CN116064371A - 犏牛肾细胞系及其应用 - Google Patents

犏牛肾细胞系及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116064371A
CN116064371A CN202211031159.0A CN202211031159A CN116064371A CN 116064371 A CN116064371 A CN 116064371A CN 202211031159 A CN202211031159 A CN 202211031159A CN 116064371 A CN116064371 A CN 116064371A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
dzo
nbls
kidney
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211031159.0A
Other languages
English (en)
Inventor
乔自林
李铀
刘文凯
王家敏
刘振斌
孙娜
马忠仁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwest Minzu University
Original Assignee
Northwest Minzu University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwest Minzu University filed Critical Northwest Minzu University
Priority to CN202211031159.0A priority Critical patent/CN116064371A/zh
Publication of CN116064371A publication Critical patent/CN116064371A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/25—Urinary tract cells, renal cells
    • C12N2502/256—Renal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/91—Cell lines ; Processes using cell lines
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明犏牛肾细胞系NBLS，保藏编号为CCTCC NO：C2022197。本发明还提供其在培养BVDV病毒中的应用。本发明成功的将SV40‑LT基因导入原代犏牛肾细胞中，激活了其端粒酶活性，延长了细胞在体外培养的寿命。本发明通过试验发现，本发明的犏牛肾细胞系NBLS可以连续传代50代以上，且生长增殖特性保持不变，获得了永生化细胞系。该F50代犏牛肾细胞系NBLS对BVDV病毒较为敏感，可以高效增殖BVDV病毒。用该细胞系所增殖的病毒滴度与原代犏牛肾细胞相比敏感度提高，降低了生产成本。因此，本发明的提出对BVDV疫苗的规模化生产提供了新的技术手段。

Description

犏牛肾细胞系及其应用
技术领域
本发明属于细胞工程技术领域，涉及犏牛肾细胞系，具体涉及犏牛肾上皮永生化细胞系NBLS及其应用。
背景技术
犏牛(BosCattle-yak)是牦牛与黄牛(BosTaurus)杂交的种间F1代杂种。杂交后的公犏牛和母犏牛都展现了很好的杂交优势。犏牛在体格、肉用、产奶、适应性、生产、抗病和繁殖等方面都具有明显的优势，并且能够适应恶劣的天气环境。在当地，主要是以公黄牛和母牦牛杂交产生。其中，杂交后代的公犏牛主要用于育肥产肉，杂交后代母犏牛主要用于产奶，但其产奶量和产肉量带来的经济效益并不理想。
目前已发现和建立了多种传代细胞系，如MDCK细胞和VERO细胞，且这些细胞系已应用于疫苗生产，但其来源于国外科研机构。
细胞培养是指在体外仿照体内的环境，使细胞生存、生长、分裂并保持原有结构和功能的一种方法。通过该技术，一个细胞可以通过培养转为单细胞或多细胞团，因此细胞培养也被称为细胞克隆技术，或细胞培养技术。该技术不仅可培养大量细胞，也可应用于信号转导、合成代谢及生长增殖等方面研究。同时，细胞培养技术对生物医药及其相关领域作出了巨大贡献。例如，近年来基础医学的进步在很大程度上依赖于细胞培养技术。此外，在生物医药等领域发展了以细胞培养为基础的实用技术，涉及疫苗生产，毒性评估以及辅助生殖等方面。因此，细胞培养不仅是细胞生物学中的重要技术，对于整个生物工程及生物医药领域，都能发挥重要作用。
