されている。しかしながら、ヒトｉＰＳ細胞由来の肝細胞では、ヒト由来の肝癌細胞株と同様に、ＣＹＰの活性が低く、さらに、細胞の成熟度についても初代（凍結）肝細胞よりも劣る。これらのことから、より安定に使用できるインビトロにより製造されたヒト由来の肝細胞（肝オルガノイド）が必要とされている。
　２０１３年にＨａｎｓ　Ｃｌｅｖｅｒｓらによってマウス由来の肝細胞から肝オルガノイドを培養する方法が確立され、その後、２０１５年に同グループによってヒト由来の肝幹細胞から肝オルガノイドが確立されている。さらに、２０１８年には同グループによって前出の肝オルガノイドとは異なる細胞起源の肝幹細胞から肝オルガノイドが確立されており、肝細胞の新たな供給源として期待されている（特許文献１及び非特許文献１～非特許文献２参照）。
日本国特表２０１３－５３５２０１号公報
Huch M et al., "Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.", Cell, Vol. 160, Issue 1, p299-312, 2015. Hu H et al, "Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.", Cell, Vol. 175, Issue 6, p1591-1606, 2018.
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、増殖性に優れた増殖性肝オルガノイド及びその製造方法、並びに、前記増殖性肝オルガノイドから分化された、代謝活性に優れた代謝活性化肝オルガノイド及びその製造方法を提供する。
　すなわち、本発明は、以下の実施態様を含む。
（１）　増殖性肝オルガノイドの製造方法であって、
　肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片を増殖用培地中で培養し、増殖性肝オルガノイドを得ることを含み、
　前記増殖用培地は、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを含む、製造方法。
（２）　前記インターロイキン－６ファミリーサイトカインが、インターロイキン－６、インターロイキン－１１、オンコスタチンＭ、白血病抑制因子、カルジオトロピン－１、及び毛様体神経栄養因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（１）に記載の製造方法。
（３）　前記増殖用培地がニコチンアミドを実質的に含まない、前記（１）又は前記（２）に記載の製造方法。
（４）　前記増殖用培地が成長因子を更に含む、前記（１）～前記（３）のいずれか一つに記載の製造方法。
（５）　前記成長因子が、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、アンフィレグリン、及びヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（４）に記載の製造方法。
（６）　前記増殖用培地がＷｎｔアゴニストを更に含む、前記（１）～前記（５）のいずれか一つに記載の製造方法。
（６）　前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、ノリン、及びグリコーゲン合成酵素阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（６）に記載の製造方法。
（８）　前記増殖用培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、前記（１）～前記（７）のいずれか一つに記載の製造方法。
（９）　前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、ファスジル、Ｙ３９９８３、Ｗｆ－５３６、ＳＬｘ－２１１９、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ、Ｒｈｏキナーゼα阻害剤、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサン－カルボキシアミド、Ｒｈｏスタチン、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、Ｋｉ－２３０９５、及びＶＡＳ－０１２からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（８）に記載の製造方法。
（１０）　前記増殖用培地が形質転換増殖因子－β阻害剤を更に含む、前記（１）～前記（９）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１１）　前記形質転換増殖因子－β阻害剤が、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（１０）に記載の製造方法。
（１２）　前記増殖用培地が骨形成タンパク質阻害剤を更に含む、前記（１）～前記（１１）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１３）　前記骨形成タンパク質阻害剤が、ノギン、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ－ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｇｅｎｅ　Ａｂｅｒｒａｔｉｖｅ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、及びグレムリンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（１２）に記載の製造方法。
（１４）　前記増殖用培地がフォルスコリンを更に含む、前記（１）～前記（１３）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１５）　前記増殖用培地が、ガストリン、神経生物系サプリメント、及びＮ－アセチルシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つを更に含む、前記（１）～前記（１４）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１６）　前記増殖用培地中での培養において、前記肝幹細胞又は前記肝幹細胞を含む組織片と細胞外マトリックスとを接触させて培養する、前記（１）～前記（１５）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１７）　前記増殖用培地中での培養において、前記細胞外マトリックスがコラーゲン及びマトリゲルの混合物である、前記（１６）に記載の製造方法。
（１８）　前記増殖用培地中での培養において、少なくとも２週間培養を行う、前記（１）～前記（１７）のいずれか一つに記載の製造方法。
（１９）　代謝活性化肝オルガノイドの製造方法であって、
　前記（１）～前記（１８）のいずれか一つに記載の製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドを分化用培地中で培養し、代謝活性化肝オルガノイドを得ることを含み、
　前記分化用培地が、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない、製造方法。
（２０）　前記分化用培地がニコチンアミドを実質的に含まない、前記（１９）に記載の製造方法。
（２１）　前記分化用培地が成長因子を更に含む、前記（１９）又は前記（２０）に記載の製造方法。
（２２）　前記成長因子が、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、及び肝細胞増殖因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２１）に記載の製造方法。
（２３）　前記分化用培地がＷｎｔアゴニストを更に含む、前記（１９）～前記（２２）のいずれか一つに記載の製造方法。
（２４）　前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、ノリン、及びグリコーゲン合成酵素阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２３）に記載の製造方法。
（２５）　前記分化用培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、前記（１９）～前記（２４）のいずれか一つに記載の製造方法。
（２６）　前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、ファスジル、Ｙ３９９８３、Ｗｆ－５３６、ＳＬｘ－２１１９、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ、Ｒｈｏキナーゼα阻害剤、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサン－カルボキシアミド、Ｒｈｏスタチン、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、Ｋｉ－２３０９５、及びＶＡＳ－０１２からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２５）に記載の製造方法。
