BR122023002590B1

BR122023002590B1 - Anticorpo humanizado ou quimérico de ligação ao cd3 humano, anticorpo biespecífico, microrganismo, composição, composição farmacêutica, uso dos mesmos, método para produzir um anticorpo, composição de diagnóstico, método in vitro para detectar a presença de antígeno cd3, ou uma célula expressando cd3, em uma amostra, kit para detectar a presença de antígeno cd3, ou uma célula que expressa cd3, em uma amostra e anticorpo anti-idiotípico

Info

Publication number: BR122023002590B1
Application number: BR122023002590-3A
Authority: BR
Inventors: Edward VAN DEN BRINK; Joost J. Neijssen; Aran Frank Labrijn; Joyce MEESTERS; Janine Schuurman; Paul Parren
Original assignee: Genmab A/S
Priority date: 2013-07-05
Filing date: 2014-07-04
Publication date: 2023-12-05
Also published as: JP6619342B2; US10407501B2; KR102363220B1; US11613575B2; KR20230073341A; JP2024026114A; IL276530B; EP3693385A1; IL243127B; US20230374131A1; JP2020005635A; IL290613A; AU2014286116A1; SI3016681T1; CA2915575A1; US20160168247A1; AU2022203851A1; CN105722529B; KR20160027177A; RS60131B1

Abstract

A presente invenção refere-se ao CD3 que liga anticorpos humanizados ou quiméricos. Além disso, a mesma refere-se aos anticorpos biespecíficos, composições, composições farmacêuticas, uso dos ditos anticorpos no tratamento de uma doença, e método de tratamento.

Description

Campo da invenção

[001]A presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado ou quimérico que se liga ao CD3 humano, composições compreendendo o dito anticorpo humanizado ou quimérico, e o uso dos ditos anticorpos humanizados ou quiméricos no tratamento de uma doença.

Fundamentos

[002]O Grupo de Diferenciação 3 (CD3) foi conhecido durante muitos anos e, portanto, foi objeto de interesse em muitos aspectos. Especificamente anticorpos incitados contra CD3 ou o Complexo Receptor de célula T, do qual CD3 é parte, são conhecidos. Uma caracterização in vitro de cinco anticorpos variantes de função efetora OKT3 humanizados foram descritos [1].

[003]O tratamento com o anticorpo monoclonal anti-CD3 hOKT3gama1(Ala-Ala) resulta em respostas de peptídeo C melhoradas e parâmetros clínicos para pelo menos 2 anos depois do início da diabete tipo 1 na ausência de medicações imunossupressivas contínuas [2].

[004]Um método promissor para melhorar a terapia de anticorpo alvejada é pela liberação de células citotóxicas especificamente para as células cancerosas que expressam antígeno. Este conceito de usar células T para o extermínio eficiente de células de tumor foi descrito [3]. Entretanto, os estudos clínicos iniciais foram muito desapontadores principalmente devido à baixa eficácia, efeitos adversos severos (tempestade de citocinas) e imunogenicidade dos anticorpos biespecíficos [4]. Avanços no planejamento e aplicação de anticorpos biespecíficos têm parcialmente superado a barreira inicial da tempestade de citocinas e eficácia clínica melhorada sem toxicidades limitantes da dose [5].

[005]Por exemplo, certos anticorpos biespecíficos que alvejam com um ramo o antígeno na célula de tumor e com o outro ramo por exemplo CD3 nas células T, fornecem o receptor Fc que se liga pela região Fc. Na ligação a, um complexo de células T, as células de tumor e células efetoras que ligam a região Fc de anticorpo são formadas, levando ao extermínio das células de tumor [4]. Catumaxomab consiste de um heterodímero de IgG2a de camundongo/IgG2b de rato e foi descoberto ser bem-sucedido para o tratamento de ascite associado com o câncer depois da aplicação intraperitoneal [6]. Entretanto, o híbrido de camundongo/rato é imunogênico [7] e não pode ser aplicado para o tratamento intravenoso de longa duração nos seres humanos. Os eventos adversos relacionados com o tratamento frequente atribuídos ao catumaxomab incluíram sintomas relacionados com a liberação de citocina (isto é, pirexia, náusea, vômito, calafrios, taquicardia e hipotensão) [8]-[9], que se refere às funções efetoras da região Fc de catumaxomab. Um outro anticorpo é ertumaxomab (HER2xCD3), que induz a citotoxicidade nas linhagens de células com a expressão baixa de HER2. Ertumaxomab tem estado no desenvolvimento clínico de Fase II para câncer mamário metastático [10]-[11].

[006]A reação cruzada dos anticorpos CD3 com o CD3 de macacos cinomolgo e/ou rhesus foi descrita [12]-[13], entretanto, outras melhorias para tais anticorpos de reação cruzada são necessárias.

Sumário da invenção

[007]É um objetivo da presente invenção fornecer anticorpos CD3 humanizados ou quiméricos. Assim, em um aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado ou quimérico que se liga ao CD3 humano, em que o dito anticorpo compreende uma região de ligação compreendendo a CDR1, CDR2, e CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, respectivamente, e CDR1, CDR2, e CDR3 da região variável de cadeia leve (VL) tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentada na SEQ ID NO: 5, respectivamente.

[008]Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo biespecífico compreendendo uma primeira região de ligação de um anticorpo de acordo com a invenção, e uma segunda região de ligação que liga um alvo diferente do que a primeira região de ligação de antígeno.

[009]Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma construção de ácido nucléico que codifica uma ou mais sequências de aminoácido de acordo com a invenção.

[0010] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor de expressão compreendendo (i) uma sequência de ácido nucléico que codifica uma sequência de cadeia pesada de um anticorpo humanizado ou quimérico de acordo com a invenção, (ii) uma sequência de ácido nucléico que codifica uma sequência de cadeia leve de um anticorpo humanizado ou quimérico de acordo com a invenção, ou (iii) tanto (i) quanto (ii).

[0011] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão de acordo com a invenção.

[0012] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo o anticorpo ou anticorpo biespecífico de acordo com a invenção.

[0013] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou anticorpo biespecífico de acordo com a invenção e um portador farmacêutico aceitável

[0014] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao anticorpo ou anticorpo biespecífico, à composição, ou à composição farmacêutica de acordo com a invenção para o uso como um droga.

[0015] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao anticorpo ou anticorpo biespecífico, à composição, ou à composição farmacêutica de acordo com a invenção para o uso no tratamento de uma doença.

[0016] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de uma doença compreendendo administrar o anticorpo ou anticorpo biespecífico, a composição, ou a composição farmacêutica de acordo com a invenção, a um indivíduo em necessidade do mesmo.

[0017] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de diagnosticar uma doença caracterizada pelo envolvimento ou acúmulo das células de expressão de CD3, compreendendo administrar o anticorpo humanizado ou quimérico, a composição ou a composição farmacêutica de acordo com a invenção a um indivíduo, opcionalmente em que o dito anticorpo humanizado ou quimérico é rotulado com um agente detectável.

[0018] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para produzir um anticorpo ou um anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, compreendendo as etapas de a) cultivar uma célula hospedeira de acordo com a invenção, e b) purificar o anticorpo do meio de cultura.

[0019] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição de diagnóstico compreendendo um anticorpo ou anticorpo biespecífico de acordo com a invenção.

[0020] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para detectar a presença de antígeno de CD3, ou uma célula que expressa CD3, em uma amostra compreendendo as etapas de a) contactar a amostra com um anticorpo ou anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, sob condições que possibilitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou anticorpo biespecífico e CD3, e b) analisar se um complexo foi formado.

[0021] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um kit para detectar a presença de antígeno de CD3, ou uma célula que expressa CD3, em uma amostra compreendendo i) um anticorpo ou anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, e ii) instruções para o uso do kit.

[0022] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo anti-idiotípico que se liga a um anticorpo de acordo com a invenção.

Breve descrição das figuras

[0023] Figura 1: Mostra as curvas de ligação de (Figure 1A) variantes de anticorpo monoespecífico de IgG1-huCD3 e (Figure 1B) variantes de anticorpo biespecífico bsIgG1 huCD3xHER2 para a linhagem de célula T humana Jurkat. Os dados mostrados são intensidades de fluorescência média (MFI) de um experimento representativo, como descrito no Exemplo 2. As tabelas mostram as concentrações de anticorpo (µg/ml) que resultam em ligação meio-máxima (EC50).

[0024] Figura 2: Mostra curvas de ligação de (Figure 2A) variantes de anticorpo monoespecífico de IgG1-huCD3 e (Figura 2B) variantes de anticorpo biespecífico bsIgG1 huCD3xHER2 à linhagem de célula T de cinomolgo HSC-F. Dados mostrados são intensidades de fluorescência média (MFI) de um experimento representativo, como descrito no Exemplo 2.

[0025] Figura 3: ativação de célula T pelas variantes de anticorpo IgG1-huCD3. A expressão de CD69 nas células T de origem humana (Figura 3A) e cinomolgo (Figura 3B) em cultura de PBMC foi medida pela análise de FACS, como descrito no Exemplo 3. Estes experimentos foram realizados duas vezes e resultados representativos de um experimento são mostrados.

[0026] Figura 4: proliferação de célula T induzida pelas variantes de anticorpo IgG1-huCD3. PBMCs humanas (Figura 4A) ou de cinomolgo (Figura 4B) foram incubadas com variantes de anticorpo IgG1-huCD3 por 3 dias, depois que proliferação foi medida por um ELISA de proliferação de célula, como descrito no Exemplo 4. Os resultados representativos de dois experimentos independentes são mostrados.

[0027] Figura 5: Indução da citotoxicidade mediada por célula T humana (Figura 5A) e de cinomolgo (Figura 5B) pelas variantes de anticorpo huCD3 com mutações LFLEDA não ativadoras foi determinada como explicado no Exemplo 5. Os resultados representativos de dois experimentos independentes realizados em duplicada são mostrados.

[0028] Figura 6: Mostra as curvas de ligação de variantes de anticorpo monoespecífico não ativadoras de IgG1-huCD3 (Figura 6A) e variantes de anticorpo biespecífico não ativadora bsIgG1-huCD3xHER2 (Figura 6B) para a linhagem de célula T humana Jurkat. Os dados mostrados são intensidades de fluorescência média (MFI) de um experimento representativo, como descrito no Exemplo 2. As tabelas mostram as concentrações de anticorpo (µg/ml) que resultam na ligação meia máxima (EC50).

[0029] Figura 7: Mostra as curvas de ligação de variantes de anticorpo monoespecífico não ativadoras de IgG1-huCD3 (Figura 7A) e variantes de anticorpo biespecífico não ativadoras bsIgG1-huCD3xHER2 (Figura 7B) para a linhagem de célula T de cinomolgo HSC-F. Os dados mostrados são intensidades de fluorescência média (MFI) de um experimento representativo, como descrito no Exemplo 2. As tabelas mostram as concentrações de anticorpo (µg/ml) que resultam na ligação meia máxima (EC50).

[0030] Figura 8: Ativação de célula T pelas variantes de anticorpo IgG1-huCD3 monoespecíficos não ativadoras (Figura 8A e B) ou bsIgG1- huCD3xHER2 biespecíficos não ativadoras (Figura 8C e D). A expressão de CD69 nas células T de origem humana (Figura 8A e C) e cinomolgo (Figura 8B e D) em cultura de PBMC foi medida pela análise FACS, como descrito no Exemplo 3. Estes experimentos foram realizados duas vezes e os resultados representativos de um experimento são mostrados.

[0031] Figura 9: Proliferação de célula T induzida pelas variantes de anticorpo IgG1-huCD3 monoespecíficos não ativadoras (Figura 9A e B) ou bsIgG1-huCD3xHER2 biespecíficas não ativadoras (Figura 9C e D). A proliferação de célula T foi medida em PBMCs humanas (Figura 9A e C) ou de cinomolgo (Figura 9B e D) que foram incubadas com várias variantes de anticorpo por 3 dias, depois que a proliferação foi medida por um ELISA de proliferação de célula, como descrito no Exemplo 4. Os resultados representativos de dois experimentos independentes são mostrados.

[0032] Figura 10: Indução da citotoxicidade mediada pela célula T humana (Figura 10A) e de cinomolgo (Figura 10B) pelas variantes de anticorpo huCD3 com mutações LFLEDA não ativadoras foi determinada como explicado no Exemplo 5. Os resultados representativos de dois experimentos independentes realizados em duplicata são mostrados.

[0033] Figura 11: Ativação de célula T de rhesus pelas variantes de anticorpo IgG1-huCD3. A expressão de CD69 nas células T de origem de rhesus em cultura de PBMC foi medida pela análise FACS, como descrito no Exemplo 6.

[0034] Figura 12: Ativação de célula T pelas variantes não ativadoras de anticorpo huCLB-T3/4. As variantes IgG1-huCLB-T3/4 foram tituladas nas PBMCs. A expressão de CD69 nas células T em cultura de PBMC foi medida pela análise FACS, como descrito no Exemplo 7. Os exemplos representativos de 3 experimentos são mostrados.

[0035] Figura 13: Proliferação de célula T pelas variantes não ativadoras de anticorpo huCLB-T3/4. As PBMCs foram incubadas com anticorpos por três dias, depois do que a proliferação foi medida por um ELISA de proliferação de célula, como descrito no Exemplo 8. Os resultados representativos de dois experimentos independentes são mostrados.

[0036] Figura 14: Citoxicidade mediada pela célula T in vitro induzida pelas variantes de anticorpo não ativadoras de um anticorpo CD3. A indução da citotoxicidade mediada pela célula T pelas variantes de anticorpo (N297Q, LFLE, LFLENQ, LFLEDA, DANQ, LFLEDANQPS [Figura 14A- G]) foi determinada como explicado no Exemplo 9. As médias de dois experimentos realizados in duplicata são mostradas.

[0037] Figura 15: Citotoxicidade mediada por célula T in vitro induzida pelas variantes não ativadoras huCLB-T3/4. Indução da citotoxicidade mediada pela célula T pelas variantes de anticorpo (LFLEDA LAL [Figura 15A-C] foi determinada como descrito no Exemplo 9. As médias de um experimento realizado em duplicata são mostradas.

[0038] Figura 16: Avaliação da ligação de C1q a variantes de anticorpo não ativadoras huCLB-T3/4. A ligação de C1q aos IgG1 monoespecíficos huCLB-T3/4 (Figura 16A-C) e bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2 (Figura B-D) e variantes de anticorpo não ativadoras do mesmo foi avaliada pelo ELISA como descrito no Exemplo 10. Os resultados no gráficos são representativos para n = 2 experimentos.

[0039] Figura 17: Análises farmacocinéticas (PK) de variantes de anticorpo não ativadoras huCLB-T3/4 foram comparadas com aquelas de anticorpo IgG1-huCLB-T3/4 do tipo selvagem como descrito no Exemplo 11. A concentração plasmática de IgG1 humana foi plotada contra o tempo (Figura 17A). A taxa de depuração plasmática calculada como descrito no Exemplo 11 (Figura 17B). A linha pontilhada horizontal representa a taxa de depuração média de anticorpos IgG1 humanas em camundongos SCID (10 ml/dia/kg).

[0040] Figura 18: A frequência de respostas de célula T positiva entre doadores tipo HLA saudáveis. Índices SI de >1,9 tanto nos ensaios de proliferação quanto de secreção de IL-2 foram considerados respostas positivas. A33 humanizado foi usado como anticorpo de controle de ponto de referência clínico que mostra alto nível de imunogenicidade na clínica e rotineiramente induz 20 a 30% de respostas de célula T no Ensaio EpiScreen. As respostas KLH foram incluídas para checar a qualidade das PBMC (depois do descongelamento).

[0041] Figura 19: Alinhamento de sequência de regiões variáveis de cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL) de anticorpos CD3 humanizados de acordo com a presente invenção.

Descrição detalhada

[0042] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado ou quimérico que liga o CD3 humano, em que o dito anticorpo compreende uma região de ligação compreendendo a CDR1, CDR2, e CDR3 da região variável de cadeia pesada (VH) tendo as sequências como apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, e 3, respectivamente, e a CDR1, CDR2, e CDR3 da região variável de cadeia leve (VL) tendo as sequências como apresentadas na SEQ ID NO: 4, a sequência GTN, e a sequência como apresentadas na SEQ ID NO: 5, respectivamente.

[0043] O termo “anticorpo” como aqui usado é intencionado a se referir a uma molécula de imunoglobulina, um fragmento de uma molécula de imunoglobulina, ou um derivado de cada um dos mesmos, que tem a capacidade para especificamente ligar a um antígeno sob condições fisiológicas típicas com uma meia vida de períodos de tempo significantes, tais como pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de uma hora, pelo menos cerca de duas horas, pelo menos cerca de quatro horas, pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 12 horas, cerca de 24 horas ou mais, cerca de 48 horas ou mais, cerca de 3, 4, 5, 6, 7 ou mais dias, etc., ou qualquer outro período relevante funcionalmente definidos (tais como um tempo suficiente para induzir, promover, realçar, e/ou modular uma resposta fisiológica associada com o antígeno de ligação de anticorpo e/ou tempo suficiente para o anticorpo recrutar uma atividade efetora). A região de ligação (ou domínio de ligação que também pode ser aqui usado, ambos os termos tendo o mesmo significado) que interage com um antígeno, compreende regiões variáveis tanto de cadeia pesada quanto leve da molécula de imunoglobulina. As regiões constantes dos anticorpos (Abs) podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (tais como células efetoras e células T) e componentes do sistema de complemento tais como C1q, o primeiro componente no caminho clássico da ativação de complemento. Como indicado acima, o termo anticorpo como aqui usado, a menos que de outro modo estabelecido ou claramente contradito pelo contexto, inclui fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade para reagir especificamente, tal como ligar, ao antígeno. Foi mostrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada pelos fragmentos de um anticorpo de tamanho natural. Os exemplos de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo "anticorpo" incluem (i) um fragmento Fab’ ou Fab, um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, VH, CL e CH1, ou um anticorpo monovalente como descrito na WO2007059782 (Genmab A/S); (ii) fragmentos F(ab’)2, fragmentos bivalentes compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo essencialmente dos domínios VH e CH1; e (iv) um fragmento Fv consistindo essencialmente dos domínios VL e VH de um único ramo de um anticorpo. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligador sintético que possibilita que eles sejam fabricados como uma única cadeia protéica em que as regiões VL e VH se juntem para formar moléculas monovalentes (conhecidas como anticorpos de cadeia única ou Fv de cadeia única (scFv), ver por exemplo Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) e Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Tais anticorpos de cadeia única são abrangidos dentro do termo anticorpo a menos que de outro modo mencionado ou claramente indicado pelo contexto. Embora tais fragmentos sejam geralmente incluídos dentro do significado de anticorpo, eles coletivamente e cada um independentemente são traços únicos da presente invenção, exibindo propriedades e utilidades biológicas diferentes. Estes e outros fragmentos de anticorpo úteis no contexto da presente invenção são aqui debatidos ainda mais. Também deve ser entendido que o termo anticorpo, a menos que de outro modo especificado, também inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados, e fragmentos de anticorpo que retêm a capacidade para especificamente se ligar ao antígeno (fragmentos de ligação de antígeno) fornecido por qualquer técnica conhecida, tal como a clivagem enzimática, síntese de peptídeo, e técnicas recombinantes. Um anticorpo como gerado pode possuir qualquer isótipo.

[0044] Os termos “cadeia pesada da imunoglobulina”, “cadeia pesada de uma imunoglobulina” ou “cadeia pesada” como aqui usados são intencionados a se referir a uma das cadeias de uma imunoglobulina. Uma cadeia pesada é tipicamente compreendida de uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada (aqui abreviada como CH) que define o isótipo da imunoglobulina. A região constante de cadeia pesada tipicamente é compreendida de três domínios, CH1, CH2, e CH3. A região constante de cadeia pesada pode compreender ainda uma região de dobradiça. O termo “imunoglobulina” como aqui usado é intencionado a se referir a uma classe de glicoproteínas estruturalmente relacionadas consistindo de dois pares de cadeias polipeptídicas, um par de cadeias leves (L) de peso molecular baixo e um par de cadeias pesadas (H), todas as quatro potencialmente interconectadas pelas ligações de dissulfeto. A estrutura das imunoglobulinas foram bem caracterizadas (ver por exemplo [14]). Dentro da estrutura da imunoglobulina, as duas cadeias pesadas são interconectadas por intermédio das ligações de dissulfeto na chamada “região de dobradiça”. Igualmente às cadeias pesadas cada cadeia leve é tipicamente compreendida de várias regiões; uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve (aqui abreviada como CL). A região constante de cadeia leve tipicamente é compreendida de um domínio, CL. Além disso, as regiões VH e VL podem ser subdivididas ainda em regiões de hipervariabilidade (ou regiões hipervariável que podem ser hipervariáveis na sequência e/ou forma de alças estruturalmente definidas), também chamadas de regiões determinadoras de complementaridade (CDRs), intercalada com regiões que são mais conservadas, chamadas de regiões de armação (FRs). Cada VH e VL é tipicamente composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino ao terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (ver [15]). A sequências de CDR pode ser determinada pelo uso do método fornecido pelo IMGT [16]-[17].

[0045] O termo “isótipo” como aqui usado, se refere à classe das imunoglobulinas (por exemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ou IgM) ou qualquer alotipo das mesmas, tal como IgG1m(za) e IgG1m(f) [SEQ ID NO: 15]) que é codificada pelos genes da região constante de cadeia pesada. Assim, em uma modalidade, o anticorpo compreende uma cadeia pesada de uma imunoglobulina da classe IgG1 ou qualquer alotipo da mesma. Além disso, cada isótipo de cadeia pesada pode ser combinado com uma cadeia leve capa (K) ou lambda (À).

[0046] O termo “anticorpo quimérico” como aqui usado, se refere a um anticorpo em que a região variável é derivada de uma espécie não humana (por exemplo derivada de roedores) e a região constante é derivada de uma espécie diferente, tal como humana. Anticorpos quiméricos podem ser gerados pelo engenheiramento de anticorpo. “Engenheiramento de anticorpo” é um termo usado genérico para tipos diferentes de modificações de anticorpos, e que é um processo bem conhecido pela pessoa habilitada. Em particular, um anticorpo quimérico pode ser gerado pelo uso de técnicas de DNA padrão como descritas em [18]. Assim, o anticorpo quimérico pode ser um anticorpo recombinante genética ou enzimaticamente engenheirado. Está dentro do conhecimento da pessoa habilitada gerar um anticorpo quimérico, e assim, a geração do anticorpo quimérico de acordo com a presente invenção pode ser realizada por outros métodos do que os aqui descritos. Os anticorpos monoclonais quiméricos para aplicações terapêuticas são desenvolvidos para reduzir a imunogenicidade do anticorpo. Eles podem tipicamente conter regiões variáveis não humanas (por exemplo, de murino), que são específicas para o antígeno de interesse, e domínios de cadeia pesada e leve constantes de anticorpo humano. Os termos “região variável” ou “domínios variáveis” como usados no contexto de anticorpos quiméricos, se refere a uma região que compreende as CDRs e regiões de armação das cadeias tanto pesadas quanto leves da imunoglobulina.

[0047] O termo “anticorpo humanizado” como aqui usado, se refere a um anticorpo não humano geneticamente engenheirado, que contém domínios constantes de anticorpo humano e domínios variáveis não humanos modificados para conter um alto nível de homologia de sequência com os domínios variáveis humanos. Isto pode ser obtido enxertando-se as seis regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) de anticorpo não humano, que juntas formam o sítio de ligação de antígeno, em uma região de armação (FR) aceitadora humana homóloga (ver [19]-[20]). De modo a reconstituir totalmente a afinidade e especificidade de ligação do anticorpo precursor, a substituição dos resíduos de armação do anticorpo precursor (isto é o anticorpo não humano) nas regiões de armação humanas (retromutações) pode ser requerida. A modelagem de homologia estrutural pode ajudar a identificar os resíduos de aminoácido nas regiões de armação que são importantes para as propriedades de ligação do anticorpo. Assim, um anticorpo humanizado pode compreender sequências de CDR não humanas, primariamente regiões de armação humanas opcionalmente compreendendo uma ou mais retromutações de aminoácido para a sequência de aminoácido não humana, e regiões constantes totalmente humanas. Opcionalmente, modificações de aminoácido adicionais, que não são necessariamente retromutações, podem ser aplicadas para se obter um anticorpo humanizado com características preferidas, tais como afinidade e propriedades bioquímicas.

[0048] O anticorpo humanizado ou quimérico de acordo com qualquer aspecto ou modalidade da presente invenção pode ser denominado “anticorpo CD3 humanizado ou quimérico”, “anticorpo humanizado ou quimérico da invenção”, “anticorpo CD3”, ou “anticorpo CD3 da invenção”, que todos têm o mesmo significado e propósito a menos que de outro modo contradito pelo contexto.

[0049] A sequência de aminoácido de um anticorpo de origem não humana é distinta dos anticorpos de origem humana, e portanto um anticorpo não humano é potencialmente imunogênico quando administrado aos pacientes humanos. Entretanto, a despeito da origem não humana do anticorpo, os seus segmentos da CDR são responsáveis pela capacidade do anticorpo para se ligar ao seu antígeno alvo e a humanização visa manter a especificidade e afinidade de ligação do anticorpo. Assim, a humanização de anticorpos terapêuticos não humanos é realizada para minimizar a sua imunogenicidade no ser humano enquanto tais anticorpos humanizados ao mesmo tempo mantêm a especificidade e afinidade de ligação do anticorpo de origem não humana.

[0050] O termo “região de ligação” como aqui usado, se refere a uma região de um anticorpo que é capaz de ligar qualquer molécula, tal como um polipeptídeo, por exemplo presente em uma célula, bactéria, ou virion.