建立稳定的细胞系的关键是维持原代细胞的正常功能，同时最大限度地促进细胞本身的增殖作用。细胞永生化是指动物细胞脱分化失败，受到病毒感染，外源基因转染，辐射等作用后，细胞分裂次数限制机制和DNA检测凋亡机制失灵，导致细胞具有无限分裂生长能力的过程。永生化细胞则与传代细胞系大致相同，不仅有无限的增殖能力，且具有与原代细胞相同的生物学特性。依据《中华人民共和国药典》永生化细胞系标准，将能稳定传代F50次以上的细胞称为永生化细胞。迄今为止，已发现以下几种方法可以实现细胞永生化，包括猿猴病毒40(simianvacuolatingvirus40，SV40)大T抗原(largeTantigen， LT)的转染、人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)E6/E7蛋白的介导、人端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase，hTERT)的过度表达，以及自发、辐照与外界刺激等。
SV40全称为猿猴病毒40，由VP1、VP2、VP3、LT和小T抗原(smallTantigen，ST) 构成。LT抗原通过与Rb-E2F信号通路口袋位点复合物结合从而激活E2F介导的转录，还可与Rb蛋白通过LxCxE基序和J结构域以ATP依赖的方式结合。其中ATP酶结构域又可与p53蛋白结合促进细胞转化。因此LT可通过pRB和p53共同调节使细胞永生化。研究表明LT与p300/CBP组蛋白乙酰转移酶结合后可作用于p53，并导致细胞永生化。ST 具有多种致癌特性，可与LT协同作用共同诱导细胞的完全转化，起到稳定作用。由于SV40 的表达会因为p53的缺失造成基因组的不稳定，为避免这个问题，使用piggyBac转座子切除选择性标记基因可使细胞恢复原代状态，也可使用SV40的tsA58温度敏感突变体通过温度调节消除SV40-LT的表达。最新研究表明，小鼠足细胞通过γ-干扰素驱动形式进行条件性永生化，在高于37.5℃条件下需要大约14天才能完全失去SV40-LT抗原的活性。
BVDV(牛病毒性腹泻病毒)病毒是牛产业的主要常见病毒威胁之一。目前研究人员已经从分子生物学、发病机制、免疫应答和防治措施等方面对BVDV进行了大量研究。疫苗的使用有助于控制和清除BVDV感染，是预防临床疾病和胎儿感染有效途径的。但 BVDV新变种和毒株的不断出现会对诊断分析及疫苗效价评估造成一定阻碍，因此高效价新型细胞基质的使用对BVDV疫苗生产及技术升级是十分关键的。目前BVDV疫苗所采用的培养细胞为MDBK细胞，但是病毒滴度较低。
在中国，关于犏牛的研究较少，且集中于饲养、皮毛应用等方面，并无更大应用价值。关于犏牛肾细胞的研究则寥寥无几，更未有犏牛肾细胞永生化方面的相关研究。制备BVDV疫苗程序复杂，病毒滴度较低，对疫苗厂规模化生产BVDV疫苗带来不便，企业也难以获得丰厚的利润。同时，MDBK细胞是由国外科研机构引入。因此，研发一种适于BVDV疫苗生产的传代细胞系，对疫苗企业具有非常重要的现实意义。
为进一步开发犏牛的可利用价值，同时考虑到目前应用于疫苗生产的细胞基质(如 MDCK细胞和VERO细胞)均为肾脏细胞，本研究采用慢病毒转染方式，进行永生化细胞系的构建与评价。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，且原代犏牛肾细胞在体外培养的时间十分有限，从而阻碍了对细胞的生长、分化及代谢作用机制的研究，故需要一个能够在体外长期培养适合各种不同实验研究目的的细胞模型。本申请人将尝试建立我国自主传代细胞系，为基础研究领域做出自己的贡献。
本申请发明人采用SV40-LT基因导入法，将编码SV40-LT的病毒液导入有限传代犏牛肾细胞中，获得犏牛肾细胞系NBLS。然后对犏牛肾细胞系进行永生化改造，发现传代至50代时，F50代细胞系NBLS与传代细胞系大致相同，不仅有无限的增殖能力，且具有与原代细胞相同的生物学特性，即获得了犏牛肾永生化细胞系。实验还发现F50代犏牛肾细胞系NBLS能够高效增殖BVDV病毒。故将传代至F50代的犏牛肾细胞系NBLS于 2022年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCCNO：C2022197。
本发明还提供犏牛肾细胞系NBLS在培养BVDV病毒中的应用。
本发明还提供一种培养BVDV病毒的方法，在BVDV病毒液中加入培养基，然后将其加入到含细胞的容器中进行培养；所述细胞为上述的犏牛肾细胞系NBLSCCTCCNO：C2022197。
作为优选，所述培养基配方为：含体积百分比2％胎牛血清的DMEM培养基。