（２７）　前記分化用培地が形質転換増殖因子－β阻害剤を更に含む、前記（１９）～前記（２６）のいずれか一つに記載の製造方法。
（２８）　前記形質転換増殖因子－β阻害剤が、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２７）に記載の製造方法。
（２９）　前記分化用培地が骨形成タンパク質阻害剤を更に含む、前記（１９）～前記（２８）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３０）　前記骨形成タンパク質阻害剤が、ノギン、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ－ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｇｅｎｅ　Ａｂｅｒｒａｔｉｖｅ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、及びグレムリンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、前記（２９）に記載の製造方法。
（３１）　前記分化用培地がフォルスコリンを更に含む、前記（１９）～前記（３０）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３２）　前記分化用培地が、ガストリン、神経生物系サプリメント、及びＮ－アセチルシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つを更に含む、前記（１９）～前記（３１）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３３）　前記分化用培地が、ビタミンＤを更に含む、前記（１９）～前記（３２）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３４）　前記分化用培地が、Ｎｏｔｃｈ阻害剤を更に含む、前記（１９）～前記（３３）のいずれか一つに記載の製造方法。
（３５）　代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導する方法であって、
　前記（１９）～前記（３４）のいずれか一つに記載の製造方法により製造された代謝活性化肝オルガノイドを誘導用培地中で培養し、前記代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導することを含み、
　前記誘導用培地は、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを含む、誘導方法。
（３６）　前記（１）～前記（１８）のいずれか一つに記載の製造方法により製造された、増殖性肝オルガノイド。
（３７）　前記（１９）～前記（３４）のいずれか一つに記載の製造方法により製造された、代謝活性化肝オルガノイド。
（３８）　インターロイキン－６ファミリーサイトカインを含む、増殖性肝オルガノイドを培養するための増殖用培地。
（３９）　前記（３７）に記載の代謝活性化肝オルガノイドと被験物質とを接触させることと、
　前記代謝活性化肝オルガノイドの応答を評価することと、
を含む、被験物質の評価方法。
　上記態様の増殖性肝オルガノイドの製造方法によれば、増殖性に優れた増殖性肝オルガノイドを提供することができる。上記態様の代謝活性化肝オルガノイドの製造方法によれば、前記増殖性肝オルガノイドから分化された、代謝活性に優れた代謝活性化肝オルガノイドを提供することができる。
図１は実験例１における増殖性肝オルガノイドの顕微鏡像である。スケールバーは１００μｍである。 図２は実験例２における肝オルガノイドの顕微鏡像である。スケールバーは１００μｍである。 図３は実験例５における代謝活性化肝オルガノイドの顕微鏡像である。 図４Ａは実験例１３における細胞外マトリクスとして、マトリゲル、コラーゲン及びマトリゲルの混合物、並びに、コラーゲンを用いた場合の継代回数の比較を示すグラフである。図４Ａ中、Ｐは継代回数を示す。 図４Ｂは実験例１３における細胞外マトリクスとして、コラーゲン及びマトリゲルの混合物を用いた場合の１４回継代後であって培養１９０日後の増殖性肝オルガノイドの顕微鏡像である。 図４Ｃは図４Ｂの拡大像である。スケールバーは１００μｍである。 図４Ｄは実験例１３における細胞外マトリクスとして、マトリゲル、コラーゲン及びマトリゲルの混合物、並びに、コラーゲンを用いた場合の増殖能の比較を示すグラフである。
　以下、実施形態を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではない。
　本明細書中で例示する各成分、例えば増殖用培地中や分化用培地中の各成分は、特に言及しない限り、それぞれ１種単独で含有することもでき、或いは、２種以上組み合わせて含有することもできる。
　本明細書で、「Ａ～Ｂ」等の数値範囲を表す表記は、「Ａ以上、Ｂ以下」と同義であり、Ａ及びＢをその数値範囲に含むものとする。
＜増殖性肝オルガノイドの製造方法＞
　一実施形態において、本発明は、増殖性肝オルガノイドの製造方法であって、肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片を増殖用培地中で培養し、増殖性肝オルガノイドを得ること（以下、「工程Ａ」ともいう）を含み、前記増殖用培地は、インターロイキン－６（ＩＬ－６）ファミリーサイトカインを含む、製造方法を提供する。
　本実施形態の増殖性肝オルガノイドの製造方法によれば、増殖性に優れた増殖性肝オルガノイドが得られる。
　従来のヒト初代（凍結）肝細胞では、数に限りがあることから、良質の肝細胞を安定して入手することが難しかった。
　これに対して、本実施形態の増殖性肝オルガノイドの製造方法では、ヒト初代（凍結）肝細胞等の肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片から、増殖能を有する増殖性肝オルガノイドを得ることができる。そのため、薬物動態試験に必要な良質の肝細胞を安定して供給することができる。
　また、本実施形態の増殖性肝オルガノイドの製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドを分化させることで、代謝活性に優れた、代謝活性化肝オルガノイドが得られる。
　本明細書における「代謝活性化肝オルガノイド」とは、生体の肝臓組織を構成する肝細胞と類似の特性を有する細胞集団であることを意味する。代謝活性化肝オルガノイドとしては、例えば、ヒト初代凍結浮遊肝細胞での発現量に対してアルブミンの発現量が５０％以上、ＣＹＰ２Ｅ１の発現量が３００％以上、ＵＧＴ１Ａ１の発現量が３００％以上、ＮＲＰ２の発現量が５００％以上である肝オルガノイドが挙げられる。
　また、本明細書において、「分化させる」、「分化誘導する」とは、少なくとも、複雑化及び異性化のいずれかが起こるように働きかけることをいう。後述する本実施形態の代謝活性化肝オルガノイドの製造方法では、増殖性肝オルガノイドを代謝活性化肝オルガノイドへと分化誘導する。
　なお、本実施形態の製造方法により製造された「増殖性肝オルガノイド」と、後述する本実施形態の代謝活性化肝オルガノイドの製造方法により前記増殖性肝オルガノイドから分化して製造された「代謝活性化肝オルガノイド」と、を総じて「肝細胞塊」と称する場合がある。
［工程Ａ］
　工程Ａでは、肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片を増殖用培地中で培養し、増殖性肝オルガノイドを得る。
　肝臓は、肝機能の本質を担う肝実質細胞とこの肝実質細胞の増殖や生存を支える肝非実質細胞群により構成されている。肝実質細胞は、肝細胞とも呼ばれる。肝非実質細胞群は、肝星細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、胆管上皮細胞等から構成されている。
　肝幹細胞は肝細胞と胆管上皮細胞へ分化する両能性を保持する細胞であり、肝臓内の肝細胞にも肝非実質細胞にも存在し、組織損傷時に肝臓再生を担う幹細胞集団である。肝幹細胞を含む組織片は、肝細胞の組織片である。
　工程Ａでは、肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片と細胞外マトリックス（ＥＣＭ）とを接触させて培養することが好ましい。
　ＥＣＭと肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片とを接触させて培養する方法としては、例えば、肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片と細胞外マトリックス前駆体とを混合し、細胞外マトリックス前駆体をゲル化させてＥＣＭを形成し、次いで、ＥＣＭを増殖用培地に浸漬して培養することができる。
　工程Ａにおいて使用するＥＣＭとしては、少なくとも２種類の特異な糖タンパク質を含むＥＣＭが好ましい。例えば、２つの異なるタイプのコラーゲンを含むＥＣＭであってもよく、例えば、コラーゲン及びラミニンを含むＥＣＭであってもよい。ＥＣＭは、合成ヒドロゲル細胞外マトリックスであってもよく、天然ＥＣＭであってもよい。ＥＣＭとして、ラミニン、エンタクチン及びコラーゲンＩＶを含む、マトリゲル（登録商標）（ＢＤバイオサイエンス社）を用いることが好ましい。また、コラーゲンＩ及びマトリゲルの混合物を用いてもよく、このとき、混合比は体積比で１：１であることが好ましい。細胞外マトリックスは、細胞培養容器の上にコーティングされた状態のものであってもよく、溶解状態のものであってもよい。
