CN110938144A

CN110938144A - 一种抗angptl3单克隆抗体及其在制备治疗肾病综合征药物中的用途

Info

Publication number: CN110938144A
Application number: CN201911177503.5A
Authority: CN
Inventors: 徐虹; 韩新利; 沈茜; 孙利; 刘海梅; 吕倩影
Original assignee: SHANGHAI MINHANG DISTRICT CENTRAL HOSPITAL
Current assignee: Childrens Hospital of Fudan University
Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2039-11-27
Also published as: CN110938144B

Abstract

本发明公开了一种抗ANGPTL3单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链氨基酸序列为SEQ ID:No 1，轻链氨基酸序列为SEQ ID:No 2；重链DNA序列为SEQ ID:No 3，轻链DNA序列为SEQ ID:No 4。本发明的抗ANGPTL3单克隆抗体在制备治疗肾病综合征药物中的应用，所述抗ANGPTL3单克隆抗体特异性识别ANGPTL3，阻断ANGPTL3的纤维蛋白原样结构域，拮抗ANGPTL3对足细胞的损伤。本发明可应用于检测ANGPTL3，有望用于肾病综合征蛋白尿的治疗。

Description

一种抗ANGPTL3单克隆抗体及其在制备治疗肾病综合征药物中的用途

技术领域

本发明涉及单克隆抗体领域，具体是一种抗ANGPTL3单克隆抗体及其在制备治疗肾病综合征药物中的用途。

背景技术

蛋白尿是肾脏疾病常见的临床表现，主要与肾脏足细胞损伤有关，目前缺少针对致病因子的特异性治疗手段。

血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)是一种分泌性糖蛋白，包含螺旋-螺旋样结构域(coiled-coil domain,CCD)和纤维蛋白原样结构域(FLD)，CCD可抑制脂蛋白酯酶，调节脂质代谢，FLD与受体整合素ανβ3结合参与足细胞损伤。

目前针对ANGPTL3的单克隆抗体，仅用于Western-Blot、ELISA等实验检测，没有针对ANGPTL3的功能结构域的功能性抗体。

发明内容

本发明提供了一种抗ANGPTL3单克隆抗体及其在制备治疗肾病综合征药物中的用途，以填补现有技术中无针对ANGPTL3功能结构域的功能性抗体的空白。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种抗ANGPTL3单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链氨基酸序列为SEQ ID:No 1；轻链氨基酸序列为SEQ ID:No 2。

进一步的，所述单克隆抗体的重链DNA序列为SEQ ID:No 3；轻链DNA序列为SEQID:No 4。

一种抗ANGPTL3单克隆抗体在制备治疗肾病综合征药物中的应用。

进一步的，所述抗ANGPTL3单克隆抗体特异性识别ANGPTL3，阻断ANGPTL3的纤维蛋白原样结构域，拮抗ANGPTL3对足细胞的损伤。

本发明获得了如下的有益效果。

本发明公开了一种针对ANGPTL3的FLD的单克隆抗体，可以特异性识别ANGPTL3，阻断ANGPTL3的功能结构域FLD，拮抗ANGPTL3对足细胞的损伤，从而达到保护足细胞的作用。本发明可应用于检测ANGPTL3，有望用于肾病综合征蛋白尿的治疗。

附图说明

图1是本发明抗原人ANGPTL3的SDS-PAGE和Western-blot图；

图2是本发明抗ANGPTL3单克隆抗体的三维结构图；

图3是本发明重组蛋白ANGPTL3-CCD和ANGPTL3-FLD的SDS-PAGE图；

图4是本发明抗ANGPTL3单克隆抗体的Western Blot检测；

图5是本发明抗ANGPTL3单克隆抗体与ANGPTL3的亲和力检测图；

图6是本发明抗ANGPTL3单克隆抗体减少PAN诱导的整合素β3的激活结果图；

图7是本发明抗ANGPTL3单克隆抗体减少PAN诱导的足细胞凋亡结果图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行进一步说明。