作为优选，所述培养条件为：36±1℃下培养24-48h。
本发明的有益效果是：本发明成功的将SV40-LT基因导入原代犏牛肾细胞中，激活了其端粒酶活性，延长了细胞在体外培养的寿命。
本发明通过试验发现，本发明的犏牛肾细胞系NBLS可以连续传代50代以上，且生长增殖特性保持不变，即获得了犏牛肾细胞永生化细胞系NBLS。该F50代犏牛肾细胞系NBLS对BVDV病毒较为敏感，可以高效增殖BVDV病毒。用该细胞系所增殖的病毒滴度与原代犏牛肾细胞相比敏感度提高，降低了生产成本。因此，本发明的提出对BVDV疫苗的规模化生产提供了新的技术手段。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为犏牛肾细胞形态学观察。其中，A：明场视野×40；B：明场视野×100。
图2为犏牛肾细胞的嘌呤霉素最低筛选浓度。其中，A：7d，0ug/ml；B：7d，1ug/ml；C：7d，2ug/ml。
图3为犏牛肾细胞慢病毒的MOI值筛选。其中，A-F图依次表示：A：MOI＝30；B： MOI＝50；C：MOI＝80；D：MOI＝100；E：MOI＝120；F：MOI＝150。
图4为SV40-LT转染荧光图片。其中，A图为NBLS明场照片×100，B图为NBLS- 绿色荧光×100。
图5为NBLS细胞形态分析。
图6为NBLS细胞中基因稳定性分析。其中A图：细胞中SV40-LT基因水平情况；B 图：SV40-LT的WB图谱比对；C图：细胞中蛋白水平情况；D图：NBLS细胞中的SV40-LT 免疫荧光。
图7为细胞生长特性分析。其中，A图：细胞生长曲线；B图：细胞周期检测；C图：细胞凋亡检测。
图8为细胞遗传特性分析。其中，A图：细胞核型分析；B图：细胞波形蛋白分析； C图：细胞角蛋白-18分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明中，如无特别说明，所使用的培养基均为：含体积百分比10％胎牛血清的完全培养基(10％胎牛血清+DMEM)。
实施例1
1犏牛肾细胞系NBLS的建立
1.1犏牛肾细胞的复苏及传代培养
为避免造成原代细胞的过度使用和浪费，本发明选用种质资源库中的F2代犏牛肾细胞，并对其进行复苏、传代、扩增及冻存，以保证后续实验的顺利进行。
从液氮中取3支F2代犏牛肾上皮细胞，迅速置于37℃水浴中解冻细胞。细胞解冻后，吸出细胞悬液，接种至T-25细胞培养方瓶中，加入含10％胎牛血清的完全培养基(胎牛血清+DMEM)，培养体积为5ml。将细胞置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养6h，更换新的完全培养液，降低细胞冻存液中二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)对细胞的损伤，继续培养，拍照记录生长状态。
观察F2代犏牛肾细胞的生长状态，待细胞长至85％以上时，按照1：3的比例进行传代培养：弃去培养液，利用PBS清洗三次，加入2ml0.25％胰蛋白酶，置于细胞培养箱中孵育1min后于显微镜下观察，当细胞分散并皱缩为圆形时，弃去胰蛋白酶，再加入3ml 完全培养液将细胞重悬，按不同比例传至T-25细胞瓶中，培养体积为5ml，置于培养箱中继续培养。待F3代犏牛肾细胞密度达85％以上时，进行细胞清洗及消化，并在镜下观察。之后进行冻存，以备后续使用：将重悬的细胞液按1ml/支分装至冻存管中，按照4℃ 0.5h、-20℃1h、-80℃过夜保存的顺序依次冷冻，最终投入液氮管中保存。
消化后的细胞贴壁生长，并逐渐铺满瓶底，细胞成片生长，细胞间连接紧密，呈梭形单层排布(见图1)。
图1为犏牛肾细胞形态学观察(A：明场视野×40；B：明场视野×100)。
1.2犏牛肾细胞的嘌呤霉素筛选
为了后续阳性细胞筛选，需要筛选出犏牛肾细胞的嘌呤霉素最低致死浓度以供后续实验参考。具体实验过程如下：
复苏F3代犏牛肾细胞，以1×104个/孔的密度接种在细胞培养板中，当细胞长至50％-60％时进行实验。将嘌呤霉素在0ug/ml-10ug/ml范围，按每1ug/ml为一个梯度，用培养液配置成不同的筛选浓度。每2d更换一次筛选培养液，4-7d所有细胞都死亡时的浓度即为嘌呤霉素的最低致死浓度。
嘌呤霉素筛选结果显示，2ug/ml浓度组及更大浓度组的细胞在第7d细胞全部死亡，即2ug/ml可作为嘌呤霉素最低筛选浓度。
图2为犏牛肾细胞的嘌呤霉素最低筛选浓度(A：7d，0ug/ml；B：7d，1ug/ml；C： 7d，2ug/ml)。
1.3犏牛肾细胞的慢病毒MOI值测定
由于病毒液数量有限，需要对犏牛肾细胞的慢病毒的MOI值进行测定，以供转染使用参考。
