CN110075115A - miR-337-3p过表达方案在预防治疗肌腱病及韧带骨化或钙化病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供miR‑337‑3p过表达方案在预防治疗肌腱病及韧带骨化或钙化病中的应用。本发明的miR‑337‑3p过表达方案在预防治疗肌腱病及韧带骨化或钙化病中的应用，能够抑制钙化肌腱基因表达，抑制肌腱及韧带组织钙化，并促进肌腱及韧带组织修复。

Description

miR-337-3p过表达方案在预防治疗肌腱病及韧带骨化或钙化 病中的应用

技术领域

本发明涉及一种miR-337-3p过表达方案在预防治疗肌腱病及韧带骨化或钙化病中的应用，属于生物医药领域。

背景技术

肌腱病(tendinopathy)是运动医学中的一类常见疾病，常发生于过度用力人群和老年人中。常见的肌腱病有跟腱病、肩袖损伤、冈上肌腱炎、网球肘等余种。在英国，一些医院的统计曾显示在肌肉骨骼系统疾病中的咨询比例高达30％，并且由于只有40％有肩痛的老年人(70岁以上)寻求治疗，这个比例实际可能更高。由于其常见于体育运动、日常运动和重复劳动中，随着我国全民健身意识的增强和对身体健康的关注，肌腱病的预防和治疗在我国也开始备受关注。中国运动员刘翔因为跟腱钙化肌导致跟腱撕裂而不得不退出2008年北京奥运会，从而对其运动事业造成严重影响。肌腱病的影响不仅在于著名的运动员，其他职业的个体也可能遭受肌腱病导致的活动能力和功能的下降。根据香港医院管理局统计，从2001到2011年，由于肌肉骨骼和连接组织疾病导致的住院率及死亡率增加了23％。由于中国人口老化问题，这个数字预计将继续增加。因此，肌腱病可以影响任何人，可能对一个人的日常活动和生活质量产生非常严重的影响。

类固醇药物和非固醇类抗炎药(NSAIDs)经常被使用减轻肌腱病的症状。运动损伤的治疗一般遵循PRICE原则——保护(Protection)，休息(Rest)，冰敷(Ice/cold)，压迫(Compression)和提高(Elevation)，但是依靠自身的恢复能力和控制炎性症状并不能从根本上控制和帮助治愈肌腱病。而且类固醇药物和非固醇类药物在长疗程的肌腱病治疗中反而起到了有害的作用。物理疗法如超声，激光和电子脉冲可以通过刺激纤维化和提高肌腱的生物力学性能，帮助修复肌腱。机械应力的刺激也可以通过加速肌腱细胞的代谢加快修复。反向训练(Eccentric training)即伸长肌肉的同时收缩肌肉的训练被提出用于治疗肌腱病如慢性跟腱，髌腱，侧肱骨上踝及肩袖肌腱病，并证明有较好的临床治疗效果。但是对于一些病情严重的如严重的钙化只能进行手术治疗，但术后存在不完全的恢复或复发。

韧带骨化或钙化是脊柱外科的常见病，包括前纵韧带、后纵韧带和黄韧带、项韧带等骨化或钙化等，韧带骨化多数与创伤、劳损、退变有关，肌腱和韧带都是非常致密的纤维结缔组织，两者的成分基本相同，我们的miR-337-3p过表达方案适用于预防治疗韧带骨化或钙化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过miR-337-3p过表达的方案在预防治疗肌腱病及韧带骨化或钙化中的应用，以防治肌腱、韧带钙化，恢复钙化性肌腱、韧带病中肌腱、韧带的形态和功能。