本发明用到以下试剂、细胞、抗体：

以上试剂、细胞、抗体均为市售商品，均来自金斯瑞(genescript)生物科技有限公司。

一、单克隆抗体的序列

本发明的一种抗ANGPTL3单克隆抗体，重链DNA序列(1392bp)(SEQ ID:No 3)如下：

ATGGCTGTCCTGGCACTGCTCCTCTGCCTGGTGACATTCCCAAGCTGTGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTCTCAGGGTTCTCATTAACCACCTATGGTGTAAGCTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTGACGGGAACACAAATTATCATTCAGCTCTCATATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGATAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAACTGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCACGTACTACTGTGCCAAAGGAGGACCCTATGGTAACTACGTGCCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA

重链氨基酸序列(463aa)(SEQ ID:No 1)如下：

MAVLALLLCLVTFPSCVLSQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTTYGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGNTNYHSALISRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQTDDTATYYCAKGGPYGNYVPFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK-

轻链DNA序列(717bp)(SEQ ID:No 4)如下：

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACAGGTGACATTGTGCTGACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATATCCTGCAGAGCCAGTGAAAGTGTTGATAGTTATGGCAATAGTTTTATGCACTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCGTGCATCCAACCTAGAATCTGGGATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTAGGACAGACTTCACCCTCACCATTAATCCTGTGGAGGCTGATGATGTTGCAACCTATTACTGTCAGCAGAGTGATGAGGAGCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAACCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG轻链氨基酸序列(238aa)(SEQ ID:No 2)如下：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSDEEPPTFGGGTNLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC-

二、单克隆抗体的制备方法

第一阶段：抗原准备

1.克隆方案设计

EcoRI-Kozak sequence-gp67-Angiopoietin related protein 3-His--stopcodon-HindIII

Protein Length＝491MW＝57172.7Predicted pI＝7.05

氨基酸序列

MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFARIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFEHHHHHHHHHH**

2.将步骤1中的氨基酸序列对应碱基序列合成克隆到pFastBacgp67病毒中。

3.蛋白生成与鉴定

质粒转染昆虫细胞中，于培养基中培养后，取上清做SDS-PAGE进行验证(实验结果参见图1，M1、M2为蛋白Marker；1为BSA；2、3为人ANGPTL3)，实验结果表明：昆虫细胞表达抗原人ANGPTL3后，将其分泌至培养基中，将含有人ANGPTL3的培养基进行SDS-PAGE，以BSA作为对照，可见位于约58KD和30KD的条带，用抗HIS标签的单克隆抗体作为一抗进行Western-blot检测，可见相同位置的两条带，证明两个条带均为人ANGPTL3的条带,抗原表达成功。

第二阶段：动物免疫

将ANGPTL3蛋白作为免疫原，按照常规方法免疫10只BALB/c小鼠，具体的动物免疫流程见表1。

表1常规免疫程序

流程名称	时间	免疫剂量/途径
			免疫前采血	T＝-4天
第一次免疫	T＝0天	50μg/每只，i.p.
			第二次免疫	T＝14天	25μg/每只，i.p.
第一次采血检测	T＝21天
			第三次免疫	T＝28天	25μg/每只，i.p.
第二次采血检测	T＝35天
			第四次免疫	T＝42天	25μg/每只，i.p.
第三次采血检测	T＝49天
			终免	T＝63±7天	10μg/每只，i.p.或者i.v
融合	T＝终免+4天

1.从第二次免疫之后7天开始采血进行ELISA检测。用蛋白和His无关蛋白分别进行包板ELISA间接检测。

2.三免之后血清进行检测，如果动物的血清效价用蛋白在ELISA的检测下满足融合要求(血清在1：8000稀释时OD值>1.0)，则继续进行。如果免疫效价低不满足要求，后续改善计划。