　工程Ａにおける培養条件としては、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすることができる。例えば、３０℃以上４０℃以下程度（好ましくは、３７℃程度）の温度、５％体積分率（１気圧）程度のＣＯ２濃度環境下で行なうことができる。
　培養時間は細胞数や細胞の状態等に応じて、適宜調整することができる。培養開始から１週間以上２週間以下程度の期間後、増殖性肝オルガノイドを形成させることができる。中でも、増殖性肝オルガノイドの増殖及びオルガノイドの形成の観点から、少なくとも２週間培養を行なうことが好ましい。
［増殖用培地］
　増殖用培地は、増殖性肝オルガノイドを培養するための培地であり、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを含む。
　増殖用培地としては、ニコチンアミドを実質的に含まないことが好ましい。また、ＩＬ－６ファミリーサイトカインに加えて、成長因子、Ｗｎｔアゴニスト及びＴＧＦ－β阻害剤を更に含むことが好ましく、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤及びフォルスコリンを更に含むことがより好ましい。
　増殖用培地は、通常、基本培地に各成分を添加して調製することができる。基本培地としては、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、基礎培地（ＭＥＭ）、ノックアウト－ＤＭＥＭ（ＫＯ－ＤＭＥＭ）、グラスゴー基本培地（Ｇ－ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／ハムＦ１２（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２）、イスコフ改変ダルベッコ培地、ハムＦ－１０、ハムＦ－１２、１９９培地、ＲＰＭＩ１６４０培地が挙げられる。
　これらの中でもＨＥＰＥＳ、グルタミン、及びペニシリン／ストレプトマイシンが添加された、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、及びＲＰＭＩ１６４０が好ましい。また、無血清培養に最適化され、グルタミンの代わりに、ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧＩＢＣＯ社製、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＡｄｖａｎｃｅｄ　ＲＰＭＩが好ましい。Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＡｄｖａｎｃｅｄ　ＲＰＭＩ培地には、グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加することが好ましい。
　発明者らは、細胞周期におけるＧ０期からＧ１期への移行に関与しているサイトカインや成長因子等の各種因子のうち、炎症性サイトカインであるＩＬ－６ファミリーサイトカインに着目し、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを含む増殖用培地を用いることで高い増殖能を維持しながら長期間培養できる増殖性肝オルガノイドを得ることができることを見出した。
（１）ＩＬ－６ファミリーサイトカイン
　ＩＬ－６ファミリーサイトカインとしては、例えば、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、カルジオトロピン－１（ＣＴ－１)、及び毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）が挙げられ、中でも、ＩＬ－６が好ましい。
　ＩＬ－６ファミリーサイトカインの由来は特に限定されず、各種生物由来のものを用いることができる。中でも、哺乳動物由来のものであることが好ましい。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウサギ等が挙げられ、中でも、ヒトが好ましい。
　主な哺乳動物のＩＬ－６ファミリーサイトカインを始めとする増殖用培地に含まれる各種成分のアミノ酸配列及びこれをコードする遺伝子の塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから取得することができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ヒトＩＬ－６のアミノ酸配列はアクセッション番号ＸＰ＿０１１５１３６９２、ＸＰ＿００５２４９８０２で登録されている。
　増殖用培地に含まれるＩＬ－６ファミリーサイトカインの濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１．０μｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬである。
（２）ニコチンアミド
　増殖用培地は、長期培養時の細胞増殖能の向上及び維持の観点から、ニコチンアミドを実質的に含まないことが好ましい。ここでいう「ニコチンアミドを実質的に含まない」とは、増殖用培地がニコチンアミドを全く含まない（増殖用培地の総容量に対して０ｍＭ）、又は、長期培養時の細胞増殖能の向上及び維持の妨げにならない程度の極微量、例えば、９ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下の濃度しか含まないことを意味する。
（３）成長因子
　増殖用培地は、細胞増殖性の向上の観点から、成長因子を更に含むことが好ましい。成長因子は、細胞の成長、分化、生存、炎症、および組織修復を刺激する拡散性シグナル伝達タンパク質を指す。
　成長因子としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、アンフィレグリン（Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ）等が挙げられる。
　ＥＧＦはＥＧＦファミリーの一つであり、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ１）を活性化させる成長因子である。活性化したＥＧＦＲは、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を主に活性化させ、また、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路やＪａｋ／ｓｔａｔシグナル伝達経路を活性化させる。
　増殖用培地中に含まれるＥＧＦの濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬである。
　ＨＧＦは、Ｍｅｔ受容体を活性化させる成長因子であり、活性化したＭｅｔ受容体は、ＨＧＦ－Ｍｅｔシグナル伝達経路を活性化させる。ＨＧＦ－Ｍｅｔシグナル伝達経路の活性化は、βカテニン経路の活性化を促し、血管新生やメタロプロテアーゼ産生を促す。
　増殖用培地中に含まれるＨＧＦの濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬである。
　ＦＧＦとしては、ＦＧＦ受容体２（ＦＧＦＲ２）又はＦＧＦ受容体４（ＦＧＦＲ４）に結合することができるものが好ましく、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７又はＦＧＦ１０であることが好ましく、ＦＧＦ１０であることが特に好ましい。
　増殖用培地中に含まれるＦＧＦの濃度は、通常、２０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ～１５０ｎｇ／ｍＬ以下である。
　Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ及びＨＢ－ＥＧＦはＥＧＦファミリーの一つであり、ＥＧＦと同じくＥＧＦＲを活性化させて、ＭＡＰＫシグナル伝達経路、ＰＩ３Ｋシグナル伝達経路、又はＪａｋ／ｓｔａｔシグナル伝達経路を活性化させる。
　増殖用培地中に含まれるＡｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎの濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬである。
　増殖用培地中に含まれるＨＢ－ＥＧＦの終濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは８０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬである。
（４）Ｗｎｔアゴニスト
　増殖用培地は、肝幹細胞の維持及び細胞増殖性の向上の観点から、Ｗｎｔアゴニストを更に含むことが好ましい。ＷｎｔアゴニストとはＷｎｔシグナル伝達経路を活性化する作動薬である。
　Ｗｎｔアゴニストとしては、例えば、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジンファミリー、ノリン（Ｎｏｒｒｉｎ）、及びグリコーゲン合成酵素（ＧＳＫ）阻害剤が挙げられる。
　Ｗｎｔファミリーメンバーとしては、例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６が挙げられ、中でも、Ｗｎｔ３ａが好ましい。