[0051] O termo “ligação” como aqui usado, se refere à ligação de um anticorpo a um antígeno ou alvo predeterminados aos quais a ligação tipicamente é com uma afinidade correspondendo a uma KD de cerca de 10-6 M ou menos, por exemplo 10-7 M ou menos, tal como cerca de 10-8 M ou menos, tal como cerca de 10-9 M ou menos, cerca de 10-10 M ou menos, ou cerca de 10-11 M ou ainda menos quando determinada por exemplo pela tecnologia de ressonância de plásmon de superfície (SPR) em um instrumento BIAcore 3000 usando o antígeno como o ligante e o anticorpo como o análito, e se liga ao antígeno predeterminado com uma afinidade correspondendo a uma KD que é pelo menos dez vezes mais baixa, tal como pelo menos 100 vezes mais baixa, por exemplo pelo menos 1.000 vezes mais baixa, tal como pelo menos 10.000 vezes mais baixa, por exemplo pelo menos 100.000 vezes mais baixa do que a sua afinidade para ligar um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) outro que não o antígeno predeterminado ou um antígeno intimamente relacionado. O grau com o qual a afinidade é mais baixa é dependente do KD do anticorpo, de modo que quando o KD do anticorpo é muito baixo (isto é, o anticorpo é altamente específico), então o grau com que a afinidade para o antígeno é mais baixa do que a afinidade para um antígeno não específico pode ser pelo menos 10.000 vezes. O termo “KD” (M), como aqui usado, se refere à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular.

[0052] O termo “CD3 humano” como aqui usado, se refere à proteína do Grupo de Diferenciação 3 humano que é parte do complexo de proteína do co-receptor de célula T e é composta de quatro cadeias distintas. O CD3 é também encontrado em outras espécies, e assim, o termo “CD3” pode ser aqui usado e não é limitado ao CD3 humano a menos que contradito pelo contexto. Nos mamíferos, o complexo contém uma cadeia CD3Y (gama) (cadeia CD3 Y humano Swissprot P09693, ou de CD3Y de macaco cinomolgo Swissprot Q95LI7), uma cadeia CD3d (delta) (CD3 d humano Swissprot P04234, ou de CD3d de macaco cinomolgo Swissprot Q95LI8), duas cadeias CD3e (épsilon) (CD3e humano Swissprot P07766; ou CD3e de cinomolgo Swissprot Q95LI5), CD3e de rhesus (Swissprot G7NCB9), e uma cadeia CD3Z (zeta) (CD3Z humano Swissprot P20963, CD3Z de macaco cinomolgo Swissprot Q09TK0). Estas cadeias associam-se com uma molécula conhecida como o receptor de célula T (TCR) e geram um sinal de ativação em linfócitos T. As moléculas TCR e CD3 juntas compreendem o complexo TCR.

[0053] Está dentro do conhecimento da pessoa habilitada que as sequências de aminoácido aludidas como números Swissprot incluem um peptídeo de sinal que é removido depois da tradução da proteína. Assim, proteínas, tais como CD3, presentes nas superfícies da célula não incluem o peptídeo de sinal. Em particular, as sequências de aminoácido listadas na Tabela 1 não contêm tal peptídeo de sinal. Tais proteínas como listadas na Tabela 1 podem ser denominadas “proteínas maduras”. Assim, a SEQ ID NO: 14 mostra a sequência de aminoácido de CD3d (delta) humano madura, a SEQ ID NO: 13 mostra a sequência de aminoácido de CD3e (épsilon) humano madura, a SEQ ID NO: 21 mostra a sequência de aminoácido de CD3e de cinomolgo madura, e a SEQ ID NO: 23 mostra a sequência de aminoácido de CD3e de rhesus madura. Assim, o termo “madura” como aqui usado, se refere a uma proteína que não compreende nenhum sinal ou sequência líder.

[0054] É bem conhecido que a homologia de sequência, comprimento, e a posição do local de clivagem do peptídeo de sinal, variam significantemente entre proteínas diferentes. Os peptídeos de sinal podem ser determinados por métodos diferentes, por exemplo a SEQ ID NO: 13 da presente invenção foi determinada de acordo com a aplicação de SignalP (disponível em http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/).

[0055] Em uma modalidade particular, o anticorpo humanizado ou quimérico da presente invenção liga a cadeia épsilon de CD3, tal como a cadeia épsilon de CD3 humano (SEQ ID NO: 13). Já em uma outra modalidade particular, o anticorpo humanizado ou quimérico liga um epítopo dentro dos aminoácidos 1 a 27 da parte do terminal N de CD3e (épsilon) humano (SEQ ID NO: 13). Em uma tal modalidade particular, o anticorpo pode reagir cruzado ainda mais com outra espécie de primata não humano, tal como de macacos cinomolgos (CD3 épsilon de cinomolgo SEQ ID NO: 21) e/ou macacos rhesus (CD3 épsilon de rhesus SEQ ID NO: 23).

[0056] O termo “reagir cruzado” como aqui usado, se refere à capacidade de um anticorpo, tal como um anticorpo humanizado ou quimérico de acordo com a invenção, para ligar seu alvo em espécies diferentes. Em particular, o anticorpo CD3 humanizado exemplificado nos exemplos aqui descritos, tem a capacidade tanto para ligar CD3 humano (Exemplo 2), de cinomolgo (Exemplo 2) quanto de macaco rhesus.

[0057] Um anticorpo de acordo com a presente invenção compreendendo as sequências de CDR como aqui definidas, compreendendo ainda regiões de armação pode diferir na sequência fora das sequências de CDR mas ainda retém a capacidade de ligação completa quando comparado com o anticorpo original. Assim, a presente invenção também refere-se a anticorpos compreendendo uma sequência de aminoácido da região variável tendo uma certa identidade de sequência para qualquer sequência aqui descrita.

[0058] O termo “identidade de sequência” como usado no contexto da presente invenção, se refere à identidade percentual entre duas sequências como uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é,% de homologia = # de posições idênticas/# total de posições x 100), levando-se em conta o número de intervalos, e o comprimento de cada intervalo, que necessita ser introduzido para alinhamento ideal das duas sequências. A identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeo ou aminoácido por exemplo pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller [21]. Além disso, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch [22]. Alinhamentos múltiplos são preferivelmente realizados usando o algoritmo Clustal W [23] (como usado por exemplo, no software Vector NTI Advance® versão 11.5; Invitrogen Inc.).

[0059] Assim, em uma modalidade, a região VH tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácido a pelo menos uma sequência de aminoácido como apresentada nas sequências VH selecionadas do grupo consistindo de: a)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6; b)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8; c)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 7; e d) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9.

[0060] Em uma modalidade particular, a região VH tem pelo menos 96% de identidade de sequência de aminoácido a pelo menos uma sequência de aminoácido como apresentada nas sequências VH selecionadas do grupo consistindo de: a)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6; b)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8; c)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 7; e d) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9.

[0061] Em uma modalidade, a região VL tem pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácido a pelo menos uma sequência de aminoácido como apresentada nas sequências VL selecionadas do grupo consistindo de: a)uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; b)uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 11; e c)uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12.

[0062] Em uma modalidade particular, a região VL tem pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácido a pelo menos uma sequência de aminoácido como apresentada nas sequências VL selecionadas do grupo consistindo de: a)uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; b)uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 11; e c) uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12.

[0063] Em uma modalidade, a região VH é selecionada do grupo consistindo de: a)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6; b)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8; c)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 7; e d) uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9.

[0064] Em uma modalidade, a região VL é selecionada do grupo consistindo de: a)uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; b)uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 11; e c) uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12.

[0065] Em uma modalidade, apenas uma de cada uma das sequências VH ou VL é 100% idêntica a uma das sequências aqui divulgadas ao passo que a outra pode ter uma identidade de sequência de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência de aminoácido com uma das sequências aqui divulgadas.

[0066] Em uma modalidade particular, a sequência VH tem pelo menos 97% de identidade de sequência de aminoácido a pelo menos uma sequência de aminoácido como apresentada nas sequências VH selecionadas do grupo consistindo de: a)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6; b)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 7; c)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8; e d)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9; e)a sequência VL tem pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácido a pelo menos uma sequência de aminoácido como apresentada nas sequências VL selecionadas do grupo consistindo de: i.uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; ii.uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 11; e iii.uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12.

[0067] Em uma modalidade, as sequências VH e VL são selecionadas do grupo consistindo de: a)uma sequência VH e uma VL tendo pelo menos 90% de identidade com assequências apresentadas nasSEQ ID NOs: 6e10, respectivamente; 7e10,respectivamente;8e10,respectivamente;9e10, respectivamente; 6e11,respectivamente;7e11,respectivamente;8e11, respectivamente; 9e11,respectivamente;6e12,respectivamente;7e12, respectivamente; 8 e 12, respectivamente; e 9 e 12, respectivamente; b)uma sequência VH e uma VL tendo pelo menos 95% de identidade com assequências apresentadas nasSEQ ID NOs: 6e10, respectivamente; 7e10,respectivamente;8e10,respectivamente;9e10, respectivamente; 6e11,respectivamente;7e11,respectivamente;8e11, respectivamente; 9e11,respectivamente;6e12,respectivamente;7e12, respectivamente; 8 e 12, respectivamente; e 9 e 12, respectivamente; c)uma sequência VH e uma VL tendo pelo menos 97% de identidade com assequências apresentadas nasSEQ ID NOs: 6e10, respectivamente; 7e10,respectivamente;8e10,respectivamente;9e10, respectivamente; 6e11,respectivamente;7e11,respectivamente;8e11, respectivamente; 9e11,respectivamente;6e12,respectivamente;7e12, respectivamente; 8 e 12, respectivamente; e 9 e 12, respectivamente; d)uma sequência VH e uma VL tendo pelo menos 99% de identidade com assequências apresentadas nasSEQ ID NOs: 6e10, respectivamente; 7e10,respectivamente;8e10,respectivamente;9e10, respectivamente; 6e11,respectivamente;7e11,respectivamente;8e11, respectivamente; 9e11,respectivamente;6e12,respectivamente;7e12, respectivamente; 8 e 12, respectivamente; e 9 e 12, respectivamente; e)uma sequência VH e uma VL tendo pelo menos 100% de identidade com assequências apresentadas nasSEQ ID NOs: 6e10, respectivamente; 7e10,respectivamente;8e10,respectivamente;9e10, respectivamente; 6e11,respectivamente;7e11,respectivamente;8e11, respectivamente; 9e11,respectivamente;6e12,respectivamente;7e12, respectivamente; 8 e 12, respectivamente; e 9 e 12, respectivamente; f)uma sequência VH tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; g)uma sequência VH tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 97% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; h)uma sequência VH tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 99% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; i)uma sequência VH tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 100% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; j)uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; k)uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 97% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; l)uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 99% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; m)uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 100% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; h)uma sequência VH tendo pelo menos 97% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; o)uma sequência VH tendo pelo menos 97% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; p)uma sequência VH tendo pelo menos 97% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 99% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; q)uma sequência VH tendo pelo menos 97% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 100% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; r)uma sequência VH tendo pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; s)uma sequência VH tendo pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; t)uma sequência VH tendo pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 97% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; u)uma sequência VH tendo pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 100% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; v)uma sequência VH tendo pelo menos 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; x) uma sequência VH tendo pelo menos 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; y) uma sequência VH tendo pelo menos 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 97% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; z) uma sequência VH tendo pelo menos 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL tendo pelo menos 99% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; aa) uma sequência VH tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ab) uma sequência VH tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 97% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ac) uma sequência VH tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 99% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ad) uma sequência VH tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 100% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ae) uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; af) uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 97% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ag) uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 99% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ah) uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 100% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ai) uma sequência VH tendo pelo menos 97% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; aj) uma sequência VH tendo pelo menos 97% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ak) uma sequência VH tendo pelo menos 97% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 99% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; al) uma sequência VH tendo pelo menos 97% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 100% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; am) uma sequência VH tendo pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; an) uma sequência VH tendo pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ao) uma sequência VH tendo pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 97% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ap) uma sequência VH tendo pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 100% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; aq) uma sequência VH tendo pelo menos 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ar) uma sequência VH tendo pelo menos 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; as) uma sequência VH tendo pelo menos 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 97% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; at) uma sequência VH tendo pelo menos 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 e uma sequência VL tendo pelo menos 99% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ba) uma sequência VH tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bb) uma sequência VH tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 97% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bc) uma sequência VH tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 99% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bd) uma sequência VH tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 100% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; be) uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bf) uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 97% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bg) uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 99% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bh) uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 100% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bi) uma sequência VH tendo pelo menos 97% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bj) uma sequência VH tendo pelo menos 97% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: e uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bk) uma sequência VH tendo pelo menos 97% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 99% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bl) uma sequência VH tendo pelo menos 97% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 100% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bm) uma sequência VH tendo pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bn) uma sequência VH tendo pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bo) uma sequência VH tendo pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 97% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bp) uma sequência VH tendo pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 100% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bq) uma sequência VH tendo pelo menos 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; br) uma sequência VH tendo pelo menos 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bs) uma sequência VH tendo pelo menos 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 97% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; bt) uma sequência VH tendo pelo menos 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL tendo pelo menos 99% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ca) uma sequência VH tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; cb) uma sequência VH tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 97% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; cc) uma sequência VH tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 99% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; cd) uma sequência VH tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 100% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ce) uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; cf) uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 97% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; cg) uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 99% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ch) uma sequência VH tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 100% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ci) uma sequência VH tendo pelo menos 97% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; cj) uma sequência VH tendo pelo menos 97% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; ck) uma sequência VH tendo pelo menos 97% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 99% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; cl) uma sequência VH tendo pelo menos 97% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 100% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; cm) uma sequência VH tendo pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; cn) uma sequência VH tendo pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; co) uma sequência VH tendo pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 97% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; cp) uma sequência VH tendo pelo menos 99% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 100% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; cq) uma sequência VH tendo pelo menos 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 90% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; cr) uma sequência VH tendo pelo menos 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 95% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; cs) uma sequência VH tendo pelo menos 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 97% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12; e ct) uma sequência VH tendo pelo menos 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL tendo pelo menos 99% de identidade com as sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 10, 11, ou 12.

[0068] Em uma modalidade, a região de ligação compreende uma VH e uma VL selecionadas do grupo consistindo de; a)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; b)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, e um VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; c)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; d)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 11; e)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; f)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 7, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; g)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 7, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 11; h)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 7, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; i)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 11; j)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; k)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 11; e l)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12.

[0069] Em uma modalidade particular, a região de ligação compreende uma sequência VH e uma sequência VL selecionadas do grupo consistindo de; a)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; b)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; e c)uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10.

[0070] O anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção pode ser gerado pela comparação das sequências de aminoácido da região variável de cadeias pesada e leve contra uma base de dados de sequências da região variável da linha germinativa humana de modo a identificar a sequência humana de cadeia pesada e leve com o grau apropriado de homologia para o uso como as regiões de matriz variável humana. Uma série de regiões variáveis de cadeias pesada e leve humanizadas podem ser planejadas enxertando-se, por exemplo as CDRs de murino nas regiões de armação (identificadas como descrito acima) e, se necessário, pela retro mutação (mutação de um ou mais dos resíduos de aminoácido humanos nas regiões de armação de volta para o aminoácido não humano na(s) posição(ões) específica(s)) para a sequência de murino específica de resíduos identificados que pode ser crítica para a restauração da eficiência de ligação de anticorpo. As sequências variantes com a incidência mais baixa dos epítopos de célula T potenciais podem ser depois selecionadas como determinado pela aplicação de tecnologias in silico; iTope® e TCED® ([24], [25], e [26]).

[0071] Além disso, os anticorpos humanizados de acordo com a presente invenção também podem ser “desimunizados”. A desimunização pode ser desejada, como dentro de uma sequência de proteína, tal como um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção, a presença de epítopos de célula T humana pode aumentar o perfil de risco de imunogenicidade visto que eles têm o potencial para ativar células T auxiliares. Tal ativação das células T auxiliares pode ser evitada pela desimunização. A desimunização pode ser realizada pela introdução de uma mutação na sequência de aminoácido do anticorpo humanizado de modo a remover os epítopos de célula T sem significantemente reduzir a afinidade de ligação do anticorpo.

[0072] Assim, em uma modalidade da presente invenção, o anticorpo humanizado pode ser produzido por um método compreendendo as etapas de (i) comparar a sequência variável completa de cadeia pesada e/ou a sequência variável completa de cadeia leve não humana com uma base de dados das sequências da linha germinativa humana, (ii) selecionar a sequência da linha germinativa humana tendo a homologia mais alta com a sequência não humana para se obtiver uma sequência humanizada, (iii) otimizar a sequência humanizada pela retro mutação(ões) se requerido, e (iv) expressar a sequência em um sistema de expressão adequado.

[0073] Assim, um anticorpo de tamanho natural de acordo com a presente invenção pode ser produzido por um método compreendendo as etapas de (i) comparar a sequência de cadeia pesada e as sequências de cadeia leve variáveis não humanas com uma base de dados das sequências da linha germinativa humana, (ii) selecionar a sequência da linha germinativa humana tendo a homologia mais alta com a sequência não humana, (iii) enxertar as CDRs não humanas na linha germinativa humana selecionada para se obter uma sequência humanizada, (iv) otimizar as sequências humanizadas pela(s) retro mutação(ões) se requerido, (v) identificar sequências constantes de cadeia pesada e leve, e (vi) expressar as sequências de cadeia pesada completas e as sequências de cadeia leve completas no sistema de expressão adequado. Um anticorpo de tamanho natural de acordo com a presente invenção pode, assim, ser produzido como descrito no Exemplo 1. Está dentro do conhecimento da pessoa habilitada para produzir um anticorpo de tamanho natural quando partindo de cada uma das sequências de CDR ou sequências da região variável completas. Assim, a pessoa habilitada saberia como gerar um anticorpo de tamanho natural de acordo com a presente invenção.

[0074] O termo “sequências de cadeia pesada completas” como aqui usado, se refere a uma sequência consistindo de sequências variáveis de cadeia pesada e constantes de cadeia pesada.

[0075] O termo “sequências de cadeia leve completas” como aqui usado, se refere a uma sequência consistindo das sequências de cadeia leve variáveis e cadeia leve constantes.

[0076] A(s) retromutação(ões) pode(m) ser introduzida(s) pela mutagênese de DNA padrão. Tais técnicas padrão para a mutagênese de DNA são descritas em [18]. Alternativamente, o uso de kits comercialmente disponíveis tais como O Kit de Mutagênese loco-dirigida Quickchange® (Stratagene), ou as retromutações desejadas podem ser introduzidas pela síntese de DNA de novo.

[0077] Assim, em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo humanizado.

[0078] Os anticorpos quiméricos podem ser gerados substituindo-se todas as sequências da região constante de um anticorpo não humano (tal como de murino) com as sequências da região constante de origem humana. Assim, as sequências da região variável totalmente não humanas são mantidas no anticorpo quimérico. Assim, um anticorpo quimérico de acordo com a presente invenção pode ser produzido por um método compreendendo a etapa de expressar as sequências de cadeia pesada variável não humana (SEQ ID NO: 27), de cadeia leve variável não humana (SEQ ID NO: 28), sequências de cadeia pesada constante humana e cadeia leve constante humana nos sistemas de expressão adequados, e gerando deste modo um anticorpo quimérico de tamanho natural. Métodos alternativos podem ser usados. Tais métodos de produzir um anticorpo quimérico está dentro do conhecimento da pessoa habilitada, e assim, a pessoa habilitada saberia como produzir um anticorpo quimérico de acordo com a presente invenção.

[0079] Assim, em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo quimérico.

[0080] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de tamanho natural. O termo “anticorpo de tamanho natural” como aqui usado, se refere a um anticorpo (por exemplo, um anticorpo precursor ou variante) que contém todas os domínios constante e variável das cadeias pesada e leve corresponde a aqueles que são normalmente encontrados em um anticorpo do tipo selvagem deste isótipo.

[0081] Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região Fc compreendendo uma primeira e uma segunda cadeias pesadas da imunoglobulina.

[0082] O termo “região Fc” como aqui usado, se refere a uma região compreendendo, na direção do terminal N para C, pelo menos uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma região CH3. Uma região Fc pode compreender ainda uma região CH1 na extremidade do terminal N da região de dobradiça.

[0083] O termo “região de dobradiça” como aqui usado se refere à região de dobradiça de uma cadeia pesada da imunoglobulina. Assim, por exemplo a região de dobradiça de um anticorpo de IgG1 humano corresponde aos aminoácidos 216 a 230 de acordo com a numeração Eu como apresentada em Kabat.

[0084] A menos que de outro modo estabelecido ou contradito pelo contexto, os aminoácidos das sequências da região constante são aqui numeradas de acordo com o índice Eu de numeração (descrito em [27]) e pode ser denominada “de acordo com a numeração Eu como apresentada em Kabat”, “numeração Eu de acordo com Kabat”, ou “de acordo com o sistema de numeração Eu”.

[0085] Os termos “região CH1” ou “domínio CH1” como aqui usados, se referem à região CH1 de uma cadeia pesada da imunoglobulina. Assim, por exemplo a região CH1 de um anticorpo de IgG1 humano corresponde aos aminoácidos 118 a 215 de acordo com o sistema de numeração EU. Entretanto, a região CH1 também pode ser qualquer um dos outros subtipos como aqui descritos.

[0086] Os termos “região CH2” ou “domínio CH2” como aqui usados, se referem à região CH2 de uma cadeia pesada da imunoglobulina. Assim, por exemplo a região CH2 de um anticorpo IgG1 humano corresponde aos aminoácidos 231 a 340 de acordo com o sistema de numeração EU. Entretanto, a região CH2 também pode ser qualquer um dos outros subtipos como aqui descritos.

[0087] Os termos “região CH3” ou “domínio CH3” como aqui usados, se referem à região CH3 de uma cadeia pesada da imunoglobulina. Assim, por exemplo a região CH3 de um anticorpo IgG1 humano corresponde aos aminoácidos 341 a 447 de acordo com o sistema de numeração EU. Entretanto, a região CH3 também pode ser qualquer um dos outros subtipos como aqui descritos.

[0088] Em uma modalidade, o isótipo da cadeia pesada da imunoglobulina é selecionado do grupo consistindo de IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. A cadeia pesada da imunoglobulina pode ser qualquer alotipo dentro de cada classe da imunoglobulina, tal como IgG1m(f) (SEQ ID NO: 15). Assim, em uma modalidade particular, o isótipo das cadeias pesadas da imunoglobulina é um IgG1, ou qualquer alotipo da mesma, tal como IgG1m(f) (SEQ ID NO: 15).

[0089]Quando do alvejamento do antígeno CD3 que é parte do Receptor de Célula T (TCR), os mecanismos específicos de célula T de extermínio celular é desejável. Outras funções efetoras, por exemplo ativação de complemento, podem não ser requeridas, e portanto, a redução de funções efetoras é desejável. A ligação C1q é a primeira etapa na cascata de complemento, e portanto serve como um indicador para a capacidade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) dos anticorpos. Se a ligação de C1q ao anticorpo pode ser evitada, a ativação da cascata de complemento também pode ser evitada.

[0090] Assim, em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região Fc que foi modificada de modo que a ligação de C1q ao dito anticorpo é reduzida comparada a um anticorpo do tipo selvagem em pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99%, ou 100%, em que a ligação de C1q é determinada pelo ELISA.

[0091] O termo “modificado” como aqui usado, se refere à sequência de aminoácido de uma região Fc que não é idêntica à sequência de aminoácido de uma região Fc do tipo selvagem. Isto é resíduos de aminoácido em posições específicas da região Fc do tipo selvagem foram substituídos, deletados ou inseridos de modo a alterar, por exemplo, o sítio de ligação para C1q, sítio de ligação para outras moléculas efetoras ou ligação de Receptores Fc (FcRs). Tal(is) modificação(ões) da sequência de aminoácido pode(m) ser preparada(s) pela substituição de um ou mais aminoácidos com um aminoácido conservativo ou pode(m) ser preparada(s) pela substituição de um ou mais aminoácidos com um aminoácido alternativo que seja física e/ou funcionalmente similar ao aminoácido presente no tipo selvagem. As substituições também podem ser preparadas pela substituição com um aminoácido não conservativo.

[0092] No contexto da presente invenção, os aminoácidos podem ser descritos como aminoácidos conservativos ou não conservativos, e portanto podem ser classificados consequentemente. Os resíduos de aminoácido também podem ser divididos em classes definidas pelas propriedades físicas e funcionais alternativas. Assim, as classes de aminoácidos podem ser refletidas em uma ou ambas das seguintes tabelas: Resíduo de aminoácido da classe conservative Classificações Físicas e Funcionais Alternativas de Resíduos de Aminoácido

[0093] No contexto da presente invenção, uma substituição em um anticorpo, tal como um anticorpo humanizado ou quimérico, é indicada como: Aminoácido original - posição - aminoácido substituído;

[0094] Referindo-se à nomenclatura bem reconhecida para aminoácidos, o código de três letras, ou código de uma letra, são usados, incluindo os códigos Xaa e X para indicar qualquer resíduo de aminoácido. Consequentemente, a notação “L234F” ou “Leu234Phe” significa, que o anticorpo compreende uma substituição de Leucina com Fenilalanina na posição de aminoácido 234.

[0095] A substituição de um aminoácido em uma dada posição para qualquer outro aminoácido é aludida como: Aminoácido original - posição; ou por exemplo “L234”.

[0096] Para uma modificação onde o(s) aminoácido(s) original(is) e/ou aminoácido(s) substituído(s) pode(m) compreender mais do que um, mas não todos o(s) aminoácido(s), os mais do que um aminoácido podem ser separados por “,” ou “/”. Por exemplo a substituição de Leucina por Fenilalanina, Arginina, Lisina ou Triptofano na posição 234 é: “Leu234Phe,Arg,Lys,Trp” ou “Leu234Phe/Arg/Lys/Trp” ou “L234F,R,K,W” ou “L234F/R/K/W” ou “L234 para F, R, K ou W”

[0097]Tal designação pode ser usada intercambiavelmente no contexto da invenção mas tem o mesmo significado e propósito.

[0098]Além disso, o termo “uma substituição” abrange uma substituição em qualquer um dos outros dezenove aminoácidos naturais, ou em outros aminoácidos, tais como aminoácidos não naturais. Por exemplo, uma substituição de aminoácido L na posição 234 inclui cada uma das seguintes substituições: 234A, 234C, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234P, e 234Y. Isto é, a propósito, equivalente à designação 234X, em que o X designa qualquer aminoácido outro que não o aminoácido original. Estas substituições também podem ser designadas L234A, L234C, etc., ou L234A,C,etc., ou L234A/C/etc. O mesmo se aplica por analogia a cada e toda posição aqui mencionada, para especificamente incluir aqui qualquer uma de tais substituições.

[0099] O anticorpo de acordo com a invenção também pode compreender uma deleção de um resíduo de aminoácido. Tal deleção pode ser indicada “del”, e inclui, por exemplo, escrever como L234del. Assim, em tais modalidades, a Leucina na posição 234 foi deletada da sequência de aminoácido.

[00100] Os termos “aminoácido” e “resíduo de aminoácido” podem ser aqui usados intercambiavelmente.