实验分为三组：1)M组：慢病毒载体GV367；2)P组：慢病毒载体GV367+HitransG P增强液；3)Control组：空白对照组。将实验组分为6个梯度：MOI＝30，MOI＝50，MOI＝80， MOI＝100，MOI＝120，MOI＝150。
其中，慢病毒载体GV367购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司，含有puro筛选基因和EGFP绿色荧光基因，不含有SV40-LT基因。
HitransGP增强液为慢病毒载体GV367的配套试剂。具体实验过程如下：
复苏F3代犏牛肾细胞，按3×103个/孔的密度接种到96孔板中，继续培养约24h。待细胞生长密度为80％-90％时，分别加入各梯度的实验组，进行慢病毒感染预实验。感染约72小时后，观察到荧光表达丰度较高时，感染效率50％左右，且细胞生长良好的组所对应的感染条件和MOI值可以作为后续正式感染实验的依据。
慢病毒空载感染F3代犏牛肾细胞72h后，观察到P组的细胞荧光效率随着MOI值增加先增强后降低。MOI＝100时细胞荧光丰度较高。当MOI超过100时，细胞荧光率开始降低。当MOI＝100时，荧光丰度较高，可满足后续功能检测标准，因而选用MOI＝100的慢病毒进行后续实验(具体结果见图3和表1)。
图3为犏牛肾细胞慢病毒的MOI值筛选。其中，A-F图为P组的实验数据，依次表示：A：MOI＝30；B：MOI＝50；C：MOI＝80；D：MOI＝100；E：MOI＝120；F： MOI＝150。
表1犏牛肾细胞慢病毒载体MOI值筛选
Figure BDA0003817459340000061
1.4SV40-LT病毒转染
采用慢病毒的转染方法将SV40-LT基因转入至犏牛肾细胞中，即将SV40-LT基因构建至慢病毒载体GV367上，得到SV40-LT-慢病毒，然后利用SV40-LT-慢病毒包装液进行转染。参考使用步骤1.3慢病毒感染预实验中确定的最佳感染MOI条件进行正式感染实验。SV40-LT-慢病毒包装液的转染：复苏F3代犏牛肾细胞，以1×104个/孔接种于细胞培养板中。待细胞生长至60％汇合度时进行慢病毒转染实验。根据细胞MOI及病毒滴度，加入SV40-LT-慢病毒以及HitransGP增强液。计算公式：病毒体积＝(MOI×细胞数目)/病毒滴度。37℃培养12h，更换为完全培养基，继续培养。
目标基因SV40-LT基因序列如下：
Figure BDA0003817459340000071
Figure BDA0003817459340000081
为了确定72h后NBLS细胞是否成功转染，在荧光显微镜下拍照并进行imageJ分析，观察细胞是否有荧光出现，结果见图4和表2。
图4为SV40-LT-慢病毒转染荧光图片。其中，A图为NBLS明场照片×100，B图为NBLS-绿色荧光×100。
表2慢病毒方式转染SV40-LT72h后的荧光imageJ分析
Figure BDA0003817459340000082
转染SV40-LT-慢病毒后，对24h、48h、72h的细胞进行观察，结果显示，细胞转染72h后荧光强度与荧光率均较高，可以进行后续评价实验。为方便描述将SV40-LT-慢病毒转染后的细胞统称为NBLS。
1.5阳性细胞筛选
为了筛选出荧光强度高以及转染效率高的NBLS细胞，对转染72h后的NBLS细胞进行筛选。
用含2ug/ml嘌呤霉素的培养基筛选NBLS细胞。每2d天更换一次筛选培养基，观察细胞的死亡情况。当对照细胞完全死亡时，再次用含2ug/ml嘌呤霉素的培养基筛选NBLS 细胞。等细胞达到90％以上汇合率时将细胞转移至培养瓶中继续培养。
对SV40-LT慢病毒转染的犏牛肾细胞经2ug/ml嘌呤霉素筛选得到抗嘌呤霉素阳性细胞克隆，从抗嘌呤霉素阳性细胞克隆中提取RNA，利用qPCR方法检测发现，抗嘌呤霉素阳性细胞均表达了SV40-LT基因。表明SV40-LT基因成功的转入犏牛肾原代细胞中，并得到有效表达。将该筛选得到的抗嘌呤霉素阳性细胞命名为犏牛肾细胞系NBLS，然后进行传代，分别对不同代次细胞的性能进行分析，发现传代至50代时，F50代犏牛肾细胞系NBLS能够高效增殖BVDV病毒。故将传代至F50代的犏牛肾细胞系NBLS于2022 年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路 299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCCNO：C2022197。
2犏牛肾细胞系NBLS的分析
2.1形态学分析
对NBLS细胞进行传代培养，每隔5代观察细胞荧光并冻存，每隔10代从5个方面进行生物学特性检测。
