TW202200624A - 抗體 - Google Patents

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派翠克 恩格伯特
丹尼斯 維希爾
艾德華 布林克
瑞克 雷德馬克
賽托 伯斯格拉
費德瑞克 伊吉洛
大衛 沙堤杰
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Abstract

本發明關於結合至B7H4之抗體，包括結合至B7H4及CD3之雙特異性抗體。本發明進一步提供包含該抗體之醫藥組成物及抗體用於治療和診斷程序之用途，特別用於癌症療法。

Description

抗體
本發明關於結合至B7H4之抗體，特別關於結合至B7H4及CD3之雙特異性抗體。本發明進一步提供包含抗體之醫藥組成物及抗體用於治療和診斷程序之用途，特別用於癌症療法。
B7H4 (B7-H4，含有V組結構域之T細胞活化抑制劑1或VTCN1)為B7蛋白質家族的成員，該家族包含結合至淋巴細胞上的受體之細胞表面蛋白質配體。B7家族在調節免疫反應中扮演重要的角色。B7H4係藉由抑制T細胞活化、增生、細胞激素生成和細胞毒活性來負調節經T細胞媒介之免疫反應(Prasad等人之2003, Immunity 18: 863-873)。B7H4為I型跨膜蛋白，其包括短的細胞內結構域、疏水性跨膜結構域及具有IgV和IgC樣結構域之細胞外結構域，具有四個保守型半胱胺酸殘基及七個用於經N連結之糖化位點。(Sica等人之2003, Immunity 18: 849-861)。迄今，尚未鑑定出B7H4之受體。 在正常的成人組織中，B7H4表現非常有限，反而在許多癌組織的腫瘤細胞上發現B7H4表現(Kaur和Janakiram之2019, ESMO Open 4:e000554)。在癌症中，B7H4表現係與癌症晚期、預後不良及降低的患者總體生存率互相相關。 因此，已提出靶向B7H4以治療癌症(Podojil和Miller之Immunological Reviews, 2017: 276; 40-51)。目前正在開發以B7H4結合抗體用於癌症療法。例如，FPA150為非海藻糖苷化人類抗體，其解除經B7H4媒介之T細胞活化抑制及展現抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性(Wainberg等人之2019, Annals of Oncology 30, Suppl. 5, v489 (1198P))。其目前於早期臨床試驗中作為晚期實性腫瘤中的單一療法或與帕博利珠單抗(pembrolizumab)之組合。 亦致力於使T細胞靶向B7H4。B7H4/CD3雙特異性單鏈抗體，Fab scFv係基於小鼠抗人類B7H4抗體及小鼠抗人類CD3抗體之Fab及單鏈可變片段(scFv)結構而製成(Iizuka等人之2019, Clin Cancer Res 25: 2925-2934)。Smith等人說明具有B7H4特異性嵌合抗原受體(CAR)之工程化T細胞，其展示對抗B7H4陽性人類卵巢腫瘤異種移植物之抗腫瘤活性，但亦在小鼠中顯示多器官淋巴細胞浸潤及致死毒性(Smith等人之2016, Molecular Therapy, Vol.24 Iss. 11 pp 1987-99)。 儘管已達成一些進展，但仍需要開發靶向B7H4的基於抗體之癌症療法，其對人類使用為有效及/或安全的。
本發明之目的係提供包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及結合至CD3 (諸如人類CD3ε(epsilon))之抗原結合區的抗體。此等抗體之抗原結合區包含至少人類框架區，諸如例如FR1、FR2、FR3和FR4。最佳的是所有框架區為人類。此等抗原結合區係經人源化及/或為人類抗原結合區。該等抗體可用於治療病症，其中要求特異性靶向例如病症(諸如癌症)中表現B7H4之細胞及經T細胞媒介之該細胞毒殺。此抗體較佳地適合於人類使用，例如用於醫學治療。可適合於治療的癌症為實性腫瘤。依照本發明，例如在癌細胞中的該B7H4表現及經T細胞媒介之毒殺可在相對低的B7H4表現(諸如在MCF-7細胞中)至相對高的B7H4表現(諸如在SK-BR3細胞中)之範圍內，如例如實施例12中所示。此等雙特異性抗體更佳地在恆定區內具有取代，這使得Fc區(若存在)呈惰性。 在一個實施態樣中，提供雙特異性抗體，其包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至CD3 (諸如人類CD3ε(epsilon))之抗原結合區，其中能夠結合至人類B7H4之抗原結合區包含可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：25、29或31之CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之CDR1、CDR2和CDR3，且其中能夠結合至CD3之抗原結合區包含重鏈可變區(VH)，其包含分別以SEQ ID NO：18、19和21之CDR1、CDR2和CDR3序列；及輕鏈可變區(VL)，其包含分別以SEQ ID NO：23、GTN和24之CDR1、CDR2和CDR3序列。 在另一態樣中，提供編碼如本文所定義之抗體的核酸，諸如DNA或RNA，以及生產如本文所定義之抗體或其組分之方法。 在進一步的態樣中，依照本發明之抗體或核酸係用於醫學治療。
表1-胺基酸及核酸序列
Figure 02_image001
Figure 02_image003
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Figure 02_image007
Figure 02_image009
Figure 02_image011
Figure 02_image013
Figure 02_image015
以上所列之表中的CDR區(CDR1、CDR2和CDR3，及在VH及VL序列中的劃底線之序列)已根據IMGT註釋(參見Lefranc MP.等人之Nucleic Acids Research, 27, 209-212, 1999]及Brochet X.之Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008))。如上表中所使用之K405L及K409R的參考係依照Eu編號索引(在Kabat, E.A.等人之Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)中所述。 定義 如本文所使用之術語「抗體」意欲指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一者之衍生物，其在典型的生理及/或腫瘤特異性條件下具有特異性結合至抗原的能力，具有很長時間段的半生期，諸如至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約一小時、至少約兩小時、至少約四小時、至少約8小時、至少約12小時、至少約24小時或更長、至少約48小時或更長、至少約3、4、5、6、7或更多天等或任何其他相關功能性定義的期間(諸如足以誘導、促進、增強及/或調節與抗體結合至抗原相關聯的生理反應之時間及/或足以使抗體內化之時間)。抗體包含可與抗原交互作用之結合區(或可於本文使用之結合結構域，兩者兼具相同的意義)，結合區包含免疫球蛋白分子或類似者之重鏈及輕鏈兩者的可變區。抗體可包含抗體(Ab)的恆定區，其可媒介免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統的各種細胞(諸如效應子細胞)及補體系統的組分(諸如C1q，補體活化之經典途徑中的第一組分))之結合。 在本發明之上下文中，術語「抗體」包括單株抗體(mAb)、抗體樣多肽、嵌合抗體、人源化抗體、以及保留特異性結合至抗原(抗原結合片段)的能力之「抗體片段」或「其片段」，其係由任何已知的技術提供，諸如酵素切割、肽合成和重組DNA技術。術語「抗體」包括雙特異性抗體及/或具有更多修飾之抗體，例如其抗體-藥物共軛體。 如根據本發明所定義之抗體可具有任何同型，除非本文的揭示另有其他限制。 已顯示抗體的抗原結合功能可由全長抗體的片段來執行。涵蓋在術語「抗體」內之結合片段的實例包括(i) Fab’或Fab片段，由輕鏈可變結構域(VL)、重鏈可變結構域(VH)、輕鏈恆定區(CL)及重鏈恆定區結構域1 (CH1)結構域所組成之單價片段或如WO 2007/059782中所述之單價抗體；(ii) F(ab’)2 片段，包含在鉸鏈區由雙硫鍵連結的兩個Fab片段之雙價片段；(iii) Fd片段，基本上由VH及CH1結構域所組成；(iv) Fv片段，基本上由抗體之單臂的VL及VH結構域所組成；(v) dAb片段，Ward等人之Nature 341, 544-546 (1989)，其基本上由VH結構域所組成且亦稱為結構域抗體，Holt等人之Trends Biotechnol. 2003 Nov;21 (11):484-90；(vi)駱駝科動物或奈米抗體，Revets等人之Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5 (1):111-24，及(vii)經單離之互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段的兩個結構域VL及VH係以單獨的基因編碼，但是彼等可使用重組方法藉由能使彼等成為單一蛋白鏈之合成連結子接合，其中VL及VH區配對形成單價分子(稱為單鏈抗體或單鏈Fv (scFv)，參見例如Revets等人之Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1):111-24及Bird等人之Science 242, 423-426 (1988))。此等單鏈抗體涵蓋在術語抗體內，除非上下文另有註明或明確地指示。儘管此等片段通常包括在抗體的涵義內，但是彼等全體且各自獨立為本發明獨特的特性，展現不同的生物學性質及效用。在本發明之上下文中的該等及其他有用的抗體片段於本文進一步討論。 抗體可自不同的試管內或活體外表現或生產系統生產及收集，例如自經重組修飾之宿主細胞、自融合瘤或使用支持編碼抗體之核酸序列的試管內轉錄及/或轉譯之細胞提取物的系統。應理解的是多種不同的抗體(如本發明之上下文中所定義之抗體)可藉由在如上述生產系統中單獨產生各抗體且隨後混合抗體，或藉由在同一生產系統中產生幾種抗體來提供。 如本文所使用之術語「免疫球蛋白重鏈」或「免疫球蛋白的重鏈」意欲指免疫球蛋白的重鏈中之一者。重鏈典型地由重鏈可變區(在本文縮寫為VH)及重鏈恆定區(在本文縮寫為CH)所組成，其限定免疫球蛋白之同型。重鏈恆定區典型地由三個結構域所組成，CH1、CH2和CH3。如本文所使用之術語「免疫球蛋白」意欲指結構相關的糖蛋白類別，其係由兩對多肽鏈、一對輕(L)低分子量鏈及一對重(H)鏈所組成，所有四種鏈可能由雙硫鍵交互連接。免疫球蛋白的結構已經完整地特徵化(參見例如Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W.編輯之2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))。在免疫球蛋白的結構內，兩個重鏈係經由所謂的「鉸鏈區」中的雙硫鍵交互連接。與重鏈一樣，各輕鏈典型地由幾個區所組成；輕鏈可變區(在本文縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區典型地由一個結構域CL所組成。此外，VH及VL區可進一步細分成高可變區(hypervariability)(或高變區(hypervariable region)，其在序列及/或結構限定環形式上可為高可變的)，其亦稱為互補決定區(CDR)，以稱為框架區(FR)的更保守型區域穿插。各VH及VL典型地由三個CDR及四個FR所組成，以下列順序自胺基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。 當本文使用術語「半分子(half molecule)」、「Fab臂」及「臂」時，其係指重鏈-輕鏈對。當說明雙特異性抗體包含「源自」第一抗體之半分子抗體及「源自」第二抗體之半分子抗體時，則術語「源自」表示雙特異性抗體係藉由以任何已知的方法重組來自該第一及第二抗體中之各者的該半分子成為所得雙特異性抗體而產生。在此上下文中，「重組」不意欲受限於任何特定的重組方法，且因此包括用於產生本文下述之雙特異性抗體的所有方法，包括例如藉由半分子交換來重組，以及在核酸水平及/或通過在同一細胞中的兩個半分子之共表現來重組。 如本文所使用之術語「抗原結合區」或「結合區」係指能夠結合至抗原之抗體的區域。抗原可為任何分子，諸如多肽。抗原可例如呈現於細胞、細菌或病毒體上。術語「抗原」及「標靶」在本發明之上下文中可交換使用，除非與上下文牴觸。術語「抗原結合區」及「抗原結合位點」在本發明之上下文中可交換使用，除非與上下文牴觸。 術語「阻斷結合」或「阻斷抗體之結合」或「交叉阻斷結合」或「交叉阻斷結合」係指其中一種與特異性抗原結合之抗體阻止第二抗體與同一抗原結合的情況，且反之亦然。在沒有其他抗體存在下，各抗體具有結合至抗原的能力，如以顯著的結合反應所測定，而當有其他抗體存在時，則抗體中之一者缺乏結合反應。一種抗體阻斷另一抗體結合的能力可以經典的夾層表位分倉(sandwich epitope binning)檢定型式中的生物膜干涉法測定，例如本申請案的實施例5及由Abdiche等人所述(Abdiche YN, Malashock DS, Pinkerton A, Pons J. Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors. Anal Biochem. 2009; 386(2): 172-180)。簡言之，在夾層表位分倉檢定中，測試溶液中的抗體與其經由固定之抗體先捕獲的特異性抗原之結合。在本發明之上下文中，若一種抗體能夠在第二抗體存在下結合至抗原，則該抗體不阻斷第二抗體之結合，且反之亦然。術語「阻斷結合」及「阻斷抗體結合」及「交叉阻斷結合」及「交叉阻斷結合」在本發明之上下文中可交換使用，除非與上下文牴觸。據稱阻斷另一抗體之結合的抗體亦可據稱與另一抗體競爭與靶標之結合。 如本文所使用之術語「K D 」(M)係指特定的抗體-抗原交互作用之平衡解離常數且藉由k d 除以k a 而獲得。K D 亦可稱為「結合親和性」。 如本文所使用之術語「k d 」(sec-1 )係指特定的抗體-抗原交互作用之解離速率常數。該值亦稱為koff 值或解離速率(off-rate)。 如本文所使用之術語「k a 」(M-1 x sec-1 )係指特定的抗體-抗原交互作用之締合速率常數。該值亦稱為kon 值或締合速率(on-rate)。 如本文所使用之術語「結合」係指抗體與預定抗原或標靶之結合，當以使用抗體作為配體及抗原作為分析物之生物膜干涉法測定時，典型地具有對應於1E-6 M或更小的K D 之結合親和性，例如5E-7 M或更小、1E-7 M或更小，諸如5E-8 M或更小，諸如1E-8 M或更小，諸如5E-9 M或更小，或諸如1E-9 M或更小，且以對應於比其結合至除了預定抗原或密切相關抗原以外的非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白)之親和力低至少10倍的K D 之親和性結合至預定抗原，諸如低至少100倍，例如低至少1,000倍，諸如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍。 如本文所使用之術語「B7H4」係指稱號為B7H4之蛋白質，其亦稱為：B7-H4；含有T細胞活化抑制劑1之V組結構域；或VTCN1。B7H4為B7蛋白質家族的成員，該家族包含結合至淋巴細胞上的受體之細胞表面蛋白質配體。B7H4為I型跨膜蛋白，其包括短的細胞內結構域、疏水性跨膜結構域及具有IgV和IgC樣結構域之細胞外結構域，具有四個保守型半胱胺酸殘基及七個用於經N連結之糖化位點(Sica等人之2003, Immunity 18: 849-861)。B7H4蛋白質係自各種物種已知，諸如人類(智人) B7H4 (Uniprot登錄號Q7Z7D3)、食蟹猴(食蟹獼猴) B7H4轉錄本1 (Uniprot登錄號A0A2K5U6P5)、狗(家犬) B7H4 (Uniprot登錄號 F1P8R9)、兔(穴兔) B7H4 (Uniprot登錄號G1TQE8)、大鼠(褐鼠) B7H4 (Uniprot登錄號Q501W4)、小鼠(家鼷鼠) B7H4 (Uniprot登錄號Q7TSP5)及豬(野豬) B7H4 (Uniprot登錄號F1SAY4)。所列之B7H4序列的天然變異體可能存在。 如本文所使用之術語「CD3」係指人類分化簇3蛋白質，其為T細胞共受體蛋白複合物的一部分且由四個不同的鏈所組成。CD3係於各種物種中發現，且因此術語「CD3」可能不限於人類CD3，除非與上下文牴觸。在哺乳動物中，複合物含有CD3γ (gamma)鏈(人類CD3γ鏈UniProtKB/Swiss-Prot No P09693或食蟹猴CD3γ UniProtKB/Swiss-Prot No Q95LI7)、CD3δ (delta)鏈(人類CD3δ UniProtKB/Swiss-Prot No P04234或食蟹猴CD3δ UniProtKB/Swiss-Prot No Q95LI8)、兩個CD3ε (epsilon)鏈(人類CD3ε:UniProtKB/Swiss-Prot No P07766，其序列在本文併入為SEQ ID NO：13，其中胺基酸殘基1至22代表訊息肽及胺基酸殘基23至207代表成熟CD3ε多肽；食蟹猴CD3ε UniProtKB/Swiss-Prot No Q95LI5；或恆河猴CD3ε UniProtKB/Swiss-Prot No G7NCB9)及CD3ζ鏈(zeta)鏈(人類CD3ζ UniProtKB/Swiss-Prot No P20963、食蟹猴CD3ζ UniProtKB/Swiss-Prot No Q09TK0)。該等鏈係與稱為T細胞受體(TCR)之分子締合且在T淋巴細胞中產生活化訊息。TCR及CD3分子一起包含TCR複合物。 術語「抗體結合區」係指抗原區，其包含抗體結合之表位。抗體結合區可藉由使用生物膜干涉法之表位分倉、藉由丙胺酸掃描或藉由結構域置換(shuffle)檢定法(使用抗原構築體，其中抗原區係與另一物種之區交換且測定抗體是否仍結合至抗原結合)來測定。在抗體結合區內涉及與抗體交互作用之胺基酸可藉由藉由氫/氘交換質譜術及/或藉由與其抗原結合之抗體的結晶學來測定。 術語「表位」意指以抗體特異性結合之抗原決定位。表位經常由分子的表面群組所組成，諸如胺基酸、糖側鏈或其組合，且經常具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。構形及非構形表位的區別在於在變性溶劑的存在下失去與前者，但不失去與後者之結合。表位可包含直接涉及結合之胺基酸殘基及不直接涉及結合之其他胺基酸殘基，諸如以抗體(當其結合至抗原時)有效地阻斷或覆蓋之胺基酸殘基(換言之，胺基酸殘基係在特定抗體的足跡內或與其緊鄰)。 如本文所使用之術語「單株抗體」、「單株Ab」、「單株抗體組成物」、「mAb」或類似者係指單一分子組成物之抗體分子製品且典型地展示對特定表位之單一結合特異性及親和性。