第三阶段：细胞融合和筛选

根据免疫检测结果决定用于融合的实验动物

1.细胞融合和铺板:选择效价最好的两只小鼠进行融合。融合效率可以达到2000个左右的B细胞产生1个杂交瘤细胞。每次融合铺板数为15块96孔板。

2.初筛：用蛋白进行包板，用间接ELISA进行融合细胞上清液的筛选。

3.确认性筛选：将初筛得到的阳性上清挑选出来，用蛋白再次进行ELISA检测，His无关蛋白包被进行反筛，筛选特异性针对目的蛋白的阳性细胞株。

第四阶段：亚克隆、保种与冻存

1.在上述融合之后母克隆上清进行Western-Blot检测，根据特异性选择10株母克隆，利用有限稀释法进行一轮亚克隆。

2.一轮亚克隆之后，对上清进一步检测，根据结果利用有限稀释法进行亚克隆定株，每轮亚克隆进行ELISA检测，选择特异性针对目的蛋白的细胞株。

3.每个选定的母克隆将会保留两个子克隆进行扩大培养，细胞冻存，亚型鉴定。

第五阶段：抗体生产

1.将10株细胞用转瓶培养或小鼠腹水方式进行小规模的抗体生产。

2.用蛋白A/G柱进行亲和纯化，预计每个细胞株得到2-5mg抗体。

3.纯化后抗体将进行ELISA检测，测定抗体滴度(表2)。

表2.纯化的抗ANGPTL3单克隆抗体的ELIS

备注：包被抗原：A为血管生成素样蛋白3蛋白

B为His标签蛋白

包被浓度：1ug/ml，100ul/孔

包被缓冲液：pH为7.4的磷酸盐缓冲液

二抗：过氧化酶标记的羊抗鼠IgG，Fcγ特异片段

起始浓度为1mg/ml，稀释倍数基于实际浓度

空白孔的OD值为两个复孔的均值

滴度是试验孔/空白孔OD值>＝2.1时的最高稀释浓度

三、单克隆抗体的验证

1、抗ANGPTL3单克隆抗体可特异性结合ANGPTL3-FLD

(一)重组质粒pET-28a-Angptl3-CCD，pET-28a-Angptl3-FLD构建所用试剂及方法

试剂：Angptl3 cDNA由厦门大学提供；

MaxDNA聚合酶购自Takara；引物由上海康尼公司合成；T4 DNA连接酶(T4 DNA Ligase)、Not I限制性内切酶、BmH I限制性内切酶购自NEB；质粒提取试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；卡那青霉素、DL 2000DNA Marker、DL 10000DNA Marker购自Thermo Scientific；感受态大肠杆菌DH5α购自天根生化科技有限公司；蛋白胨和酵母购自OXOID；氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司；琼脂糖和琼脂粉购自生工生物。

LB培养基：1％Nacl，1％蛋白胨，0.5％酵母

LB固体培养基：1％Nacl，1％蛋白胨，0.5％酵母，1％琼脂

1％琼脂糖凝胶：2g琼脂糖加入100ml TAE，加热融解，加入EB(终浓度0.5ug/ml)混匀，倒入磨具，插入梳子，待冷却。

方法：

1.以鼠Angptl3 cDNA为模板，加入设计的上下游引物进行PCR反应，扩增目的基因。

目的序列：CCD

ctatcacttcgaaccaatgaaatcaaagaagaggaaaaggagctaagaagaactacatctacactacaagttaaaaacgaggaggtgaagaacatgtcagtagaactgaactcaaagcttgagagtctgctggaagagaagacagcccttcaacacaaggtcagggctttggaggagcagctaaccaacttaattctaagcccagctggggctcaggagcacccagaagtaacatcactcaaaagttttgtagaacagcaagacaacagcataagagaactcctccagagtgtggaagaacagtataaacaattaagtcaacagcacatgcagataaaagaaatagaaaagcagctcagaaagact

