CN111378782B - 鸭蛋减产综合征病毒检测方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种鸭蛋减产综合征病毒检测试剂盒，包含：针对鸭蛋减产综合征病毒SEQ ID NO：1所示基因序列设计的上游引物和下游引物，该上游引物和下游引物用于扩增SEQ ID NO：1所示基因序列中的基因片段。本发明的试剂盒，能快速、准确、及时地诊断鸭蛋减产综合征，对有效防控鸭蛋减产综合征具有重要意义。

Description

鸭蛋减产综合征病毒检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种鸭蛋减产综合征病毒检测方法及其试剂盒。

背景技术

2016年以来，首先在种鸭场陆续发生了不明原因的产蛋下降，鸭群产蛋率下降20～30％，数周后有一定恢复，但很难恢复到发病前的产蛋率，从而导致种鸭场遭受巨大经济损失。该病的主要症状是蛋鸭产蛋下降，因此将该病命名为鸭蛋减产综合征。该病在中国不断蔓延，全国主要的蛋鸭生产地区都有该病的暴发，但目前尚无诊断该鸭蛋减产综合征的检测方法及试剂盒，对鸭蛋减产综合征的防控非常不利，急需开发有效的鸭蛋减产综合征检测试剂盒。

发明内容

本发明要解决目前对鸭蛋减产综合征的诊断手段有限的技术问题，提供一种新型鸭蛋减产综合征病毒的检测试剂盒，该新型病毒是从鸭蛋减产综合征发病鸭中分离获得的一株全新的鸭蛋减产综合征病毒，本发明试剂盒可快速、简便、准确地检测该鸭蛋减产综合征病毒，对鸭蛋减产综合征作出及时诊断。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种鸭蛋减产综合征病毒检测试剂盒，包含：针对鸭蛋减产综合征病毒SEQ ID NO：1所示基因序列设计的上游引物和下游引物，该上游引物和下游引物组成的引物对用于扩增SEQ ID NO：1所示基因序列中的基因片段。

优选的，所述上游引物和下游引物包括下述引物对中的任意一对或两对以上组合：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。

在本发明中，两对以上引物对，可用于套式PCR检测，如本发明的一个实施例中，先用第一对引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4进行PCR扩增，再用第二对引物SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，以第一次扩增产物为模板进行第二次PCR扩增。

优选的，所述试剂盒还包含探针，该探针与扩增出的基因片段相结合，该探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

更优选的，所述试剂盒包含下述引物对和探针：SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示引物对，SEQ ID NO：11所示探针；或者SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示引物对，SEQ IDNO：14所示探针。

优选的，所述试剂盒还包含发光染料。

优选的，所述试剂盒还包含阳性对照，该阳性对照为鸭蛋减产综合征病毒AH204株。

所述试剂盒检测鸭蛋减产综合征病毒的方法包括普通RT-PCR、套式RT-PCR、或荧光定量RT-PCR。

在本发明的另一方面，还提供了上述鸭蛋减产综合征病毒检测试剂盒在制备快速诊断鸭蛋减产综合征的产品中的应用。

本发明鸭蛋减产综合征病毒检测试剂盒，具有特异性强、灵敏度高的特点，能快速、准确、及时地诊断相关的鸭蛋减产综合征。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1引物AH204-F1和AH204-R1的PCR鉴定电泳图；

图2是本发明实施例1引物AH204-F2和AH204-R2的PCR鉴定电泳图；

图3是本发明实施例1引物AH204-F3和AH204-R3的PCR鉴定电泳图；

图4是本发明实施例2套式PCR鉴定电泳图；

图5是本发明实施例3第一套引物和探针的荧光定量RT-PCR检测结果图，A为病毒的动力学曲线，B为病毒的标准曲线；

图6是本发明实施例3第二套引物和探针的荧光定量RT-PCR检测结果图，A为病毒的动力学曲线，B为病毒的标准曲线。

具体实施方式

实施例1RT-PCR方法检测鸭蛋减产综合征病毒

1.1仪器设备与耗材

可调移液器：2μL、20μL、200μL、1000μL，台式高速冷冻离心机；无RNA酶的1.5mL管；无RNA酶的PCR管；无RNA酶的带滤芯枪头；PCR基因扩增仪；核酸电泳仪；核酸电泳槽；凝胶成像分析系统。

1.2试剂

商品化RNA提取试剂盒，DEPC处理水，反转录试剂盒(包括随机引物、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂)，PCR Mix(2X)，dNTPs(2.5mM each)，DNA Marker，电泳级琼脂糖，Tis-乙酸电泳缓冲液TAE(50×TAE，1×TAE)，1％琼脂糖。