單株抗體典型地可由相同的細胞製成，該等細胞全部為獨特的親本細胞之選殖株，諸如融合瘤、穩定的細胞株或類似者。據此，術語「人類單株抗體」係指展示單一結合特異性之抗體，其具有源自人類種系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。人類單株抗體可由融合瘤生產，該融合瘤包括自基因轉殖或染色體轉殖非人類動物(諸如基因轉殖小鼠)獲得的B細胞，其具有包含人類重鏈轉殖基因及輕鏈轉殖基因的基因組，與不朽化細胞融合。人類單株抗體可源自人類B細胞或血漿細胞。單株抗體亦可自經重組修飾之宿主細胞或使用支持編碼抗體之核酸序列的試管內轉錄及/或轉譯之細胞提取物的系統來生產。 如本文所使用之術語「同型」係指以重鏈恆定區基因編碼之免疫球蛋白類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)或其任何異型(諸如IgG1m(za)和IgG1m(f))。再者，各重鏈同型可與kappa (κ)或lambda (λ)輕鏈組合。 當本文使用術語「全長抗體」時，其係指包含一個重鏈及輕鏈配對或兩個不同的重鏈及輕鏈配對之抗體(例如親本或變異體抗體)，各配對含有重鏈及輕鏈恆定結構域和可變結構域，諸如通常在該同型之野生型抗體的重鏈-輕鏈配對中發現。當與全長親本或野生型抗體相比時，在全長變異抗體中的重鏈及輕鏈恆定結構域和可變結構域可特別含有修飾及/或改進抗體的功能性質之胺基酸取代。根據本發明之全長抗體可以包含以下步驟之方法生產：(i)將CDR序列選殖至一或多個包含完整重鏈及輕鏈序列之適合載體中，及(ii)將所獲得的具有重鏈及輕鏈序列之適合載體表現在適合的表現系統中。當自CDR序列或完全可變區序列開始時，則產生全長抗體係在熟習本技術領域者的知識範圍內。因此，熟習本技術領域者知道如何依照本發明產生全長抗體。 如本文所使用之術語「人源化抗體」係指基因工程化非人類抗體，其含有人類抗體恆定結構域及經修飾以含有高水平的人類可變結構域之序列同源性的非人類可變結構域。這可藉由將共同形成抗原結合位點之非人類抗體互補決定區(CDR)移植至同源性人類受體框架區(FR)上來達成(參見例如WO92/22653和EP0629240)。為了完全重建親本抗體之結合親和性及特異性，可能需要將來自親本抗體(亦即非人類抗體)之框架殘基取代至人類框架區(回復突變)中。結構同源性建模可助於鑑定框架區中對抗體之結合性質重要的胺基酸殘基。因此，人源化抗體可包含非人類CDR序列，主要為人類框架區(其視需要地包含一或多個胺基酸回復突變至非人類胺基酸序列)及完全人類恆定區。視需要地可應用額外的胺基酸修飾(其不一定為回復突變)以獲得具有較佳的特徵之人源化抗體，諸如特別有用的親和性和生化性質，例如包括避免脫醯胺作用、提供「惰性Fc區」及/或改進製造之修飾。 如本文所使用之術語「人類抗體」意欲包括具有源自人類種系免疫球蛋白序列的可變區和框架區及源自人類免疫球蛋白恆定結構域的恆定結構域之抗體。本發明之人類抗體可包括未以人類種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由試管內隨機或位點特異性誘變或藉由活體內體細胞突變所引入之突變、插入或刪除)。「人類抗體」可併入已自人類、基因轉殖動物(諸如在本文的實施例中所述)、HIS小鼠或類似者中的人類種系免疫球蛋白序列產生的VH及VL序列中。此等VH及VL序列被認為是人類VH及VL序列，其例如已與源自人類免疫球蛋白恆定結構域之恆定結構域融合。 因此，「人類抗體」可為工程化抗體。「人類抗體」可能已接受進一步的工程化，例如包括避免脫醯胺作用、提供「惰性Fc區」、能夠產生雙特異性抗體及/或改進製造之修飾。人類抗體亦可能在非人類細胞中生產，例如在CHO細胞或類似者中。然而，如本文所使用之術語「人類抗體」不意欲包括其中源自另一非人類物種(諸如小鼠)的種系之CDR序列已移植至人類框架序列上之抗體。 如本文所使用之術語「Fc區」係指在抗體的兩個重鏈之N端至C端方向上包含至少鉸鏈區、CH2區和CH3區之區域。抗體之Fc區可媒介免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統的各種細胞(諸如效應子細胞)及補體系統的組分)之結合。 如本文所使用之術語「鉸鏈區」係指免疫球蛋白重鏈之鉸鏈區。因此，例如人類IgG1抗體之鉸鏈區係對應於根據Eu編號之胺基酸216至230，如在Kabat Kabat, E.A.等人之Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662,680,689 (1991)中所列。然而，鉸鏈區亦可具有如本文所述之其他亞型中任一者。 如本文所使用之術語「CH1區」或「CH1結構域」係指免疫球蛋白重鏈之CH1區。因此，例如人類IgG1抗體之CH1區係對應於根據Eu編號之胺基酸118至215，如Kabat (同出處)中所列。然而，CH1區 亦可具有如本文所述之其他亞型中任一者。 如本文所使用之術語「CH2區」或「CH2結構域」係指免疫球蛋白重鏈之CH2區。因此，例如人類IgG1抗體之CH2區係對應於根據Eu編號之胺基酸231至340，如Kabat (同出處)中所列。然而，CH2區亦可具有如本文所述之其他亞型中任一者。 如本文所使用之術語「CH3區」或「CH3結構域」係指免疫球蛋白重鏈之CH3區。因此，例如人類IgG1抗體之CH3區係對應於根據Eu編號之胺基酸341至447，如Kabat (同出處)中所列。然而，CH3區亦可具有如本文所述之其他亞型中任一者。 如本文所使用之術語「經Fc媒介之效應子功能」意欲指多肽或抗體結合至其在細胞膜上的靶標或抗原的結果之功能，其中經Fc媒介之效應子功能可歸因於多肽或抗體之Fc區。經Fc媒介之效應子功能的實例包括(i) C1q結合，(ii)補體活化，(iii)補體依賴性細胞毒性(CDC)，(iv)經抗體依賴性細胞媒介之細胞毒性(ADCC)，(v) Fc-γ受體(FcgR)結合，(vi)經抗體依賴性FcγR媒介之抗原交聯，(vii)抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)，(viii)補體依賴性細胞毒性(CDCC)，(ix)經補體增強之細胞毒性，(x)結合至經抗體媒介之助噬化抗體的補體受體，(xi)助噬素作用，及(xii) (i)至(xi)中任一者之組合。 如本文所使用之術語「惰性(inertness)」、「惰性的(inert)」或「非活化」係指至少不能夠經由個別抗體的兩個Fc區結合任何FcγR、誘導經Fc媒介之FcγR交聯或誘導經FcγR媒介之標靶抗原交聯，或不能夠結合C1q之Fc區。其實例為恆定結構域內的FEA取代，如本文所述。抗體之Fc區的惰性可使用抗體以單特異性或雙特異性型式來測試。 當在抗體之上下文中使用術語「全長」時，其表示抗體不為片段，但是含有與特定的同型對應的所有結構域，諸如通常在自然界中發現的該同型，例如IgG1抗體之VH、CH1、CH2、CH3、絞鏈、VL及CL結構域。 在本發明之上下文中，術語「單價抗體」係指可與具有僅一個抗原結合結構域(例如一個Fab臂)的抗原交互作用之抗體分子。在雙特異性抗體之上下文中，「單價抗體結合」係指雙特異性抗體與具有僅一個抗原結合結構域(例如一個Fab臂)的抗原之結合。 在本發明之上下文中，術語「單特異性抗體」係指僅對一種抗原、一個表位具有結合特異性之抗體。抗體可為單特異性單價抗體(亦即僅攜有一個抗原結合區)或單特異性雙價抗體(例如具有兩個相同的抗原結合區之抗體)。 術語「雙特異性抗體」係指具有兩個結合不同表位的抗原結合結構域之抗體，例如兩個不同的VH及VL區配對、兩個不同的Fab臂或兩個具有不同的CDR區之Fab臂。在本發明之上下文中，雙特異性抗體對至少兩個不同的表位具有特異性。此等表位可在相同或不同的抗原或標靶上。若表位係在不同的抗原上，此等抗原可在相同的細胞或不同的細胞、細胞類型或結構上，諸如細胞外基質或囊泡和可溶性蛋白質。雙特異性抗體可能因此能夠交聯多種抗原，例如兩種不同的細胞。 術語「雙價抗體」係指具有兩個抗原結合區之抗體，該抗原結合區結合至相同抗原中之兩者上的相同表位中之兩者或結合至相同或不同抗原上的兩個不同表位。因此，雙價抗體可能為單特異性抗體或雙特異性抗體。 術語「胺基酸」及「胺基酸殘基」在本文可交換使用且不應理解為限制。胺基酸為含有胺(-NH2 )及羧基(-COOH)官能基連同各胺基酸特有的側鏈(R基團)之有機化合物。在本發明之上下文中，胺基酸可基於結構及化學特徵分類。因此，胺基酸的類別可能反映在下表中之一或兩者中： 基於R基之結構及一般化學特徵的主要分類 表2
類別 胺基酸
酸性殘基 D和E
鹼性殘基 K、R和H
親水性不帶電殘基 S、T、N和Q
脂族不帶電殘基 G、A、V、L和I
非極性不帶電殘基 C、M和P
芳族殘基 F、Y和W
表3 胺基酸殘基之替代性物理及功能分類
類別 胺基酸
含羥基之殘基 S和T
脂族殘基 I、L、V和M
環烯基相關性殘基 F、H、W和Y
疏水性殘基 A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y
帶負電殘基 D和E
極性殘基 C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T
帶正電殘基 H、K和R
小殘基 A、C、D、G、N、P、S、T和V
非常小殘基 A、G和S
涉及依次形成的殘基 A、C、D、E、G、H、K、N、Q、R、S、P和T
撓性殘基 Q、T、K、S、G、P、D、E和R
以一種胺基酸取代另一胺基酸可分類成保守型或非保守型取代。在本發明之上下文中，「保守型取代」為經具有類似結構及/或化學特徵之另一胺基酸取代一個胺基酸，此為以一種胺基酸殘基取代如以上兩個表中任一者所定義之相同類別的另一胺基酸殘基：例如，白胺酸可經異白胺酸取代，因為該兩者皆為脂族、支鏈疏水物。同樣地，天冬胺酸可經麩胺酸取代，因為該兩者皆為帶負電小殘基。 在本發明之上下文中，在抗體中的取代表示為： 原始胺基酸-位置-經取代之胺基酸； 參考公認的胺基酸命名法，使用三字母代碼或一個字母代碼，包括代碼「Xaa」或「X」以表示任何胺基酸殘基。因此，Xaa或X典型地可代表20種天然生成胺基酸中任一者。如本文所使用之術語「天然生成」係指下列胺基酸殘基中任一者：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、色胺酸、苯基丙胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸和半胱胺酸。 據此，註記「K409R」或「Lys409Arg」意指抗體包含在胺基酸位置409上經精胺酸取代離胺酸。在給出之位置上的胺基酸取代成為任何其他的胺基酸稱為：原始胺基酸-位置；或例如「K409」。關於其中原始胺基酸及/或經取代之胺基酸可能包含超過一個以上，但不是所有胺基酸之修飾，超過一個以上的胺基酸可以「,」或「/」隔開。例如，在位置409上的離胺酸經精胺酸、丙胺酸或苯基丙胺酸取代：「Lys409Arg,Ala,Phe」或「Lys409Arg/Ala/Phe」或「K409R,A,F」或「K409R/A/F」或「K409至R,A或F」。此標示在本發明之上下文中可交換使用，但具有相同的涵義及目的。 此外，術語「取代」包含取代成任何一種或其他十九種天然胺基酸，或取代成其他胺基酸，諸如非天然胺基酸。例如，在位置409上的胺基酸K之取代包括下列取代中之各者：409A、409C、409D、409E、409F、409G、409H、409I、409L、409M、409N、409Q、409R、409S、409T、409V、409W、409P和409Y。順便一提，這相當於標記409X，其中X標示除了原始胺基酸以外的任何胺基酸。亦可將該等取代標示為K409A、K409C等或K409A,C等或K409A/C/等。以類似方式同樣適用於本文所提及的每一及每個位置，在此具體地包括此等取代中任一者。 根據本發明之抗體亦可能包含胺基酸殘基之刪除。可將此刪除表示為「del」，且包括例如書寫成K409del。因此，在此等實施態樣的例子中，在位置409上的離胺酸已自胺基酸序列刪除。 如本文所使用之術語「宿主細胞」意欲指其中已引入核酸(諸如表現載體)之細胞。應理解的是此等術語不僅意欲指特定的個體細胞，且亦可包括此細胞的後代。因為特定的修飾可能由於突變或環境影響而在後續世代中發生，所以此後代事實上可能與親本細胞不同，但仍包括在如本文所使用之術語「宿主細胞」的範圍內。重組宿主細胞包括例如轉染瘤，諸如CHO細胞、HEK-293細胞、Expi293F細胞、PER.C6細胞、NS0細胞和淋巴細胞及原核細胞(諸如大腸桿菌)和其他的真核宿主(諸如植物細胞和真菌)。 如本文所使用之術語「轉染瘤」包括表現抗體或標靶抗原之重組真核宿主細胞，諸如CHO細胞、PER.C6細胞、NS0細胞、HEK-293細胞、Expi293F細胞、植物細胞或真菌(包括酵母細胞)。 出於本發明之目的，在兩個胺基酸序列之間的序列同一性係使用如以EMBOSS套裝之Needle程式 (EMBOSS：歐洲分子生物學開放電腦軟體組(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人之2000, Trends Genet. 16: 276-277)，較佳為5.0.0版或更新版本中所執行之Needleman-Wunsch演算法(Needleman和Wunsch之1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)以整個參考序列長度來測定。所使用的參數為10之間隙開放罰分(gap open penalty)、0.5之間隙延伸罰分(gap extension penalty)及EBLOSUM62 (BLOSUM62之EMBOSS版)取代矩陣。使用經Needle標記之「最長一致性」的輸出(使用-nobrief選項獲得)作為一致性百分比且如下計算： (相同的殘基 x 100)/(比對長度-比對的間隙總數目)。 相似殘基的保留性亦可以或可替代地以相似性分數來測量，如藉由使用BLAST程式(例如通過NCBI取得的BLAST 2.2.8，使用標準的設定BLOSUM62，開口間隙=11及延伸間隙=1)來測定。適合的變異體典型地展現與親本或參考序列至少約45%，諸如至少約55%、至少約65%、至少約75%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或更多(例如約99%)的相似性。 如本文所使用之術語「內化(internalized)」或「內化作用(internalization)」係指其中分子(諸如根據本發明之抗體)係經細胞膜吞沒且被吸入細胞內部之生物學過程。內化作用亦可稱為「胞飲作用」。 靶向CD3xB7H4之雙特異性抗體 在本發明之第一態樣中，提供抗體，其包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至人類CD3之抗原結合區，其中該抗原結合區包含重鏈及輕鏈可變區，其中該抗原結合區為人類可變區及/或人源化可變區。例如，一個抗原結合區可包含人類重鏈及輕鏈可變區及另一抗原結合區可包含人源化重鏈及輕鏈可變區。或者，兩個抗原結合區可包含人類重鏈及輕鏈可變區，或兩個抗原結合區可包含人源化重鏈及輕鏈可變區。因此，據此提供抗體，其包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至人類CD3之抗原結合區，其中該抗原結合區包含重鏈及輕鏈可變區，其中該重鏈及輕鏈可變區包含人類框架區。包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至人類CD3之抗原結合區的依照如本文所述的本發明之抗體在本文亦可稱為例如B7H4xCD3抗體。 此等抗體較佳為雙特異性抗體。在進一步的實施態樣中，如上文所述之此抗體能夠結合癌細胞及T細胞，諸如例如實施例中所述。可選擇的癌細胞為表現人類B7H4之癌細胞及/或為實性腫瘤之癌細胞。此抗體較佳地能夠誘導癌細胞經T細胞媒介之細胞毒殺。 應理解的是能夠結合包含：如實施例中所示，使抗體在結合檢定法中結合至其標靶，如藉由例如典型的結合曲線所示，諸如本文的圖3和4中所示，或藉由使用例如生物膜干涉法測定結合親和性，如實施例3和4中所示。不能夠結合至特定標靶之抗原結合區對其標靶具有例如不可檢測的結合親和性，例如在典型的生物膜干涉法檢定中所使用的最高濃度下具有＜0.05 nm之反應，諸如實施例3中所示。在任何例子中，熟習本技術領域者非常清楚如何測定抗原結合區是否能夠結合至其標靶。 雙特異性型式 本發明提供雙特異性CD3xB7H4抗體，其有效地促進表現B7H4之腫瘤細胞經T細胞媒介之毒殺。取決於特定用途的所欲功能性質，特定的抗原結合區可選自本發明所提供的抗體組或抗原結合區。雙特異性抗體的許多不同型式及用途為本技術中已知且由Kontermann之Drug Discov Today, 2015 Jul;20(7):838-47；及MAbs, 2012 Mar-Apr; 4(2):182-97綜述。根據本發明之雙特異性抗體可能不限於任何特定的雙特異性型式或其產生方法。 可在本發明使用之雙特異性抗體分子的實施例包含(i)單一抗體，其具有兩個包含不同的抗原結合區之臂；(ii)單鏈抗體，其對兩個不同的表位具有特異性，例如經由兩個以額外的肽連結子串接連結之scFv；(iii)雙重可變結構域抗體(DVD-Ig)，其中各輕鏈及重鏈含有兩個通過短的肽鍵聯串接之可變結構域(Wu等人之Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010))；(iv)經化學連結之雙特異性(Fab’)2片段；(v) Tandab，其為兩個單鏈雙功能抗體之融合體，得到對標靶抗原中之各者具有兩個結合位點之四價雙特異性抗體；(vi)撓性抗體(flexibody)，其為scFv與雙功能抗體之組合，得到多價分子；(vii)基於蛋白激酶A中的「二聚合及對接(docking)結構域」之所謂的「對接與鎖定(dock and lock)」分子」，當應用於Fab時，其可產生由兩個連結至不同的Fab片段之相同的Fab片段所組成的三價雙特異性結合蛋白；(viii)所謂的Scorpion分子，其包含例如兩個與人類Fab臂的兩個末端融合之scFv；及(ix)雙功能抗體。 在一個實施態樣中，本發明之雙特異性抗體為雙功能抗體、交叉抗體或經由受控之Fab臂交換所獲得的雙特異性抗體(諸如WO2011131746中所述(Genmab))。 不同類別的雙特異性抗體的實例包括但不限於(i) IgG樣分子，具有互補的CH3結構域以迫使異二聚合；(ii) 重組IgG樣雙重靶向分子，其中分子的兩側各自含有至少兩種不同抗體之Fab片段或Fab片段的部分；(iii) IgG融合分子，其中全長IgG抗體係與額外的Fab片段或Fab片段的部分融合；(iv) Fc融合分子，其中單鏈Fv分子或穩定之雙功能抗體係與重鏈恆定結構域、Fc區或其部分融合；(v) Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合於一起，與重鏈恆定結構域、Fc區或其部分融合；及(vi) 基於ScFv和雙功能抗體之抗體及重鏈抗體(例如結構域抗體、奈米抗體)，其中不同的單鏈Fv分子或不同的雙功能抗體或不同的重鏈抗體(例如結構域抗體、奈米抗體)彼此融合或與另一與重鏈恆定結構域、Fc區或其部分融合之蛋白質或載體分子融合。 