本发明采用了如下技术方案：

本发明提供miR-337-3p过表达的方案在预防治疗肌腱病及韧带骨化或钙化病中的应用。

进一步，本发明的应用，还具有这样的特征：其中，所述肌腱病及韧带骨化或钙化的发病生物为人及哺乳动物。

进一步，本发明的应用，还具有这样的特征：其中，所述肌腱病及韧带骨化或钙化的发病生物为人类。

进一步，本发明的应用，还具有这样的特征：其中，所述肌腱病及韧带骨化或钙化的发病生物为哺乳动物。

进一步，本发明的应用，还具有这样的特征：其中，所述miR-337-3p在体内过表达倍数为大于等于钙化肌腱及韧带组织表达量的5倍，可发挥过表达后的治疗作用。

进一步，本发明的应用，还具有这样的特征：其中，所述miR-337-3p过表达慢病毒的用量为10-100微升10⁹TU/mL。

进一步，本发明的应用，还具有这样的特征：其中，所述miR-337-3p过表达慢病毒的用量为50微升10⁹TU/mL。

发明的有益效果

本发明的miR-337-3p过表达方案在预防治疗肌腱病及韧带骨化或钙化中的应用，能够达到防治肌腱及韧带组织钙化，抑制肌腱及韧带钙化基因表达，促进肌腱及韧带组织修复。

附图说明

图1 miR-337-3p过表达方案防治钙化性肌腱病大鼠模型实验示意图

图2 SD大鼠膝关节被处理8周，12周和16周后的X光片(图注：红色星标表示在髌腱处形成的异位骨化。标尺，5mm。)

图3偏正光显微镜观察天狼星红染色后每组髌腱切片的胶原蛋白排列(图注：左边栏为完整的髌腱图片。右边栏为放大的髌腱图片。左侧标尺，800μm。右侧标尺，200μm。)

图4治疗后各个时间点每组样本切片H&E染色及免疫组化检测成软骨—成骨基因和成肌腱基因，

其中，图4(A)为8周后收集的样本，图4(B)为12周后收集的样本，图4(C)为16周后收集的样本。标尺，50μm。

具体实施方式

以下通过具体实施方式来详细说明本发明的技术方案。

一、材料与方法

1.动物

8周龄雄性SD大鼠

2.实验试剂

miR-337-3p过表达的慢病毒(吉玛生物(上海，中国))

Anti-Osteopontin抗体(ab8448)(Abcam(CA,UK))

Anti-Sox9抗体(ab26414)(Abcam(CA,UK))

Anti-Type II collagen抗体(ab34712)(Abcam(CA,UK))

Anti-TenC抗体(3118-1)(Epitomics(CA,USA))

天狼星红染色液(雷根生物(北京，中国))

免疫组化试剂盒(迈新(福州，中国))

DAB Kit(迈新(福州，中国))

3.实验仪器

正置显微镜Nikon(Japan)

偏振光显微镜Olympus(Japan)

小动物X-ray机Faxitron(USA)

4.后续实施方式中所涉及的试验方法

4.1肌腱钙化动物模型的建立与治疗

肌腱钙化动物模型使用的是由I型胶原酶诱导的大鼠肌腱病模型。

1)实验动物分组：

8周龄的大鼠分为四种处理组，对每只大鼠的两条后腿分别进行两种处理，以节约实验大鼠数量。

①假手术对照组(Mock)：只对其髌腱注射与其他组等量的生理盐水溶液。

②肌腱病组(Collagenase I)：左腿髌腱注射20μl用生理盐水溶解的0.015mg/ml的I型胶原酶。

③治疗对照组(Collagenase I+NC lentivirus)：在注射I型胶原酶三天后再对髌腱注射50μl 10⁹TU/mL的对照慢病毒。

④治疗组(Collagenase I+miR-337-3p lentivirus)：在注射I型胶原酶三天后再对髌腱注射50μl 10⁹T U/mL的miR-337-3p过表达慢病毒。