1.3引物

从鸭蛋减产综合征发病鸭的肝脏、脾脏和肺脏等组织中分离得到一株全新的鸭蛋减产综合征病毒，通过基因组序列测定，获得该病毒的全长基因序列如SEQ ID NO：1所示。同时将该鸭蛋减产综合征病毒保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心)，保藏号为CCTCC NO：V201866，其分类命名为鸭蛋减产综合征病毒AH204株。

本发明针对鸭蛋减产综合征病毒AH204株SEQ ID NO：1所示的全基因序列，设计特异性PCR引物，用于鸭蛋减产综合征病毒的检测。由于鸭蛋减产综合征病毒AH204株是一种小RNA病毒，因此还需设计反转录引物。

1.3.1反转录引物

AH204-RT：5’AAGCAAGTGGCTTAG 3’(SEQ ID NO：2)

1.3.2PCR引物

以下三对引物任性一对：

上游引物AH204-F1：5’CCAGCCTCGCAAGACTAAAT 3’(SEQ ID NO：3)；

下游引物AH204-R1：5’CAGAACACATACCTCCCTCAAC 3’(SEQ ID NO：4)；

扩增片段长度803bp(扩增片段是SEQ ID NO：1全基因序列中第7409位到第8211位的核酸序列)。

上游引物AH204-F2:5’GCCAAGGTCACTACAACT3’(SEQ ID NO：5)；

下游引物AH204-R2:5’CTCACATTACCCTCATACA 3’(SEQ ID NO：6)；

扩增片段长度797bp(扩增片段是SEQ ID NO：1全基因序列中第2958位到第3754位的核酸序列)。

上游引物AH204-F3:5’CATTCGGACCAGCTGTCTTATC 3’(SEQ ID NO：7)；

下游引物AH204-R3:5’GCCACTTTGTCGTTAGGTCTTA 3’(SEQ ID NO：8)；

扩增片段长度385bp(扩增片段是SEQ ID NO：1全基因序列中第7462位到第7846位的核酸序列)。

1.4样品

1.4.1阴性对照

阴性对照为正常鸭胚尿囊液。

1.4.2阳性对照

鸭蛋减产综合征病毒AH204株(CCTCC NO：V201866)。

1.5试验步骤1.5.1病毒RNA的提取

按照RNA提取试剂盒操作说明书，提取待检组织样品总RNA。提取的RNA应测定其浓度和纯度，并立即用于反转录，否则应于-80℃冰箱冻存。

1.5.2病毒cDNA的合成

将5μL RNA提取液与2μL反转录引物(10μmol/μL)混匀，70℃保温10min后迅速冰浴2min，然后分别加入4μL 5×M-MLV Buffer、1μL RNA酶抑制剂、1μL M-MLV、1μL dNTPs、6μLDEPC水，共20μL，混匀后30℃保温10min，42℃保温2h～3h，75℃15min。

1.5.3PCR反应体系及反应条件

在试剂储存和准备区配制PCR反应液，在样品制备区进行加样。采用25μL反应体系，组成如下：

瞬时离心，置PCR基因扩增仪内进行扩增，反应程序为：95℃预变性3min；然后进入扩增循环：95℃30s，53℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min。

1.5.4产物检测

在扩增产物分析区，将制备好的1.0％琼脂糖凝胶放入电泳槽(带加样孔的一端在阴极)，倒入电泳液(1×TAE)浸过胶面。PCR产物各取10μL加入电泳胶孔内(先加5μL DNAMarker，然后依次加阴性对照产物，再加待测样品，最后加阳性对照产物)；在100V电压下电泳15min～30min；在凝胶成像分析系统下观察、拍照、记录结果。

1.6RT-PCR结果判定

1.6.1试验成立的条件

阴性对照样品无条带，阳性对照样品出现对应大小的条带，则试验结果成立。

1.6.2试验结果的判定

1.6.2.1在试验成立的前提下，待检样品出现对应大小的条带，(见图1、2、3)判定待检样品为鸭蛋减产综合征病毒PCR阳性。必要时对扩增片段进行序列测定。

图1中，1：为阳性对照，2-7：为PCR阳性样品，8-15：为PCR阴性样品，16：为阴性对照，M：为DNA Marker。

图2中，1：为阳性对照，2-6：为PCR阳性样品，7-15：为PCR阴性样品，16：为阴性对照，M：为DNA Marker。

图3中，M：为DNA Marker，1：为阳性对照，2-6：为PCR阳性样品，7-14：为PCR阴性样品，15：为阴性对照。

1.6.2.2在试验成立的前提下，待检样品无条带，则为鸭蛋减产综合征病毒PCR阴性。

实施例2套式RT-PCR检测鸭蛋减产综合征病毒

2.1仪器设备与耗材

可调移液器：2μL、20μL、200μL、1000μL，台式高速冷冻离心机；无RNA酶的1.5mL管；无RNA酶的PCR管；无RNA酶的带滤芯枪头；PCR基因扩增仪；核酸电泳仪；核酸电泳槽；凝胶成像分析系统。