具有互補的CH3結構域分子之IgG樣分子的實例包括但不限於三功能抗體(Triomab)/四功能抗體(Quadroma)分子(Trion Pharma/Fresenius Biotech；Roche，WO2011069104)、所謂的旋鈕入孔(Knob-into-Hole)分子(Genentech，WO9850431)、CrossMAb (Roche，WO2011117329)和靜電匹配分子(Amgen，EP1870459和WO2009089004；Chugai，US201000155133；Oncomed，WO2010129304)、LUZ-Y分子(Genentech，Wranik等人之J. Biol. Chem. 2012, 287(52): 43331-9, doi； 10.1074/ jbc.M112.397869. Epub 2012 Nov 1)、DIG抗體和PIG抗體分子(Pharmabcine，WO2010134666、WO2014081202)、鏈交換工程化(Strand Exchange Engineered)結構域抗體(SEEDbody)分子(EMD Serono，WO2007110205)、Biclonics分子(Merus，WO2013157953)、FcΔAdp分子(Regeneron，WO201015792)、雙特異性IgG1和IgG2分子(Pfizer/Rinat，WO11143545)、Azymetric支架分子(Zymeworks/Merck，WO2012058768)、mAb-Fv分子(Xencor，WO2011028952)、雙價雙特異性抗體(WO2009080254)及DuoBody®分子(Genmab A/S，WO2011131746)。 重組IgG樣雙重靶向分子的實例包括但不限於雙重靶向(DT)-Ig分子(WO2009058383)、二合一(Two-in-one)抗體(Genentech；Bostrom等人之2009. Science 323, 1610-1614.)、交聯Mab (卡門諾斯癌症中心(Karmanos Cancer Center))、mAb2 (F-Star，WO2008003116)、Zybody分子(Zyngenia；LaFleur等人之MAbs. 2013 Mar-Apr;5(2):208-18)、具有共同輕鏈之通道(Crucell/Merus，US7,262,028)、κλBodies (NovImmune，WO2012023053)及CovX抗體(CovX/Pfizer；Doppalapudi, V.R.等人之2007. Bioorg. Med. Chem. Lett. 17,501-506.)。 IgG融合分子的實例包括但不限於雙重可變結構域(DVD)-Ig分子(Abbott，US7,612,181)、雙重結構域雙頭抗體(Unilever；Sanofi Aventis，WO20100226923)、IgG樣雙特異性分子(ImClone/Eli Lilly，Lewis等人之Nat Biotechnol. 2014 Feb;32(2):191-8)、Ts2Ab (MedImmune/AZ；Dimasi等人之J Mol Biol. 2009 Oct 30;393(3):672-92)和BsAb分子(Zymogenetics，WO2010111625)、HERCULES分子(Biogen Idec，US007951918)、scFv融合分子(Novartis)、scFv融合分子(Changzhou Adam Biotech Inc，CN 102250246)及TvAb分子(Roche，WO2012025525、WO2012025530)。 Fc融合分子的實例包括但不限於ScFv/Fc融合體(Pearce等人之Biochem Mol Biol Int. 1997 Sep;42(6):1179-88)、SCORPION分子(Emergent BioSolutions/Trubion，Blankenship JW等人之AACR 100 th Annual meeting 2009 (Abstract # 5465)；Zymogenetics/BMS，WO2010111625)、雙重親和性再靶向技術(Fc-DART)分子(MacroGenics，WO2008157379、WO2010080538)及雙重(ScFv)2-Fab分子(國家抗體醫學研究中心-中國)。 Fab融合雙特異性抗體的實例包括但不限於F(ab)2分子(Medarex/AMGEN；Deo等人之J Immunol. 1998 Feb 15;160(4):1677-86.)、雙重作用或雙Fab分子(Genentech，Bostrom等人之2009. Science 323, 1610至1614.)、對接及鎖定(DNL)分子(ImmunoMedics，WO2003074569、WO2005004809)、雙價雙特異性分子(Biotecnol，Schoonjans，J Immunol. 2000 Dec 15;165(12):7050-7.)及Fab-Fv分子(UCB-Celltech，WO 2009040562 A1)。 基於ScFv、雙功能抗體之抗體及結構域抗體的實例包括但不限於雙特異性T細胞銜接抗體(Engager)(BiTE)分子(Micromet，WO2005061547)、串接雙功能抗體分子(TandAb)(Affimed) Le Gall等人之Protein Eng Des Sel. 2004 Apr;17(4):357-66.)、雙重親和性再靶向技術(DART)分子(MacroGenics，WO2008157379、WO2010080538)、單鏈雙功能抗體分子(Lawrence，FEBS Lett. 1998 Apr 3; 425(3):479-84)、TCR樣抗體(AIT，ReceptorLogics)、人類血清白蛋白ScFv融合體(Merrimack，WO2010059315)和COMBODY分子(Epigen Biotech，Zhu等人之Immunol Cell Biol. 2010 Aug;88(6):667-75.)、雙重靶向奈米抗體(Ablynx，Hmila等人之FASEB J. 2010)及雙重靶向僅重鏈結構域抗體。 本發明之雙特異性抗體可為任何同型。例示性同型包括但不限於人類IgG1、IgG2、IgG3和IgG4同型中任一者。雙特異性抗體較佳地可選擇為人類IgG1同型，如實施例中所示。可使用人類輕鏈恆定區kappa或lambda中任一者。在一個實施態樣中，本發明之抗體的兩個重鏈為IgG1同型，例如IgG1,κ。在一個實施態樣中，雙特異性抗體的兩個重鏈分別為IgG1和IgG4同型。雙特異性抗體較佳地可選擇為人類IgG1同型，如實施例中所示。所選擇之同型的重鏈及其Fc序列視需要地且較佳地可如本文所述於絞鏈及/或CH3區中進行修飾，能夠產生雙特異性抗體且引入惰性。 在一個態樣中，本發明之雙特異性抗體包含Fc區，其包含第一重鏈，其具有包含第一CH3區之第一Fc序列，及第二重鏈，其具有包含第二CH3區之第二Fc序列，其中第一和第二CH3區之序列不同，且使得該第一與第二CH3區之間的異二聚合交互作用比該第一和第二CH3區各自的同二聚合交互作用強。有關該等交互作用及可如何達成的更多細節提供於WO2011131746和WO2013060867 (Genmab)中，將該等特此併入以供參考。 如本文進一步的說明，穩定的雙特異性CD3xB7H4抗體可基於一個B7H4抗體及一個CD3抗體而以高產量獲得，各抗體係由兩個相同的重鏈及兩個相同的輕鏈所組成，各抗體於CH3區中僅含有很少的相當保守(不對稱)型突變。不對稱的突變意指該第一和第二CH3區之序列含有一或多個在不同位置上的胺基酸取代。 能夠結合CD3之抗原結合區 如所述，本發明提供根據本發明之抗體，其包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至人類CD3之抗原結合區。此外，本發明提供根據本發明之抗體，其包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至人類CD3之抗原結合區，其中能夠結合CD3之抗原結合區能夠結合人類CD3ε (epsilon)，諸如以SEQ ID NO：13指定之人類CD3ε (epsilon)。此抗原結合區能夠結合人類CD3ε (epsilon)，如在T細胞(諸如原代人類T細胞)上所呈現。 根據本發明之該抗體可為包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至人類CD3之抗原結合區的抗體，其中結合至CD3之抗原結合區包含 重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17之CDR1、CDR2和CDR3區，及視需要地 輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：22之CDR1、CDR2和CDR3區。 CDR1、CDR2和CDR3區可使用本技術中已知的方法自可變重鏈及輕鏈區鑑定。來自該可變重鏈及輕鏈區之CDR區可根據IMGT註釋(參見Lefranc MP.等人之Nucleic Acids Research, 27, 209-212, 1999]及Brochet X.之Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008))。因此，亦揭示包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至人類CD3之抗原結合區的抗體，其中結合至CD3之抗原結合區包含 重鏈可變區(VH)，其包含分別以SEQ ID NO：18、19和20或18、19和21之CDR1、CDR2和CDR3序列；及視需要地 輕鏈可變區(VL)，其包含分別以SEQ ID NO：23、GTN和24之CDR1、CDR2和CDR3序列。 進一步揭示包含
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能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至人類CD3之抗原結合區的抗體，其中結合至CD3之抗原結合區包含 重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：16之序列或與SEQ ID NO：16之序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%之胺基酸序列同一性之序列；及視需要地 輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：22之序列或與SEQ ID NO：22之序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%之胺基酸序列同一性之序列。 能夠結合人類CD3之此等抗原結合區已說明於例如WO2015001085和WO2017009442中。能夠結合人類CD3之另外抗原結合區揭示且說明於WO2015001085和WO2017009442中，可進一步考慮且使用彼等作為產生依照本發明之抗體的基礎，將彼等併入以供本文參考。 依照本發明之該抗體可以在結合至人類CD3之抗原結合區與人類CD3之間的平衡解離常數K D 結合，該平衡解離常數K D 係在1至1000 nM之範圍內。 依照本發明之該抗體可以在結合至人類CD3之抗原結合區與人類CD3之間的平衡解離常數K D 結合，該平衡解離常數K D 係在1至100 nM之範圍內，諸如在5至100 nM之範圍內、在10至100 nM之範圍內、在1至80 nM之範圍內、在1至60 nM之範圍內、在1至40 nM之範圍內、在1至20 nM之範圍內、在5至80 nM之範圍內、在5至60 nM之範圍內、在5至40 nM之範圍內、在5至20 nM之範圍內、在10至80 nM之範圍內、在10至60 nM之範圍內、在10至40 nM之範圍內，或諸如在10至20 nM之範圍內。例示性且適合的抗原結合區包含SEQ ID NO：16之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：22之輕鏈可變區(VL)。此等可變區已說明於例如WO2015001085中。 在本發明之另一態樣中，該抗體對人類CD3ε具有的結合親和性比具有包含以SEQ ID NO：16所列之VH序列及以SEQ ID NO：22所列之VL序列的抗原結合區之抗體低，其中該親和性較佳地低至少5倍，諸如低至少10倍，例如低至少20倍、低至少30倍、低至少40倍、低至少45倍，或諸如低至少50倍。 在本發明之另一態樣中，該抗體可以在結合至人類CD3之抗原結合區與人類CD3抗原結合之間的平衡解離常數K D 結合，該平衡解離常數K D 係在200至1000 nM之範圍內，諸如在300至1000 nM之範圍內、在400至1000 nM之範圍內、在500至1000 nM之範圍內、在300至900 nM之範圍內、在400至900 nM之範圍內、在400至700 nM之範圍內、在500至900 nM之範圍內、在500至800 nM之範圍內、在500至700 nM之範圍內、在600至1000 nM之範圍內、在600至900 nM之範圍內、在600至800 nM之範圍內，或諸如在600至700 nM之範圍內。例示性且適合的抗原結合區包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17之重鏈可變區(VH)及SEQ ID NO：22之輕鏈可變區(VL)。此等可變區已說明於例如WO2017009442中。 該結合親和性可以生物膜干涉法測定，視需要地如本文實施例4中所列。因此，如本文所定義之對人類CD3具有結合親和性的根據本發明之抗體可具有使用包含以下步驟之生物膜干涉法所測定之結合親和性： I)     將抗體以1 µg/mL的量固定在抗人類IgG Fc捕獲生物感測器(Capture biosensor)上600秒； II)    使用1.40 nM至1000 nM之範圍的3倍稀釋系列測定經人類重組可溶性CD3ε (CD3E27-GSKa) (SEQ ID NO：13之成熟蛋白)在1000秒時間段內之締合及在2000秒時間段內之解離； III)  引用數據至緩衝對照物(0 nM)。 此外，該結合親和性可使用抗體測定，諸如單特異性、雙價抗體，諸如其為全長IgG1之抗體。 因此，在進一步的實施態樣中，根據本發明之抗體為如下抗體，其中 結合至CD3之抗原結合區包含如本文所定義之重鏈可變(VH)區，其包含CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列，當該重鏈可變(VH)區與包含以SEQ ID NO：16所列之序列的重鏈可變(VH)區相比時，其具有在選自由下列所組成的群組之位置上的胺基酸取代：T31、N57、H101、G105、S110和Y114，位置係根據SEQ ID NO：16之序列編號；及 野生型輕鏈可變(VL)區包含分別以SEQ ID NO：23、GTN和SEQ ID NO：24所列之CDR1、CDR2和CDR3序列。 特別地，根據本發明之抗體如下之抗體，其中結合至CD3之抗原結合區包含如本文所定義之重鏈可變(VH)區，其包含選自由下列所組成的群組之取代：T31M、T31P、N57E、H101G、H101N、G105P、S110A、S110G、Y114M、Y114R、Y114V。 此外，根據本發明之抗體為如下之抗體，其中結合至CD3之抗原結合區包含如本文所定義之重鏈可變區，其在胺基酸位置31上具有M或P，或在胺基酸位置57上具有E，或在胺基酸位置101上具有G或N，或在胺基酸105上具有P，或在胺基酸位置110上具有A或G，或在胺基酸位置114上具有M、R或V，該位置對應於具有以SEQ ID NO：16所列之序列的重鏈可變(VH)區編號之胺基酸位置。 又進一步地，根據本發明之抗體為如下之抗體，其中當如本文所定義之結合至CD3之抗原結合區的重鏈可變(VH)區之CDR1、CDR2和CDR3與SEQ ID NO：16之序列的CDR1、CDR2和CDR3相比時，其包含總共最多1、2、3、4或5個胺基酸取代，該胺基酸取代較佳地包含如上文所定義之胺基酸取代。 能夠結合B7H4之抗原結合區 本發明特別地提供根據本發明之抗體，其包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至人類CD3之抗原結合區，其中該人類B7H4為SEQ ID NO：1之人類B7H4。依照本發明之該抗體較佳地包含能夠結合至如以SEQ ID NO：13指定之人類CD3ε (epsilon)的抗原結合區及能夠結合SEQ ID NO：1之人類B7H4的抗原結合區。 根據本發明之抗體特別為如下之抗體，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區能夠結合至人類B7H4之細胞外結構域。該B7H4較佳地表現在細胞上，更佳為人類細胞。 在進一步的實施態樣中，根據本發明之抗體為如下之抗體，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區能夠結合至人類B7H4之IgC樣恆定區。在另一進一步的實施態樣中，根據本發明之抗體為如下之抗體，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區能夠結合至B7H3-IgV/B7H4-IgC。B7H3-IgV/B7H4-IgC代表在人類B7H3與B7H4之間的融合體，其中B7H3 IgV-樣結構域係與對應於SEQ ID NO：11之B7H4 IgC樣結構域融合。該B7H3-IgV/B7H4-IgC係由細胞表現，諸如本文實施例7中所述。在又另一進一步的實施態樣中，根據本發明之抗體為如下之抗體，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區不能夠結合至B7H4-IgV/B7H3-IgC。B7H4-IgV/B7H3-IgC代表在人類B7H3與B7H4之間的融合體，其中B7H4 IgV-樣結構域係與對應於SEQ ID NO：10之B7H3 IgC樣結構域融合。該B7H4-IgV/B7H3-IgC係由細胞表現，諸如本文實施例7中所述。 