CN116271055A - 一种用于改善和/或治疗糖尿病肾病足细胞损伤的组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于改善和/或治疗糖尿病肾病足细胞损伤的组合物及其应用，涉及医药领域。通过高糖诱导足细胞损伤细胞模型实验，评价Ang‑(1‑7)、BK受体拮抗剂单独使用及其联合使用对高糖诱导足细胞损伤的影响，发现Ang‑(1‑7)和BK受体拮抗剂及其联合给药对高糖诱导的足细胞凋亡具有良好的保护效果，且联合给药具有协同保护效应，直观地验证了Ang‑(1‑7)+BK受体拮抗剂对高糖诱导的足细胞损伤具有改善和/或治疗作用，能够用于制备治疗糖尿病肾病的药物。相较于现有技术其他治疗药物，本发明提供的药物组合靶向作用于足细胞，减轻足细胞损伤，促进足细胞修复，为糖尿病肾病的高效治疗提供新的方案。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种用于改善和/或治疗糖尿病肾病足细胞损伤的组合物及其应用。
背景技术
糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)最常见的微血管并发症，也是终末期肾脏病(ESRD)的最主要病因，给公众健康带来沉重的经济负担。由于致病机制尚不明确，识别介导糖尿病肾病的新致病因素及其作用相应的信号通路对开发新的治疗方法、改善预后极其重要。越来越多的证据表明，足细胞损伤，包括足细胞结构和功能异常，在蛋白尿的发生和DN的进展中发挥着重要作用。足细胞丢失、凋亡、足突融合、消失与脱落，以及nephrin、podocin、CD2相关蛋白(CD2AP)、Wilms’瘤蛋白-1(WT-1)等足细胞裂孔隔膜(SD)特异性标志物表达下调(足细胞损伤)，导致肾小球滤过屏障(GFB)破坏，最终导致DN蛋白尿和永久性损害。因此，减轻足细胞损伤，促进足细胞修复是糖尿病肾病潜在的治疗策略。
然而，DN足细胞损伤及凋亡的分子调控机制仍不清楚。目前认为，肾素-血管紧张素系统(RAS)是DN肾损伤发病机制中的关键环节，特别是经典的血管紧张素II(Ang II)被认为是RAS的核心，通过血管紧张素原(AGT)、肾素和血管紧张素转换酶(ACE)作用于血管紧张素1型受体(AT1R)。目前，血管紧张素转换酶抑制剂(ACEIs)和血管紧张素II受体阻滞剂(ARBs)用于积极控制血压、减少蛋白尿及其他风险因素，被认为是治疗糖尿病肾病的有效药物并已广泛应用于临床。然而，这些治疗仍不能完全阻止DN的进展，由此提示尚存在其他重要的发病机制及亟待开发新的治疗药物。
血管紧张素-(1-7)(Ang-[1-7])是一种新的RAS组分，通过ACE同系物ACE2作用于特定的G蛋白偶联受体Mas(MasR)，能够发挥拮抗Ang II的作用，是一种天然的Ang II拮抗剂。虽然近年来Ang-(1-7)在糖尿病肾病中的作用逐渐引起学者的重视，然而，有关Ang-(1-7)在糖尿病肾病中以足细胞为作用靶点的研究尚未见研究报道，更未见其与缓激肽受体拮抗剂联合应用、协同治疗糖尿病肾病足细胞损伤的报道。
发明内容
本发明针对现有技术中有效干预糖尿病肾病足细胞损伤的药物缺少问题，目的在于提供了一种用于改善和/或治疗糖尿病肾病足细胞损伤的组合物及其应用，所述组合物包括：血管紧张素-(1-7)或其类似物，以及缓激肽受体拮抗剂，所述组合物对糖尿病引起的肾小球足细胞损伤具有明显保护作用，降低足细胞凋亡率，延缓DN进程，能够用于制备治疗糖尿病肾病的药物。
为解决上述问题，本发明首先提供了一种用于改善和/或治疗糖尿病肾病足细胞损伤的组合物，所述组合物包括：血管紧张素-(1-7)或其类似物，以及缓激肽受体拮抗剂。
优选地，所述的类似物包括AVE 0991AVE 0991、Ala(1)-Angiotensin-(1–7)、环血管紧张素-(1-7)(cyclic Ang-(1-7)，cAng-(1-7))、A1317、环非天然δ-氨基酸ACCA(cyclicnon-naturalδ-amino acid ACCA)、丙氨定(Alamandine)。
优选地，所述的缓激肽受体拮抗剂为作用于缓激肽B1受体和/或缓激肽B2受体的拮抗剂，所述的作用于缓激肽B2受体的拮抗剂包括：HOE140。
本发明另一方面还提供了前面任一项所述的用于改善和/或治疗糖尿病肾病足细胞损伤的组合物在制备治疗糖尿病肾病的药物中的应用。
优选地，所述的药物用于减少糖尿病高糖引起的肾小球足细胞凋亡，达到保护足细胞、治疗糖尿病肾病的用途。
本发明另一方面还提供了一种用于治疗糖尿病肾病的药用组合物，所述的药用组合物包括前面任一项所述的用于改善和/或治疗糖尿病肾病的组合物，以及药学上可接受的载体。