　Ｗｎｔファミリーメンバーの安定化及び可溶化には、アファミン（Ａｆａｍｉｎ）が寄与していることが知られていることから、Ｗｎｔアゴニストとしては、Ｗｎｔファミリーメンバーとアファミンとの複合体を用いることがより好ましい。Ｗｎｔファミリーメンバーとアファミンとの複合体は、Ｗｎｔファミリーメンバーの濃度が１８ｎｇ／ｍＬ～９００ｎｇ／ｍＬの該複合体を含む熟成培養液（コンディションメディウム）として用いることができる。
　アファミンとは、アルブミンファミリーに属する糖タンパク質を意味する。
ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ヒトアファミンのアミノ酸配列はＡＡＡ２１６１２、ウシアファミンのアミノ酸配列はＤＡＡ２８５６９で登録されている。
　Ｗｎｔファミリーメンバーとして、Ｗｎｔファミリーメンバーの濃度が上記範囲であるコンディションメディウムを用いる場合に、増殖用培地中に含まれるコンディションメディウムの含有量は、増殖用培地の総容量に対して、通常、１容量（ｖ／ｖ）％～５０容量（ｖ／ｖ）％、好ましくは１０容量（ｖ／ｖ）％～３０容量（ｖ／ｖ）％、１５容量（ｖ／ｖ）％～２５容量（ｖ／ｖ）％である。
　Ｒ－スポンジンファミリーとしては、例えば、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、及びＲ－スポンジン４が挙げられ、中でも、Ｒ－スポンジン１が好ましい。Ｒ－スポンジンファミリーは、細胞膜においてＬｇｒ５と結合すると，自己ユビキチン化により細胞膜から除去され，その結果，Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化を誘導するＦｒｅｚｚｌｅｄが細胞膜において安定化やβカテニン経路を活性化する。Ｒ－スポンジンファミリーメンバーは、濃度が０．１３μｇ／ｍＬ～６．５μｇ／ｍＬの該複合体を含む熟成培養液として用いることができる。
　Ｒ－スポンジンファミリーメンバーとして、Ｒ－スポンジンファミリーメンバーの濃度が上記範囲であるコンディションメディウムを用いる場合に、増殖用培地中に含まれるコンディションメディウムの含有量は、増殖用培地の総容量に対して、通常、１容量（ｖ／ｖ）％～５０容量（ｖ／ｖ）％、好ましくは５容量（ｖ／ｖ）％～２５容量（ｖ／ｖ）％、８容量（ｖ／ｖ）％～２０容量（ｖ／ｖ）％である。
　ＧＳＫ阻害剤は、グリコーゲン合成酵素３β（ＧＳＫ３β）の阻害剤を示す。ＧＳＫ３βは、β－カテニンをリン酸化しその分解反応を促進することから、ＧＳＫ阻害剤はＷｎｔアゴニストとして作動する。
　ＧＳＫ阻害剤として、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＡＳ番号：２５２９１７－０６－９）、ＳＢ２１６７６３（ＣＡＳ番号：２８０７４４－０９－４）、ＳＢ４１５２８６（ＣＡＳ番号：２６４２１８－２３－７）、ＣＨＩＲ９８０１４（ＣＡＳ番号：２５２９３５－９４－７）、ＡＺＤ１０８０（ＣＡＳ番号：６１２４８７－７２－６）、ＬＹ２０９０３１４（ＣＡＳ番号：６０３２８８－２２－８）が挙げられ、中でも、ＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。
　Ｗｎｔアゴニストとしては、Ｗｎｔファミリーメンバー及びＲ－スポンジンファミリーを組み合わせて用いることが好ましく、Ｗｎｔ３ａ及びＲ－スポンジン１を組み合わせて用いることがより好ましく、Ｗｎｔ３ａとアファミンとの複合体及びＲ－スポンジン１を組み合わせて用いることがさらに好ましい。
（５）Ｒｈｏキナーゼ阻害剤
　増殖用培地は、アポトーシス抑制の観点から、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を更に含むことが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤は、ＩＧＦ－１シグナル伝達のアンタゴニストとして作動するものである。
　ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｙ－２７６３２（ＣＡＳ番号：１４６９８６－５０－７）、ファスジル（Ｆａｓｕｄｉｌ）（ＣＡＳ番号：１０５６２８－０７－７）、Ｙ３９９８３（ＣＡＳ番号：２０３９１１－２６－６）、Ｗｆ－５３６（ＣＡＳ番号：５３９８５７－６４－２）、ＳＬｘ－２１１９（ＣＡＳ番号：９１１４１７－８７－３）、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン（Ａｚａｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ－ａｍｉｎｏｆｕｒａｚａｎｓ）（ＣＡＳ番号：８５０６６４－２１－０）、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ（ＣＡＳ番号：８７２５４３－０７－６）、Ｒｈｏキナーゼα阻害剤（ＲＯＫα　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンーカルボキシアミド（４－（１－ａｍｉｎｏａｌｋｙｌ）－Ｎ－（４－ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅｓ）、Ｒｈｏスタチン（Ｒｈｏｓｔａｉｎ）、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、Ｋｉ－２３０９５、及びＶＡＳ－０１２が挙げられる。これらの中でも、Ｙ－２７６３２が好ましい。
　増殖用培地中に含まれる、ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、通常、１μＭ～２０μＭ、好ましくは５μＭ～１５μＭ、より好ましくは８μＭ～１２μＭである。なお、単位「μＭ」は増殖用培地１リットル中の分子量（ｍｏｌ／Ｌ）の１／１００００００である濃度を示し、以降も同様の濃度を表す。
（６）形質転換増殖因子－β阻害剤
　増殖用培地は、肝幹細胞の維持の観点から、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）－β阻害剤を含むことが好ましい。
　ＴＧＦ－β阻害剤は、この阻害剤の非存在下でのＴＧＦ－β活性レベルと比較して、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは、９０％以上の阻害活性を有する。ＴＧＦ－β阻害活性は、当業者にとって公知の方法で評価することができる。係る評価系としては、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を動かすヒトＰＡＩ－１プロモーター又はＳｍａｄ２／３結合部位を含むレポーター構築物を用いて細胞が安定にトランスフェクトされている細胞アッセイが挙げられる。
　ＴＧＦ－β阻害剤としては、例えば、Ａ８３－０１（ＣＡＳ番号：９０９９１０－４３－６）、ＳＢ－４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６－４１－９）、ＳＢ－５０５１２４（ＣＡＳ番号：６９４４３３－５９－５）、ＳＢ－５２５３３４（ＣＡＳ番号：３５６５５９－２０－１）、ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ番号：３９６１２９－５３－６）、ＳＤ－２０８（ＣＡＳ番号：６２７５３６－０９－８）、及びＳＪＮ２５１１（ＣＡＳ番号：４４６８５９－３３－２）が挙げられ、中でも、Ａ８３－０１が好ましい。
　増殖用培地中に含まれるＴＧＦ－β阻害剤の濃度は、通常、０．０５μＭ～５０μＭ、好ましくは０．５μＭ～３０μＭ、より好ましくは１μＭ～１５μＭ以下である。
（７）骨形成タンパク質阻害剤
　増殖用培地は、オルガノイド内に含まれる肝幹細胞の量を調節する観点から、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害剤を更に含むことが好ましい。
　ＢＭＰは、二量体リガンドとして二種類の異なる受容体セリン／スレオニンキナーゼ、Ｉ型及びＩＩ型受容体からなる受容体複合体に結合する。ＩＩ型受容体はＩ型受容体をリン酸化し、その結果、この受容体キナーゼが活性化される。このＩ型受容体は、続いて特異的な受容体基質（Ｓｍａｄ１／５／９）をリン酸化し、その結果、シグナル伝達経路によって転写活性が導かれる。
　ＢＭＰ阻害剤としては、例えば、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ－ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｇｅｎｅ　Ａｂｅｒｒａｔｉｖｅ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ（ＤＡＮ）、及びＤＡＮ様タンパク質が挙げられる。ＤＡＮ様タンパク質としては、例えば、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、及びグレムリンが挙げられる。中でも、ノギンが好ましい。
　増殖用培地中に含まれるＢＭＰ阻害剤の濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬである。
（８）フォルスコリン
　増殖用培地は、細胞増殖性の向上の観点から、フォルスコリン（Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）を更に含むことが好ましい。