为比较细胞在转染前后形态差异，将F3代犏牛肾细胞、F3、F10、F20、F30、F40、 F50代的NBLS细胞分别接种至六孔板中，待生长密度达到70％～80％左右，在倒置显微镜下观察细胞形态特征。结果见图5。
图5为NBLS细胞形态分析。
对F3代犏牛肾细胞，F3、F10、F20、F30、F40、F50代的NBLS细胞观察发现，细胞呈梭形，形态完整，传代后细胞贴壁生长，并逐渐铺满瓶底。F3、F10、F20、F30、F40、 F50代的NBLS细胞随着代次增高，形态逐渐拉长，体积缩小，呈现多层排布。
2.2基因稳定性分析
以F3代犏牛肾细胞为对照，利用qPCR、WesternBlot及免疫荧光三种方法对F3、F10、 F20、F30、F40、F50代的NBLS细胞中的基因及蛋白水平进行检测。
2.2.1 qPCR分析鉴定
(1)RNA提取
使用TRIzolReagent试剂提取细胞中的总RNA。将冻存在液氮中的F3代犏牛肾细胞， F3、F10、F20、F30、F40、F50代NBLS细胞进行复苏，接种于T25细胞瓶中，待细胞长至80％-90％，具有良好的形态与生长状态时提取细胞中的cDNA。
(2)引物设计
根据GenBank中犏牛肾细胞的hTERT基因、SV40-LT基因以及内参肌动蛋白-β(Actin Beta，ACTB)序列，在核酸序列保守区内，应用Primer5和Oligo6设计分析适合qPCR的引物，并在NCBIBlast检测引物特异性。
(3)去除基因组DNA及反转录
按照反转录试剂盒说明进行DNA的去除及cDNA的合成。
(4)逆转录反应
利用DEPC水将引物稀释至10nmol，设置对照孔，按照比例进行配置，上机进行qPCR实验。
使用qPCR方法鉴定NBLS细胞中SV40-LT的基因水平，结果显示：NBLS细胞中 SV40-LT基因mRNA相对水平随着代次增加不断升高，而F3代的犏牛肾细胞的SV40-LT 基因mRNA水平几乎为零(图6-A)。
2.2.2WesternBlot鉴定
复苏F3代犏牛肾细胞、F3、F10、F20、F30、F40、F50代NBLS细胞，接种于T25 细胞瓶中，当细胞生长密度约为80％-90％时，按照以下步骤进行SV40-LT的WesternBlot 实验：(1)蛋白样品制备(2)蛋白含量的测定(3)SDS-PAGE电泳(4)显影检测。
使用WesternBlot方法鉴定NBLS细胞中SV40-LT在细胞中的蛋白定量，结果显示：NBLS细胞中SV40-LT蛋白有表达，表达量较高，与犏牛肾细胞相比表达差异显著 (P<＝0.05)，但F3代到F50代不同代次之间SV40-LT表达差异不显著(P>0.05)(图 6-B、图6-C)。
2.2.3免疫荧光鉴定
将细胞爬片置于12孔板中，复苏F3代犏牛肾细胞、F3、F10、F20、F30、F40、F50 代NBLS细胞，以5×103个/孔进行接种，当细胞生长密度约为80％-90％时，按照以下步骤进行SV40-LT的免疫荧光检测：1)加入4％多聚甲醛室温固定30min；2)吸去固定液，加入1ml0.1％Triton-100，通透15min；3)加入健康胎羊血清，37℃室温封闭30min；
4)弃去封闭液，加入SV40-LT一抗，4℃孵育过夜；5)加入FITC标记羊抗兔IgG二抗，37℃避光孵育2h；5)加入2mlDAPI原液避光染色4min；6)滴加抗荧光碎灭剂，甘油封片，将爬片封在载玻片上避光保存，在激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
使用免疫荧光方法鉴定NBLS细胞中SV40-LT在细胞中的定位情况(外源基因在细胞质中表达，以红色荧光呈现；外源基因未表达于细胞核中，以蓝色荧光呈现)，结果显示：细胞质因SV40-LT表达蛋白被染为红色，细胞核内并未表达因而被染为蓝色(图6-D)。
图6为NBLS细胞中基因稳定性分析。其中A图：细胞中SV40-LT基因水平情况；B 图：SV40-LT的WB图谱比对；C图：细胞中蛋白水平情况；D图：NBLS细胞中的SV40-LT 免疫荧光。
2.3生长特性分析
2.3.1细胞活率测定
为了检测活细胞的活力状态和数量，使用细胞计数仪对复苏F3代犏牛肾细胞、F3、F10、F20、F30、F40、F50代的NBLS细胞，进行细胞活率测定。吸取细胞悬液滴入，使计数板充满细胞悬液，放入计数仪中测定。
结果显示：F3代犏牛肾细胞的平均活率高于90％以上，倍增时间约为27h。F3、F10、F20、F30、F40及F50代的NBLS细胞的平均活率与最低活率均高于90％。详见表2。
表2细胞活率、倍增时间测定
Figure BDA0003817459340000111
2.3.2细胞生长曲线测定及倍增时间测定