优选地，所述的药用组合物的剂型包括固体剂型、液体剂型和气体剂型。
优选地，所述的固体剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、膜剂、胶剂、膏剂或粉剂。
优选地，所述的液体剂型包括注射液、合剂、口服液、糖浆剂、酒剂、溶胶剂、乳剂。
优选地，所述的气体剂型包括雾化剂、气雾剂、鼻吸入剂。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
1、本发明通过高糖诱导足细胞损伤细胞模型实验，评价Ang-(1-7)、BK受体拮抗剂单独使用及其联合使用对高糖诱导足细胞损伤的影响，发现Ang-(1-7)和BK受体拮抗剂及其联合给药对高糖诱导的足细胞凋亡具有良好的保护效果，且联合给药具有协同保护效应，直观地验证了Ang-(1-7)+BK受体拮抗剂对糖尿病肾病足细胞损伤具有改善和/或治疗作用，能够用于制备治疗糖尿病肾病的药物。
2、相较于现有技术其他治疗药物，本发明提供的药物组合靶向作用于足细胞，减轻足细胞损伤，促进足细胞修复，为糖尿病肾病的高效治疗提供新的方案。
附图说明
图1为使用CCK-8法检测不同浓度的干预试剂Ang-(1-7)、A779[Ang-(1-7)/AT7-MasR拮抗剂]对HG(高糖)刺激的足细胞活性的影响；其中：
a为不同浓度Ang-(1-7)处理结果，选取作用最明显的Ang-(1-7)浓度用于后续实验；
b为选定浓度的Ang-(1-7)(10μM)分别与不同浓度的A779共同处理的结果，选取作用最明显的A779的浓度用于后续实验；
***P<0.001，vs.LG；#P<0.05；##P<0.01，###P<0.001vs.HG；$P<0.05，$$P<0.01，$$$P<0.001vs.HG+Ang-(1-7)；n＝9。
图2为流式细胞术检测LG(低糖)、HG、HG+Ang-(1-7)和HG+Ang-(1-7)+A779组足细胞凋亡结果，其中：
a为各组足细胞的流式细胞图；
b为各组足细胞相对凋亡率的差异对比；
****P<0.0001vs.LG；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001vs.HG；$P<0.05，$$P<0.01，$$$P<0.001vs.HG+Ang-(1-7)；n＝9。
图3为Ang-(1-7)及其拮抗剂A779对HG刺激的足细胞SD特异性标志物nephin、podocin和WT-1mRNA(a-c)及蛋白(d-g)表达的影响，其中：
a为足细胞nephin mRNA表达水平变化；
b为足细胞podocin mRNA表达水平变化；
c为足细胞WT-1mRNA表达水平变化；
d为足细胞nephin、podocin和WT-1蛋白表达水平变化。
e为足细胞nephin蛋白表达变化的相对灰度值；
f为足细胞podocin蛋白表达变化的相对灰度值；
g为足细胞WT-1蛋白表达变化的相对灰度值；
*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs.LG；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001vs.HG；$P<0.05，$$P<0.01，$$$P<0.001vs.HG+Ang-(1-7)；n＝9。
图4为流式细胞术检测LG、HG、HG+Ang-(1-7)、HG+HOE140(BKB2R拮抗剂)、HG+Ang-(1-7)+HOE140、HG+des-Arg(9)-BK(BKB1R激动剂)和HG+Ang-(1-7)+des-Arg(9)-BK组足细胞凋亡结果，其中：
a为各组足细胞的流式细胞图；
b为各组足细胞相对凋亡率的差异对比；
*P<0.05，**P<0.01，***P≤0.001，****P<0.0001。
图5为Western blot检测Ang-(1-7)对HG刺激的足细胞中BK两种受体BKB1R和BKB2R蛋白表达的影响；
*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001vs.LG；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001，####P<0.0001vs.HG；$P<0.05，$$P<0.01，$$$P<0.001vs.HG+Ang-(1-7)。
图6为qRT-PCR检测Ang-(1-7)和BK受体拮抗剂/激动剂对HG刺激的足细胞中AT1R和MasR mRNA表达的影响，其中：
a为足细胞AT1R mRNA表达水平变化；