　増殖用培地中に含まれるフォルスコリンの濃度は、通常、０．１μＭ～１００μＭ、好ましくは１μＭ～５０μＭ、より好ましくは５μＭ～１５μＭである。
（９）その他の成分
　増殖用培地は、上記成分に加えて、ガストリン、神経生物系サプリメント、及び、Ｎ－アセチルシステインからなる群より選択される少なくとも１つを更に含むことができる。神経生物系サプリメントとしては、例えば、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、並びにＮ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）等のインシュリンを含むサプリメントが挙げられる。
　増殖用培地中に含まれるガストリンの含有量は、通常、５ｎＭ～１５ｎＭ以下である。なお、単位「ｎＭ」は増殖用培地１リットル中の分子量（ｍｏｌ／Ｌ）の１／１０００００００００である濃度を示し、以降も同様の濃度を表す。
　Ｂ２７サプリメントは、ビオチン、コレステロール、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、レチノール、酢酸レチニル、亜セレン酸ナトリウム、トリヨードチロニン（Ｔ３）、ＤＬ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）、アルブミン、インシュリン及びトランスフェリン等を含む組成物であり、５０倍液体濃縮液として市販されている。
　Ｎ２サプリメントは、５００μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン、５００μｇ／ｍＬのウシインシュリン、０．６３μｇ／ｍＬのプロゲステロン、１６１μｇ／ｍＬのプトレシン及び０．５２μｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム等を含む組成物であり、１００倍液体濃縮液として市販されている。
　増殖用培地中に含まれるＮ－アセチルシステインの濃度は、通常、１５０ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬである。
＜代謝活性化肝オルガノイドの製造方法＞
　一実施形態において、本発明は、上記増殖性肝オルガノイドの製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドを分化用培地中で培養し、代謝活性化肝オルガノイドを得ること（以下、「工程Ｂ」ともいう）を含み、前記分化用培地が、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない、製造方法を提供する。
　本実施形態の代謝活性化肝オルガノイドの製造方法によれば、上記増殖性肝オルガノイドの製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドから分化された、代謝活性に優れた、代謝活性化肝オルガノイドが得られる。この代謝活性化肝オルガノイドは、後述する実施例に示すように、薬物動態試験に使用できる程度まで各種代謝酵素の発現が向上している。
［工程Ｂ］
　工程Ｂでは、上記製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドを分化用培地中で代謝活性化肝オルガノイドへ分化させる。
　工程Ｂで使用される増殖性肝オルガノイドとしては、増殖性肝オルガノイドの増殖及びオルガノイドの形成の観点から、工程Ａにおいて２週間以上培養を行なったものが好ましい。
　工程Ｂにおける培養期間は、通常、５日間～１５日間、好ましくは７日間～１２日間である。
　工程Ｂでは、増殖性肝オルガノイドと細胞外マトリックス（ＥＣＭ）とを接触させて培養することが好ましい。例えば、後述する実施例に示すように、重合したＥＣＭに増殖用培地を重層して培養した増殖性肝オルガノイドにおいて、必要に応じて、適度な個数の増殖性肝オルガノイドを含むように物理的に解離した後、増殖用培地の代わりに分化用培地を重層して培養してもよい。
　工程Ｂにおいて使用するＥＣＭとしては、上述した、工程Ａで使用するＥＣＭと同様のものが挙げられる。
　工程Ｂにおける培養条件としては、工程Ａにおける培養条件と同様の条件が挙げられる。
　本実施形態の代謝活性化肝オルガノイドの製造方法において、増殖性肝オルガノイドが代謝活性化肝オルガノイドに分化したことは、肝細胞マーカーの発現や薬物代謝活性等を指標にして判定又は評価することができる。肝細胞マーカーとしては、例えば、アルブミン（ＡＬＢ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、チロシン－アミノ基転移酵素（ＴＡＴ）、プレグナンＸ受容体（ＰＸＲ）等が挙げられる。肝細胞マーカーの発現量の測定は、遺伝子レベルで行ってもよく、タンパク質レベルで行ってもよい。
　代謝活性化肝オルガノイドを含む細胞集団から、代謝活性化肝オルガノイドのみからなる細胞を得る方法としては、例えば、前記肝細胞マーカーの存在を指標にして、代謝活性化肝オルガノイドを選別及び分取する方法が挙げられる。
　薬物代謝活性は、薬物代謝酵素の発現の検出又は薬物代謝アッセイによって評価することができる。薬物代謝酵素としては、例えば、シトクロムＰ４５０　１Ａ２（ＣＹＰ１Ａ２）、シトクロムＰ４５０　２Ｂ（ＣＹＰ２Ｂ）、シトクロムＰ４５０　２Ｃ９（ＣＹＰ２Ｃ９）、シトクロムＰ４５０　２Ｃ１９（ＣＹＰ２Ｃ１９）、シトクロムＰ４５０　２Ｄ６（ＣＹＰ２Ｄ６）、シトクロムＰ４５０　２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）、シトクロムＰ４５０　３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）、シトクロムＰ４５０　３Ａ７（ＣＹＰ３Ａ７）、ウリジン二リン酸－グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ）、及び硫酸転移酵素（ＳＵＬＴ）が挙げられる。
［分化用培地］
　分化用培地は、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない。これにより、増殖性肝オルガノイドから肝細胞への分化することができる。
　分化用培地としては、ニコチンアミドを実質的に含まないことが好ましく、成長因子、Ｗｎｔアゴニスト及びＴＧＦ－β阻害剤を含むことが好ましく、これらに加えて、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤及びフォルスコリンを含むことが好ましい。
　分化用培地は、通常、基本培地に各成分を添加して調製することができる。基本培地としては、増殖用培地と同様の基礎培地が挙げられる。
（１）ＩＬ－６ファミリーサイトカイン
　分化用培地は、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない。「ＩＬ－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない」とは、分化用培地中に含まれるＩＬ－６ファミリーサイトカインの濃度が、０ｎｇ／ｍＬ、又は極微量、具体的には、分化用培地中に含まれるＩＬ－６ファミリーサイトカインの濃度が、１０ｎｇ／ｍＬ未満、好ましくは、１ｎｇ／ｍＬ以下であることを意味する。ＩＬ－６ファミリーサイトカインとしては、上述した増殖用培地で例示されたものと同様のものが挙げられる。
（２）ニコチンアミド
　分化用培地は、長期培養時の細胞増殖能の向上及び維持の観点から、ニコチンアミドを実質的に含まないことが好ましい。「ニコチンアミドを実質的に含まない」とは、分化用培地中に含まれるニコチンアミドの濃度が０ｍＭ、又は極微量、具体的には、分化用培地中に含まれるニコチンアミドの濃度が、９ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下であることを意味する。
（３）成長因子
　分化用培地は、細胞増殖性の向上の観点から、成長因子を更に含むことが好ましい。成長因子の種類及び分化用培地中に含まれる成長因子の濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
（４）Ｗｎｔアゴニスト
　分化用培地は、肝幹細胞の維持及び細胞増殖性の向上の観点から、Ｗｎｔアゴニストを更に含むことが好ましい。Ｗｎｔアゴニストの種類及び分化用培地中に含まれるＷｎｔアゴニストの濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
（５）ＲＯＣＫ阻害剤
　分化用培地は、細胞のアポトーシス抑制の観点から、ＲＯＣＫ阻害剤を更に含むことが好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤の種類及び分化用培地中に含まれるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
（６）ＴＧＦ－β阻害剤
　分化用培地は、肝幹細胞の維持の観点から、ＴＧＦ－β阻害剤を更に含むことが好ましい。ＴＧＦ－β阻害剤の種類及び分化用培地中に含まれるＴＧＦ－β阻害剤の濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
（７）ＢＭＰ阻害剤