复苏F3代犏牛肾细胞、F3、F10、F20、F30、F40、F50代NBLS细胞，以1×104个 /孔进行接种。每日收集消化细胞，1000r离心5min，弃上清，制备单细胞悬液。吹打均匀后对细胞进行计数，做三个复孔，计算3孔培养细胞数的平均值。连续12天按上述方法消化细胞算平均值。以培养时间作为横坐标、细胞数为纵坐标，绘制细胞生长曲线。细胞群体倍增时间按照以下公式计算：PDT＝t×lg2lgNt-lgN0。式中，t代表培养时间，N0代表首次计数获得的细胞数，Nt代表培养t时间后的细胞计数。
通过测定生长曲线分析细胞的生长趋势，结果显示：F3代的犏牛肾细胞在第1d到第 3d细胞增殖缓慢，从第3d开始细胞进入对数生长期，到第5d时到达平缓期，但细胞数目未下降。F3、F10、F20、F30、F40、F50代的NBLS细胞均在第1d到第3d细胞增殖缓慢，从第3d开始细胞进入对数生长期，到第8d时到达最高值，然后进入平台期，在第 9d降低(图7-A)。
2.3.3细胞周期测定
复苏F3代犏牛肾细胞，F3、F10、F20、F30、F40、F50代的NBLS细胞，待生长密度达到70％～80％左右，进行细胞周期的测定。
通过流式细胞周期检测细胞经过一次完整分裂所需时间，结果显示：F3代犏牛肾细胞S期与G1期均为40％左右，G2期为11.78％。F3代到F50代NBLS细胞的G1与S期均超过40％，与犏牛肾细胞结果相似，无显著差异(P>0.05)(图7-B)。
2.3.4细胞凋亡测定
复苏F3代犏牛肾细胞、F3、F10、F20、F30、F40、F50代的NBLS细胞，待生长密度达到70％～80％左右，进行细胞凋亡的测定。
通过流式细胞凋亡检测细胞活细胞、死亡细胞及凋亡细胞占比，结果显示：F3代犏牛肾细胞的凋亡率低于2％，活细胞率则高于95％；F3代到F50代的NBLS细胞的凋亡率均低于2％，活细胞率均高于95％，与犏牛肾细胞结果相似，并无显著差异(P>0.05)(图 7-C)。
图7为细胞生长特性分析。其中，A图：细胞生长曲线；B图：细胞周期检测；C图：细胞凋亡检测。
2.4遗传特性分析
2.4.1核型分析测定
复苏F3代犏牛肾细胞，F3、F10、F20、F30、F40、F50代的NBLS细胞接种至6孔培养板，待生长密度达到70％-80％左右。按照以下步骤进行操作：1)每孔加入0.1ug/ml 的秋水仙素处理6h，消化后用预热过的0.075mol/l氯化钾吹打重悬，放入37℃静置 30min；2)弃去氯化钾，加入400ul固定液，1500rpm离心5min；3)保留1ml上清液再次离心，重复上述过程；4)重悬细胞后，将玻片从水浴中拿出，吸取重悬液从50cm高处滴下，风干30min；5)待玻片晾干后，使用10％的Giemsa染液染色20min，蒸馏水冲洗，封片后显微镜下观察。
使用核型分析方法鉴定细胞中染色体数目和形态的突变情况，结果显示：F3、F10、F20、F30、F40、F50代的NBLS细胞的染色体大多为2n＝60条，与犏牛肾细胞染色体数目大致相同(图8-A)。
2.4.2免疫荧光测定
将细胞爬片置于12孔板中，复苏F3代犏牛肾细胞，F3、F10、F20、F30、F40、F50 代的NBLS细胞按照5×103个/孔进行接种，待生长密度达到70％-80％左右，进行实验，其中一抗为细胞角蛋白-18与波形蛋白，利用胎羊血清封闭，二抗为FITC标记的羊抗兔 IgG。
使用免疫荧光方法鉴定细胞中角蛋白-18与波形蛋白在细胞中的表达情况，结果显示： F3-F50代NBLS细胞的细胞角蛋白-18均有表达，并表达在细胞质中，以红色荧光呈现，而波形蛋白并未表达，以蓝色荧光呈现，NBLS细胞的结果与犏牛肾细胞一致(图8-B、图8-C)。
图8为细胞遗传特性分析。其中，A图：细胞核型分析；B图：细胞波形蛋白分析； C图：细胞角蛋白-18分析。
2.5功能验证
2.5.1 BVDV病毒扩增
复苏F3代犏牛肾细胞接种于T25细胞瓶中，待犏牛肾细胞的汇合度生长到80％时，在无菌条件下弃去细胞培养基，使用2ml无菌PBS清洗三次，加入4.5ml的含有2％胎牛血清的DMEM培养基，再加入0.5ml的BVDV病毒原液，将细胞瓶放于36℃的CO2恒温箱培养。每日观察细胞的状态。待细胞全部死亡后，在接种病毒后的第5d，将接毒后的细胞瓶放于-80℃冰箱，反复冻融3次。收集冻融后的病毒培养液，12000rpm离心10min，收集上清液，再进一步使用0.22um滤膜进行过滤处理，分装至离心管中，放于-80℃冰箱中保存。
2.5.2 TCID50实验