b为足细胞MasR mRNA表达水平变化；
*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
图7为Western blot分析Ang-(1-7)和BK受体拮抗剂/激动剂对HG刺激的足细胞中MasR、BKB1R、BKB2R和相关信号分子ERK、JNK蛋白表达的影响；
***P<0.001vs.LG；###P<0.001vs.HG；&&P<0.01，&&&P<0.001vs.HG+des-Arg9-BK，⊿⊿⊿⊿P<0.0001。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
专业术语说明
缓激肽：是一种具有心脏保护作用的9肽物质，其受体具有两种，分为缓激肽B1受体(BKB1R)和缓激肽B2受体(BKB2R)。
现有技术已知，RAS新成员Ang-(1-7)与其特异性的Mas受体结合而负性调控传统的RAS通路；缓激肽(BK)可防止DN足细胞丢失；而Ang-(1-7)可增加BK的表达，并在BK的作用下改善糖代谢。本发明申请人经过前期研究证实足细胞上存在Ang-(1-7)的特异性受体MasR，因此推测，Ang-(1-7)与MasR结合，可能上调BK的表达，使BK受体结合增加，从而使游离BK受体减少，进而拮抗AngⅡ-ACE-AT1R轴，减轻足细胞损伤，延缓DN进展。并最终通过实验证实了上述推测。
进一步，本发明申请人联合应用Ang-(1-7)和减少游离BK受体的BK受体拮抗剂，以期达到显著减轻糖尿病引起的肾小球足细胞损伤的作用。
基于上述，本发明申请人经过大量研究和实验，最终首先提供了一种用于改善和/或治疗糖尿病肾病足细胞损伤的组合物，所述组合物包括：血管紧张素-(1-7)或其类似物，以及缓激肽受体拮抗剂。
一些实施例中，所述的类似物为AVE 0991AVE 0991、Ala(1)-Angiotensin-(1–7)、环血管紧张素-(1-7)(cyclic Ang-(1-7)，cAng-(1-7))、A1317、环非天然δ-氨基酸ACCA(cyclic non-naturalδ-amino acid ACCA)、丙氨定(Alamandine)中的任意一种或多种的组合。
一些实施例中，所述的缓激肽受体拮抗剂为作用于缓激肽B1受体的拮抗剂；另一些实施例中，所述的缓激肽受体拮抗剂为作用于缓激肽B2受体的拮抗剂；另一些实施例中，所述的缓激肽受体拮抗剂为作用于缓激肽B1受体和B2受体的拮抗剂。
进一步地，一些实施例中，所述的作用于缓激肽B2受体的拮抗剂包括：HOE140。
本发明另一方面还提供了前面任一项所述的用于改善和/或治疗糖尿病肾病足细胞损伤的组合物在制备治疗糖尿病肾病的药物中的应用。所述的药物用于减少糖尿病引起的肾小球足细胞凋亡，达到治疗糖尿病肾病的用途。
本发明另一方面还提供了一种用于治疗糖尿病肾病的药用组合物，所述的药用组合物包括前面任一项所述的用于改善和/或治疗糖尿病肾病的组合物，以及药学上可接受的载体。
合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。在使用时，是将安全有效量的本发明所述的组合物施用于哺乳动物(如人)。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
一些实施例中，所述的药用组合物的剂型为固体剂型，所述的固体剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、膜剂、胶剂、膏剂或粉剂；另一些实施例中，所述的药用组合物的剂型为液体剂型，所述的液体剂型包括注射液、合剂、口服液、糖浆剂、酒剂、溶胶剂、乳剂；另一些实施例中，所述的药用组合物的剂型为气体剂型，所述的气体剂型包括雾化剂、气雾剂、鼻吸入剂。
本发明通过高糖诱导足细胞损伤的细胞模型实验，评价Ang-(1-7)、BK受体拮抗剂单独使用及其联合使用对高糖诱导足细胞损伤的影响，发现Ang-(1-7)和BK受体拮抗剂及其联合给药对高糖刺激引起的足细胞凋亡具有良好的保护效果，且联合给药具有协同保护效应，直观地验证了Ang-(1-7)+BK受体拮抗剂对糖尿病肾病足细胞损伤具有改善和/或治疗作用，能够用于制备治疗糖尿病肾病的药物。
下面对本发明的实验过程及实验结果进行详细说明，从而详细阐述Ang-(1-7)和缓激肽受体拮抗剂对糖尿病肾病足细胞损伤的改善和/或治疗作用，能够用于制备治疗糖尿病肾病的药物。
(一)实验材料及方法
1、足细胞的细胞培养
