CN109072302B - 非酒精性脂肪性肝炎的非侵入性诊断 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于诊断非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和用于将对象分类为NASH治疗的潜在接受者的新方法。

Description

非酒精性脂肪性肝炎的非侵入性诊断
技术领域
本发明涉及用于诊断非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和用于将对象分类为NASH治疗的潜在接受者的新方法。
背景技术
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种渐进性肝脏疾病，其范围从简单的脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)也是一种渐进性肝脏疾病，其在组织学上以脂肪积累、肝细胞损伤和类似酒精性肝炎的炎症为特征。在可以引起肝硬化、肝衰竭和/或HCC(肝细胞癌)的过程中，NASH是一个关键阶段。为了确立这种诊断，仔细地确定缺少显著酒精摄入史是必不可少的。NASH是肝病学家所评估的患者中转氨酶升高的最常见原因之一。肥胖症和2型糖尿病与NASH相关。
在近年中，全世界NASH的发病率与肥胖率一起提高，并且发生NASH的患者的与肝脏相关的死亡率提高。由于这些疾病的患病率不断增加，预期NASH的患病率也增加，因此这种疾病在美国以及其他国家中正变成一个新出现的公共问题。因此，与这些疾病相关的不断增长的患病率和提高的死亡率强调了对i)疾病发展的更多机理性理解和ii)开发用于NASH的非侵入性诊断的更灵敏可靠的方法的需求。
由于这些疾病如果被足够早地诊断就有可能被逆转或至少它们的后果有限，因此能够为医学领域提供允许这种早期、快速且精确的诊断的新工具，似乎是关键的。
尽管已做出几次尝试，提出了用于诊断NASH和确定NASH的活性、阶段或严重性的非侵入性方法，但截至今天，肝组织活检的组织学分析仍然是用于将NASH与早期脂肪变性区分开的最佳方法。脂肪变性、小叶和肝门炎症、作为膨胀和凋亡形式的肝细胞损伤、以及纤维化是从活检组织评估的NASH的特点。然而，肝组织活检具有许多明显缺点。首先，在肝组织活检中收集的材料仅代表被诊断对象肝脏的极小部分，因此带来了收集的样品是否代表对象器官的整体状态的疑问。此外，肝组织活检是非常侵入性的程序，其对于患者来说可能是麻烦、令人担忧和疼痛的，并带来了关于发病和死亡的担忧。最后，鉴于上述情况，不能合理地提议将肝组织活检作为例行程序，用于确定普通人群中的个人或甚至是具有NASH风险的患者是否患有NASH，和/或用于确定所述个人中NASH的活性、阶段或严重性。
超声波检查也被用于诊断肝脂肪变性。然而，这种方法是主观的，因为它基于回声的强度(回声强度)和回声的特殊模式(质地)。结果，它不够灵敏并且常常是不准确的，特别是在具有晚期纤维化的患者中。
目前用于NASH诊断的指导方针推荐在非重症患者中使用AST/ALT比率(AnguloP.N.Engl.J.Med.2002Apr 18；346(16):1221-31；Maher JJ.Semin GastrointestDis.2002；13:31-9)，并在Maddrey判别函数高于32的重症患者中使用肝组织活检(Levitsky J,Mailliard ME.Semin Liver Dis.2004；24:233-47；Mathurin P等，Gastroenterology.1996；110:1847-53；Mathurin P等，J Hepatol.2002；36:480-7)。
由于肝组织活检仍然是侵入性且昂贵的程序并具有可能的取样误差，因此获得快速容易的方法来进行提供患者中NASH水平的良好预测价值的测试，可能是有利的。
几项研究观察到，纤维化的某些血清生物标志物与标准的血清标志物例如转氨酶或ActiTest相比具有更好的诊断价值(Naveau S等，Clin Gastroenterol Hepatol.2005；3(2)；Castera L等，J.Hepatol.2000；32:412-8；Annoni G等，Hepatology.1989；9:693-7；Nojgaard C等，J Hepatol.2003；39:179-86；Chossegros P.1995；22(2Su[ppl):96-9]，但这些研究都尚未真正鉴定到NASH的标志物的准确组合。
此外，近年中已进行了一些试验，以开发在肝诊断领域中获得重要性的非侵入性生物标志物的用途。例如，EP1846862B描述了一种用于从患者的血清或血浆样品诊断酒精性或非酒精性脂肪性肝炎的非侵入性体外方法，所述方法包括测量7种生物化学标志物的浓度，然后通过逻辑函数将它们组合以便获得最终值的步骤。
在WO 2014/049131中公开了一种用于非酒精性脂肪性肝炎的非侵入性诊断的血液测试，其基于反映凋亡的至少一种生物标志物、反映人体测量学的至少一种生物标志物、反映代谢活性的至少一种生物标志物和任选的反映肝脏状态的至少一种生物标志物的测量，以及在数学函数中所述生物标志物之间的组合。
已进行了几项研究，它们将非侵入性生物标志物进行比较和组合以评估肝纤维化，而且还比较了并入有这些非侵入性生物标志物的不同算法的准确性。难处在于选择有效且相关的生物标志物，最终通过算法将它们组合，以分析不同结果并任选地以良好的方式定义响应性患者。
然而，目前尚没有这种用于NASH的精确诊断方法可用。
因此，在提供用于在对象中诊断NASH和确定NASH的活性、阶段或严重性的准确、非侵入性工具中存在强烈需求。
发明内容
本发明是基于在由申请人进行的临床试验(研究GFT505-212-7-NCT01694849)期间，从获自NASH患者的超过300份高质量样品确定的大量变量、包括从所述患者的肝活检组织获得的组织学数据的非常精细和完整的分析。这项研究导致发现了指示NASH及其严重性或阶段或活性的关键循环因子(或生物标志物)。
本发明公开了一种用于诊断非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，和/或用于在对象中确定NASH的活性、阶段或严重性，和/或用于将对象分类为NASH治疗的接受者或非接受者，和/或用于评估医学治疗的功效，和/或用于确定NASH患者中病理的发展或消退，和/或用于将患者分类为医学治疗的潜在响应者或非响应者，和/或用于预测患者的疾病结果，和/或用于鉴定临床相关的结果的替代标志物的方法，所述方法包括测量血液、血清或血浆的循环hsa-miR-34或其共线变量之一的水平和肝损伤的至少一种其他血液、血清或血浆循环标志物的水平。
其他方面和实施方式将从下面的详细描述变得显而易见。
发明详述
本发明是基于特定的循环micro-RNA(miRNA)和作为肝损伤的循环标志物的其他循环生物标志物例如生物化学生物标志物的定量和/或组合。
具体来说，申请人鉴定到，在本领域中公开的在NASH/NAFLD背景中作为炎症的潜在标志物的miRNA(hsa-miR-21、hsa-miR-24、hsa-miR-33a、hsa-miR-34a、hsa-miR-122和hsa-miR-155)中，hsa-miR-34a是用于诊断NASH的关键生物标志物。
因此，本发明的第一方面涉及一种用于在对象中诊断NASH或用于确定NASH的活性、阶段或严重性的方法，所述方法包括测量血液、血清或血浆的循环hsa-miR-34a和任选地肝损伤的至少一种其他血液、血清或血浆循环标志物的水平。
根据本发明，特定miRNA和任选地其他特定生物化学标志物的组合可以产生用于在对象中诊断NASH和确定NASH的活性、阶段或严重性的非常准确的非侵入性工具。因此，本发明公开了两种类型的标志物的组合，其组合的方式使得所述方法非常强有力且精确。本发明对于对象中的NASH而言，提供了选择性和特异性两者。
因此，本发明源自于确定的一组循环标志物的鉴定，所述标志物当合在一起考虑时，在被测试NASH或其严重性或阶段或活性的对象中指示NASH和/或NASH的活性、阶段或严重性。具体来说，本发明涉及一种用于诊断非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和/或用于在对象中确定NASH的活性、阶段或严重性的方法，所述方法将循环micro-RNA(miRNA)和肝损伤的其他循环标志物的鉴定与它们的水平的定量相组合。
最近，围绕作为各种不同疾病(包括癌症、肝炎、肝损伤和NAFLD(非酒精性脂肪性肝病))的生物标志物的循环miRNA，存在着显著的热情(Osman,Clin.Lab.2012；58:393-402；Cermelli等，PloS.One,2011；6:e23937；Elfimova等，Front Physiol.2012；3:476)。
miRNA是非编码的、小的(19至25个核苷酸长)、高度保守的调控性RNA，其作为调节蛋白质合成的进化上保守的分子机制，通过靶mRNA的部分阻遏或降解在转录后水平上调控基因表达。
目前，在人类基因组的各种基因间、内含子或外显子序列中，存在超过2000种已知的编码的miRNA，并且据估计，miRNA可以直接靶向所有人类基因中多达60％的基因。miRNA参与广泛的生物过程，包括细胞凋亡、分化、发育、增殖和代谢。
循环miRNA在血液的富含核糖核酸酶的环境中非常稳定，这是因为它们可以并入到核糖核蛋白复合体或囊泡中。
miRNA特异性表达模式与几种疾病相关，包括一些癌症、肝脏疾病、心脏疾病、肾脏疾病和自体免疫疾病。如果循环miRNA的表达模式与特定病症强烈相关，则所述循环miRNA模式可以充当诊断和监测疾病的生物标志物。最近，miRNA已成为NAFLD管理中的新的生物标志物和潜在治疗靶点。
自从发现以来，就已调查了miRNA在人类疾病中的可能关联。与正常的组织和血清相比，在许多疾病状态下已观察到它们的表达模式的改变。具体地，在心脏病、脓毒症、恶性肿瘤和自体免疫疾病中miRNA表达的变化，提出了研究和靶向以治疗人类疾病的新途径。
这个有前途的新领域推动了研究，并开辟了可以在血清和血浆中检测到的稳定miRNA可以充当早期疾病状态的生物标志物或确定疾病严重性的非侵入性工具的可能性。然而，尽管miRNA足够有效并且显著指示NASH，但仍需要执行它们的方法，因为当前用于诊断或确定NASH阶段的金标准仍然是肝组织活检。
在所述miRNA中，已提出将hsa-miR-122作为肝脏疾病的生物标志物(Chang等，2004；Lagos-Quintana等，2002)。
表达模式研究已在人类和小鼠NASH中鉴定到几种差异表达的miRNA，包括hsa-miR-21、hsa-miR-34a、hsa-miR-122和hsa-miR-155，并且这些miRNA的表达的改变提示了在NASH的病理发生中的显著作用。然而，尽管最近在NASH的调查和临床管理中取得一些成功，但主要问题仍然存在。这包括对生物化学病因学、其表象的广泛性以及从NAFLD到NASH的疾病发展的基本过程的了解有限。
具体来说，某些患者或组织对发展成NASH是否存在不同的易感性，以及这种易感性是否可以与miRNA的表达改变相关联，仍然是未知的。
迄今为止，尚没有基于单独的或组合的miRNA的表达改变，用于NASH的更精确诊断的诊断测试方法可用。
本发明源自于在临床试验期间对患者的活检组织进行的非常精细的分析，以关联循环生物标志物的存在或水平，并按照下文所描述的NAS评分来定义待治疗的不同患者类型。特别是，本发明非限制性地定义了三类待治疗的NASH患者。这些患者根据NASH特征的评分进行分类。
在特定实施方式中，对于每类患者来说，申请人定义了用于几类患者的相关生物标志物的名单。还公开了组合这些不同的相关生物标志物的方法。
因此，所述不同方法与待治疗的患者直接相关。本发明的方法可以允许将患者根据它们的NASH分值特点分类为NASH治疗的未来接受者或非接受者。所述待治疗的患者可能依赖于监管机构或每个国家的卫生政策。这里为医生提供了一种鉴定这些待治疗患者的强有力工具，因为申请人提出了用于鉴定几类患者的不同的标志物组合。本发明的方法的执行产生监测下的对象的精确分类。
根据本发明，对于每一类型的待治疗患者，可以获得NASH分值。
本发明提供了一种用于将对象分类为NASH治疗的接受者或非接受者或潜在接受者或潜在非接受者的方法。这种分类也可以成为基础，用于进一步确定对象是否应该通过本领域中已知的方法例如通过进行肝组织活检来进行NASH的进一步确认。
本发明的方法可用于：
-在对象中诊断NASH，
-在对象中确定NASH的活性，
-在对象中确定NASH的阶段，
-在对象中确定NASH的严重性，
-将对象分类为NASH治疗的接受者或非接受者，
-评估NASH的医学治疗的功效，例如药物的功效，
-在NASH患者中确定病理的发展或消退，
-在施用医学治疗后在NASH患者中确定病理的发展或消退，
-预测患者是否易接受NASH的医学治疗，即是(潜在)响应者还是(潜在)非响应者，
-建立预后评估，即疾病结果的预测，
-提供临床相关的结果的替代标志物。
本发明的方法允许在患者中诊断NASH，并且允许跟踪NASH的演化。这些方法可以被有利地执行，用于确定何时开始例如医学治疗或对更危重患者进行手术(例如通过肝脏移植)。
本发明是基于不同生物标志物的精细组合，所述生物标志物是由于应用于关于Elafibranor的效果的大型临床研究的结果的数学算法而被鉴定到的，Elafibranor是一种非常有前途的用于治疗NASH的药物。Elafibranor是GENFIT的主线产品。Elafibranor是每日一次的口服治疗，并且是通过双重过氧化物酶体增殖物活化的α/δ途径起作用的首创新药，被开发用于治疗特别是NASH。据信，Elafibranor针对NASH的多个方面，包括炎症、胰岛素敏感性、脂类/代谢分布情况和肝脏标志物。
在特定实施方式中，执行了不同的算法，它们各自专用于特定患者类别。
通过根据患者的状态确定特异性算法，结果的进一步利用是更加精细且预测性的。
令人吃惊的是，在已知与NASH或多或少相关的所有miRNA中，发明人已确定hsa-miR-34(或其共线变量之一)当与至少一种其他生物标志物相组合时，是NASH的最强有力且指示性的生物标志物。
根据本发明，“非酒精性脂肪性肝炎”或“NASH”被定义为存在肝脂肪变性、肝细胞膨胀和肝脏炎症。
对于所述疾病的这个基本定义而言，NASH还可以包括肝纤维化。
根据本发明，术语“对象”或“患者”可互换使用，并且是指哺乳动物对象，特别是人类对象或人类患者。
由于本发明的非侵入性本质，本发明可以在任何对象上执行，例如对NASH没有已知的或怀疑的易感性的对象。
然而，在特定实施方式中，所述对象是处于具有NASH或在将来发生NASH的风险下的对象，例如具有肥胖症、糖尿病、患有代谢综合征或肝脏酶(ALT和/或AST)的循环水平升高或以前被诊断为非酒精性脂肪性肝病(或肝脂肪变性)的对象。
所述对象也可以是具有已经鉴定的NASH的对象，因此本发明的方法允许确定所述疾病朝肝硬化、纤维化、肝癌、肝脏移植或心血管疾病演化的风险。
当所述对象患有NASH时，本发明的方法允许确定用于治疗NASH疾病的药物的功效，并且也允许将所述患者分类为所述治疗的响应者/非响应者。
可以执行本发明以鉴定可能是NASH治疗的响应者或非响应者的患者。具体来说，本发明允许将患者分类成不同类别。
对于每种患者分类来说，提供了用于诊断NASH，或用于在对象中确定NASH的活性、阶段或严重性，或用于将对象分类为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)治疗的接受者或非接受者，或用于评估NASH的医学治疗例如通过药物给药的治疗的功效，或用于确定NASH患者中病理的发展或消退，或用于确定在施用医学治疗后NASH的发展或消退，或用于预测患者是否易接受医学治疗，或用于患者的预后评估、即疾病结果的预测，或用于鉴定临床相关的结果的替代标志物的方法，所述方法包括测量循环hsa-miR-34(例如hsa-miR-34a)或其共线变量和肝损伤的至少一种其他血液、血清或血浆循环标志物的血液、血清或血浆水平。
所述患者分类根据在临床试验期间来自于具有NASH的患者的高质量样品的肝活检组织的组织学特点来定义：肝细胞脂肪变性，膨胀，小叶炎症和任选的纤维化。
基于以前的分析，NAFLD活性分值(NAS)被建立，并可以定义如下：
所述NAS是基于3个特点，每个特点被评分为0到2或3(参见下表)。
所述NAS是脂肪变性(S)分值、小叶炎症(L)分值和肝细胞膨胀(B)分值之和。
因此，所述NAS可以被包含在0至8之间。
然后，任选地，如果有纤维化的话，可以通过纤维化的阶段对NASH患者进行进一步表征。NASH中纤维化的分期可以被定义为4个阶段，其中阶段1具有3种可能性，如下所示。
来源：Kleiner等，Hepatology 2005；41:1313–21。
将发明人收集的数据按照两种不同的生物统计方法进行处理，导致确定了指示疾病和/或其严重性或阶段或活性的分值，由此为医生提供了容易地确定对象是否患有NASH或确定所述疾病的阶段或活性或严重性的强有力、准确且高度预测性的工具。
两种生物统计方法，即中值模型和自举模型(bootstrap model)，被用于精细地确定与NASH患者相关联的标志物的组合，如下所述。
在本发明中测量的标志物的水平是从对象的体液确定的，所述体液特别地可以是血液，更特别是血清或血浆样品。所述样品还可以对应于另一种体液，例如尿液。
根据特定实施方式，在本发明中测量的标志物、特别是miRNA的水平是从血浆样品、优选地从无血小板的血浆样品确定的。
由发明人鉴定的标志物的水平可以根据生物标志物的类型(例如蛋白质、micro-RNA、葡萄糖水平、……)，通过本领域中公知的常规方法例如免疫测定法(例如ELISA)或分子和生物化学测定法(定量RT-PCR、比色测定法)或分析方法(例如质谱术)来确定。
当所测试的标志物是micro-RNA、更具体为hsa-miR-34a时，它的测量可以按照本领域中公知的大量方法例如在下面的实施例中呈现的方法来进行。
简单来说，从提取自血液、血浆或血清样品、特别是无细胞、柠檬酸盐产生的无血小板的血浆样品的总RNA进行所述测量。在RNA提取之前，可以向所述样品添加适合的内标(例如已知序列和量的micro-RNA，例如秀丽隐杆线虫(C.elegans)miR-39)。使用定量RT-PCR来确定Cq值。可获得用于进行这些测定的商品化试剂盒。例如，Taqman miRNA qRT-PCR测定法：Taqman MicroRNA反转录试剂盒、TaqMan MicroRNA Assay 20X和TaqManUniversal Master Mix II(Applied Biosystems)可以按照制造商的说明书使用。反转录可以使用容易获得的PCR系统例如PCR System 9700热循环仪(AppliedBiosystems)进行，使用适合的循环参数例如在16℃下30分钟，然后在42℃下30分钟并在85℃下5分钟，然后保持在4℃下。所述反转录可以以多路格式执行。然后使用定量PCR系统例如CFX96TM实时系统(C1000 TouchTM热循环仪，BioRad)进行定量PCR。循环条件可以如下：在95℃下10分钟，然后进行总共50个循环的在95℃下15秒和在60℃下60秒，然后在30℃下30秒。Cq确定模式可以是定量PCR系统中的回归模式。在特定实施方式中，按照本发明的方法确定的Cq值是可以使用上述特定参数和材料获得的Cq值。如果样品的Cq值高于每种miRNA的标准曲线的最大Cq，可以将所述值从分析中排除。所述标准曲线可用于评估反应效率。
从最浓的cDNA样品开始可以进行超过8个点的连续稀释，以确保标准曲线覆盖在研究期间可能遇到的所有可能的模板浓度。所述标准曲线可以通过将模板的起始量的对数对获得的Cq值进行作图来构建。为了获得绝对定量数据，可以将合成的hsa-miRNA(例如来自于Integrated DNA Technologies)稀释到3.125fmol/mL，并且可以将5μL与从血清样品提取的RNA同时用于反转录。然后可以将产物连续稀释，并且可以对所有样品(标准品和血清来源的RNA)进行PCR。标准曲线可以进行两份平行实验，并用于将Cq数据转变成拷贝数/μL。Cq确定模式是回归。在算法的构建中使用的数据为Log10(拷贝数/μL血清)的格式。
根据本发明，当hsa-miR-34a的水平和至少一种其他标志物的水平提高，特别是当与从对照(或参比)样品获得的参比值相比提高时，对象被诊断为具有NASH，或被诊断为潜在具有NASH或可能具有NASH。所述参比样品可以对应于从一个或多个例如2个或更多个不具有NAFLD或NASH的对象获得的体液样品，例如血液、血清或血浆样品。
在本发明中，如上所述测量的生物标志物的水平，即hsa-miR-34(例如hsa-miR-34a)或其共线变量之一以及至少一种其他标志物的水平，也可用于确定也被称为“NASH分值”的疾病分值。在下面的描述中，该分值对于从业人员和有需要的对象两者来说是无价且有力的工具，因为它允许使用非侵入性程序、即不依靠肝组织活检，即可诊断NASH或确定NASH的严重性或阶段或活性以及下面列出的所有参数。可以将所述NASH分值与阈值进行比较，所述阈值在低、中和高NASH活性之间或中度与严重NASH之间做出鉴别。
此外，所述NASH分值也可预测医学治疗、例如基于药物同化的医学治疗的功效。
所述NASH分值提供临床相关的结果的替代标志物。
根据本发明，该信息可以被有利地用于确定对象是否将接受治疗性NASH治疗。根据特定实施方式，被确定为具有NASH(低、中或高的NASH活性或严重NASH)的患者的对象，将用适合的NASH医学治疗进行治疗。在另一个特定实施方式中，具有中至高的NASH活性或严重NASH的对象将被治疗。
此外，所述NASH分值的计算还允许预测患者对医学治疗是否易接受，即是医学治疗的响应者还是非响应者。
通过同样的方式，所述NASH分值允许在NASH患者中跟踪病理的发展或消退。此外，它允许确定在施用医学治疗后NASH的发展或消退。
所述NASH分值还允许患者的预后评估，即疾病结果的预测，例如他发生肝硬化的风险。
事实上，高的NASH分值表示所述患者具有风险并且可能演化出负面问题，即肝硬化或甚至死亡。
因此，本发明涉及一种用于将对象分类为NASH治疗的接受者或非接受者或分类为潜在接受者或潜在非接受者的方法，所述方法包括确定如上所定义的标志物的水平，计算本文中所提供的NASH分值，并基于所述NASH分值将所述对象分类为治疗的(潜在)接受者或(潜在)非接受者。这种分类也可以成为基础，用于进一步确定对象是否应该通过本领域中已知的方法例如通过进行肝组织活检来进行NASH的进一步确认。
此外，所述对象的分类也可用于确定对象中低的NASH活性或中度NASH，并在该分类的基础上向所述对象提供饮食和/或生活方式推荐意见，以逆转NASH。
待治疗的患者可能具有低、中或高的NASH活性或表现出严重NASH。然而，根据优选实施方式，申请人从待治疗的患者被定义为有风险的患者这一前提开始。
因此，本发明中考虑的患者优选被分类为中度至严重NASH患者。
根据特定实施方式，在本发明中，那些被分类为中至高的NASH活性或分类为严重NASH患者的对象，被认为是NASH治疗的接受者或潜在接受者。
在本发明的情形中，一般来说NASH患者被定义为表现出下述源自于肝组织活检的等级：
-脂肪变性分值≥1
-肝细胞膨胀分值≥1
-小叶炎症分值≥1
-NAS(NAFLD活性分值)≥3(NAS被定义为脂肪变性分值、肝细胞膨胀分值和小叶炎症分值之和)。
本发明的方法包括测量hsa-miR-34(例如hsa-miR-34a)或其共线变量之一和肝损伤的至少一种其他血液、血清或血浆循环标志物。
在特定实施方式中，所述miRNA水平的测量在血浆样品上，特别是在无血小板的血浆样品上实现。
根据统计分析，生物标志物也通过如下所述的共线性检验来检验。
当两个或几个变量表现出超过0.7的相关性时，进行它们的平均值之差相对于定义患者的响应变量的单变量检验。这意味着共线变量在存在时也被包含。在共线变量中，选择在单变量检验中具有最佳结果的变量。这些选出的变量以及其他非共线变量被包含在建模方法中。
在本发明中，如上所述测量的生物标志物的水平也可用于确定也被称为“NASH分值”的疾病分值。
因此，本发明还描述了一种方法，在所述方法中从肝损伤的血液、血清或血浆循环标志物的测量到的水平计算NASH分值，并且在所述方法中诊断NASH，和/或确定NASH的阶段或活性或严重性，和/或确定对象作为NASH治疗的接受者或非接受者的分类，和/或确定基于药物给药的医学治疗的功效，和/或测量NASH患者中病理的发展或消退，和/或测量在施用医学治疗后NASH的发展或消退，和/或确定患者的特点是对医学治疗易接受还是不易接受，和/或建立患者的预后评估，即疾病结果的预测，和/或提供临床相关的结果的替代标志物。
根据本发明，所述方法包括下述步骤：
-测量hsa-miR-34或其共线变量之一以及肝损伤的至少一种血液、血清或血浆循环标志物的水平，以及
-通过数学算法组合结果，以获得NASH分值。
在特定实施方式中，所述肝损伤的至少一种其他循环标志物选自α2-巨球蛋白、糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平、胰岛素、C-肽、稳态模型评估(HOMA)、III型胶原蛋白N-端前肽、hsa-miR-200、YKL-40、CK18-M30、CK18-M65、ALT、AST、尿液比重(Uri Spec Grav)、尿液肌酐、嗜碱性粒细胞、高敏反应蛋白(HSCRP)、尿液β-NAG、白细胞、嗜中性粒细胞和纤维蛋白原。这些测量可以与其他参数例如对象的身高的测量一起完成，正如从下文显而易见的。在特定实施方式中，本发明的方法将miR34(特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p)水平的测量与YKL-40水平的测量相组合。在另一个特定实施方式中，本发明的方法将miR34(特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p)水平的测量与YKL-40和α2-巨球蛋白水平的测量相组合。在另一个特定实施方式中，本发明的方法将miR34(特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p)水平的测量与YKL-40、α2-巨球蛋白和糖化血红蛋白(HbA1c)水平的测量相组合。
根据本发明，在本文描述的方法中，测定的标志物的水平相对于对照样品水平的变化指示NASH和/或NASH的活性、阶段或严重性，和/或对象被分类为NASH治疗的接受者或非接受者，和/或基于药物给药的医学治疗的功效，和/或在NASH患者中病理的发展或消退，和/或在施用医学治疗后NASH的发展或消退，和/或患者的特点是对医学治疗易接受还是不易接受，和/或患者的预后评估，即疾病结果的预测。
所述NASH分值也被称为“S”，在特定实施方式中可以是指具有中至高的NASH活性或严重NASH的概率。
第一亚类的患者
在本发明的情形中并且在本发明的第一种变体中，第一亚类的患者被定义为或等同于表现出下述源自于肝组织活检的等级的患者：
-脂肪变性分值≥1
-肝细胞膨胀分值≥1
-小叶炎症分值≥1
-NAS(NAFLD活性分值)≥4(NAS被定义为脂肪变性分值、肝细胞膨胀分值和小叶炎症分值之和)
-纤维化阶段≥2(例如纤维化阶段等于2、3或4，特别是2或3)。
可以执行下述方法，以在对象中诊断NASH，或将所述对象分类为可能表现出上述源自于肝组织活检的等级，或将所述患者表征为NASH治疗的接受者或非接受者。
在用于鉴定(或诊断)所述第一亚类的患者的方法的第一种变体中，测量hsa-miR-34、特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p的水平，并且所述共线变量选自hsa-miR-122、特别是hsa-miR-122-5p，和hsa-miR-192、特别是hsa-miR-192-5p。
在本发明的第一种变体的优选实施方式中，所述方法包括下述步骤：
-测量hsa-miR-34、特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p，或hsa-miR-122、特别是hsa-miR-122-5p，或hsa-miR-192、特别是hsa-miR-192-5p的水平；以及
-测量选自下述的至少一种其他标志物、优选地所有其他标志物的水平：
-α2-巨球蛋白，
-糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹葡萄糖水平或果糖胺水平，
-III型胶原蛋白N-端前肽(PIIINP)，
-hsa-miR-200、特别是hsa-miR-200a、更特别是hsa-miR-200a-3p，
-YKL-40。
在本发明的第一种变体的特定实施方式中，本发明的NASH分值从如上所提供的测量到的下述标志物水平计算：
-miR-34a(更特别是miR-34a-5p)的水平；和
-α2-巨球蛋白水平；和
-HbA1c水平；和
-III型胶原蛋白N-端前肽的水平；和
-hsa-miR-200a(特别是hsa-miR-200a-3p)的水平；和
-YKL-40的水平。
在所述第一种变体的另一个特定实施方式中，所述分值被定义为下述逻辑函数：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F+g*G
其中：
S是本发明的NASH分值；
A是以g/L为单位的α2-巨球蛋白水平；
B是以百分数为单位的HbA1c水平(例如如果测量到的HbA1c百分数为10％，则B等于10)；
C是以ng/mL为单位的III型胶原蛋白N-端前肽的水平；
D是以Cq为单位的hsa-miR-34a(特别是hsa-miR-34a-5p)的水平；
F是以Cq为单位的hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a、更特别是hsa-miR-200a-3p)的水平；
G是以pg/ml为单位的YKL-40水平；
k是所述逻辑函数的常数；
a是与所述α2-巨球蛋白水平相关的系数；
b是与所述HbA1c水平相关的系数；
c是与所述III型胶原蛋白N-端前肽的水平相关的系数；
d是与所述hsa-miR-34a(特别是hsa-miR-34a-5p)的水平相关的系数；
f是与所述hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a、更特别是hsa-miR-200a-3p)的水平相关的系数；
g是与所述YKL-40水平相关的系数；
因此所述NASH分值是具有中至高的NASH活性或严重NASH的概率。
如果S大于或等于阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为将进行NASH治疗或可能将进行NASH治疗。根据特定实施方式，如果S低于阈值，则所述对象可以被分类为将进行治疗或将不进行治疗，特别是将不进行治疗，和/或所述对象被分类为用于管理其低NASH活性或中度NASH的饮食和/或生活方式劝告的接受者或潜在接受者。
在源自于在本申请的实验部分中描述的中值模型的特定实施方式中：
k是包含在5.94至50.74之间的数；
a是包含在0至1.07之间的数；
b是包含在0至1.20之间的数；
c是包含在0至0.24之间的数；
d是包含在0.97至0之间的数；
f是包含在-0.87至0之间的数；
g是包含在0至1.74E-05之间的数；
并且其中所述阈值被包含在0.2017至0.4645之间，更特别地等于0.2302。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.2017至0.4645之间的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
在仍源自于所述中值模型的另一个特定实施方式中：
k等于25.13；
a等于0.52；
b等于0.57；
c等于0.12；
d等于-0.43；
f等于-0.47；并且
g等于9,54E-06，
并且其中所述阈值被包含在0.2017至0.4645之间，更特别地等于0.2302。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.2017至0.4645之间的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
根据该特定实施方式，接受者操作特征(ROC)曲线下面积(AUC)至少等于0.80，优选为0.82，更优选为0.84。所述AUC是在许多应用中用于测量算法的质量的众所周知的判据。它的值越接近1，所述算法越好。
在源自于在本申请的实验部分中所描述的自举模型的另一个特定实施方式中：
k是包含在8.24至35.44之间的数；
a是包含在0.06至0.88之间的数；
b是包含在0.14至1.04之间的数；
c是包含在0.03至0.23之间的数；
d是包含在-0.75至-0.05之间的数；
f是包含在-0.73至-0.07之间的数；
g是包含在3.59E-06至1.78E-05之间的数；
并且其中所述阈值被包含在0.2718至0.6391之间，更特别地等于0.3502。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.2718至0.6391之间的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
在也源自于所述自举模型的另一个特定实施方式中：
k等于21.84；
a等于0.47；
b等于0.59；
c等于0.13；
d等于-0.40；
f等于-0.40；并且
g等于1.07E-05，
并且其中所述阈值被包含在0.2718至0.6391之间，更特别地等于0.3502。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.2718至0.6391之间的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
根据该特定实施方式，所述AUC至少等于0.80，优选为0.82，更优选为0.84。
在特定实施方式中，上面为所述第一种变体描述的方法从血浆样品执行。
对于所述自举和中值模型两者来说，所述AUC非常良好。
这意味着两种模型可以在本发明中互换使用。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含用于确定下述标志物的水平的工具：
(i)选自hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a、更特别是miR-34a-5p)、hsa-miR-122(特别是hsa-miR-122-5p)和hsa-miR-192(特别是hsa-miR-192-5p)的至少一种标志物；以及选自下列的至少一种其他标志物、特别是所有其他标志物：
(ii)α2-巨球蛋白；
(iii)选自HbA1c、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平的至少一种标志物；
(iv)III型胶原蛋白N-端前肽；
(v)hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a、更特别是hsa-miR-200a-3p)，和
(vi)YKL-40。
在本发明的特定实施方式中，所述试剂盒包含用于确定下述标志物的水平的工具：
(i)hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a、更特别是miR-34a-5p)，
(ii)α2-巨球蛋白，
(iii)HbA1c，
(iv)III型胶原蛋白N-端前肽，和
(v)hsa-miR-200a(特别是hsa-miR-200a、更特别是hsa-miR-200a-3p)和YKL-40。
本发明的试剂盒可用于执行上述方法，并且可以进一步任选地包含用于执行所述方法的说明书。所述试剂盒可以包含适用于执行上面鉴定的标志物的水平的测量的试剂和缓冲液。具体来说，所述试剂盒可以包含特异性针对待定量蛋白质的抗体，和/或可用于定量micro-RNA水平的引物，正如本领域中公知的。
在本发明的该第一种变体中，
申请人进一步进行他的研究，并决定聚焦于血清循环miRNA。
一般来说，从具有风险的待治疗的不同患者的血浆评估不同的循环标志物、特别是miRNA。
在新方法中，申请人在血清上评估所述不同的循环标志物。血清可以被定义为在允许全血凝结之后将全血分离成固体和液体组分后获得的澄清微黄色流体。
从血清评估的miRNA以Log10(拷贝数/μl血清)为单位表示，下文陈述了用于确定该值的详细方法。
在另一个模型中，在血清中评估的miRNA以Cq为单位表示。
根据本发明的第一种变体的其中评估血清中的miRNA并以Cq为单位表示的优选实施方式，所述方法包括下述步骤：
-测量hsa-miR-34、特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p，或hsa-miR-122、特别是hsa-miR-122-5p，或CK18-M30、CK18-M65或ALT或AST，以及肝损伤的至少一种血液、血清或血浆循环标志物的血清水平，以及
-通过数学算法组合结果，以获得NASH分值。
在本发明的这种情况的另一个优选实施方式中，所述方法包括下述步骤：
-测量hsa-miR-34、特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p，或hsa-miR-122、特别是hsa-miR-122-5p，或CK18-M30、CK18-M65或ALT或AST的血清水平，
-测量α2-巨球蛋白水平，
-测量糖化血红蛋白(HbA1c)水平、空腹葡萄糖水平或果糖胺水平，
-测量YKL-40的水平。
在本发明的第一种情况的特定实施方式中，本发明的NASH分值从如上所提供的测量到的下述标志物水平计算：
-在血清中测量到的miR-34a(更特别是miR-34a-5p)的水平；和
-血清中的α2-巨球蛋白水平；和
-血清中的YKL-40水平；和
-HbA1c水平。
根据该特定实施方式，所述分值被定义为具有以Cq为单位表示的hsa-miR-34a(特别是hsa-miR-34a-5p)的血清水平的逻辑函数：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D
其中：
S是NASH分值；
A是以Cq为单位的hsa-miR-34a(特别是hsa-miR-34a-5p)的血清水平；
B是以g/L为单位的α2-巨球蛋白的血清水平；
C是以pg/ml为单位的YKL-40的血清水平；
D是以百分数为单位的HbA1c水平(例如如果测量到的HbA1c百分数为10％，则D等于10)；
k是所述逻辑函数的常数；
a是与所述hsa-miR-34a(特别是hsa-miR-34a-5p)的血清水平相关的系数；
b是与所述α2-巨球蛋白的血清水平相关的系数；
c是与所述YKL-40的血清水平相关的系数；并且
d是与所述HbA1c水平相关的系数。
如果S大于或等于阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为将进行NASH治疗或可能将进行NASH治疗。根据特定实施方式，如果S低于阈值，则所述对象可以被分类为将进行治疗或将不进行治疗，特别是将不进行治疗，和/或所述对象被分类为用于管理其低NASH活性或中度NASH的饮食和/或生活方式劝告的接受者或潜在接受者。
在源自于在本申请的实验部分中所描述的自举模型的特定实施方式中：
k是包含在9.51至34.37之间的数；
a是包含在-1.17至-0.47之间的数；
b是包含在0.02至0.84之间的数；
c是包含在6.10E-06至2.09E-05之间的数；
d是包含在0.07至0.89之间的数；
并且其中所述阈值被包含在0.2013至0.5965之间，更特别地等于0.4661。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.2013至0.5965之间的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
在也源自于所述自举模型的另一个特定实施方式中：
k等于21.94；
a等于-0.82；
b等于0.43；
c等于1.35E-05；
d等于0.48；
并且其中所述阈值被包含在0.2013至0.5965之间，更特别地等于0.4661。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.2013至0.5965之间的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
根据该特定实施方式，所述AUC至少等于0.80，优选为0.82。
在源自于在本申请的实验部分中所描述的中值模型的另一个特定实施方式中：
k是包含在6.02至56.69之间的数；
a是包含在-1.26至0.00之间的数；
b是包含在0.00至0.88之间的数；
c是包含在0.00至2.00E-05之间的数；
d是包含在0.00至0.96之间的数；
并且其中所述阈值被包含在0.9773至0.9955之间，更特别地等于0.9936。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.9773至0.9955之间的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
在也源自于所述中值模型的另一个特定实施方式中：
k等于28.17；
a等于-0.84；
b等于0.36；
c等于1.23E-05；
d等于0.41；
并且其中所述阈值被包含在0.9773至0.9955之间，更特别地等于0.9936。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.9773至0.9955之间的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
根据该特定实施方式，所述AUC至少等于0.80，优选为0.82。
对于所述自举和中值模型两者来说，所述AUC是非常良好的。
这意味着两种模型可以在本发明中互换使用。
也根据本发明的第一种变体的其中评估血清中的miRNA并以拷贝数/μl(log10)为单位表示的特定实施方式，所述方法包括下述步骤：
-测量hsa-miR-34、特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p，或hsa-miR-122、特别是hsa-miR-122-5p，或CK18-M30或AST，以及肝损伤的至少一种血液、血清或血浆循环标志物的血清水平，以及
-通过数学算法组合结果，以获得NASH分值。
在本发明的该第一种变体的另一个优选实施方式中，所述方法包括下述步骤：
-测量hsa-miR-34、特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p，或hsa-miR-122、特别是hsa-miR-122-5p，或CK18-M30或AST的血清水平，
-测量α2-巨球蛋白的水平，
-测量糖化血红蛋白(HbA1c)水平、空腹葡萄糖水平或果糖胺水平，
-测量YKL-40的水平。
也根据这个特定实施方式，所述分值被定义为具有以拷贝数/μl(log10)为单位表示的has-miR-34a(特别是hsa-miR-34a-5p)的血清水平的逻辑函数：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D
其中：
S是NASH分值；
A是以拷贝数/μL(log10)为单位的hsa-miR-34a(特别是hsa-miR-34a-5p)的血清水平；
B是以g/L为单位的α2-巨球蛋白的血清水平；
C是以pg/ml为单位的YKL-40的血清水平；
D是以百分数为单位的HbA1c水平(例如如果测量到的HbA1c百分数为10％，则D等于10)；
k是所述逻辑函数的常数；
a是与所述hsa-miR-34a(特别是hsa-miR-34a-5p)的血清水平相关的系数；
b是与所述α2-巨球蛋白的血清水平相关的系数；
c是与所述YKL-40的血清水平相关的系数；
d是与所述HbA1c水平相关的系数。
因此，所述NASH分值是具有中至高的NASH活性或严重NASH的概率。
如果S大于或等于阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为将进行NASH治疗或可能将进行NASH治疗。根据特定实施方式，如果S低于阈值，则所述对象可以被分类为将进行治疗或将不进行治疗，特别是将不进行治疗，和/或所述对象被分类为用于管理其低NASH活性或中度NASH的饮食和/或生活方式劝告的接受者或潜在接受者。
在源自于在本申请的实验部分中所描述的自举模型的特定实施方式中：
k是包含在-14.50至-7.40之间的数；
a是包含在1.38至3.58之间的数；
b是包含在0.02至0.84之间的数；
c是包含在5.98E-06至2.08E-05之间的数；
d是包含在0.07至0.89之间的数；
并且其中所述阈值被包含在0.1895至0.6089之间，更特别地等于0.4255。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.1895至0.6089之间的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
在也源自于所述自举模型的另一个特定实施方式中：
k等于-10.95；
a等于2.48；
b等于0.43；
c等于1.34E-05；
d等于0.48；
并且其中所述阈值被包含在0.1895至0.6089之间，更特别地等于0.4255。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.1895至0.6089之间的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
根据该特定实施方式，所述AUC至少等于0.80，优选为0.82。
在源自于在本申请的实验部分中所描述的中值模型的另一个特定实施方式中：
k是包含在-27.16至-0.78之间的数；
a是包含在0至3.97之间的数；
b是包含在0至0.89之间的数；
c是包含在0至1.98E-05之间的数；
d是包含在0至0.97之间的数；
并且其中所述阈值被包含在0.1421至0.4556之间，更特别地等于0.3201。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.1421至0.4556之间的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
在另一个特定实施方式中：
k等于–11.03；
a等于2.59；
b等于0.38；
c等于1.21E-05；
d等于0.40；
并且其中所述阈值被包含在0.1421至0.4556之间，更特别地等于0.3201。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.1421至0.4556之间的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
根据该特定实施方式，所述AUC至少等于0.80，优选为0.82。
在涉及在血清中评估并以拷贝数/μl(log10)为单位表示的miRNA的该第一种变体的最后一个实施方式中，申请人还决定将某些其他生物标志物的测量值转变成log10值。这意味着上面定义的某些标志物的测量值以log10为单位表示。
因此，根据本发明的第一种情况的该最后一个实施方式，所述方法包括下述步骤：
-测量hsa-miR-34、特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p，或hsa-miR-122、特别是hsa-miR-122-5p，或CK18-M30、或ALT或AST，以及肝损伤的至少一种血液、血清或血浆循环标志物的血清水平，以及
-通过数学算法组合结果，以获得NASH分值。
在本发明的该变体的另一个优选实施方式中，所述方法包括下述步骤：