2.2试剂

商品化RNA提取试剂盒，DEPC处理水，反转录试剂盒(包括随机引物、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂)，PCR Mix(2X)，dNTPs(2.5mM each)，DNA Marker，电泳级琼脂糖，Tis-乙酸电泳缓冲液TAE(50×TAE，1×TAE)，1％琼脂糖。

2.3引物

2.3.1反转录引物

AH204-RT：5’AAGCAAGTGGCTTAG 3’(SEQ ID NO：2)

2.3.2 PCR引物

首次套式扩增引物

上游引物AH204-F1：5’CCAGCCTCGCAAGACTAAAT 3’(SEQ ID NO：3)；

下游引物AH204-R1：5’CAGAACACATACCTCCCTCAAC 3’(SEQ ID NO：4)。

二次套式扩增引物

上游引物AH204-F3:5’CATTCGGACCAGCTGTCTTATC 3’(SEQ ID NO：7)；

下游引物AH204-R3:5’GCCACTTTGTCGTTAGGTCTTA 3’(SEQ ID NO：8)。

2.4样品

2.4.1阴性对照

正常鸭胚尿囊液。

2.4.2阳性对照

鸭蛋减产综合征病毒AH204株(CCTCC NO：V201866)。

2.5试验步骤

2.5.1病毒RNA的提取

按照RNA提取试剂盒操作说明书，提取待检组织样品总RNA。提取的RNA应测定其浓度和纯度，并立即用于反转录，否则应于-80℃冰箱冻存。

1.5.2病毒cDNA的合成

将5μL RNA提取液与2μL反转录引物(10μmol/μL)混匀，70℃保温10min后迅速冰浴2min，然后分别加入4μL 5×M-MLV Buffer、1μL RNA酶抑制剂、1μL M-MLV、1μL dNTPs、6μLDEPC水，共20μL，混匀后30℃保温10min，42℃保温2h～3h，75℃15min。

1.5.3 PCR反应体系及反应条件

1.5.3.1首次扩增

在试剂储存和准备区配制PCR反应液，在样品制备区进行加样。采用25μL反应体系，组成如下：

瞬时离心，置PCR基因扩增仪内进行扩增，反应程序为：95℃预变性3min；然后进入扩增循环：95℃30s，53℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min。

1.5.3.2二次扩增

在试剂储存和准备区配制PCR反应液，在样品制备区进行加样。采用25μL反应体系，组成如下：

瞬时离心，置PCR基因扩增仪内进行扩增，反应程序为：95℃预变性3min；然后进入扩增循环：95℃30s，53℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃延伸10min。

1.5.4产物检测

在扩增产物分析区，将制备好的1.0％琼脂糖凝胶放入电泳槽(带加样孔的一端在阴极)，倒入电泳液(1×TAE)浸过胶面。PCR产物各取10μL加入电泳胶孔内(先加5μL DNAMarker，然后依次加阴性对照产物，再加待测样品，最后加阳性对照产物)；在100V电压下电泳15min～30min；在凝胶成像分析系统下观察、拍照、记录结果。

1.6套式PCR结果判定

1.6.1试验成立的条件

阴性对照样品无条带，阳性对照样品出现385bp大小的条带，则试验结果成立。

1.6.2试验结果的判定

1.6.2.1在试验成立的前提下，待检样品出现385bp大小条带，(见图4)判定待检样品为鸭蛋减产综合征病毒套式PCR阳性。必要时对扩增片段进行序列测定。

图4中，M：为DNA Marker，1：为阳性对照，2-9：为套式PCR阳性样品，10：为套式PCR阴性样品，11：为阴性对照。

1.6.2.2在试验成立的前提下，待检样品无条带，则为鸭蛋减产综合征病毒套式PCR阴性。

实施例3荧光RT-PCR方法检测鸭蛋减产综合征病毒

3.1仪器设备与耗材

实时荧光定量PCR检测仪，台式高速冷冻离心机，涡旋振荡器，可调移液器：2μL、20μL、200μL、1000μL，无RNA酶的1.5mL离心管无RNA酶的荧光定量PCR管，无RNA酶的带滤芯枪头。

3.2试剂

商品化RNA提取试剂盒，反转录试剂盒(包括随机引物、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂)，实时荧光定量PCR试剂盒，dNTPs(2.5mM each)，DEPC处理水。