培养条件性永生化的小鼠足细胞：将复苏的足细胞(本申请足细胞由复旦大学附属华山医院肾脏内科郝传民教授赠送，且最初源于美国纽约，阿尔伯特·爱因斯坦医学院医学系和解剖与结构生物学系Peter Mundel教授赠送，也可购买商业化成熟的足细胞系，或实验室自提并验证的足细胞)重新悬浮在含有10％胎牛血清(FBS)(购自Gibco BRL)、100U/mL青霉素-链霉素(购自Gibco BRL)和50U/mL重组干扰素-γ(IFNγ，购自SIGMA-Aldrich)的完全RPMI培养基(购自Gibco BRL，美国马里兰州盖瑟斯堡)中，并转移到预包被I型胶原(购自SIGMA-Aldrich)的细胞培养瓶中。然后将足细胞于33℃、5％ CO2饱和湿化培养箱中孵育，以促进增殖。每2～3天更换一次培养基，进行常规消化，同时降低IFN-γ(40U/mL、30U/mL、20U/mL)，直至达到10U/mL。随后，将增殖的足细胞转移至37℃、无IFN-γ条件下培养10～14天，以诱导分化直至分化成熟，倒置相差显微镜下观察足细胞形态和结构，37℃下分化成熟的足细胞用于后续实验。
2、细胞干预处理
分化成熟的足细胞用胰蛋白酶(购自Gibco BRL)消化，并以30％的密度重新接种到96孔板中；用含有10％ FBS、无IFN-γ的RPMI-1640完全培养基在37℃继续培养足细胞5天；随后换成无血清RPMI-1640培养基静止24h，使约106个足细胞同步进入静止期，然后用下列一种或多种组合干预处理：低浓度葡萄糖(5mM，LG)；高浓度葡萄糖(30mM，HG)；Ang-(1-7)(10μM，SIGMA-Aldrich)；A779(10μM，SIGMA-Aldrich)预处理15分钟；HOE140(10μM，SIGMA-Aldrich)；des-Arg(9)-BK(10μM，SIGMA-Aldrich)，每组三个复孔，每个实验重复三次。
其中，A779为Ang-(1-7)特异性受体MasR的拮抗剂。
HOE140为缓激肽B1受体(BKB1R)的拮抗剂。
des-Arg(9)-BK为缓激肽B2受体(BKB2R)的激动剂。
3、细胞活性试验
为了确定不同干预对足细胞活性的影响，使用CCK-8分析法测定了培养的小鼠足细胞的活力。用10μL CCK-8溶液替换96孔板中干预处理过的足细胞的培养基，并将细胞在37℃、含5％ CO2的培养箱中避光培养1小时。然后使用酶标仪(Biotek EPOCH2，美国)在450nm波长下测量吸光度值。从含有细胞的孔的数值中减去仅含有生长培养基的空白孔的吸光度。每组足细胞检测3次，实验重复3次
4、流式细胞术分析
共处理结束后，按照Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)说明书指导，收集足细胞进行凋亡检测：胰蛋白酶消化足细胞后重新悬浮，1500rpm离心5min，弃去上清液；用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤足细胞，并再次1500rpm离心5分钟；然后将足细胞重悬于100μL结合缓冲液(1x)中，于室温避光下用5μL AnnexinV-PE和10μL 7-AAD溶液染色30min。将样本与385μL结合缓冲液(1x)混合，并在2小时内通过流式细胞仪(FACSAriaTMⅢ，BD，美国)进行分析。
5、定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)
使用qRT-PCR评估足细胞上SD标志分子nephrin、podocin和WT-1以及BKB1R、BKB2R、AT1R、MasR的mRNA表达变化。使用TRIzol试剂从接受干预的足细胞中分离出总RNA(15596-018；Invitrogen)，并用紫外分光光度计测定RNA浓度。使用第一链cDNA合成试剂盒(EP 0733；Thermo Scientific，美国)将提取的RNA逆转录成cDNA，并将cDNA于-20℃保存。qRT-PCR在PCR系统(ABI StepOnePlus)中进行，反应体积为20μL(含有2μL cDNA 、1μL ExTaqTM(DRR100A，Takara)，nephrin、podocin、WT-1、BKB1R、BKB2R、AT1R、MasR或甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物，以及10μL SG Fast qPCR Master Mix(B639273，生工生物工程(上海)股份有限公司)。所有引物如下所示：
nephrin：5’-GATGCGGAGTACGAGTGCC-3’(SEQ ID NO：1)和5’-GGGGAACTAGGACGGAGAGG-3’(SEQ ID NO：2)；