-测量hsa-miR-34、特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p，或hsa-miR-122、特别是hsa-miR-122-5p，或CK18-M30或ALT或AST的血清水平，
-测量log10(HOMA)(稳态模型评估)或空腹血浆葡萄糖或空腹血清葡萄糖或log10(果糖胺)或HBA1C或胰岛素或C-肽的水平，
-测量log10(YKL-40)的水平。
也根据这个特定实施方式，所述分值被定义为具有以拷贝数/μl(log10)为单位表示的hsa-miR-34a(特别是hsa-miR-34a-5p)的血清水平的逻辑函数：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C
其中：
S是NASH分值；
A是以拷贝数/μL(log10)为单位的hsa-miR-34a(特别是hsa-miR-34a-5p)的血清水平；
B是log10(HOMA)的血清水平；
C是log10(YKL-40)的血清水平；
k是所述逻辑函数的常数；
a是与hsa-miR-34a(特别是hsa-miR-34a-5p)的血清水平相关的系数；
b是与log10(HOMA)的血清水平相关的系数；
c是与log10(YKL-40)的血清水平相关的系数。
因此，所述NASH分值是具有中至高的NASH活性或严重NASH的概率。
如果S大于或等于阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为将进行NASH治疗或可能将进行NASH治疗。根据特定实施方式，如果S低于阈值，则所述对象可以被分类为将进行治疗或将不进行治疗，特别是将不进行治疗，和/或所述对象被分类为用于管理其低NASH活性或中度NASH的饮食和/或生活方式劝告的接受者或潜在接受者。
在源自于在本申请的实验部分中所描述的自举模型的特定实施方式中：
k是包含在-25.68至-13.34之间的数；
a是包含在1.62至3.78之间的数；
b是包含在0.40至2.52之间的数；
c是包含在1.37至3.61之间的数。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.2392至0.5907之间的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
在仍源自于所述自举模型的另一个特定实施方式中：
k等于-19.51；
a等于2.70；
b等于1.46；
c等于2.49；
并且其中所述阈值被包含在0.2392至0.5907之间，更特别地等于0.5313。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.2392至0.5907之间的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥2，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
根据该特定实施方式，所述AUC至少等于0.80，优选为0.82。
第二亚类的患者
在本发明的情形中并且在本发明的第二种变体中，第二亚类的患者被定义为或等同于表现出下述源自于肝组织活检的等级的患者：
-脂肪变性分值≥1
-肝细胞膨胀分值≥1
-小叶炎症分值≥1
-NAS(NAFLD活性分值)≥4(NAS被定义为脂肪变性分值、肝细胞膨胀分值和小叶炎症分值之和)
-纤维化阶段≥1(例如纤维化阶段等于1、2、3或4)。
本发明的方法包括测量hsa-miR-34或其共线变量之一以及肝损伤的至少一种其他血液、血清或血浆循环标志物。
根据统计分析，所述生物标志物也通过如下所述的共线性检验进行检验。
在用于鉴定(或诊断)所述第二亚类的患者的方法的第一种变体中，测量hsa-miR-34、特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p的水平，并且所述共线变量选自hsa-miR-122、特别是hsa-miR-122-5p，和hsa-miR-192、特别是hsa-miR-192-5p。
在本发明的第二种变体的优选实施方式中，所述方法包括下述步骤：
-测量hsa-miR-34、特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p的水平，并且所述共线变量选自hsa-miR-122、特别是hsa-miR-122-5p，和hsa-miR-192、特别是hsa-miR-192-5p，
-测量YKL-40的水平；并且任选地
-测量尿液比重(Uri Spec Grav)或尿液肌酐的水平；
-测量嗜碱性粒细胞的水平；和
-测量HSCRP(高敏C反应蛋白)的水平。
在源自于中值模型的本发明的该第二种变体的更优选实施方式中，所述方法包括下述步骤：
-测量hsa-miR-34、特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p的水平，
-测量YKL-40的水平。
在本发明的第二种变体的特定实施方式中，本发明的NASH分值从如上所提供的测量到的下述标志物水平计算：
-miR-34a(更特别是miR-34a-5p)的水平；和
-YKL-40的水平。
在本发明的第二种变体的另一个特定实施方式中，所述分值被定义为逻辑函数：
其中：
Y＝k+a*A+b*B
其中：
S是NASH分值；
A是以Cq为单位的hsa-miR-34a(特别是hsa-miR-34a-5p)的水平；
B是以pg/ml为单位的YKL-40水平；
k是包含在-116.08至40.97之间的数；
a是包含在-0.82至0之间的数；
b是包含在0至1.88E-05之间的数；
并且其中所述阈值被包含在0.1387至0.3481之间，更特别地等于0.2187。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.1387至0.3481之间、更特别地等于0.2187的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥1，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
如果S大于或等于阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥1，和/或被分类为将进行NASH治疗或可能将进行NASH治疗。根据特定实施方式，如果S低于阈值，则所述对象可以被分类为将进行治疗或将不进行治疗，特别是将不进行治疗，和/或所述对象被分类为用于管理其低NASH活性或中度NASH的饮食和/或生活方式劝告的接受者或潜在接受者。
在仍源自于在本申请的实验部分中所描述的中值模型的特定实施方式中：
k等于12,87；
a等于-0.42；
b等于8.160E-06；
并且其中所述阈值被包含在0.1387至0.3481之间，更特别地等于0.2187。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.1387至0.3481之间、更特别地等于0.2187的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥1，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
根据该特定实施方式，所述AUC至少等于0.68，优选为0.70。
在源自于所述自举模型的本发明的第二种变体的另一个优选实施方式中，所述方法包括下述步骤：
-测量hsa-miR-34、特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p的水平，
-测量YKL-40的水平，
-测量尿液比重水平，
-测量嗜碱性粒细胞的水平，
-测量HSCRP的水平。
在本发明的第二种变体的特定实施方式中，本发明的NASH分值从如上所提供的测量到的下述标志物水平计算：
-miR-34a(更特别是miR-34a-5p)的水平；和
-YKL-40的水平，和
-尿液比重的水平，和
-嗜碱性粒细胞的水平，和
-HSCRP的水平。
在本发明的第二种变体的另一个特定实施方式中，所述分值被定义为逻辑函数：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F
其中：
S是NASH分值；
A是以Cq为单位的hsa-miR-34a(特别是hsa-miR-34a-5p)的水平；
B是以pg/ml为单位的YKL-40水平；
C是尿液比重的水平(无单位)；
D是以10e9/L为单位的嗜碱性粒细胞水平；
F是以mg/dL为单位的HSCRP水平；
k是包含在-124.81至1.13之间的数；
a是包含在-0.91至-0.25之间的数；
b是包含在4.77e-06至2.39e-05之间的数；
c是包含在17.21至141.51之间的数；
d是包含在2.80至60.74之间的数；
f是包含在0.01至0.23之间的数；
并且其中所述阈值被包含在0.5791至0.8269之间，更特别地等于0.7758。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.5791至0.8269之间的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥1，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
如果S大于或等于阈值，则所述对象被分类为具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥1，和/或被分类为将进行NASH治疗或可能将进行NASH治疗。根据特定实施方式，如果S低于阈值，则所述对象可以被分类为将进行治疗或将不进行治疗，特别是将不进行治疗，和/或所述对象被分类为用于管理其低NASH活性或中度NASH的饮食和/或生活方式劝告的接受者或潜在接受者。
在源自于在本申请的实验部分中所描述的自举模型的特定实施方式中：
k等于-61.84；
a等于-0.58；
b等于1.44E-05；
c等于79.36；
d等于31.77；
f等于0.12；
并且其中所述阈值被包含在0.5791至0.8269之间，更特别地等于0.7758。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.5791至0.8269之间的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段≥1，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
根据该特定实施方式，所述AUC至少等于0.75，优选为0.77。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含用于确定下述标志物的水平的工具：
(i)选自hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a、更特别是miR-34a-5p)，或hsa-miR-122、特别是hsa-miR-122-5p，或hsa-miR-192、特别是hsa-miR-192-5p的至少一种标志物，和
(ii)YKL-40；以及任选地
(iii)尿液比重(Uri Spec Grav)或尿液肌酐，嗜碱性粒细胞，和HSCRP(高敏C反应蛋白)。
在本发明的特定实施方式中，所述试剂盒包含用于确定下述标志物的水平的工具：
(i)hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a、更特别是miR-34a-5p)，和
(ii)YKL-40。
在本发明的另一个特定实施方式中，所述试剂盒包含用于确定下述标志物的水平的工具：
(i)hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a、更特别是miR-34a-5p)，和
(ii)YKL-40,，和
(iii)尿液比重，和
(iv)嗜碱性粒细胞，和
(v)HSCRP。
本发明的试剂盒可用于执行上文描述的方法，并且还可以任选地包含用于执行所述方法的说明书。所述试剂盒可以包含适用于执行上面鉴定的标志物的水平的测量的试剂和缓冲液。具体来说，所述试剂盒可以包含特异性针对待定量的蛋白质的抗体和/或可用于定量micro-RNA水平的引物，正如本领域中公知的。
第三亚类的患者
在本发明的情形中并且在本发明的第三种变体中，第三亚类的患者被定义为或等同于表现出下述源自于肝组织活检的等级的患者：
-脂肪变性分值≥1
-肝细胞膨胀分值≥1
-小叶炎症分值≥1
-NAS(NAFLD活性分值)≥4(NAS被定义为脂肪变性分值、肝细胞膨胀分值和小叶炎症分值之和)
-纤维化阶段＝1b、1c、2、3或4。
在本发明的第三种变体的优选实施方式中，所述方法包括下述步骤：
-测量hsa-miR-34、特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p，或hsa-miR-122、特别是hsa-miR-122-5p，或hsa-miR-192、特别是hsa-miR-192-5p的水平，
-测量CK18-M65或CK18-M30或AST或ALT的水平，和
-测量尿液β-NAG的水平，和
-测量白细胞或嗜中性粒细胞的水平，和
-测量α2-巨球蛋白的水平，以及任选地
-测量hsa-miR-200、特别是hsa-miR-200a、更特别是hsa-miR-200a-3p的水平，和
-测量纤维蛋白原的水平，和
-测量所述患者的身高。
在源自于中值模型的本发明的该第三种变体的更优选实施方式中，所述方法包括下述步骤：
-测量hsa-miR-34、特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p，或hsa-miR-122、特别是hsa-miR-122-5p，或hsa-miR-192、特别是hsa-miR-192-5p的水平，
-测量CK18-M65或CK18-M30或AST或ALT的水平，和
-测量尿液β-NAG的水平，和
-测量白细胞或嗜中性粒细胞的水平，和
-测量α2-巨球蛋白的水平，和
-测量hsa-miR-200、特别是hsa-miR-200a、更特别是hsa-miR-200a-3p的水平。
在源自于中值模型的本发明的第三种情况的特定实施方式中，本发明的NASH分值从如上提供的测量到的下述标志物水平计算：
-miR-34a(特别是miR-34a-5p)的水平，和
-CK18-M65的水平，和
-尿液β-NAG的水平，和
-白细胞水平，和
-α2-巨球蛋白的水平，
-hsa-miR-200a(特别是hsa-miR-200a-3p)的水平。
在本发明的第三种变体的另一个特定实施方式中，所述分值被定义为逻辑函数：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F+g*G
其中：
S是NASH分值；
A是以Cq为单位的hsa-miR-34a(特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p)的水平；
B是以U/L为单位的CK18-M65水平；
C是以U/L为单位的尿液β-NAG水平；
D是以10e9/L为单位的白细胞水平；
F是以g/L为单位的α2-巨球蛋白水平；
G是以Cq为单位的hsa-miR-200a(特别是hsa-miR-200a-3p)的水平；
k是包含在-69.89至57.02之间的数；
a是包含在-1.09至0之间的数；
b是包含在0至0.005之间的数；
c是包含在0至0.28之间的数；
d是包含在0至0.69之间的数；
f是包含在0至1.08之间的数；
g是包含在-0.80至0之间的数；
并且其中所述阈值被包含在0.0197至0.1136之间，更特别地等于0.0592。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.0197至0.1136之间、更特别地等于0.0592的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段＝1b、1c、2、3或4，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