3.3引物

3.3.1特异反转录引物

AH204-RT：5’AAGCAAGTGGCTTAG 3’(SEQ ID NO：2)

3.3.2荧光RT-PCR引物和探针，以下两套引物和探针任选其一。

3.3.2.1第一套荧光RT-PCR引物和探针

引物：

上游引物F1：TGGGACTCAATGATGGAGAATG(SEQ ID NO：9)；

下游引物R1：TGTTTATGGAAGCAGGCTAAGA(SEQ ID NO：10)。

探针：

Probe1：TCAAGTCATGGAGGCTGCAGTTGA(SEQ ID NO：11)。

3.3.2.2第二套荧光RT-PCR引物和探针

引物

上游引物F2:GAGTCTATCCCACCCAACATAC(SEQ ID NO：12)；

下游引物R2:CTCCTCAACATCTCCGTCTTC(SEQ ID NO：13)。

探针：

Probe2:TGGCAATGCAGCTTGGGTTAGAGA(SEQ ID NO：14)

3.3.3阴性对照

阴性对照为正常鸭胚尿囊液。

3.3.4阳性对照

鸭蛋减产综合征病毒AH204株(CCTCC NO：V201866)。

3.3.5阳性质粒标准品的制备

分别用第一套和第二套引物经RT-PCR扩增鸭蛋减产综合征病毒相应的核酸片段，PCR产物回收经试剂盒纯化后连接入pMD18-T载体，转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞，提取经PCR鉴定和通过序列测定分析验证的阳性克隆质粒，质粒标准品分别命名为Plasmid1和Plasmid2，测定DNA浓度后，按公式计算标准品的拷贝数，拷贝数(copies)＝(质量/分子量)×6.0×10²³。以10倍系列分别稀释质粒标准品至下限达10⁰copies/ul。其中Plasmid1对应于第一套荧光RT-PCR引物和探针，Plasmid2对应于第二套荧光RT-PCR引物和探针。

3.4试验步骤3.4.1病毒RNA的提取

按照RNA提取试剂盒操作说明书，提取待检组织样品总RNA。提取的RNA应测定其浓度和纯度，并立即用于反转录，否则应于-80℃冰箱冻存。

3.4.2病毒cDNA的合成

将5μL RNA提取液与2μL反转录引物(10μmol/μL)混匀，70℃保温10min后迅速冰浴2min，然后分别加入4μL 5×M-MLV Buffer、1μL RNA酶抑制剂、1μL M-MLV、1μL dNTPs、6μLDEPC水，共20μL，混匀后30℃保温10min，42℃保温2h～3h，75℃15min。

3.4.3荧光RT-PCR反应体系及反应条件

在实验室洁净区域，将试剂盒中预混液、引物和探针取出，置于冰上直至融化。将下列试剂依次加入到无RNA酶的荧光定量PCR管中。采用20μL反应体系，组成如下：

将上述加有反应液的荧光定量PCR管移至核酸提取区，依次加入阴性对照、待检样品和阳性对照的cDNA，1μL/管，做好标记。瞬时离心，打开荧光定量PCR仪和联机电脑，将上述荧光PCR管置于荧光定量PCR仪内，设置反应程序为：95℃预变性2min；然后进入扩增循环：95℃20s，54℃1min，40个循环。启动运行程序，试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。

3.5荧光RT-PCR结果判定

3.5.1试验成立的条件

阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。阴性对照的检测结果应无特异性扩增；阳性对照的Ct值应<28.0，则试验结果成立。

3.5.2试验结果的判定

3.5.2.1Ct值≤30，而且出现明显的扩增线，表明样品中存在鸭蛋减产综合征病毒，判为阳性。

3.5.2.2无Ct值，并且无扩增曲线，或者CT值>35，表明样品中无鸭蛋减产综合征病毒，判为阴性。

3.5.2.3 30<Ct值<35的样品，判为可疑，必须重做，重做结果Ct值<30者为阳性，否则判为阴性。

3.6荧光RT-PCR定量

根据所选引物和探针不同，分别依据第一套引物和探针的标准曲线图(图5)和第二套引物和探针的标准曲线图(图6)确定样品中鸭蛋减产综合征病毒的核酸拷贝数。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序 列 表