①、④分别处理同一只大鼠的左右后腿，②、③分别处理同一只大鼠的左右后腿。肌腱病中肌腱钙化分子机制及腱骨结合处断裂修复的研究

2)手术过程：

①雄性SD大鼠(200-250g)按体重比例0.6mL/100g腹腔注射5％水合氯醛；

②麻醉后，剃除膝盖出被毛，大鼠仰卧位固定，用碘酒擦拭膝关节处皮肤。

③在无菌条件下纵向剪开膝关节处皮肤，暴露髌腱。

④对相应组做出对应处理(见实验动物分组)。

⑤手术丝线缝合皮肤，碘酒擦拭消毒。

3)取样：

处理完成后的8周，12周，16周，大鼠通过麻醉过量致死后取样，进行肌腱钙化各项指标的检测。

4.2大鼠X-ray检测膝关节

将手术后8周的大鼠用麻醉后，用小动物X-ray检测仪，对其膝关节进行拍摄，观察是否存在钙化。

4.3天狼星红染色及偏正光观察

切片脱蜡至水后，滴加天狼星红染料，避光，室温染1小时，水洗3次，苏木素复染，脱水后封片。

4.4组织学及免疫组化

4.4.1石蜡包埋及切片

1)固定：将取材的髌腱样本固定于4％多聚甲醛中，室温放置12h以上，不超过24h。确保有足够的固定液覆盖组织，固定液体积约为组织体积的5-10倍。

2)冲洗：将固定好的标本置于包埋框中，流水冲洗过夜，去除多余的固定液。

3)脱水：按以下程序进行梯度脱水

80％酒精一次，每次2小时。

95％酒精三次，每次2小时。

100％酒精两次，每次1小时。

4)透明：二甲苯两次，每次15分钟。

5)浸蜡：将标本按以下程序浸于60℃石蜡中

石蜡Ⅰ，15分钟

石蜡Ⅱ，30分钟

石蜡Ⅲ，2小时

石蜡Ⅳ，过夜

6)包埋与切片：常规方法包埋后，切片厚度8μm并转移到45℃水浴锅中。用

载玻片捞起切片，37℃过夜烤干。

4.4.2切片脱蜡及水化

1)在二甲苯中脱蜡两次，每次10分钟。

2)100％酒精两次，每次5分钟。

3)95％酒精两次，每次5分钟。

4)85％酒精一次，每次5分钟。

5)75％酒精中放置5分钟，之后浸于双蒸水中。

4.4.3 H&E染色

1)石蜡切片常规脱蜡水化。

2)自来水冲洗30秒。

3)苏木精染液3min，自来水涮洗。

4)1％盐酸酒精分化(100ml 75％乙醇+1ml浓盐酸)(3－5s，切片由深蓝变色即应中止分化)。

5)流水冲洗10min，返蓝。

6)伊红染色2－3min，自来水涮洗。

7)自来水冲洗1分钟，去除多余的番红染液。

8)脱水：75％乙醇1min，85％乙醇1min，95％乙醇I 2min，95％乙醇II 2min，100％乙醇I 2min，100％乙醇II 2min。

9)二甲苯透明5分钟，2次。

10)中性树胶封固(避免产生气泡)，通风橱柜中吹风干燥。

4.4.4免疫组化

1)石蜡切片常规脱蜡和水化后，PBST(PBS中加入Tween-20至终浓度为0.1％)洗涤三次，每次3分钟。

2)用无尘纸巾吸除组织周围的水分，根据不同抗体的要求，对组织抗原进行相应修复。

3)每张切片滴加足够的3％H2O2溶液(30％H2O2和甲醇按照1：9的比例配制)，室温下孵育10分钟，以阻断组织内内源性的过氧化物酶的活性。PBST洗涤三次，每次5分钟。

4)去除组织周围水分，用免疫组化笔在组织周围画圈。5％山羊血清室温封闭30分钟，血清用PBST稀释。

5)去除封闭液，按1:200用2.5％山羊血清稀释一抗OPN，Sox9，Type II collagen，TenC，IRS1和Nox4，。每张切片加50μl一抗，4℃过夜。