　分化用培地は、オルガノイドに含まれる肝幹細胞量の調節の観点から、ＢＭＰ阻害剤を更に含むことが好ましい。ＢＭＰ阻害剤の種類及び分化用培地中に含まれるＢＭＰ阻害剤の濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
（８）フォルスコリン
　分化用培地は、細胞増殖性の向上の観点から、フォルスコリンを更に含むことが好ましい。分化用培地中に含まれるフォルスコリンの濃度は、上述した増殖用培地と同様である。
（９）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤
　分化用培地は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤を更に含むことができ、代謝活性化肝オルガノイドのＣＹＰ３Ａ４の発現量を増大させることができる。Ｎｏｔｃｈシグナルは細胞間の情報伝達を担っており、細胞の分化を制御するシグナルである。
　Ｎｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤としては、例えば、Ｌ－６８５４５８（ＣＡＳ番号：２９２６３２－９８－５）、ＤＡＰＴ（ＣＡＳ番号：２０８２５５－８０－５）、ＤＢＺ（ＣＡＳ番号：２０９９８４－５６－５）、ＭＲＫ５６０（ＣＡＳ番号：６７７７７２－８４－８）、３，５－ビス（４－ニトロフェノキシ）安息香酸、ＭＲＫ００３（ＣＡＳ番号：６２３１６５－９３－５）、ＭＫ０７５２（ＣＡＳ番号：４７１９０５－４１－６）、フルルビプロフェン、及びＪＬＫ６（ＣＡＳ番号：６２２５２－２６－０）等のγ-セクレターゼ阻害剤が挙られる。
　分化用培地中に含まれるＮｏｔｃｈシグナル伝達阻害剤の濃度は、通常、１０ｎｇ／ｍＬ～１，０００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ～３００ｎｇ／ｍＬである。
（１０）ビタミンＤ
　分化用培地は、ビタミンＤを更に含むことができ、代謝活性化肝オルガノイドのアルブミンの産生量を増大させることができる。ビタミンＤ受容体の活性化は、Ｐ２１とＰ２７タンパク質の発現を誘導し細胞周期におけるＧ０／Ｇ１期を停止する。
　ビタミンＤは、生体内で合成や代謝する。よって、ビタミンＤとしては、ビタミンＤ前駆体、ビタミンＤ代謝産物およびビタミンＤ類洞体が含まれる。
　ビタミンＤとしては、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）、７－デヒドロコレステロール等のビタミンＤ前駆体、カルシフェジオール、及びカルシトリオール等のビタミンＤ代謝産物、並びにカルシポトリオール、２４，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３、ＺＫ１９１７８４、及びＺＫ２０３２７８8等のビタミンＤ類洞体が挙げられる。
　分化用培地中に含まれるビタミンＤの濃度は、通常、１０ｎＭ～１，０００ｎＭ、好ましくは５０ｎＭ～８００ｎＭ、より好ましくは１００ｎＭ～５００ｎＭである。
（１１）ＤＮＡ脱メチル化剤
　分化用培地は、ＤＮＡ脱メチル化剤を更に含むことができ、代謝活性化肝オルガノイドのＣＹＰ３Ａ４の発現量を増大させることができる。
　ＤＮＡ脱メチル化剤としては、５－アザ－２－デオキシシチジン、５－アザシチジン（アザシチジン）、ゼブラリン、プソイドイソシチジン、５－フルオロ－２－デオキシシチジン、５，６－ジヒドロ－５－アザシチジン、２’－デオキシ－５，６－ジヒドロ－５－アザシチジン、６－アザシチジン、２’，２’－ジフルオロ－デオキシシチジン、及びシトシン－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシド等のシチジン類似体が挙げられる。
　分化用培地中に含まれるＤＮＡ脱メチル化剤の濃度は、通常、０．１μＭ～１００μＭ、好ましくは１μＭ～５０μＭ、より好ましくは５μＭ～１５μＭである。
（１２）その他の添加剤
　分化用培地は、上記成分に加えて、ガストリン、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、又はＮ－アセチルシステインを含有することができる。分化用培地において、ガストリン、Ｂ２７サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｎ２サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、及びＮ－アセチルシステインとしては、上述した増殖用培地におけるものと同様のものを同様の濃度で用いることができる。
＜代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導する方法＞
　一実施形態において、本発明は、上記代謝活性化肝オルガノイドの製造方法により製造された代謝活性化肝オルガノイドを誘導用培地で培養し、代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導すること（以下、「工程Ｃ」ともいう）を含み、前記誘導用培地は、ＩＬ－６ファミリーサイトカインを含む、誘導方法を提供する。
　本実施形態の誘導方法によれば、代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに戻すことができ、細胞の増殖能を回復させることができる。
　工程Ｃにおける培養条件は、上述した増殖性肝オルガノイドの製造方法における工程Ａにおける培養条件と同様の条件である。また、使用する誘導用培地は、上述した増殖性肝オルガノイドの製造方法に記載の増殖用培地と同様の組成である。
＜被験物質の評価方法＞
　一実施形態において、本発明は、代謝活性化肝オルガノイドの製造方法により製造された代謝活性化肝オルガノイドと被験物質とを接触させること、及び代謝活性化肝オルガノイドの応答を評価することを含む、前記被験物質の評価方法を提供する。
　本実施形態の評価方法により、被験物質の代謝、薬物相互作用、肝毒性、トランスポーター活性等をインビトロで評価し、インビボにおける評価に近い結果を得ることができる。
　被験物質としては、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、及び代謝物ライブラリが挙げられる。被験物質には様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例としては、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ９、Ｂ１２、Ｃ、Ａ、Ｄ、Ｅ等）等が挙げられる。
　医薬や栄養食品等の既存成分又は候補成分も被験物質の一つである。植物抽出液、細胞抽出液、及び培養上清等を被験物質として用いることができる。また、２種類以上の被験物質を同時に添加することにより、被験物質間の相互作用、相乗作用等を調べることもできる。
　被験物質と代謝活性化肝オルガノイドとを接触させる期間は、通常、１０分間～３日間、好ましくは１時間～１日間である。被験物質と代謝活性化肝オルガノイドとの接触を複数回に分けて行うことができる。
　代謝活性化肝オルガノイドの応答の評価は、例えば、産生される代謝産物に応じて、質量分析、液体クロマトグラフィー、又は免疫学的手法により行うことができる。免疫学的手法としては、例えば、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、及び酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）が挙げられる。
　代謝活性化肝オルガノイドにおける薬物代謝酵素（例えば、シトクロム、ＵＧＴ等）の発現を指標として被験物質の代謝を測定することもできる。薬物代謝酵素の発現は、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルが挙げられる。
　本実施形態の評価方法は、被験物質の毒性を試験することもできる。例えば、被験物質を接触させた後の代謝活性化肝オルガノイドの状態を調べ、被験物質の毒性を評価する。代謝活性化肝オルガノイドの状態としては、生存率、細胞形態、及び培養液中の肝障害マーカー（例えば、ＧＯＴ、ＧＰＴ等）の存在量等が挙げられる。
＜その他実施形態＞
　一実施形態において、本発明は、上記増殖性肝オルガノイドの製造方法により製造された増殖性肝オルガノイド及び代謝活性肝オルガノイドの製造方法により製造された代謝活性化肝オルガノイドを提供する。本実施形態の代謝活性化肝オルガノイドは、被験物質の代謝、薬物相互作用、肝毒性、及びトランスポーター活性等のインビトロ評価に好適に用いることができる。
　増殖性肝オルガノイド及び代謝活性化肝オルガノイドと、例えば生体内に天然に存在する肝細胞とは、遺伝子発現パターン等に相違が存在する可能性がある。しかしながら、そのような相違が存在するか否かは定かではなく、また、そのような相違を特定して、遺伝子発現パターン等により本実施形態の細胞を特定するためには、著しく多くの試行錯誤を重ねることが必要であり、実質的に不可能である。したがって、本実施形態の細胞は、上述した製造方法により製造されたことにより特定することが実際的であるといえる。
　一実施形態において、本発明は、増殖用培地及び分化用培地を提供する。増殖用培地及び分化用培地は、それぞれ、増殖性肝オルガノイドの製造方法に記載の増殖用培地、及び代謝活性肝オルガノイドの製造方法に記載の分化用培地に記載したとおりである。
　以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。また、全ての実験は慶應義塾大学医学部倫理委員会で承認された倫理研究計画に基づいて行った。