<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）

<120> 鸭蛋减产综合征病毒检测方法及其试剂盒

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9042

<212> DNA

<213> 鸭蛋减产综合征病毒（Duck egg-drop syndrome virus）

<400> 1

tcgactaagt aggtatcttc tttttcctcg gatggatttt tggtttgacc taatgtaaac 60

acacgataat actctcacaa gtgcgatttc atggtggtct agccagccac ttccttggcg 120

aaagcttcat ggaaaggaaa attggtagac atgccctaat gatgcatagc ctgaaatcgt 180

ctagtagggc gatgcctctc ttagataagc atgttggcta ggtgaagtag actagactag 240

tgtgaaggtt cggggccagc attgctatac cccctctcat ccggcgtgga tttccggcca 300

ttggagagag cttcacatta gcagggtaat gggataaccc tgttgatcta gactcctgat 360

aaggggaact gcctgtttca cgacccacct agtataaaat cacaggctgt acttatgcaa 420

tggatactct tacgcaaccc attaagaaaa ttgcaggaga ggttgaggag acaattgaga 480

agacaactga agcagcaaca ttgatatcag atacaatctc agcagccacc catcaaggag 540

aacaggctgc ctccatcgag acaggacagc ccactgaagt aactgatgtc catacagatg 600

gatcaactga cgacatgctt tcgtgcagca tgtctgtcga tttttacaag gagaatttta 660

caaagttggt ccatttatca actttccagt ggaatactac aaatggaatt ggccacagac 720

tagatggtag atggctaccc aatgtgttct tccagaactt tatgccaaca caaagtgcta 780

gccaactatt ttcttacttg agatgtgggt atcactttag gatgcttgtg aatgcttcac 840

ctggagtttt gggatcattg atatgtgtgt acataccagg aggatattgt aagacatttg 900

attcttcttt tccgagggac tttaaatctg ttctctctct cccgcatacc atacttgacg 960

taaggtgttc aaatcaggct gacttggttg tgccatatgc taattacaca aactatgtcc 1020

attatacaaa aacaggaccc ctagaagatg gtgctatggt ctgtgtgtat gtctttgcaa 1080

aaatggaggt tggctctggt ttttctggag aaattgatgt tagcttgtat ggtgaattga 1140

ttgaggctga ctttcaagcc ccccgaccca taaatcaagg tcggcccaaa aggcggcaag 1200

tcaagccccc cccaaaacca ccagtaaaac atcatacaat ggttgatggt gcccctgggt 1260

gttgcaatct atctaatgtt gagagcacag gcactagtga gtctttggcc ctagttggag 1320

aatcaactgc aattgattat gcaacagctg gatgcagttc aaacataaat gacttcatcg 1380

aaattatgag gaaatgggtc attatagatc aaggtgtttg ggagaatacg gttggtaggg 1440

gctctgagat aacagcattg aatctgcaac catacagata tggcaatatg ggattaattc 1500

ttgggtgttt ccagttcttt agagggtcat ttgaaattaa agtgttgacc tatgcctctc 1560

ctctagctac agccaggtat caaatcacat ggtttccaga atattatgag acagttggca 1620

ttgacaaaca gaggaatgga gtctacctca cagccgacat cggttgtgag agcgggactt 1680

tagtgctgcc attcacgtca agcacctgga ggaggcagtg tgaccaaccg tacggtcgca 1740

taaccatgtc ttgtataaat aagatcgcct ataacacaac agccccgaat aaagtctctt 1800

ataagattct aatgagagtt ggtcctgatt ttcaagtttt ttgcccccgc cttccagtcc 1860

tttcgattca aggtttgggg gatggtagca gtgacccagt cctcttcatt aattatgagg 1920

ttgatcacat tcctattcaa tctcaatccc attctaatgt caatgctttg ctaggtagaa 1980

tacagcatta cggcaaattt actcttacag ctgccacaat caaccaagct gagataacac 2040

tggttaataa gaggccatat aaaatattag aaactgttgc atattggagc ggagaactgc 2100

tcttttccat cttgaatcat tgtccttccc cgctatattt tgcacacaaa tacacgtcct 2160

acaactttac aaatcaggaa gacatgatgg cgcatggtgt gattctcata ccagctaatg 2220

ggatgaagac cattaacata ccattttaca gtgacacacc attgcgtagg actattgaca 2280

attttggacg gatagccctt ctatccaaag aggctggaca agttgaggtc aacattgctt 2340

ttaggaaacc cagttttttt tttccaatcc cgtgtacttc tactgctcag gcgacatctt 2400

atgtgaagga tttgaccatt gatggagatg tagagtccaa tcctgggccc cagtatgtta 2460

gacagagaat tgacttagga gaggaataca tccagtatga gttcaagaag tggaggggct 2520

tgcttgttac caacaaagtt ttggtatggt ctctccacaa gggaccttac ccctccccag 2580