podocin：5’-GACCAGAGGAAGGCATCAAGC-3’(SEQ ID NO：3)和5’-GCACAACCTTTATGCAGAACCAG-3’(SEQ ID NO：4)；
WT-1：5’-GAGAGCCAGCCTACCATCC-3’(SEQ ID NO：5)和5’-GGGTCCTCGTGTTTGAAGGAA-3’(SEQ ID NO：6)；
BKB1R：5’-CCCCTCCCAACATCACCTC-3’(SEQ ID NO：7)和5’-GGACAGGACTAAAAGGTTCCCC-3’(SEQ ID NO：8)；
BKB2R：5’-ATGTTCAACGTCACCACACAA-3’(SEQ ID NO：9)和5’-GCTGAGGACAAAGAGGTTCTCC-3’(SEQ ID NO：10)；
AT1R：5’-ATGCTTGGGGCAACTTCACTA-3’(SEQ ID NO：11)和5’-GCAGCAAGAGAAGGGCTTCA-3’(SEQ ID NO：12)；
MasR：5’-AGAAATCCCTTCACGGTCTACA-3’(SEQ ID NO：13)和5’-GTCACCGATAATGTCACGATTGT-3’(SEQ ID NO：14)；
GAPDH：5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’(SEQ ID NO：15)和5’-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3’(SEQ ID NO：16)；
扩增程序：95℃预变性3分钟，1个循环；95℃变性7秒、57℃退火10秒、72℃延伸15秒，40个循环。以GAPDH为内参，利用融峰曲线分析验证扩增产物的特异性。每份生物样本测试三次。
6、Western Blot分析
使用western blotting(WB)法测定足细胞上nephrin、podocin、WT-1、BKB1R、BKB2R、AT1R、MasR及信号分子ERK和JNK的蛋白水平：用预冷的PBS洗涤足细胞两次，然后用含有蛋白酶抑制剂混合物(ST506，SIGMA，美国)和磷酸酶抑制剂(S1873，上海碧云天生物技术有限公司)的RIPA裂解缓冲液(P0013B，上海碧云天生物技术有限公司)在4℃下裂解30min以提取足细胞总蛋白，其间每10min振荡一次；使用25％功率的超声波均质机对每份裂解样本进行超声处理12次，每次1秒；13000rpm、4°C条件下离心10min，并使用BCA蛋白检测试剂盒(P0010，上海碧云天生物技术有限公司)测定蛋白浓度；上清液加入5×蛋白上样缓冲液，100℃变性10min，取等量的蛋白质样本(40g)在10％十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)上；在Tris-缓冲盐水(含Tween-20(TBS-T))中用5％脱脂奶粉封闭30min后，在4℃下将膜用一定浓度的一抗孵育过夜，一抗浓度如下：抗-BKB1R(1：1000，Enzo，美国)、抗-BKB2R(1：500，Santa Cruz，美国)、抗-AT1R(1：250，Santa Cruz，美国)、抗-MasR(1：500，Santa Cruz，美国)、抗-p-MAPK(ERK1/2)(1:5000，Cell Signaling，美国)、抗-MAPK(ERK1/2)(1:5000，Cell Signaling，美国)、抗-p-SAPK/JNK(1:5000，Cell Signaling，美国)、抗-SAPK/JNK(1:5000，CellSignaling，美国)和抗-GAPDH(1:20000，Sigma-Aldrich，美国)作为内参。用TBS-T充分洗涤后，将膜与相应的辣根过氧化物酶结合的二抗(1：5000，博士德，中国武汉)在37℃摇床上孵育2小时。使用增强化学发光(ECL)法(NCI5079，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国)在胶片上曝光。通过Image J软件(NIH，Bethesda，MD，美国)对条带强度进行量化分析。
7、统计方法
每个实验至少重复3次。最终数据以均数±标准差表示，并采用graph pad Prism7.0(graph pad Software Inc.，San Diego，CA，美国)进行分析，组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)或Student-Newman-Keuls(SNK-q)检验。所有P值均为双尾分布，认为P<0.05表示比较组之间具有统计学差异。
(三)实验结果
1、Ang-(1-7)对HG诱导的足细胞活性的影响