6)去除一抗，PBST洗涤三次，每次5分钟。每张切片加1滴多聚酶结合物(迈新免疫组化试剂盒二抗)，室温孵育15分钟。

7)去除二抗，PBST洗涤三次，每次5分钟。每张切片加50μl新鲜配制的DAB溶液，室温放置3-5分钟。

8)去除多余的DAB溶液，自来水稍冲洗，苏木素复染10秒，自来水冲洗返蓝后，用1％盐酸酒精分化1秒。

9)自来水冲洗返蓝，95％乙醇脱水5分钟，2次。

10)100％乙醇脱水5分钟，2次。

11)二甲苯透明5分钟，2次。

12)中性树胶封固。

实施例一

钙化性肌腱病大鼠模型的建立及miR-337-3p过表达慢病毒注射髌腱

通过构建I型胶原酶诱导的大鼠肌腱病模型来模拟肌腱病的肌腱钙化，检测miR-337-3p在肌腱钙化治疗中的应用效果。I型胶原酶注射肌腱组织诱导的大鼠肌腱病是一种比较成熟，常见的诱导肌腱病形成的方法，并伴随肌腱处软骨和骨的增生。通过该动物模型建立钙化性肌腱病大鼠模型。miR-337-3p过表达慢病毒治疗I型胶原酶诱导的大鼠肌腱病的实验设计如图1所示。基于减少实验动物的使用，并不影响实验分组的结果的基础，将8周龄的大鼠分为两组，一组的左腿作为假手术对照组(Mock)，只对其髌腱注射与其他组等量的生理盐水溶液。另一组的左腿则注射20微升用生理盐水溶解的0.015mg/ml的I型胶原酶(Collagenase I)作为肌腱病组。Mock组相对的另一条腿注射I型胶原酶后三天后再注射10微升10⁹TU/mL的miR-337-3p过表达慢病毒(CollagenaseI+miR-337-3p lentivirus)作为治疗组。同时肌腱病组大鼠的另一条腿在注射I型胶原酶后三天再注射10微升对照慢病毒(Collagenase I+NC lentivirus)，作为治疗组的对照。在之后的8周，12周，16周分别取样，进行肌腱钙化各项指标的检测。检测结果表明miR-337-3p过表达慢病毒组能够减轻肌腱钙化。且8周时取对照组与治疗组肌腱进行RNA检测，可见miR-337-3p在治疗组的表达量中为肌腱病对照组的5倍以上，见图5。

实施例二

钙化性肌腱病大鼠模型的建立及miR-337-3p过表达慢病毒注射髌腱

基于减少实验动物的使用，并不影响实验分组的结果的基础，将8周龄的大鼠分为两组，一组的左腿作为假手术对照组(Mock)，只对其髌腱注射与其他组等量的生理盐水溶液。另一组的左腿则注射20微升用生理盐水溶解的0.015mg/ml的I型胶原酶(CollagenaseI)作为肌腱病组。Mock组相对的另一条腿注射I型胶原酶后三天后再注射50微升10⁹TU/mL的miR-337-3p过表达慢病毒(Collagenase I+miR-337-3p lentivirus)作为治疗组。同时肌腱病组大鼠的另一条腿在注射I型胶原酶后三天再注射50微升对照慢病毒(CollagenaseI+NC lentivirus)，作为治疗组的对照。在之后的8周，12周，16周分别取样，进行肌腱钙化各项指标的检测。

过表达miR-337-3p慢病毒对钙化性肌腱病大鼠模型治疗的X光检测

在治疗8周，12周，16周后，分别将大鼠麻醉后用X光检测膝关节髌腱处异位骨化的情况。未处理组(Untreated)和假手术对照组(Mock)的髌腱都很正常，完全没有异位骨化的情况(图2)。在肌腱病组(Collagenase I)和治疗对照组(Col+NC)在三个时间点都有不同程度的异位骨化，如图2中星标处所示。随着时间的延长，异位骨化的情况越严重。而在miR-337-3p过表达慢病的治疗组(Col+miR-337-3p)中，如图2所示，在8周的时候，还有少量异位骨化现象，但是12周和16周时，异位骨化现象消失。并且8周时，治疗组的异位骨化程度也比肌腱病组和治疗对照组的小很多。说明了过表达miR-337-3p对I型胶原酶诱导的大鼠肌腱病模型中异位骨化有良好的治疗效果。

图2是SD大鼠膝关节被处理8周，12周和16周后的X光片。图中：红色星标表示在髌腱处形成的异位骨化。标尺，5mm。

过表达miR-337-3p慢病毒对钙化性肌腱病大鼠模型治疗的胶原纤维检测

胶原纤维的含量和排列也是检测肌腱病严重程度的一项重要指标。将三个时间点收集的大鼠髌腱样本切片用天狼星红染色后在偏正光显微镜下观察胶原纤维的排列。如图3所示，与假手术对照组相比，红色的I型胶原在肌腱病组和治疗对照组中都有显著减少，从右侧放大图可以看出这两个组I型胶原的排列也很紊乱。而在治疗组中，如图3所示，I型胶原的数量显著增加，在16周时已经达到了与假手术对照组相似的程度，并且I型胶原的排列也很有规律，达到了正常的水平。说明了miR-337-3p对I型胶原酶诱导的大鼠肌腱病模型中I型胶原的含量和胶原纤维的排列有很好的促进恢复的作用。