根據如本文所述之本發明考慮的能夠結合至人類B7H4之適合的抗原結合區包含： a)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：25之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； b)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：29之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； c)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：36之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：40之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； d)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：43之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：47之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； e)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：50之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：54之分別的CDR1、CDR2和CDR3區；或 f)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：31之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； g)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：65之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：69之分別的CDR1、CDR2和CDR3區。 CDR1、CDR2和CDR3區可使用本技術中已知的方法自可變重鏈區及輕鏈區鑑定。來自該可變重鏈區及輕鏈區之CDR區可根據IMGT註釋(參見Lefranc MP.等人之Nucleic Acids Research, 27, 209-212, 1999]及Brochet X.之Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008))。因此，根據如本文所述之本發明考慮的能夠結合至人類B7H4之適合的抗原結合區包含： a)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、27和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； b)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、30和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； c)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：37、38和39之分別的CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：41、DTS和SEQ ID NO：42之分別的CDR1、CDR2和CDR3； d)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：44、45和46之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：48、YTS和SEQ ID NO：49之分別的CDR1、CDR2和CDR3； e)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：51、52和53之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：55、GAS和SEQ ID NO：56之分別的CDR1、CDR2和CDR3；或 f)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、32和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； g)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：66、67和68之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：70、GAS和SEQ ID NO：71之分別的CDR1、CDR2和CDR3。 根據如本文所述之本發明考慮的能夠結合至人類B7H4之又進一步適合的抗原結合區包含： a) SEQ ID NO：25之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； b) SEQ ID NO：29之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； c) SEQ ID NO：36之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：40之可變輕鏈區； d) SEQ ID NO：43之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：47之可變輕鏈區； e) SEQ ID NO：50之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：54之可變輕鏈區；或 f) SEQ ID NO：31之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； g) SEQ ID NO：65之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：69之可變輕鏈區。 結合至B7H4之該抗原結合區視需要地包含與下列者具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%之胺基酸序列同一性的重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區： a) SEQ ID NO：25之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； b) SEQ ID NO：29之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； c) SEQ ID NO：36之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：40之可變輕鏈區； d) SEQ ID NO：43之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：47之可變輕鏈區； e) SEQ ID NO：50之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：54之可變輕鏈區；或 f) SEQ ID NO：31之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； g) SEQ ID NO：65之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：69之可變輕鏈區。 根據本發明之抗體可具有能夠結合至B7H4之抗原結合區，其對人類B7H4具有對應於5E-7 M或更小的K D 值之結合親和性，諸如1E-7 M或更小，諸如具有對應於在5E-7至2E-10 M之範圍內的K D 值之結合親和性，諸如在2E-7至1E-10 M或1E-7至5E-9 M之範圍內。 該結合親和性可以生物膜干涉法測定，視需要地如本文實施例3中所列。因此，如本文所定義之對人類B7H4具有結合親和性的根據本發明之抗體可具有使用包含以下步驟之生物膜干涉法所測定之結合親和性： I)     將抗體以1 µg/mL的量固定在抗人類IgG Fc捕獲生物感測器上600秒； II)    使用1.56 nM至100 nM之範圍的2倍稀釋系列測定經人類重組His標籤化之B7H4蛋白質(Sino Biological目錄號10738-H08H；自編碼具有C端多組胺酸標籤的人類VTCN1 (Uniprot登錄號Q7Z7D3)(Phe29-Ala258)之DNA序列的構築體所表現之蛋白質)在300秒時間段內之締合及在1000秒時間段內之解離； III)  引用數據至緩衝對照物(0 nM)。 此外，該結合親和性可使用抗體測定，諸如單特異性、雙價抗體，諸如其為全長IgG1之抗體。 在進一步的實施態樣中，提供依照本發明之抗體，其包含能夠結合至人類B7H4之抗原區，其中該抗原結合區能夠交叉阻斷： 包含SEQ ID NO：29之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區的抗體；及 包含SEQ ID NO：36之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：40之可變輕鏈區的抗體；且 其中該抗原結合區不能夠交叉阻斷 包含SEQ ID NO：43之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：47之可變輕鏈區的抗體； 包含SEQ ID NO：50之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：54之可變輕鏈區的抗體；及 包含SEQ ID NO：65之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：69之可變輕鏈區的抗體。 在又另一進一步的實施態樣中，依照本發明之該抗體包含能夠結合至人類B7H4之抗原區，該抗原結合區能夠交叉阻斷 包含SEQ ID NO：43之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：47之可變輕鏈區的抗體； 包含SEQ ID NO：50之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：54之可變輕鏈區的抗體；及 包含SEQ ID NO：65之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：69之可變輕鏈區的抗體； 且其中該抗原結合區不能夠交叉阻斷包含如下的抗體： 包含SEQ ID NO：29之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區的抗體；及 包含SEQ ID NO：36之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：40之可變輕鏈區的抗體。 特別地，根據本發明之抗體阻斷另一抗體與B7H4結合之「交叉阻斷」或能力經定義為與B7H4結合之第一抗體阻斷第二抗體與結合至第一抗體之B7H4結合的能力。交叉阻斷可使用如實施例5中所述之檢定法測定。此交叉阻斷亦可在例如包含以下步驟的程序中測定： i)     提供一組樣品，各樣品包含結合至B7H4之抗體； ii)    將來自樣品組的第一抗體以20 µg/mL的量固定在胺反應性第二代(Amine Reactive 2nd Generation)生物感測器(AR2G)上600秒； iii)   將經固定之具有人類B7H4的抗體(100 nM經人類重組His標籤化之B7H4蛋白質(Sino Biological目錄號10738-H08H；自編碼具有C端多組胺酸標籤的人類VTCN1 (Uniprot登錄號Q7Z7D3)(Phe29-Ala258)之DNA序列的構築體所表現之蛋白質)裝載於ARG2生物感測器； iv)   測定來自樣品組的第二抗體以10 µg/mL的量經300秒之締合。 當第二抗體不能夠締合時，則認為第一抗體交叉阻斷第二抗體。熟習本技術領域者熟悉適合於測定抗體交叉阻斷另一抗體與其靶標結合的能力之技術，本申請案揭示適合於測定阻斷結合及置換之程序。在進一步的實施態樣中，如本文所述之交叉阻斷係如實施例5中所述來測定。 在進一步的實施態樣中，具有能夠結合至人類B7H4之抗原結合區的依照本發明之抗體符合如上述之交叉阻斷特性，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區能夠結合至B7H3-IgV/B7H4-IgC (SEQ ID NO：11)，且視需要地不能夠結合至B7H4-IgV/B7H3-IgC (SEQ ID NO：10)。 CD3及B7H4抗原結合區組合 本揭示進一步提供根據本發明之抗體，其包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至人類CD3之抗原結合區，其中結合至CD3之抗原結合區包含 重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：16之CDR1、CDR2和CDR3區；及
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輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：22之CDR1、CDR2和CDR3區；且 其中能夠結合至B7H4之抗原結合區包含： a)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：25之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； b)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：29之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； c)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：36之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：40之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； d)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：43之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：47之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； e)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：50之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：54之分別的CDR1、CDR2和CDR3區；或 f)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：31之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； g)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：65之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：69之分別的CDR1、CDR2和CDR3區。 本揭示進一步提供根據本發明之抗體，其可為包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至人類CD3之抗原結合區的抗體，其中結合至CD3之抗原結合區包含 重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：17之CDR1、CDR2和CDR3區；及
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輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：22之CDR1、CDR2和CDR3區；且 其中能夠結合至B7H4之抗原結合區包含： a)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：25之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； b)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：29之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； c)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：36之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：40之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； d)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：43之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：47之分別的CDR1、CDR2和CDR3區; e)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：50之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：54之分別的CDR1、CDR2和CDR3區；或 f)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：31之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； g)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：65之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：69之分別的CDR1、CDR2和CDR3區。 