参见附图1，CCK-8测定结果显示，与LG相比，HG显著抑制了足细胞活性；加入不同浓度的Ang-(1-7)逐渐减弱了HG对足细胞活性的抑制作用，使得足细胞活性增加，从而达到保护足细胞的作用；且Ang-(1-7)在10μM浓度下对HG诱导足细胞损伤的保护作用最大(图1的a)。随后，用不同浓度的A779预处理HG诱导后的足细胞15分钟，然后与10μM Ang-(1-7)共培养。结果可见：与HG+Ang-(1-7)组相比，HG+Ang-(1-7)+A779组足细胞活性受到抑制。表明A779拮抗了Ang-(1-7)对足细胞的保护作用，从而加重了HG诱导的足细胞损伤。此外，在10μM浓度下，A779对Ang-(1-7)的拮抗作用最大(图1的b)。
参见附图2，流式细胞术检测结果与CCK-8实验结果一致：与LG组相比，HG能显著诱导足细胞凋亡；10μM Ang-(1-7)显著降低了由HG诱导的足细胞凋亡，而A779逆转了Ang-(1-7)的这种效应而导致凋亡率明显增加(图2的a-b)。
2、Ang-(1-7)对HG处理的足细胞中SD标志分子nephrin、podocin和WT-1mRNA及蛋白水平表达的影响
为进一步证实Ang-(1-7)对HG诱导的足细胞损伤的保护作用，本申请对足细胞标志物分子nephrin、podocin和WT-1mRNA及蛋白表达水平进行了检测分析。
如图3所示，qRT-PCR检测结果显示，HG组中足细胞标志物nephrin、podocin和WT-1的mRNA水平显著低于LG对照组，Ang-(1-7)干预在一定程度上增加了足细胞标志物的mRNA表达，但通过A779部分抵消了Ang-(1-7)的保护作用，导致足细胞标志物的mRNA表达显著降低(图3的a-c)。
此外，WB结果与qRT-PCR检测结果一致(图3的d-g)。
3、Ang-(1-7)和BK受体拮抗剂联合应用对HG诱导的足细胞凋亡的保护作用
参见附图4中a-b图，流式细胞检测结果显示，Ang-(1-7)和BKB2R拮抗剂HOE140单独使用时，均可减少HG诱导的足细胞凋亡；当HOE140联合Ang-(1-7)使用时，两者发挥协同效应，能更显著地减少HG诱导的足细胞凋亡。
相反地，加入BKB1R激动剂des-Arg(9)-BK会加重足细胞的凋亡情况，其中HG+Ang-(1-7)+des-Arg(9)-BK组足细胞凋亡率明显高于HG+Ang-(1-7)+HOE140组，提示des-Arg(9)-BK可拮抗Ang-(1-7)/HOE140对足细胞的保护作用，加重高糖诱导的足细胞损伤。
4、Ang-(1-7)和BK受体拮抗剂拮抗HG诱导的足细胞凋亡，从而保护足细胞的机制探究
(1)Ang-(1-7)对HG处理的足细胞中BK受体蛋白表达的影响
如图5所示，相较于LG组，HG组中足细胞上BKB1R蛋白表达量明显升高，Ang-(1-7)的加入显著抑制了HG这一作用，BKB1R蛋白表达显著降低。当接受A779预处理时(HG+Ang-(1-7)+A779组)，BKB1R蛋白表达再次明显高于HG+Ang-(1-7)组，但仍明显低于HG组(图5的a和b)。足细胞中BKB2R蛋白在各组的表达变化趋势与BKB1R相似(图5的a和c)。
(2)Ang-(1-7)和BK受体拮抗剂/激动剂对HG诱导的足细胞中AT1R和MasR mRNA表达的影响
为了观察受体间的相互作用，探讨Ang-(1-7)和BK受体拮抗剂/激动剂对RAS相关受体的影响，通过qRT-PCR检测了足细胞AT1R和MasR的mRNA表达情况。结果如图6所示：
HG干预组足细胞AT1R mRNA表达明显高于LG对照组，单独加入Ang-(1-7)后显著降低了HG诱导的足细胞AT1R mRNA的表达量；单独加入HOE140(HG+HOE 140)也略微降低了HG诱导的AT1R mRNA的表达量(P>0.05，与HG相比)；当Ang-(1-7)和HOE140联用(HG+Ang-(1-7)+HOE140)时，足细胞AT1R mRNA表达水平显著低于单独使用HOE140时的表达水平，略低于HG+Ang-(1-7)组(P>0.05)。相反，BKB1R激动剂des-Arg(9)-BK与HG对足细胞的作用相当，与HG+Ang-(1-7)+HOE140组相比，加入des-Arg(9)-BK的HG诱导足细胞模型(HG+des-Arg(9)-BK)中AT1R mRNA的表达显著增加(P<0.001)。HG+Ang-(1-7)+des-Arg(9)-BK联合干预组AT1RmRNA表达明显低于des-Arg(9)-BK单独干预组(HG+des-Arg(9)-BK，P<0.05)。由此可见，BKB1R激动剂des-Arg(9)-BK显著增加了HG诱导的足细胞中AT1R的mRNA表达(图6的a)。