如果S大于或等于阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段＝1b、1c、2、3或4，和/或被分类为将进行NASH治疗或可能将进行NASH治疗。根据特定实施方式，如果S低于阈值，则所述对象可以被分类为将进行治疗或将不进行治疗，特别是将不进行治疗，和/或所述对象被分类为用于管理其低NASH活性或中度NASH的饮食和/或生活方式劝告的接受者或潜在接受者。
在仍源自于在本申请的实验部分中所描述的中值模型的特定实施方式中：
k等于24,98；
a等于-0.54；
b等于0.002；
c等于0.14；
d等于0.32；
f等于0.43，并且
g等于-0.37；
并且其中所述阈值被包含在0.0197至0.1136之间，更特别地等于0.0592。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.0197至0.1136之间、更特别地等于0.0592的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段＝1b、1c、2、3或4，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
根据该特定实施方式，所述AUC至少等于0.80，优选为0.82，更优选为0.83。
在源自于所述自举模型的本发明的该第三种变体的更优选实施方式中，所述方法包括下述步骤：
-测量hsa-miR-34、特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p，或hsa-miR-122、特别是hsa-miR-122-5p，或hsa-miR-192、特别是hsa-miR-192-5p的水平，
-测量CK18-M65或CK18-M30或AST或ALT的水平，和
-测量尿液β-NAG的水平，和
-测量白细胞或嗜中性粒细胞的水平，和
-测量α2-巨球蛋白的水平，和
-测量纤维蛋白原的水平，和
-测量身高。
在源自于所述自举模型的本发明的第三种变体的特定实施方式中，本发明的NASH分值从如上所提供的测量到的下述标志物水平计算：
-hsa-miR-34a、特别是hsa-miR-34a-5p的水平，
-CK18-M65的水平，和
-尿液β-NAG的水平，和
-白细胞的水平，和
-α2-巨球蛋白的水平，
-纤维蛋白原的水平，
-所述患者的身高水平。
在本发明的第三种变体的另一个特定实施方式中，所述分值被定义为逻辑函数：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F+g*G+h*H
其中：
S是NASH分值；
A是以Cq为单位的hsa-miR-34a(特别是hsa-miR-34a-5p)的水平；
B是以U/L为单位的CK18-M65水平；
C是以U/L为单位的尿液β-NAG水平；
D是以10E9/L为单位的白细胞水平；
F是以g/L为单位的α2-巨球蛋白水平；
G是以g/L为单位的纤维蛋白原水平；
H是以cm为单位的身高水平；
k是包含在8.31至35.79之间的数；
a是包含在-0.96至-0.26之间的数；
b是包含在0.0006至0.0034之间的数；
c是包含在0.04至0.24之间的数；
d是包含在0.04至0.52之间的数；
f是包含在0.07至0.89之间的数；
g是包含在0.14至1.28之间的数；
h是包含在-0.08至-0.001之间的数；
并且其中所述阈值被包含在0.3373至0.7260之间，更特别地等于0.6370。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.3373至0.7260之间、更特别地等于0.6370的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段＝1b、1c、2、3或4，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
如果S大于或等于阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段＝1b、1c、2、3或4，和/或被分类为将进行NASH治疗或可能将进行NASH治疗。根据特定实施方式，如果S低于阈值，则所述对象可以被分类为将进行治疗或将不进行治疗，特别是将不进行治疗，和/或所述对象被分类为用于管理其低NASH活性或中度NASH的饮食和/或生活方式劝告的接受者或潜在接受者。
在仍源自于在本申请的实验部分中所描述的自举模型的特定实施方式中：
k等于22.05；
a等于-0.61；
b等于0.002；
c等于0.14；
d等于0.28；
f等于0.48；
g等于0.71；并且
h等于-0.04；
并且其中所述阈值被包含在0.3373至0.7260之间，更特别地等于0.6370。
根据特定实施方式，如果所述NASH分值S高于或等于包含在0.3373至0.7260之间，更特别地等于0.6370的阈值，则所述对象被分类为具有NASH，或已具有或可能具有脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4和纤维化阶段＝1b、1c、2、3或4，和/或被分类为治疗的接受者或潜在接受者。
根据该特定实施方式，所述AUC至少等于0.80，优选为0.82，更优选为0.84。
根据该第三种变体，本发明还涉及一种试剂盒，其包含用于确定下述标志物的水平的工具：
(i)选自hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a、更特别是hsa-miR-34a-5p)，hsa-miR-122、特别是hsa-miR-122-5p，和hsa-miR-192、特别是hsa-miR-192-5p的至少一种标志物，和
(ii)CK18-M65或CK18-M30或AST或ALT，和
(iii)尿液β-NAG，和
(iv)白细胞或嗜中性粒细胞，和
(v)α2-巨球蛋白，和任选地
(vi)hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a、更特别是hsa-miR-200a-3p)、纤维蛋白原和身高。
在本发明的特定实施方式中，所述试剂盒包含用于确定下述标志物的水平的工具：
(i)hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a、更特别是miR-34a-5p)，和
(ii)CK18-M65，和
(iii)尿液β-NAG，和
(iv)白细胞，和
(v)α2-巨球蛋白，和
(vi)hsa-miR-200(特别是hsa-miR-200a、更特别是hsa-miR-200a-3p)。
在本发明的另一个特定实施方式中，所述试剂盒包含用于确定下述标志物的水平的工具：
(i)hsa-miR-34(特别是hsa-miR-34a、更特别是miR-34a-5p)，和
(ii)CK18-M65，和
(iii)尿液β-NAG，和
(iv)白细胞，和
(v)α2-巨球蛋白，和
(vi)纤维蛋白原，和
(vii)身高。
本发明的试剂盒可用于执行上文描述的方法，并且还可以任选地包含用于执行所述方法的说明书。所述试剂盒可以包含适用于执行上面鉴定的标志物的水平的测量的试剂和缓冲液。具体来说，所述试剂盒可以包含特异性针对待定量的蛋白质的抗体和/或可用于定量micro-RNA水平的引物，正如本领域中公知的。
根据另一方面，本发明还涉及用于对患者进行分类的不同方法。
治疗方法
本发明还涉及一种用于在对象中治疗NASH的方法，所述方法包括：
(a)按照上文提供的方法，在对象中诊断NASH或确定NASH的活性、阶段或严重性，将对象分类为NASH治疗的接受者或非接受者，确定基于药物同化的医学治疗的功效，确定NASH的发展或消退，并确定患者的结果；
(b)在步骤(a)的基础上向所述对象施用NASH治疗。
本发明还涉及一种用于在对象中治疗NASH的方法，所述方法包括：
(a)按照如上所定义的分类方法将所述对象分类；
(b)如果按照步骤(a)将所述对象分类为NASH治疗的接受者，则向所述对象施用NASH治疗。
本发明还涉及一种用于在对象中管理低的NASH活性或中度NASH的方法，所述方法包括：
(a)按照如上所定义的分类方法将所述对象分类；
(b)如果按照步骤(a)将所述对象分类为治疗的非接受者，则向所述对象提供饮食和/或生活方式推荐意见。
本发明的治疗NASH的方法包括向有需要的对象给药一种或多种抗NASH化合物，例如式(I)的化合物，或其可药用盐：
其中：
X1表示卤素、R1或G1-R1基团：
A表示CH＝CH或CH2-CH2基团：
X2表示G2-R2基团；
G1和G2相同或不同，表示氧或硫原子；
R1表示氢原子，未取代的烷基，芳基，或被一个或多个卤素原子、烷氧基或烷硫基、环烷基、环烷硫基或杂环基取代的烷基；
R2表示至少被–COOR3基团取代的烷基，其中R3表示氢原子或被一个或多个卤素原子、环烷基或杂环基取代或未取代的烷基；
R4和R5相同或不同，表示被一个或多个卤素原子、环烷基、杂环基取代或未取代的烷基。
在这种用于治疗NASH的方法的特定实施方式中，所述式(I)的化合物选自1-[4-甲硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-甲硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-异丙氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-甲硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲氧基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-叔丁氧基羰基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、1-[4-三氟甲氧基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮、2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲硫基)苯基]-3-氧代-丙基]苯氧基]-2-甲基丙酸和2-[2,6-二甲基-4-[3-[4-(甲硫基)苯基]-3-氧代-丙基]苯氧基]-2-甲基-丙酸异丙基酯，或其可药用盐。在本发明的另一个特定实施方式中，所述式(I)的化合物是1-[4-甲硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮或其可药用盐。
可用于本发明的NASH治疗方法中的其他化合物可以包括但不限于选自下述类别和后文中的特定化合物的化合物。
可用于本发明的实践的说明性、非限制性的抗NASH药剂包括：
-乙酰CoA羧化酶抑制剂；
-抗LPS抗体；
-顶膜钠互相依赖性胆汁酸转运蛋白抑制剂；
-生物活性脂类；
-大麻素CB1受体拮抗剂；
-半胱天冬酶抑制剂；
-组织蛋白酶抑制剂；
-CCR拮抗剂；
-二酰基甘油-O-酰基转移酶(DGAT)抑制剂；
-二肽基肽酶IV(DPP4)抑制剂；
-双重NOX(NADPH氧化酶)1&4抑制剂；
-细胞外基质蛋白调节剂；
-硬脂酰CoA去饱和酶-1抑制剂/脂肪酸胆汁酸偶联物(FABAC)；
-法尼醇X受体(FXR)激动剂；
-成纤维细胞生长因子19(FGF-19)重组体；
-成纤维细胞生长因子21(FGF-21)激动剂；
-半乳糖凝集素3抑制剂；
-胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物；
-G蛋白偶联受体(GPCR)调节剂；
-整合蛋白抑制剂；
-白三烯(LT)/磷酸二酯酶(PDE)/脂氧合酶(LO)抑制剂；
-大环内酯类；
-miRNA拮抗剂；
-单克隆抗体；
-mTOR调节剂；
-核受体配体；
-P2Y13蛋白激动剂；
-蛋白酶活化受体(PAR)-2拮抗剂；
-蛋白激酶调节剂；
-PPARα激动剂；
-PPARγ激动剂；
-PPARδ激动剂；
-PPARα/γ激动剂；
-PPARα/δ激动剂；
-PPARγ/δ；
-PPARα/γ/δ激动剂或PPAR泛激动剂；
-Rho相关蛋白激酶2(ROCK2)抑制剂；
-信号调控激酶1(ASK1)抑制剂；
-钠-葡萄糖转运(SGLT)2抑制剂；
-硬脂酰CoA去饱和酶-1抑制剂/脂肪酸胆汁酸偶联物；
-甲状腺受体β(THRβ)激动剂；
-Toll样受体4(TLR-4)拮抗剂；
-酪氨酸激酶受体(RTK)调节剂；
-血管黏附蛋白-1(VAP-1)抑制剂；和
-维生素D受体(VDR)激动剂。
其他抗NASH药剂包括KB-GE-001、NGM-386、NGM-395、NC-10和TCM-606F。
根据本发明，术语“乙酰CoA羧化酶抑制剂”当在本文中使用时，包括但不限于GS-0976、ND-654、AC-8632、PF05175157。
根据本发明，术语“抗LPS抗体”当在本文中使用时，包括但不限于IMM-124-E。
根据本发明，术语“顶膜钠互相依赖性胆汁酸转运蛋白抑制剂”当在本文中使用时，包括但不限于A-4250、volixibat、以前被称为SHP-625的maralixibat、GSK-2330672、elobixibat、CJ-14199。
根据本发明，术语“生物活性脂类”当在本文中使用时，包括但不限于5-羟基二十碳五烯酸(15-HEPE，DS-102)。
根据本发明，术语“大麻素CB1受体拮抗剂”当在本文中使用时，包括但不限于namacizumab、GRC-10801、MRI-1569、MRI-1867、DBPR-211、AM-6527:AM-6545、NESS-11-SM、CXB-029、GCC-2680、TM-38837、Org-50189、PF-514273、BMS-812204、ZYO-1、AZD-2207、AZD-1175、奥替那班、伊必那班、溴乙那班、利莫那班、屈那班、SLV-326、V-24343、O-2093。
根据本发明，术语“半胱天冬酶抑制剂”当在本文中使用时，包括但不限于恩利卡生、belnacasan、nivocasan、IDN-7314、F-573、VX-166、YJP-60107、MX-1122、IDN-6734、TLC-144、SB-234470、IDN-1965、VX-799、SDZ-220-976、L-709049。
根据本发明，术语“组织蛋白酶抑制剂”当在本文中使用时，包括但不限于VBY-376、VBY-825、VBY-036、VBY-129、VBY-285、Org-219517、LY3000328、RG-7236、BF/PC-18。
根据本发明，术语“CCR拮抗剂”当在本文中使用时，包括但不限于cenicriviroc(CCR2/5拮抗剂)、PG-092、RAP-310、INCB-10820、RAP-103、PF-04634817、CCX-872。
根据本发明，术语“二酰基甘油-O-酰基转移酶抑制剂”当在本文中使用时，包括但不限于以前被称为ISIS-DGAT2Rx的IONIS-DGAT2Rx、LY-3202328、BH-03004、KR-69530、OT-13540、AZD-7687、ABT-046。
根据本发明，术语“二肽基肽酶IV抑制剂”当在本文中使用时，包括但不限于evogliptin、维达列汀、复格列汀、阿格列汀、沙格列汀、tilogliptin、阿拉格列汀、西他列汀、瑞格列汀、美罗利汀、戈格列汀、曲格列汀、替格列汀、dutogliptin、利拉利汀、吉格利汀、yogliptin、betagliptin、imigliptin、奥格列汀、维达列汀、地那列汀。
根据本发明，术语“双重NOX(NADPH氧化酶)1&4抑制剂”当在本文中使用时，包括但不限于以前被称为GKT137831的GKT-831、GKT-901。