目的序列：FLD

acagaacaagatgaccttcctgccgactgctctgccgtttataacagaggcgaacatacaagtggcgtgtacactattaaaccaagaaactcccaagggtttaatgtctactgtgatacccaatcaggcagtccatggacattaattcaacaccggaaagatggctcacaggacttcaacgaaacatgggaaaactacgaaaagggctttgggaggctcgatggagaattttggttgggcctagagaagatctatgctatagtccaacagtctaactacattttacgactcgagctacaagactggaaagacagcaagcactacgttgaatactcctttcacctgggcagtcacgaaaccaactacacgctacatgtggctgagattgctggcaatatccctggggccctcccagagcacacagacctgatgttttctacatggaatcacagagcaaagggacagctctactgtccagaaagttactcaggtggctggtggtggaatgacatatgtggagaaaacaacctaaatggaaaatacaacaaacccagaaccaaatccagaccagagagaagaagagggatctactggagacctcagagcagaaagctctatgctatcaaatcatccaaaatgatgctccagcccaccacc

引物序列：

CCD-F：5’CGCGGATCCCTATCACTTCGAACCAATGAAATC 3’

CCD-R：5’CGCGGATCCCTATCACTTCGAACCAATGAAATC 3’

FLD-F：5’CGCGGATCCACAGAACAAGATGACCTTCC3’

FLD-R：5’ATAAGAATGCGGCCGCTTAGGTGGTGGGCTGG3’

载体质粒pET28a由上海医学院分子医学重点实验室提供。

2.将扩增的目的基因与载体质粒pET28a连接，用BamHI和NotI两个限制性内切酶于37°水浴中双酶切反应4h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照，切胶，用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收两组酶切产物。

3.将酶切后的载体大片段(pET28a)与目的基因片(Angptl3-CCD或Angptl3-FLD)以1：3的摩尔比16℃反应过夜，进行连接。

4.将全部的连接产物转化入DH5α感受态细胞，转化好的细胞涂抹于含有卡那青霉素抗性的LB固体琼脂培养基上，倒置培养皿置于37°培养箱中培养12-16h。

5.挑取转化平板上的大肠杆菌单菌落，菌落PCR验证，同时接种于LB液体培养基中，在37°摇床200rpm/min摇菌12-16h。用质粒提取试剂盒提取质粒并测浓度。

6.将提取的质粒用BamHI和NotI两个限制性内切酶于37°水浴中双酶切反应4h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。酶切正确的质粒进行测序鉴定。

(二)重组蛋白ANGPTL3-CCD和ANGPTL3-FLD诱导表达纯化所用试剂

试剂：感受态大肠杆菌BL21购自Solarbio，IPTG购自sigma

方法：

1.将测序验证正确的pET28a-Angptl3-CCD重组质粒和pET28a-Angptl3-FLD重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中。将转化好的感受态细胞液体涂于含卡那霉素的LB固体培养基上，平板倒置于37°电热恒温培养箱中培养12-16h。

2.待平板长出菌后挑取单菌落接种于50mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃270 r/min培养到OD＝0.6-0.8时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)，200r/min 37℃振荡诱导培养。诱导表达5小时后的菌液，4500r/min离心15min，弃上清，用12％的分离胶通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况(参见图3，a、诱导表达ANGPTL3-CCD 0小时；b、诱导表达ANGPTL3-CCD 3小时；c、诱导表达ANGPTL3-FLD 0小时；d、诱导表达ANGPTL3-FLD 3小时)。实验结果表明：重组质粒pET-28a-Angptl3-CCD和pET-28a-Angptl3-FLD转化入表达菌BL21后，由IPTG诱导5小时，弃去培养基后，菌体蛋白SDS-PAGE，与诱导前相比较，诱导5小时后重组蛋白ANGPTL3-CCD，ANGPTL3-FLD明显表达。

(三)抗ANGPTL3单克隆抗体特异性结合FLD的Western-Blot实验

以重组蛋白(ANGPTL3-CCD或ANGPTL3-FLD)为检测目的蛋白，以抗ANGPTL3单克隆抗体为一抗，以过氧化物酶标记的鼠源IgG作为二抗，进行Western-Blot验证(参见图4，a、阴性对照；b、重组蛋白ANGPTL3-CCD；c、阴性对照；d、重组蛋白ANGPTL3-FLD)。实验结果表明：抗ANGPTL3单克隆抗体可以特异性的结合ANGPTL3-FLD。