本揭示亦進一步提供包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至人類CD3之抗原結合區的抗體，其中能夠結合至CD3之抗原結合區包含： 重鏈可變區(VH)，其包含分別以SEQ ID NO：18、19和20之CDR1、CDR2和CDR3序列；及輕鏈可變區(VL)，其包含分別以SEQ ID NO：23、GTN和24之CDR1、CDR2和CDR3序列；且 其中能夠結合至B7H4之抗原結合區包含： a)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、27和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； b)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、30和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； c)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：37、38和39之分別的CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：41、DTS和SEQ ID NO：42之分別的CDR1、CDR2和CDR3； d)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：44、45和46之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：48、YTS和SEQ ID NO：49之分別的CDR1、CDR2和CDR3； e)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：51、52和53之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：55、GAS和SEQ ID NO：56之分別的CDR1、CDR2和CDR3；或 f)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、32和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； g)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：66、67和68之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：70、GAS和SEQ ID NO：71之分別的CDR1、CDR2和CDR3。 本揭示進一步提供包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至人類CD3之抗原結合區的抗體，其中 能夠結合至CD3之抗原結合區包含： 重鏈可變區(VH)，其包含分別以SEQ ID NO：18、19和21之CDR1、CDR2和CDR3序列；及輕鏈可變區(VL)，其包含分別以SEQ ID NO：23、GTN和24之CDR1、CDR2和CDR3序列；且 其中能夠結合至B7H4之抗原結合區包含： a)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、27和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； b)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、30和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； c)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：37、38和39之分別的CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：41、DTS和SEQ ID NO：42之分別的CDR1、CDR2和CDR3； d)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：44、45和46之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：48、YTS和SEQ ID NO：49之分別的CDR1、CDR2和CDR3； e)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：51、52和53之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：55、GAS和SEQ ID NO：56之分別的CDR1、CDR2和CDR3；或 f)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、32和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； g)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：66、67和68之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：70、GAS和SEQ ID NO：71之分別的CDR1、CDR2和CDR3。 進一步揭示包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至人類CD3之抗原結合區的抗體，其中結合至CD3之抗原結合區包含：
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重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：16之序列，及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：22之序列；且 其中能夠結合至B7H4之抗原結合區包含結合至B7H4之抗原結合區，其包含具有如下的重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區： a) SEQ ID NO：25之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； b) SEQ ID NO：29之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； c) SEQ ID NO：36之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：40之可變輕鏈區； d) SEQ ID NO：43之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：47之可變輕鏈區； e) SEQ ID NO：50之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：54之可變輕鏈區；或 f) SEQ ID NO：31之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； g) SEQ ID NO：65之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：69之可變輕鏈區。 又進一步揭示
Figure 02_image017
包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至人類CD3之抗原結合區的抗體，其中結合至CD3之抗原結合區包含：
Figure 02_image020
Figure 02_image021
重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：17之序列，及輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：22之序列；且 其中能夠結合至B7H4之抗原結合區包含具有如下的抗原結合重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區： a) SEQ ID NO：25之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； b) SEQ ID NO：29之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； c) SEQ ID NO：36之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：40之可變輕鏈區； d) SEQ ID NO：43之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：47之可變輕鏈區； e) SEQ ID NO：50之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：54之可變輕鏈區；或 f) SEQ ID NO：31之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； g) SEQ ID NO：65之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：69之可變輕鏈區。 在進一步的實施態樣中，在此雙特異性抗體中，能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區包含在重鏈及輕鏈中，該重鏈包含該VH區及IgG1重鏈恆定區，且該輕鏈包含該VL區及kappa輕鏈恆定區；且其中能夠結合至人類CD3之該抗原結合區包含在重鏈及輕鏈中，該重鏈包含該VH區及IgG1重鏈恆定區，且該輕鏈包含該VL區及lambda輕鏈恆定區。更佳地，在此雙特異性抗體中，一個IgG1重鏈恆定區係如SEQ ID NO：60中所定義及其他係如SEQ ID NO：61中所定義，且其中該kappa輕鏈恆定區係如SEQ ID NO：63中所定義及該lambda輕鏈恆定區係如SEQ ID NO：64中所定義。應理解的是視需要可刪除如SEQ ID NO：60和61中所定義之該IgG1重鏈恆定區的末端離胺酸。 如熟習本技術領域者所熟知，抗體之各抗原結合區通常包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，且可變區之各者分別包含三個CDR序列，CDR1、CDR2和CDR3及可分別包含四個框架序列FR1、FR2、FR3和FR4。抗體之各抗原結合區通常可包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，且可變區之各者分別包含三個CDR序列，CDR1、CDR2和CDR3及可分別包含四個人類框架序列，FR1、FR2、FR3和FR4。此結構較佳地亦可在根據本發明之抗體中發現。此外，根據本發明之抗體可包含兩個重鏈恆定區(CH)及兩個輕鏈恆定區(CL)。恆定區的實例提供在例如SEQ ID NO：57至64中。 在特別的實施態樣中，根據本發明之抗體包含第一和第二重鏈，諸如分別包含至少鉸鏈區、CH2和CH3區之第一和第二重鏈。穩定的異二聚合抗體可例如藉由如WO 2008/119353和WO 2011/131746中所提供的所謂Fab臂交換而以高產量獲得，該獲得係以兩種於CH3區中僅含有很少的不對稱突變之同二聚合起始蛋白質為基礎。因此，在本發明之一些實施態樣中，抗體包含第一重鏈，其中在對應於選自由人類IgG1重鏈中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409所組成的群組之位置的位置上之胺基酸中至少一者已經取代，及第二重鏈，其中在對應於選自由人類IgG1重鏈中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409所組成的群組之位置的位置上之胺基酸中至少一者已經取代，其中該第一和該第二重鏈之該取代不在相同的位置上，且其中胺基酸位置係根據Eu編號進行編號。例如，具有此取代之恆定結構域係提供在例如SEQ ID NO：58和62中，其可與不具有此取代之SEQ ID NO：57相比。 如本文所使用之術語「對應於…位置之胺基酸」係指在人類IgG1重鏈中的胺基酸位置號碼。在其他的免疫球蛋白中，對應的胺基酸位置可藉由與人類IgG1比對來找到。除非上下文另有其他陳述或牴觸，否則恆定區序列之胺基酸在本文係根據Eu編號索引編號(在Kabat, E.A.等人之1991, Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242, pp 662, 680, 689中所述)。因此，一個序列中「對應於」另一序列中的胺基酸或片段之胺基酸或片段為使用標準的序列比對程式(諸如ALIGN、ClustalW或類似程式)通常在預設的設定下與其他胺基酸或片段比對之胺基酸或片段，且與人類IgG1重鏈具有至少50%、至少80%、至少90%或至少95%之同一性。如何比對序列或序列中的片段且從而測定序列中對應於根據本發明之胺基酸位置的位置被認為是本技術中所熟知的。 在特別的實施態樣中，本發明提供抗體，其中在對應於人類IgG1重鏈中之K409的位置上之胺基酸為該第一重鏈中的R，及在對應於人類IgG1重鏈中之F405的位置上之胺基酸為該第二重鏈中的L，或反之亦然。 在一些實施態樣中，根據本發明之抗體包含除了抗原結合區以外亦包含具有兩個重鏈之Fc序列的Fc區。第一和第二Fc序列可分別為任何同型，包括任何人類同型，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgD、IgM或IgA同型或混合同型。Fc區較佳為人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4同型或混合同型，諸如人類IgG1同型。在一些實施態樣中，較佳的是根據本發明之抗體為全長抗體，其最佳為IgG1類型。 根據本發明之抗體可包含在Fc區中的修飾，使得抗體成為惰性或非活化抗體。因此，在本文所揭示之抗體中，一或兩個重鏈可經修飾，使得抗體誘導經Fc媒介之效應子功能至在程度上比相同(除了包含未經修飾之第一和第二重鏈以外)的抗體小。經Fc媒介之效應子功能可藉由測定在T細胞上經Fc媒介之CD69表現(亦即由於經CD3抗體媒介之Fcγ受體依賴性CD3交聯所致的CD69表現)、藉由結合至Fcγ受體、藉由結合至C1q或藉由誘導經Fc媒介之FcγR交聯來測量。重鏈恆定序列特別地可經修飾，當與野生型(未經修飾)抗體相比時，使得經Fc媒介之CD69表現降低至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中該經Fc媒介之CD69表現係以基於PBMC之功能檢定法測定，例如在WO2015001085的實施例3中所述。重鏈及輕鏈恆定序列之修飾亦可導致C1q與該抗體之結合降低。當與未經修飾之抗體相比時，降低可為至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或100%，且C1q結合可以ELISA測定。再者，Fc區可經修飾，使得該抗體媒介經Fc媒介之T細胞增生與未經修飾之抗體相比而降低至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%或100%，其中該T細胞增生係以基於PBMC之功能檢定法測量。 已開發範圍廣泛不同的非活化抗體型式，其中已將胺基酸取代及其組合引入IgG1同型抗體之恆定重鏈區中以消除經Fc媒介之效應子功能(例如Chiu等人之Antibodies 2019 Dec; 8(4): 55；Liu等人之Antibodies, 2020 Nov 17; 9(4): 64；29(10):457-66；Shields等人之J Biol Chem,. 2001 Mar 2;276(9):6591-604)。 可經修飾之胺基酸位置(例如在IgG1同型抗體中)的實例包括位置L234和L235。因此，根據本發明之抗體可包含第一和第二重鏈，且其中在第一和第二重鏈兩者中，在對應於人類IgG1重鏈中根據Eu編號之位置L234和L235的位置上之胺基酸殘基分別為F和E。應理解的是除了胺基酸位置L234和L235之修飾以外，可修飾另外的位置。 另外，D265A胺基酸取代可降低與所有Fcγ受體之結合且防止ADCC (Shields等人之2001, J. Biol. Chem. (276): 6591-604)。因此，根據本發明之抗體可包含第一和第二重鏈，其中在第一和第二重鏈兩者中，在對應於人類IgG1重鏈中根據Eu編號之位置D265的位置上之胺基酸殘基為A。本發明進一步的實施態樣提供抗體，其中在第一和第二重鏈中至少一者中(諸如兩者中)在對應於人類IgG1重鏈中之位置L234、L235和D265的位置上之胺基酸分別為F、E和A。在本申請案中，具有如本文以上所揭示之三個胺基酸取代L234F、L235E和D265A及另外的K409R或F405L突變之組合的抗體可分別以後綴「FEAR」或「FEAL」來命名。 野生型IgGl重鏈恆定區之胺基酸序列在本文以SEQ ID NO：57識別。與以上所揭示之實施態樣一致，本發明之抗體可包含攜有F405L取代之IgG1重鏈恆定區且可具有以SEQ ID NO：58所列之胺基酸序列及/或攜有K409R取代之IgG1重鏈恆定區且可具有以SEQ ID NO：62所列之胺基酸序列。 攜有L234F、L235E和D265A取代之IgG1重鏈恆定區的胺基酸序列在本文以SEQ ID NO：59識別。攜有L234F、L235E、D265A和F405L取代之IgG1重鏈恆定區的胺基酸序列在本文以SEQ ID NO：60識別。攜有L234F、L235E、D265A和K409R取代之IgG1重鏈恆定區的胺基酸序列在本文以SEQ ID NO：61識別。 以SEQ ID NO：57至62所列之恆定區序列列出末端離胺酸(K)，此等序列用於本文之實施例章節中。此離胺酸的起源為人類中發現的天然生成序列，自此衍生出該等Fc區。在重組抗體之細胞培養物生產期間，此末端離胺酸可藉由內源性羧肽酶之蛋白水解作用來切割，得到具有相同序列但缺乏C端離胺酸之恆定區。出於抗體之製造目的，編碼此末端離胺酸之DNA可自序列省略，使得生產不具有離胺酸之抗體。自編碼或不編碼末端離胺酸之核酸序列所生產之抗體在序列及功能上實質上相同，因為當例如使用基於CHO之生產系統生產抗體時，末端離胺酸之處理程度通常很高(Dick, L.W.等人之Biotechnol. Bioeng. 2008;100: 1132-1143)。因此，應理解的是可產生無需編碼或具有末端離胺酸的依照本發明之抗體，諸如本文所列。出於製造目的，因此可產生不具有末端離胺酸之抗體。 本發明進一步提供抗體，其中 a) 能夠結合至B7H4之抗原結合區為人類，及 b) 能夠結合至CD3之抗原結合區係經人源化。 本發明亦提供抗體，其中 a) 能夠結合至B7H4之抗原結合區為人類，及/或 b) 能夠結合至CD3之抗原結合區係經人源化。 在本發明之一些實施態樣中，抗體包含kappa (κ)輕鏈。關於雙特異性抗體之本發明特定的實施態樣之序列，kappa輕鏈包含B7H4抗體輕鏈之CDR1、-2和-3序列，如上文所揭示。 在本發明進一步的實施態樣中，根據前述請求中任一者之抗體，其中該抗體包含lambda (λ)輕鏈。在關於雙特異性抗體之本發明特定的實施態樣中，lambda輕鏈包含CD3抗體輕鏈之CDR1、-2和-3序列，如上文所揭示，特別為對CD3具有降低的親和性的CD3抗體之CDR1、-2和-3序列，如上文所揭示。kappa輕鏈恆定區之胺基酸序列係作為SEQ ID NO：63包括在本文中及lambda輕鏈恆定區之胺基酸序列係作為SEQ ID NO：64包括在本文中。 在特別的實施態樣中，抗體包含lambda (λ)輕鏈和kappa (κ)輕鏈；例如包含能夠結合至CD3之結合區的具有重鏈及lambda輕鏈之抗體，及包含能夠結合至B7H4之結合區的具有重鏈及kappa輕鏈之抗體。 因此，在進一步的實施態樣中，在如本文所定義之雙特異性抗體中，能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區包含在重鏈及輕鏈中，該重鏈包含該VH區和IgG1重鏈恆定區，及該輕鏈包含該VL區和kappa輕鏈恆定區；且能夠結合至人類CD3之該抗原結合區包含在重鏈及輕鏈中，該重鏈包含該VH區和IgG1重鏈恆定區，及該輕鏈包含該VL區和lambda輕鏈恆定區。更佳地，在該雙特異性抗體中，一個IgG1重鏈恆定區係如SEQ ID NO：60中所定義及其他係如SEQ ID NO：61中所定義，且該kappa輕鏈恆定區係如SEQ ID NO：63中所定義及該lambda輕鏈恆定區係如SEQ ID NO：64中所定義。應理解的是如SEQ ID NO：60和61中所定義之該IgG1重鏈恆定區可具有經刪除之彼等末端離胺酸。 結合、細胞毒性及T細胞活化 可結合至人類CD3和人類B7H4的如本文所述之抗體(諸如雙特異性抗體)可有利地靶向T細胞至表現人類B7H4之癌細胞，從而誘導該癌細胞經T細胞媒介之毒殺。藉由在此等抗體中具有降低或惰性的Fc功能性，如實施例章節中所示，可將安全、有效且足夠的抗體投予人類患者，同時有效對抗不同的B7H4表現水平之範圍廣泛的癌症。 如所述，依照本發明之抗體較佳地缺乏或具有降低的經Fc媒介之效應子功能，且此外，抗體： a)  能夠結合至表現B7H4之人類腫瘤細胞，如本文實施例9和10中所述， b)  當使用例如經純化之PBMC或T細胞作為效應子細胞時，當如本文實施例11和12中所述方式檢定時，能夠媒介表現B7H4之人類腫瘤細胞的濃度依賴性細胞毒性， c)  當使用例如經純化之PBMC或T細胞作為效應子細胞時，當如本文實施例11和12中所述方式檢定時，能夠媒介一或多種選自由MCF-7、MDA-MB-468、SK-BR3、NIH-OVCAR-3、HCC1954和NCI-H1650所組成的群組之表現人類B7H4之腫瘤細胞株的濃度依賴性細胞毒性， d)  例如當如在本文實施例13中所述方式檢定時，能夠在表現B7H4之人類腫瘤細胞存在下於試管內活化T細胞， e)  例如當如本文實施例13中所述方式檢定時，能夠在一或多種選自由MCF-7、MDA-MB-468、SK-BR3、NIH-OVCAR-3、HCC1954和NCI-H1650所組成的群組之表現B7H4之人類腫瘤細胞株存在下於試管內活化T細胞， f)  例如當如本文實施例11和12中所述方式檢定時，能夠誘導表現B7H4之人類腫瘤細胞之細胞毒性，及/或 g)  例如當如本文實施例11和12中所述方式檢定時，能夠在一或多種選自由MCF-7、MDA-MB-468、SK-BR3、NIH-OVCAR-3、HCC1954和NCI-H1650所組成的群組之表現B7H4之人類腫瘤細胞株中誘導經T細胞媒介之細胞毒性。 此外，依照本發明之抗體可能缺乏或具有降低的經Fc媒介之效應子功能，且此外能夠誘導經T細胞媒介之細胞毒性抗體，其中細胞毒性係以試管內IC50檢定法評定，其包含： i)     提供來自健康的人類捐贈者膚色血球層的經單離之周邊血液單核細胞(PBMC)或經純化之T細胞， ii)    提供表現B7H4之腫瘤細胞，諸如選自由MCF-7、MDA-MB-468、SK-BR3、NIH-OVCAR-3、HCC1954和NCI-H1650所組成的群組之表現人類B7H4之腫瘤細胞株； iii)   將該PBMC或該經純化之T細胞與該表現B7H4之腫瘤細胞的複數個樣品組合，其中來自該PBMS之T細胞或該經純化之T細胞對所選擇之腫瘤細胞的數目比為8：1； iv)   將用於所選擇的表現人類B7H4之腫瘤細胞的例如0.0128 ng/mL至10,000 ng/mL之範圍的稀釋系列之該抗體提供至該樣品中，且 v)    將步驟iv)中所獲得的樣品在37℃下培育例如72小時，且隨後 vi)   評定表現B7H4之腫瘤細胞的生存力， vii)  測定各稀釋樣品之活細胞百分比，且 viii) 測定IC50。 亦可以經純化之T細胞代替經單離之周邊血液單核細胞(PBMC)提供在步驟i)中。 據此，抗體可具有在0.001至2微克/ml之範圍內的IC50，其中IC50係於試管內細胞毒性檢定法測定，其包含以下步驟： i)     提供來自健康的人類捐贈者膚色血球層的經單離之周邊血液單核細胞(PBMC)， ii)    提供表現B7H4之腫瘤細胞，諸如選自由MCF-7、MDA-MB-468、SK-BR3、NIH-OVCAR-3和HCC1954所組成的群組之表現人類B7H4之腫瘤細胞株； iii)   將該PBMC與該表現B7H4之腫瘤細胞的複數個樣品組合，其中來自該PBMS之T細胞對所選擇之腫瘤細胞的數目比為8：1； iv)   將用於所選擇的表現人類B7H4之腫瘤細胞的例如0.0128 ng/mL至10,000 ng/mL之範圍的稀釋系列之該抗體提供至該樣品中，且 v)    將步驟iv)中所獲得的樣品在37℃下培育例如72小時，且隨後， vi)   評定表現B7H4之腫瘤細胞的生存力， vii)  測定各稀釋樣品之活細胞百分比，且 viii) 測定IC50。 據此，抗體可具有在0.001至5微克/ml之範圍內的IC50，其中IC50係於試管內細胞毒性檢定法測定，其包含以下步驟： i)     提供來自健康的人類捐贈者膚色血球層的經單離之周邊血液單核細胞(PBMC)或經純化之T細胞， ii)    提供表現B7H4之腫瘤細胞，諸如選自由MCF-7、MDA-MB-468、SK-BR3、NIH-OVCAR-3、HCC1954和NCI-H1650所組成的群組之表現人類B7H4之腫瘤細胞株； iii)   將該PBMC或該經純化之T細胞與該表現B7H4之腫瘤細胞的複數個樣品組合，其中來自該PBMS之T細胞或該經純化之T細胞對所選擇之腫瘤細胞的數目比為8：1； iv)   將用於所選擇的表現人類B7H4之腫瘤細胞的例如0.0128 ng/mL至10,000 ng/mL之範圍的稀釋系列之該抗體提供至該樣品中，且 v)    將步驟iv)中所獲得的樣品在37℃下培育例如72小時，且隨後 vi)   評定表現B7H4之腫瘤細胞的生存力， vii)  測定各稀釋樣品之活細胞百分比，且 viii) 測定IC50。 在一個實施態樣中，依照本發明之抗體可具有在0.001至5微克/ml之範圍內的IC50。在一個實施態樣中，依照本發明之抗體可具有在0.001至2微克/ml之範圍內的IC50。在另一實施態樣中，依照本發明之抗體可具有在0.001至0.03微克/ml之範圍內的IC50。在又另一實施態樣中，IC50可在0.05至2微克/ml之範圍內。在又另一實施態樣中，IC50可在0.05至5微克/ml之範圍內。該IC50可使用諸如實施例12中所述之方法測定。 在進一步的實施態樣中，依照本發明之抗體媒介T細胞活化的能力係於試管內檢定法測定，其包含以下步驟： i)     提供來自健康的人類捐贈者膚色血球層的經單離之周邊血液單核細胞(PBMC)， ii)    提供表現B7H4之腫瘤細胞； iii)   將PBMC及表現B7H4之腫瘤細胞組合成複數個樣品，其中PBMC對腫瘤細胞的數目比為8：1； iv)   將例如0.0128 ng/mL至10,000 ng/mL之範圍的稀釋系列之該抗體提供至該樣品中，且 v)    將樣品在37℃下培育例如72小時；且 vi)   隨後檢測細胞激素。 可例如檢測的例示性細胞激素為例如IFN-γ，諸如在實施例13中所述。表現B7H4之腫瘤細胞較佳為表現人類B7H4之腫瘤(諸如原發性腫瘤)或選自由MCF-7、MDA-MB-468、SK-BR3、NIH-OVCAR-3和HCC1954所組成的群組之腫瘤細胞株。 B7H4抗體 在另一實施態樣中，提供包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區的抗體，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區包含： a)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：25之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； b)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：29之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； c)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：31之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； d)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、27和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； e)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、30和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； f)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、32和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； g) SEQ ID NO：25之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區；或 h) SEQ ID NO：29之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； i) SEQ ID NO：31之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； j) 具有重鏈(VH)可變區及輕鏈(VH)可變區，其與各自的SEQ ID NO：25之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%之胺基酸序列同一性。 此等抗體不一定包含結合至CD3之抗原結合區。此等抗體可用於例如檢測B7H4之套組及檢定法中。此等抗體亦可用於治療癌症。因此，此抗體可為結合至B7H4之單特異性抗體。此抗體可為雙價抗體。 此抗體較佳為包含重鏈恆定區(其為人類IgG1恆定區)之抗體。例如，重鏈恆定區係以諸如SEQ ID NO：57至62所列。較佳的輕鏈恆定區為kappa輕鏈，諸如以SEQ ID NO：63所列。 在一個實施態樣中，本文所提供之抗體可結合至人類B7H4上的表位或抗體結合區，其包含胺基酸殘基S151、V157、D158、Y159、E164、L166、W173、P175、P177、V179、W181、F199、M208、V210、T222、Y223、V240、E242和I245中之一或多者；各胺基酸殘基的編號係指其在SEQ ID NO：1中的位置。在進一步的實施態樣中，本文所提供之抗體可結合至人類B7H4上的表位或抗體結合區，其包含胺基酸殘基V157、D158、Y159、E164、L166中之一或多者；各胺基酸殘基的編號係指其在SEQ ID NO：1中的位置。 在另一實施態樣中，本文所提供之抗體可結合至人類B7H4上的表位或抗體結合區，其包含胺基酸殘基S151、V157、D158、Y159、E164、L166、W173、P175、P177、V179、W181、F199、M208、V210、T222、Y223、V240、E242和I245；各胺基酸殘基的編號係指其在SEQ ID NO：1中的位置。在進一步的實施態樣中，本文所提供之抗體可結合至人類B7H4上的表位或抗體結合區，其包含胺基酸殘基V157、D158、Y159、E164、L166；各胺基酸殘基的編號係指其在SEQ ID NO：1中的位置。 基於本文實施例7中所提供的結果，不想受到理論的束縛，假設該等胺基酸殘基(亦即S151、V157、D158、Y159、E164、L166、W173、P175、P177、V179、W181、F199、M208、V210、T222、Y223、V240、E242和I245)中任何一或多者係直接涉及抗體之結合，諸如以非共價交互作用的方式；例如與抗體之CDR序列內的胺基酸殘基。 由該表位或抗體結合區所包含的胺基酸殘基及視需要地間接涉及結合的一或多種額外的胺基酸殘基可藉由具有以SEQ ID NO：1所列之胺基酸序列或SEQ ID NO：1之細胞外結構域序列的人類B7H4之丙胺酸掃描來鑑定。丙胺酸掃描可特別如本文實施例7中所列或基本上如本文實施例7中所列方式執行。 再者，丙胺酸掃描可以包含以下步驟之程序執行： i)    表現突變的人類B7H4多肽(其中在人類B7H4之細胞外結構域中的胺基酸殘基(除了半胱胺酸和丙胺酸以外)個別地經丙胺酸取代)及個別地在人類胚胎腎細胞(例如HEK 293細胞)中的對應野生型B7H4多肽，使得對各突變體或野生型B7H4提供包含40至60.000個細胞(諸如50.000個細胞)的樣品， ii)   將各樣品中的細胞以20 µL該抗體培育，其中該抗體係由單一重鏈及單一輕鏈所組成，將抗體以例如適合於流動式細胞測量術分析之標記物(諸如mNeogreen標記物)標記且在室溫下培育1小時，且隨後以FACS緩衝液(例如磷酸鹽緩衝之鹽水[PBS；Lonza，目錄號BE17-517] + 0.1% [w/v]之BSA [Roche，目錄號10735086001] + 0.02% [w/v]之疊氮化鈉[NaN3 ；EMELCA Bioscience，目錄號41920044-3])清洗且將各樣品中的細胞懸浮於30 µL FACS緩衝液中， iii)  對各樣品測定每一細胞結合之抗體的平均量，作為該樣品中活的單細胞群之螢光強度的幾何平均值(gMFI)，且各試驗抗體的數據係使用以下公式對比未交叉阻斷之B7H4特異性參考抗體之結合強度正規化：
Figure 02_image022
其中「aa位置」係指突變成丙胺酸之位置， 其中根據以下計算法計算差異倍數或Z分數以表示抗體結合的失去或增加：
Figure 02_image024
其中，在胺基酸經丙胺酸置換後，以特定抗體未失去或未增加結合之胺基酸位置給出結果「0」，而增加結合得到「＞0」及失去結合得到「＜0」，且在結合差異倍數小於平均差異倍數-1.5 x SD (其中SD為自特定的試驗抗體之四次獨立實驗所計算之差異倍數的標準偏差)的情況下，其中僅B7H4胺基酸殘基被認為是「失去結合的突變體」，且其中若參考抗體對特定的B7H4突變體之gMFI小於平均gMFI - 平均gMFI對照Ab的2.5 x SD，則將數據自分析排除。 此外，此抗體亦可雙特異性抗體，其除了包含能夠結合至B7H4之抗原結合區以外亦包含另一抗原結合區。此另一抗原結合區可為能夠結合至人類CD3之抗原結合區。能夠結合至人類CD3之此抗原結合區可為能夠結合至CD3之抗原結合區，如本文所述及揭示。 在進一步的實施態樣中，在此雙特異性抗體中，能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區包含在重鏈及輕鏈中，該重鏈包含該VH區和IgG1重鏈恆定區，及該輕鏈包含該VL區和kappa輕鏈恆定區；且其中能夠結合至人類CD3之該抗原結合區包含在重鏈及輕鏈中，該重鏈包含該VH區及IgG1重鏈恆定區，及該輕鏈包含該VL區及lambda輕鏈恆定區。更佳地，在此雙特異性抗體中，一個IgG1重鏈恆定區係如SEQ ID NO：60中所定義及其他係如SEQ ID NO：61中所定義，且其中該kappa輕鏈恆定區係如SEQ ID NO：63中所定義及該lambda輕鏈恆定區係如SEQ ID NO：64中所定義。應理解的是如SEQ ID NO：60和61中所定義之該IgG1重鏈恆定區可視需要地具有經刪除之末端離胺酸。 依照本發明之非常佳的雙特異性抗體係如實施例章節中所述及使用，且稱為BsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4 -C1-N52S-FEAR。 因此，在較佳的實施態樣中，提供能夠結合人類CD3及人類B7H4之雙特異性抗體，其包含： -   第一重鏈及第一輕鏈，其包含能夠結合至人類CD3之結合區，其中該第一重鏈包含如以SEQ ID NO：17所定義之重鏈可變區和如本文所定義之人類IgG1重鏈恆定區，且其中該第一輕鏈包含如以SEQ ID NO：22所定義之輕鏈可變區和人類lamba輕鏈恆定區；及 -   第二重鏈及第二輕鏈，其包含能夠結合至人類B7H4之結合區，其中該第二重鏈包含如以SEQ ID NO：29所定義之重鏈可變區和如本文所定義之人類IgG1重鏈恆定區，且其中該第二輕鏈包含如以SEQ ID NO：33所定義之輕鏈可變區和人類kappa輕鏈恆定區。 應理解的是如本文所定義之人類IgG1重鏈恆定區可涵蓋如本文所定義之取代(例如FEAR/FEAL)或類似者。亦應理解的是人類IgG1重鏈恆定區可具有經刪除之其末端離胺酸(K)。 在進一步較佳的實施態樣中，提供能夠結合人類CD3及人類B7H4之雙特異性抗體，其包含： -   第一重鏈及第一輕鏈，其包含能夠結合至人類CD3之結合區，其中該第一重鏈包含如以SEQ ID NO：17所定義之重鏈可變區和如以SEQ ID NO：60所定義之重鏈恆定區，且其中該第一輕鏈包含如以SEQ ID NO：22所定義之輕鏈可變區和如以SEQ ID NO：64所定義之輕鏈恆定區；且 -   第二重鏈及第二輕鏈，其包含能夠結合至人類B7H4之結合區，其中該第二重鏈包含如以SEQ ID NO：29所定義之重鏈可變區和如以SEQ ID NO：61所定義之重鏈恆定區，且其中該第二輕鏈包含如以SEQ ID NO：33所定義之輕鏈可變區和如以SEQ ID NO：63所定義之輕鏈恆定區。 同樣地，應理解的是人類IgG1重鏈恆定區可具有經刪除之其末端離胺酸(K)。 在又另一進一步較佳的實施態樣中，提供能夠結合人類CD3及人類B7H4之雙特異性抗體，其包含： -   第一重鏈及第一輕鏈，其包含能夠結合至人類CD3之結合區，其中該第一重鏈係由如以SEQ ID NO：17所定義之重鏈可變區和如以SEQ ID NO：60所定義之重鏈恆定區所組成，且其中該第一輕鏈係由如以SEQ ID NO：22所定義之輕鏈可變區和如以SEQ ID NO：64所定義之輕鏈恆定區所組成；且 -   第二重鏈及第二輕鏈，其包含能夠結合至人類B7H4之結合區，其中該第二重鏈係由如以SEQ ID NO：29所定義之重鏈可變區和如以SEQ ID NO：61所定義之重鏈恆定區所組成，且其中該第二輕鏈係由如以SEQ ID NO：33所定義之輕鏈可變區和如以SEQ ID NO：63所定義之輕鏈恆定區所組成。 在另一進一步較佳的實施態樣中，提供能夠結合人類CD3及人類B7H4之雙特異性抗體，其包含： -   第一重鏈及第一輕鏈，其包含能夠結合至人類CD3之結合區，其中該第一重鏈係由如以SEQ ID NO：17所定義之重鏈可變區和具有經刪除之末端離胺酸(K)的如以SEQ ID NO：60所定義之重鏈恆定區所組成，且其中該第一輕鏈係由如以SEQ ID NO：22所定義之輕鏈可變區和如以SEQ ID NO：64所定義之輕鏈恆定區所組成；且 -   第二重鏈及第二輕鏈，其包含能夠結合至人類B7H4之結合區，其中該第二重鏈係由如以SEQ ID NO：29所定義之重鏈可變區和具有經刪除之末端離胺酸(K)的如以SEQ ID NO：61所定義之重鏈恆定區，且其中該第二輕鏈係由如以SEQ ID NO：33所定義之輕鏈可變區和如以SEQ ID NO：63所定義之輕鏈恆定區所組成。 