根据本发明，术语“细胞外基质蛋白调节剂”当在本文中使用时，包括但不限于CNX-024、CNX-025、SB-030。
根据本发明，术语“法尼醇X受体(FXR)激动剂”当在本文中使用时，包括但不限于奥贝胆酸、GS-9674、LJN-452、EDP-305、AKN-083、INT-767、GNF-5120、LY2562175、INV-33、NTX-023-1、EP-024297、Px-103、SR-45023。
根据本发明，术语“成纤维细胞生长因子19(FGF-19)重组体”当在本文中使用时，包括但不限于NGM-282。
根据本发明，术语“成纤维细胞生长因子21(FGF-21)激动剂”当在本文中使用时，包括但不限于以前被称为BMS-986036的PEG-FGF21、YH-25348、BMS-986171、YH-25723、LY-3025876、NNC-0194-0499。
根据本发明，术语“半乳糖凝集素3抑制剂”当在本文中使用时，包括但不限于GR-MD-02、TD-139、ANG-4021、半乳糖凝集素-3C、LJPC-201、TFD-100、GR-MD-03、GR-MD-04、GM-MD-01、GM-CT-01、GM-CT-02、Gal-100、Gal-200。
根据本发明，术语“胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物”当在本文中使用时，包括但不限于索马鲁肽、利拉鲁肽、艾塞那肽、albiglutide、度拉糖肽、利西拉肽、loxenatide、efpeglenatide、他司鲁肽、MKC-253、DLP-205、ORMD-0901。
根据本发明，术语“G蛋白偶联受体(GPCR)调节剂”当在本文中使用时，包括但不限于CNX-023。
根据本发明，术语“整合蛋白抑制剂”当在本文中使用时，包括但不限于PliantTherapeutic的整合蛋白抑制剂、Indalo Therapeutics的整合蛋白抑制剂、St Louis大学的整合蛋白抑制剂、ProAgio、GSK-3008348。
根据本发明，术语“白三烯/磷酸二酯酶/脂氧合酶抑制剂”当在本文中使用时，包括但不限于tipelukast(以前被称为MN-001)、托鲁司特、硫鲁司特、masilukast、扎鲁司特、普鲁司特、孟鲁司特、gemilukast、维鲁司特、aklukast、pobilikast、西那司特、伊拉司特。
根据本发明，术语“大环内酯类”当在本文中使用时，包括但不限于索利霉素、阿奇霉素、红霉素。
根据本发明，术语“miRNA拮抗剂”当在本文中使用时，包括但不限于以前被称为AZD4076的RG-125、RGLS-5040、RG-101、MGN-5804、MRG-201。
根据本发明，术语“金属蛋白酶-9(MMP-9)刺激剂”当在本文中使用时，包括但不限于Elastomics Ab的MMP-9刺激剂。
根据本发明，术语“单克隆抗体”当在本文中使用时，包括但不限于柏替木单抗、NGM-313、靶向IL-20的mAb、以前被称为GC1008的fresolimumab(抗TGFβ抗体)、以前被称为BTT-1023的timolumab、namacizumab、奥马珠单抗、兰尼单抗、贝伐单抗、lebrikizumab、依帕珠单抗、felvizumab、马妥珠单抗、monalizumab、reslizumab、inebilizumab。
根据本发明，术语“mTOR调节剂”当在本文中使用时，包括但不限于MSDC-0602、与SVP-西罗莫司共同给药的AAV基因疗法。
根据本发明，术语“核受体配体”当在本文中使用时，包括但不限于以前被称为DV928的DUR-928。
根据本发明，术语“P2Y13蛋白激动剂”当在本文中使用时，包括但不限于CER-209。
根据本发明，术语“蛋白酶活化受体(PAR)-2拮抗剂”当在本文中使用时，包括但不限于PZ-235、NP-003。
根据本发明，术语“蛋白激酶调节剂”当在本文中使用时，包括但不限于CNX-014、MB-11055、ALF-1、芒果苷、氨来占诺、GS-444217、REG-101、缬氨酸。
根据本发明，术语“PPARα激动剂”当在本文中使用时，包括但不限于非诺贝特、环丙贝特、pemafibrate、吉非罗齐、氯贝丁酯、比尼贝特、克利贝特、氯贝酸、尼可贝特、吡贝特、普拉贝脲、罗尼贝特、theofibrate、托考贝特、SR10171。
根据本发明，术语“PPARγ激动剂”当在本文中使用时，包括但不限于吡格列酮、氘化吡格列酮、罗格列酮、efatutazone、ATx08-001、OMS-405、CHS-131、THR-0921、SER-150-DN、KDT-501、GED-0507-34-Levo、CLC-3001、ALL-4。
根据本发明，术语“PPARδ激动剂”当在本文中使用时，包括但不限于GW501516(Endurabol或({4-[({4-甲基-2-[4-(三氟甲基)苯基]-1,3-噻唑-5-基}甲基)硫烷基]-2-甲基苯氧基}乙酸))或MBX8025(Seladelpar或{2-甲基-4-[5-甲基-2-(4-三氟甲基-苯基)-2H-[l,2,3]三唑-4-基甲基硫烷基]-苯氧基}-乙酸)或GW0742([4-[[[2-[3-氟-4-(三氟甲基)苯基]-4-甲基-5-噻唑基]甲基]硫基]-2-甲基苯氧基]乙酸)或L165041或HPP-593或NCP-1046。
根据本发明，本文中使用的术语“PPARα/γ激动剂”(也被称为格列扎类)包括但不限于Saroglitazar、阿格列扎、Muraglitazar、替格列扎、DSP-8658。
除了elafibranor之外，说明性的PPARα/δ激动剂包括但不限于T913659。
根据本发明，本文中使用的术语“PPARγ/δ激动剂”包括但不限于偶联的亚油酸(CLA)、T3D-959。
根据本发明，本文中使用的术语“PPARα/γ/δ激动剂”或“PPAR泛激动剂”包括但不限于IVA337或TTA(十四烷基硫代乙酸)或Bavachinin或GW4148或GW9135或苯扎贝特或Lobeglitazone或CS038。
根据本发明，术语“Rho相关蛋白激酶2(ROCK2)抑制剂”当在本文中使用时，包括但不限于KD-025、TRX-101、BA-1049、LYC-53976、INS-117548、RKI-1447。
根据本发明，术语“信号调控激酶1(ASK1)抑制剂”当在本文中使用时，包括但不限于GS-4997。
根据本发明，术语“钠-葡萄糖转运(SGLT)2抑制剂”当在本文中使用时，包括但不限于remogliflozin、达格列净、恩格列净、埃格列净、sotagliflozin、ipragliflozin、tianagliflozin、坎格列净、托格列净、janagliflozin、bexagliflozin、鲁格列净、sergliflozin、HEC-44616、AST-1935、PLD-101。
根据本发明，术语“硬脂酰CoA去饱和酶-1抑制剂/脂肪酸胆汁酸偶联物”当在本文中使用时，包括但不限于aramchol、GRC-9332、steamchol、TSN-2998、GSK-1940029、XEN-801。
根据本发明，术语“甲状腺受体β(THRβ)激动剂”当在本文中使用时，包括但不限于VK-2809、MGL-3196、MGL-3745、SKL-14763、sobetirome、BCT-304、ZYT-1、MB-07811、伊罗替罗。
根据本发明，术语“Toll样受体4(TLR-4)拮抗剂”当在本文中使用时，包括但不限于纳曲酮、JKB-121、M-62812、瑞沙托维、dendrophilin、CS-4771、AyuV-1、AyuV-25、NI-0101、EDA-HPVE7、eritoran。
根据本发明，术语“酪氨酸激酶受体(RTK)调节剂”当在本文中使用时，包括但不限于CNX-025、KBP-7018。
根据本发明，术语“血管黏附蛋白-1(VAP-1)抑制剂”当在本文中使用时，包括但不限于PXS-4728A、CP-664511、PRX-167700、ASP-8232、RTU-1096、RTU-007、BTT-1023。
根据本发明，术语“维生素D受体(VDR)激动剂”当在本文中使用时，包括但不限于钙化醇、阿法骨化醇、1,25-二羟基维生素D3、维生素D2、维生素D3、骨化三醇、维生素D4、维生素D5、双氢速甾醇、钙泊三醇、他卡西醇1,24-二羟基维生素D3、帕立骨化醇。
本发明还致力于其他肝脏疾病，更具体来说是纤维化肝脏疾病例如：病毒性肝炎(HBV、HCV、……)、酒精性脂肪性肝炎、胆道疾病(原发性胆汁性胆管炎,原发性硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、威尔逊氏病、α1抗胰蛋白酶缺乏症)。
实施例
材料和方法
样品收集和分析
临床研究
所述临床试验(NASH的2期GOLDEN-505试验(GFT505-212-7-NCT01694849))是一项多中心随机双盲安慰剂对照的研究，用于评估每日一次Elafibranor(1-[4-甲硫基苯基]-3-[3,5-二甲基-4-羧基二甲基甲氧基苯基]丙-2-烯-1-酮)对患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的患者中的脂肪性肝炎的功效和安全性。
进行肝组织活检以在适合地排除其他病因的肝脏疾病后确认NASH的诊断。在随机分配之前6个月内，NASH作为通过肝组织活检评估的脂肪性肝炎被诊断。脂肪性肝炎的确认是基于肝组织活检的中心读数。NASH患者被定义为具有NAS≥3，包括脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀≥1和小叶炎症≥1。
所述研究在每个参加的中心处都得到适合的监管主体的批准，所有患者给出了参加医学研究的知情同意书。
来自于NASH的2期GOLDEN-505试验的血浆样品被用于鉴定NASH的最有力且显著的标志物。
进行肝组织活检以在适合地排除其他病因的肝脏疾病后确认NASH的诊断。
在随机分配之前6个月内，NASH作为通过肝组织活检评估的脂肪性肝炎被诊断。脂肪性肝炎的确认是基于肝组织活检的中心读数。
所述研究在每个参加的中心处都得到适合的监管主体的批准，所有患者给出了参加医学研究的知情同意书。
血液取样和实验室测试
血液样品按照中心实验室流程和手册(Central Laboratory Protocol andManual–Genfit–GFT505-212-7)来收集。
根据研究方案，进行以下分析。
血液学分析包括血红蛋白、血细胞比容、RBC计数、白细胞、白细胞分类计数(嗜中性粒细胞、淋巴细胞、嗜曙红细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞——绝对数值和％值)、血小板和网织红细胞。
第I组生物化学分析包括血浆葡萄糖、甘油三酯(TG)、肌酐、肌酐清除率、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酸磷酸激酶(CPK)、碱性磷酸酶、促甲状腺激素(TSH)和HbA1c。
第II组生物化学分析包括血浆葡萄糖、肌酐、肌酐清除率、总蛋白、白蛋白、钠、钾、氯化物、钙、尿酸、表示为血液尿素氮(BUN)的尿素、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、碱性磷酸酶、肌酸磷酸激酶(CPK)、总胆红素、结合胆红素、C反应蛋白(hsCRP)、AST/ALT比率和HbA1c。
尿液分析包括：
-试纸分析(比重、pH、RBC、白细胞、葡萄糖、蛋白质、酮类、胆红素、尿胆素原和亚硝酸盐)
-显微术分析包括RBC、WBC、管型、晶体、细菌、上皮细胞和酵母。
-化学分析(白蛋白和肌酐)
血清学分析包括HIV ab I/II、HCV ab、HCV RNA(仅在收到HCV RNA访视样品之后并在HCV Ab结果为“反应性”或“不确定”的情况下测试)和HbsAg。
脂类组包括甘油三酯(TG)、总胆固醇、非HDL-C(计算)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)(计算)、计算的极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)(计算)、载脂蛋白AI(ApoAI)和载脂蛋白B(ApoB)。
尿液化学包括α-1-微球蛋白、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(β-NAG)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(N-Gal)。
安全性标志物包括高半胱氨酸、NT-ProBNP、肌钙蛋白T、胱抑素C和β2-微球蛋白。
血糖和其他脂类参数包括瘦蛋白、胰岛素、稳态模型评估(HOMA-IR)、血清葡萄糖(用于HOMA-IR的计算)、果糖胺、C-肽和游离脂肪酸(FFA)。
炎性标志物包括结合珠蛋白、纤维蛋白原、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和纤溶酶原激活因子抑制剂1(PAI-1)Ag(柠檬酸盐)。
肝脏标志物包括细胞角蛋白-18(CK18)(M65&M30)、脂连蛋白、铁蛋白、α2-巨球蛋白、FGF19&FGF21、透明质酸(Advia centaur，由Siemens Belgium生产并转手归于Genfit的试剂)、III型胶原蛋白N-端前肽(PIIINP)(Advia centaur，由Siemens Belgium生产的试剂)和基质金属蛋白酶-1的组织抑制剂(TIMP-1)(Advia centaur，由Siemens生产的试剂)。
用于每种生物化学测定的方法、仪器和制造商的名单报告在下表中：
样品收集和储存
在该生物标志物研究中使用的血液样品是在治疗时段之前从505.212.7研究的患者抽取的。从每位患者获得附加样品的收集、储存和使用的书面正式知情同意书。
收集在含有柠檬酸盐的2.7mL管中的血液，通过在收集的15分钟内以1,500xg离心15分钟以将无细胞血浆与血细胞分离开而进行处理。将上清液血浆转移到新管。将管保持在-70℃下。
为了进行RNA提取，随后将血浆管以13,000xg离心2min以沉淀并除去血小板。将无血小板的上清液血浆转移到新管，在液氮中冷冻并储存在-80℃下。
含柠檬酸盐血浆中的总RNA提取和miRNA定量
通过miRNeasy提取试剂盒(miRNeasy血清/血浆试剂盒(目录号217184))并使用1:5的血浆/QIAzol比例，按照制造商的说明书，从400μl无血小板血浆提取保留有miRNA的总RNA。在RNA提取之前向所述样品添加用于掺入的合成的秀丽隐杆线虫miR-39[3,125fmoles]作为RNA提取过程的内标。在18μl洗脱缓冲液中进行洗脱。
使用Taqman miRNA qRT-PCR测定法，按照制造商的说明书来检测成熟miRNA的表达：TaqMan MicroRNA反转录试剂盒(Ref：4366596，Applied Biosystems,Carlsbad,CA)，TaqMan MicroRNA Assay 20X(Ref：4440887，Applied Biosystems)和TaqMan UniversalMaster Mix II(Ref：4440040，Applied Biosystems)。
使用PCR System 9700热循环仪(Ref：200005，Applied Biosystems)来进行反转录，循环条件为在16℃下30分钟，然后在42℃下30分钟并在85℃下5分钟，然后保持在4℃下。使用4种miRNA特异性反向引物多路执行所述反转录，以便保存RNA样品。
使用CFX96TM实时系统(C1000 TouchTM热循环仪，BioRad)来进行定量PCR，循环条件为在95℃下10分钟，然后进行总共50个循环的95℃下15秒和60℃下60秒，最后30℃下30秒。
用于潜在重要的miRNA的特异性引物的序列按照下面的表2选择。
表2：测试的miRNA的序列
在算法的构建中使用的数据为Cq格式。Cq的确定模式为回归。
血清中的总RNA提取和miRNA定量