[00101] O termo “ligação de C1q” como aqui usado, se refere à ligação de C1q a um anticorpo, quando o dito anticorpo é ligado ao seu antígeno. O termo “ligado ao seu antígeno” como aqui usado, se refere à ligação de um anticorpo ao seu antígeno tanto in vivo quanto in vitro.

[00102] O termo “reduzir” como aqui usado quando da referência à ligação C1q, se refere à capacidade do anticorpo de acordo com a invenção para reduzir, minimizar ou ainda inibir completamente a ligação de C1q ao anticorpo quando comparado à ligação de C1q a um anticorpo do tipo selvagem.

[00103] O termo “anticorpo do tipo selvagem” como aqui usado, em relação ao uso em ensaios de comparação de um anticorpo de acordo com a presente invenção, se refere a um anticorpo que é idêntico ao anticorpo a ser testado exceto quanto a não ser inerte. Neste contexto, o termo “inerte” se refere a uma região Fc modificada tendo ligação reduzida ou nenhuma ligação de C1q como determinado no Exemplo 10, isto é onde a ligação de C1q é determinada pelo ELISA; proliferação de célula T mediada por Fc reduzida ou nenhuma como determinada no Exemplo 4, isto é a proliferação de célula T é medida em um ensaio funcional com base em célula mononuclear de sangue periférico (PBMC); e/ou expressão de CD69 mediada por Fc reduzida ou nenhum como determinado no Exemplo 3, isto é expressão de CD69 mediada por Fc é determinada em um ensaio funcional com base em PBMC. Assim, o anticorpo do tipo selvagem compreende os aminoácidos que ocorrem naturalmente nas cadeias pesadas da imunoglobulina, isto é um anticorpo que não compreende nenhuma das modificações de aminoácido que possam alterar ou reduzir a capacidade do anticorpo para interagir com por exemplo C1q, Receptores Fc ou os semelhantes. Assim, um tal anticorpo do tipo selvagem permanecerá um anticorpo ativador que é capaz de ligar por exemplo C1q. Um anticorpo do tipo selvagem e um anticorpo da presente invenção podem compreender outras modificações de aminoácido além daquelas que afetam a capacidade do anticorpo de induzir funções efetoras, de modo a tornar o anticorpo um anticorpo biespecífico ou os semelhantes.

[00104] O termo “ELISA” como aqui usado se refere ao ensaio imunossorvente ligado à enzima que é um teste que usa anticorpos e mudança de cor para identificar uma substância. Um primeiro anticorpo específico é ligado à superfície da placa. Com isso a proteína de uma amostra é adicionada em que a ligação do dito primeiro anticorpo específico é testado. Um segundo anticorpo de ligação de anticorpo da amostra é adicionado. O segundo anticorpo é ligado a uma enzima, e, na etapa final, uma substância contendo o substrato da enzima é adicionada. A reação subsequente produz um sinal detectável, mais habitualmente uma mudança de cor no substrato. O conceito do método ELISA é bem conhecido dentro da técnica e vários modos de realizar um ELISA são considerados ser parte de um método para avaliar o anticorpo de acordo com a invenção. Assim, esta interpretação não deve ser entendida como limitando visto que as várias formas de ELISAs podem ser realizadas tais como descritas no Exemplo 4.

[00105] Especificamente, a capacidade de um anticorpo de acordo com a presente invenção para ligar C1q pode ser determinada pelo ELISA compreendendo as etapas de (i) revestir o dito anticorpo em uma placa de 96 reservatórios, (ii) adicionar 3% de soro, (iii) adicionar um anticorpo C1q antiser humano, (iv) desenvolver a placa, e (v) medir a OD405 nm. Assim, em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região Fc que foi modificada de modo que a ligação de C1q ao dito anticorpo fosse reduzida comparada à de um anticorpo do tipo selvagem em pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou 100%, em que a ligação de C1q é determinada pelo ELISA compreendendo as etapas de (i) revestir os ditos anticorpos em uma placa de 96 reservatórios, (ii) adicionar 3% de soro, (iii) adicionar um C1q anti-ser humano, (iv) desenvolver a placa, e (v) medir a OD405 nm. Assim, em modalidade particular, a ligação de C1q é avaliada como descrito no Exemplo 10.

[00106] Os termos “Receptor de Fc” ou “FcR” como aqui usado, se refere a uma proteína encontrada na superfície de certas células. FcRs se liga à região Fc dos anticorpos. Existem vários tipos diferentes de FcRs que são classificados com base no tipo de anticorpo que eles reconhecem. Por exemplo os Receptores de FCY (gama) se ligam aos anticorpos da classe IgG.

[00107]Os termos “Receptor de FCY”, “Receptor de Fc gama” ou “FCYR” como aqui usados, se referem a um grupo de Receptores de Fc pertencentes à superfamília da imunoglobulina e é o receptor de Fcs mais importante para induzir a fagocitose de micróbios opsonizados (revestidos). Esta família inclui vários membros, FcyRI (CD64), FcyRIIa (CD32a), FcyRIIb (CD32b), FcyRIIIa (CD16a), FcyRIIIb (CD16b), que diferem nas suas afinidades de anticorpo devido à sua estrutura molecular diferente.

[00108] As funções efetoras mediadas por Fc formam parte da atividade biológica das moléculas da imunoglobulina G (IgG) humana. Os exemplos de tais funções efetoras incluem por exemplo citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC) que são deflagradas pela ligação de várias moléculas efetoras à região Fc. No contexto da presente invenção, “ligação de Fc”, “ligação do Receptor de Fc”, “ligação de FcR”, e “ligação de uma região de anticorpo Fc ao FcR” se referem à ligação da região Fc a um Receptor de Fc (FcR) ou uma molécula efetora. Os termos “ligação de FcyR” e “ligação de FcyRI” se referem à ligação ou com uma região Fc ao Receptor de Fc gama e Receptor I de Fc gama, respectivamente. Quando um anticorpo CD3 liga células T, a região Fc do tipo selvagem do anticorpo CD3 se liga aos FcRs presentes nas outras células, por exemplo monócitos, que leva à ativação não específica, ativação mediada por Fc da célula T. Tal ativação não específica, mediada por Fc de células T pode ser indesejada. As células T também podem ser ativadas pela ativação de célula T alvejada ou específica de alvo,. Tal ativação de célula T alvejada pode ser altamente desejável para o tratamento de uma faixa de indicações, tais como câncer. O termo “ativação alvejada de célula T” como aqui usado, se refere a direcionar as células T para as células específicas, tais como células de tumor pelo uso de um anticorpo biespecífico compreendendo a ligação de uma primeira região de ligação a um alvo específico, tal como um alvo de tumor em uma célula de tumor, e a ligação de uma segunda região de ligação a um alvo específico de célula T, tal como CD3. Assim, o alvejamento de células T às células específicas, por exemplo células de tumor, pode ser facilitado pelo uso de um anticorpo biespecífico, em que uma das regiões de ligação liga o CD3 presente na célula T e a outra região de ligação liga um antígeno específico de alvo, por exemplo em uma célula de tumor. Se bem que, a ativação de células T não específica, mediada por Fc pode ser ainda possível e portanto tal ativação de célula T não específica, mediada por Fc indesejada por intermédio da reticulação mediada por Fc deve ser evitada e pode ser desativada tornando a região Fc inerte para tal atividade. Deste modo, a interação entre a dita região Fc inerte com os Receptores Fc presentes é evitada. Um anticorpo humanizado da presente invenção foi mostrado ser inerte quando testado em vários ensaios diferentes, isto é ver os Exemplos 3 a 5. Um outro anticorpo CD3 testado, huCLB-T3/4, compreendendo modificações de aminoácido na região Fc também mostrou ser inerte quando testado em ensaios diferentes, isto é ver os Exemplos 7 a 10. O anticorpo CD3 humanizado de acordo com a presente invenção compreendendo as substituições de aminoácido L234F, L235E, e D265A, como descrito nos Exemplos, mostrou níveis baixos de expressão de CD69 nas células T (Exemplo 3), anulação da proliferação de célula T mediada por Fc (Exemplo 4), e nenhum extermínio de alvo não específico quando na forma de um anticorpo biespecífico (Exemplo 5). Assim, um anticorpo humanizado da presente invenção mostra resultados superiores em vários ensaios quando comparado a um anticorpo do tipo selvagem.

[00109] Um anticorpo de acordo com a presente invenção pode compreende modificações na região Fc. Quando um anticorpo compreende tais modificações o mesmo pode se tornar um anticorpo inerte, ou não ativador. Os termos “inércia”, “inerte” ou “não ativador” como aqui usados, se referem a uma região Fc que pelo menos não é capaz de ligar nenhum dos Receptores de FCY, induz a reticulação mediada por Fc de FcRs, ou induz a reticulação mediada por FcR de antígenos alvo por intermédio de duas regiões Fc de anticorpos individuais, ou não é capaz de ligar C1q. A inércia de uma região Fc de um anticorpo CD3 humanizado ou quimérico é vantajosamente testada usando o anticorpo em um formato monoespecífico embora uma região Fc inerte assim identificada pode ser usada em anticorpos CD3 biespecíficos ou outros multiespecíficos humanizados ou quiméricos.

[00110] Diversas variantes podem ser construídas para tornar a região Fc de um anticorpo inativa para as interações com Receptores Fc gama e C1q para o desenvolvimento de anticorpo terapêutico. Os exemplos de tais variantes são aqui descritos.

[00111] Assim, em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região Fc que foi modificada de modo que o dito anticorpo mediasse a proliferação de célula T mediada por Fc reduzida comparada a um anticorpo do tipo selvagem em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100%, em que a dita proliferação de célula T é medida em um ensaio funcional com base em célula mononuclear de sangue periférico (PBMC).

[00112] O termo “reduzir” como aqui usado, se refere a uma redução de atividade ou expressão quando comparada a uma proteína de controle, tal como um anticorpo. Em particular, o termo “reduzir” quando da referência à proliferação de célula T, se refere à capacidade do anticorpo de acordo com a invenção para reduzir, minimizar ou mesmo completamente inibir a proliferação de células T quando comparadas à proliferação de células T ligadas por um anticorpo do tipo selvagem. A capacidade de um anticorpo para reduzir a proliferação de célula T pode ser avaliada por um ensaio funcional com base na PBMC, como descrito no Exemplo 4 e Exemplo 8. Em uma modalidade o ensaio é realizado com PBMCs humanas. Em uma outra modalidade o ensaio é realizado com PBMCs de cinomolgo. Ainda em uma outra modalidade, o ensaio é realizado com PBMCs de rhesus. Visto que os anticorpos de acordo com a presente invenção reagem cruzado, um ensaio com base em PBMC como aqui descrito pode ser realizado com PBMCs de qualquer espécie para mostrar a redução da proliferação de célula T contanto que a PBMC da espécie usada esteja dentro dos espectros de reatividade cruzada dos anticorpos, por exemplo de ser humano, de macacos cinomolgo ou rhesus.

[00113] O termo “ensaio funcional com base em célula mononuclear de sangue periférico (PBMC)” como aqui usado se refere a um ensaio usado para avaliar um traço funcional do anticorpo da presente invenção, tal como a capacidade do dito anticorpo para afetar a proliferação de célula T ou a expressão de CD69, em que as únicas células presentes são células mononucleares de sangue periférico. Assim, em uma modalidade, a proliferação de célula T é medida por um método compreendendo as etapas de incubar PBMCs com anticorpo na faixa de 1 a 1000 ng/ml a 37°C em uma incubadora com 5% (vol/vol) de CO2 umidificada por três dias, adicionar um composto químico, tal como BrdU, que é incorporado no DNA das células proliferantes, incubar por cinco horas, granular as células, secar as células, opcionalmente armazenando as células a 4°C, revestir as células nas placas de ELISA, incubar com anti-BrdU-peroxidase por 90 min na temperatura ambiente, desenvolver por cerca de 30 min com 1 mg/ml do ácido 2,2’-azino- bis (3-etilbenzotiazolino-6-sulfônico), adicionar 100 µL de ácido oxálico a 2% para interromper a reação, e medir a absorbância a 405 nm em uma leitora de microplaca adequada.

[00114] O termo “proliferação” como aqui usado, se refere ao crescimento da célula no contexto da divisão celular.

[00115] O termo “BrdU” como aqui usado, se refere a 5-bromo-2’- desoxiuridina, que é um homólogo para timidina. Quando BrdU é adicionado à cultura de célula por um período limitado de tempo (por exemplo 4 horas) será incorporada no DNA de células proliferantes. Depois de fixar as células, a detecção de BrdU incorporada pode ser realizada em um ELISA usando anti-BrdU-peroxidase. A incorporação de BrdU é portanto uma medida para a proliferação.

[00116] Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma região Fc que foi modificada de modo que o dito anticorpo reduz a expressão de CD69 mediada por Fc em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100% quando comparado a um anticorpo do tipo selvagem em que a dita expressão de CD69 mediada por Fc é determinada em um ensaio funcional com base em PBMC.

[00117] O termo “reduzir” como aqui usado, se refere a uma redução de atividade ou expressão quando comparado a uma proteína de controle, tal como um anticorpo. Em particular, o termo “reduzir” quando da alusão ao nível de expressão do marcador CD69 da ativação de célula T, se refere a uma redução no nível de expressão de CD69 quando comparado com o nível de expressão de CD69 quando a célula T é ligada por um anticorpo do tipo selvagem contanto que ambas as regiões de ligação do anticorpo liguem CD3. Uma capacidade do anticorpo para reduzir a expressão de CD69 pode ser avaliada por um ensaio funcional com base em PBMC, como descrito no Exemplo 3 e Exemplo 7. Assim, em uma modalidade, a expressão de CD69 é medida por um método compreendendo as etapas de incubar PBMCs com um anticorpo na faixa de 1 a 1000 ng/ml a 37°C em uma incubadora a 5% (vol/vol) CO2 umidificada por 16 a 24 horas, lavando as células, tingindo as células a 4°C com um anticorpo CD28-PE de camundongo anti-ser humano e de CD69-APC camundongo anti-ser humano, e determinando a expressão de CD69 nas células positivas em CD28 pela citometria de fluxo.

[00118] O termo “CD69” como aqui usado, se refere a Grupo de Diferenciação 69 que é uma proteína de lectina do Tipo C de transmembrana humana codificada pelo gene CD69. A ativação de linfócitos T e células matadoras naturais (NK), tanto in vivo quanto in vitro, induz a expressão de CD69. A função CD69 como um receptor transmissor de sinal envolvido nos eventos de ativação celular incluindo proliferação, funções como um receptor transmissor de sinal em linfócitos, incluindo células matadoras naturais e plaquetas, e a indução de genes específicos.

[00119] O termo “ensaio funcional com base em célula mononuclear de sangue periférico (PBMC)” como aqui usado se refere a um ensaio usado para avaliar um traço funcional do anticorpo da presente invenção, tal como a capacidade do dito anticorpo para afetar a proliferação de célula T ou a expressão de CD69, em que as únicas células presentes são células mononucleares de sangue periférico. Um ensaio funcional com base em PBMC como descrito nos Exemplos 3, 4, 5, e 7 compreende as etapas de (i) incubar as PBMCs com um anticorpo a 37°C em uma incubadora a 5% (vol/vol) de CO2 umidificada por cerca de 16 a 24 horas, (ii) lavar as células, (iii) tingir as células a 4°C com um anticorpo CD28-PE de camundongo antiser humano e CD69-APC de camundongo anti-ser humano, e (iv) determinar a expressão de CD69 nas células positivas em CD28 pela citometria de fluxo, quando a expressão de CD69 é avaliada. Assim, em uma modalidade, a expressão de CD69 pode ser determinada como descrito nos Exemplos 3, 4, 5, ou 7.

[00120] Assim, os aminoácidos na região Fc que desempenham um papel dominante nas interações com C1q e os Receptores Fc Gama podem ser modificados. Os exemplos de posições de aminoácido que podem ser modificadas incluem as posições L234, L235 e P331. Combinações dos mesmos, tais como L234F/L235E/P331S, podem causar uma diminuição profunda na ligação de CD64, CD32A, CD16 e C1q humanos.

[00121] Consequentemente, em uma modalidade, o aminoácido em pelo menos uma posição que corresponde a L234, L235 e P331, pode ser A, A e S, respectivamente ([1], [28]). Também, as substituições de aminoácido L234F e L235E podem resultar nas regiões Fc com interações anuladas com Receptores Fc Gama e C1q ([29]-[30]). Consequentemente, em uma modalidade, os aminoácidos nas posições correspondentes a L234 e L235, podem ser F e E, respectivamente. Uma substituição de aminoácido D265A pode diminuir a ligação a todos os Receptores Fc gama e impedir ADCC ([31]). Consequentemente, em uma modalidade, o aminoácido na posição correspondente a D265 pode ser A. A ligação C1q pode ser anulada pelas posições mutantes D270, K322, P329, e P331. A mutação destas posições para D270A ou K322A ou P329A ou P331A pode tornar o anticorpo deficiente na atividade CDC ([32]). Consequentemente, em uma modalidade, os aminoácidos em pelo menos uma posição correspondente a D270, K322, P329 e P331, pode ser A, A, A, e A, respectivamente.

[00122] Um método alternativo para minimizar a interação da região Fc com Receptores Fc gama e C1q é pela remoção do sítio de glicosilação de um anticorpo. A posição de mutação N297 para por exemplo Q, A, e E remove um sítio de glicosilação que é crítico para as interações do Receptor de IgG-Fc gama. Consequentemente, em uma modalidade, o aminoácido em uma posição correspondente a N297, pode ser G, Q, A ou E ([33]). Um outro método alternativo para minimizar a interação da região Fc com Receptores Fc gama pode ser obtido pelas seguintes mutações; P238A, A327Q, P329A ou E233P/L234V/L235A/G236del ([31]).

[00123] Alternativamente, as subclasses de IgG2 e IgG4 humanas são consideradas naturalmente comprometidas em suas interações com C1q e Receptores Fc gama embora, as interações com Receptores FCY (Receptores Fc gama) foram relatados ([34]-[35]). As mutações que anulam estas interações residuais podem ser feitas em ambos os isótipos, resultando na redução de efeitos colaterais indesejados associados com a ligação de FcR. Para IgG2, estes incluem L234A e G237A, e para IgG4, L235E. Consequentemente, em uma modalidade, o aminoácido em uma posição correspondente a L234 e G237 em uma cadeia pesada IgG2 humana, pode ser A e A, respectivamente. Em uma modalidade, o aminoácido em uma posição correspondente a L235 em uma cadeia pesada IgG4 humana, pode ser E.

[00124] Outros métodos para minimizar ainda mais a interação com Receptores Fc gama e C1q em anticorpos IgG2 incluem aqueles descritos em [36] e [37].

[00125] A região de dobradiça do anticorpo também pode ser de importância com respeito às interações com os Receptores Fc gama e complemento ([38]-[39]). Consequentemente, as mutações na ou deleção da região de dobradiça podem influenciar as funções efetoras de um anticorpo.

[00126] O termo “reticulação” como aqui usado, se refere à ligação em ponte indireta de ramo(s) Fab do anticorpo (monovalente ou bivalentemente) ligados ao antígeno alvo pela célula que carrega FcR através da ligação da região Fc do anticorpo. Assim, um anticorpo que liga o seu antígeno alvo nas células que carregam antígeno alvo pode reticular com uma outra célula que expressa FcRs.

[00127] O termo “extermínio não específico” como aqui usado, se refere ao extermínio de células pela função citotóxica das células T ou outras células efetoras, através da ativação independente de antígeno do alvo de tumor das ditas células. Assim, pelo extermínio não específico é intencionado que as células que carregam alvo de tumor podem ser mortas por exemplo pelas células T citotóxicas e não pela ligação de anticorpo ao alvo de tumor por exemplo pela indução de CDC.

[00128] Os presentes inventores mostraram (ver os Exemplos 3 a 5, 7 a 10) que uma região Fc não ativadora pode ser obtida modificando-se uma ou mais de pelo menos cinco posições de aminoácido específicas na região Fc.

[00129] Assim, em uma modalidade, o anticorpo compreende uma primeira e uma segunda cadeias pesadas da imunoglobulina, em que em pelo menos uma da dita primeira e segunda cadeias pesadas da imunoglobulina um ou mais aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, D265, N297, e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não são L, L, D, N, e P, respectivamente.

[00130] Em uma modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas um ou mais aminoácidos na posição correspondente às posições L234, L235, D265, N297, e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não são L, L, D, N, e P, respectivamente.

[00131] Em uma outra modalidade, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas um ou mais aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235 e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não são L, L e D, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondentes a N297 e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00132] O termo “aminoácido correspondente às posições” como aqui usado se refere a um número de posição de aminoácido em uma cadeia pesada de IgG1 humana. A menos que de outro modo estabelecido ou contradito pelo contexto, os aminoácidos das sequências da região constante são aqui numerados de acordo com o índice EU de numeração (descrito em [27]). Assim, um aminoácido ou segmento em uma sequência que “corresponde a” um aminoácido ou segmento em uma outra sequência é um que alinha com o outro aminoácido ou segmento usando um programa de alinhamento de sequência padrão tal como ALIGN, ClustalW ou similar, tipicamente em ajustes de default e tem pelo menos 50%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% de identidade com uma cadeia pesada de IgG1 humana. É considerado bem conhecido na técnica como alinhar uma sequência ou segmento em uma sequência e deste modo determinar a posição correspondente em uma sequência para uma posição de aminoácido de acordo com a presente invenção.

[00133] No contexto da presente invenção, o aminoácido pode ser definido como descrito acima.

[00134] O termo “o aminoácido não é” ou expressão similar quando da alusão aos aminoácidos em uma cadeia pesada deve ser entendido significar que o aminoácido é qualquer outro aminoácido além dos aminoácidos específicos mencionados. Por exemplo, o aminoácido na posição correspondente a L234 em uma cadeia pesada de IgG1 humana não é L, significa que o aminoácido pode ser qualquer um dos outros aminoácidos que ocorrem natural ou não naturalmente além de L.

[00135] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não é D.

[00136] Em uma modalidade, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente a D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não é D, e os aminoácidos nas posições correspondentes às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00137] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é de aminoácidos hidrofóbicos ou polares.

[00138] O termo “hidrofóbico” como aqui usado em relação a um resíduo de aminoácido, se refere a um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W, e Y. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionado do grupo de aminoácidos consistindo de; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W e Y.

[00139] O termo “polar” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de; C, D, E, H, K, N, Q, R, S, e T. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada humana é selecionada do grupo consistindo de; C, E, H, K, N, Q, R, S, e T.

[00140] Em uma outra modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em um cadeia pesada de IgG1 humana é um aminoácido alifático não carregado, aromático ou ácido.

[00141] O termo “alifáticos não carregados” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de: A, G, I, L, e V. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo de; A, G, I, L, e V.

[00142] O termo “aromático” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de: F, T, e W. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo de; F, T, e W.

[00143] O termo “ácido” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido escolhido do grupo consistindo de: D e E. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo de; D e E.

[00144] Em uma modalidade particular, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo de; A, E, F, G, I, L, T, V, e W.

[00145] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não é D.

[00146] Em uma modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente a D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não é D, e os aminoácidos nas posições correspondentes às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00147] Em uma modalidade, tanto a dita primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é aminoácido hidrofóbico ou polar.

[00148] O termo “hidrofóbico” como aqui usado em relação a um resíduo de aminoácido, se refere a um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W, e Y. Assim, em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionado do grupo de aminoácidos consistindo de; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W e Y.

[00149] O termo “polar” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de; C, D, E, H, K, N, Q, R, S, e T. Assim, em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada humana é selecionada do grupo consistindo de; C, E, H, K, N, Q, R, S, e T. Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionado do grupo de aminoácidos consistindo de; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W e Y.

[00150] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes à posição D265 em um cadeia pesada humana são selecionados do grupo consistindo de; C, E, H, K, N, Q, R, S, e T.

[00151] Em uma outra modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é aminoácido alifático não carregado, aromático ou ácido.

[00152] O termo “alifático não carregado” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de: A, G, I, L, e V. Assim, em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo de; A, G, I, L, e V.

[00153] O termo “aromático” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de: F, T, e W. Assim, em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionada do grupo consistindo de; F, T, e W.

[00154] O termo “ácido” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido escolhido do grupo consistindo de: D e E. Assim, em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são selecionadas do grupo consistindo de; D e E.

[00155] Em uma modalidade particular, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionada do grupo consistindo de; A, E, F, G, I, L, T, V, e W.

[00156] Em outra modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição N297 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não é N.

[00157] Em uma modalidade, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente a N297 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não é N, e o aminoácido na posição correspondente à posição P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é P.

[00158] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente às posições N297 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não é N.

[00159] Em uma modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente a N297 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não é N, e o aminoácido na posição correspondente à posição P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é P.

[00160] Em outra modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não são L e L, respectivamente.

[00161] Em uma modalidade, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes a L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não são L e L, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondentes às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00162] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são selecionadas do grupo consistindo de; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, Y, V.

[00163] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são aminoácidos hidrofóbicos ou polares.

[00164] O termo “hidrofóbica” como aqui usado em relação a um resíduo de aminoácido, se refere a um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W, e Y. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo de; A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W, e Y.

[00165] O termo “polar” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de; C, D, E, H, K, N, Q, R, S, e T. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo de aminoácidos consistindo de; C, D, E, H, K, N, Q, R, S, e T.

[00166] Em uma modalidade particular, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo de; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y.

[00167] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não são L e L, respectivamente.

[00168] Em uma modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes a L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não são L e L, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondentes às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00169] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes a L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são aminoácidos hidrofóbicos ou polares.

[00170] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo de; A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W, e Y.

[00171] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo de aminoácidos consistindo de; C, D, E, H, K, N, Q, R, S, e T.

[00172] Em uma modalidade particular, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo de; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y.

[00173] Em uma outra modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são aminoácidos alifáticos não carregados, aromáticos ou ácidos.

[00174] O termo “alifático não carregado” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de: A, G, I, L, e V. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo de; A, G, I, e V.

[00175] O termo “aromático” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de: F, T, e W. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo de; F, T, e W.

[00176] O termo “ácido” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido escolhido do grupo consistindo de: D e E. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo de; D e E.

[00177] Em uma modalidade particular, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes a L234 e L235 são cada um selecionados do grupo consistindo de; A, D, E, F, G, I, T, V, e W.

[00178] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F e E; ou A e A, respectivamente.