製備雙特異性抗體之方法 可使用傳統方法(諸如雜交融合瘤)及化學共軛方法(Marvin和Zhu (2005) Acta Pharmacol Sin 26:649)製備本發明之雙特異性抗體。由不同的重鏈及輕鏈所組成的兩種抗體在宿主細胞中的共表現導致除了所欲雙特異性抗體以外，亦導致可能的抗體產物之混合物，其接著可以例如親和性層析術或類似方法單離。 亦可使用在不同的抗體構築體共表現後有利於形成功能性雙特異性產物之策略，例如由Lindhofer等人之(1995 J Immunol 155:219)所述之方法。生產不同抗體的大鼠和小鼠融合瘤之融合導致數量有限的異二聚合蛋白質，因為經優先物種限制之重鏈/輕鏈配對。促進異二聚體超越同二聚體形成之另一策略為「旋鈕入孔」策略，其中在第一重鏈多肽上引入突起及在第二重鏈多肽中引入對應的空腔，使得突起可位於該兩個重鏈界面之空腔中，以促進異二聚體形成且阻礙同二聚體形成。「突起」係藉由以較大的側鏈置換來自第一多肽界面之小胺基酸側鏈來構建。與突起相同或類似大小的補償「空腔」係藉由以較小的胺基酸側鏈置換大胺基酸側鏈而在第二多肽界面中創建(美國專利5,731,168)。EP1870459 (Chugai)和WO2009089004 (Amgen)說明不同的抗體結構域在宿主細胞中共表現後有利於形成異二聚體之其他策略。在該等方法中，構成兩個CH3結構域中的CH3-CH3界面之一或多個殘基係經帶電胺基酸置換，使得在靜電上不利於同二聚體形成，而在靜電上有利於異二聚體形成。WO2007110205 (Merck)說明又另一策略，其中利用在IgA與IgG CH3結構域之間的差異性促進異二聚合。 生產雙特異性抗體之另一試管內方法已說明於WO2008119353 (Genmab)中，其中雙特異性抗體係藉由在還原條件下培育後在兩種單特異性IgG4樣或IgG4樣抗體之間的「Fab臂」或「半分子」交換(重鏈與附著之輕鏈交換)來形成。所得產物為具有兩個可包含不同序列的Fab臂之雙特異性抗體。 用於製備本發明之雙特異性CD3xB7H4抗體之較佳方法包括在WO2011131746和WO13060867 (Genmab)中所述之方法，其包含以下步驟： a) 提供包含Fc區之第一抗體，該Fc區包含第一CH3區； b) 提供包含第二Fc區之第二抗體，該Fc區包含第二CH3區，其中第一抗體為CD3抗體及第二抗體為B7H4抗體，或反之亦然； 其中該第一和第二CH3區之序列不同，且使得該第一與第二CH3區之間的異二聚合交互作用比該第一和第二CH3區各自的同二聚合交互作用強； c) 將該第一抗體與該第二抗體一起在還原條件下培育；且 d) 獲得該雙特異性CD3xB7H4抗體。 在一個實施態樣中，該第一抗體與該第二抗體一起在足以容許在鉸鏈區中的半胱胺酸經歷雙硫鍵異構化之還原條件下培育，其中在所得異二聚合抗體中的該第一與第二抗體之間的異二聚合交互作用使得在37℃下24小時後於0.5 mM GSH下不發生Fab臂交換。 不受理論的限制，在步驟c)中，將親本抗體之鉸鏈區中的重鏈雙硫鍵還原，且所得半胱胺酸接著能夠與另一親本抗體分子(最初具有不同的特異性)之半胱胺酸殘基形成重鏈間雙硫鍵。在此方法的一個實施態樣中，在步驟c)中的還原條件包含添加還原劑，例如選自由下列所組成的群組之還原劑：2-巰乙胺(2-MEA)、二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(dithioerythritol)(DTE)、麩胱甘肽、參(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱胺酸和β-巰乙醇，較佳為選自由下列所組成的群組之還原劑：2-巰乙胺、二硫蘇糖醇和參(2-羧乙基)膦。在進一步的實施態樣中，步驟c)包含將條件恢復成為非還原或低還原，例如藉由移除還原劑，例如藉由脫鹽。 本文所述之CD3及B7H4 抗體中任一者可用於此方法。在特別的實施態樣中，可分別選擇CD3及B7H4抗體，以便於獲得如本文所述之雙特異性CD3xB7H4抗體。 在此方法的一個實施態樣中，該第一及/或第二抗體為全長抗體。 第一和第二抗體之Fc區可為任何同型，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在此方法的一個實施態樣中，該第一和該第二抗體兩者之Fc區為IgG1同型。在另一實施態樣中，該抗體之Fc區中之一者為IgG1同型及其他為IgG4同型。在後者的實施態樣中，所得雙特異性抗體包含IgG1之Fc區及IgG4之Fc區，且可能因此具有關於效應子功能活化之關心的中間性質。 在進一步的實施態樣中，抗體起始蛋白質中之一者已經工程化而不結合蛋白質A，因此容許藉由使產物通過蛋白質A管柱而使異二聚合蛋白質與該同二聚合起始蛋白質單離。 如上述，同二聚合起始抗體的第一和第二CH3區之序列不同，且使得該第一與第二CH3區之間的異二聚合交互作用比該第一和第二CH3區各自的同二聚合交互作用強。有關該等交互作用及可如何達成的更多細節提供於WO2011131746和WO2013060867 (Genmab)中，將該等特此併入以供參考。 穩定的雙特異性CD3xB7H4抗體可特別地使用本發明之上述方法而以高產量獲得，該獲得係以兩種分別結合CD3及B7H4且於CH3區中僅含有很少的相當保守型不對稱突變之同二聚合起始抗體為基礎。不對稱突變意指該第一和第二CH3區之序列含有在不同位置上的胺基酸取代。 本發明之雙特異性抗體亦可藉由編碼單細胞中的第一和第二多肽之構築體的共表現來獲得。 因此，在進一步的態樣中，本發明關於生產雙特異性抗體之方法，該方法包含以下步驟： a) 提供第一核酸構築體，其編碼包含第一抗體重鏈之第一Fc區和第一抗原結合區的第一多肽，該第一Fc區包含第一CH3區， b) 提供第二核酸構築體，其編碼包含第二抗體重鏈之第二Fc區和第二抗原結合區的第二多肽，該第二Fc區包含第二CH3區， 其中第一和第二CH3區之序列不同，且使得該第一與第二CH3區之間的異二聚合交互作用比該第一和第二CH3區各自的同二聚合交互作用強，且其中該第一同二聚合蛋白質在位置409上具有除了Lys、Leu或Met以外的胺基酸及該第二同二聚合蛋白質在選自由下列所組成的群組之位置上具有胺基酸取代：366、368、370、399、405和407， 其中該第一和第二核酸構築體視需要地編碼該第一和第二抗體之輕鏈序列， c) 共表現在宿主細胞中的該第一和第二核酸構築體，且 d) 自細胞培養物獲得該異二聚合蛋白質。 因此，本發明亦關於重組真核或原核宿主細胞，其生產本發明之雙特異性抗體。 用生產抗體之適合的表現載體(包括啟動子、增強子等)及適合的宿主細胞為本技術中所熟知。宿主細胞的實例包括酵母、細菌和哺乳動物細胞，諸如CHO或HEK細胞。 在實施態樣中，提供用於生產依照本發明能夠結合至B7H4及CD3兩者之抗體之方法，其包含以下步驟： a) 提供能夠結合至B7H4之抗體，該抗體包含如本文所定義之能夠結合至B7H4之抗原結合區； b) 提供能夠結合至CD3之抗體，該抗體包含如本文所定義之能夠結合至CD3之抗原結合區； c) 將能夠結合至B7H4之該抗體與能夠結合至CD3之該抗體一起在足以容許鉸鏈區中的半胱胺酸經歷雙硫鍵異構化之還原條件下培育，且 d) 獲得能夠結合至B7H4及CD3之該抗體。 在此等方法中，提供能夠結合至B7H4及/或CD3之抗體的步驟可包含以下步驟： - 提供用於生產該抗體或該抗體類的包含表現載體之細胞；及 - 容許細胞生產該抗體或該抗體類，且隨後， - 獲得該抗體或該抗體類，從而提供該抗體或該抗體類。 此外，本發明提供 a) 編碼如本文所定義之能夠結合至B7H4之抗原結合區的重鏈序列之核酸序列，及/或 b) 編碼能夠結合至B7H4之抗原結合區的對應輕鏈序列之核酸序列。 本發明此外提供一或多種核酸類，其包含： a) 編碼如本文所定義之能夠結合至B7H4之抗原結合區的重鏈序列之核酸序列， b) 編碼能夠結合至B7H4之該抗原結合區的對應輕鏈序列之核酸序列， c) 編碼如本文所定義之能夠結合至CD3之抗原結合區的重鏈序列之核酸序列；及 d) 編碼能夠結合至CD3之該抗原結合區的對應輕鏈序列之核酸序列。 如本文所定義之核酸或一或多種核酸類可為RNA或DNA。如本文所定義之核酸或一或多種核酸類可用於表現於哺乳動物細胞中。因此，本發明此外提供包含如本文所定義之核酸或包含如本文所定義之一或多種核酸類的細胞或細胞類。 在本發明之上下文中，核酸可為表現載體，其可為任何適合的載體，包括染色體、非染色體和合成核酸載體(包含一組適合的表現控制元件之核酸序列)。此等載體的實例包括SV40之衍生物、細菌質體、噬菌體DNA、桿狀病毒、酵母質體、衍生自質體與噬菌體DNA之組合的載體和病毒核酸(RNA或DNA)載體。在一個實施態樣中，編碼B7H4或CD3抗體之核酸包含在裸DNA或RNA載體中，包括例如線性表現元件(如在例如Sykes和Johnston之Nat Biotech 17, 355 59 (1997)中所述)、緊密核酸載體(如在例如US 6,077,835及/或WO 00/70087中所述)、質體載體，諸如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119，尺寸最小的「微型(midge)」核酸載體(如在例如Schakowski等人之Mol Ther 3, 793 800 (2001)中所述)或經沉澱之核酸載體構築體，諸如經CaP04沉澱之構築體(如在例如WO200046147；Benvenisty和Reshef之PNAS USA 83, 9551 55 (1986)；Wigler等人之Cell 14, 725 (1978)；及Coraro和Pearson之Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)中所述)。此等核酸載體及其用途為本技術中所熟知(參見例如US 5,589,466和US 5,973,972)。 在一個實施態樣中，載體適合於細菌細胞中的B7H4抗體及/或CD3抗體表現。此等載體的實例包括表現載體(諸如BlueScript (Stratagene))、pIN載體(Van Heeke & Schuster之J Biol Chem 264, 5503 5509 (1989))、pET載體(Novagen, Madison WI)及類似者。 表現載體亦可為或可替代為適合於酵母系統中表現之載體。可使用適合於酵母系統中表現之任何載體。適合的載體包括例如包含組成型或可誘導型啟動子(諸如α因子、醇氧化酶和PGH)之載體(綜述於：F. Ausubel等人編輯之Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987)，及Grant等人之Methods in Enzymol 153, 516 544 (1987))。 核酸及/或表現載體亦可包含編碼分泌/定位序列之核酸序列，其可靶向多肽(諸如新生多肽鏈)至周質空間或細胞培養基中。此等序列為本技術中已知，且包括分泌前導序列或訊息肽。核酸及/或表現載體可包含促成核酸表現(亦即轉錄及/或轉譯)之任何適合的元件，使得(雙特異性)抗體之組分表現。核酸及/或載體係與任何適合的啟動子、增強子及其他促成表現之元件締合。此等元件的實例包括強表現啟動子(例如人類CMV IE啟動子/增強子，以及RSV、SV40、SL3 3、MMTV和HIV LTR啟動子)、有效的poly (A)終止序列、質體產物於大腸桿菌中的複製起點、作為可選標誌的抗生素抗性基因及/或方便的選殖位點(例如聚連結子)。核酸亦可包含可誘導型啟動子，其與組成型啟動子(諸如CMV IE)相反。 在一個實施態樣中，編碼B7H4及/或CD3抗體之表現載體可定位在細胞中及/或遞送至細胞。因此，在進一步的態樣中，本發明關於包含如本文所定義之核酸或載體的宿主細胞。細胞可為人類起源，諸如人類胚胎腎(HEK)細胞，諸如HEK/Expi細胞，或可為囓齒動物起源，諸如中國倉鼠卵巢細胞，諸如CHO/N50細胞。 組成物及(醫療)用途 此外，本發明提供包含如本文所定義之抗體的組成物。此組成物較佳為醫藥組成物，亦即抗體包含在醫藥上可接受的載劑中。本發明之醫藥組成物可含有靶向B7H4及CD3兩者的本發明之雙特異性抗體。醫藥組成物亦可包含靶向B7H4之抗體。醫藥組成物亦可包含抗體之組合，包括靶向B7H4之抗體及/或依照本發明之雙特異性抗體。 醫藥組成物可依照習知的技術調配，諸如那些在Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995中所揭示之技術。本發明之醫藥組成物可例如包括稀釋劑、填充劑、鹽類、緩衝劑、清潔劑(例如非離子性清潔劑，諸如Tween-20或Tween-80)、穩定劑(例如糖或無蛋白質胺基酸)、保存劑、組織固定劑、增溶劑及/或適合於包括在醫藥組成物中的其他材料。 依照本發明之抗體、組成物或醫藥組成物較佳地用作為藥劑。依照本發明之抗體、組成物或醫藥組成物較佳地用於治療疾病。本發明之雙特異性抗體可用於許多目的。本發明之雙特異性抗體可特別地用於治療各種形式的癌症，包括轉移性癌症和難治性癌症。癌症較佳地可為實性腫瘤類型。 根據本發明之雙特異性抗體可特別地用於希望特異性靶向表現B7H4之細胞及經T細胞媒介之該細胞毒殺的治療設定。 在一個實施態樣中，本發明提供治療個體的癌症之方法，該方法包含投予治療有效量的本發明之雙特異性B7H4xCD3抗體。在進一步的實施態樣中，本發明提供治療個體中涉及表現B7H4之細胞的疾患之方法，該方法包含投予治療有效量的本發明之雙特異性抗體。 在另一實施態樣中，本發明提供治療個體的癌症之方法，該方法包含投予治療有效量的本發明之抗體，其能夠結合至人類B7H4。在進一步的實施態樣中，本發明提供治療個體中涉及表現B7H4之細胞的疾患之方法，該方法包含投予治療有效量的本發明之單特異性抗體，其能夠結合至人類B7H4。 如所述，可依照本發明之方法及用途考慮的適合疾病為癌症。該癌症最佳地以B7H4表現為特徵。在癌症中的B7H4表現可使用本技術中已知的方法容易地測定，諸如PCR、免疫染色或FACS分析，亦即檢測B7H4轉錄本及/或蛋白質之表現。如本文所述的能夠結合至人類B7H4之抗體可用於例如免疫染色及/或FACS分析或類似分析中。 可表現B7H4之癌症包括乳癌、子宮癌/子宮內膜癌、子宮癌肉瘤、卵巢癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌(鱗狀細胞癌和腺癌)、頭與頸鱗狀細胞癌、膀胱癌、食管癌、膽管癌、胰臟癌、胃癌、腎臟癌和前列腺癌。 可表現B7H4之癌症包括癌症，諸如胃癌、膽管癌、膀胱癌、非小細胞肺癌(特別為鱗狀NSCLC)、胰臟癌、子宮頸癌、頭與頸癌、乳癌(包括三重陰性乳癌)、卵巢癌和子宮癌。可能較佳的癌症類型係選自子宮癌肉瘤(UCS)、膀胱泌尿上皮癌(BLCA)、胰腺癌(PAAD)、肺鱗狀細胞癌(LUSC)、侵襲性乳癌(BRCA)、子宮體子宮內膜癌(UCEC)、卵巢漿液囊腺癌(OV)和膽管癌(CHOL)之癌症。 在進一步的實施態樣中，可使經診斷患有癌症的患者接受癌細胞中的B7H4表現之評定，且當檢測出B7H4時，其可能在低至高的範圍內，可選擇此患者以依照本發明之抗體治療。可使經診斷患有胃癌、膽管癌、膀胱癌、非小細胞肺癌(特別為鱗狀NSCLC)、胰臟癌、子宮頸癌、頭與頸癌、乳癌(包括三重陰性乳癌)、卵巢癌或子宮癌的患者接受此試驗。在進一步的實施態樣中，可使經診斷患有子宮癌肉瘤(UCS)、膀胱泌尿上皮癌(BLCA)、胰腺癌(PAAD)、肺鱗狀細胞癌(LUSC)、侵襲性乳癌(BRCA)、子宮體子宮內膜癌(UCEC)、卵巢漿液囊腺癌(OV)或膽管癌(CHOL)的患者接受此試驗。然而，在選擇治療的患者時可能未必需要包括此評定。    套組  　　本發明進一步提供包含如上文所揭示之抗體的配件套組，諸如用作為伴隨診斷/用於鑑定在患者群體內對如上文所定義之抗體或如上文所定義之免疫共軛體或抗體-藥物共軛體(ADC)的治療具有反應傾向的那些患者，或用於預測該抗體或免疫共軛體或ADC在用於治療患者時的效力或抗腫瘤活性之套組，套組包含如上文所定義之抗體；及使用該套組之用法說明。 配件套組(諸如用作為伴隨診斷/用於鑑定在患者群體內對如請求項1至55中任一項所定義之抗體的治療具有反應傾向的那些患者之套組)包含如請求項1至55中任一項所定義之抗體；及使用該套組之用法說明。 因此，在一個態樣中，本發明關於包含如本文所定義之雙特異性CD3xB7H4抗體或如本文所定義之B7H4抗體的診斷組成物及其用途。 在另一態樣中，本發明關於用於檢測在源自患者的樣品中表現CD3之細胞與表現B7H4之細胞之間的交聯之套組，其包含 i) 根據如本文所揭示之實施態樣中任一者之雙特異性抗體；及 ii) 使用該套組之用法說明。 在一個實施態樣中，本發明提供用於癌症診斷之套組，其包含容器，該容器包含雙特異性CD3xB7H4抗體及用於檢測表現B7H4之細胞與表現CD3之細胞的交聯之一或多種試劑。試劑可包括例如螢光標籤、酶標籤或其他可檢測標籤。試劑亦可包括二級或三級抗體或用於酶反應之試劑，其中酶反應產生可目測之產物。 在進一步的態樣中，本發明關於用於檢測在投予根據如本文所揭示之實施態樣中任一者之雙特異性抗體後在源自患者的樣品中表現CD3之細胞與表現B7H4之細胞之間是否發生的交聯之方法，其包含以下步驟： (i) 將樣品與根據如本文所揭示之實施態樣中任一者之雙特異性抗體在容許該雙特異性抗體與表現CD3之細胞及表現B7H4之細胞之間形成複合物的條件下接觸；及 (ii)分析是否已形成複合物。 本發明係以下列的實施例進一步例證，不應將其解釋為限制本發明之範圍。 實施例1 - B7H4抗體的產生及篩選材料 B7H4構築體之表現 產生編碼各種全長B7H4變異體之構築體：人類(智人) B7H4 (Uniprot登錄號Q7Z7D3)、食蟹猴(食蟹獼猴) B7H4轉錄本1 (Uniprot登錄號A0A2K5U6P5)、狗(家犬) B7H4 (Uniprot登錄號 F1P8R9)、兔(穴兔) B7H4 (Uniprot登錄號G1TQE8)、大鼠(褐鼠) B7H4 (Uniprot登錄號Q501W4)、小鼠(家鼷鼠) B7H4 (Uniprot登錄號Q7TSP5)及豬(野豬) B7H4 (Uniprot登錄號F1SAY4)(參見表1)。 另外，產生與具有C端His標籤和C標籤之人類IgG1 Fc結構域(B7H4ECD-FcHisC)(SEQ ID NO：12)融合之細胞外結構域(人類B7H4之ECD (來自Uniprot登錄號Q7Z7D3之aa 25至259))之構築體。在SEQ ID NO：1中，胺基酸殘基1至24為訊息肽；因此，成熟B7H4ECD-FcHisC蛋白質係對應於SEQ ID NO：1之胺基酸殘基25至259。 構築體含有適合於選殖之限制位點及最適化科扎克(GCCGCCACC)序列(Kozak, M.之Gene 1999;234(2):187-208)。將B7H4構築體之全長及ECD選殖至pSB中，其為含有以CMV啟動子及HSV-TK polyA訊息所組成的表現卡匣為側翼之睡美人(Sleeping Beauty)反向末端重複的哺乳動物表現載體。 