复苏F3代犏牛肾细胞与F50代犏牛肾细胞系NBLSCCTCCNO：C2022197接种于 96孔板中37℃培养24h，待细胞生成单层后备用。待细胞长满时，将步骤2.5.1所收集的 BVDV病毒液用含体积百分比2％胎牛血清的DMEM培养基作为稀释液进行10倍倍比稀释，先将稀释液分装于10个试管中，每管0.9ml，取0.1ml病毒悬液加入第一管中，摇匀后为10-1，换一支吸管，在10-1病毒液中吸放3～4次，取0.1ml放入第二管中摇匀，如此稀释至10-10。吸去原有培养液，取已稀释好的病毒液接种于细胞中：每孔加入100ul病毒液，并以不加病毒液的F3代犏牛肾细胞作为病毒对照。置37℃培养，24h、48h、72h、 96h后观察结果，观察时先看正常细胞对照，然后看试验组细胞。根据Reed-Muench公式进行计算并绘制图表：TCID50＝50％感染的高临界稀释度倒数的对数+距离比×稀释系数的对数。式中：距离比＝(50％的临界感染率-50％)/(50％的临界感染率-50％的低临界感染率)；
使用TCID50实验检测细胞的半数感染量及感染效率，结果显示：lgTCID50(F3牛肾上皮细胞)＝10-5.62/0.1ml，lgTCID50(F50NBLS细胞)＝10-6.59/0.1ml，具体见表3。
表3 TCID50测定结果统计
Figure BDA0003817459340000131
Figure BDA0003817459340000141
综上所述，本发明将SV40-LT基因成功导入细胞基因组中，SV40-LT可使得细胞的端粒酶被激活，阻止端粒缩短并保持稳定长度，最终使细胞实现永生化，成功构建犏牛肾细胞系NBLSCCTCCNO：C2022197。犏牛肾细胞系NBLSCCTCCNO：C2022197仍保持其父本细胞(原代犏牛肾细胞)正常的生物学特性，且可以高效增殖BVDV病毒。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.犏牛肾细胞系NBLS，保藏编号为CCTCCNO：C2022197。
2.根据权利要求1所述的犏牛肾细胞系NBLS，其特征在于：所述犏牛肾细胞系NBLS为永生化细胞系。
3.根据权利要求1所述的犏牛肾细胞系NBLS，其特征在于：是将SV40-LT基因导入犏牛肾上皮细胞中得到的。
4.权利要求1-3任一项所述的犏牛肾细胞系NBLS在培养BVDV病毒中的应用。
5.一种培养BVDV病毒的方法，其特征在于：在BVDV病毒液中加入培养基，然后将其加入到含细胞的容器中进行培养；所述细胞为权利要求1-3任一项所述的犏牛肾细胞系NBLSCCTCCNO：C2022197。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述培养基配方为：含体积百分比2％胎牛血清的DMEM培养基。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述培养条件为：36±1℃下培养24-48h。
CN202211031159.0A 2022-08-26 2022-08-26 犏牛肾细胞系及其应用 Pending CN116064371A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211031159.0A CN116064371A (zh) 2022-08-26 2022-08-26 犏牛肾细胞系及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211031159.0A CN116064371A (zh) 2022-08-26 2022-08-26 犏牛肾细胞系及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116064371A true CN116064371A (zh) 2023-05-05

Family

ID=86175769

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211031159.0A Pending CN116064371A (zh) 2022-08-26 2022-08-26 犏牛肾细胞系及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116064371A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116590345A (zh) * 2023-05-06 2023-08-15 北京中医药大学 永生化小鼠足细胞系及其制备方法、分化方法和应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116590345A (zh) * 2023-05-06 2023-08-15 北京中医药大学 永生化小鼠足细胞系及其制备方法、分化方法和应用