[00179] Em uma modalidade, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes a L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F e E; ou A e A, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondentes às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00180] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F e E; ou A e A, respectivamente.

[00181] Em uma modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes a L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F e E; ou A e A, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondentes às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00182] Em uma modalidade particular, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F e E, respectivamente.

[00183] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F e E, respectivamente.

[00184] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas pelo menos os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são A e A, respectivamente.

[00185] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas pelo menos os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são A e A, respectivamente.

[00186] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não são L, L, e D, respectivamente.

[00187] Em uma modalidade, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes a L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não são L, L e D, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondentes às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00188] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são selecionadas do grupo consistindo de; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, Y, V, e W, e o aminoácido correspondente à posição D265 é selecionado do grupo consistindo de; A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, Y, V, e W.

[00189] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235 e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são aminoácidos hidrofóbicos ou polares.

[00190] O termo “hidrofóbico” como aqui usado em relação a um resíduo de aminoácido, se refere a um resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W, e Y. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionado do grupo de aminoácidos consistindo de; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W e Y, e os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo de; A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W, e Y.

[00191] O termo “polar” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de; C, D, E, H, K, N, Q, R, S, e T. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo de aminoácidos consistindo de; C, D, E, H, K, N, Q, R, S, e T, o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada humana é selecionado do grupo consistindo de; C, E, H, K, N, Q, R, S, e T.

[00192] Em uma modalidade particular, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo de; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y, e o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo de; A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y.

[00193] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes a L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são aminoácidos hidrofóbicos ou polares.

[00194] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionado do grupo de aminoácidos consistindo de; A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W e Y, e os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo de; A, C, F, G, H, I, M, R, T, V, W, e Y.

[00195] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo de aminoácidos consistindo de; C, D, E, H, K, N, Q, R, S, e T, o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada humana é selecionado do grupo consistindo de; C, E, H, K, N, Q, R, S, e T.

[00196] Em uma modalidade particular, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo de; A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y, e o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo de; A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, e Y.

[00197] Em uma outra modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235 e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são aminoácidos alifáticos não carregados, aromáticos ou ácidos.

[00198] O termo “alifático não carregado” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de: A, G, I, L, e V. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo de; A, G, I, L, e V, e os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo de; A, G, I, e V.

[00199] O termo “aromático” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido selecionado do grupo consistindo de: F, T, e W. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235 e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo de; F, T, e W.

[00200] O termo “ácido” como aqui usado em relação aos resíduos de aminoácido, se refere a qualquer resíduo de aminoácido escolhido do grupo consistindo de: D e E. Assim, em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo de; D e E.

[00201] Em uma modalidade particular, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo de; A, E, F, G, I, L, T, V, e W, e os aminoácidos nas posições correspondentes a L234 e L235 são cada um selecionados do grupo consistindo de; A, D, E, F, G, I, T, V, e W.

[00202] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235 e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não são L, L, e D, respectivamente.

[00203] Em uma modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes a L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, não são L, L, e D, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondentes às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00204] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes a L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são aminoácidos alifáticos não carregados, aromáticos ou ácidos.

[00205] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo de; A, G, I, L, e V, e os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo de; A, G, I, e V.

[00206] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são cada um selecionados do grupo consistindo de; D e E.

[00207] Em uma modalidade particular, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é selecionado do grupo consistindo de; A, E, F, G, I, L, T, V, e W, e os aminoácidos nas posições correspondentes a L234 e L235 são cada um selecionados do grupo consistindo de; A, D, E, F, G, I, T, V, e W.

[00208] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A; ou A, A, e A, respectivamente.

[00209] Em uma modalidade, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes a L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A; ou A, A, e A, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondentes às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00210] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A; ou A, A, e A, respectivamente.

[00211] Em uma modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes a L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A; ou A, A, e A, respectivamente, e os aminoácidos nas posições correspondentes às posições N297 e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são N e P, respectivamente.

[00212] Em uma modalidade particular, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00213] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00214] Em uma modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são A, A, e A, respectivamente.

[00215] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são A, A, e A, respectivamente.

[00216] Em uma outra modalidade, em pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, D265, N297, e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, A, Q, e S, respectivamente.

[00217] Em uma modalidade, tanto na dita primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, D265, N297, e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, A, Q, e S, respectivamente.

[00218] Em uma modalidade particular, o anticorpo de acordo com a invenção, compreende uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10, e em pelo menos uma das cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00219] Em uma outra modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção, compreende uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12, e em pelo menos uma das cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00220] Em uma outra modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção, compreende uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10, e em pelo menos uma das cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00221] Em uma outra modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção, compreende uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12, e em pelo menos uma das cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00222] Em uma outra modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção, compreende uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10, e em pelo menos uma das cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00223] Em uma outra modalidade, o anticorpo de acordo com a invenção, compreende uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12, e em pelo menos uma das cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00224] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo multiespecífico compreendendo pelo menos uma primeira região de ligação de um anticorpo de acordo com qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos, e uma ou mais regiões de ligação que liga um ou mais alvos diferentes da primeira região de ligação. Um tal anticorpo multiespecífico pode ser um anticorpo biespecífico.

[00225] Assim, em um aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo biespecífico compreendendo uma primeira região de ligação de um anticorpo de acordo com qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos, e uma segunda região de ligação que liga um alvo diferentes da primeira região de ligação.

[00226] O termo “anticorpo multiespecífico” se refere a um anticorpo tendo especificidades para pelo menos dois epítopos diferentes, tais como pelo menos três, tipicamente não sobrepostos. Tais epítopos podem estar no mesmo ou em alvos diferentes. Se os epítopos estão em alvos diferentes, tais alvos podem estar na mesma célula ou em células ou tipos de célula diferentes.

[00227] O termo “anticorpo biespecífico” se refere a um anticorpo tendo especificidades para pelo menos dois epítopos diferentes, tipicamente não sobrepostos. Tais epítopos podem estar no mesmo ou em alvos diferentes. Se os epítopos estão em alvos diferentes, tais alvos podem estar na mesma célula ou células ou tipos de célula diferentes.

[00228] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira e uma segunda cadeias pesadas.

[00229] As modalidades que dizem respeito à modificação da região Fc e modalidades que dizem respeito às substituições de aminoácido específicas são consideradas ser parte de qualquer anticorpo biespecífico de acordo com a invenção. Assim, em uma modalidade, pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas compreende um ou mais aminoácidos modificados como definido em qualquer modalidade aqui descrita, tal como aquelas descritas em relação ao fornecimento de uma região Fc inerte. Em uma modalidade, tanto a dita primeira quanto a segunda cadeias pesadas compreende um ou mais aminoácidos modificados como definidos em qualquer modalidade aqui descrita, tal como aquelas descritas em relação ao fornecimento de uma região Fc inerte. Consequentemente, o anticorpo biespecífico compreende uma região Fc modificada de acordo com qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos; ou pelo menos uma das ditas primeira e segunda cadeias pesadas compreende um ou mais aminoácidos modificados como definidos em qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos.

[00230] Assim, em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; e em que a região Fc foi modificada de modo que a ligação de C1q ao dito anticorpo é reduzida comparada a um anticorpo do tipo selvagem em pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou 100%, em que a ligação de C1q é determinada pelo ELISA.

[00231] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; e em que a região Fc foi modificada de modo que a ligação de C1q ao dito anticorpo é reduzida comparada à de um anticorpo do tipo selvagem em pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou 100%, em que a ligação de C1q é determinada pelo ELISA.

[00232] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; e em que a região Fc foi modificada de modo que a ligação de C1q ao dito anticorpo é reduzida comparada a um anticorpo do tipo selvagem em pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou 100%, em que a ligação de C1q é determinada pelo ELISA.

[00233] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; e em que a região Fc foi modificada de modo que a ligação de C1q ao dito anticorpo é reduzida comparada a um anticorpo do tipo selvagem em pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou 100%, em que a ligação de C1q é determinada pelo ELISA.

[00234] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; e em que a região Fc foi modificada de modo que a ligação de C1q ao dito anticorpo é reduzida comparada à de um anticorpo do tipo selvagem em pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou 100%, em que a ligação de C1q é determinada pelo ELISA.

[00235] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; e em que a região Fc foi modificada de modo que a ligação de C1q ao dito anticorpo é reduzida comparada a um anticorpo do tipo selvagem em pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou 100%, em que a ligação de C1q é determinada pelo ELISA.

[00236] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; e em que a região Fc foi modificada de modo que o dito anticorpo medeie a proliferação de célula T mediada por Fc reduzida comparada com a de um anticorpo do tipo selvagem em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100%, em que a dita proliferação de célula T é medida em um ensaio funcional com base em célula mononuclear de sangue periférico (PBMC).

[00237] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; e em que a região Fc foi modificada de modo que o dito anticorpo medeie a proliferação de célula T mediada por Fc reduzida comparada com a de um anticorpo do tipo selvagem em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100%, em que a dita proliferação de célula T é medida em um ensaio funcional com base em célula mononuclear de sangue periférico (PBMC).

[00238] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; e em que a região Fc foi modificada de modo que o dito anticorpo medeie a proliferação de célula T mediada por Fc reduzida comparada com a de um anticorpo do tipo selvagem em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100%, em que a dita proliferação de célula T é medida em um ensaio funcional com base em célula mononuclear de sangue periférico (PBMC).

[00239] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; e em que a região Fc foi modificada de modo que o dito anticorpo medeie a proliferação de célula T mediada por Fc reduzida comparada com a de um anticorpo do tipo selvagem em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100%, em que a dita proliferação de célula T é medida em um ensaio funcional com base em célula mononuclear de sangue periférico (PBMC).

[00240] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; e em que a região Fc foi modificada de modo que o dito anticorpo medeie a proliferação de célula T mediada por Fc reduzida comparada com a de um anticorpo do tipo selvagem em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100%, em que a dita proliferação de célula T é medida em um ensaio funcional com base em célula mononuclear de sangue periférico (PBMC).

[00241] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; e em que a região Fc foi modificada de modo que o dito anticorpo medeie a proliferação de célula T mediada por Fc reduzida comparada com a de um anticorpo do tipo selvagem em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100%, em que a dita proliferação de célula T é medida em um ensaio funcional com base em célula mononuclear de sangue periférico (PBMC).

[00242] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; e em que a região Fc foi modificada de modo que o dito anticorpo reduz a expressão de CD69 mediada por Fc em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100% quando comparada com a de um anticorpo do tipo selvagem em que a dita expressão de CD69 mediada por Fc é determinada em um ensaio funcional com base em PBMC.

[00243] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; e em que a região Fc foi modificada de modo que o dito anticorpo reduz a expressão de CD69 mediada por Fc em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100% quando comparada com a de um anticorpo do tipo selvagem em que a dita expressão de CD69 mediada por Fc é determinada em um ensaio funcional com base em PBMC.

[00244] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; e em que a região Fc foi modificada de modo que o dito anticorpo reduz a expressão de CD69 mediada por Fc em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100% quando comparada com a de um anticorpo do tipo selvagem em que a dita expressão de CD69 mediada por Fc é determinada em um ensaio funcional com base em PBMC.

[00245] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; e em que a região Fc foi modificada de modo que o dito anticorpo reduz a expressão de CD69 mediada por Fc em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100% quando comparada com a de um anticorpo do tipo selvagem em que a dita expressão de CD69 mediada por Fc é determinada em um ensaio funcional com base em PBMC.

[00246] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; e em que a região Fc foi modificada de modo que o dito anticorpo reduz a expressão de CD69 mediada por Fc em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100% quando comparada com a de um anticorpo do tipo selvagem em que a dita expressão de CD69 mediada por Fc é determinada em um ensaio funcional com base em PBMC.

[00247] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; e em que a região Fc foi modificada de modo que o dito anticorpo reduz a expressão de CD69 mediada por Fc em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100% quando comparada com a de um anticorpo do tipo selvagem em que a dita expressão de CD69 mediada por Fc é determinada em um ensaio funcional com base em PBMC.

[00248] Em uma modalidade particular, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; e em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00249] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; e em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00250] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; e em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00251] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; e em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00252] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; e em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00253] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9 e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; e em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00254] Os exemplos de moléculas de anticorpo biespecífico que podem ser usadas na presente invenção compreende (i) um único anticorpo que tem dois ramos compreendendo diferentes regiões de ligação de antígeno, (ii) um anticorpo de cadeia única que tem especificidade para dois epítopos diferentes, por exemplo, por intermédio de dois scFvs ligados em tandem por um ligador de peptídeo extra; (iii) um anticorpo de domínio variável duplo (DVD-Ig®), onde cada cadeia leve e cadeia pesada contêm dois domínios variáveis em tandem através de uma ligação de peptídeo curto ([40]); (iv) um fragmento (Fab’)2 biespecífico quimicamente ligado; (v) um TandAb®, que é uma fusão de dois diacorpos de cadeia única resultando em um anticorpo biespecífico tetravalente que tem dois sítios de ligação para cada um dos antígenos alvo; (vi) um flexicorpo, que é uma combinação de scFvs com um diacorpo resultando em uma molécula multivalente; (vii) uma chamada molécula “dock and lock” (Dock-and-Lock®), com base na “dimerização e ancoramento de domínio” na Cinase de Proteína A, que, quando aplicado aos Fabs, pode produzir uma proteína de ligação biespecífica trivalente consistindo de dois fragmentos Fab idênticos ligados a um fragmento Fab diferente; (viii) uma molécula denominada Scorpion, compreendendo, por exemplo, dois scFvs fundidos a ambos os terminais de um ramo Fab humano; e (ix) um diacorpo.

[00255] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico da presente invenção é um diacorpo, um cross-body, ou um anticorpo biespecífico obtido por intermédio de uma troca de ramo Fab controlada, por exemplo DuoBody® (tal como descrito em [41]) como aqueles descritos na presente invenção.

[00256] Os exemplos de classes diferentes de anticorpos biespecíficos incluem mas não são limitados a (i) moléculas como IgG com domínios CH3 complementares para forçar a heterodimerização; (ii) moléculas de alvejamento dual como IgG recombinante, em que os dois lados da molécula cada um contém o fragmento Fab ou parte do fragmento Fab de pelo menos dois anticorpos diferentes; (iii) moléculas de fusão de IgG, em que os anticorpos IgG de tamanho natural são fundidos ao fragmento Fab extra ou partes do fragmento Fab; (iv) moléculas de fusão de Fc, em que moléculas de Fv de cadeia única ou diacorpos estabilizados são fundidos aos domínios constantes de cadeia pesada, regiões Fc ou partes das mesmas; (v) moléculas de fusão Fab, em que diferentes fragmentos Fab são fundidos entre si, fundidos aos domínios constantes de cadeia pesada, regiões Fc ou partes das mesmas; e (vi) anticorpos com base em ScFv- e diacorpo e de cadeia pesada (por exemplo, anticorpos de domínio, Nanobodies®) em que diferentes moléculas de Fv de cadeia única ou diferentes diacorpos ou diferentes anticorpos de cadeia pesada (por exemplo anticorpos de domínio, Nanobodies®) são fundidas entre si ou a uma outra proteína ou molécula portadora fundida aos domínios constantes de cadeia pesada, regiões Fc ou partes das mesmas.

[00257] Os exemplos de moléculas como IgG com moléculas de domínios CH3 complementares incluem mas não são limitadas à Triomab® (Trion Pharma/Fresenius Biotech, [42]), à Knobs-into-Holes (Genentech, [43]), CrossMAbs (Roche, [44]) e às eletrostaticamente emparelhadas (Amgen, [45]-[46]; Chugai, [47]; Oncomed, [48]), à LUZ-Y (Genentech), DIG-corpo e PIG-corpo (Pharmabcine), ao corpo de Domínio Engenheirado de Troca de Filamento (SEEDbody)(EMD Serono, [49]), à Biclonics (Merus), Fc?Adp (Regeneron, [50]), IgG1 e IgG2 biespecíficas (Pfizer/Rinat, [51]), esqueleto Azymetric (Zymeworks/Merck, [52]), mAb-Fv (Xencor, [53]), anticorpos biespecíficos bivalentes (Roche) e moléculas DuoBody® (Genmab A/S, [41]).

[00258] Os exemplos de moléculas de alvejamento dual como IgG recombinantes incluem mas não são limitados a Dual Targeting (DT)-Ig (GSK/Domantis), Anticorpo Two-in-one (Genentech), Mabs reticulados (Karmanos Cancer Center), mAb2 (F-Star, [54]), Zycorpos® (Zyngenia), métodos com cadeia leve comum (Crucell/Merus, [55]), KÀBodies (NovImmune) e CovX-body® (CovX/Pfizer).

[00259] Os exemplos de moléculas de fusão IgG incluem mas não são limitados a Domínio Variável Dual (DVD)-Ig® (Abbott, [56]), anticorpos de cabeça dupla de domínio dual (Unilever; Sanofi Aventis, [57]), Biespecíficos como IgG (ImClone/Eli Lilly), Ts2Ab (MedImmune/AZ) e BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec, [58]), fusão scFv (Novartis), fusão scFv (Changzhou Adam Biotech Inc, [59]) e TvAb (Roche, [59], [60]).

[00260] Os exemplos de moléculas de fusão Fc incluem mas não são limitados a Fusões ScFv/Fc (Academic Institution), SCORPION (Emergent BioSoluções/Trubion, Zymogenetics/BMS), Tecnologia de Realvejamento de Afinidade Dual (Fc-DART®) (MacroGenics, [62], [63]) e Dual(ScFv)2-Fab (National Research Center for Antibody Medicine - China).

[00261] Os exemplos de anticorpos biespecíficos de fusão Fab incluem mas não são limitados a F(ab)2 (Medarex/AMGEN), Ação Dual ou Bis-Fab (Genentech), Dock-and-Lock® (DNL) (ImunoMedics), Biespecíficos Bivalentes (Biotecnol) e Fab-Fv (UCB-Celltech).

[00262] Os exemplos de anticorpos ScFv, com base em diacorpo e de domínio incluem mas não são limitados a Ligador de Célula T Biespecífico (BiTE®) (Micromet, Tandem Diabody (Tandab) (Affimed), Tecnologia de Realvejamento de Afinidade Dual (DART®) (MacroGenics), Diacorpo de Cadeia Única (Academic), Anticorpos como TCR (AIT, ReceptorLogics), Fusão de Albumina Sérica Humana ScFv (Merrimack) e COMBODY (Epigen Biotech), nanocorpos® de alvejamento dual (Ablynx), anticorpos de domínio apenas de cadeia pesada de alvejamento dual.

[00263] É considerado ainda que qualquer anticorpo monoespecífico que satisfaça as condições de ensaio aqui descritas pode formar a base de um anticorpo biespecífico. Isto é um anticorpo biespecífico em que uma das regiões de ligação liga CD3 pode originar-se de qualquer anticorpo CD3 monoespecífico testado nos ensaios funcionais e que satisfaçam as exigências aqui estabelecidas. Um tal anticorpo biespecífico pode ser fornecido pelos métodos descritos em [41], que é por meio deste incorporada por referência.

[00264] Assim, em uma modalidade particular, cada uma da dita primeira e segunda cadeias pesadas compreende pelo menos uma região de dobradiça, uma região CH2 e CH3, em que na dita primeira cadeia pesada pelo menos um dos aminoácidos nas posições correspondentes a uma posição selecionada do grupo consistindo de T366, L368, K370, D399, F405, Y407, e K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana foi substituída, e na dita segunda cadeia pesada pelo menos um dos aminoácidos nas posições correspondentes a uma posição selecionadas do grupo consistindo de T366, L368, K370, D399, F405, Y407, e K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana foi substituído, e em que a dita primeira e a dita segunda cadeias pesadas não são substituídas nas mesmas posições. No contexto o termo “substituído”, se refere a que o aminoácido em uma posição de aminoácido específica foi substituído com um outro aminoácido que ocorre natural ou não naturalmente. Assim, um aminoácido “substituído” em uma posição correspondente à posição em uma cadeia pesada de IgG1 humana significa que o aminoácido na posição particular é diferente do aminoácido que ocorre naturalmente em uma cadeia pesada de IgG1.

[00265] Em uma modalidade, na dita primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana não é K, L ou M, e opcionalmente o aminoácido na posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é F, e na dita segunda cadeia pesada pelo menos um dos aminoácidos nas posições correspondentes a uma posição selecionada do grupo consistindo de; T366, L368, K370, D399, F405, e Y407 em uma cadeia pesada de IgG1 humana foi substituído.

[00266] Em uma modalidade, na dita primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana não é K, L ou M, e na dita segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana não é F e opcionalmente o aminoácido na posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é K.

[00267] Em uma modalidade, na dita primeira cadeia pesada, o aminoácido na posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana não é F, R, e G, e na dita segunda cadeia pesada os aminoácidos nas posições correspondentes a uma posição selecionada do grupo consistindo de; T366, L368, K370, D399, Y407, e K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana foram substituídos.

[00268] Em uma modalidade, o aminoácido na posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana não é K, L ou M na dita primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana não é F.

[00269] Em uma outra modalidade, o aminoácido na posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é L na dita primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é R na dita segunda cadeia pesada, ou vice e versa.

[00270] Assim, em uma modalidade, o aminoácido na posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é R na primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é L na segunda cadeia pesada.

[00271] Em uma outra modalidade, o anticorpo CD3 humanizado ou quimérico da invenção contém em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas uma ou mais das substituições inativadoras como divulgado em qualquer uma das modalidades acima, tais como L234F, L235E, e D265A; e que o aminoácido na posição correspondente a F405 não é F. Em uma modalidade o anticorpo CD3 humanizado ou quimérico da invenção contém em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas uma ou mais das substituições inativadoras como divulgado em qualquer uma das modalidades acima, tais como L234F, L235E, e D265A; e uma outra substituição na posição K409, tal como K409R. Em particular, em uma modalidade, o anticorpo CD3 humanizado ou quimérico da invenção contém tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas uma ou mais das substituições inativadoras como divulgado em qualquer uma das modalidades acima, tais como L234F, L235E, e D265A; e uma substituição na posição F405, tal como F405L. Em uma modalidade o anticorpo de CD3 humanizado ou quimérico da invenção contém tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas uma ou mais das substituições inativadoras como divulgado em qualquer uma das modalidades acima, tais como L234F, L235E, e D265A; e uma outra substituição na posição K409, tal como K409R. Tais anticorpos são úteis para gerar um anticorpo biespecífico.

[00272] Consequentemente, em uma outra modalidade, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes à posição L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são F, E, e A, respectivamente, o aminoácido na posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é L na primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é R na segunda cadeia pesada.

[00273] Em uma modalidade, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes a L234, L235, D265, N297, e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são F, E, A, N, e P respectivamente, o aminoácido na posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é L na primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é R na segunda cadeia pesada.

[00274] Em uma modalidade alternativa, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes à posição L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são F, E, e A, respectivamente, o aminoácido na posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é R na primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é L na segunda cadeia pesada.

[00275] Em uma modalidade, em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes a L234, L235, D265, N297, e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são F, E, A, N, e P respectivamente, o aminoácido na posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é R na primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é L na segunda cadeia pesada.

[00276] Em uma outra modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes à posição L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são F, E, e A, respectivamente, o aminoácido na posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é L na primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é R na segunda cadeia pesada.

[00277] Em uma modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes a L234, L235, D265, N297, e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são F, E, A, N, e P respectivamente, o aminoácido na posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é L na primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é R na segunda cadeia pesada.

[00278] Em uma modalidade alternativa, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes à posição L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são F, E, e A, respectivamente, o aminoácido na posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é R na primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é L na segunda cadeia pesada.

[00279] Em uma modalidade, tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes a L234, L235, D265, N297, e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são F, E, A, N, e P respectivamente, o aminoácido na posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é R na primeira cadeia pesada, e o aminoácido na posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é L na segunda cadeia pesada.

[00280] Como aqui descrito, o recrutamento de célula T às células alvo específicas, tais como células cancerosas ou de tumor, fornece um modo de extermínio das células alvo. Os presentes inventores mostraram que um anticorpo CD3xHER2 biespecífico compreendendo as substituições de aminoácido específicas L234F, L235E, e D265A em ambas das cadeias pesadas, foi capaz de induzir o extermínio de células AU565 como descrito no Exemplo 5. O extermínio mediado pela célula T pode ser obtido por um anticorpo biespecífico que alveja CD3 com a primeira região de ligação e um outro alvo com a segunda região de ligação. Assim, em uma modalidade, a primeira região de ligação está de acordo com qualquer uma das modalidades aqui descritas para o anticorpo CD3 humanizado ou quimérico, e a segunda região de ligação liga um alvo diferente da primeira região de ligação. Deve ser entendido que quando o anticorpo é um anticorpo biespecífico, pelo menos uma metade do anticorpo, isto é um dos pares de cadeias pesada e leves do anticorpo, é um anticorpo humanizado ou quimérico como aqui descrito. Assim, metade do anticorpo biespecífico é uma ligação CD3 de anticorpo humanizado ou quimérico de acordo com a presente invenção e a outra metade pode ser ligação humanizada, quimérica, totalmente não humana ou totalmente humana a um segundo alvo. Assim, em uma modalidade, o anticorpo compreende uma primeira e uma segunda cadeia pesada, uma primeira e segunda cadeia leve, em que a dita primeira cadeia pesada e a dita primeira cadeia leve são humanizadas ou quiméricas e são conectadas por intermédio de pontes de dissulfeto formando uma primeira região de ligação; e a dita segunda das cadeias pesada e leve são totalmente humanas e são conectadas por intermédio de pontes de dissulfeto formando uma segunda região de ligação, em que a dita primeira região de ligação está de acordo com qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos, e a dita segunda região de ligação liga um alvo diferente. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma primeira e uma segunda cadeias pesadas, uma primeira e segunda cadeias leves, em que a dita primeira cadeia pesada e a dita primeira cadeia leve são humanizadas ou quiméricas e são conectadas por intermédio de pontes de dissulfeto formando uma primeira região de ligação; e a dita segunda das cadeias pesada e leve são humanizadas ou quiméricas e são conectadas por intermédio de pontes de dissulfeto formando uma segunda região de ligação, em que a dita primeira região de ligação está de acordo com qualquer aspecto ou modalidade aqui descrita, e a dita segunda região de ligação liga um epítopo diferente de CD3 do que a primeira região de ligação.