ccagctttac ttgttatgag cagacaaagc aaactctatg gaaaaagaaa atgtttatag 2640

agtgggagct ggactataat ggagtaactt attggagcag acaggaaatt gagcgtaaat 2700

ggaacttcca aaaaacgtgt agagaggttg agggatctta tgtcaaagat ttgacggagg 2760

aaggcattga acccaaccct ggaccggcag atttttcttc ttttagctca ggcttttcct 2820

cagtcacttc aagggcctat ggtgaaaatt ttactcatta ttggcaaaat aataattaca 2880

ctaatggtta ttacacaacg aacttgacca cagttcatgc taagtcaaat ggaataccct 2940

ctccaccagt ttttacagcc aaggtcacta caactgcttc atggtttaca gttaaggttc 3000

gggttgtggt atcaattaga actcatcagg ggtggaaaat gtttagggca aaattcaagt 3060

tgaatagaat gacttttgct aggtggaacc ccattgaatt tcaagaaacc cttcctgaaa 3120

tagtggcata ttcaactgtc actaattctg gaacaagagg aagtcagtgg accgtgataa 3180

gatcaactga agtggcagga tcagcagtga gtctgtcaaa gacctgggac agaattgatg 3240

tcagagtcta tcccacccaa catactcaac cttacctatt aaaaattggc aatgcagctt 3300

gggttagaga cctgacggaa gacggagatg ttgaggagaa ccctggacca actcaatggc 3360

tttgtgatag ggatatgatc catgctagag acgggtggat gatggtagat acctatattc 3420

tagttaagaa aaatggtgat cggatgagga tggttggccc acttatttct gtaatcaaga 3480

caaaactcaa tgacgggcga tctcaagtag aatacagatg gaggaggtcc ttaatacata 3540

gtccagaaag tgttgtgtat aactgtcatg agtcctgttg gaatagggac ctgactattg 3600

atggtgatgt tgagcttaat cctggcccac gagatccttt accatgttca acagttgaga 3660

gaaaagaatg ggagcacaat ggggtcttgt attattacac aaagtacacg aagtcattta 3720

ggtggtttgg ccacgtgtat gagggtaatg tgagtttggt tcatgtcatg gaagtccacc 3780

ctgataatcg cagaaaggac acatttaaat taaaggatga aaatggacaa atctatgatt 3840

gggtttttaa gtgtcatgaa aaatgttggc agaaagatcc tacacaggat ggtgatgttg 3900

aacaaaatcc aggcccatac ttagaaataa ctacatggag agtagggaat gtccatataa 3960

ctgagcattg ctatgatggt ggccttatta tccaccagac gttcataaat tggtcaaatg 4020

gtgcgaagaa agaagtgttc attgttgagg acaggtgtta tgaatttaag tgccatgaac 4080

actgctgggt tagagatttg actatggatg gagatgtgga agagaatccg ggcccatggt 4140

ccccagacac aaagaccata atggttttgg gagcaaccgg atcaggaaaa tcatatgcag 4200

ctaataagat tcttggtaaa gaagccttta tacataagtt atccacaaag tctgtcactt 4260

actgtgacca ggccattacc catggcaacc taacagtcat cgatacagct cctctaccaa 4320

aattaactga ttttgtttcg ggattcgtat atgttcacaa ggctgggagg tttaacgccg 4380

aggaaaaggc atatttggat ttattggata agatgctgcc taattggcaa gcccatgctg 4440

tgttacttgt cccacaaagg gaagtccaaa aagtgtatgt tgaagattat attaaaaatc 4500

acaaggagct ttctgggcta gcttttaaaa tgatgggtag aattactgac tcctatgaaa 4560

ttgccaaaaa gatgatttgt gaatgtctac catcaccata tttttcgcac cactataaat 4620

tggtctataa gaacaggggt gcttatcggc actatggagt cttgtcccat gggagagtct 4680

tccatcttaa cactgctgac attcttaaat cagccctttc aggatctgcc tctgtccagg 4740

ttgaccacaa tccccaagag tggataaagg cagaagagaa tggctataga tcggcactct 4800

acctggtcaa cgctggagct atagatttgg actttaattt tgactcaaat tgtgaaacat 4860

gggctaaaac aatactaggg tcagaccaag cctgccaggg ccatagactt aagtggtgct 4920

tgacattagc cgccgcagca gcctttatgt ttagtggagt tcatattgag gaccaatctc 4980

ctggcttgtt ttcaaaaatt attacatcta tatctggcca cttttataaa aatttggaat 5040

gtgtagtgat taagactgtg attcggacgg tgtgcaggat attgtgttat cttattttat 5100

attgccatag tccgaatctg ttaacaactg gggtcataat tgctctcatt tcaatggatg 5160

taacatcaat tgagattgat gccagggtca aggctgcatg tgagagtttg gctaatgggg 5220

agtttgctca attttgctca gacattattg acttgactgg tgatcctgat tacgtggatt 5280

tgaaatcaca catccctcaa tttaccaaca aaaattacac cttacagcgc ctccagcaag 5340

