CN107801692A - 一种氯胺酮诱导精神分裂症动物模型及其机制研究 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种氯胺酮诱导精神分裂症动物模型及其机制研究，包括以下步骤：1)氯胺酮诱导精神分裂症动物模型建立；2)氯胺酮诱导精神分裂症后行为表现及形态观察；3)氯胺酮诱导精神分裂症后与氧化应激的相关性；通过对小、中、大三个剂量氯胺酮单次或连续给药小鼠所产生的类似精神分裂症症状进行了系统观察，并对不同剂量及不同给药方式建立模型的可行性进行了比较与初步评价，结果显示单次或连续使用氯胺酮后均可诱导小鼠产生类似精神分裂症的症状，且具有一定的剂量依赖趋势。并且本发明通过分析得出氯胺酮致小鼠产生类似精神分裂症症状后与氧化应激有关，为后续氯胺酮成瘾机制和精神分裂症研究提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型技术领域，具体涉及一种氯胺酮诱导精神分裂症动物模型及其机制研究。
背景技术
氯胺酮(Ketamine,K)为苯环己哌啶(phencylidine,PCP)衍生物，是非竞争性N-甲基-D-天门冬氨酸(N-Methyl-D-Aspartate,NMDA)受体拮抗剂。从1970年开始，氯胺酮即作为一种静脉麻醉药在临床应用。氯胺酮有左旋、右旋两种旋光异构体，其中右旋体治疗指数较高，不良反应少。目前临床所用的氯胺酮是右旋氯胺酮和左旋氯胺酮两种对映异构体的消旋体。
氯胺酮是唯一被美国食品和药物管理局(food and drug administration,FDA)认可的NMDA受体拮抗剂，其作用机制复杂，涉及NMDA受体、阿片类受体、单胺类受体、乙酰胆碱受体和电压门控钙通道受体等。氯胺酮能选择性地阻断痛觉冲动向丘脑新皮层系统的传导，兴奋脑干及边缘系统，引起意识模糊，短暂性记忆缺失，可表现为谵妄、恶梦、恐惧、血压上升、肌张力增加，呈现木僵样状态，这种对中枢兼有兴奋和抑制作用的麻醉被称为“分离麻醉” (dissociative nesthesia)。氯胺酮除传统的麻醉、预镇痛作用外，还具有抗炎、抗惊厥、解除支气管痉挛、遗忘及诱发精神异常等多项药理作用。
氯胺酮单独使用时，适用于不需肌肉松弛的小手术和诊断性检查，小儿麻醉，全麻诱导，烧伤患者更换敷料、清创、植皮或切痂。更多的是与其它药物配伍组合复合麻醉。此外，氯胺酮还是一种潜在的、作用迅速的抗抑郁药。Liebrenz等研究表明,0.5mg/kg氯胺酮即可显著改善抑郁患者的症状。氯胺酮毒副作用：氯胺酮麻醉过程中可产生明显的精神症状，表现为多种不同形式的幻觉：缓慢形成的偏执思维、性冲动增强、感官的敏感性增强等，并且这些症状呈剂量依赖性。氯胺酮还可加重精神分裂症患者的症状。研究显示氯胺酮可用于复制精神分裂症的动物模型。
此外，氯胺酮具有一定的致幻作用和成瘾性，被广泛滥用于各种娱乐场所。近几年来，非法滥用氯胺酮的人数呈现快速增长趋势，这一问题已引起许多国家的普遍关注。Trujillo等研究指出，反复注射氯胺酮可导致大鼠活动增多,行为精神病尤其是精神分裂症行为影响脑神经高级思维功能的病变，是近代以来对于影响人的思维及工作能力最具威胁力同时也是最缺乏诊断方法和治疗手段的疾病。目前对其发病机理及发病的分子细胞学的机制缺乏了解。敏感性增强，当把大鼠置于新的环境中时，这种效果更为明显。当首次注射大剂量的氯胺酮时，大鼠主要表现为共济失调现象，掩盖了氯胺酮的刺激作用，当反复注射一段时间后，大鼠即对这种共济失调现象产生了一定程度的耐受。而耐受和敏化是整个成瘾过程中处于不同时期的表现。
随着社会竞争压力的增加，精神分裂症的患病人数有升高的趋势。精神分裂症的主要症状包括阳性症状、阴性症状和认知功能损害。阳性症状表现为幻觉、妄想、思维紊乱以及行为怪异；阴性症状表现为行为动机低下、情感反应淡漠、失语症以及兴奋能力低下；认知功能损害以注意力、记忆力和计划能力的损害最为常见。
精神分裂症病因不明，目前对其发病机制的研究较少，临床诊断上主要取决于对阳性症状和阴性症状的判定，缺乏客观的生物学检测指标，其治疗也一直是医学界的一个难题，因此建立精神分裂症的实验动物模型就显得尤为重要。在目前所建立的动物模型中，以谷氨酸功能低下为基础的，利用NMDA受体拮抗剂所诱导的动物模型是研究较多的一种。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，提供一种氯胺酮诱导精神分裂症动物模型及其机制研究。
为实现上述目的，达到上述效果，本发明是通过以下技术方案实现：
一种氯胺酮诱导精神分裂症动物模型及其机制研究，其特征在于：包括以下步骤：
一、氯胺酮诱导精神分裂症动物模型建立；
二、氯胺酮诱导精神分裂症后行为表现及形态观察；
三、氯胺酮诱导精神分裂症后与氧化应激的相关性；
优选的，所述步骤一包括：选昆明种小鼠随机分为生理盐水对照组、氯胺酮小剂量(25mg/kg)、中剂量(50mg/kg)、大剂量(100mg/kg) 组，生理盐水组予以生理盐水，不同剂量氯胺酮组腹腔注射给药，1次 /天，连续给药7天。
优选的，所述步骤二包括:分别于第1、3、5、7天依次评价对照组和不同剂量氯胺酮组小鼠进行：1)旷场实验；2)刻板行为；3) 悬吊实验；4)爬杆实验；5)Y型迷宫实验；以第1天给药作为单次给药模型，给药7天做为连续给药模型，比较各项指标的差异。
优选的，所述步骤三包括：1)标本采集；2)血清及脑组织SOD 含量测定；3)血清及脑组织MDA含量测定；4)免疫组织化学技术； 5)统计分析。
本发明的有益效果是：本发明通过对小、中、大三个剂量氯胺酮单次或连续给药小鼠所产生的类似精神分裂症症状进行了系统观察，并对不同剂量及不同给药方式建立模型的可行性进行了比较与初步评价，结果显示单次或连续使用氯胺酮后均可诱导小鼠产生类似精神分裂症的症状，且具有一定的剂量依赖趋势。大剂量氯胺酮(100 mg/kg)所诱导的症状更为明显，连续给药7天后部分症状具有更好的稳定性，建立稳定的精神分裂动物模型。并且本发明通过分析得出氯胺酮致小鼠产生类似精神分裂症症状后与氧化应激有关，为后续氯胺酮成瘾机制和精神分裂症研究提供基础。
具体实施方式
结合以下具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
一种氯胺酮诱导精神分裂症动物模型及其机制研究，其特征在于：包括以下步骤：
一、氯胺酮诱导精神分裂症动物模型建立；
二、氯胺酮诱导精神分裂症后行为表现及形态观察；
三、氯胺酮诱导精神分裂症后与氧化应激的相关性；
所述步骤一包括：选昆明种小鼠随机分为生理盐水对照组、氯胺酮小剂量(25mg/kg)、中剂量(50mg/kg)、大剂量(100mg/kg)组，生理盐水组予以生理盐水，不同剂量氯胺酮组腹腔注射给药，1次/ 天，连续给药7天。
所述步骤二包括:分别于第1、3、5、7天依次评价对照组和不同剂量氯胺酮组小鼠：1)旷场实验；2)刻板行为；3)悬吊实验；4) 爬杆实验；5)Y型迷宫实验；以第1天给药作为单次给药模型，给药7天做为连续给药模型，比较各项指标的差异。
所述步骤三包括：1)标本采集；2)血清及脑组织SOD含量测定；3)血清及脑组织MDA含量测定；4)免疫组织化学技术；5)统计分析。
实施例1
1、实验动物
取昆明种小鼠40只，雄性，体重25-30克，清洁级。实验前小鼠在动物房饲养至少3天，维持室温(22±1)℃，湿度50-60％,在整个实验过程中小鼠自由饮水及进食。
2、神分裂症动物模型的建立及分组
小鼠40只随机均分为4组，生理盐水对照组、氯胺酮小剂量(25 mg/kg)、中剂量(50mg/kg)、大剂量(100mg/kg)组。对照组和不同剂量氯胺酮组分别腹腔注射生理盐水、氯胺酮1次/天，连续给药7 天。
3、行为学实验
3.1旷场实验
给药10min后将小鼠置于40cm×40cm×30cm自制的洁净木质旷野箱中，周壁为灰色，底面均分为25个方格，适应10min后，将小鼠轻轻放入旷野箱的正中格，用摄像系统记录小鼠5min内的行为活动。①水平得分：穿越底面的格子数；②垂直得分：直立、两前爪离开地面的次数；旷场实验得分＝①+②。行为评定采用盲法，由两位观察者观看录像记录评分。
3.2刻板行为
测定自主活动的同时评价小鼠的刻板行为，每只小鼠在5min内评价5次，l min评价一次，5次的平均值作为小鼠刻板行为最后得分。
3.3悬吊实验
将小鼠两前肢悬挂于距底面约25cm水平放置的电线上，如小鼠用两后肢抓住电线记3分；仅用一只后肢抓住电线记2分；两后肢均抓不住电线记1分。各组小鼠于实验前一日每日进行2次悬吊行为训练，每次数秒。
3.4爬杆实验
实验采用粗1cm高50cm的直杆，杆顶部固定有一直径为2.5cm 的塑料小球，木杆上覆盖纱布以防止小鼠打滑。将小鼠放到球顶，记录以下3个时间：(1)小鼠爬完杆长的上半部分所需的时间；(2)小鼠爬完杆长的下半部分所需的时间；(3)小鼠爬完杆长的全长所需的时间。然后按以下的标准打分：3秒钟内完成上述某一动作的记3.0 分；6秒钟内完成记2.0分；超过6秒记1.0分。将这三个时间的得分相加即为被测小鼠本次爬杆实验的最后得分。
3.5 Y型迷宫实验
将小鼠放入Y型迷宫中适应5min，然后无规则变换安全区，训练小鼠辨别灯光刺激及安全方位的能力。小鼠受电击后跑到有灯光的安全区后停止，灯光继续作用30s以巩固记忆，然后以小鼠所在支臂作为下一次测试的起点。以小鼠一次性跑向安全区为正确反应，否则为错误反应。连续测试30次，记录正确反应次数作为学习成绩。在安静、光线较暗的环境中进行。
小剂量氯胺酮单次给药致小鼠产生四肢无力、刻板行为(P<0.05)；中、大剂量时可有明显的运动亢进、刻板行为、四肢无力和共济失调现象(P<0.01)。氯胺酮各给药剂量组间相比较，大剂量组诱导小鼠产生的类似精神分裂症症状更为明显(P<0.05)。
氯胺酮连续给药7天后，中剂量组运动亢进较明显(P<0.05)中、大剂量组表现为刻板行为增加，共济失调现象和学习记忆能力下降 (P<0.01)。
实施例2
1、标本采集
各组实验小鼠于给药结束后采用眼眶取血方法采集血液，处死小鼠后取出脑组织，在冰冻条件下制成匀浆，血液及匀浆冷冻保存用于生化测定。
2、血清及脑组织SOD含量测定
3、血清及脑组织MDA含量测定
4、免疫组织化学技术
免疫组织化学染色步骤主要参照试剂公司试剂盒说明书进行，对切片行高温高压处理代替胰酶消化，促进抗原暴露。