[00281] Assim, em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 19, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 20; em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00282] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 29, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 30; em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00283] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 19, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 20; em que tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00284] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 29, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 30; em que tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00285] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 19, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 20; em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00286] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 29, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 30; em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00287] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 19, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 20; em que tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00288] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 8, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 29, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 30; em que tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00289] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 19, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 20; em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00290] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 29, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 30; em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00291] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 19, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 20; em que tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00292] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 29, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 30; em que tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00293] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 19, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 20; em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00294] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 29, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 30; em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00295] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 19, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 20; em que tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00296] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 6, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 29, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 30; em que tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00297] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 19, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 20; em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00298] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 29, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 30; em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00299] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 19, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 20; em que tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00300] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 10; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 29, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 30; em que tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00301] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 19, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 20; em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00302] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 29, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 30; em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00303] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 19, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 20; em que tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00304] Em uma outra modalidade, o anticorpo biespecífico compreende uma primeira região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 9, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 12; uma segunda região de ligação compreendendo uma sequência VH como apresentada na SEQ ID NO: 29, e uma sequência VL como apresentada na SEQ ID NO: 30; em que tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente; e em que na primeira cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é L, e na segunda cadeia pesada o aminoácido na posição correspondente à posição K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, é R.

[00305] O termo “pontes de dissulfeto” como aqui usado se refere à ligação covalente entre dois resíduos de Cisteína, isto é a dita interação também pode ser designada uma interação Cys-Cys.

[00306] O termo “alvo” como aqui usado, se refere a uma molécula à qual a região de ligação do anticorpo de acordo com a invenção se liga. Quando usado no contexto da ligação de um anticorpo o termo inclui qualquer antígeno para o qual o anticorpo incitado é direcionado.

[00307] Em uma modalidade particular, a primeira cadeia pesada e a primeira leve são humanizadas ou quiméricas e são conectadas por intermédio de pontes de dissulfeto formando uma primeira região de ligação; e a segunda das cadeias pesada e leve são totalmente humanas e são conectadas por intermédio de pontes de dissulfeto formando uma segunda região de ligação, em que a primeira região de ligação é de acordo com qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos, e a segunda região de ligação liga um alvo diferente; e em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00308] Em uma modalidade particular, a primeira cadeia pesada e a primeira leve são humanizadas ou quiméricas e são conectadas por intermédio de pontes de dissulfeto formando uma primeira região de ligação; e a segunda das cadeias pesada e leve são totalmente humanas e são conectadas por intermédio de pontes de dissulfeto formando uma segunda região de ligação, em que a primeira região de ligação está de acordo com qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos, e a segundo região de ligação liga um epítopo diferente de CD3 do que a primeira região de ligação; e em que em pelo menos uma da primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00309] Em uma modalidade particular, a primeira cadeia pesada e a primeira leve são humanizadas ou quiméricas e são conectadas por intermédio de pontes de dissulfeto formando uma primeira região de ligação; e a segunda das cadeias pesada e leve são totalmente humanas e são conectadas por intermédio de pontes de dissulfeto formando uma segunda região de ligação, em que a primeira região de ligação está de acordo com qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos, e a segunda região de ligação liga um alvo diferente; e em que tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente.

[00310] Em uma modalidade particular, a primeira cadeia pesada e a primeira leve são humanizadas ou quiméricas e são conectadas por intermédio de pontes de dissulfeto formando uma primeira região de ligação; e a segunda das cadeias pesada e leve são totalmente humanas e são conectadas por intermédio de pontes de dissulfeto formando uma segunda região de ligação, em que a primeira região de ligação está de acordo com qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos, e a segunda região de ligação liga um epítopo diferente de CD3 do que a primeira região de ligação; e em que tanto na primeira quanto na segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana, são F, E, e A, respectivamente. Construções de ácido nucléico, vetores de expressão, e células hospedeiras

[00311] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma construção de ácido nucléico que codifica uma ou mais sequências apresentadas na Tabela 1. Assim, a presente invenção refere-se a uma construção de ácido nucléico que codifica qualquer uma das sequências apresentadas nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, e 26.

[00312] Em um outro aspecto, a invenção refere-se à construção de ácido nucléico que codifica uma sequência de um anticorpo CD3 humanizado ou quimérico de acordo com a presente invenção, aos vetores de expressão compreendendo uma construção de ácido nucléico de acordo com a presente invenção, às células hospedeiras compreendendo tais vetores de expressão, e aos métodos de produzir um tal anticorpo cultivando-se tais células hospedeiras sob condições apropriadas por meio das quais o anticorpo é produzido e, opcionalmente, recuperado. Anticorpos CD3 humanizados também podem ser indicados como “huCD3”.

[00313] Em uma modalidade, a invenção fornece um vetor de expressão compreendendo (i) uma sequência de ácido nucléico que codifica uma sequência de cadeia pesada de um anticorpo humanizado ou quimérico de acordo com a invenção, (ii) uma sequência de ácido nucléico que codifica uma sequência de cadeia leve de um anticorpo humanizado ou quimérico de acordo com a invenção, ou (iii) tanto (i) quanto (ii). Assim, o vetor de expressão compreende uma ou mais construções de ácido nucléico ou sequências de ácido nucléico de acordo com qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos.

[00314] Em uma modalidade, o vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica uma ou mais das sequências de CDR de cadeia pesada e cadeia leve selecionadas do grupo consistindo de: SEQ ID NOs.: 1, 2, 3, 4, e 5; e a sequência GTN.

[00315] Em uma modalidade, a invenção fornece um vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucléico que codifica uma ou mais sequências de aminoácido selecionadas do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 19, 20, 27, 28, 29, e 30, ou qualquer combinação das mesmas. Em uma outra modalidade, o vetor de expressão compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica a sequência de aminoácido de VH CDR3 como apresentada na SEQ ID NO: 3. Em uma outra modalidade, o vetor de expressão compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica uma sequência VH de aminoácido selecionada das SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 9, 19, 27, e 29. Em uma outra modalidade, o vetor de expressão compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica uma sequência VL de aminoácido selecionada das SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 20, 28, e 30. Em uma outra modalidade, o vetor de expressão compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica a região constante de uma cadeia leve de anticorpo humano, de uma cadeia pesada de anticorpo humano, ou ambas. Em uma outra modalidade, a invenção fornece um vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucléico que codifica a sequência de aminoácido de acordo com as SEQ ID NOs: 15, 16, 23, 24, 25, e 26.

[00316] Em uma modalidade particular, o vetor de expressão compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica uma variante de uma ou mais das sequências de aminoácido acima, a dita variante tendo no máximo 25 modificações de aminoácido, tal como no máximo 20, tal como no máximo 15, 14, 13, 12, ou 11 modificações de aminoácido, tais como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 modificação de aminoácido, tais como deleções ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou não conservativas, ou pelo menos 80% de identidade com qualquer uma das ditas sequências, tais como pelo menos 85% de identidade ou 90% de identidade ou 95% de identidade, tal como 96% de identidade ou 97% de identidade ou 98% de identidade ou 99% de identidade com qualquer uma das sequências de aminoácido anteriormente mencionadas. A presente invenção também refere-se às sequências de ácido nucléico diferentes das sequências de ácido nucléico mencionadas acima mas que devido à variação do código genético codificam a mesma sequência de aminoácido como um anticorpo da presente invenção. Por exemplo a sequência de ácido nucléico pode variar mas resulta em um sequência de aminoácido idêntica como qualquer sequência de aminoácido aqui descrita. É bem conhecido para a pessoa habilitada como identificar tais outras sequências de ácido nucléico com base no código genético.

[00317] Em um outra modalidade, o vetor de expressão compreende ainda uma sequência de ácido nucléico que codifica a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou tanto cadeias leves quanto pesadas de um anticorpo, por exemplo um anticorpo humano.

[00318] Tais vetores de expressão como descritos acima podem ser usados para a produção recombinante de anticorpos da invenção.

[00319] Um vetor de expressão no contexto da presente invenção pode ser qualquer vetor adequado, incluindo vetores de ácido nucléico cromossômicos, não cromossômicos, e sintéticos (uma sequência de ácido nucléico compreendendo um conjunto adequado de elementos de controle de expressão). Os exemplos de tais vetores incluem derivados de SV40, plasmídeos bacterianos, DNA de fago, baculovírus, plasmídeos de levedura, vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago, e vetores de ácido nucléico viral (RNA ou DNA). Em uma modalidade, um ácido nucléico que codifica anticorpo CD3 humanizado ou quimérico está compreendido em um vetor de DNA ou RNA nu, incluindo, por exemplo, um elemento de expressão linear (como descrito por exemplo em [64]), um vector de ácido nucléico compacto (como descrito por exemplo em [65] e/ou [66]), um vetor plasmídico tal como pBR322, pUC 19/18, ou pUC 118/119, um vetor de ácido nucléico de tamanho minimamente “minúsculo” (como descrito por exemplo em [67]), ou como uma construção de vetor de ácido nucléico precipitada, tal como uma construção precipitada com CaPO4- (como descrito por exemplo em [68], [69], [70], e [71]). Tais vetores de ácido nucléico e o uso dos mesmos são bem conhecidos na técnica (ver por exemplo [72] e [73]).

[00320] Em uma modalidade, o vetor é adequado para a expressão do anticorpo CD3 humanizado ou quimérico em uma célula bacteriana. Os exemplos de tais vetores incluem vetores de expressão tais como BlueScript (Stratagene), vetores pIN ([74]), vetores pET (Novagen, Madison WI) e os semelhantes.

[00321] Um vetor de expressão também pode ou alternativamente ser um vetor adequado para a expressão em um sistema de levedura. Qualquer vetor adequado para a expressão em um sistema de levedura pode ser utilizada. Os vetores adequados incluem, por exemplo, vetores compreendendo promotores constitutivos ou indutíveis tais como fator alfa, álcool oxidase e PGH (revisado em: [75] e [76]).

[00322] Uma construção de ácido nucléico e/ou vetor também pode compreender uma sequência de ácido nucléico que codifica uma sequência de secreção/localização, que pode alvejar um polipeptídeo, tal como uma cadeia de polipeptídeo nascente, ao espaço periplásmico ou dentro de meio de cultura de célula. Tais sequências são conhecidas na técnica, e incluem líder de secreção ou peptídeos de sinal, sequências que alvejam organela (por exemplo, sequências de localização nuclear, sinais de retenção de ER, sequências de trânsito mitocondrial, sequências de trânsito de cloroplasto), sequências de localização de membrana/âncora (por exemplo, sequências de parada de transferência, sequências âncoras de GPI), e as semelhantes que são bem conhecidas na técnica.

[00323] Em um vetor de expressão da invenção, ácidos nucléicos que codificam anticorpo CD3 humanizado ou quimérico podem compreender ou estar associados com qualquer promotor, realçador, e outros elementos que facilitem a expressão adequados. Os exemplos de tais elementos incluem promotores de expressão fortes (por exemplo, promotor/realçador de IE do CMV humano assim como promotores de RSV, SV40, SL3-3, MMTV, e LTR do HIV), sequências de terminação poli (A) efetivas, uma origem de replicação para o produto de plasmídeo na E. coli, um gene de resistência a antibiótico como marcador selecionável, e/ou um sítio de clonagem conveniente (por exemplo, um poliligador). As construções de ácido nucléico e/ou vetores também podem compreender um promotor indutível como oposto a um promotor constitutivo tais como IE do CMV (a pessoa habilitada reconhecerá que tais termos são de fato descritores de um grau de expressão de gene sob certas condições).

[00324] Em uma modalidade, o vetor de expressão que codifica o anticorpo CD3 humanizado ou quimérico é posicionado na e/ou liberado à célula hospedeira ou animal hospedeiro por intermédio de um vetor viral.

[00325] Tais vetores de expressão podem ser usados para a produção recombinante de anticorpos CD3 humanizados ou quiméricos.

[00326] Em um aspecto, a invenção fornece uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão de acordo com a invenção.

[00327] Em um aspecto, os anticorpos CD3 humanizados ou quiméricos de qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos são fornecidos pelo uso de célula hospedeira eucariótica recombinante, procariótica recombinante, ou microbiana recombinante que produz o anticorpo. Consequentemente, a invenção fornece uma célula hospedeira eucariótica recombinante, procariótica recombinante, ou microbiana recombinante, que produz um anticorpo CD3 humanizado ou quimérico ou imunoglobulina como aqui definido. Os exemplos de células hospedeiras incluem células de levedura, bacteriana e de mamífero, tais como células CHO ou HEK-293. Por exemplo, em uma modalidade, a célula hospedeira compreende uma sequência de ácido nucléico estavelmente integrada no genoma celular que compreende uma sequência que codifica a expressão de um anticorpo CD3 humanizado ou quimérico aqui descrito. Em uma outra modalidade, a célula hospedeira compreende uma sequência de ácido nucléico não integrada, tal como um plasmídeo, cosmídeo, fagomídeo, ou elemento de expressão linear, que compreende uma sequência que codifica a expressão de um anticorpo CD3 humanizado ou quimérico aqui descrito.

[00328] O termo “célula hospedeira recombinante” (ou simplesmente “célula hospedeira”), como aqui usado, é intencionado a se referir a uma célula dentro da qual um vetor de expressão ou construção de ácido nucléico ou sequência foram introduzidos. Deve ser entendido que tais termos são intencionados a se referir não apenas à célula individual particular, mas também à progênie de uma tal célula. Porque certas modificações podem ocorrer em gerações seguintes devido à mutação ou influências ambientais, tal progênie, de fato, pode não ser idêntica à célula precursora, mas são ainda incluídas dentro do escopo do termo “célula hospedeira” como aqui usado. As células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, células hospedeiras eucarióticas, tais como células CHO, células HEK-293, PER.C6, células NS0, e células linfocíticas, e células procarióticas tais como E. coli e outros hospedeiros eucarióticos tais como células vegetais e fungos.

[00329] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para produzir um anticorpo CD3 humanizado ou quimérico da invenção, o dito método compreendendo as etapas de a)cultivar uma célula hospedeira da invenção como aqui descrita acima, e b)recuperar e/ou purificar o anticorpo da invenção do meio de cultura.

[00330] Em um outro aspecto, a sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de um anticorpo CD3 humanizado ou quimérico codifica ainda uma segunda porção, tal como um polipeptídeo terapêutico. Os polipeptídeos terapêuticos exemplares são aqui descritos em outro lugar. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para produzir uma proteína de fusão de anticorpo CD3 humanizado ou quimérico, o dito método compreendendo as etapas de a)cultivar uma célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão compreendendo uma tal sequência de nucleotídeo, e b)recuperar e/ou purificar a proteína de fusão do anticorpo CD3 humanizado ou quimérico do meio de cultura.

Composições

[00331] Emum aspecto,a invençãoforneceumacomposição compreendendo oanticorpo ouanticorpo biespecífico deacordo com qualquer aspecto e modalidade aqui descrita.

[00332] Emum aspecto,a invençãoforneceumacomposição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou anticorpo biespecífico como definidos em qualquer um dos aspectos e modalidades aqui descritos, e um portador farmaceuticamente aceitável.

[00333] As composições farmacêuticas podem ser formuladas com portadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis assim como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de acordo com técnicas convencionais tais como aquelas divulgadas em [77].

[00334] Os portadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis assim como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos devem ser adequados para o anticorpo humanizado ou quimérico da presente invenção e o modo escolhido de administração. A adequabilidade para os portadores e outros componentes das composições farmacêuticas é determinada com base na falta de impacto negativo significante sobre as propriedades biológicas desejadas do composto ou composição farmacêutica escolhidos da presente invenção (por exemplo, menos do que um impacto substancial (10% ou menos em relação à inibição, 5% ou menos em relação à inibição, etc.)) sobre a ligação de antígeno.

[00335] Uma composição farmacêutica da presente invenção também pode incluir diluentes, enchedores, sais, tampões, detergentes (por exemplo, um detergente não iônico, tal como Tween-20 ou Tween-80), estabilizantes (por exemplo, açúcares ou aminoácidos livres de proteína), preservantes, fixadores de tecido, solubilizantes, e/ou outros materiais adequados para a inclusão em uma composição farmacêutica.

[00336] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a se obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para se obter a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição, e modo de administração, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção utilizada, ou a sua amida, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular que é utilizada, a duração do tratamento, outros drogas, compostos e/ou materiais usados na combinação com as composições particulares utilizadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente que é tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.

[00337] A composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer via e modo adequados. As vias adequadas de administrar um anticorpo humanizado ou quimérico da presente invenção in vivo e in vitro são bem conhecidos na técnica e podem ser selecionadas por aqueles de habilidade comum na técnica.

[00338]Em uma modalidade, uma composição farmacêutica da presente invenção é parenteralmente administrada.

[00339]As frases “administração parenteral” e “parenteralmente administrada” como aqui usadas significa modos de administração outros que não a administração enteral e tópica, usualmente por injeção, e incluem injeção e infusão epidérmica, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, intratendinosa, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnóide, intraespinhal, intracraniana, intratoráxica, epidural e intrasternal.

[00340] Em uma modalidade esta composição farmacêutica é administrada pela injeção ou infusão intravenosa ou subcutânea.

[00341] Os portadores farmaceuticamente aceitáveis incluem quaisquer e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de isotonicidade, antioxidantes e agentes retardadores de absorção, e os semelhantes adequados que sejam fisiologicamente compatíveis com um anticorpo humanizado ou quimérico da presente invenção.

[00342] Os exemplos de portadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, etanol, dextrose, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e os semelhantes), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como óleo de oliva, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, e óleo de gergelim, soluções coloidais de carboximetil celulose, goma tragacanto e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila, e/ou vários tampões. Outros portadores são bem conhecidos nas técnicas farmacêuticas.

[00343] Os portadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para as substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencionais sejam incompatíveis com o composto ativo, o seu uso nas composições farmacêuticas da presente invenção é considerado. Quando da alusão ao “composto ativo” é considerado também referir-se ao anticorpo humanizado ou quimérico de acordo com a presente invenção.

[00344] A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.

[00345] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem compreender antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis por exemplo (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridreto de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e os semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol, e os semelhantes; e (3) agentes queladores de metal, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e os semelhantes.

[00346] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem compreender agentes de isotonicidade, tais como açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, glicerol ou cloreto de sódio nas composições.

[00347] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem conter um ou mais adjuvantes apropriados para a via escolhida de administração tais como preservantes, agentes de umectação, agentes de emulsificação, agentes de dispersão, preservantes ou tampões, que podem realçar a vida de prateleira ou eficácia da composição farmacêutica. O anticorpo humanizado ou quimérico da presente invenção pode ser preparado com portadores que protegerão o composto contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos, e sistemas de liberação microencapsulados. Tais portadores podem incluir gelatina, monoestearato de glicerila, diestearato de glicerila, polímeros biodegradáveis, biocompatíveis tais como etileno acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido poliláctico sozinhos ou com uma cera, ou outros materiais bem conhecidos na técnica. Os métodos para a preparação de tais formulações são no geral conhecidos por aqueles habilitados na técnica (ver por exemplo, [78]).

[00348] Em uma modalidade, o anticorpo humanizado ou quimérico da presente invenção pode ser formulado para garantir a distribuição apropriada in vivo. Os portadores farmaceuticamente aceitáveis para a administração parenteral incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para as substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencionais sejam incompatíveis com o composto ativo, o seu uso nas composições farmacêuticas da presente invenção é considerado. Outros compostos ativos ou terapêuticos também podem ser incorporados dentro das composições.

[00349] As composições farmacêuticas para injeção tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de droga. O portador pode ser um solvente ou meio de dispersão aquosos ou um não aquoso contendo por exemplo água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e os semelhantes), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como glicerol, manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada pela inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes por exemplo como enumerado acima, como requerido, seguido pela microfiltração com esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contenha um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos por exemplo daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os exemplos de métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente filtrada estéril do mesmo.

[00350] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pela incorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido pela microfiltração de esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando-se o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os exemplos de métodos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente filtrada estéril do mesmo. Aplicações terapêuticas

[00351] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado ou quimérico, ou composição farmacêutica da invenção como definidos em qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos, para o uso como uma droga.

[00352] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado ou quimérico, ou composição farmacêutica da invenção como definido em qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos, para o uso no tratamento de uma doença.

[00353] O anticorpo humanizado ou quimérico ou composição farmacêutica da invenção podem ser usados como no tratamento de qualquer câncer em que os mecanismos efetores das células T citotóxicas são desejados. Por exemplo, o anticorpo humanizado ou quimérico pode ser administrado às células em cultura, por exemplo, in vitro ou ex vivo, ou aos indivíduos humanos, por exemplo in vivo, para tratar ou prevenir distúrbios tais como câncer, distúrbios inflamatórios ou autoimunes. Como aqui usado, o termo “indivíduo” é tipicamente um ser humano que responde ao anticorpo humanizado ou quimérico, ou composição farmacêutica. Os indivíduos por exemplo podem incluir pacientes humanos tendo distúrbios que possam ser corrigidos ou melhorados pela modulação de uma função alvo ou pela condução ao extermínio da célula, direta ou indiretamente.

[00354] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para tratar ou prevenir um distúrbio, tal como câncer, em que o recrutamento de células T contribuiria para o tratamento ou prevenção, método este que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo humanizado ou quimérico, ou composição farmacêutica da presente invenção a um indivíduo em necessidade do mesmo. O método tipicamente envolve administrar a um indivíduo um anticorpo humanizado ou quimérico em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir os distúrbios.

[00355] Em um aspecto particular, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de câncer compreendendo administrar o anticorpo humanizado ou quimérico ou composição farmacêutica da invenção como definido em qualquer aspecto e modalidades aqui descritos, a um indivíduo em necessidade do mesmo.

[00356] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se ao uso ou ao método como definidos em qualquer aspecto ou modalidades aqui descritos em que o anticorpo humanizado ou quimérico é um anticorpo biespecífico que especificamente se liga tanto a CD3 quanto a um alvo específico de câncer, ou um alvo que seja superexpressado em câncer ou associado com câncer, tal como HER2, CD19, EpCAM, EGFR, CD66e (ou CEA, CEACAM5), CD33, EphA2 ou MCSP (ou HMW-MAA) e em que a doença é câncer, tal como câncer mamário, câncer prostático, câncer pulmonar de célula não pequena, câncer vesical, câncer ovariano, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer esofágico e carcinoma de célula escamosa da cabeça & pescoço, câncer cervical, câncer pancreático, câncer testicular, melanoma maligno, um câncer de tecido mole (por exemplo, sarcoma sinovial), uma forma indolente ou agressiva de linfoma de célula B, leucemia linfática crônica ou leucemia linfática aguda.

[00357] As dosagens e regimes de dosagem eficientes para o anticorpo humanizado ou quimérico dependem da doença ou condição a serem tratadas e podem ser determinados pelas pessoas habilitadas na técnica.

[00358] Um médico tendo habilidade comum na técnica pode facilmente determinar e prescrever a quantidade eficaz da composição farmacêutica requerida. Por exemplo, o médico começaria com doses do anticorpo humanizado ou quimérico utilizado na composição farmacêutica em níveis mais baixos do que requerido de modo a obter o efeito terapêutico desejado e gradualmente aumentar a dosagem até que o efeito desejado seja obtido. No geral, uma dose adequada de uma composição da presente invenção será aquela quantidade do anticorpo humanizado ou quimérico que é a dose eficaz mais baixa para produzir um efeito terapêutico de acordo com um regime de dosagem particular. Uma tal dose eficaz no geral dependerá dos fatores descritos acima.

[00359] Por exemplo, uma “quantidade eficaz” para o uso terapêutico pode ser medida pela sua capacidade para estabilizar a progressão da doença. A capacidade de um composto para inibir câncer, por exemplo, pode ser avaliada em um sistema de modelo animal preditivo da eficácia em tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando-se a capacidade do anticorpo humanizado ou quimérico para inibir o crescimento da célula ou para induzir a citotoxicidade pelos ensaios in vitro conhecidos pelo técnico habilitado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico, isto é um anticorpo terapêutico humanizado ou quimérico, ou composição farmacêutica de acordo com a invenção, pode diminuir o tamanho do tumor, ou de outro modo melhorar os sintomas em um indivíduo. Uma pessoa de habilidade comum na técnica seria capaz de determinar tais quantidades com base em fatores tais como o tamanho do indivíduo, a severidade dos sintomas do indivíduo, e a composição ou via particular de administração selecionadas.

[00360] Uma faixa exemplar, não limitante para uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo humanizado ou quimérico da invenção é de cerca de 0,001 a 30 mg/kg, tal como de cerca de 0,001 a 20 mg/kg, tal como de cerca de 0,001 a 10 mg/kg, tal como de cerca de 0,001 a 5 mg/kg, por exemplo de cerca de 0,001 a 2 mg/kg, tal como de cerca de 0,001 a 1 mg/kg, por exemplo de cerca de 0,001, cerca de 0,01, cerca de 0,1, cerca de 1, cerca de 5, cerca de 8, cerca de 10, cerca de 12, cerca de 15, cerca de 18 mg/kg.

[00361] A administração por exemplo pode ser intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, ou subcutânea, e por exemplo administrada próxima ao local do alvo.

[00362] Os regimes de dosagem nos métodos acima de tratamento e usos são ajustados para fornecer a resposta ideal desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolo pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas com o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica.

[00363] Em uma modalidade, a eficácia do tratamento é monitorada durante a terapia, por exemplo em pontos predefinidos no tempo.

[00364] Se desejado, uma dose diária eficaz de uma composição farmacêutica pode ser administrada como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais subdoses administradas separadamente em intervalos apropriados por todo o dia, opcionalmente, nas formas de dosagem unitária. Em uma outra modalidade, o anticorpo humanizado ou quimérico, ou composição farmacêutica são administrados pela infusão contínua lenta em um período longo, tal como mais do que 24 horas, de modo a minimizar quaisquer efeitos colaterais indesejados.

[00365] Embora seja possível para um anticorpo humanizado ou quimérico da presente invenção ser administrado sozinho, é preferível administrar o anticorpo humanizado ou quimérico como uma composição farmacêutica como descrito acima.

[00366] Uma dose eficaz de um anticorpo humanizado ou quimérico da invenção também pode ser administrado usando um período de dosagem semanal, bissemanal ou trissemanal. O período de dosagem pode ser restrito a, por exemplo, 8 semanas, 12 semanas ou até que a progressão clínica tenha sido estabelecida. Alternativamente, uma dose eficaz de um anticorpo humanizado ou quimérico da invenção pode ser administrada a cada segunda, terceira ou quarta semana.