CN116590345B (zh) * 2023-05-06 2024-01-30 北京中医药大学 永生化小鼠足细胞系及其制备方法、分化方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
You et al. Culture and differentiation of mouse tracheal epithelial cells
CN113025574B (zh) 一种大口黑鲈脑细胞系及其应用
CN112574946B (zh) 一种原代分离培养土狗多个组织来源的成纤维细胞及其永生化的构建方法
CN110241071B (zh) 一种人正常肾小管原代细胞及其体外分离培养和应用
CN116064371A (zh) 犏牛肾细胞系及其应用
Wang et al. Establishment and characterization of fibroblast cell lines from the skin of the Yangtze finless porpoise
Ashraf et al. Propagation of rhinovirus-C strains in human airway epithelial cells differentiated at air-liquid interface
CN104974977B (zh) 一种鞍带石斑鱼肾组织细胞系及其构建方法
CN111411073A (zh) 一种海鲈仔鱼细胞系的构建方法
US20230167413A1 (en) Isolation and functional analysis of epithelial progenitor cells from the human lung
CN109706181B (zh) 一种构建永生化猪肝星状细胞系的方法、永生化猪肝星状细胞系和应用
WO2019140900A1 (zh) 一种永生化的尿液来源细胞株及其构建方法
CN110527661B (zh) 一种剑尾鱼仔鱼细胞系及其构建方法和应用
Brockman-Schneider et al. Serial culture of murine primary airway epithelial cells and ex vivo replication of human rhinoviruses
JP6463029B2 (ja) ヒト間葉系幹細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体並びにこれを用いたヒト間葉系幹細胞の分離及び／または品質評価を行う方法
Ezaz et al. A simple non-invasive protocol to establish primary cell lines from tail and toe explants for cytogenetic studies in Australian dragon lizards (Squamata: Agamidae)
CN114058566B (zh) 一种鳜皮肤细胞系及其应用
Bai et al. Establishment and biological research of the Jining Grey goat fibroblast line
CN114874974A (zh) 一种斜带石斑鱼肠道细胞系ecgi-21及其用途
CN112280740A (zh) 一株稀有鮈鲫脑细胞系及其应用
Sun et al. Analysis of growth properties and cell cycle regulation using mouse embryonic fibroblast cells
CN105483087A (zh) 一种人支气管上皮细胞株hbe-tt
CN109680000A (zh) 利用树鼩骨髓间充干细胞建立hcv细胞模型的方法
CN115161285B (zh) 一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系及其构建方法和应用
RU2343194C2 (ru) Линия диплоидных клеток фибробластов легкого эмбриона человека для выделения, идентификации вирусов и получения диагностических и вакцинных препаратов

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination