JP2021502999A - 鎮痛活性を有するポリペプチドおよびその応用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、鎮痛活性を有するポリペプチドおよびその応用を開示し、生物医学分野に属する。本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸配列Ｘａ−Ｘｂ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｘｅ、またはその薬学的に許容される塩を有し、ＸａはＧｌｙまたは欠失で、ＸｂはＳｅｒまたはＬｙｓのいずれかであり、Ｘｃはｄ−ＣｙｓまたはＳｅｒまたはＡｓｐのいずれかで、ＸｄはＡｌａまたは欠失であり、ＸｅはＣｙｓまたはＳｅｒである。配列における２つのシステインの間で、１対のジスルフィド結合が形成され、これは、物理的および化学的刺激、病理学的および神経障害性疼痛に対して良好な抑制効果を有し、各実験モデルでの鎮痛効果が良好であり、具体的には、マウスの疼痛閾値を有意に増加させ、マウスの高温に耐える時間を延長し、マウスの自発運動や興奮性などの有害作用がいずれも正常値よりも低いという効果を示す。【選択図】なし
Description
本発明は、生物医薬品の分野に属し、より具体的には、鎮痛活性を有するポリペプチドおよびその応用に関する。
痛み発生プロセスは複雑であり、侵害受容器、伝達神経、疼痛の中枢などの要因が関与している。痛みを引き起こす主な原因は次のとおりである。（１）一連の外部の機械的刺激および炎症反応に伴う組織の局所浮腫は、神経終末を圧迫して痛みを引き起こす。（２）物理的および化学的刺激は、感覚ニューロンを介して疼痛の中枢を興奮させ、痛みを引き起こす。（３）末梢神経への病理学的損傷は交感神経線維を刺激し、最終的に大脳皮質の過度の興奮を刺激し、神経障害性疼痛を引き起こす。（４）生体が外部から刺激を受けると、損傷した細胞または侵害受容器によって放出される発痛物質が局所的な受容器を刺激し、中枢神経系を興奮させて痛みを引き起す。
初期の鎮痛剤は、非ステロイド類（アスピリン）、オピオイド受容体類（コノトキシン）、他の補助鎮痛剤（抗けいれん薬）に大別できる。それらは、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症に良い効果があるが、制限性や副作用は常にボトルネックの問題であり、あまり改善されていない。例えば、アスピリンは人間の循環器系、特に消化器系および造血系に大きなダメージを与え、コノトキシンは重度の中毒性、耐性、呼吸困難などの一連の有害作用があり、抗けいれん薬のアレルギーおよび副作用もあまり改善されていない。新しいターゲットに対する鎮痛剤を見つけたり、新しい構造の化合物を創製して最適化したりすることは、製薬業界の労働者が緊急に解決すべき問題である。従来の鎮痛剤と比較して、イオンチャネルに作用する鎮痛ポリペプチドは、その幅広い供給源、小さな毒性と副作用、長い半減期、および明らかな効果などの特性により、研究者に新しい光をもたらした。生体膜イオンチャネル（ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｏｆ ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ）は、細胞膜の脂質二重層を貫通し、かつ中央に親水性の孔を有する膜タンパク質の一種であり、神経、骨格筋、心筋細胞などにおける生体電気の生成の基盤となっている。このチャネルは、受容器の電位発生、神経興奮伝導や中枢神経系調節などの様々な生命活動と密接に関連し、かつ高い選択性を伴っている。特定の生体膜イオンチャネルにより、１つまたはいくつかの特定のイオンのみが高張になり、よって、ナトリウムイオンチャネル、カリウムイオンチャネル、カルシウムイオンチャネルや酸感受性イオンチャネルなどに分けることができる。一般的にＣａ２＋イオンとＫ＋イオンは細胞膜の内外でバランスを取り、中枢内のカリウムイオンとナトリウムイオンの濃度を調整することで、ニューロンの興奮性を抑えることができ、これは中枢神経系が中枢神経の鎮痛効果を発揮するメカニズムでもある。一方で、Ｎａ＋イオンチャネルの活性は、痛覚衝動の形成と伝達を決定し、多くの鎮痛剤は、電位依存性ナトリウムイオンチャネルを抑制することにより、痛覚興奮経路を遮断する。近年来、痛みの分子メカニズムに関する研究の深化とともに、研究者たちは、イオンチャネルの構造変化と生体が痛みを生み出すかどうかということが密接に関連しており、ここで、ナトリウムイオンチャネル（ＮａＶ）が最も重要な役割を果たすことを発見した。現代の分子生物学の研究により、このサブタイプＮａＶ１．７は、痛みを治療する新しいターゲットとして、正常な生理学的機能を発揮すると、興奮性細胞を脱分極させ、信号分子を灰白質後角からシナプスを介して侵害受容器に伝達し、最終的に生体に疼痛を発生せることができる、ということが示されている。動物毒素には、イオンチャネルに作用するポリペプチドがたくさんあり、開発の余地が大きい。徹底的に研究されているいくつかのポリペプチド構造には、Ｓｃｏｒｏｐｅｎｄｒａ ｓｕｂｓｐｉｎｉｐｅｓ ｍｕｔｉｌａｎｓから抽出されたμ−ＳＬＰＴＸＳｓｍ６ａ、Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓｉｉから抽出されたＢｍＫＡＧＡＰ、Ｏｒｎｉｔｈｏｃｔｏｎｕｓ ｈｕｗｅｎａから抽出されたＨＷＴＸ−Ｉ、ブラックマンバヘビから抽出されたＭａｍｂａｌｇｉｎｓなどが含まれる。
コノトキシンポリペプチドの研究は常にこの分野のホストポットであり、例えば、中国特許出願番号が２０１４８００８２２８３．７、出願公開日が２０１７年５月３１日である特許文献にはコノトキシンポリペプチドκ−ＣＰＴｘ−ｂｔ１０５、その製造方法および応用が開示されている。前記コノトキシンポリペプチドは１６個のアミノ酸で構成され、分子量が１６２６．６２ダルトンで、全配列がＧＩＣＣＶＤＤＴＣＴＴＨＳＧＣＬである。前記コノトキシンポリペプチドは、カリウムイオンチャネル電流に対する抑制効果と鎮痛効果を有する。しかしながら、巻貝からコノトキシンポリペプチドを抽出する現在の方法は比較的複雑であり、しかもコノトキシンポリペプチドに特定の副作用があり、身体的および精神的依存が深刻となる。
既存のコノトキシンポリペプチドの副作用を考慮して、本発明は、鎮痛活性を有するポリペプチドおよびその応用を提供し、コノトキシンと比較して構造安定性および鎮痛活性が大幅に改善され、生体の損傷などの有害作用が弱い。
上記の課題を解決するために、本発明で採用される技術的解決手段は次のとおりである。
鎮痛活性を有するポリペプチド、またはその薬学的に許容される塩を提供し、そのうち、前記ポリペプチドは、アミノ酸配列Ｘａ−Ｘｂ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｘｅを有する。
鎮痛活性を有するポリペプチド、またはその薬学的に許容される塩を提供し、そのうち、前記ポリペプチドは、アミノ酸配列Ｘａ−Ｘｂ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｘｅを有する。
さらに、前記のＸａはＧｌｙまたは欠失で、前記のＸｂはＳｅｒまたはＬｙｓのいずれかであり、前記のＸｃはｄ−ＣｙｓまたはＳｅｒまたはＡｓｐのいずれかで、前記のＸｄはＡｌａまたは欠失であり、前記のＸｅはＣｙｓまたはＳｅｒである。
さらに、前記のポリペプチドアミノ酸配列は、
ポリペプチドＩ：Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ｄ｛Ｃｙｓ｝−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ、
ポリペプチドＩＩ：Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ、または
ポリペプチドＩＩＩ：Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓである。
さらに、前記の各ポリペプチド配列における２つのシステインの間で、１対のジスルフィド結合が形成される。
さらに、鎮痛効果を有するポリペプチド、または当該ポリペプチドの薬学的に許容される塩を提供し、そのうち、前記ポリペプチドは、上記の配列に基づいて１つ以上のアミノ酸を削除、置換または添加することによって得られる配列を有する。
痛みを予防および／または治療するための製品の製造における上記のポリペプチドの応用である。
痛みを予防および／または治療するための製品であって、その有効成分は上記のポリペプチドである。
上記の製品は具体的には薬物であり得る。
必要に応じて、上記の薬物に１つ以上の薬学的に許容される補助材料を添加することができ、前記補助材料は、製薬分野における一般的な希釈剤、賦形剤、充填剤、接着剤、湿潤剤、吸収促進剤、界面活性剤、潤滑剤や安定剤などを含む。
本発明の薬物は、注射剤、乾燥粉末注射剤、錠剤または顆粒剤などの様々な形態として製造することができる。上記の様々な剤形の薬物はすべて、製薬分野における従来の方法に従って製造することができる。
さらに、前記の痛みは、物理的および化学的刺激、病理学的または神経障害性疼痛を含む。
現在の臨床では、抗炎症鎮痛剤およびオピオイド鎮痛剤を主とする。抗炎症鎮痛剤は臨床で、主に頭痛、歯痛、筋肉および関節痛、月経困難症などの慢性鈍痛に使用され、これらの薬物は中毒になりにくく、臨床診療で広く使用される。オピオイド鎮痛剤（麻薬性鎮痛薬）は、痛みを解消または軽減し、痛みに対する感情的反応を変化させることができる薬物であるが、便秘、眠気、感覚鈍麻、吐き気、嘔吐、呼吸抑制や依存性などの特定の副作用があり、身体的および精神的依存が深刻となるため、その広範な臨床応用が厳しく制限される。麻薬性鎮痛剤に加えて、中枢神経系に作用する多くの薬物、例えば、抗うつ薬、抗けいれん薬、神経遮断薬などは、痛みを制御するために応用され、ある程度、直接的な鎮痛効果または潜在的な鎮痛活性を有するが、副作用は用量の増加に伴ってより深刻になる。例えば、アスピリンは人間の循環器系、特に消化器系および造血系に大きなダメージを与え、コノトキシンは重度の中毒性、耐性、呼吸困難などの一連の有害作用があり、抗けいれん薬のアレルギーおよび副作用もあまり改善されていない。従って、本発明は、コンピュータ三次元シミュレーション技術を利用して、多数の伝統的な構造への分析および薬理学的実験に基づいて、独立して設計されたポリペプチド構造がより強い鎮痛活性およびより低い中毒性副作用を有するものである。本発明では、既存の様々な鎮痛ポリペプチド構造を分析することにより、三次元構造を利用して、イオンチャネルに作用する完全に新しい構造の鎮痛ポリペプチドを独立して設計した。様々な実験モデルにより、コノトキシンと同じ鎮痛効果を有し、かつ耐性などの有害作用が低く、開発の見通しが高いことが検証される。
従来技術と比較して、本発明の有益な効果は次のとおりである。
（１）本発明のポリペプチドは簡単な構造を有し、合成、分離および精製が容易であり、コノトキシンの鎮痛活性を効果的に保持および改善する。
（２）本発明のポリペプチドは有害作用および中毒性副反応が弱い。
（３）本発明に係るポリペプチドは、各実験モデルでの鎮痛効果が良好であり、具体的には、マウスの疼痛閾値を有意に増加させ、マウスの高温に耐える時間を延長し、マウスの自発運動や興奮性などの有害作用がいずれも正常値よりも低いという効果を示す。
以下、具体的な実施例と組み合わせて、本発明をさらに説明する。以下の説明は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明を他の形態で限定するものではなく、当業者であれば、上記に開示した技術的内容を利用して同等に変化する等価実施例に変更することができる。本発明の解決手段の内容から逸脱することなく、本発明の技術的本質に基づいて以下の実施例に対して行われたあらゆる簡単な修飾または同等の変更は、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。
本発明は、鎮痛活性を有するポリペプチド、または当該ポリペプチドの薬学的に許容される塩に関し、そのうち、前記ポリペプチドのコア構造はアミノ酸配列Ｘａ−Ｘｂ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｘｅを有し、ここで、ＸａはＧｌｙまたは欠失であり、ＸｂはＳｅｒまたはＬｙｓのいずれかであり、Ｘｃはｄ−ＣｙｓまたはＳｅｒまたはＡｓｐのいずれかであり、ＸｄはＡｌａまたは欠失であり、ＸｅはＣｙｓまたはＳｅｒであり得る。具体的には、このようなポリペプチドのアミノ酸配列は、
ポリペプチドＩ：Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ｄ｛Ｃｙｓ｝−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ、
ポリペプチドＩＩ：Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ、または
ポリペプチドＩＩＩ：Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓである。
または、鎮痛効果を有するポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、上記の配列に基づいて、１つ以上のアミノ酸を削除、置換または添加することにより得られる配列を有する。配列における２つのシステインの間で、１対のジスルフィド結合が形成され、このようなポリペプチドは、物理的および化学的刺激、病理学的および神経障害性疼痛に対して良好な抑制効果を有する。
実施例では、主に、当該ポリペプチドＩ、ポリペプチドＩＩおよびポリペプチドＩＩＩを対象として、その鎮痛活性を研究する。当該ポリペプチドの合成は南京ゲンスクリプトバイオテック有限公司に委託され、純度は９５％以上である。
鎮痛ホットプレート実験における鎮痛ポリペプチドの痛みへの抑制効果
体重２０±２ｇの昆明メスマウスを用意する。室内温度は２２〜２５℃に維持される。５５℃の恒温金属板にマウスを置き、一定の温度（±０．５℃以内で変化）で、マウスが金属板に触れた時刻から、それが後ろ足をなめるかジャンプするまでの時間を疼痛閾値の指標とする。
１．実験動物：昆明メスマウス
実験用マウスのケージ換気システムにおいてマウスを飼育する。飼育温度は約２３℃であり、正常な昼夜交替で生かせる。すべての実験動物は自由に摂食する。購入した実験動物は、実験環境に適応するように本実験室で３〜５日間飼育する。すべての動物実験は８：００〜１８：００で行われ、実験動物は手術後、いずれも単一のケージで飼育する。
２．実験装置：電子天秤、ホットプレートテスター、ケージ換気システム、１ｍＬのシリンジ、Ｕｌｔｒａ超純水システム
３．実験試薬：コノトキシン、０．９％のＮａＣｌ溶液、ポリペプチドＩ、ポリペプチドＩＩ、ポリペプチドＩＩＩ。
本発明で使用されるコノトキシンポリペプチド（タイピングがＢｕＩＡである）構造はＧｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓであり、そのうち、Ｃ１−Ｃ３は環を形成し、Ｃ２−Ｃ４は環を形成する。
４．実験方法：実験の前に基本疼痛閾値を測定し、２回測定して平均値を計算し、測定する場合、５分間の間隔をあける。反応潜時が５ｓ未満または３０ｓを超えるマウスを除外する。マウスの足のやけどを防ぐために、カットオフ時間を６０ｓに設定する。適格なマウスを、乱数表に従って、陰性対照群、陽性対照群およびコノトキシン群に分け、群当たり１０匹とする。
合計で、生理食塩水、コノトキシン、ポリペプチドＩ、ポリペプチドＩＩおよびポリペプチドＩＩＩの５群があり、群当たり１０匹とする。そのうち、生理食塩水群は０．９％ のＮａＣｌ溶液で、陰性対照群として使用され、コノトキシン群は用量が１ μｇ／ｋｇで、陽性対照群として使用され、ポリペプチド群は実験群として投与され、投与量はすべて２ ｎｍｏｌ／ｋｇとする。投与方法は腹腔内注射である。
投与後の１５、３０、４５、６０、７５、９０ ｍｉｎで、それぞれマウスの疼痛閾値を記録し、実験は独立して３回繰り返され、結果は−ｘ±Ｓで表され、かつ統計的Ｔ検定を実行し、生理食塩水の陰性群と比較して、＊Ｐ＜０．０５の場合は有意差があることを表し、＊＊Ｐ＜０．０１の場合は有意差が非常に高いことを表し、コノトキシンの陽性群と比較して、＾Ｐ＜０．０５の場合は有意差があることを表し、＾＾Ｐ＜０．０１の場合は有意差が非常に高いことを表す。投与前後のホットプレートに対するマウスの耐性時間の変化を各群内で比較し、各群のマウスの疼痛閾値を群間で比較する。投与後の可能な最大鎮痛率を計算し、薬物の鎮痛効果を評価する。
注：生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、コノトキシンの陽性対照群と比較して、＾Ｐ＜０．０５、＾＾Ｐ＜０．０１である
５．実験結果：
５．１マウスの熱閾値の検出結果
ポリペプチド群はホットプレート鎮痛動物モデルでいずれも鎮痛効果を発揮でき、結果を表１に示し、生理食塩水の陰性群と比較して、ポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩ群はいずれもマウスの熱閾値を効果的に高めることができる。ポリペプチドＩＩの疼痛閾値の増加レベルは、生理食塩水群およびコノトキシン群よりも明らかに高い。実験結果は統計的有意性がある。
５．２ＰＭＡＰ評価結果
ＰＡＭＰは約４７．５７％と計算されており、コノトキシン群と比較して鎮痛効果に大きな差はなく、優れた鎮痛効果を有する。
熱放射テールフリック実験における痛みに対する鎮痛ポリペプチドの抑制効果
体重２０±２ｇの昆明マウスは、メスとオスを半々にする。室内温度は２２−２５℃に維持される。小型スポットライトで特定の強度のビームを生成し、痛みを引き起こすためにレンズを通してマウスの尾に集光照射する。実験中、マウスの尾をテールフリック式痛覚測定装置のテールスロットに置き、光点をマウスの尾の中間下部の３分の１の部位に当てるようにし（実験の前に、ペンで色を塗ってマークし、毎回同じ位置で痛みを測定するようにする）、熱放射の開始からテールフリック反応の出現までの潜時（ＴＦＬ、Ｔａｉｌ Ｆｌｉｃｋ Ｌａｔｅｎｃｙ）を痛み反応の指標とする。
投与前に、まず、すべてのマウスの基本疼痛閾値を測定し、反応潜時が１ｓ未満または３ｓを超えるマウスを除外し、マウスの尾のやけどを防ぐために、カットオフ時間を１０ｓに設定する。基本疼痛閾値が基準を満たしているマウスは、乱数表に従って、陰性対照群、陽性対照群、コノトキシン群に分けられ、群当たり１０匹とする。
生理食塩水、コノトキシン、ポリペプチドＩ、ポリペプチドＩＩおよびポリペプチドＩＩＩ群として、群当たり１０匹とする。そのうち、生理食塩水群は陰性対照群として使用され、コノトキシン群は用量が１ μｇ／ｋｇで、陽性対照群として使用され、ポリペプチド群の投与量はすべて２ ｎｍｏｌ／ｋｇである。投与方法は側脳室への投与である。
投与後の５、１５、３０、４５、６０、９０、１２０ ｍｉｎで、それぞれ疼痛閾値を記録し、結果は−ｘ±Ｓで表され、投与前後の熱放射に対するマウスの耐性時間の変化を群内で比較し、各群のマウスの疼痛閾値を群間で比較する。投与後の疼痛閾値の増加率を計算し、薬物の鎮痛効果を評価する。
注：生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、コノトキシンの陽性対照群と比較して、＾Ｐ＜０．０５、＾＾Ｐ＜０．０１である
実験結果：
１．マウスの熱閾値の検出結果
ポリペプチド群はマウスの熱放射テールフリック動物モデルでいずれも鎮痛効果を発揮でき、結果を表２に示し、生理食塩水の陰性群と比較して、ポリペプチド群はいずれもマウスの熱閾値を効果的に高めることができる。ある時間帯で、ポリペプチドＩは２ ｎｍｏｌ／ｋｇの用量でコノトキシン群と非常に高度な有意差（＾＾Ｐ＜０．０１）を比較し、ある時間帯で、ポリペプチドＩＩＩは２ ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で生理食塩水群と非常に高度な有意差（＊＊Ｐ＜０．０１）を比較する。実験結果は統計的有意性がある。
２．ＰＭＡＰ評価結果
ＰＡＭＰは約３８．３２％と計算されており、コノトキシン群と比較して鎮痛効果に大きな差はなく、優れた鎮痛効果を有する。
オープンフィールド実験におけるマウスの自発活動と探索行動に対する鎮痛ポリペプチドの影響と作用
１．材料と方法
１．１実験動物
昆明メスマウスは６０匹とする。
飼育条件：室温（２３±１）℃、湿度（５０±５）％、蛍光灯で照明し、明暗サイクル１２／１２（照明時間が７：００〜１９：００）とし、動物は自由に摂食する。
１．２実験器械
コンピュータのリアルタイム監視および分析システムのＳＭＡＲＴ ＶＩＤＥＯ−ＴＲＡＣＫＩＮＧ（米国、ＳＭＡＲＴｖ３．０．０２）を利用する。当該器械は主に４つの４０ｃｍ×４０ｃｍ×４０ｃｍの実験用オープンボックスで構成され、記録システムに接続されたカメラがボックスの上部の中央に配置され、システムによってマウスのリアルタイム画像を分析し、オープンフィールドでのマウスの行動データを取得する。
２．実験方法：
実験を開始する前に、各マウスに対して統計学的ボディマス測定を実行し、不適格なマウスを除外し、乱数表に従って、陰性対照群、陽性対照群、ポリペプチドＩ、ポリペプチドＩＩおよびポリペプチドＩＩＩ群に分ける。そのうち、生理食塩水群は陰性対照群として０．９％ ＮａＣｌ溶液を注射し、コノトキシン群は用量が１ μｇ／ｋｇで、陽性対照群として使用され、ポリペプチド群の投与量はすべて２ ｎｍｏｌ／ｋｇである。投与方法は腹腔内注射である。
まず、オープンフィールド装置が清潔で異臭がないことを確認する。マウスの番号、日付、状態をオペレーティングソフトウェアに記録し、次に、実験動物を事前、行動実験室の特別な臨時ケージに送り、約３時間環境に適応させ、動物の緊張を緩和する必要があり、そして、マウスをケージから取り出して（マウスの尾部を実験者に向けるようにする）、装置の中央に置いてから装置の上部カバーをすばやく静かに閉じ、ビデオ記録システムを開き、オープンフィールドでのマウスの活動を記録する。合計時間は５ｍｉｎである。観察後、７５％エタノールを使用してボックスの内壁と底面を適時に洗浄し、前回試験用動物が残る情報（動物の便、尿、匂いなど）が次の試験結果に影響を与えないようにする。最後に、今回のマウスをケージ内に戻し、次のマウスのテストを開始する。すべてのマウスを観察した後、１ｈと２４ｈの間隔で、上記の手順に従って、関連する指標を再度計測する。Ｏｒｉｇｉｎ ８．０ソフトウェアを使用してマウスの中央滞在時間、運動時間、壁登り回数および乗り越えた格子の数を最終データとして統計する。
３．実験結果：
注：生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、コノトキシンの陽性対照群と比較して、＾Ｐ＜０．０５、＾＾Ｐ＜０．０１である
注：生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、コノトキシンの陽性対照群と比較して、＾Ｐ＜０．０５、＾＾Ｐ＜０．０１である
注：生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、コノトキシンの陽性対照群と比較して、＾Ｐ＜０．０５、＾＾Ｐ＜０．０１である
注：生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、コノトキシンの陽性対照群と比較して、＾Ｐ＜０．０５、＾＾Ｐ＜０．０１である
注：生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、コノトキシンの陽性対照群と比較して、＾Ｐ＜０．０５、＾＾Ｐ＜０．０１である
注：生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、コノトキシンの陽性対照群と比較して、＾Ｐ＜０．０５、＾＾Ｐ＜０．０１である
注：生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、コノトキシンの陽性対照群と比較して、＾Ｐ＜０．０５、＾＾Ｐ＜０．０１である
オープンフィールド実験におけるポリペプチドＩ、ポリペプチドＩＩおよびポリペプチドＩＩＩの各指標は、生理食塩水群と比較して有意差がなく、コノトキシン群と比較してそのほとんどは有意差があり、それによって、ポリペプチドＩ、ポリペプチドＩＩおよびポリペプチドＩＩＩはコノトキシンよりも低い副反応効果を有し、マウスの自発活動などの不良状況を顕著に改善しうることが説明された。詳細は表３〜９を参照する。実験結果は統計的有意性がある。
強制水泳実験におけるマウスの運動疲労耐性に対する鎮痛ポリペプチドの影響と作用
１．材料と方法
１．１実験動物
昆明メスマウスは４０匹とする。
室温１８〜２２℃、１２ｈ（６：００〜１８：００）の明るい環境および１２ｈ（１８：００〜６：００）の暗い環境で、自由に摂食して飼育し、１週間環境に事前に適応させた後、１８〜２２ｇのマウスを２０匹選択して本格的な実験（すべての実験は１９：００〜２４：００で実行される）に使用される。
１．２．実験装置
ビーカー、恒温水槽、ストップウォッチ、カウンター、ＡＯＮＩ ＡＮＣ Ｃｏｒｅ ＨＤ１０８０Ｐ高解像度カメラなどの実験装置は、すべて本実験室で作られる。
１．３．方法
実験の前に、２５匹のマウスを乱数表に従って陰性対照群、陽性対照群、ポリペプチドＩ、ポリペプチドＩＩおよびポリペプチドＩＩＩ群に分ける。そのうち、生理食塩水群は陰性対照群として０．９％ ＮａＣｌ溶液を注射し、コノトキシン群は用量が１ μｇ／ｋｇで、陽性対照群として使用され、ポリペプチド群の投与量はすべて２ ｎｍｏｌ／ｋｇである。投与方法は腹腔内注射である。
作業者は、直径１０ｃｍ、水深１０ｃｍ、水温２３〜２５℃の温水で満たされた丸いビーカーにマウスを入れ、カメラシステムを使用して５ｍｉｎ内の動物の運動状態時間を記録する。運動状態とは、動物が自発的に足掻き、体が浮いてうねっているという状態を意味する。すべてのマウスを観察した後、１ｈと２４ｈの間隔で、上記の手順に従って、マウスの水中での運動時間を再度計測する。
２．実験結果
注：生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、コノトキシンの陽性対照群と比較して、＾Ｐ＜０．０５、＾＾Ｐ＜０．０１である
運動持久力の改善は、抗疲労能力の強化の最も直接的な兆候であり、水泳時間の長さは動物の運動疲労の程度を反映でき、運動時間が短いほど、毒性と副作用が大きくなる。強制水泳実験におけるポリペプチド群のデータは、生理食塩水群と比較して有意差がなく、コノトキシン陽性群と比較してそのほとんどは有意差があり、いくつかは非常に高度な有意差がある。ポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩはコノトキシンよりも低い毒性副反応効果を有することが説明された。詳細は表１０を参照する。実験結果は統計的有意性がある。
尾懸垂実験におけるマウスの抗うつ効果に対する鎮痛ポリペプチドの影響と作用
１．材料と方法
１．１実験動物
昆明メスマウスは５０匹とする。
室温１８〜２２℃、１２ｈ（６：００〜１８：００）の明るい環境および１２ｈ（１８：００〜６：００）の暗い環境で、自由に摂食して飼育し、１週間環境に事前に適応させた後、１８〜２２ｇのマウスを２０匹選択して本格的な実験（すべての実験は１９：００〜２４：００で実行される）に使用される。
１．２．実験装置
側面に立って、周囲の壁と底が黒い尾懸垂ボックス（２０ ｃｍ×２０ ｃｍ×３０ ｃｍ）、ストップウォッチ、カウンター、ＡＯＮＩ ＡＮＣ Ｃｏｒｅ ＨＤ１０８０Ｐ高解像度カメラを含む実験装置は、すべて本実験室で作られる。
１．３．方法
実験の前に、２０匹のマウスを乱数表に従って陰性対照群、陽性対照群、ポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩ群に分ける。そのうち、生理食塩水群は陰性対照群として０．９％ ＮａＣｌ溶液を注射し、コノトキシン群は用量が１ μｇ／ｋｇで、陽性対照群として使用され、ポリペプチド群の投与量はすべて２ ｎｍｏｌ／ｋｇである。投与方法は腹腔内注射である。
作業者は、マウスの尾の先端の１／３部位をテープで尾懸垂ボックスに吊り下げ、頭がボックスの底から約１０ｃｍ離れ、カメラに面するようにし、カメラシステムを使用して動物の６ｍｉｎ内の不動状態潜時および４ｍｉｎ内の不動状態持続時間を記録する。不動状態とは、動物が自発的な足掻きをあきらめ、体が吊り下げられてうねっていないという状態を意味する。
２．実験結果
注：生理食塩水群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、コノトキシンの陽性対照群と比較して、＾Ｐ＜０．０５、＾＾Ｐ＜０．０１である
マウスは吊り下げられて逃げようとするが、逃げられないため、足掻きをあきらめ、独特のうつかつ不動の状態になることにより、実験中、動物の不動時間を記録してうつ状態を反映し、尾懸垂運動時間が短いほど、毒性と副作用が大きくなる。尾懸垂実験におけるポリペプチドＩ、ＩＩおよびＩＩＩ群のデータは、生理食塩水群と比較して有意差がなく、コノトキシン陽性群と比較してそのほとんどは有意差がある。鎮痛ポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩはコノトキシンよりも低い毒性副反応効果を有することが説明された。詳細は表１１を参照する。実験結果は統計的有意性がある。
ホルマリンによる疼痛誘発実験における疼痛抑制率に対する鎮痛ポリペプチドの影響
急性組織損傷による持続性疼痛をシミュレートする。希釈したホルマリン溶液を動物の片足の背側に皮下注射すると、安静時の脚の屈曲、運動中の跛行、足舐めなどの動物の行動変化が引き起こされる。これらの行動の程度（足舐め時間など）は、ホルマリンの濃度に正比例し、一般的には痛みの象徴と考えられる。また、毛づくろい、探索や運動活動などの他の行動もホルマリン注射による影響を受ける。
体重２０±２ｇの昆明マウスは、メスとオスを半々にする。室内温度は２３〜２４℃に維持される。乱数表に従ってマウスを群別し、陰性対照群、陽性対照群およびポリペプチド群をそれぞれ設定し、群当たり１０匹とする。そのうち、０．９％のＮａＣｌ溶液群は陰性対照群として使用され、コノトキシン群は用量が１ μｇ／ｋｇで、陽性対照群として使用され、鎮痛ポリペプチド群Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの投与量は０．２ ｎｍｏｌ／匹である。各群の実験用マウスに５ｍｉｎ投与した後、１ｍＬシリンジを使用してマウスの右後足裏に５％ホルマリン（フォルマザン含有量５％）溶液を２０ μＬ皮下注射し、注射直後、マウスを大きなガラスビーカーに入れて１ｈ以内の疼痛反応を観察し、右足を舐める時間を行動反応指標とする。ビーカーの後ろに鏡をプラットフォームに対して約３０°の角度で置き、同時に、正面と鏡面から、ストップウォッチを使用して、注射された足を５ｓごとに舐める、噛む、振る累計時間を記録し、連続的に６０ｍｉｎ観察して記録し、それぞれフェーズＩ（０−１０ｍｉｎ）およびフェーズＩＩ（１０−６０ｍｉｎ）とし、ホルマリンによる炎症性疼痛誘発モデルを使用して試薬の急性投与後の鎮痛効果を検討する。陽性対照群およびコノトキシンのフェーズＩおよびフェーズＩＩの疼痛反応に対する抑制率をそれぞれ計算する。
実験結果：
注：陰性群と比較して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であり、陽性対照群と比較して、＾Ｐ＜０．０５、＾＾Ｐ＜０．０１である
ホルマリンによる疼痛誘発実験における自己設計された鎮痛ポリペプチドのデータは、生理食塩水群と比較して有意差があり、コノトキシン陽性群と比較してそのほとんどは有意差がある。ポリペプチドＩ、ＩＩおよびＩＩＩはすべて優れた鎮痛効果を有することが説明される。詳細は表１１を参照する。実験結果は統計的有意性がある。
がん浸潤性疼痛モデルＣＩＰにおける神経痛に対する鎮痛ポリペプチドの影響と作用
１．材料
１．１．動物
体重２５〜３０ｇのオスＢＡＬＢ／ｃマウスを数匹用意する。
１．２．実験装置および試薬
ｖｏｎＦｅｒｙモノフィラメント、マイクロシリンジ、５ ｍｇ／ｍＬのポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩ溶液、生理食塩水。
１．３方法
ＢＡＬＢ／ｃマウスの右坐骨神経を露出し、５×１０４ Ｍｅｔｈ Ａ肉腫細胞を含む腹水を、後部二頭筋腱のブランチから離れた坐骨神経転子近くの近位神経に注射し、傷口を閉じ、左側に偽手術を行い、同一体積の生理食塩水を注入する。
１．３．１熱感受性テスト
接種後の４日目、７日目、１０日目、１４日目に、動物の熱放射刺激による足上げの潜時を観察し、熱放射の強度を、通常のマウスの足上げ潜時が（１０±２）秒であることを基準とするように調整する。
接種後の４日目、７日目、１０日目、１４日目に、動物の熱放射刺激による足上げの潜時を観察し、熱放射の強度を、通常のマウスの足上げ潜時が（１０±２）秒であることを基準とするように調整する。
１．３．２機械的感度テスト
接種後の４日目、７日目、１０日目、１４日目に、ｖｏｎ Ｆｅｒｙモノフィラメントを使用して両足の機械的感度をテストし、フリップテスト法を使用して５０％足足引っ込め反応が現れる時の閾値を測定し、テストは０．４ｇから始まる。
接種後の４日目、７日目、１０日目、１４日目に、ｖｏｎ Ｆｅｒｙモノフィラメントを使用して両足の機械的感度をテストし、フリップテスト法を使用して５０％足足引っ込め反応が現れる時の閾値を測定し、テストは０．４ｇから始まる。
１．３．３Ｇｒｏｓｓ行動
接種後の４日目、７日目、１０日目、１４日目に、熱感受性および機械的痛覚過敏などの行動が起こる前に、まず、自発痛と下垂足などが現れ、１０分間以内に右後足を上げる累計時間を計算する。
２．結果
すべてのデータはＭ±ＳＤで表され、一元配置分散分析を使用する。
２．１熱感受性の亢進の発生
熱放射刺激による足上げの潜時は、接種後の１０日目に明らかに８秒短縮され、接種後の１４日目に明らかに１５秒延長され、そのうち、ポリペプチドＩ群は特に顕著である。
２．２機械的感度の変化
痛覚過敏症や熱感受性過敏症の症状が現れ、同時に自発痛も観察される。１０日目にｖｏｎ Ｆｅｒｙモノフィラメントの機械的痛覚過敏を検出できるが、１４日目に、マウスの機械的痛覚過敏が低減するようになる。群間に差はない。
２．３自発痛神経症候群
接種後の１０日目に、一部のマウスに下垂足が観察され、右後足上げの累計持続時間がわずかに増加するが、１４日目に、ポリペプチドＩ、ＩＩ群で左足上げの行動が明らかに観察される。
パクリタキセルによる疼痛誘発マウスモデルにおける痛みに対する鎮痛ポリペプチドの抑制効果
１．材料
１．１．動物
７週齢の体重２０〜２５ｇのｄｄＹオスマウスを用意する。
１．２．実験装置および試薬
フィラメント機械的痛み測定装置、細いフィラメント（０．０６８８ｇの強度に相当）、太いフィラメント（１．４７９８ｇの強度に相当）、パクリタキセル、ポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ロキソプロフェン、生理食塩水。
１．３方法
１．３．１動物の群別
マウスを温度（２２±１）℃、相対湿度５５％±１０％の動物室内で１週間飼育して試験に使用する。３６匹のマウスをモデル群（パクリタキセルのみ）、ブランク対照群（パクリタキセルなし）、ロキソプロフェン群およびポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩ群に分け、そのうち、パクリタキセルの投与の３日前に、それぞれロキソプロフェン群およびポリペプチド群に対応する薬物を７日間投与する。群当たり６匹のマウスがある。
１．３．２実験過程
パクリタキセルによる疼痛誘発モデルの作製：マウスに１０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを腹腔内注射してモデル化する。
マウスの痛み行動学的テスト：３つのコンパートメントに分割された金属メッシュの上にマウスを置き、１５分間静置させ、後足の足底部の機械的刺激応答を測定し、まず細いフィラメントで異常痛を評価し、そして太いフィラメントで痛覚過敏の程度を評価する。刺激応答は５回で、合計１０ポイントである。評価基準（０ポイント：足をすばやく持ち上げる動作、２ポイント：足を激しく振ったり舐めたりする動作。測定時間はパクリタキセルの投与前および投与後の２４、４８、７２、９６時間とする）。
２．実験結果
測定データはＭ±ＳＤで表され、群間の差はｔ検定で検定される。
２．１パクリタキセル投与後のマウスの痛み反応
マウスに１０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを腹腔内投与すると、異常痛と痛覚過敏は両方ともパクリタキセル投与後の２４時間でピークに達し、その後、ゆっくりと軽減し、９６時間後に投与前のレベルに戻る。投与前後の２４時間の痛み関連スコアについて、異常痛は０．５±０．２、１．８±０．６であり、痛覚過敏は２．３±０．５、５．５±０．６である。
２．２ロキソプロフェンとポリペプチド注射剤の治療効果
異常痛への影響について、ポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩ群はモデル群と比較して痛み関連スコアが顕著に低い（Ｐ＜０．０５）。ポリペプチド群はモデル群と比較して痛み関連スコアが減少傾向を示し、有意差がない。痛覚過敏への影響について、ロキソプロフェン、ポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩ群はモデル群と比較して痛み関連スコアに有意差がない。
三叉神経疼痛閾値に対する鎮痛ポリペプチドの影響
１．材料
１．１．動物
体重１７０〜２００ｇのＳＤラット（オスまたはメス）を用意する。
１．２．実験装置および試薬
機械的閾値試験機（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ公司、米国）、顕微鏡、ポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、生理食塩水。
１．３方法
１．３．１動物モデルの作製（すべての操作は無菌条件で完了する）。
１．３．２三叉神経痛誘発およびモデル動物の陽性基準