[00367] Em uma modalidade, o anticorpo humanizado ou quimérico pode ser administrado pela infusão em uma dosagem semanal de calculada em mg/m2. Tais dosagens, por exemplo, podem estar fundamentadas nas dosagens em mg/kg fornecidas acima de acordo com o seguinte: dose (mg/kg) x 70: 1,8. Tal administração pode ser repetida, por exemplo, de 1 a 8 vezes, tal como de 3 a 5 vezes. A administração pode ser realizada pela infusão contínua em um período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Em uma modalidade, o anticorpo humanizado ou quimérico pode ser administrado pela infusão lenta contínua em um período longo, tal como mais do que 24 horas, de modo a reduzir os efeitos colaterais tóxicos.

[00368] Em uma modalidade, o anticorpo humanizado ou quimérico pode ser administrado em uma dosagem semanal de calculado como uma dose fixa por até 8 vezes, tal como de 4 a 6 vezes quando dado uma vez por semana. Tal regime pode ser repetido uma ou mais vezes como necessário, por exemplo, depois de 6 meses ou 12 meses. Tais dosagens fixas, por exemplo, podem estar fundamentadas nas dosagens em mg/kg fornecidas acima, com um peso corporal estimado de 70 kg. A dosagem pode ser determinada ou ajustada medindo-se a quantidade de anticorpo humanizado ou quimérico da presente invenção no sangue na administração por exemplo tomando-se uma amostra biológica e usando anticorpos anti-idiotípicos que alvejam a região de ligação dos anticorpos humanizados ou quiméricos da presente invenção.

[00369] Em uma modalidade, o anticorpo humanizado ou quimérico pode ser administrado pela terapia de manutenção, tal como, por exemplo, uma vez por semana por um período de 6 meses ou mais.

[00370] Um anticorpo humanizado ou quimérico também pode ser administrado profilaticamente de modo a reduzir o risco de desenvolver câncer, retardar o início da ocorrência de um evento na progressão do câncer, e/ou reduzir o risco de retorno quando um câncer está em remissão.

[00371] As composições parenterais podem ser formuladas na forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária como aqui usado se refere a unidades fisicamente separadas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o portador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagem unitária da presente invenção são ditadas e diretamente dependente (a) das características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser obtido, e (b) das limitações inerentes na técnica de combinação de um tal composto ativo para o tratamento da sensibilidade nos indivíduos.

[00372] Um anticorpo humanizado ou quimérico também pode ser administrado profilaticamente de modo a reduzir o risco de desenvolver câncer, retardar o início da ocorrência de um evento na progressão do câncer, e/ou reduzir o risco de retorno quando um câncer está em remissão. Isto pode ser especialmente útil em pacientes em que é difícil localizar um tumor que é sabido estar presente devido a outros fatores biológicos.

Aplicações em diagnóstico

[00373] O anticorpo humanizado ou quimérico da invenção também pode ser usado para propósitos de diagnóstico, usando uma composição compreendendo um anticorpo humanizado ou quimérico como aqui descrito. Consequentemente, a invenção fornece métodos e composições de diagnóstico usando os anticorpos humanizados ou quiméricos aqui descritos. Tais métodos e composições podem ser usadas para propósitos puramente de diagnóstico, tais como detectar ou identificar uma doença, assim como para o monitoramento do progresso de tratamentos terapêuticos, monitoramento da progressão da doença, avaliar a situação depois do tratamento, monitorar o retorno da doença, avaliar o risco de desenvolver uma doença, e os semelhantes.

[00374] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de diagnosticar uma doença caracterizada pelo envolvimento ou acúmulo de células de expressão de CD3, compreendendo administrar o anticorpo humanizado ou quimérico de acordo com a invenção, a composição de acordo com a invenção, ou a composição farmacêutica de acordo com a invenção a um indivíduo, opcionalmente em que o dito anticorpo humanizado ou quimérico é rotulado com um agente detectável.

[00375] Em um aspecto, o anticorpo humanizado ou quimérico da presente invenção é usado ex vivo, tal como no diagnóstico de uma doença na qual as células que expressam um alvo específico de interesse e à qual o anticorpo humanizado ou quimérico se liga, são indicativos de doença ou envolvidos na patogênese, pela detecção dos níveis do alvo ou níveis de células que expressam o alvo de interesse na sua superfície celular em uma amostra tirada de um paciente. Isto pode ser obtido, por exemplo, contatando- se a amostra a ser testada, opcionalmente junto com uma amostra de controle, com o anticorpo humanizado ou quimérico de acordo com a invenção sob condições que permitem a ligação do anticorpo ao alvo. A formação de complexo pode depois ser detectada (por exemplo, usando um ELISA). Quando do uso de uma amostra de controle junto com a amostra de teste, o nível de anticorpo humanizado ou quimérico ou complexo anticorpo-alvo é analisado em ambas as amostras e um nível mais alto estatisticamente significante de anticorpo humanizado ou quimérico ou complexo anticorpo- alvo na amostra de teste indica um nível mais alto do alvo na amostra de teste comparada com o da amostra de controle.

[00376] Os exemplos de imunoensaios convencionais em que os anticorpos humanizados ou quiméricos da presente invenção podem ser usados incluem, sem limitação, os ensaios de ELISA, RIA, FACS, ensaios de ressonância de plásmon, ensaios cromatográficos, imunoistoquímica de tecido, Western blot, e/ou imunoprecipitação.

[00377] Consequentemente, em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método de diagnosticar uma doença caracterizada pelo envolvimento ou acúmulo de células que expressam CD3, compreendendo administrar um anticorpo, anticorpo biespecífico, composição ou composição farmacêutica de acordo com qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos, a um indivíduo, opcionalmente em que o anticorpo é rotulado com um rótulo detectável.

[00378] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um método para detectar a presença de um alvo, ou uma célula que expressa o alvo, em uma amostra compreendendo: -contactar a amostra com um anticorpo humanizado ou quimérico da invenção sob condições que possibilitam a ligação do anticorpo humanizado ou quimérico ao alvo na amostra; e -analisar se um complexo foi formado. Tipicamente, a amostra é uma amostra biológica.

[00379] Em uma modalidade, a amostra é uma amostra de tecido conhecida ou suspeita de conter um alvo específico e/ou células que expressam o alvo. Por exemplo, detecção in situ da expressão do alvo pode ser realizada pela remoção de um espécime histológico de um paciente, e fornecer o anticorpo humanizado ou quimérico da presente invenção a um tal espécime. O anticorpo humanizado ou quimérico pode ser fornecido aplicando-se ou sobrepondo-se o anticorpo humanizado ou quimérico ao espécime, que é depois detectado usando meios adequados. É depois possível determinar não apenas a presença do alvo ou das células que expressam o alvo, mas também a distribuição do alvo ou das células que expressam o alvo no tecido examinado (por exemplo, no contexto de avaliar a disseminação das células cancerosas). Usando a presente invenção, aqueles de habilidade comum facilmente perceberá que qualquer um de uma ampla variedade de métodos histológicos (tais como procedimentos de tingimento) pode ser modificada de modo a se obter tal detecção in situ.

[00380] Nos ensaios acima, o anticorpo humanizado ou quimérico pode ser rotulado com uma substância detectável para permitir que a ligação de anticorpo seja detectada. Alternativamente, o anticorpo humanizado ou quimérico ligado (primário) específico pode ser detectado por um anticorpo que é rotulado com uma substância detectável e que se liga ao anticorpo humanizado ou quimérico específico primário. Além disso, nos ensaios acima, uma composição de diagnóstico compreendendo um anticorpo ou anticorpos biespecíficos de acordo com qualquer aspecto ou modalidade aqui descrita podem ser usados. Assim, em um aspecto, a presente invenção refere- se a uma composição de diagnóstico compreendendo um anticorpo ou anticorpo biespecífico de acordo com qualquer aspecto ou modalidade aqui descritos.

[00381] O nível de alvo em uma amostra também pode ser estimado por um imunoensaio de competição utilizando padrões do alvo rotulados com uma substância detectável e um anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo não rotulado. Neste tipo de ensaio, a amostra biológica, o(s) padrão(s) alvo(s) rotulado(s) e o anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo são combinados, e a quantidade de padrão do alvo rotulado ligado ao anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo não rotulado é determinada. A quantidade de alvo na amostra biológica é inversamente proporcional à quantidade de padrão do alvo rotulado ligado ao anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo.

[00382] Os rótulos adequados para o anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo, anticorpo secundário e/ou padrões de alvo usados nas técnicas de diagnóstico in vitro incluem, sem limitação, várias enzimas, grupos protético, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, e materiais radioativos. Os exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, ß-galactosidase, e acetilcolinesterase; os exemplos de complexos do grupo protético adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; os exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila e ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e os exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 35S, e 3H.

[00383] Em um aspecto, o anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo da invenção é usado na formação de imagem in vivo de tecidos que expressam o alvo tais como tumores. Para os métodos in vivo, fragmentos de anticorpo tais como, por exemplo, fragmentos (Fab’)2, Fab e Fab’, são particularmente vantajosos por causa das suas cinéticas de distribuição rápidas.

[00384] A formação de imagem in vivo pode ser realizada por qualquer técnica adequada. Por exemplo, um anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo (por exemplo, um anticorpo ou um fragmento) rotulado com 99Tc, 131I, 111In ou outro isótopo que emita raio gama pode ser usado para imagear o acúmulo do anticorpo específico do alvo ou a distribuição nos tecidos que expressam o alvo tais como tumores com uma câmera de cintilação gama (por exemplo, um dispositivo Elscint Apex 409ECT), tipicamente usando colimador de baixa energia, alta resolução ou um colimador de baixa energia de uso geral. Alternativamente, a rotulação com 89Zr, 76Br, 18F ou outro radionuclídeo que emita pósitron pode ser usada para imagear anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo, ou a distribuição de fragmento de anticorpo nos tumores usando a tomografia de emissão de pósitron (PET). As imagens obtidas pelo uso de tais técnicas podem ser usadas para avaliar a biodistribuição do alvo em um paciente, mamífero, ou tecido, por exemplo no contexto de usar o alvo como um biomarcador quanto à presença de células cancerosas/de tumor. Variações nesta técnica podem incluir o uso de formação de imagem de ressonância magnética (MRI) para melhorar a formação da imagem em relação às técnicas da câmera gama. Os métodos de imunocintilografia convencionais e princípios são descrito, por exemplo, em [79], [80], e [81]. Além disso, tais imagens também podem, ou alternativamente, servem como a base para técnicas cirúrgicas para remover tumores. Além disso, tais técnicas de formação de imagem in vivo podem permitir a identificação e localização de um tumor em uma situação onde um paciente é identificado como tendo um tumor (devido á presença de outros biomarcadores, metástases, etc.), mas o tumor não pode ser identificado pelas técnicas analíticas tradicionais. Todos estes métodos são traços da presente invenção.

[00385] A formação de imagem in vivo e outros métodos de diagnóstico fornecidos pela presente invenção são particularmente úteis na detecção de micrometástases em um paciente humano (por exemplo, um paciente não anteriormente diagnosticado com câncer ou um paciente em um período de recuperação/remissão de um câncer).

[00386] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de formação de imagem in vivo em que um anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo da presente invenção é conjugado a um agente radio-opaco promotor da detecção, o anticorpo humanizado ou quimérico conjugado é administrado a um hospedeiro, tal como pela injeção na corrente sanguínea, e a presença e localização do anticorpo humanizado ou quimérico rotulado no hospedeiro é ensaiado. Através desta técnica e qualquer outro método de diagnóstico aqui fornecido, a presente invenção fornece um método para triar quanto a presença de células relacionadas com doença em um paciente humano ou uma amostra biológica tirada de um paciente humano e/ou para avaliar a distribuição de anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo antes da terapia de ADC específica de alvo.

[00387] Para a formação de imagem de diagnóstico, radioisótopos podem ser ligados a um anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo direta ou indiretamente pelo uso de um grupo funcional intermediário. Os grupos funcionais intermediários úteis incluem queladores, tais como ácido etilenodiaminotetraacético e ácido dietilenotriaminopentaacético (ver por exemplo [82]).

[00388] Além dos radioisótopos e agentes radio-opacos, os métodos de diagnóstico podem ser realizados usando anticorpos específicos de alvo que são conjugados aos pigmentos (tais como com o complexo de biotina- estreptavidina), agentes de contraste, compostos ou moléculas fluorescentes e agentes realçadores (por exemplo íons paramagnéticos) para a formação de imagem de ressonância magnética (MRI) (ver, por exemplo, [83], que descreve técnicas de MRI e a preparação de anticorpos conjugados a um agente realçador de MRI). Tais agentes de diagnóstico/detecção podem ser selecionados de agentes para o uso na MRI, e compostos fluorescentes. De modo a carregar um anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo com metais radioativos ou íons paramagnéticos, pode ser necessário reagir o mesmo com um reagente tendo uma cauda longa à qual uma multiplicidade de grupos queladores são ligados para a ligação dos íons. Uma tal cauda pode ser um polímero tal como uma polilisina, polissacarídeo, ou uma outra cadeia derivatizada ou derivatizável tendo grupos pendentes aos quais pode ser ligado grupos queladores tais como, por exemplo, porfirinas, poliaminas, éteres crown, bistiossemicarbazonas, polioximas, e grupos semelhantes conhecidos ser úteis para este propósito. Os quelatos podem ser ligados aos anticorpos humanizados ou quiméricos específicos do alvo usando químicas padrão.

[00389] Assim, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo de diagnóstico, em que o anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo é conjugado a um agente de contraste (tal como para a formação de imagem de ressonância magnética, tomografia computadorizada, ou agente realçador do contraste de ultrassom) ou um radionuclídeo que pode ser, por exemplo, um isótopo que emite elétron ou pósitron gama, beta, alfa, Auger.

[00390] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição de diagnóstico compreendendo um anticorpo ou anticorpo biespecífico de acordo com a invenção.

[00391] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um kit para detectar a presença de antígeno alvo ou uma célula que expressa o alvo, em uma amostra, compreendendo: -um anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo da invenção; e -instruções para o uso do kit.

[00392] Assim, em um aspecto, a presente invenção fornece um kit para detectar a presença de um antígeno de CD3, ou uma célula que expressa CD3, em uma amostra compreendendo as etapas de: a)contactar a amostra com um anticorpo ou anticorpo biespecífico de acordo com a invenção, sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo ou anticorpo biespecífico e CD3; e b)analisar se um complexo foi formado.

[00393] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um kit para o diagnóstico de câncer compreendendo um recipiente compreendendo um anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo, e um ou mais reagentes para detectar a ligação do anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo ao alvo. Os reagentes podem incluir, por exemplo, rótulos fluorescentes, rótulos enzimáticos, ou outros rótulos detectáveis. Os reagentes também podem incluir anticorpos secundários ou terciários ou reagentes para as reações enzimáticas, em que as reações enzimáticas produzem um produto que pode ser visualizado. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um kit de diagnóstico compreendendo um ou mais anticorpos humanizados ou quiméricos específicos do alvo da presente invenção nas formas rotulada ou não rotulada em recipiente(s) adequado(s), reagentes para as incubações para um ensaio indireto, e substratos ou agentes derivatizantes para a detecção em um tal ensaio, dependendo da natureza do rótulo. Reagente(s) de controle e instruções para o uso também podem ser incluídos.

[00394] Os kits de diagnóstico também podem ser fornecidos para o uso com um anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo, tal como um anticorpo específico do alvo rotulado, para a detecção da presença do alvo em uma amostra de tecido ou hospedeiro. Em tais kits de diagnóstico, assim como em kits para os usos terapêuticos aqui descritos em outro lugar, um anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo tipicamente pode ser fornecido em uma forma liofilizada em um recipiente, sozinho ou em conjunção com anticorpos específicos adicionais para uma célula ou peptídeo alvos. Tipicamente, um portador farmaceuticamente aceitável (por exemplo, um diluente inerte) e/ou componentes do mesmo, tal como um Tris, tampão de fosfato ou carbonato, estabilizantes, preservantes, biocidas, proteínas inertes, por exemplo, albumina sérica, ou os semelhantes, também são incluídos (tipicamente em um recipiente separado para mistura) e reagentes adicionais (também tipicamente em recipiente(s) separado(s)). Em certos kits, um anticorpo secundário capaz de ligar o anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo, que tipicamente está presente em um recipiente separado, também é incluído. O segundo anticorpo é tipicamente conjugado a um rótulo e formulado em uma maneira similar ao anticorpo humanizado ou quimérico específico do alvo da presente invenção. Usando os métodos descritos acima e aqui em outro lugar, os anticorpos humanizados ou quiméricos específicos do alvo podem ser usados para definir subconjuntos de células cancerosas/de tumor e caracterizar tais células e tecidos tumorais relacionados.

Anticorpos anti-idiotípicos

[00395] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo anti-idiotípico que se liga a um anticorpo humanizado ou quimérico da invenção como aqui descrito.

[00396] Um anticorpo anti-idiotípico (Id) é um anticorpo que reconhece determinantes únicos geralmente associados com o antígeno-sítio de ligação de um anticorpo. Um anticorpo anti-Id pode ser preparado imunizando-se um animal da mesma espécie e tipo genético como a fonte de um anticorpo CD3 monoclonal com o anticorpo monoclonal ao qual um anti- Id está sendo preparado. O animal imunizado tipicamente pode reconhecer e responder aos determinantes idiotípicos do anticorpo imunizador pela produção de um anticorpo para estes determinantes idiotípicos (o anticorpo anti-Id). Tais anticorpos são descritos por exemplo na US 4.699.880. Tais anticorpos são traços adicionais da presente invenção.

[00397] Um anticorpo anti-Id também pode ser usado como um “imunógeno” para induzir uma resposta imune em um outro animal, produzindo um chamado anticorpo anti-anti-Id. Um anticorpo anti-anti-Id pode ser epitopicamente idêntico ao anticorpo monoclonal original, que induziu o anticorpo anti-Id. Assim, pelo uso de anticorpos para os determinantes idiotípicos de um anticorpo monoclonal, é possível identificar outros clones que expressam anticorpos de especificidade idêntica. Os anticorpos anti-Id podem ser variados (produzindo deste modo variantes de anticorpo anti-Id) e/ou derivatizados por qualquer técnica adequada, tal como aquelas aqui descritas em outro lugar com respeito aos anticorpos específicos de CD3 da presente invenção. Por exemplo, um anticorpo monoclonal anti-Id pode ser ligado a um portador tal como hemocianina do lapa buraco de fechadura (KLH) e usado para imunizar camundongos BALB/c. Os soros destes camundongos tipicamente conterão anticorpos anti-anti-Id que têm as propriedades de ligação similares, se não idênticas, a um anticorpo CD3 original/precursor. Sequências Tabela 1

Exemplos Exemplo 1 - Geração de anticorpos CD3 humanizados e variantes de anticorpo não ativadoras Humanização de anticorpos CD3

[00398] A humanização de um anticorpo CD3 de murino (US 8,236,308, aqui descrito como IgG1-CD3) foi realizada pela Antitope (Cambridge, UK) usando a sua versão melhorada da tecnologia de humanização da linha germinativa (enxerto de CDR) (EP 0 629 240). Usando esta tecnologia, 4 cadeias VH diferentes (SEQ ID NOs: 6, 7, 8, e 9) e 3 cadeias VL diferentes (SEQ ID NOs: 10, 11, e 12) foram planejadas. Combinando-se estas 4 cadeias VH com as 3 VL, 12 anticorpos diferentes foram gerados. As variantes humanizadas são aqui descritas como huCD3. Assim, as variantes humanizadas compreendendo uma VH e uma VL de acordo com a invenção, são descritas como, por exemplo, IgG1-huCD3-H1L1 significando que as ditas variantes específicas são do isótipo IgG1, são um CD3 humanizado e compreendem a sequência de aminoácido VH denominada “H1” e é definida de acordo com a SEQ ID NO: 6, e a sequência de aminoácido VL denominada “L1” e é definida de acordo com a SEQ ID NO: 10. Assim, H1 se refere à região variável de cadeia pesada VH1, L1 se refere à região variável cadeia leve VL1, e assim por diante.

[00399] Em particular, as variantes IgG1-huCD3-H1L1 (CD3 humanizadas compreendendo a sequência VH1 apresentada na SEQ ID NO: 6 e a sequência VL1 apresentada na SEQ ID NO: 10), IgG1-huCD3-H1L2 (CD3 humanizado compreendendo a sequência VH1 apresentada na SEQ ID NO: 6 e a sequência VL2 apresentada na SEQ ID NO: 11), IgG1-huCD3- H1L3 (CD3 humanizado compreendendo a sequência VH1 apresentada na SEQ ID NO: 6 e a sequência VL3 apresentada na SEQ ID NO: 12), IgG1- huCD3-H3L3 (CD3 humanizado compreendendo a sequência VH3 apresentada na SEQ ID NO: 8 e a sequência VL3 apresentada na SEQ ID NO: 12), IgG1-huCD3-H4L1 (CD3 humanizado compreendendo a sequência VH4 apresentada na SEQ ID NO: 9 e a sequência VL1 apresentada na SEQ ID NO: 10), IgG1-huCD3-H3L1 (CD3 humanizado compreendendo a sequência VH3 apresentada na SEQ ID NO: 8 e a sequência VL1 apresentada na SEQ ID NO: 10), IgG1-huCD3-H3L3 (CD3 humanizado compreendendo a sequência VH3 apresentada na SEQ ID NO: 8 e a sequência VL3 apresentada na SEQ ID NO: 12), e IgG1-huCD3-H4L3 (CD3 humanizado compreendendo a sequência VH4 apresentada na SEQ ID NO: 9 e a sequência VL3 apresentada na SEQ ID NO: 12) foram geradas e testadas nos exemplos aqui descritos.

[00400] Em alguns exemplos um anticorpo compreendendo as sequências da região variável das cadeias pesada e leve de huCLB-T3/4 (SEQ ID NOs: 17 e 18, respectivamente) foram usadas como um anticorpo de controle (Labrijn et al., PNAS 2013, 110: 5145-50) e para verificar diferentes combinações da mutação não ativadora na região Fc (ver os Exemplos 8 a 10). O huCBL-T3/4 é uma versão humanizada do anticorpo CD3 de murino CLB-T3/4 (Parren et al., Res Immunol. 1991, 142(9): 749-63). Ambas as sequências (SEQ ID NOs: 17 e 18) foram clonadas nos vetores de expressão pcDNA3.3 (Invitrogen) relevantes e expressadas pela cotransfecção em células HEK293F. O anticorpo de controle resultante é descrito como IgG1- huCLB-T3/4.

[00401] Em alguns exemplos um anticorpo compreendendo as sequências da região variável das cadeias pesada e leve do anticorpo CD20 7D8 (SEQ ID NO: 29 correspondente à sequência VH e a SEQ ID NO: 30 correspondente à sequência VL) foi usada como um controle positivo. Quando usado no contexto de um controle positivo o mesmo é denominado “IgG1-CD20”.

[00402] Estes IgG1-CD3 (isto é o anticorpo CD3 quimérico, precursor), anticorpos IgG1-huCD3 e IgG1-huCLB-T3/4 foram usados no formato monoespecífico e biespecífico, onde os anticorpos biespecíficos foram gerados como descrito abaixo.

Anticorpo HER2

[00403] Em alguns dos exemplos um anticorpo contra HER2 foi usado. As sequências VH e VL para este anticorpo específico de HER2 (anticorpo 169, SEQ ID NOs: 19 e 20, respectivamente) foram descritos antes (WO2012/143524 [Genmab]; Labrijn et al., PNAS 2013, 110: 5145-50). O anticorpo foi usado tanto no formato monoespecífico quanto no biespecífico, e é denominado “IgG1-HER2”.

Anticorpo b12

[00404] Em alguns dos exemplos o anticorpo b12, um anticorpo específico de gp120 (Barbas, CF. J Mol Biol. 5 de abril de 1993; 230(3): 81223.) foi usado como um controle negativo, e é denominado “IgG1-b12”.

Expressão

[00405] Ao anticorpos foram expressos como IgG1,K ou IgG1,X com ou sem as mutações não ativadoras descritas abaixo e com uma mutação no domínio CH3 que possibilita a geração de anticorpos biespecíficos pelo método descrito abaixo: IgG1-HER2-K409R, IgG1-b12-K409R, IgG1-CD3- F405L. As misturas de DNA plasmídico que codificam ambas as cadeias pesada e leve de anticorpos foram transitoriamente transfectadas para células HEK293F Freestile (Invitrogen, US) usando 293fectin (Invitrogen, US) essencialmente como descrito pelo fabricante.

Purificação de anticorpos

[00406] O sobrenadante de cultura foi filtrado em filtros tipo dead-end de 0,2 µm, carregados em colunas MabSelect SuRe de 5 ml (GE Health Care) e eluído com citrato de sódio a 0,1 M em NaOH, pH 3. O eluído foi imediatamente neutralizado com Tris a 2 M em HCl, pH 9 e dialisado durante a noite a 12,6 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCl, pH 7,4 (B. Braun). Alternativamente, subsequente à purificação, o eluído foi carregado em uma coluna de Dessalinização HiPrep e o anticorpo foi trocado em tampão de 12,6 mM de NaH2PO4, 140 mM de NaCl, pH 7,4 (B. Braun). Depois da diálise ou troca de tampão, as amostras foram filtradas estéreis em filtros do tipo dead-end de 0,2 µm. A pureza foi determinada pela SDS-PAGE e a concentração foi medida pela absorbância a 280 nm. Os anticorpos purificados foram armazenados de 2 a 8°C. Geração de anticorpos biespecíficos

[00407] Anticorpos biespecíficos foram gerados in vitro usando a tecnologia da plataforma DuoBody®, isto é troca de ramo Fab induzida por 2- MEA como descrito na WO 2011/147986 e Labrijn et al. (Labrijn et al., PNAS 2013, 110: 5145-50; Gramer et al., MAbs 2013, 5: 962-973). Para possibilitar a produção de anticorpos biespecíficos por este método, as moléculas de IgG1 que carregam uma mutação única no domínio CH3 foram geradas: em um anticorpo IgG1 precursor a mutação F405L (isto é o anticorpo IgG1-CD3), no outro anticorpo IgG1 precursor a mutação K409R (isto é os anticorpos HER2 ou b12). Para gerar anticorpos biespecíficos, estes dois anticorpos precursores, cada anticorpo em uma concentração final de 0,5 mg/ml, foram incubados com 25 ou 75 mM de 2-mercaptoetilamina-HCl (2- MEA) em um volume total de 500 µL de TE a 31°C por 5 horas. A reação de redução foi interrompida quando o agente redutor 2-MEA foi removido pelo uso de colunas PD-10 (GE-healthcare, produto #17-0851-01), equilibrado com 25 ml de PBS. Antes da dessalinização, 2 ml de PBS (B. Braun, produto #3623140) foram adicionados às amostras para ajustar o volume para 2,5 ml. A elução foi feita em 3,5 ml de PBS. As amostras foram coletadas em unidades centrífugas Amicon Ultra (30 kD de MWCO, Millipore, produto #UFC803096) e concentradas centrifugando-se 8 min a 3000x g. Os volumes foram ajustados a 500 µL (quando necessário) com PBS e as amostras foram filtradas estéril em um filtro de 0,2 µm (Millex-GV, produto #SLGV004SL). Os produtos biespecíficos foram armazenados de 2 a 8°C.

