CN117660371A - 一种新型冠状病毒假病毒、表达细胞以及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种新型冠状病毒假病毒、表达细胞以及制备方法。该新型冠状病毒假病毒的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。该新型冠状病毒假病毒可以在普通的BSL‑2实验环境也能与ACE2结合，并且具有较高的亲和力。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种新型冠状病毒假病毒、表达细胞以及制备方法。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是20世纪以来第三种能够感染人类的高致病性冠状病毒，在极短的时间内引发COVID-19大流行，对人类公共卫生安全与全球经济造成了严重威胁。
人类血管紧张素转换酶2(ACE2)是SARS-CoV-2病毒与膜结合的主要受体，它参与病毒和宿主细胞特异性结合及进入过程，并且SARS-CoV-2的刺突蛋白(S蛋白)与ACE2的亲和力是SARS的十倍；而病毒表面刺突糖蛋白受体结合区与人受体ACE2会形成复合物晶体结构，再次揭示了SARS-CoV-2的S蛋白与ACE2受体存在相互作用。但是，由于SARS-CoV-2病毒极高的致病性和传染性，必须在BSL-3实验环境下处理，这极大地限制了疫苗和抗病毒药物的研究进程。
因此，发明一种可以在不局限于高等生物安全条件的实验室(比如普通的BSL-2实验环境)即可进行研究的新型冠状病毒假病毒具有意义。
发明内容
针对以上问题，本发明目的之一在于提供一种新型冠状病毒假病毒，该新型冠状病毒假病毒在普通的BSL-2实验环境也能与ACE2结合，并且具有较高的亲和力。
为了达到上述目的，本发明可以采用以下技术方案：
本发明一方面提供一种新型冠状病毒假病毒，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明另一方面提供一种上述的新型冠状病毒假病毒的制备方法，包括：(1)将慢病毒包装载体、慢病毒包装系统和rLV-CMV-SARS-CoV-2-Sipke-mcherry-WPRE与培养基中混合；然后与PEI混合得DNA-PEI转染试剂复合物；(2)将DNA-PEI转染试剂复合物在表达细胞中培养转染，培养转染后吸除培养基得上清液a；(3)将上清液a第一次离心得细胞和碎片得上清液b，将上清液b超速离心得新型冠状病毒假病毒。
进一步地，上述步骤(1)中，慢病毒包装载体选择PMD2.G，慢病毒包装系统选择PSPAX2。
进一步地，上述步骤(1)中，培养基为DMEM培养基。
进一步地，上述步骤(2)中，表达细胞为293T细胞。
进一步地，上述步骤(3)中，第一次离心包括3500rpm室温离心10min；和/或超速离心包括：30,000rpm，4℃离心2h。
本发明再一方面提供一种表达细胞，其由上述的新型冠状病毒假病毒转染得到。
进一步地，上述表达细胞为293T细胞。
本发明有益效果至少包括：本发明提供的新型冠状病毒假病毒可以在普通的BSL-2实验环境也能与ACE2结合，并且具有较高的亲和力。
附图说明
图1假病毒感染293T细胞48h的荧光成像；
图2假病毒感染293T细胞72h的荧光成像；
图3假病毒感染含有hACE2受体的293T细胞48h的荧光成像；
图4假病毒感染含有hACE2受体的293T细胞72h的荧光成像；
图5空白对照组感染48h的荧光成像；
图6空白对照组感染72h的荧光成像。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
本发明实施例提供一种新型冠状病毒假病毒，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
需要说明的是，假病毒能够模拟活病毒与受体结合并入侵细胞的过程，本申请中的SARS-CoV-2假病毒由骨架核心以及病毒表面的S蛋白组成，不具备复制能力，只能做到单轮感染，因而可以在BSL-2实验室开展实验，部分替代活病毒的相关操作。
本发明另一方面提供一种上述的新型冠状病毒假病毒的制备方法，包括：(1)将慢病毒包装载体、慢病毒包装系统和rLV-CMV-SARS-CoV-2-Sipke-mcherry-WPRE与培养基中混合；然后与PEI混合得DNA-PEI转染试剂复合物；(2)将DNA-PEI转染试剂复合物在表达细胞中培养转染，培养转染后吸除培养基得上清液a；(3)将上清液a第一次离心得细胞和碎片得上清液b，将上清液b超速离心得新型冠状病毒假病毒。
在一些具体实施例中，上述步骤(1)中，慢病毒包装载体可以选择PMD2.G，慢病毒包装系统选择PSPAX2。需要说明的是，上述的慢病毒包装载体和慢病毒包装系统可以选择本领域所已知的，其中优选慢病毒包装载体选择PMD2.G，慢病毒包装系统选择PSPAX2。
在一些具体实施例中，上述步骤(1)中，培养基可以为DMEM培养基。需要说明的是，上述的培养基为本领域所已知的培养基，本发明中可以优选DMEM培养基。
在一些具体实施例中，上述步骤(2)中，表达细胞可以为293T细胞。需要说明的是，表达细胞为本领域所已知的表达细胞，本发明中优选293T细胞。
在一些具体实施例中，上述步骤(3)中，第一次离心包括3500rpm室温离心10min；和/或超速离心包括：30000rpm，4℃离心2h。
需要说明的是，在感染性细胞中提取病毒时，由于与病毒大小相近的细胞亚单位及碎片的存在，提纯效果不理想。以差速离心法分离提纯病毒时，经常以低速及中速去除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其它较大的杂质。然后，选择在60min内能够沉淀80％以上的病毒粒子的较高速度，离心1～2h使病毒沉淀。
本发明再一方面提供一种表达细胞，其由上述的新型冠状病毒假病毒转染得到。
在一些具体实施例中，上述表达细胞为293T细胞。
为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。
一、假病毒包装
(1)细胞铺皿
HEK293T细胞计数，按照每皿8.0×106个细胞接种至10cm培养皿中。
(2)质粒转染