［実験例１］ヒト増殖性肝オルガノイドの製造
　ヒト初代凍結浮遊肝細胞（ＢＩＯＰＲＲＩＤＩＣ、ＨＥＰ１８７－Ｓ）を３７℃のウォーターバスで融解し、無血清培地を加えた５０ｍＬチューブに懸濁して遠心した。なお、無血清培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２にＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ペニシリン／ストレプトマイシンを加えた培地である。遠心後、上清を除き、その後、無血清培地で懸濁し、肝細胞懸濁液を調製した。この懸濁液から４０，０００個の肝細胞を５０μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）と混合し、２４ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲルが完全に重合するまで３７℃で５分間以上１０分間以下程度インキュベートした。続いて、マトリゲルが重合した後に、表１に示す増殖用培地を重層して１２週間培養し、実験例１の増殖性肝オルガノイドを製造した。
　なお、Ｒ－スポンジン１は、Ｒ－スポンジン１を含むコンディションメディウムの形態で用いており、コンディションメディウムの総容量に対するＲ－スポンジン１の濃度は１．３μｇ／ｍＬである。
　Ｗｎｔ３ａについてもＲ－スポンジン１と同様に、Ｗｎｔ３ａとアファミンとの複合体を含むコンディションメディウムの形態で用いており、コンディションメディウムの総容量に対するＷｎｔ３ａの濃度は３６０ｎｇ／ｍＬである。
　初代凍結浮遊肝細胞からの増殖性肝オルガノイド（培養開始から２週間後）の増殖率を目視にて判定した。結果を表１に示す。判定基準は、増殖率が高いものから順に（＋＋＋、＋＋、＋、－）とした。
　培養開始から２週間後の増殖性肝オルガノイドの形態を蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ社製、装置名「ＢＺ－Ｘ７１０」）で観察し、形態を観察した。オルガノイドの内部が空洞であるものを「中空」と判定し、内部まで細胞がつまっているものを「中実」と判定した。結果を表１に示す。また、顕微鏡像を図１に示す。
　増殖性肝オルガノイドの維持継代培養の可否を判定した。判定は継代した後に細胞の増殖性を顕微鏡像から判断した。結果を表１に示す。
　培養開始から２週間後の増殖性肝オルガノイドについて、市販のキット（商品名「ＦａｓｔＬａｎｅ　Ｃｅｌｌ　ｃＤＮＡ　Ｋｉｔ」、キアゲン社）を用いて、細胞から総リボ核酸（ＲＮＡ）を抽出してｃＤＮＡを合成し、リアルタイム定量ＰＣＲによりアルブミン、代謝酵素及びトランスポーター遺伝子のｍＲＮＡの発現量を測定した。リアルタイム定量ＰＣＲは、市販のキット（商品名「ＳＹＢＲ（登録商標）　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（Ｐｅｒｆｅｃｔ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ）」、タカラバイオ株式会社）を用いて行った。また、内在性コントロールとしてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を用い、測定結果を補正した。結果を表３に示す。なお、表３において、数値は、ヒト初代凍結浮遊肝細胞（ＢＩＯＰＲＲＩＤＩＣ、ＨＥＰ１８７－Ｓ）での発現量を１００とした時の相対値で表されている。
［実験例２～実験例４］肝オルガノイドの製造
　表１に示す各組成である増殖用培地を用いた以外は、実験例１と同様の方法を用いて、肝オルガノイドを製造した。増殖率、細胞の形態、維持拡大培養、並びに遺伝子レベルでの代謝酵素、トランスポーター及びアルブミン発現量の測定についても実験例１と同様の方法を用いて行なった。結果を表１及び表３に示す。また、実験例２の肝オルガノイドの顕微鏡像を図２に示す。
［実験例５］代謝活性化肝オルガノイドの製造
　実験例１の方法を用いて、増殖用培地中で２週間培養したヒト増殖性肝オルガノイドを機械的解離によって希釈し、継代した。その際、培地を増殖用培地から分化用培地に交換して、１週間培養することで、代謝活性化肝オルガノイドを製造した。分化用培地としては、表２に示す組成であるＩＬ－６を含まない無血清培地を用いた。細胞の形態、維持拡大培養、並びに遺伝子レベルでの代謝酵素、トランスポーター及びアルブミン発現量の測定について実験例１と同様の方法を用いて行なった。結果を表２及び３に示す。また、得られた肝オルガノイドの顕微鏡像を図３に示す。
［参考例１］ヒト肝オルガノイドの製造
　非特許文献２に記載の方法を用いて、ヒト肝オルガノイドを製造した。遺伝子レベルでの代謝酵素、トランスポーター及びアルブミン発現量の測定について実験例１と同様の方法を用いて行なった。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表１から、ＩＬ－６を含む増殖用培地を用いて得られた増殖性肝オルガノイド（実験例１）は、細胞の形態が中空であり、増殖率が高く、維持拡大培養が可能なものであった。また、図１の顕微鏡像から、オルガノイド内部に赤色の成分が含まれることが観察された。
　これに対して、ＩＬ－６を含まない増殖用培地を用いて得られた肝オルガノイド（実験例２）は、細胞の形態が中実であり、増殖率は高いが、維持拡大培養をすることができなかった。また、ＩＬ－６を含まず、ニコチンアミドを含む増殖用培地を用いて得られた肝オルガノイド（実験例３及び実験例４）は、細胞の形態が中実であり、増殖率が低く、維持拡大培養をすることができなかった。
　表２及び表３から、ＩＬ－６を含まない分化用培地を用いて実験例１の増殖性肝オルガノイドから分化された実験例５の代謝活性化肝オルガノイドは、細胞の形態が中空であり、維持拡大培養はできないものの、遺伝子レベルでの代謝酵素、トランスポーター及びアルブミン発現量が万遍なく向上しており、薬物動態試験に使用できる程度のものであった。また、図３の顕微鏡像から、オルガノイド内部にビリルビンと推定される黄色の成分が含まれることが観察された。
［実験例６～実験例７］増殖性肝オルガノイドの製造
　表４に示す増殖用培地を用いた以外は、実験例１と同様の方法を用いて、増殖性肝オルガノイドを製造した。増殖率、及び維持拡大培養の測定についても実験例１と同様の方法を用いて行なった。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［実験例８～実験例１２］代謝活性肝オルガノイドの製造
　表４に示す分化用培地を用いた以外は、実験例５と同様の方法を用いて、代謝活性肝オルガノイドを製造した。アルブミン発現量及びＣＹＰ３Ａ４発現量の測定についても実験例５と同様の方法を用いて行なった。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
［実験例１３］コラーゲン－マトリゲル上でのヒト増殖性肝オルガノイドの製造
　ヒト初代凍結浮遊肝細胞（ＢＩＯＰＲＲＩＤＩＣ、ＨＥＰ１８７－Ｓ）を３７℃のウォーターバスで融解し、無血清培地を加えた５０ｍＬチューブに懸濁して遠心した。なお、無血清培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２にＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ペニシリン／ストレプトマイシンを加えた培地である。遠心後、上清を除き、その後、無血清培地で懸濁し、肝細胞懸濁液を調製した。この懸濁液から５０，０００個の肝細胞を１２．５μＬのマトリゲル（ＢＤバイオサイエンス社）及び１２．５μＬのコラーゲンＩ（新田ゼラチン株式会社）と混合し、４８ウェル組織培養プレートに播種し、マトリゲル及びコラーゲンＩが完全に重合するまで３７℃で５分間以上１０分間以下程度インキュベートした。対照として、マトリゲルのみ又はコラーゲンのみを用いたものも準備した。続いて、マトリゲル及びコラーゲンＩが重合した後に、上記表１に示す増殖用培地を重層して培養し、実験例１３の増殖性肝オルガノイドを製造した。
　図４Ａ～図４Ｄに示すように、コラーゲン及びマトリゲルを混合したＥＣＭを用いた場合には、より多くの継代回数で培養可能であり、増殖性の増強が見られた。
　本実施形態の増殖性肝オルガノイドの製造方法によれば、増殖性に優れた増殖性肝オルガノイドが得られる。本実施形態の代謝活性化肝オルガノイドの製造方法によれば、前記増殖性肝オルガノイドから分化された、代謝活性に優れた、代謝活性化肝オルガノイドが得られる。

Claims (39)

  1. 　増殖性肝オルガノイドの製造方法であって、
    　肝幹細胞又は肝幹細胞を含む組織片を増殖用培地中で培養し、増殖性肝オルガノイドを得ることを含み、
    　前記増殖用培地は、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを含む、製造方法。
  2. 　前記インターロイキン－６ファミリーサイトカインが、インターロイキン－６、インターロイキン－１１、オンコスタチンＭ、白血病抑制因子、カルジオトロピン－１、及び毛様体神経栄養因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記増殖用培地がニコチンアミドを実質的に含まない、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。