[00408] Em um modo alternativo, produzir o mesmo anticorpo biespecífico, para gerar anticorpos biespecíficos 100 µg dos dois anticorpos precursores foram misturados e incubados com 75 mM de 2- mercaptoetilamina-HCl (2-MEA) em um volume total de 400 µL de PBS (B. Braun, produto #3623140) a 31°C por 5 horas. A reação de redução foi interrompida quando o agente redutor 2-MEA foi removido pelo uso de unidades centrífugas Amicon Ultra 0,5 ml (10 kD de MWCO, Millipore, produto #UFC501096) e lavando 4x com 400 µl de PBS centrifugando-se 10 min a 13000x g. As amostras foram coletadas em um novo tubo invertendo-se o filtro e centrifugando-se 2 min a 1000 g. Os volumes foram ajustados a 200 µL (quando necessário) com PBS. A absorbância de 280 nm (A280) de produtos biespecíficos foi medida para determinar a concentração final. A HPLC cromatografia de troca catiônica (HPLC-CEX) (como descrito na WO 2013/060867) foi realizada para determinar a quantidade de produto biespecífico. As amostras foram armazenadas de 2 a 8°C.

[00409] Os anticorpos biespecíficos gerados são descritos como “cadeia principal de IgG1 K409R” e “cadeia principal de IgG1 F405L” nos seguintes.

Mutações não ativadoras

[00410] Diversas variantes de anticorpo foram geradas com uma ou mais substituições de aminoácido na região Fc. Uma região Fc não ativadora impede o anticorpo de interagir com receptores Fc presentes nas células sanguíneas, tais como monócitos, ou com C1q para ativar o caminho de complemento clássico. A redução da atividade Fc foi testada em variantes de anticorpo que continham diferentes combinações de substituições de aminoácido na região Fc. No máximo cinco substituições de aminoácido foram introduzidas, que incluem as mutações N297Q, L234A, L235A, L234F, L235E, D265A, e P331S. As substituições em uma ou mais destas cinco posições de aminoácido foram introduzidas nas cadeias principais de IgG1 K409R e/ou F405L. As seguintes variantes da região Fc do anticorpo huCLB- T3/4 foram gerados: N297Q (se refere à substituição N297Q, denominada IgG1-huCLB-T3/4-N297Q), LFLE (se refere às substituições L234F/L235E, denominadas IgG1-huCLB-T3/4-LFLE), LALA (se refere às substituições L234A/L235A, denominadas IgG1-huCLB-T3/4-LALA), LFLENQ (se refere às substituições L234F/L235E/N297Q, denominada IgG1-huCLB-T3/4- LFLENQ), LFLEDA (se refere às substituições L234F/L235E/D265A, denominadas IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA), DA (se refere à substituição D265A, denominada IgG1-huCLB-T3/4-DA), DAPS (se refere às substituições D265A/P331S, denominadas IgG1-huCLB-T3/4-DAPS), DANQ (se refere às substituições D265A/N297Q, denominadas IgG1- huCLB-T3/4-DANQ), LFLEPS (se refere às substituições L234F/L235E/P331S, denominadas IgG1-huCLB-T3/4-LFLEPS), e LFLEDANQPS (se refere às substituições L234F/L235E/D265A/N297Q/ P331S, denominadas IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDANQPS).

[00411] Em particular, nas variantes de anticorpo IgG1-huCD3 uma combinação de três substituições de aminoácido, que incluem as mutações L234F, L235E e D265A e é aludido como LFLEDA, foram introduzidos nas cadeias principais de IgG1 K409R e F405L para gerar anticorpos com uma região Fc não ativadora. A variante de anticorpo não ativadora resultante é denominada com o sufixo “-LFLEDA”.

Exemplo 2 - A ligação de anticorpos humanizados CD3 e suas variantes não ativadoras às linhagens de célula T de ser humano e cinomolgo que expressam CD3

[00412] A ligação de variantes purificadas de anticorpos CD3 humanizados (huCD3) e moléculas (bs)IgG1-huCD3 x HER2 biespecíficas com ou sem mutações LFLEDA na região Fc (ver o Exemplo 1) à linhagem de célula T humana Jurkat (Clone E6-1, ATCC® TIB-152®, LGC Standards GmbH, Wesel, Alemanha) ou à linhagem de célula T de cinomolgo HSC-F (cat. no. JCRB1164; Health Science Research Resources Bank, Osaka, Japão) foi analisada pela análise FACS. Além das mutações não ativadoras, LFLEDA, as variantes de anticorpo contiveram as mutações F405L ou K409R como descrito no Exemplo 1.

[00413] As células (1 x 105 células/reservatório) foram incubadas em placas de fundo redondo de 96 reservatórios de poliestireno (Greiner bio-one 650101) com diluições em série de preparações de anticorpo (faixa de 5 a 10.000 ng/ml em diluições de 3 vezes) em 100 µL de PBS/0,1% de BSA/0,02% de azida a 4°C por 30 min.

[00414] Depois de lavar duas vezes em PBS/0,1% de BSA/0,02% de azida, as células foram incubadas em 100 µL com anticorpo secundário a 4°C por 30 min. Como um anticorpo secundário, IgG F(ab’)2 anti-ser humano de cabra conjugado a R-Ficoeritrina (PE) (109-116-098, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) diluído 1/100 em PBS/0,1% de BSA/0,02% de azida, foi usado para todos os experimentos. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes em PBS/0,1% de BSA/0,02% de azida, recolocadas em suspensão em 150 µL de PBS/0,1% de BSA/0,02% de azida e analisada em um FACS Cantoll (BD Biosciences). As curvas de ligação foram analisadas usando a regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) usando o software GraphPad Prism V5.04 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

[00415] A Figura 1A mostra que a ligação das células Jurkat das variantes IgGU-huCD3 IgG1-huCD3-H1L1 (SEQ ID NOs: 6 e 10, respectivamente),IgG1-huCD3-H1L2(SEQIDNOs:6 e11, respectivamente),IgG1-huCD3-H1L3(SEQIDNOs:6 e12, respectivamente),IgG1-huCD3-H3L3(SEQIDNOs:8 e12, respectivamente), e IgG1-huCD3-H4L1 (SEQ ID NOs: 9 e 10, respectivamente) com região Fc do tipo selvagem foi observado para todas as variantes, e que a capacidade de ligação de IgG1-CD3-LFLEDA (anticorpo CD3 precursor como descrito no Exemplo 1 com mutações LFLEDA não ativadoras) e IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA com mutações LFLEDA não ativadoras foram similares às variantes huCD3 com regiões Fc do tipo selvagem. A ligação de IgG1-huCLB-T3/4, incluída como controle positivo, foi forte para as células Jurkat em comparação com as variantes IgG1-huCD3. Nenhuma ligação foi observada para o anticorpo de controle negativo IgG1- b12.

[00416] A Figura 6A mostra que a ligação das células Jurkat do IgG1- CD3-LFLEDA (anticorpo CD3 precursor como descrito no Exemplo 1 com mutações LFLEDA não ativadoras), IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA, IgG1- huCD3-H3L3-LFLEDA, IgG1-3huCD3-H1L1-LFLEDA, IgG1-huCD3- H1L3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H4L1-LFLEDA, e IgG1-huCD3-H4L3- LFLEDA com as mutações LFLEDA não ativadoras foram similares à capacidade de ligação às variantes huCD3 com regiões Fc do tipo selvagem. A ligação de IgG1-huCLB-T3/4, incluídas como controle positivo, foi mais forte para as células Jurkat em comparação com as variantes IgG1-huCD3 em concentrações de anticorpo baixas mas similares às concentrações de anticorpo mais altas. Geralmente, as variantes CD3 humanizadas mantiveram a capacidade de ligação para CD3 como o anticorpo IgG1-CD3. Nenhuma ligação foi observada para o anticorpo de controle negativo IgG1-b12.

[00417] A Figura 1B mostra que as variantes de anticorpo biespecífico bsIgG1 CD3 x HER2, bsIgG1 CD3 x b12-LFLEDA, e bsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA também se ligam às células Jurkat. Os valores de ligação máxima para estes anticorpos biespecíficos são mais altos do que os valores de ligação máxima dos anticorpos monoespecíficos. As concentrações EC50 dos anticorpos biespecíficos foram 6 a 10 vezes mais altas. Mais uma vez, nenhuma ligação foi observada para o anticorpo de controle negativo IgG1- b12.

[00418]A Figura 6B mostra que as variantes de anticorpo Fc biespecíficas não ativadoras bsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2- LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA, e bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA também se ligam às células Jurkat. Os valores de ligação máxima para estes anticorpos biespecíficos são mais altos do que os valores de ligação máxima dos anticorpos monoespecíficos. As concentrações EC50 dos anticorpos biespecíficos foram 4 a 10 vezes mais altas. A ligação monovalente permite que mais anticorpos acumulem na superfície da célula, assim, os valores de ligação mais altos para os anticorpos biespecíficos. Mais uma vez, nenhuma ligação foi observada para o anticorpo de controle negativo IgG1-b12.

[00419] As Figuras 2A mostram que a ligação das variantes IgG1- huCD3 IgG1-huCD3-H1L1, IgG1-huCD3-H1L2, IgG1-huCD3-H1L3, IgG1- huCD3-H3L3, e IgG1-huCD3-H4L1 com a região Fc do tipo selvagem e IgG1-CD3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA à linhagem de célula T de cinomolgo HSC-F foi similar. Nenhuma ligação foi observada para o anticorpo de controle huCLB-T3/4, que não reage cruzado com o CD3 de cinomolgo, e o anticorpo de controle negativo IgG1-b12.

[00420] A Figura 7A mostra que a ligação das variantes de IgG1- huCD3 IgG1-CD3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA, IgG1-huCD3- H3L3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H1L1-LFLEDA, IgG1-huCD3-H1L3- LFLEDA, IgG1-huCD3-H4L1-LFLEDA, e IgG1-huCD3-H4L3-LFLEDA à linhagem de célula T de cinomolgo HSC-F foi similar. Nenhuma ligação foi observada para o anticorpo de controle negativo IgG1-b12.

[00421] As Figuras 2B mostram que as variantes de anticorpo biespecífico bsIgG1 CD3 x HER2 e bsIgG1 huCD3-H3L1-LFLEDA também se ligam às células HSC-F. Os valores de ligação máxima para estes anticorpos biespecíficos são mais altos do que os valores de ligação máxima das variantes anti-CD3 monoespecíficas. As concentrações EC50 dos anticorpos biespecíficos foram 10 a 12 vezes mais altas do que aquela dos anticorpos anti-CD3 monoespecíficos. Mais uma vez, nenhuma ligação foi observada para o anticorpo de controle negativo IgG1-b12.

[00422] A Figura 7B mostra que as variantes de anticorpos Fc biespecíficos não ativadoras bsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2- LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA, e bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA também se ligam às células HSC-F. Os valores de ligação máxima para estes anticorpos biespecíficos são mais altos do que os valores de ligação máxima das variantes anti-CD3 monoespecíficas. As concentrações EC50 dos anticorpos biespecíficos foram 3 a 6 vezes mais altas do que aquela dos anticorpos CD3 anti-hu monoespecíficos. Mais uma vez, nenhuma ligação foi observada para o anticorpo de controle negativo IgG1-b12. Exemplo 3 - Ativação de célula T pelas variantes de anticorpo CD3 humanizadas

[00423] A expressão de CD69 é um marcador inicial da ativação de célula T. Os anticorpos CD3 podem mediar a reticulação de células T e células imunes através da ligação de CD3 expressado pelas células T e receptores Fc expressados pelas células imunes pela região Fc do anticorpo, tal como a região Fc de IgG1. Isto levaria à ativação de célula T e à indução de CD69. Variantes de anticorpo contendo uma região Fc não ativadoras (mutações LFLEDA) não ligam o receptor Fcs. Portanto, foi previsto que anticorpos CD3 não ativadores não induzissem a ativação de célula T e a expressão de CD69 visto que a região Fc não ativadoras não se liga ao receptor Fc que expressa células imunes e assim não podem reticular células T e células imunes.

[00424] A expressão de CD69 nas células T foi avaliada pela análise FACS para determinar a ativação inicial de células T depois da incubação com variantes CD3 humanizadas (huCD3) com e sem as mutações LFLEDA na região Fc. Além das mutações não ativadoras, as variantes LFLEDA contêm as mutações F405L ou K409R como descrito no Exemplo 1.

[00425] As PBMCs foram isoladas de sangue integral ou camada plaquetária pela separação de gradiente de densidade usando tubos Leucosep (#227290; Greiner Bio-one, Alphen a/d Rijn, Países Baixos), lavadas com PBS e recolocadas em suspensão em meio de cultura.

[00426] Uma série de dose-resposta de variantes de anticorpo huCD3, um controle negativo (IgG1-b12) e controles positivos (IgE-huCD3 e IgG1- CD3 precursor) foram preparados em meio de cultura (variando de 0,1 a 1.000 ng/ml em diluições de 10 vezes) e adicionados aos reservatórios de uma placa de fundo redondo de 96 reservatórios contendo PBMCs humanas ou de cinomolgo. Depois de 16 a 24 horas de incubação, as células foram granuladas pela centrifugação e o sobrenadante (contendo citocinas) foi coletado e armazenado a -20°C. As células foram depois lavadas com PBS/0,1% de BSA/0,02% de azida e tingidas por 30 minutos a 4°C com um CD28-PE anti-ser humano de camundongo (854,222,010; Sanquin, Amsterdam, Países Baixos; marcador de célula T) e anticorpo CD69-APC anti-ser humano de camundongo (340560; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), que reagem cruzado com CD28 e CD69 de cinomolgo, respectivamente. Os anticorpos não ligados foram removidos lavando-se duas vezes com PBS/0,1% de BSA/0,02% de azida. As células foram recolocadas em suspensão em 150 µL/reservat0rio e a expressão de CD69 nas células positivas em CD28 foi medida em FACS Canto II (BD Biosciences).

[00427] A Figura 3 mostra que IgG1-CD3 (como descrito no Exemplo 1) e as variantes IgG1-huCD3 humanizadas com a região Fc de IgG1 do tipo selvagem induziu níveis similares de expressão de CD69 nas células T da origem de ser humano (Figura 3A) e de cinomolgo (Figura 3B). As variantes não ativadoras (LFLEDA) IgG1-CD3-LFLEDA e IgG1-huCD3-H3L1 induziram níveis baixos de expressão de CD69 em células T humanas. Nenhuma expressão de CD69 foi induzida pelas variantes IgG1-huCD3 não ativadoras nas células T de cinomolgo. O anticorpo de controle IgG1-b12 também não induziu a expressão de CD69 em células T humanas ou de cinomolgo.

[00428] A Figura 8 mostra que as variantes não ativadoras (LFLEDA) IgG1-huCD3-H3L1-LFLEDA, IgG1-huCD3-H3L3-LFLEDA, IgG1-3huCD3- H1L1-LFLEDA, IgG1-huCD3-H1L3-LFLEDA, IgG1-huCD3-H4L1- LFLEDA, e IgG1-huCD3-H4L3-LFLEDA induziram níveis baixos de expressão de CD69 em células T humanas. As Figuras 8A e 8B mostram a indução da expressão de CD69 nas células T de macaco cinomolgo. A ativação menor pelas variantes não ativadoras observada pode ser devido à reticulação de moléculas de CD3 através da ligação bivalente de anticorpos CD3. Tal explicação é sustentada pela observação de que a ativação é reduzida na concentração mais alta onde a ligação de anticorpo é monovalente. O anticorpo de controle IgG1-b12 também não induziu a expressão de CD69 em células T humanas ou de cinomolgo.

[00429] As Figuras 8C e 8D mostram que as variantes de anticorpo biespecífico não ativadoras bsIgG1-huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2- LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA, e bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA não induzem a expressão de CD69 em células T de seres humanos (Figura 8C) ou de macacos cinomolgos (Figura 8D). Entretanto, nas concentrações de anticorpo maiores alguma indução da expressão de CD69 foi observada.

Exemplo 4 - Proliferação de célula T induzida pelas variantes de anticorpo CD3 humanizadas.

[00430] O efeito de variantes de anticorpo CD3 humanizado (huCD3) (descritas no Exemplo 1) sobre a proliferação de células T de ser humano e de cinomolgo foi avaliado pelo kit ELISA de proliferação de célula da Roche Applied Science (ELISA de proliferação de célula, kit BrdU, #11647229001; Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha), que foi realizado de acordo com as instruções do fabricante.

[00431] PBMCs humanas ou de cinomolgo, isoladas de sangue integral ou camada plaquetária, foram incubadas em placas de cultura de 96 reservatórios com série de diluição (variando de 0,1 a 1.000 ng/ml em diluições de 10 vezes) de variantes de anticorpo IgG1 huCD3. IgE-CD3 e IgG1-huCLB-T3/4 foram incluídas como controles positivos e IgG1-b12 como controle negativo. Depois de 3 dias de incubação com os anticorpos, BrdU (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) foi adicionado ao meio e as placas foram incubadas por 5 horas. As células foram depois pelotizadas pela centrifugação e o sobrenadante coletado e armazenado a - 20°C. As placas foram secadas e armazenadas a 4°C até que o ELISA fosse realizado.

[00432] A incorporação de BrdU no DNA foi determinada pelo ELISA de acordo com as instruções do fabricante (Roche Applied Science). As células foram fixadas às placas, onde depois as placas foram incubadas por 90 minutos na temperatura ambiente com um anticorpo anti-BrdU conjugado com peroxidase. As placas foram lavadas com PBST e a ligação foi detectada usando tampão ABTS (ao invés da solução de TMB fornecida com o kit). O desenvolvimento de cor foi interrompido depois de 30 min adicionando-se 2% de ácido oxálico aos reservatórios. A OD405 nm foi depois medida em uma leitora de ELISA EL808.

[00433] A Figura 4 mostra que a incubação de PBMCs com as variantes IgG1-CD3 precursoras e IgG1-huCD3 humanizadas com a região Fc de IgG1 do tipo selvagem induziram a proliferação forte de células T de ser humano (Figura 4A) e de cinomolgo (Figura 4B), mesmo em concentrações muito baixas de anticorpo. A incubação com variantes LFLEDA não ativadoras dos anticorpos CD3 de IgG1 humana não induziram a proliferação de células T humanas (Figuras 4A e 9A) ou células T de cinomolgo (Figuras 4B e 9B). Assim, embora as variantes não ativadoras dos anticorpos CD3 de IgG1 humana induziram níveis baixos de expressão de CD69 em células T humanas (como mostrado no Exemplo 3), nenhuma proliferação de células T humanas foi induzida por estas variantes IgG1-huCD3 não ativadoras.

[00434] As Figuras 9C e 9D mostram que as variantes de anticorpo biespecífico não ativadoras bsIgG1-huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2- LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA, e bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA não induzem a proliferação de células T isoladas de seres humanos (Figura 9C) ou de macacos cinomolgos (Figura 9D).

Exemplo 5 - Citotoxicidade in vitro mediada pela célula T induzida pelas variantes de anticorpo CD3 humanizado

[00435] A citotoxicidade de célula T específica de tumor pode ser mediada pelos anticorpos biespecíficos que se ligam com um ramo ao CD3 e o outro ramo a um alvo específico de tumor, tal como HER2. A ligação simultânea de anticorpos biespecíficos tanto para as células T quanto para as células de tumor levarão à ativação de célula T e citotoxicidade de célula específica de tumor. Neste Exemplo, a citotoxicidade mediada pela célula T contra células de tumor positivas em HER2 foi avaliada usando anticorpos biespecíficos contra CD3 (variantes humanizadas) e HER2.

[00436] Portanto, as células AU565 (carcinoma mamário humano) foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% (vol/vol) de CCS inativado por calor, 1,5 g/L de bicarbonato de sódio (Lonza), 1 mM de piruvato de sódio, 4,5 g/L de glicose (Sigma), 50 IU/ml de penicilina, e 50 µg/ml de estreptomicina. A linhagem de célula foi mantida a 37°C em uma incubadora com 5% (vol/vol) de CO2 umidificada. As células AU565 foram cultivadas até quase a confluência, depois que as células foram tripsinizadas, recolocadas em suspensão em meio de cultura e passadas através de uma peneira de célula para se obter uma suspensão de célula única. 5 x 104 células foram semeadas em cada reservatório de uma placa de cultura de 96 reservatórios, e as células foram incubadas pelo menos 3 horas a 37°C, 5% de CO2 para permitir a aderência à placa.

[00437] As PBMCs de ser humano ou de cinomolgo foram isoladas de sangue integral ou camada plaquetária. As PBMCs isoladas foram lavadas com PBS, recolocadas em suspensão em meio de cultura e adicionadas em uma razão 1:1 às células de tumor AU565 na placa de 96 reservatórios. A porcentagem de células T presentes nas PBMCs foi medida pela análise FACS, usando um anticorpo anti-CD3 humano-PerCP de camundongo (BD, #345766) (para tingir as células T), isto é reagir cruzado com CD3 de cinomolgo. O teor de célula T na população de PBMCs usado foi tipicamente de 50 a 60%.

[00438] A série de diluição (concentrações finais variando de 0,001 até 10.000 ng/ml) de variantes de anticorpo biespecífico bsIgG1 CD3 x HER2- LFLEDA, bsIgG1 CD3 x b12-LFLEDA, bsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2- LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3- H4L1 x HER2-LFLEDA, e bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA foram preparadas em meio de cultura e adicionadas às placas. IgG1-HER2-LFLEDA e IgG1-b12 foram incluídas como controles. Além das mutações não ativadoras, as variantes de anticorpo LFLEDA contêm mutações F405L ou K409R para a preparação em formato biespecífico (ver o Exemplo 1). As placas foram incubadas por 3 dias a 37°C, 5% de CO2. A incubação de células com 1 µM de estaurosporina (#S6942-200, Sigma) foi usada como referência para 100% de morte de célula de tumor. As placas foram lavadas duas vezes com PBS, e 150 µL de meio de cultura contendo 10% de Azul de Alamar foram adicionados a cada reservatório. As placas foram incubadas por 4 horas a 37°C, 5% de CO2. A absorbância a 590 nm foi medida (Envision, Perkin Elmer, Waltham, MA).

[00439] As variantes de anticorpo biespecífico CD3xHER2-LFLEDA (bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2-LFLEDA e bsIgG1-CD3xHER2-LFLEDA) induziram o extermínio de células AU565 em concentrações baixas usando células efetoras humanas (Figura 5A) ou células efetoras de cinomolgo (Figura 5B). O anticorpo CD3 biespecífico de controle huCLB-T3/4xHER2- LFLEDA, que não mostra nenhuma reatividade cruzada com CD3 de cinomolgo, apenas induziu o extermínio de células AU565 quando as PBMCs humanas foram usadas (Figura 5A). Assim, nenhum extermínio das células alvo foi observado quando células efetoras de cinomolgo foram usadas no ensaio (Figura 5B). A incubação com anticorpos monoespecíficos IGG1-b12 ou IgG1-HER2-LFLEDA ou bsIgG1-CD3xb12-LFLEDA não induziram extermínio não específico de células alvo.

[00440] As variantes de anticorpo biespecífico bsIgG1 huCD3-H3L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H3L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3- H1L1 x HER2-LFLEDA, bsIgG1-huCD3-H1L3 x HER2-LFLEDA, bsIgG1- huCD3-H4L1 x HER2-LFLEDA, e bsIgG1-huCD3-H4L3 x HER2-LFLEDA induziram o extermínio de células AU565 em concentrações baixas usando células efetoras humanas (Figura 10A) ou células efetoras de cinomolgo (Figura 10B). A incubação com anticorpos monoespecíficos IgG1-b12 ou IgG1-HER2-LFLEDA não induziu o extermínio de célula alvo não específico (Figura 10A e B). Assim, as variantes CD3 humanizadas compreendendo a região Fc não ativadora não induziram o extermínio de célula alvo não específica, o que indica que as variantes compreendendo uma região Fc não ativadora pode ser usada para garantir a ativação alvejada de célula T e assim evitar a ativação não alvejada de célula T.

Exemplo 6 -Ativação de célula T de rhesus pelas variantes de anticorpo CD3 humanizado

[00441] A expressão de CD69 nas células T de rhesus foi avaliada para determinar a ativação inicial de células T depois da incubação com variantes de anticorpo CD3 humanizado (huCD3) com região Fc de IgG1 do tipo selvagem. A isolação de PBMCs de rhesus e a avaliação da expressão de CD69 pela citometria de fluxo foi realizada como descrito no Exemplo 3.

[00442] A Figura 11 mostra que as variantes de anticorpo CD3 humanizado IgG1-huCD3-H1L1, IgG1-huCD3-H1L2, IgG1-huCD3-H1L3, IgG1-huCD3-H3L3, e IgG1-huCD3-H4L1 induziram a expressão de CD69 nas células T de origem rhesus aos níveis similares como IgG1-CD3 (como descrito no Exemplo 1). O anticorpo de controle negativo IgG1-b12 não induziu a expressão de CD69 em células T de rhesus. Assim, as variantes huCD3 de acordo com a presente invenção podem ser usadas em experimentos envolvendo CD3 de macaco rhesus. As variantes huCD3 reagem cruzado com CD3 de macaco rhesus.

Exemplo 7 - Ativação de célula T pelas variantes não ativadoras de huCLB-T3/4

[00443] A expressão de CD69 nas células T foi avaliada pela análise de FACS para determinar a ativação inicial de células T depois da incubação com variantes IgG1-huCLB-T3/4 com mutações na região Fc (ver o Exemplo 1).