图3偏正光显微镜观察天狼星红染色后每组髌腱切片的胶原蛋白排列，图注：左边栏为完整的髌腱图片。右边栏为放大的髌腱图片。左侧标尺，800μm。右侧标尺，200μm。

过表达miR-337-3p慢病毒对钙化性肌腱病大鼠模型治疗的组织病理学检测

对三个时间点收集的大鼠髌腱样本切片进行H&E染色和免疫组化观察髌腱组织细胞形态和miR-337-3p靶基因及分化相关基因的表达情况。如图4B所示，以12周收集的样本为例，H&E染色可以观察到在肌腱病组中有很多非规律性排列的新增殖细胞，而在治疗组中这样的新增殖细胞变少，细胞的排列也更有规律，沿着肌腱组织的方向排列。如图4B所示，在肌腱病组和治疗对照组中，成软骨基因Sox9，TypeⅡCollagen和成骨基因OPN表达都显著增加，成肌腱基因TenC的表达减少，在分子水平上显示了肌腱病成软骨—成骨分化的特征。同时miR-337-3p的靶基因在这两个组中的表达也同步增加，从侧面验证了认为miR-337-3p的减少促进肌腱病发生的推测。而相比之下，在治疗组中不但Sox9，TypeⅡCollagen和OPN的表达都降低到正常水平，TenC的表达甚至高于假手术对照组(图4B)，在分子水平上说明了miR-337-3p对肌腱钙化的治疗的作用。如图4A和4C所示，观察8周和16周的结果，基本上可以得到相同的结论。值得注意的是，如图4所示，16周时，Sox9在手术组和治疗对照组中的表达没有之前8周和12周时那么强烈，这可能与Sox9表达的时间顺序有关，Sox9作为一个早期促成软骨分化的转录因子，在成软骨—成骨分化后期的表达会逐渐减弱，从而更利于骨化的发展。

图4是治疗后各个时间点每组样本切片H&E染色及免疫组化检测成软骨—成骨基因，成肌腱基因，图4(A)为8周后收集的样本，图4(B)为12周后收集的样本，图4(C)为16周后收集的样本。标尺为50μm。

实施例三

钙化性肌腱病大鼠模型的建立及miR-337-3p过表达慢病毒注射髌腱

基于减少实验动物的使用，并不影响实验分组的结果的基础，将8周龄的大鼠分为两组，一组的左腿作为假手术对照组(Mock)，只对其髌腱注射与其他组等量的生理盐水溶液。另一组的左腿则注射20微升用生理盐水溶解的0.015mg/ml的I型胶原酶(CollagenaseI)作为肌腱病组。Mock组相对的另一条腿注射I型胶原酶后三天后再注射100微升10⁹TU/mL的miR-337-3p过表达慢病毒(Collagenase I+miR-337-3p lentivirus)作为治疗组。同时肌腱病组大鼠的另一条腿在注射I型胶原酶后三天再注射100微升对照慢病毒(Collagenase I+NC lentivirus)，作为治疗组的对照。在之后的8周，12周，16周分别取样，进行肌腱钙化各项指标的检测。检测结果表明miR-337-3p过表达慢病毒组能够减轻肌腱钙化。

Claims (7)

1.miR-337-3p过表达方案在预防治疗肌腱病及韧带骨化或钙化病中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：

其中，所述肌腱病及韧带骨化或钙化病的发病生物为人及哺乳动物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：

其中，所述肌腱病及韧带骨化或钙化病的发病生物为人类。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：

其中，所述肌腱病及韧带骨化或钙化病的发病生物为哺乳动物。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于：

其中，所述miR-337-3p在体内过表达倍数为大于等于钙化肌腱组织或钙化韧带组织表达量的5倍。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：

其中，所述miR-337-3p过表达慢病毒的用量为50微升10⁹TU/mL。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于：

其中，所述miR-337-3p过表达慢病毒的用量为10-100微升10⁹TU/mL。