HG组足细胞MasR mRNA表达明显低于LG组，单独加入Ang-(1-7)后逆转了HG的作用，明显上调了HG诱导的足细胞MasR mRNA表达水平；单独加入HOE140(HG+HOE140)对MasRmRNA表达无显著影响(P>0.05)，而Ang(1-7)和HOE140联合干预组较HG和HG+Ang-(1-7)组显著上调了MasR mRNA表达(P<0.01)。然而，Des-Arg(9)-BK在一定程度上拮抗Ang-(1-7)的作用，并明显降低MasR mRNA表达水平(HG+Ang-[1-7]+Des-Arg(9)-BK与HG+Ang-[1-7]比较P<0.01)(图6b)。
以上结果表明，HG刺激使足细胞AT1R表达上调，MasR表达下调。Ang-(1-7)与HOE140均可显著减轻HG的作用，HOE140与Ang-(1-7)联用的协同保护作用则更为显著。但des-Arg(9)-BK在一定程度上与Ang-(1-7)拮抗，提示游离BK受体增加会加剧足细胞损伤，促进DN进展。
(3)BK受体对HG诱导的足细胞中MasR蛋白表达及Ang-(1-7)对BK受体及相关信号分子蛋白表达的影响
如图7中a和b图所示，HG刺激显著降低了MasR蛋白表达，但Ang-(1-7)和HOE140抵消了HG的作用，显著升高了MasR蛋白表达，且Ang-(1-7)和HOE140联合使用时MasR蛋白表达量明显高于单独干预组。相反地，des-Arg(9)-BK的加入会加剧HG诱导的足细胞中MasR的下调。在HG诱导的足细胞(HG+des-Arg(9)-BK)中，des-Arg(9)-BK对MasR的下调作用与HG相似(P>0.05)，而加入Ang-(1-7)(HG+Ang-[1-7]+des-Arg(9)-BK)则显著上调了MasR蛋白表达(P<0.01vs HG+des-Arg(9)-BK)。因此，des-Arg9-BK在一定程度上拮抗Ang-(1-7)，明显降低MasR蛋白表达水平。
如图7中a和c图所示，HG刺激显著升高了足细胞中BKB1R蛋白表达水平，单独加入Ang-(1-7)可抑制HG的作用，降低BKB1R蛋白表达水平；尽管单独加入HOE140后，BKB1R蛋白表达没有显著变化，但HOE140和Ang-(1-7)联合干预会明显下调HG诱导的足细胞中BKB1R蛋白的表达水平。然而，des-Arg(9)-BK在HG诱导的足细胞(HG+des-Arg(9)-BK)中对BKB1R的上调与HG相当；联合Ang-(1-7)(HG+Ang-[1-7]+des-Arg(9)-BK)干预时，BKB1R蛋白表达虽明显降低(与HG+des-Arg(9)-BK相比P<0.001)，但仍高于HG+Ang-(1-7)组(P<0.0001)和HG+Ang-[1-7]+HOE 140组(P<0.0001)。由此可知，Des-Arg(9)-BK在一定程度上拮抗Ang-(1-7)，明显上调BKB1R蛋白表达水平。
如图7中a和d图所示，HG刺激显著升高了足细胞中BKB2R蛋白表达水平，Ang-(1-7)和HOE140的单独加入或联合使用均可抑制HG的作用，降低BKB2R蛋白表达水平。然而，对比HG+Ang-(1-7)组和HG+Ang-(1-7)+Des-Arg(9)-BK组BKB2R蛋白表达水平可知，BKB1R激动剂des-Arg9-BK在一定程度上拮抗Ang-(1-7)，明显上调BKB2R蛋白表达水平。
另外，如图7中a、e-f图所示，本申请还检测了信号转导通路MAPK家族重要成员ERK和JNK蛋白表达情况。结果表示为磷酸化ERK和总ERK比值、磷酸化JNK和总JNK比值(pERK/ERK，pJNK/JNK)。ERK和JNK的表达在各组之间呈现一致的趋势：HG刺激显著提高足细胞ERK和JNK的表达，Ang-(1-7)和HOE140则显著抑制了HG的作用，降低了ERK和JNK的表达，且相较于单独使用Ang-(1-7)或HOE 140，Ang-(1-7)和HOE140联合使用时对ERK和JNK的抑制作用更强。相反地，des-Arg 9-BK的加入会上调HG诱导的足细胞中ERK和JNK的表达。这部分结果提示，HG刺激上调了ERK和JNK的表达，从而通过激活MAPK信号通路介导足细胞损伤及凋亡；Ang-(1-7)与BKB2R拮抗剂HOE140逆转了HG的这种损伤效应，通过抑制MAPK信号通路来减轻足细胞损伤和凋亡，且Ang-(1-7)和HOE140二者联合效应更大；而BKB1R激动剂des-Arg9-BK与Ang-(1-7)/HOE140拮抗，上调ERK和JNK的表达，从而激活MAPK信号通路，加剧足细胞损伤及凋亡。