aagctataca cgggcagatt gagatggaga aaaagatggg cccattgagt ataaatgaac 5400

atccagataa ttgcgactgt tatttgtgtt ctgatttgaa aacctgtagt ggtaaagaag 5460

attgttattg cccaaaatgt aggaagcccc ataatcaggg ccctaaatca tttaacgatt 5520

ggacgactgc agcaaaaaat gtgaagtggt ggattgagag cttgatgaag tgttttgagt 5580

ggttgcgcga caagatcttt ccacaagatg ctgccaaaaa gatagccgaa ttagaactga 5640

ggtcagctga aatagctacc gttatggctt tggcagatga acacatttgc aagtgcagaa 5700

ccaataagaa ttatgttttg cataaggaca caccaaagaa acatgcagcc ttggttgatc 5760

ggctactctc attccatatt gatgaattgc cgtctcaatt atctcacttg caacaaaaat 5820

tgaataattt gctcactcga ctacaaaata taaacataga gccacctcta caatatgctc 5880

atcgagtgga accacttggt atatggatac agggtgctcc gggatgtggc aagtcttttc 5940

tcagtcatta tattgtgaag gaattacaaa agaggtatgg atgggaacca tattcacacc 6000

caataggaag tgaacacatg gatgggtaca ctgaccagga aatacacatt tttgatgatt 6060

tgggccagaa tcgagaagaa gaggatgttg gccttatgtg taatctcata tccagtgttc 6120

cattcatagt tccgaaggct gctttagaga gcaaaggatg ccagtataat ggaaaagtgg 6180

ttattgcaac aaccaataag agggatttta ccaccaataa gctgttagat tctggggcac 6240

tccagagaag gtttcccata atcttggaaa ttcgtcctcg cgagaagtac agaagggatg 6300

atgcatgtaa atggagcaaa ttcaatgccg ttaatgcaac aggtgatgga tcactaatga 6360

gaggtgagtg ttgggaaatt aatgttgatg caagaaatac tctgagaact agtgaacatt 6420

ggcaacattt gaatcctcaa aatttaatgg atgagatttt tcaggaaatt gactcgcgac 6480

tgaaagtctg taatttcatg aatcaaggaa aatgtaggat tactttagat tcagatgaac 6540

ccgacatgtt gagtgatatg tttccagaac caccaaaaaa taaagaaaaa tttgtgcaat 6600

atgtatcttc tgccattggc tcatttaagg aatttgtgga taggaatagg acttggtttg 6660

tagcagcagg tgctttgggg actataatat cattggcatc tataactatt ccctatgtta 6720

agaagtggat ggcaaaggac gctactgagg aggaaaattt ctatggtggt aaggttggtc 6780

ctttgcggct taaggattac aaacttcctt tgcataatca agggccctta gatatgaagt 6840

ccatttctaa attgctagtt actatcgaag atgaagatgg agatttggct actggattgg 6900

ctattggaga taagacagtg gtcacatttg gccatgagaa cttcaagaaa gttgtgtgct 6960

tcagagacac tgaggtaaac tgggaaatgg taaattccac acaaataaca ataaatggtg 7020

attccatgga tttgaggcag tatgatgtga agagtgatat acaatttaaa tcagtgaatc 7080

acaaaattta tggtgaagat tatcatggag atggatattt agtttggaaa gagatgaaac 7140

actatttgta tattcctgtc accaacatcc ggccaacatc aactattatc acccaacagg 7200

gaactaccac tcaacacaca tattcctacg tgggtaaaac atggagaggt ctgtgtgggg 7260

ccctgctggt tggtgtagtc aatggtaacc ctaagatttt gggaatacat gttgcaggaa 7320

ataagagttt gggaatggca gcccgactct ttcccatgtt caatcaaggg aaagcaaagg 7380

ttgttggacc aaatcccacc ccatactacc agcctcgcaa gactaaatat gagccatccc 7440

cagttcagca ggatgaaccg acattcggac cagctgtctt atccaataag gacaaaaggc 7500

ttgaggtaca aatagaggat ataactaaac atgcagctca gaagtacata ggtaatcatt 7560

ttgaccctcc taggggtgcg tttcagatgg ctaagagtca tgttactcaa ttgttgtctc 7620

aggttctaga ggtggaagat aatatgtctt ttgagcaggc tgtaacatct gatgtgctac 7680

ccattgattg gcaaacttct agtgggctca aatatatagg tttttccaag aagcagcttg 7740

ttcaaatgga atcattcaag gctgacgtcc ttaagatctt ggaaggtgga gagacattct 7800

ttacttgtta tctgaaagat gagttaagac ctaacgacaa agtggccatt ggtaaaacta 7860

gagctataga ggctgggaat tttgattatg tcattgcatg gaggatggtg atgggaaggt 7920

tgacagctag gctatttaat gattttgaca ggattactgg ctttgcacct ggactgaatc 7980

cctatgttta ctgggactca atgatggaga atgttaaaga gagtgtaatc ggattagact 8040

ttaaaaacta tgatggttcc ctatctcctc aagtcatgga ggctgcagtt gaggtcttag 8100

cctgcttcca taaacaacca gaacttgtta aattgatcca ttaccctact atatattcta 8160

ctaatttggt ttctgatgaa aagtggtttg ttgagggagg tatgtgttct ggatctccct 8220

gtaccacagt attaaataca attgtcaatc taattgttaa ctataccgtc atgtttgatt 8280

atgggtactc cccatcagag ttgtacatca ttgggtatgg agatgacaca gtaatttcag 8340

ctgataggaa ggttgcaatc tctgatattg ctagtaagta caagaaatat tttggaatga 8400

atgtgaccag tgctgccaaa acagatcaga ttggttggca accaaaggag aaattggagt 8460

tcttgaagcg atccactgct ctgtttcccc acacaacaaa aattgttggg aagttggacc 8520

tcaagaatat ggttggccat ttggattgga cttctggcac tttccaggag caattaaaca 8580

gcttttacct ggaactggtg cttcatggcc aagaaattta tgacaaggtt cgtaattaca 8640

atcagaaaaa ggcaccaagt tataatcact tgtcatttgg tgctgcttat gagatgatga 8700

agaccatctg ccttgtctat taatccaggg tctcggtgtt gcaggatacc ctggagttca 8760

cgtaaaacac ctgcctagca ccactagtta aatgggaccc ctctaccaga ggcaaaatgg 8820

tggaccatca ggtctgggtt gctgactagc aggctataat ctgtgccaaa cggattttta 8880

gtgtagtttt aatgattgtt taggataggt tttctttatt tgatcaaaga gagtggtgat 8940

ataaagacca gctcatcctc atttttcgag cttggaccct aagccacttg cttctctttc 9000

tttcattaaa tctaaacccc ccccccaaaa aaaaaaaaaa aa 9042

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 2

aagcaagtgg cttag 15

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 3

ccagcctcgc aagactaaat 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 4

cagaacacat acctccctca ac 22

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 5

gccaaggtca ctacaact 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 6

ctcacattac cctcataca 19

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 7

cattcggacc agctgtctta tc 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 8

gccactttgt cgttaggtct ta 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 9

tgggactcaa tgatggagaa tg 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 10

tgtttatgga agcaggctaa ga 22

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 11

tcaagtcatg gaggctgcag ttga 24

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 12

gagtctatcc cacccaacat ac 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 13

ctcctcaaca tctccgtctt c 21

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial）

<400> 14

tggcaatgca gcttgggtta gaga 24

Claims (8)

1.一种鸭蛋减产综合征病毒检测试剂盒，包含：针对鸭蛋减产综合征病毒SEQ ID NO：1所示基因序列设计的上游引物和下游引物，该上游引物和下游引物组成的引物对用于扩增SEQ ID NO：1所示基因序列中的基因片段，所述上游引物和下游引物包括下述引物对中的任意一对或两对以上组合：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，SEQID NO：7和SEQ ID NO：8。

2.根据权利要求1所述的鸭蛋减产综合征病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含探针，该探针与扩增出的基因片段相结合。

3.根据权利要求2所述的鸭蛋减产综合征病毒检测试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

4.根据权利要求2所述的鸭蛋减产综合征病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含下述引物对和探针：SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示引物对，SEQ ID NO：11所示探针。

5.根据权利要求2所述的鸭蛋减产综合征病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含下述引物对和探针：SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示引物对，SEQ ID NO：14所示探针。

6.根据权利要求1所述的鸭蛋减产综合征病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含发光染料。

7.根据权利要求1所述的鸭蛋减产综合征病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测鸭蛋减产综合征病毒的方法包括普通RT-PCR、套式RT-PCR、或荧光定量RT-PCR。

8.权利要求1-7任一项所述鸭蛋减产综合征病毒检测试剂盒在制备快速诊断鸭蛋减产综合征的产品中的应用。

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