配制DNA-PEI(聚乙烯亚胺)转染复合物：添加3.2ug PSPAX2(0.4ug/1.0×106cells)(质粒添加量，每1.0×106个cells添加0.4ug的PSPAX2，步骤1中每皿8.0×106个cells，因此添加3.2ug PSPAX2)(购自武汉枢密脑科学技术有限公司)、3.2ug rLV-CMV-SARS-CoV-2-Sipke-mcherry-WPRE(0.4ug/1.0×106cells)和1.6ug PMD2.G(0.2ug/1.0×106cells)(购自武汉枢密脑科学技术有限公司)到200uL无血清的DMEM培养基中，涡旋混匀后得到DNA-DMEM培养基，再添加20uLPEI(1mg/ml)(DNA:PEI＝1:2.5)(需要说明的是，此处的DNA指的是核心(目的)质粒rLV-CMV-SARS-CoV-2-Sipke-mcherry-WPRE)到DNA-DMEM培养基混合液中，涡旋混匀，室温静置10min得到DNA-PEI转染试剂复合物；
将配好的DNA-PEI转染试剂复合物加入上述含有HEK293T细胞的培养皿中；6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入10ml新鲜完全培养基(含10％胎牛血清的DMEM培养基)培养。
(3)假病毒收获及浓缩
1)收集上述转染后48h和72h的293T细胞上清液，分装入50ml离心管中；3500rpm室温离心10min，除去细胞和大的碎片；
2)以0.45μm滤膜过滤上清液于超速离心管中；
3)30000rpm，4℃离心2h，可观察到管壁一侧有白色的慢病毒沉淀；
4)弃上清，离心管倒扣在灭菌过的吸水纸上，去除未弃干净的上清；每管根据沉淀量添加DPBS 80μl-120μl/管，用封口膜封住管口，4℃溶解沉淀过夜；
5)分装慢病毒，-80℃冰箱保存。
二、假病毒感染293T-hACE2细胞
(1)将293T细胞按5×104个ml浓度的细胞接种24孔板。
(2)24h后更换培养基，随机分为三组，第一组加入SARS-CoV-2假病毒(MOI＝0～1)，第二组加入SARS-CoV-2假病毒(MOI＝0～1)以及表达hACE2的质粒载体(MOI＝10～20)，第三组为空白对照(仅293T细胞，不加其他质粒)；另外，每组均加入终浓度为5μg/ml的Polybrene轻轻摇晃孔板混匀；
(3)感染6小时后，更换为新鲜的培养基(含10％胎牛血清的DMEM培养基)；
(4)中途可换液，保持细胞活性；
(5)感染48h和72h荧光显微镜下观察假病毒感染情况。
假病毒感染293T细胞(第一组)48h的荧光成像情况如图1所示，感染72h的荧光成像情况如图2所示；假病毒感染含有hACE2受体的293T细胞(第二组)48h的荧光成像如图3所示，感染72h的荧光成像情况如图4所示；空白对照组感染(第三组)48h的荧光成像如图5所示，感染72h的荧光成像情况如图6所示；由上述图可以得知，空白组的EGFP为阴性；在假病毒感染后所得的EGFP阳性细胞极低，且随感染时间变化不大；而在hACE2受体干预下，293T细胞随着病毒感染时间EGFP阳性细胞比例明显增多，说明假病毒进入量在逐渐增加，在72h时感染效率达到80％以上。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。
Claims (10)
1.一种新型冠状病毒假病毒，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的新型冠状病毒假病毒的制备方法，其特征在于，包括：(1)将慢病毒包装载体、慢病毒包装系统和rLV-CMV-SARS-CoV-2-Sipke-mcherry-WPRE与培养基中混合；然后与PEI混合得DNA-PEI转染试剂复合物；(2)将DNA-PEI转染试剂复合物在表达细胞中培养转染，培养转染后吸除培养基得上清液a；(3)将上清液a第一次离心得细胞和碎片得上清液b，将上清液b超速离心得新型冠状病毒假病毒。
3.根据权利要求2所述的新型冠状病毒假病毒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，慢病毒包装载体选择PMD2.G，慢病毒包装系统选择PSPAX2。
4.根据权利要求2或3所述的新型冠状病毒假病毒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，培养基为DMEM培养基。
5.根据权利要求2或3所述的新型冠状病毒假病毒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，表达细胞为293T细胞。
6.根据权利要求2或3所述的新型冠状病毒假病毒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，第一次离心包括3500rpm室温离心10min；和/或超速离心包括：30,000rpm，4℃离心2h。
7.根据权利要求4所述的新型冠状病毒假病毒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，第一次离心包括3500rpm室温离心10min；和/或超速离心包括：30,000rpm，4℃离心2h。
8.根据权利要求5所述的新型冠状病毒假病毒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，第一次离心包括3500rpm室温离心10min；和/或超速离心包括：30,000rpm，4℃离心2h。
9.表达细胞，其特征在于，由权利要求1所述的新型冠状病毒假病毒转染得到。
10.根据权利要求8所述的表达细胞，其特征在于，表达细胞为293T细胞。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202311651405.7A CN117660371A (zh) | 2023-12-05 | 2023-12-05 | 一种新型冠状病毒假病毒、表达细胞以及制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311651405.7A CN117660371A (zh) | 2023-12-05 | 2023-12-05 | 一种新型冠状病毒假病毒、表达细胞以及制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN117660371A true CN117660371A (zh) | 2024-03-08 |
Family
ID=90063628
Family Applications (1)
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Country Status (1)
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2023
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