通过miRVanaParis提取试剂盒(AM1556，Ambion)，按照制造商的说明书，从100μl血清提取保存有miRNA的血清总RNA。在RNA提取之前向所述样品添加用于掺入的合成的秀丽隐杆线虫miR-39[3,125fmoles](MSY0000010，Qiagen)作为RNA提取过程的内标。在100μl洗脱缓冲液中进行洗脱。
使用Taqman miRNA qRT-PCR测定法，按照制造商的说明书来检测成熟miRNA的表达：TaqMan MicroRNA反转录试剂盒(Ref：4366596，Applied Biosystems,Carlsbad,CA)，TaqMan MicroRNA Assay 20X(Ref：4440887，Applied Biosystems)和TaqMan UniversalMaster Mix II(Ref：4440040，Applied Biosystems)。
使用PCR System 9700热循环仪(Ref：200005，Applied Biosystems)来进行反转录，循环条件为在16℃下30分钟，然后在42℃下30分钟并在85℃下5分钟，然后保持在4℃下。使用4种miRNA特异性反向引物多路执行所述反转录，以便保存珍贵的RNA样品。
使用CFX96TM实时系统(C1000 TouchTM热循环仪，BioRad)来进行定量PCR，循环条件为在95℃下10分钟，然后进行总共50个循环的95℃下15秒和60℃下60秒，最后30℃下30秒。
用于重要miRNA的特异性引物的序列按照下面的表来选择：
将合成的hsa-miRNA(Integrated DNA Technologies)稀释到3.125fmol/mL，并将5μL与从血清样品提取的RNA同时用于反转录。将产物连续稀释，并对所有样品(标准品和血清来源的RNA)进行PCR。标准曲线进行两份平行实验，并用于将Cq数据转变成拷贝数/μL。Cq确定模式是回归。在算法的构建中使用的数据为Log10(拷贝数/μL血清)的格式。
统计分析
目的和定义
这些分析的目的是发现可以与待治疗的NASH患者的鉴定相关联的生物标志物。待治疗患者(TBT)根据所述研究的不同部分被不同地定义。
根据本发明的第一种情况，TBT被定义为：
-脂肪变性分值≥1
-肝细胞膨胀分值≥1
-小叶炎症分值≥1
-NAS(NAFLD活性分值)≥4(NAS被定义为脂肪变性分值、肝细胞膨胀分值和小叶炎症分值之和)
-纤维化阶段≥2(例如纤维化阶段等于2、3或4，特别是2或3)。
根据本发明的第二种情况，TBT被定义为：
-脂肪变性分值≥1
-肝细胞膨胀分值≥1
-小叶炎症分值≥1
-NAS(NAFLD活性分值)≥4(NAS被定义为脂肪变性分值、肝细胞膨胀分值和小叶炎症分值之和)
-纤维化阶段≥1(例如纤维化阶段等于1、2、3或4)。
根据本发明的第三种情况，TBT被定义为：
-脂肪变性分值≥1
-肝细胞膨胀分值≥1
-小叶炎症分值≥1
-NAS(NAFLD活性分值)≥4(NAS被定义为脂肪变性分值、肝细胞膨胀分值和小叶炎症分值之和)
-纤维化阶段＝1b、1c、2、3或4。
其他患者被陈述为将不进行治疗(NTBT)。对于所述分析来说，在响应变量中TBT患者被分类为1，NTBT为0。如上所示，解释性变量涵盖了在血液(血液学、生物化学、凝血、肝脏标志物、循环miRNA)或尿液(试纸、沉积物)样品中测量的广范围的生物标志物，以及人口统计学(年龄、性别、种族)、地区(研究中心、国家、洲)或医学(糖尿病)记录。
数据集管理
在本研究中使用的数据集来自于Golden-505试验，并且一开始由274位患者和121种变量构成。数据集管理包括下述步骤：
1.移除没有进行miRNA测量的患者
2.移除缺失值超过10个的变量
3.移除具有极端值的患者和28位仍具有缺失值的患者
这产生的数据集具有216位患者可用于本发明的所有方法，例外的是关于血清的方法在212位患者上进行，以及112种变量，其被用于测试解释性变量之间的共线性。
共线性的测试
Pearson相关性在定量变量之间两个两个地计算。当对于使用血浆miRNA的分析来说两个变量表现出超过0.7的相关性或者对于使用血清miRNA的分析来说超过0.6的相关性时，进行它们的平均值之差相对于定义患者TBT的响应变量的单变量检验。所选变量是更加显著。
共线和选择的变量呈现在表3至表8中。
这些变量依赖于患者定义，因此容易在一类患者与另一类患者之间变化。
中值模型
中值模型建立过程始于在对应于2/3的TBT/NTBT患者的训练集和对应于剩余1/3的TBT/NTBT患者的验证集中的数据集取样。该取样随机进行一百万次，并保留在训练和验证集之间表现出均一性(在两个集之间所有解释性变量没有显著差异)的样品用于分析。在每个训练集中计算响应变量(定义TBT/NTBT患者)相对于解释性变量(生物标志物)的逻辑广义线性模型。对于每种训练集模型来说，进行反向变量选择，并通过最低Akaike指数准则(AIC)寻找最佳模型。因此，所有解释性变量对每个训练集具有模型系数。使用显示出不为零的中值系数的变量和它们的相应系数来构建中值算法。将这种算法在每个验证集中验证(计算ROC、AUC、最佳阈值、总准确度、灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值)，并获得最佳中值阈值。为了与自举模型进行比较，也将所述中值模型应用于整个数据集进行验证。
自举模型
在自举模型建立过程中，在来自于整个数据集的所有患者上计算响应变量(定义TBT/NTBT患者)相对于解释性变量(生物标志物)的逻辑广义线性模型。进行反向变量选择，并使用AIC选择最佳算法。然后通过使用1000个自举样品运行所述最佳算法，来测试来自于该算法的变量系数的显著性。显示出95％置信区间的不为零的系数被认为是显著的。然后通过计算ROC、AUC、最佳阈值、总准确度、灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值来验证所述算法。
与其他NASH评分方法的比较
以前在文献中描述了确立NASH分值的方法：
-NAFLD纤维化分值(Angulo指数)(Angulo等，2007)
-ELF(Guha等，2008)(也参见ELF规格单http://www.healthcare.siemens.com/clinical-specialities/liver-disease/elf-test-now-avail)
-Fibrotest(Ratziu等，2006)
-Fibrometer(Cales等，2009)
-FLI(Bedogni等，2006)
-脂肪变性分值或SteatoTest(Poynard等，2005)
因此，发明人使用多种这些以前的方法来评估本发明的NASH分值。
本发明的不同模型的分值与其他分值之间的比较和本发明的不同模型的分值与各个变量之间的比较呈现在表9至13中。
本文呈现的数据显示出NASH患者或潜在NASH患者的鉴定、NASH活性、阶段或严重性的确定的准确性的惊人提高。这一发现是极为重要的，并将成为提高患者管理效率的无价工具。
参考文献
Angulo P,Hui JM,Marchesini G,Bugianesi E,George J,Farrell GC,EndersF,Saksena S,Burt AD,Bida JP,Lindor K,Sanderson SO,Lenzi M,Adams LA,Kench J,Therneau TM,Day CP(2007)“NAFLD纤维化分值：用于在具有NAFLD的患者中鉴定肝纤维化的非侵入性系统”(The NAFLD fibrosis score:a noninvasive system that identifiesliver fibrosis in patients with NAFLD)，Hepatology 45:846-854。
Bedogni G,Bellentani S,Miglioli L,Masutti F,Passalacqua M,CastiglioneA,Tiribelli C(2006)“脂肪肝指数：普通人群中肝脂肪变性的简单且准确的预测物”(TheFatty Liver Index:a simple and accurate predictor of hepatic steatosis in thegeneral population)，BMC Gastroenterol 6:33。
Cales P,Laine F,Boursier J,Deugnier Y,Moal V,Oberti F,Hunault G,Rousselet MC,Hubert I,Laafi J,Ducluzeaux PH,Lunel F(2009)“对NAFLD特异性或不特异性的肝纤维化的血液测试的比较”(Comparison of blood tests for liver fibrosisspecific or not to NAFLD)，J Hepatol 50:165-173。
Guha IN,Parkes J,Roderick P,Chattopadhyay D,Cross R,Harris S,Kaye P,Burt AD,Ryder SD,Aithal GP,Day CP,Rosenberg WM(2008)“非酒精性脂肪性肝病中纤维化的非侵入性标志物：验证欧洲肝纤维化评估组并探索简单的标志物”(Noninvasivemarkers of fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease:Validating theEuropean Liver Fibrosis Panel and exploring simple markers)，Hepatology 47:455-460。
Poynard T,Ratziu V,Naveau S,Thabut D,Charlotte F,Messous D,Capron D,Abella A,Massard J,Ngo Y,Munteanu M,Mercadier A,Manns M,Albrecht J(2005)“用于肝脂肪变性预测的生物标志物(SteatoTest)的诊断价值”(The diagnostic value ofbiomarkers(SteatoTest)for the prediction of liver steatosis)，Comp Hepatol 4:10。
Ratziu V,Massard J,Charlotte F,Messous D,Imbert-Bismut F,Bonyhay L,Tahiri M,Munteanu M,Thabut D,Cadranel JF,Le Bail B,de Ledinghen V,Poynard T(2006)“用于预测肝纤维化的生物化学标志物(FibroTest-FibroSURE)在患有非酒精性脂肪性肝病的患者中的诊断价值”(Diagnostic value of biochemical markers(FibroTest-FibroSURE)for the prediction of liver fibrosis in patients withnon-alcoholic fatty liver disease)，BMC Gastroenterol 6:6。
序列表
<110> 基恩菲特公司
<120> 非酒精性脂肪性肝炎的非侵入性诊断
<130> B2217PC00
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 1
ucaccgggug uaaaucagcu ug 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
<213> homo sapiens
<400> 2
uggaguguga caaugguguu ug 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> homo sapiens
<400> 3
uggcaguguc uuagcugguu gu 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> homo sapiens
<400> 4
uaacacuguc ugguaacgau gu 22
<210> 5
<211> 23
<212> RNA
<213> homo sapiens
<400> 5
uagcaccauu ugaaaucagu guu 23
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> homo sapiens
<400> 6
cugaccuaug aauugacagc c 21
<210> 7
<211> 23
<212> RNA
<213> homo sapiens
<400> 7
agcuacauug ucugcugggu uuc 23
<210> 8
<211> 23
<212> RNA
<213> homo sapiens
<400> 8
agcagcauug uacagggcua uga 23
<210> 9
<211> 23
<212> RNA
<213> homo sapiens
<400> 9
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23
<210> 10
<211> 23
<212> RNA
<213> homo sapiens
<400> 10
cccaguguuc agacuaccug uuc 23
<210> 11
<211> 22
<212> RNA
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 11
ucaccgggug uaaaucagcu ug 22
<210> 12
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
uggaguguga caaugguguu ug 22
<210> 13
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
uggcaguguc uuagcugguu gu 22
<210> 14
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
uaacacuguc ugguaacgau gu 22
<210> 15
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 15
uagcaccauu ugaaaucagu guu 23
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
cugaccuaug aauugacagc c 21
<210> 17
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
agcuacauug ucugcugggu uuc 23
<210> 18
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
agcagcauug uacagggcua uga 23
<210> 19
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23
<210> 20
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 20
cccaguguuc agacuaccug uuc 23

Claims (15)

1.一种用于测量血液、血清或血浆的循环hsa-miR-34a-5p和YKL-40的水平的非侵入性工具在制备试剂中的用途，所述试剂用于诊断非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，和/或用于确定对象中NASH的活性、阶段或严重性的方法中，
所述方法包括下述步骤：
-测量hsa-miR-34a-5p的水平，
-测量YKL-40的水平和任选地测量肝损伤的至少一种血液、血清或血浆循环标志物的水平，以及