[00444] As PBMCs foram isoladas de sangue integral ou camada plaquetária pela separação de gradiente de densidade usando tubos Leucosep (#227290; Greiner Bio-one, Alphen a/d Rijn, Países Baixos), lavadas com PBS e recolocadas em suspensão em meio de cultura.

[00445] Uma série de resposta de dose de variantes IgG1-huCLB-T3/4, um controle negativo (IgG1-huCLB-T3/4-Fab) e controle positivo (IgE- huCLB-T3/4) foi preparada em meio de cultura (variando de 1 a 1000 ng/ml em diluições de 3 vezes) e adicionada aos reservatórios de uma placa de fundo redondo de 96 reservatórios contendo as PBMCs. Depois de 16 a 24 horas de incubação, as células foram granuladas pela centrifugação e o sobrenadante (contendo citocinas) coletadas e armazenadas a -20°C. As células foram depois lavadas com PBS/0,1% de BSA/0,02% de azida e tingidas por 30 minutos a 4°C com um CD28-PE anti-ser humano de camundongo (854,222,010; Sanquin, Amsterdam, Países Baixos; marcador de célula T) e anticorpo CD69-APC anti-ser humano de camundongo (340560; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Os anticorpos não ligados foram removidos lavando-se duas vezes com PBS/0,1% de BSA/0,02% de azida. As células foram recolocadas em suspensão em 150 µL/reservat0rio e a expressão de CD69 nas células positivas em CD28 foi medida no FACS Canto II (BD Biosciences).

[00446] A Figura 12A mostra que a expressão de CD69 foi alta nas células que foram incubadas com IgE-huCLB-T3/4, IgG1-huCLB-T3/4, IgG1-huCLB-T3/4-DA e IgG1-huCLB-T3/4-DAPS. A incubação com IgG1- huCLB-T3/4-N297Q induziu níveis de expressão um pouco mais baixos de CD69 comparados com os de IgG1-huCLB-T3/4 do tipo selvagem, e a incubação com IgG1-huCLB-T3/4-LFLE e IgG1-huCLB-T3/4-LFLEPS induziram CD69 a um grau menor. A incubação de PBMCs com anticorpos IgG1-CD3 Fab, IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA, IgG1-huCLB-T3/4-LFLENQ, IgG1-huCLB-T3/4-DANQ e IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDANQPS não induziram nenhuma expressão de CD69 nas células T.

[00447] A Figura 12B mostra que a expressão de CD69 foi alta nas células que foram incubadas com IgE-huCLB-T3/4 e IgG1-huCLB-T3/4. A incubação com IgG1-huCLB-T3/4-LALA induziu níveis de expressão um pouco mais baixos de CD69 comparado com os de IgG1-huCLB-T3/4 do tipo selvagem, e a incubação com IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA e IgG1-b12 (controle negativo) não induziu nenhuma expressão de CD69 nas células T.

Exemplo 8 - Proliferação de célula T pelas variantes não ativadoras de huCLB-T3/4

[00448] O efeito de variantes huCLB-T3/4 (descritas no Exemplo 1) sobre a proliferação de células T foi avaliada pelo kit ELISA de proliferação de célula da Roche Applied Science (ELISA de proliferação de célula, kit BrdU, #11647229001; Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha), que foi realizado de acordo com as instruções do fabricante.

[00449] As PBMCs, isoladas de sangue integral ou camada plaquetária, foram incubadas em placas de cultura 96 reservatórios com série de diluição (variando de 0,1 a 1000 ng/ml) de variantes IgG1-CD3. IgE-CD3 e IgG1-CD3 foram incluídos como controles positivos e IgG1-b12 (com mutação K409R para a geração de anticorpos biespecíficos) como um controle negativo. Depois de 3 dias de incubação com os anticorpos, BrdU (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) foi adicionado ao meio e as placas foram incubadas por 5 horas. As células foram depois granuladas pela centrifugação e o sobrenadante coletado e armazenado a -20°C. As placas foram secadas e armazenadas a 4°C até que o ELISA fosse realizado.

[00450] A incorporação de BrdU no DNA foi determinada pelo ELISA de acordo com as instruções do fabricante (ELISA de proliferação de célula, kit BrdU, #11647229001; Roche Applied Science). As células foram fixadas às placas, onde depois as placas foram incubadas por 90 minutos na temperatura ambiente (RT) com um anticorpo anti-BrdU conjugado com peroxidase. As placas foram lavadas com PBST e a ligação foi detectada usando tampão ABTS (ao invés da solução de TMB fornecida com o kit). O desenvolvimento de cor foi interrompido depois de 30 min pela adição de 2% de ácido oxálico aos reservatórios. A OD405 nm foi depois medida em uma leitora ELISA EL808.

[00451] A Figura 13A mostra que a incubação de PBMCs com IgG1- huCLB-T3/4, IgG1-huCLB-T3/4-DA e IgG1- huCLB-T3/4-DAPS induziram proliferação forte de células T, mesmo em concentrações muito baixas de anticorpo. A incubação com IgG1-huCLB-T3/4-N297Q induziu a proliferação dependente da dose, que foi comparável ao controle positivo IgE-huCLB- T3/4. A incubação de PBMCs com anticorpos IgG1-huCLB-T3/4-Fab, IgG1- b12-N297Q, IgG1-huCLB-T3/4-LFLE, IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDA, IgG1- huCLB-T3/4-LFLENQ, IgG1-huCLB-T3/4-LFLEPS, IgG1-huCLB-T3/4- DANQ e IgG1-huCLB-T3/4-LFLEDANQPS não induziu a proliferação de células T.

[00452] A Figura 13B mostra que a incubação de PBMCs com IgG1- huCLB-T3/4 induziu proliferação forte de células T, mesmo em concentrações muito baixas de anticorpo. A incubação com IgE-huCLB-T3/4 (controle positivo) e IgG1-huCLB-T3/4-LALA induziu a proliferação dependente da dose. A incubação de PBMCs com IgG1-huCLB-T3/4- LFLEDA não induziu a proliferação de células T.

[00453] Com base nos resultados dos Exemplos 7 e 8, um subconjunto de mutantes que foram considerados menos ativadores, foi submetido à análise adicional.

Exemplo 9 - Citotoxicidade in vitro mediada pela célula T induzida pelas variantes de anticorpo não ativadoras huCLB-T3/4

[00454] Células AU565 (carcinoma mamário humano) foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% (vol/vol) de CCS inativado por calor, 1,5 g/L de bicarbonato de sódio (Lonza), 1 mM piruvato de sódio, 4,5 g/L de glicose (Sigma), 50 IU/ml de penicilina, e 50 µg/ml de estreptomicina. A linhagem de célula foi mantida a 37°C em uma incubadora com 5% (vol/vol) de CO2 umidificada. As células AU565 foram cultivadas até quase a confluência. As células foram tripsinizadas, recolocadas em suspensão em meio de cultura e passada através de uma peneira de célula para se obter uma única suspensão de célula. 5 x 104 células foram semeadas em cada reservatório de uma placa de cultura de 96 reservatórios, e as células foram incubadas pelo menos 3 horas. a 37 °C, 5% de CO2 para permitir a aderência à placa.

[00455] As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas a partir do sangue de voluntários saudáveis usando tubos Leucosep de 30 ml, de acordo com o protocolo do fabricante (Greiner Bio-one). As PBMCs isoladas foram lavadas com PBS, recolocadas em suspensão em meio de cultura e adicionadas em uma razão 1:1 às células de tumor AU565 na placa de 96 reservatórios. A porcentagem de células T presentes nas PBMCs foi medida pela análise de FACS, usando um anticorpo PerCP anti-CD3 humano de camundongo (BD, #345766) (para tingir as células T). O teor de célula T na população de PBMCs usada foi tipicamente de 50 a 60%.

[00456] A série de diluição (concentrações finais variando de 0,004 a 1000 ng/ml) de IgG1-b12, IgG1-huCLB-T3/4, IgG1-HER2, e anticorpos huCLB-T3/4xb12 e huCLB-T3/4xHER2 biespecíficos expressados como variantes Fc diferentes, tipo selvagem, N297Q, LFLE, LALA, LFLENQ, LFLEDA, DANQ, e LFLEDENQPS, foi preparada em meio de cultura e adicionada às placas. As placas foram incubadas por 3 dias a 37 °C, 5% de CO2. A incubação de células com 1 µM de estaurosporina (#S6942-200, Sigma) foi usada como referência para 100% de morte de célula de tumor. Depois da incubação, os sobrenadantes foram removidos e armazenados a - 20°C. As placas foram lavadas duas vezes com PBS, e 150 µL de meio de cultura contendo 10% de Azul de Alamar foi adicionado a cada reservatório. As placas foram incubadas por 4 horas a 37 °C, 5% de CO2. A absorbância a 590 nm foi medida (Envision, Perkin Elmer, Waltham, MA).

[00457] Dois experimentos foram realizados usando PBMCs de doadores diferentes. No primeiro experimento variantes de Fc N297Q, LFLE, LFLENQ, LFLEDA, DANQ, e LFLEDANQPS foram testados (Figura 14A- G). No segundo experimento as variantes de Fc LFLEDA e LALA foram testadas (Figura 15A-C). Anticorpos com domínios Fc do tipo selvagem foram incluídos em ambos os experimentos como referência. A incubação com anticorpos IgG1-huCLB-T3/4 monoespecífico ou huCLB-T3/4xb12 biespecífico do tipo selvagem induziu o extermínio não específico de células alvo (Figuras 14A-G e 15A-C). As variantes de IgG1-huCLB-T3/4 e bsIgG1- huCLB-T3/4xb12 monoespecíficos N297Q (Figura 14A-G) e LALA (Figura 15A-C) ainda induziu algum extermínio de célula alvo não específico, embora a um grau menor do que o anticorpo do tipo selvagem testado no mesmo experimento. O extermínio de célula alvo não específico não foi induzido por qualquer um dos outros anticorpos IgG1-huCLB-T3/4 ou bsIgG1-huCLB- T3/4xb12 testados com mutações não ativadoras (Figuras 14A-G e 15A-C).

[00458] Todos os anticorpos huCLB-T3/4xHER2 biespecíficos induziram o extermínio dependente da dose de células AU565 com pelo menos eficácia comparável comparada com o anticorpo huCLB-T3/4xHER2 biespecífico do tipo selvagem sem mutações não ativadoras (Figuras 14A-G e 15A-C). O extermínio máximo ocorreu em concentrações muito baixas.

[00459] Nenhuma citotoxicidade foi induzida pelo tipo selvagem ou variantes não ativadoras dos anticorpos b12 ou HER2 monoespecíficos (Figuras 14A-G e 15A-C), que foi como esperado.

Exemplo 10 - Avaliação da ligação de C1q às variantes de anticorpo não ativadoras de huCLB-T3/4

[00460] A interação de C1q com anticorpos ligados a uma célula alvo é a primeira etapa no caminho clássico da ativação de complemento. Visto que IgG1 do tipo selvagem abriga o sítio de interação para C1q, a interação de C1q a estas variantes de IgG1 não ativadoras por um ELISA foi avaliado.

[00461] A série de diluição (faixa de 7 a 30.000 ng/ml em diluições de 4 vezes) de IgG1-huCLB-T3/4, bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2 e IgG1-CD20 (controle positivo) e variantes de anticorpo não ativadoras como descrito acima no Exemplo 1 dos mesmos foram revestidos nas placas de ELISA Microlon de 96 reservatórios (Greiner, Alemanha) durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas e bloqueadas com PBS suplementadas com 0,025% de Tween 20 e 0,1% de gelatina. Com lavagens entre as incubações, as placas foram sequencialmente incubadas com 3% de soro humano reunidos (Sanquin, produto# M0008) por 1 h a 37°C, com 100 µL/reservat0rio de C1q anti-ser humano de coelho (DAKO, produto# A0136, 1/4.000) por 1 h na temperatura ambiente, e com 100 µL/reservat0rio de IgG-HRP anti-coelho de suíno (DAKO, P0399, 1:10.000) como anticorpo de detecção por 1 h na temperatura ambiente. A detecção foi realizada pela adição de 1 mg/ml de ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolino-6-sulfônico) (ABTS; Roche, Mannheim, Alemanha) por cerca de 30 min. A reação foi interrompida pela adição de 100 µL de ácido oxálico a 2%. A absorbância foi medida a 405 nm em uma leitora de microplaca (Biotek, Winooski, VT). Os dados transformados em Log foram analisados ajustando-se as curvas de dose- resposta sigmoidais com inclinação variável usando software GraphPad Prism.

[00462] A Figura 16A mostra que os anticorpos com região Fcs de IgG1 do tipo selvagem, IgG1-CD20 e IgG1-huCLB-T3/4 mostrou a ligação de C1q. Nenhuma ligação de C1q foi detectada em todas as variantes de anticorpo avaliadas com mutações não ativadoras (N297Q, LFLE, LFLENQ, LFLEDA, DA, DAPS, DANQ, LFLEPS, LFLEDANQPS, LALA).

[00463] A Figura 16B mostra que o anticorpo com a região Fc de IgG1 do tipo selvagem bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2 mostrou ligação C1q. Nenhuma ligação de C1q foi detectada em todas as variantes de anticorpo avaliadas com mutações não ativadoras (N297Q, LFLE, LFLENQ, LFLEDA, DA, DAPS, DANQ, LFLEPS, LFLEDANQPS, LALA).

[00464] A Figura 16C e Figura 16D mostram que os anticorpos com regiões Fc de IgG1 do tipo selvagem, IgG1-CD20, IgG1-huCLB-T3/4, e bsIgG1-huCLB-T3/4xHER2 mostraram ligação de C1q. Nenhuma ligação de C1q foi detectada nas variantes de anticorpo com mutações não ativadoras (LFLEDA e LALA).

Exemplo 11 - Análise farmacocinética (PK) de variantes de anticorpo não ativadoras

[00465] Os camundongos neste estudo foram alojados em uma unidade de barreira da Instalação Animal de Laboratório Central (Utrecht, Países Baixos) e mantidos em gaiolas com topo de filtro com água e alimento fornecido ad libitum. Todos os experimentos foram aprovados pelo Utrecht University Animal Etics Committee. Camundongos com 7 a 10 semanas de idade C.B-17 SCID (C.B-17/Icr-Prkdc<Scid>/IcrIcoCrl, Charles-River) foram intravenosamente ajustados com 100 µg de anticorpo do tipo selvagem (IgG1- huCLB-T3/4, IgG1-HER2, ou bsIgG-huCLB-T3/4xHER2) ou variantes não ativadoras dos mesmos (LALA, LFLEDA, LFLENQ, DANQ ou LFLEDANQPS) usando 3 camundongos por grupo. 50 µL de amostras de sangue foram coletadas da veia safena em 10 minutos, 4 horas, 1 dia, 2 dias, 7 dias, 14 dias e 21 dias depois da administração do anticorpo. O sangue foi coletado em frascos contendo heparina e centrifugado por 5 minutos a 10.000 x g. O plasma foi armazenado a -20°C até a determinação das concentrações de anticorpo.

[00466] As concentrações de IgG humana foram determinadas usando um ELISA de sanduiche de hIgG total. Para este ensaio, os camundongo mAb anti-ser humano IgG-capa clone MH16 (#M1268, CLB Sanquin, Países Baixos), revestido em placas de ELISA Microlon de 96 reservatórios (Greiner, Alemanha) em uma concentração de 2 µg/ml foram usados como anticorpo de captura. Depois do bloqueio as placas com PBS suplementado com 0,2% de albumina sérica bovina, as amostras foram adicionadas, diluídos em série com tampão de ELISA (PBS suplementado com 0,05% de Tween 20 e 0,2% de albumina sérica bovina), e incubados em um agitador de placa por 1 h na temperatura ambiente (RT). As placas foram subsequentemente incubadas com imunoglobulina IgG anti-ser humano de cabra (#109-035-098, Jackson, West Grace, PA) e desenvolvidos com 2,2’-azino-bis (ácido 3- etilbenztiazolino-6-sulfônico) (ABTS; Roche, Mannheim, Alemanha). A reação foi interrompida depois de 30 min pela adição de ácido oxálico a 2% aos reservatórios. A absorbância foi medida em uma leitora de microplaca (Biotek, Winooski, VT) a 405 nm.

[00467] As taxas de depuração plasmáticas (ml/dia/kg) foram calculadas com base na área sob a curva (AUC), de acordo com a seguinte equação:

[00468] A análise de dados foi realizada usando o software Graphpad prism.

[00469] A Figura 17A mostra que as concentrações de IgG de plasma humano foram mais baixas para as variantes de anticorpo N297Q, DANQ, LFLENQ, e LFLEDANQPS quando comparado com anticorpos do tipo selvagem, sugerindo uma depuração mais rápida. As concentrações de IgG humana no plasma para variantes de anticorpo LFLEDA e LALA foram similares àquelas dos anticorpos do tipo selvagem.

[00470] A Figura 17B mostra que as taxas de depuração plasmática de variantes de anticorpo N297Q, DANQ e LFLENQ foram 2 a 3 vezes mais alta do que aquela do anticorpo do tipo selvagem. A taxa de depuração da variante de anticorpo LFLEDANQPS foi 3 a 5 vezes mais alta do que aquela do anticorpo do tipo selvagem. As taxas de depuração plasmática de variantes de anticorpo LFLEDA e LALA foram similares àquela do anticorpo do tipo selvagem.

Exemplo 12 - Avaliação da imunogenicidade in vitro da cadeia principal de IgG1-LFLEDA

[00471] De modo a determinar o potencial para a imunogenicidade clínica da cadeia principal de IgG1-LFLEDA-K409R, a plataforma EpiScreen® da Antitope foi aplicada ao IgG1-HER2-LFLEDA. Em resumo, as PBMCs foram isoladas de um grupo de 50 doadores saudáveis do tipo HLA representando a população Européia e Norte Americana. Depois da depleção de célula T CD8+ as preparações de PBMC foram individualmente congelado e armazenado. As PBMCs descongeladas foram subsequentemente cultivadas e incubadas com IgG1-HER2-LFLEDA-K409R ou uma das amostras de controle (IgG1-HER2 ou IgG1-HER2-LFLE-K409R) por 5 a 8 dias. A capacidade das amostras para induzir as respostas de células T CD4+ foi avaliada medindo-se a proliferação de célula (incorporação [3H]-Timidina) e produção de IL-2 (ensaio ELISpot). Os doadores que mostraram respostas com um índice de estimulação (SI; sinal/sinal de referência) >1,9 em ambos os ensaios foram considerados positivos.

[00472] A análise EpiScreen® mostrou que para IgG1-HER2- LFLEDA, 4 doadores (8%) mostraram respostas de célula T CD4+ positivas, que foram comparáveis com 4 (8%) e 3 (6%) respostas positivas para IgG1- HER2 e IgG1-HER2-LFLE, respectivamente (Figura 18). Assim, IgG1- HER2-LFLEDA-K409R (assim como IgG1-HER2 e IgG1-HER2-LFLE- K409R) mostraram potencial baixo para imunogenicidade com frequências abaixo de 10%. O controle positivo humanizado A33 (por exemplo [84]) foi usado como anticorpo de controle de ponto de referência clínico que mostra níveis altos de imunogenicidade na clínica e rotineiramente induz 20 a 30% de respostas de célula T no Ensaio EpiScreen. Listas de Referências

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Claims

1.Anticorpo humanizado ou quimérico de ligação ao CD3 humano, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma região de ligação compreendendo a região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), em que as referidas regiões VH e VL são selecionadas do grupo que consiste de: a)uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:6 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:11 ou 12 b)uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:7 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:10, 11 ou 12; c)uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:10, 11 ou 12; d)uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:9 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:10, 11 ou 12.

2.Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as referidas regiões VH e VL são selecionadas do grupo que consiste em; a)uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:10; b)uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:9 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:10; c)uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:6 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:11; d)uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:6 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:12; e)uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:7 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:10; f)uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:7 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:11; g)uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:7 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:12; h)uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:11; i)uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:12; j)uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:9 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:11; e k ) uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:9 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:12.

3.Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a referida região de ligação compreende uma sequência VH e uma sequência VL selecionada do grupo que consiste em; a)uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:8 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:10; e b)uma sequência VH conforme apresentada na SEQ ID NO:9 e uma sequência VL conforme apresentada na SEQ ID NO:10.

4.Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado.

5.Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico.

6.Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de comprimento total.

7.Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma região Fc compreendendo uma primeira e uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina.

8.Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as referidas primeira e segunda cadeias pesadas são de um isotipo selecionado do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

9.Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma região Fc que foi modificada de modo que a ligação de C1q ao referido anticorpo seja reduzida em comparação com um anticorpo de tipo selvagem em pelo menos 70%, pelo menos 80 %, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou 100%, em que a ligação de C1q é determinada por ELISA.

10.Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma região Fc que foi modificada de modo que o referido anticorpo medeie a proliferação reduzida de células T mediada por Fc em comparação com um anticorpo de tipo selvagem em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100%, em que a referida proliferação de células T é medida em um ensaio funcional baseado em células mononucleares de sangue periférico (PBMC).

11.Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma região Fc que foi modificada de modo que o referido anticorpo reduza a expressão de CD69 mediada por Fc em pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 99% ou 100% quando comparado a um anticorpo de tipo selvagem em que a referida expressão de CD69 mediada por Fc é determinada em um ensaio funcional baseado em PBMC.

12.Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma primeira e uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina, em que em pelo menos uma das referidas primeira e segunda cadeias pesadas de imunoglobulina um ou mais aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, D265, N297 e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana não são L, L, D, N e P, respectivamente.

13.Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que em pelo menos uma das referidas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana não é D.

14.Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que em pelo menos uma das referidas primeira e segunda cadeias pesadas o aminoácido na posição correspondente à posição N297 em uma cadeia pesada de IgG1 humana não é N.

15.Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que em pelo menos uma das referidas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana não são L e L, respectivamente.

16.Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 e 15, caracterizado pelo fato de que em pelo menos uma das referidas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são F e E; ou A e A, respectivamente.

17.Anticorpo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que em pelo menos uma das referidas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são F e E, respectivamente.

18.Anticorpo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que em pelo menos uma das referidas primeira e segunda cadeias pesadas pelo menos os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234 e L235 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são A e A, respectivamente.

19.. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que em pelo menos uma das referidas primeira e segunda cadeias pesadas, os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235 e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana não são L, L , e D, respectivamente.

20.Anticorpo, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que em pelo menos uma das referidas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235 e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são F, E e A ; ou A, A e A, respectivamente.

21.Anticorpo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que em pelo menos uma das referidas primeira e segunda cadeias pesadas, os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235 e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são F, E e A , respectivamente.

22.Anticorpo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que em pelo menos uma das referidas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235 e D265 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são A, A e A , respectivamente.

23.Anticorpo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que em pelo menos uma das referidas primeira e segunda cadeias pesadas os aminoácidos nas posições correspondentes às posições L234, L235, D265, N297 e P331 em uma cadeia pesada de IgG1 humana são F, E, A, Q e S, respectivamente.

24.Anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira região de ligação de um anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e uma segunda região de ligação que se liga a um alvo diferente da referida primeira região de ligação ao antígeno.

25.Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma primeira e uma segunda cadeia pesada.

26.Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a)o referido anticorpo biespecífico compreende uma região Fc modificada conforme definido em qualquer uma das reivindicações 9 a 11; ou b)pelo menos uma das referidas primeira e segunda cadeias pesadas compreende um ou mais aminoácidos modificados conforme definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 23.

27.Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, caracterizado pelo fato de que cada uma das referidas primeira e segunda cadeia pesada compreende pelo menos uma região de dobradiça, uma região CH2 e CH3, em que na referida primeira cadeia pesada pelo menos um dos aminoácidos nas posições correspondentes a posições selecionadas do grupo que consiste em T366, L368, K370, D399, F405, Y407 e K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana foi substituída e na referida segunda cadeia pesada pelo menos um dos aminoácidos nas posições correspondentes a uma posição selecionada do grupo que consiste em T366, L368, K370, D399, F405, Y407 e K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana foi substituída e em que as referidas primeira e segunda cadeias pesadas não são substituídas em as mesmas posições.

28.Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o aminoácido na posição correspondente a F405 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é L na referida primeira cadeia pesada e o aminoácido na posição correspondente a K409 em uma cadeia pesada de IgG1 humana é R na referida segunda cadeia pesada, ou vice-versa.

29.Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 28, caracterizado pelo fato de que a referida primeira região de ligação é de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e a referida segunda região de ligação se liga a um alvo diferente da referida primeira região de ligação.

30.Microrganismo caracterizado pelo fato de que compreende um vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia pesada de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 e um vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de cadeia leve de um anticorpo humanizado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, em que o referido microrganismo é uma célula procariótica recombinante ou uma célula microbiana recombinante.

31.Composição caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 ou um anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 24 a 29.

32.Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 ou anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 24 a 29 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

33.Uso do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 24 a 29, composição como definida na reivindicação 31, ou composição farmacêutica como definido na reivindicação 32, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar um câncer, uma doença infecciosa ou uma doença autoimune.

34.Uso de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato do medicamento ser para tratamento de um câncer.

35.Uso, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico liga-se especificamente tanto a um CD3 e a um alvo específico de câncer, ou a um alvo que é superexpresso em câncer ou associado a câncer, e o medicamento tratar um câncer selecionado de câncer de mama, câncer de próstata, câncer de células não pequenas câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de ovário, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de esôfago e carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, câncer cervical, câncer de pâncreas, câncer de testículo, melanoma maligno, câncer de tecidos moles, uma forma indolente ou agressiva de linfoma de células B, leucemia linfática crônica ou leucemia linfática aguda.

36.Método para produzir um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, ou um anticorpo biespecífico, como definido em qualquer uma das reivindicações 24 a 29, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de a)cultivar um microorganismo como definido na reivindicação 30; e b)purificação do referido anticorpo do meio de cultura.

37.Composição de diagnóstico, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, ou um anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 24 a 29.

38.Método in vitro para detectar a presença de antígeno CD3, ou uma célula expressando CD3, em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de; a)contato da amostra com um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 ou um anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 24 a 29, em condições que permitam a formação de um complexo entre o referido anticorpo ou anticorpo biespecífico e CD3; e b)analisar se um complexo foi formado.

39.Kit para detectar a presença de antígeno CD3, ou uma célula que expressa CD3, em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende i)um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, ou um anticorpo biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 24 a 29; e ii)instruções de uso do referido kit.

40.Anticorpo anti-idiotípico caracterizado pelo fato de que se liga a um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23.