  4. 　前記増殖用培地が成長因子を更に含む、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　前記成長因子が、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、アンフィレグリン、及びヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項４に記載の製造方法。
  6. 　前記増殖用培地がＷｎｔアゴニストを更に含む、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、ノリン、及びグリコーゲン合成酵素阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項６に記載の製造方法。
  8. 　前記増殖用培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、請求項１～請求項７のいずれか一項に記載の製造方法。
  9. 　前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、ファスジル、Ｙ３９９８３、Ｗｆ－５３６、ＳＬｘ－２１１９、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ、Ｒｈｏキナーゼα阻害剤、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサン－カルボキシアミド、Ｒｈｏスタチン、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、Ｋｉ－２３０９５、及びＶＡＳ－０１２からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項８に記載の製造方法。
  10. 　前記増殖用培地が形質転換増殖因子－β阻害剤を更に含む、請求項１～請求項９のいずれか一項に記載の製造方法。
  11. 　前記形質転換増殖因子－β阻害剤が、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 　前記増殖用培地が骨形成タンパク質阻害剤を更に含む、請求項１～請求項１１のいずれか一項に記載の製造方法。
  13. 　前記骨形成タンパク質阻害剤が、ノギン、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ－ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｇｅｎｅ　Ａｂｅｒｒａｔｉｖｅ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、及びグレムリンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１２に記載の製造方法。
  14. 　前記増殖用培地がフォルスコリンを更に含む、請求項１～請求項１３のいずれか一項に記載の製造方法。
  15. 　前記増殖用培地が、ガストリン、神経生物系サプリメント、及びＮ－アセチルシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つを更に含む、請求項１～請求項１４のいずれか一項に記載の製造方法。
  16. 　前記増殖用培地中での培養において、前記肝幹細胞又は前記肝幹細胞を含む組織片と細胞外マトリックスとを接触させて培養する、請求項１～請求項１５のいずれか一項に記載の製造方法。
  17. 　前記増殖用培地中での培養において、前記細胞外マトリックスがコラーゲン及びマトリゲルの混合物である、請求項１６に記載の製造方法。
  18. 　前記増殖用培地中での培養において、少なくとも２週間培養を行う、請求項１～請求項１７のいずれか一項に記載の製造方法。
  19. 　代謝活性化肝オルガノイドの製造方法であって、
    　請求項１～請求項１８のいずれか一項に記載の製造方法により製造された増殖性肝オルガノイドを分化用培地中で培養し、代謝活性化肝オルガノイドを得ることを含み、
    　前記分化用培地が、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを実質的に含まない、製造方法。
  20. 　前記分化用培地がニコチンアミドを実質的に含まない、請求項１９に記載の製造方法。
  21. 　前記分化用培地が成長因子を更に含む、請求項１９又は請求項２０に記載の製造方法。
  22. 　前記成長因子が、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、及び肝細胞増殖因子からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２１に記載の製造方法。
  23. 　前記分化用培地がＷｎｔアゴニストを更に含む、請求項１９～請求項２２のいずれか一項に記載の製造方法。
  24. 　前記Ｗｎｔアゴニストが、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｒ－スポンジン１、Ｒ－スポンジン２、Ｒ－スポンジン３、Ｒ－スポンジン４、ノリン、及びグリコーゲン合成酵素阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２３に記載の製造方法。
  25. 　前記分化用培地がＲｈｏキナーゼ阻害剤を更に含む、請求項１９～請求項２４のいずれか一項に記載の製造方法。
  26. 　前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤が、Ｙ－２７６３２、ファスジル、Ｙ３９９８３、Ｗｆ－５３６、ＳＬｘ－２１１９、アザベンゾイミダゾール－アミノフラザン、ＤＥ－１０４、Ｈ－１１５２Ｐ、Ｒｈｏキナーゼα阻害剤、ＸＤ－４０００、ＨＭＮ－１１５２、４－（１－アミノアルキル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサン－カルボキシアミド、Ｒｈｏスタチン、ＢＡ－２１０、ＢＡ－２０７、Ｋｉ－２３０９５、及びＶＡＳ－０１２からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２５に記載の製造方法。
  27. 　前記分化用培地が形質転換増殖因子－β阻害剤を更に含む、請求項１９～請求項２６のいずれか一項に記載の製造方法。
  28. 　前記形質転換増殖因子－β阻害剤が、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＬＹ３６４９４７、ＳＤ－２０８、及びＳＪＮ２５１１からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２７に記載の製造方法。
  29. 　前記分化用培地が骨形成タンパク質阻害剤を更に含む、請求項１９～請求項２８のいずれか一項に記載の製造方法。
  30. 　前記骨形成タンパク質阻害剤が、ノギン、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ－ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｇｅｎｅ　Ａｂｅｒｒａｔｉｖｅ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、及びグレムリンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２９に記載の製造方法。
  31. 　前記分化用培地がフォルスコリンを更に含む、請求項１９～請求項３０のいずれか一項に記載の製造方法。
  32. 　前記分化用培地が、ガストリン、神経生物系サプリメント、及びＮ－アセチルシステインからなる群より選ばれる少なくとも１つを更に含む、請求項１９～請求項３１のいずれか一項に記載の製造方法。
  33. 　前記分化用培地が、ビタミンＤを更に含む、請求項１９～請求項３２のいずれか一項に記載の製造方法。
  34. 　前記分化用培地が、Ｎｏｔｃｈ阻害剤を更に含む、請求項１９～請求項３３のいずれか一項に記載の製造方法。
  35. 　代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導する方法であって、
    　請求項１９～請求項３４のいずれか一項に記載の製造方法により製造された代謝活性化肝オルガノイドを誘導用培地中で培養し、前記代謝活性化肝オルガノイドを増殖性肝オルガノイドに誘導することを含み、
    　前記誘導用培地は、インターロイキン－６ファミリーサイトカインを含む、誘導方法。
  36. 　請求項１～請求項１８のいずれか一項に記載の製造方法により製造された、増殖性肝オルガノイド。
  37. 　請求項１９～請求項３４のいずれか一項に記載の製造方法により製造された、代謝活性化肝オルガノイド。
  38. 　インターロイキン－６ファミリーサイトカインを含む、増殖性肝オルガノイドを培養するための増殖用培地。
  39. 　請求項３７に記載の代謝活性化肝オルガノイドと被験物質とを接触させることと、
    　前記代謝活性化肝オルガノイドの応答を評価することと、
    を含む、被験物質の評価方法。
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