-通过数学算法组合结果，以获得NASH分值。
2.根据权利要求1所述的用途，其还包括测量肝损伤的至少一种其他血液、血清或血浆循环标志物的水平。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述肝损伤的至少一种其他循环标志物选自α2-巨球蛋白、糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹葡萄糖水平、果糖胺水平、胰岛素、C-肽、稳态模型评估(HOMA)、III型胶原蛋白N-端前肽、hsa-miR-200、CK18-M30、CK18-M65、ALT、AST、尿液比重(Uri Spec Grav)、尿液肌酐、嗜碱性粒细胞、高敏反应蛋白(HSCRP)、尿液β-NAG、白细胞、嗜中性粒细胞和纤维蛋白原；
其中所述方法可以进一步包括测量至少一种其他参数例如所述对象的身高。
4.根据权利要求1所述的用途，其中NASH分值按照下述逻辑函数计算：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F+g*G
其中：
S是NASH分值；
A是以g/L为单位的α2-巨球蛋白水平；
B是以百分数为单位的HbA1c水平；
C是以ng/mL为单位的III型胶原蛋白N-端前肽的水平；
D是以Cq为单位的hsa-miR-34a-5p的水平；
F是以Cq为单位的hsa-miR-200a-3p的水平；
G是以pg/ml为单位的YKL-40水平；
k是所述逻辑函数的常数；
a是与所述α2-巨球蛋白水平相关的系数；
b是与所述HbA1c水平相关的系数；
c是与所述III型胶原蛋白N-端前肽的水平相关的系数；
d是与所述hsa-miR-34a-5p的水平相关的系数；
f是与所述hsa-miR-200a-3p的水平相关的系数；并且
g是与所述YKL-40水平相关的系数；
其中：
a)所述用途源自于中值模型，并且：
k是包含在5.94至50.74之间的数，
a是包含在0至1.07之间的数，
b是包含在0至1.20之间的数，
c是包含在0至0.24之间的数，
d是包含在-0.97至0之间的数，
f是包含在-0.87至0之间的数，
g是包含在0至1.74E-05之间的数，
其中高于包含在0.2017至0.4645之间的阈值的NASH分值指示严重的NASH或者指示中或高的NASH活性，并因此指示脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4并且纤维化阶段≥2的患者；
或者其中：
b)所述用途源自于自举模型，其中：
k是包含在8.24至35.44之间的数，
a是包含在0.06至0.88之间的数，
b是包含在0.14至1.04之间的数，
c是包含在0.03至0.23之间的数，
d是包含在-0.75至-0.05之间的数，
f是包含在-0.73至-0.07之间的数，并且
g是包含在3.59E-06至1.78E-05之间的数，
其中高于包含在0.2718至0.6391之间的阈值的NASH分值指示严重的NASH或者指示中或高的NASH活性，并因此指示脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4并且纤维化阶段≥2的患者。
5.根据权利要求4所述的用途，其中NASH分值按照下述逻辑函数计算：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F+g*G
其中：
S是NASH分值；
A是以g/L为单位的α2-巨球蛋白水平；
B是以百分数为单位的HbA1c水平；
C是以ng/mL为单位的III型胶原蛋白N-端前肽的水平；
D是以Cq为单位的hsa-miR-34a-5p的水平；
F是以Cq为单位的hsa-miR-200a-3p的水平；
G是以pg/ml为单位的YKL-40水平；
k是所述逻辑函数的常数；
a是与所述α2-巨球蛋白水平相关的系数；
b是与所述HbA1c水平相关的系数；
c是与所述III型胶原蛋白N-端前肽的水平相关的系数；
d是与所述hsa-miR-34a-5p的水平相关的系数；
f是与所述hsa-miR-200a-3p的水平相关的系数；并且
g是与所述YKL-40水平相关的系数；
其中：
a)所述用途源自于中值模型，并且：
k是25.13，
a是0.52，
b是0.57，
c是0.12，
d是-0.43，
f是-0.47，
g是9.54E-06，
其中高于等于0.2302的阈值的NASH分值指示严重的NASH或者指示中或高的NASH活性，并因此指示脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4并且纤维化阶段≥2的患者；
或者其中：
b)所述用途源自于自举模型，其中：
k是21.84，
a是0.47，
b是0.59，
c是0.13，
d是-0.4，
f是-0.4，并且
g是1.07E-05，
其中高于等于0.3502的阈值的NASH分值指示严重的NASH或者指示中或高的NASH活性，并因此指示脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4并且纤维化阶段≥2的患者。
6.根据权利要求1所述的用途，其中NASH分值按照下述逻辑函数计算：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D
其中：
a)所述用途源自于自举模型，并且其中：
S是NASH分值；
A是以Cq为单位的hsa-miR-34a-5p的血清水平；
B是以g/L为单位的α2-巨球蛋白的血清水平；
C是以pg/ml为单位的YKL-40的血清水平；
D是以百分数为单位的HbA1c水平；
k是所述逻辑函数的常数；
a是与所述hsa-miR-34a-5p的血清水平相关的系数；
b是与所述α2-巨球蛋白的血清水平相关的系数；
c是与所述YKL-40的血清水平相关的系数；并且
d是与所述HbA1c水平相关的系数；
其中：
k是包含在9.51至34.37之间的数，
a是包含在-1.17至-0.47之间的数，
b是包含在0.02至0.84之间的数，
c是包含在6.10E-06至2.09E-05之间的数，
d是包含在0.07至0.89之间的数，
其中高于包含在0.2013至0.5965之间的阈值的NASH分值指示严重的NASH或者指示中或高的NASH活性，并因此指示脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4并且纤维化阶段≥2的患者；
或者其中：
b)所述用途源自于中值模型，其中：
k是包含在6.02至56.69之间的数，
a是包含在-1.26至0.00之间的数，
b是包含在0.00至0.88之间的数，
c是包含在0.00至2.00E-05之间的数，
d是包含在0.00至0.96之间的数，
其中高于包含在0.9773至0.9955之间的阈值的NASH分值指示严重的NASH或者指示中或高的NASH活性，并因此指示脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4并且纤维化阶段≥2的患者。
7.根据权利要求6所述的用途，其中NASH分值按照下述逻辑函数计算：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D
其中：
a)所述用途源自于自举模型，并且其中：
S是NASH分值；
A是以Cq为单位的hsa-miR-34a-5p的血清水平；
B是以g/L为单位的α2-巨球蛋白的血清水平；
C是以pg/ml为单位的YKL-40的血清水平；
D是以百分数为单位的HbA1c水平；
k是所述逻辑函数的常数；
a是与所述hsa-miR-34a-5p的血清水平相关的系数；
b是与所述α2-巨球蛋白的血清水平相关的系数；
c是与所述YKL-40的血清水平相关的系数；并且
d是与所述HbA1c水平相关的系数；
其中：
k是21.94，
a是-0.82，
b是0.43，
c是1.35E-05，
d是0.48，
其中高于等于0.4661的阈值的NASH分值指示严重的NASH或者指示中或高的NASH活性，并因此指示脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4并且纤维化阶段≥2的患者；
或者其中：
b)所述用途源自于中值模型，其中：
k是28.17，
a是-0.84，
b是0.36，
c是1.23E-05，
d是0.41，
其中高于等于0.9936的阈值的NASH分值指示严重的NASH或者指示中或高的NASH活性，并因此指示脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4并且纤维化阶段≥2的患者。
8.根据权利要求1所述的用途，其中NASH分值按照下述逻辑函数计算：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D
其中：
S是NASH分值；
A是以拷贝数/μL(log10)为单位的hsa-miR-34a-5p的血清水平；
B是以g/L为单位的α2-巨球蛋白的血清水平；
C是以pg/ml为单位的YKL-40的血清水平；
D是以百分数为单位的HbA1c水平；
k是所述逻辑函数的常数；
a是与所述hsa-miR-34a-5p的血清水平相关的系数；
b是与所述α2-巨球蛋白的血清水平相关的系数；
c是与所述YKL-40的血清水平相关的系数；
d是与所述HbA1c水平相关的系数；
其中
a)所述用途源自于自举模型，其中：
k是包含在-14.50至-7.40之间的数，
a是包含在1.38至3.58之间的数，
b是包含在0.02至0.84之间的数，
c是包含在5.98E-06至2.08E-05之间的数，
d是包含在0.07至0.89之间的数，
其中高于包含在0.1895至0.6089之间的阈值的NASH分值指示严重的NASH或者指示中或高的NASH活性，并因此指示脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4并且纤维化阶段≥2的患者；
或者其中：
b)所述用途源自于中值模型，其中：
k是包含在-27.16至-0.78之间的数，
a是包含在0至3.97之间的数，
b是包含在0至0.89之间的数，
c是包含在0至1.98E-05之间的数，
d是包含在0至0.97之间的数，
其中高于包含在0.1421至0.4556之间的阈值的NASH分值指示严重的NASH或者指示中或高的NASH活性，并因此指示脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4并且纤维化阶段≥2的患者。
9.根据权利要求8所述的用途，其中NASH分值按照下述逻辑函数计算：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D
其中：
S是NASH分值；
A是以拷贝数/μL(log10)为单位的hsa-miR-34a-5p的血清水平；
B是以g/L为单位的α2-巨球蛋白的血清水平；
C是以pg/ml为单位的YKL-40的血清水平；
D是以百分数为单位的HbA1c水平；
k是所述逻辑函数的常数；
a是与所述hsa-miR-34a-5p的血清水平相关的系数；
b是与所述α2-巨球蛋白的血清水平相关的系数；
c是与所述YKL-40的血清水平相关的系数；
d是与所述HbA1c水平相关的系数；
其中
a)所述用途源自于自举模型，其中：
k是-10.95，
a是2.48，
b是0.43，
c是1.34E-05，
d是0.48，
其中高于等于0.4255的阈值的NASH分值指示严重的NASH或者指示中或高的NASH活性，并因此指示脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4并且纤维化阶段≥2的患者；
或者其中：
b)所述用途源自于中值模型，其中：
k是-11.03，
a是2.59，
b是0.38，
c是1.21E-05，
d是0.40，
其中高于等于0.3201的阈值的NASH分值指示严重的NASH或者指示中或高的NASH活性，并因此指示脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4并且纤维化阶段≥2的患者。
10.根据权利要求1所述的用途，其中NASH分值按照下述逻辑函数计算：
其中：
Y＝k+a*A+b*B
其中：
S是NASH分值；
A是以Cq为单位的hsa-miR-34a-5p的水平；
B是以pg/ml为单位的YKL-40水平；
k是包含在-116.08至40.97之间的数，
a是包含在-0.82至0之间的数，
b是包含在0至1.88E-05之间的数，
其中高于包含在0.1387至0.3481之间的阈值的NASH分值指示严重的NASH或者指示中或高的NASH活性，并因此指示脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4并且纤维化阶段≥1的患者。
11.根据权利要求10所述的用途，其中NASH分值按照下述逻辑函数计算：
其中：
Y＝k+a*A+b*B
其中：
S是NASH分值；
A是以Cq为单位的hsa-miR-34a-5p的水平；
B是以pg/ml为单位的YKL-40水平；
k是12.87，
a是-0.42，
b是8.160E-06，
其中高于等于0.2187的阈值的NASH分值指示严重的NASH或者指示中或高的NASH活性，并因此指示脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4并且纤维化阶段≥1的患者。
12.根据权利要求1所述的用途，其中NASH分值按照下述逻辑函数计算：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F
其中：
S是NASH分值；
A是以Cq为单位的hsa-miR-34a-5p的水平；
B是以pg/ml为单位的YKL-40水平；
C是尿液比重的水平；
D是以10e9/L为单位的嗜碱性粒细胞水平；
F是以mg/dL为单位的HSCRP水平；
k是包含在-124.81至1.13之间的数；
a是包含在-0.91至-0.25之间的数；
b是包含在4.77e-06至2.39e-05之间的数；
c是包含在17.21至141.51之间的数；
d是包含在2.80至60.74之间的数；
f是包含在0.01至0.23之间的数；
其中高于包含在0.5791至0.8269之间的阈值的NASH分值指示严重的NASH或者指示中或高的NASH活性，并因此指示脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4并且纤维化阶段≥1的患者。
13.根据权利要求12所述的用途，其中NASH分值按照下述逻辑函数计算：
其中：
Y＝k+a*A+b*B+c*C+d*D+f*F
其中：
S是NASH分值；
A是以Cq为单位的hsa-miR-34a-5p的水平；
B是以pg/ml为单位的YKL-40水平；
C是尿液比重的水平；
D是以10e9/L为单位的嗜碱性粒细胞水平；
F是以mg/dL为单位的HSCRP水平；
k是-61.84；
a是-0.58；
b是1.44E-05；
c是79.36；
d是31.77；
f是0.12；
其中高于等于0.7758的阈值的NASH分值指示严重的NASH或者指示中或高的NASH活性，并因此指示脂肪变性分值≥1、肝细胞膨胀分值≥1、小叶炎症分值≥1、NAS≥4并且纤维化阶段≥1的患者。
14.一种试剂盒，其包含用于确定下述标志物的水平的工具：
(i)hsa-miR-34a-5p；以及
(ii)YKL-40，
其中所述试剂盒包含特异性针对待定量蛋白质的抗体和/或可用于定量micro-RNA水平的引物作为工具。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其还包含用于确定在权利要求1至13任一项的用途中相应地使用的肝损伤的至少一种血液、血清或血浆循环标志物的水平的工具。
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