2、抗ANGPTL3单克隆抗体亲和力的检测

实验仪器及试剂：Biacore T200,BR18010468(GE Healthercare)；S系列传感器芯片CM5；10mM醋酸盐pH 5.0；胺耦合套件

NHS：在水中溶解100mM N-羟基琥珀酰亚胺；

EDC：在水中的400mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；

乙醇胺：1M乙醇胺盐酸盐，用NaOH调节至pH 8.5；

HBS-EP：10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％P20，pH7.4。

实验方法：

1.将Angptl3固定在CM5传感器芯片上

在25摄氏度下，以HBS-EP为运行缓冲液。用新鲜混合的NHS(50mmol/L)和EDC(200mmol/L)激活传感器芯片表面活化流动池1和4，持续420秒钟(10微升/分钟)。然后，将稀释在10mmol/L NaAC(pH 5.0)中的Angptl3注入流通池4中，以分别实现

ResponseUnit的结合。同时，Fc1被设置为空白。胺偶联反应后，通过420s注射1mol/L乙醇胺盐酸盐封闭芯片表面上剩余的活性偶联位点。

2.亲和力的检测

该测定在25℃进行，运行缓冲液为HBS-EP。将稀释的5E5F6注入流动池1、2、3和4的表面作为缔合阶段，然后注入运行缓冲液作为解离阶段。运行配置如表3。

表3

3.结果

所有数据均使用Biacore T200评估软件3.1版进行处理。流通池1用作减法响应单位的双重参考。如表4，图5

表4抗ANGPTL3抗体对ANGPTL3蛋白的亲和力

3、抗ANGPTL3单克隆抗体减少PAN诱导的整合素β3的激活

实验试剂：美国Kerafast公司，Anti-Integrin Beta 3(GPIIIa,CD61),PSIDomain[AP-5]Antibody(#EBW107)；美国Affinity公司，Goat Anti-Mouse IgG(H+L)FITC-conjugated(#S0007)。

实验方法：

(1)体外培养人足细胞系，选取分化至12-14天状态良好的足细胞进行干预。

(2)足细胞组别如下：

阴性对照组：未予以抗体孵育组；

对照组：未予以PAN及ANGPTL3单克隆抗体干预组

PAN组：单独予以50ug/mlPAN干预48h；

抗ANGPTL3单克隆抗体组(100ng/ml)：给予100ng/ml抗ANGPTL3单克隆抗体预干预1h后予以50ug/mlPAN干预48h；

(3)PAN干预48h后，予以0.25％胰酶消化，完全培养基终止消化，重悬细胞。

(4)预冷PBS清洗细胞2遍，弃去废液。

(5)Anti-Integrin Beta 3抗体(1:100)室温孵育细胞60min。

(6)孵育结束后，预冷PBS清洗细胞3遍。

(7)Goat Anti-Mouse IgG(H+L)FITC-conjugated抗体(1:200)室温避光孵育细胞60min。

(8)孵育结束后，预冷PBS清洗细胞3遍。

(9)将各组细胞悬液(300ul)转移至流式管中，流式细胞仪检测每组细胞。

采用流式细胞术检测各组足细胞表面整合素β3活化情况。结果显示，与对照组相比，PAN组足细胞表面整合素β3激活显著增加(P<0.05)。与PAN组相比较，抗ANGPTL3单克隆抗体组(100ng/ml)组足细胞表面整合素β3激活显著减少(P<0.05)，参见图6A、B。

4、抗ANGPTL3单克隆抗体减少PAN诱导的足细胞的凋亡

实验试剂：美国BD公司，PE Annexin-V Apoptosis Detection Kit I(#559763)