5、统计与分析
生化指标测定
氯胺酮连续给药对小鼠血清SOD、MDA含量的影响
随氯胺酮给药量增加血清SOD活性逐渐降低。中剂量组血清中 SOD活性与对照组差异显著(P<0.05)，大剂量组SOD活性与对照组差异更为显著(P<0.01)。氯胺酮大剂量组与小、中剂量组血清SOD活性相比，均具有显著性差异(P<0.01)；氯胺酮小、中、大剂量组血清中MDA含量与对照组相比依次升高，但无统计学差异(P>0.05)，各组间两两比较，差异不显著(P>0.05)。
氯胺酮连续给药对小鼠脑组织内SOD、MDA含量的影响
随氯胺酮给药量增加脑组织中SOD活性逐渐降低。大剂量组SOD 活性与对照组相比，具有显著性差异(P<0.01)，大剂量组与小、中剂量组SOD活性相比，差异显著(P<0.01)；氯胺酮小、中、大剂量组脑组织中MDA含量与对照组相比依次升高，但无统计学差异 (P>0.05)，各组间两两比较，差异不显著(P>0.05)。
血清及脑组织生化指标测定表明，大剂量氯胺酮组可显著降低 SOD活性(P<0.01)，MDA含量随氯胺酮给药剂量的增加而增大，但无显著性差异(P>0.05)
不同剂量氯胺酮组可显著增加NOX4蛋白的表达(P<0.01)，且有一定的剂量依赖趋势。不同剂量给药组间，两两比较具有显著性差异 (P<0.01)。
本发明的有益效果是：本发明通过对小、中、大三个剂量氯胺酮单次或连续给药小鼠所产生的类似精神分裂症症状进行了系统观察，并对不同剂量及不同给药方式建立模型的可行性进行了比较与初步评价，结果显示单次或连续使用氯胺酮后均可诱导小鼠产生类似精神分裂症的症状，且具有一定的剂量依赖趋势。大剂量氯胺酮(100 mg/kg)所诱导的症状更为明显，连续给药7天后部分症状具有更好的稳定性，建立稳定的精神分裂动物模型。并且本发明通过分析得出氯胺酮致小鼠产生类似精神分裂症症状后与氧化应激有关，为后续氯胺酮成瘾机制和精神分裂症研究提供基础。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (4)
1.一种氯胺酮诱导精神分裂症动物模型及其机制研究，其特征在于：包括以下步骤：1)氯胺酮诱导精神分裂症动物模型建立；2)氯胺酮诱导精神分裂症后行为表现及形态观察；3)氯胺酮诱导精神分裂症后与氧化应激的相关性。
2.如权利要求1所述的一种氯胺酮诱导精神分裂症动物模型及其机制研究，其特征在于：所述步骤一包括：选昆明种小鼠随机分为生理盐水对照组、氯胺酮小剂量(25mg/kg)、中剂量(50mg/kg)、大剂量(100mg/kg)组，生理盐水组予以生理盐水，不同剂量氯胺酮组腹腔注射给药，1次/天，连续给药7天。
3.如权利要求1所述的一种氯胺酮诱导精神分裂症动物模型及其机制研究，其特征在于：所述步骤二包括:分别于第1、3、5、7天依次评价对照组和不同剂量氯胺酮组小鼠进行：1)旷场实验；2)刻板行为；3)悬吊实验；4)爬杆实验；5)Y型迷宫实验；以第1天给药作为单次给药模型，给药7天作为连续给药模型，比较各项指标的差异。
4.如权利要求1所述的一种氯胺酮诱导精神分裂症动物模型及其机制研究，其特征在于：所述步骤三包括：1)标本采集；2)血清及脑组织SOD含量测定；3)血清及脑组织MDA含量测定；4)免疫组织化学技术；5)统计分析。
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