実験の前に適応訓練を行う。このモデルの三叉神経痛誘発実験は、手術後の約２週間に、静かであり且つ室温の条件下で実施され、ラットに以下の反応のいずれか一項または一項以上が発生した場合、モデルが確立したと判断されうる：〔１〕刺激を与えると、急速な後退、回転などの回避動作を示し、ラットは、刺激物を回避するために丸くなってケージの壁に近づいたり、顔が刺激物に触れないように頭と顔を体の下に隠したりする。〔２〕顔を引っ掻き、具体的には、顔の刺激領域を少なくとも３回続けて引っ掻く動作を示す。〔３〕ラットはすぐに刺激物をつかんで攻撃する。
１．３．３実験方法
体重１７５〜２００ｇのＳＤラット（メスまたはオス）を６０匹選択し、ランダムに６群に分ける：生理食塩水対照群（６匹）、５０ ｕｇ／ｋｇのポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩ群にそれぞれ６匹、１００ ｕｇ／ｋｇのポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩ群にそれぞれ６匹、３００ ｕｇ／ｋｇのポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩ群にそれぞれ６匹である。手術後の２週間に痛覚過敏が発生すれば、各群の動物の腹腔内にポリペプチド注射剤５０ ｕｇ／ｋｇ、１００ ｕｇ／ｋｇ、３００ ｕｇ／ｋｇ、生理食塩水０．１ ｍＬ／ｋｇをそれぞれ注射した後、疼痛閾値を５時間連続して１時間ごとに測定し、疼痛閾値の変化を記録する。
２．実験結果
実験データはＭ±ＳＤで表され、ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定の一元配置分散分析およびＭａｎｎ±Ｗｈｉｔｎｅｙ ｕ検定を使用して、時効用値の曲線下面積は台形法で計算され、２つの群間の時効用値の曲線下面積はｔ検定で計算される。Ｐ＜０．０５は統計的有意性があると見なされる。
ラットは、手術の１４日後に痛覚過敏が発生し、手術側の疼痛閾値が（０．３８±０．０４）ｇに低下し、手術の反対側が（０．４３±０．０４）ｇ、偽手術群が１２．５ｇの場合、ポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩ注射溶液を５０ ｕｇ／ｋｇ、１００ ｕｇ／ｋｇ皮下注射した後、動物反応閾値が顕著に増加する。ポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩ５０ ｕｇ／ｋｇ群において、注射してから３時間後に、手術側の最高疼痛閾値は（２．３±０．５）ｇであり、反対側は（１．２±０．２）ｇであり、かつ１時間続く。ポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩの１００ ｕｇ／ｋｇ群において、注射してから３時間後に、手術側の最高疼痛閾値は（７．４±０．９）ｇであり、反対側は（３．２±１．３）ｇであり、かつ手術側での作用は約８時間続く。その一方で、ポリペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩを３００ ｕｇ／ｋｇ皮下注射した群では、疼痛閾値は顕著に増加しない。
Claims (8)
- アミノ酸配列Ｘａ−Ｘｂ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘｃ−Ｘｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｘｅ、またはその薬学的に許容される塩を有することを特徴とする鎮痛活性を有するポリペプチド。
- 前記ＸａはＧｌｙまたは欠失で、前記ＸｂはＳｅｒまたはＬｙｓのいずれかであり、前記Ｘｃはｄ−ＣｙｓまたはＳｅｒまたはＡｓｐのいずれかで、前記ＸｄはＡｌａまたは欠失であり、前記ＸｅはＣｙｓまたはＳｅｒであることを特徴とする請求項１に記載の鎮痛活性を有するポリペプチド。
- 前記ポリペプチドアミノ酸配列は、
ポリペプチドＩ：Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−ｄ｛Ｃｙｓ｝−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ、
ポリペプチドＩＩ：Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ、または
ポリペプチドＩＩＩ：Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓであることを特徴とする請求項１または２に記載の鎮痛活性を有するポリペプチド。 - 前記各ポリペプチド配列における２つのシステインの間で、１対のジスルフィド結合が形成されることを特徴とする請求項３に記載の鎮痛活性を有するポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、請求項３に記載の配列に基づいて、１つ以上のアミノ酸を削除、置換または添加することにより得られる配列を有することを特徴とする鎮痛活性を有するポリペプチド、またはその薬学的に許容される塩。
- 痛みを予防および／または治療するための製品の製造における請求項１または２または３に記載のポリペプチドの応用。
- その有効成分は請求項１または２または３に記載のポリペプチドであることを特徴とする痛みを予防および／または治療するための製品。
- 前記痛みは、物理的および化学的刺激、病理学的または神経障害性疼痛を含むことを特徴とする請求項７に記載の痛みを予防および／または治療するための製品。
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