实验方法：

(2)足细胞组别如下：

对照组：未予以PAN及ANGPTL3单克隆抗体干预组；

PAN组：单独予以50ug/mlPAN干预48h；

500ng/ml抗ANGPTL3单克隆抗体组：给予500ng/ml抗ANGPTL3单克隆抗体预干预1h后予以50ug/mlPAN干预48h；

(4)预冷PBS清洗细胞2遍，弃去废液，之后用1×Binding Buffer调整细胞浓度至1×10^6个/ml。

(5)取100ul细胞悬液(1×10^5个细胞)于5ml离心管中。

(6)加入5ul PE-Annexin V和5ul 7-AAD。

(7)轻柔混匀细胞后，室温(25℃)避光孵育15min。

(8)孵育结束后将细胞转移至流式管内再加入400ul 1×Binding Buffer。1小时内使用流式细胞仪分析每组细胞。

采用PE-Annexin-V/7-AAD双染法检测不同处理组足细胞凋亡情况。结果显示，与对照组相比，PAN组凋亡率显著增加(P<0.05)。与PAN组相比较，抗ANGPTL3单克隆抗体组(100ng/ml)组及抗ANGPTL3单克隆抗体组(500ng/ml)细胞凋亡率均显著减少(P<0.05)，参见图7A、B。

序列表

<110> 上海市闵行区中心医院

<120> 一种抗ANGPTL3单克隆抗体及其在制备治疗肾病综合征药物中的用途

<141> 2019-11-26

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 463

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys

1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala

20 25 30

Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu

35 40 45

Thr Thr Tyr Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr His Ser

65 70 75 80

Ala Leu Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

85 90 95

Val Phe Leu Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Lys Gly Gly Pro Tyr Gly Asn Tyr Val Pro Phe Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro

130 135 140

Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser

145 150 155 160

Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala

210 215 220

His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp

225 230 235 240

Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val

245 250 255

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr

260 265 270

Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu

275 280 285

Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln

290 295 300

Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser

305 310 315 320

Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys

325 330 335

Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

340 345 350

Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro

355 360 365

Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met

370 375 380

Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn

385 390 395 400

Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr

405 410 415

Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn

420 425 430

Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu

435 440 445

His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 2

<211> 238

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser

35 40 45

Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Asp Glu Glu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly

165 170 175

Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp

195 200 205

Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr

210 215 220

Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210> 3

<211> 1392

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

atggctgtcc tggcactgct cctctgcctg gtgacattcc caagctgtgt cctgtcccag 60

gtgcagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcaca 120

tgcactgtct cagggttctc attaaccacc tatggtgtaa gctgggttcg ccagcctcca 180

ggaaagggtc tggagtggct gggagtaata tggggtgacg ggaacacaaa ttatcattca 240

gctctcatat ccagactgag catcagcaag gataactcca agagccaagt tttcttaaaa 300

ctgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc acgtactact gtgccaaagg aggaccctat 360

ggtaactacg tgccctttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc 420

aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc 480

atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg 540

aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc 600

tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc 660

tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat 720

tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc 780

ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta 840

gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg 900

cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt 960

gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac 1020

agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag 1080

gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt 1140

ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat 1200

gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac 1260

ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc 1320

tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct 1380

cctggtaaat ga 1392

<210> 4

<211> 717

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120

atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac 180

cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 240

gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 300

cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcagc agagtgatga ggagcctccg 360

acgttcggtg gaggcaccaa cctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420

atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480

aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540

aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600

agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660

actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttag 717

Claims

1.一种抗ANGPTL3单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的重链氨基酸序列为SEQID:No 1；轻链氨基酸序列为SEQ ID:No 2。

2.根据权利要求1所述的一种抗ANGPTL3单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的重链DNA序列为SEQ ID:No 3；轻链DNA序列为SEQ ID:No 4。

3.一种抗ANGPTL3单克隆抗体在制备治疗肾病综合征药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的一种抗ANGPTL3单克隆抗体在制备治疗肾病综合征药物中的应用，其特征在于：所述抗ANGPTL3单克隆抗体特异性识别ANGPTL3，阻断ANGPTL3的纤维蛋白原样结构域，拮抗ANGPTL3对足细胞的损伤。