综上所述，本发明发现Ang-(1-7)和BK受体拮抗剂及其联合给药对高糖诱导的足细胞损伤及凋亡具有良好的保护效果，且联合给药具有协同保护效应，直观地验证了Ang-(1-7)+BK受体拮抗剂对高糖诱导的足细胞损伤具有改善和/或治疗作用，能够用于制备治疗糖尿病肾病的药物。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (10)
1.一种用于改善和/或治疗糖尿病肾病足细胞损伤的组合物，其特征在于，所述组合物包括：血管紧张素-(1-7)或其类似物，以及缓激肽受体拮抗剂。
2.如权利要求1所述的用于改善和/或治疗糖尿病肾病足细胞损伤的组合物，其特征在于，所述的类似物包括AVE 0991、Ala(1)-Angiotensin-(1–7)、cyclic Ang-(1-7)、A1317、cyclic non-naturalδ-amino acid ACCA或Alamandine。
3.如权利要求1所述的用于改善和/或治疗糖尿病肾病足细胞损伤的组合物，其特征在于，所述的缓激肽受体拮抗剂为作用于缓激肽B1受体和/或缓激肽B2受体的拮抗剂，所述的作用于缓激肽B2受体的拮抗剂包括：
HOE140。
4.权利要求1-3中任一项所述的用于改善和/或治疗糖尿病肾病足细胞损伤的组合物在制备治疗糖尿病肾病的药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物用于减少糖尿病高糖引起的肾小球足细胞凋亡，达到保护足细胞、治疗糖尿病肾病的用途。
6.一种用于治疗糖尿病肾病的药用组合物，其特征在于，所述的药用组合物包括权利要求1-3中任一项所述的用于改善和/或治疗糖尿病肾病的组合物，以及药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的用于治疗糖尿病肾病的药用组合物，其特征在于，所述的药用组合物的剂型包括固体剂型、液体剂型和气体剂型。
8.如权利要求7所述的用于治疗糖尿病肾病的药用组合物，其特征在于，所述的固体剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、膜剂、胶剂、膏剂或粉剂。
9.如权利要求7所述的用于治疗糖尿病肾病的药用组合物，其特征在于，所述的液体剂型包括注射液、合剂、口服液、糖浆剂、酒剂、溶胶剂、乳剂。
10.如权利要求7所述的用于治疗糖尿病肾病的药用组合物，其特征在于，所述的气体剂型包括雾化剂、气雾剂、鼻吸入剂。
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|---|---|---|---|---|
| CN116590345A (zh) * | 2023-05-06 | 2023-08-15 | 北京中医药大学 | 永生化小鼠足细胞系及其制备方法、分化方法和应用 |
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2023
- 2023-02-15 CN CN202310117016.XA patent/CN116271055A/zh active Pending
Non-Patent Citations (1)
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| GUIXIANG CHEN等: ""Effects of Ang-(1-7) and Its Receptor Regulating Bradykinin System on Podocyte Injury Induced by High Glucose"", 《AMERICAN SOCIETY OF NEPHROLOGY(ASN) KIDNEY WEEK 2018》, 25 October 2018 (2018-10-25), pages 347 - 348 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116590345A (zh) * | 2023-05-06 | 2023-08-15 | 北京中医药大学 | 永生化小鼠足细胞系及其制备方法、分化方法和应用 |
| CN116590345B (zh) * | 2023-05-06 | 2024-01-30 | 北京中医药大学 | 永生化小鼠足细胞系及其制备方法、分化方法和应用 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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