產生瞬時表現全長B7H4變異體之HEK-293F細胞株 FreestyleTM 293-F (適合於懸浮生長及經化學定義之Freestyle培養基之HEK-293次選殖株[HEK-293F])細胞係自Invitrogen (目錄號R790-07)獲得且使用293fectin (Invitrogen，目錄號12347-019)根據製造商的用法說明以上述之構築體轉染。 純化經His標籤化之B7H4 B7H4ECD-FcHisC係使用Expi293F表現平臺(Thermo Fisher Scientific，Waltham, MA, USA，目錄號A14527)表現，基本上如製造商所述。 His標籤能夠以經固定之金屬親和性層析術Ni-NTA純化。經His標籤化之蛋白質強力結合至管柱材料，而與經His標籤化之蛋白質相比，在培養物上清液中的其他蛋白質未結合或弱結合且洗提在流出液中。清洗管柱以移除弱結合之蛋白質。接著將強力結合的經His標籤化之蛋白質以與His競爭與Ni2+ 結合的含有咪唑之緩衝液洗提。洗提液係藉由在脫鹽管柱上的緩衝液交換而移除。 免疫 將OmniRat®動物(表現具有完全人類個體遺傳型的多樣化免疫圖譜之基因轉殖大鼠；Ligand Pharmaceuticals Inc.，San Diego, USA)免疫，該免疫係藉由在兩條後腿的踝關節以皮下注射(每週兩次經7週)等體積的佐劑(Sigma adjuvant system (Sigma-Aldrich，St. Louis, MO, USA，目錄號S6322)或CFA，完全弗羅因德(Freund)佐劑(第1次注射)及IFA，非完全弗羅因德佐劑(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA，目錄號F5881/F5506)(後續注射)混合之PBS中的50 μg之B7H4ECD-FcHisC，隨後以沒有佐劑之PBS中的抗原進行最後加強的皮下注射。 抗體產生 在最後的加強注射後3天，將來自免疫動物之淋巴結細胞根據標準程序與小鼠骨髓瘤SP2.0細胞融合。萃取自生產B7H4特異性抗體之融合瘤的RNA，且5’-RACE-互補DNA (cDNA)係自總共100 ng之RNA使用SMART RACE cDNA擴增套組(Clontech)根據製造商的用法說明製備。VH及VL編碼區係以PCR擴增且以接合非依賴性選殖(Aslanidis, C.和P.J. de Jong之Nucleic Acids Res 1990; 18(20): 6069-74)在框架中直接選殖至p33G1f、p33Kappa及p33Lambda表現載體中(分別具有密碼子最適化之人類IgG1m(f)、Kappa及Lambda恆定結構域之pcDNA3.3系載體)。將來自該等表現載體之可變結構域定序且將CDR根據IMGT定義註釋(Lefranc MP.等人之Nucleic Acids Research, 27, 209-212, 1999；及Brochet X.之Nucl. Acids Res. 36, W503-508 (2008))。表現具有正確的開讀框(ORF)之選殖株且測試其與抗原之結合。在執行抗原特異性篩選檢定後，重鏈及輕鏈可變區之序列係經基因合成且選殖至包括含有下列胺基酸突變的人類IgG1重鏈之表現載體中：L234F、L235E、D265A和K409R (FEAR)，其中胺基酸位置號碼係根據Eu編號(對應於SEQ ID NO 60)，及至包括人類kappa或lambd輕鏈之表現載體中。對於一些抗體，產生在可變結構域中具有點突變之變異體以移除半胱胺酸殘基，其可能潛在地產生非所欲雙硫鍵形成，或置換天冬醯胺酸成為絲胺酸或種系殘基以移除潛在的經N連結之糖化位點。例如，自C1重鏈及輕鏈可變區序列製得對應於CDR2中的取代之具N52S取代的變異體(參考表1，SEQ ID NO：25和29)，且另外的變異體可具有N52Q取代(SEQ ID NO：31)。 抗原特異性篩選檢定 在免疫動物血清或融合瘤及轉染瘤培養物上清液中存在的B7H4抗體係以均質結合檢定法測定。分析樣品對於抗體與經構築體瞬時轉染之HEK-293F細胞(達成表現全長B7H4變異體，其表現人類B7H4、食蟹猴B7H4或鼠科B7H4)之結合，或與HEK-293F野生型細胞(陰性對照組)之結合。將樣品添加至細胞中以容許抗體結合至B7H4。隨後使用適當的螢光共軛體(AffiniPure山羊抗大鼠IgG (H+L) Alexa Fluor® 647；Jackson ImmunoResearch，目錄號112-605-143；AffiniPure山羊抗人類IgG Fcγ-Alexa Fluor® 647；Jackson ImmunoResearch，目錄號109-605-098)檢測抗體結合。將細胞(2.5 x 105 個細胞/ml)與山羊抗人類AffiniPure山羊抗人類IgG Fcγ-Alexa Fluor® 647 (0.2 µg/ml；Jackson ImmunoResearch Laboratories，109-605-098)或AffiniPure山羊抗大鼠IgG (H+L) Alexa Fluor® 647 (0.2 µg/ml；Jackson ImmunoResearch，112-605-143)混合，取決於抗體的骨架而定。製備一系列的試驗及對照抗體稀釋液(以2倍稀釋步驟的0.003至3 µg/mL之範圍)，且將2 µl抗體稀釋液添加至1536孔盤(Greiner，目錄號789866)中的5 µl細胞/共軛體混合物中。將盤在室溫下培育9小時，且隨後使用ImageXpress Velos雷射掃描細胞儀(Molecular Devices, LLC，Sunnyvale, CA, USA)測定螢光強度及使用總螢光作為讀數。當計數高於50且計數x螢光比陰性對照組高至少三倍時，則聲稱樣品為陽性。 自B7H4抗體小組產生的結果 自所得的193個融合瘤中之176個成功地獲得重鏈及輕鏈可變區序列。在所測試的351種重鏈/輕鏈組合之中，98種在使用如上述經人類B7H4轉染之HEK-293F細胞之抗原篩選檢定中顯示出結合。選擇35種抗體：26種具有原始序列及9種變異體具有引入可變結構域中的點突變。生產作為單價結合抗體(作為CD3雙特異性抗體)及雙價結合抗體(作為IgG1分子)之抗體且測試與腫瘤細胞之結合，如下述。在來自所產生的小組之抗體中，僅抗體B7H4-C1及其變異體B7H4-C1-N52S (將其對應的VH及VL抗體可變結構域編碼序列列於表1中)提供與腫瘤細胞結合之抗體，如下述。 另外的B7H4抗體 在實施例中，使用對B7H4具有特異性的另外抗體，其含有先前在下列中所述之可變結構域：WO2014159835 (在本文稱為SEQ ID NO：38和35)，在本文對應於B7H4-C2，可變結構域之相關序列列於本文的表1中且包括 SEQ ID NO：43和47；WO2014159835 (在本文稱為SEQ ID NO：56和55)，在本文對應於B7H4-C3，可變結構域之相關序列列於本文的表1中且包括SEQ ID NO：36和40；WO2009073533 (在本文稱為SEQ ID No：2和7)，在本文對應於B7H4-C4，且可變結構域之相關序列列於本文的表1中且包括SEQ ID NO：50和54；及US20190085080A1，在本文對應於B7H4-C5，且可變結構域之相關序列列於本文的表1中且包括SEQ ID NO：65和69。對應的VH及VL抗體可變結構域編碼序列經合成且選殖至具有密碼子最適化之人類IgG1m(f)和Kappa或Lambda恆定結構域之pcDNA3.3系載體或其變異體中，以生產單特異性及雙特異性抗體。當述及抗體IgG1-B7H4-CX-FEAL時，這代表具有B7H4-CX可變區、屬於IgG1同型及在重鏈之恆定區中具有胺基酸取代L234F、L235E、D265A 和 F409R之抗體。 IgG1-b12抗體 抗體b12，HIV-1 gp120特異性抗體(Barbas, CF.之J Mol Biol. 1993 Apr 5; 230(3):812-23)係於一些實施例中用作為陰性對照IgG1或用作為對照雙特異性之非結合對照Fab臂。此對照抗體的密碼子最適化之抗體編碼序列經合成且選殖至具有密碼子最適化之人類IgG1m(f)和Kappa恆定結構域之pcDNA3.3系載體或其變異體中。可變重鏈(VH)區之序列及可變輕鏈(VL)區之序列在本文分別包括在SEQ ID NO：14和15中。 實施例2 - 用於產生CD3xB7H4雙特異性抗體之人源化 CD3抗體 人源化抗體IgG1-huCD3-H1L1 (其可變重鏈及輕鏈區序列在本文列於SEQ ID NO：16和22中)之產生說明於WO2015/001085的實施例1中。IgG1-huCD3-H1L1在本文稱為「IgG1-huCD3」。抗體IgG1-huCD3-H1L1-FEAL為其變異體，除了具有容許通過受控之Fab臂交換以產生雙特異性抗體之胺基酸取代(F405L)以外，亦在Fc結構域中具有三個胺基酸取代(L234F、L235E、D265A)，如本文以下所述。已顯示此等突變對引入彼等的抗體之標靶結合沒有影響(參見例如US 2015/0337049及Engelberts等人之2020, EBioMedicine 52: 102625)。 人源化抗體IgG1-huCD3-H1L1-H101G (其可變重鏈及輕鏈區序列在本文列於SEQ ID NO：17和22中)之產生說明於WO2017/009442的實施例2中。IgG1-huCD3-H1L1-H101G稱為「IgG1-huCD3-H101G」。此變異體包含在可變重鏈區序列中的取代H101G (與SEQ ID NO：16和17相比)且具有與IgG1-huCD3-H1L1相同的輕鏈。抗體IgG1-huCD3-H101G-FEAL為具有胺基酸取代L234F、L235E、D265A和F405L之其變異體。 實施例3 - 使用生物膜干涉法之B7H4結合親和性測定 B7H4抗體之標靶結合親和性係在Octet HTX儀器(FortéBio)上以無標記生物膜干涉法(BLI)測定。實驗係同時在1,000 RPM及30℃下以搖動進行。IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR、IgG1-B7H4-C2-FEAR、IgG1-B7H4-C3-FEAR及IgG1-B7H4-C4-FEAR對人類及小鼠B7H4之親和性最初係使用BLI測定。抗人類IgG Fc捕獲(AHC)生物感測器(FortéBio，目錄號18-5060)係藉由暴露於10 mM甘胺酸(Sigma-Aldrich，目錄號15527)緩衝液(pH 1.7)中5 s，隨後在樣品稀釋液中(FortéBio，目錄號18-1048)經5 s中和來預調理；將兩個步驟重複2次。接下來，將AHC感測器以抗體(1 µg/mL於樣品稀釋液中)經600 s裝填。在樣品稀釋液中進行(100 s)基線測量後，人類B7H4 (Sino Biological，目錄號10738-H08H-100)或小鼠B7H4 (R&D Systems，目錄號2154-B7-050)之締合(300 s)及解離(1,000 s)係對人類及小鼠B7H4分別使用在樣品稀釋液中以2倍稀釋步驟的1.56至100 nM (0.04至2.68 µg/mL)及5.9至375 nM (0.16至10 µg/mL)之濃度範圍測定。使用人類B7H4及小鼠B7H4 (作為ECD-His標籤化分子)基於其胺基酸序列的理論分子量(分別為 26.8 kDa及26.6 kDa)進行計算。對於各抗體，使用參考感測器，將其與代替抗原的樣品稀釋液培育。AHC感測器係藉由暴露於10 mM甘胺酸緩衝液pH 1.7中5 s，隨後在樣品稀釋液中經5 s中和而再生；將兩個步驟重複兩次。隨後感測器再以抗體裝填而用於下一循環的動力學測量。 數據係使用數據擷取軟體v9.0.0.49d (FortéBio)擷取且以數據分析軟體v9.0.0.12 (FortéBio)分析。數據追蹤係藉由減去參考感測器來進行每一抗體之校正。Y軸係對準基線的最後10 s，應用對解離之步間校正對準及Savitzky-Golay濾波。將反應＜0.05 nm之數據追蹤自分析排除。數據係以1:1之全面完全擬合模式擬合，使用分別設定為 300 s及200 s之締合及解離時間的有利窗口。 在第二實驗中，IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR、IgG1-B7H4-C2-FEAR、IgG1-B7H4-C3-FEAR、IgG1-B7H4-C4-FEAR及IgG1-B7H4-C5-FEAR對人類及小鼠B7H4之親和性係使用BLI測定。實驗係如上述方式執行，有一些小的例外。將預調理步驟重複5次。人類或小鼠B7H4之締合(200 s)及解離(1,000 s)係使用在樣品稀釋液中以2倍稀釋步驟的0.78至800 nM之濃度範圍測定。數據係使用數據擷取軟體v12.0.1.8 (FortéBio)擷取且以數據分析軟體v12.0.1.2 (FortéBio)分析。數據係以1:1之全面完全擬合模式擬合，使用200 s之締合時間的有利窗口及200 s之解離時間的有利窗口，除了以1,000 s之解離時間用於IgG1-B7H4-C2-FEAR以外。解離時間係基於R2 值、曲線的目視檢查及在解離步驟期間至少5%之信號衰減來選擇。將以抗原濃度高於100 nM所產生的數據追蹤自具有親和性低於50 nM之抗體的分析排除。 另外，對食蟹猴B7H4之親和性係以BLI測定。在第一實驗中，測定bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-FEAR、bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR、bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR、bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C3-FEAR及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C4-FEAR對食蟹猴B7H4之親和性。胺反應性第二代(AR2G)生物感測器(FortéBio，目錄號18-5092)係藉由與20 mM EDC (N-(3-二甲基胺基丙基）-N’-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽)(FortéBio，目錄號18-1033)及10 mM s-NHS (N-羥基磺基琥珀醯亞胺鈉鹽)(FortéBio，目錄號18-1067)反應300 s來活化。將活化之感測器以10 mM乙酸鈉pH 4.0 (FortéBio，目錄號18-1068)中的10 µg/mL經重組hIgG1 Fc-標籤化之食蟹猴B7H4 (Creative BioMart，目錄號VTCN1-1517R)經600 s裝填且以1 M乙醇胺pH 8.5 (FortéBio，目錄號18-1071)經300 s淬滅。在樣品稀釋液中進行基線測量後(300 s；FortéBio，目錄號18-1048)，以CD3xB7H4雙特異性抗體之功能性單價B7H4結合的締合(100 s)及解離(1,000 s)(如表8中所指示)係使用在樣品稀釋液中以2倍稀釋步驟的0.23至15 µg/mL (1.56至100 nM)之濃度範圍測定。使用150 kDa分子量之抗體進行計算。對於各抗體，使用參考感測器，將其與代替抗體的樣品稀釋液培育。 數據係使用數據擷取軟體v9.0.0.49d (FortéBio)擷取且以數據分析軟體v9.0.0.12 (FortéBio)分析。數據追蹤係藉由減去參考感測器來進行每一抗體之校正。Y軸係對準基線的最後10 s，應用對解離之步間校正對準及Savitzky-Golay濾波。將具有反應＜0.05 nm之數據追蹤自分析排除。數據係以1:1之全面完全擬合模式擬合，使用分別設定為100 s及200 s之締合及解離時間的有利窗口。 在測定B7H4抗體對食蟹猴B7H4之親和性的第二實驗中，測定bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR之親和性。實驗係如上述方式執行，有一些小的例外。在樣品稀釋液中進行600 s之基線測量後，以CD3xB7H4雙特異性抗體之功能性單價B7H4結合的締合(200 s)及解離(1,000 s)(如表9中所指示)係使用在樣品稀釋液中以2倍稀釋步驟的約0.1至116 µg/mL (0.78至800 nM)之濃度範圍測定。使用各抗體之特定分子量(約145 kDa)進行計算。數據係使用數據擷取軟體v12 (FortéBio)擷取且以數據分析軟體v12 (FortéBio)分析。將具有反應＜0.03 nm之數據追蹤自分析排除。數據係以1:1之全面完全擬合模式擬合，使用200 s之締合時間及解離時間的有利窗口。解離時間係基於R2 值、曲線的目視檢查及在解離步驟期間至少5%之信號衰減來選擇。將以抗體濃度高於200 nM所產生的數據追蹤自具有親和性低於50 nM之抗體的分析排除。所有的結果係以至少0.98之R2 來測定。 「K D 」(M)係指抗體-抗原交互作用之平衡解離常數且藉由k d 除以k a 而獲得。「k d 」(sec-1 )係指抗體-抗原交互作用之解離速率常數。此有時亦稱為koff 值或解離速率。「k a 」(M-1 x sec-1 )係指抗體-抗原交互作用之締合速率常數。此有時亦稱為k on 值或締合速率。 表4和5顯示第一和第二實驗的結果，其中所指示之抗體對人類B7H4之締合速率常數k a (1/Ms)、解離速率常數k d (1/s)及平衡解離常數K D (M)係以生物膜干涉法測定。 表4. 以無標記生物膜干涉法所測定之抗體對人類B7H4細胞外結構域之結合親和性。ND = 未測定。
Figure 02_image026
表5. 以無標記生物膜干涉法所測定之抗體對人類B7H4細胞外結構域之結合親和性。
Figure 02_image028
1 所顯示的是n=3次實驗的平均結果。 表6和7顯示兩個實驗的結果，其中所指示之抗體對小鼠B7H4之k a (1/Ms)、k d (1/s)及K D (M)係以生物膜干涉法測定。 表6. 以無標記生物膜干涉法所測定之抗體對小鼠B7H4細胞外結構域之結合親和性。ND = 未測定；- = 未結合(在所使用之最高濃度下的反應＜0.05 nm)。
Figure 02_image030
表7. 以無標記生物膜干涉法所測定之抗體對小鼠B7H4細胞外結構域之結合親和性。- = 未結合(在所使用之最高濃度下的反應＜0.05 nm)。
Figure 02_image032
表8和9顯示兩個實驗的結果，其中所指示之抗體對食蟹猴B7H4之k a (1/Ms)、k d (1/s)及K D (M)係以生物膜干涉法測定。 表8. 以無標記生物膜干涉法所測定之功能性單價抗體對食蟹猴B7H4細胞外結構域之結合親和性。
Figure 02_image034
表9. 以無標記生物膜干涉法所測定之功能性單價抗體對食蟹猴B7H4細胞外結構域之結合親和性。
Figure 02_image036
a 所顯示的是n=3次實驗的平均結果。b 不符合0.98之嚴格的質量控制R2 閾值。 實施例4 - 使用生物膜干涉法之CD3結合親和性測定 IgG1-huCD3-FEAL及IgG1-huCD3-H101G-FEAL之結合親和性係如WO2017/009442的實施例7所述方式測定。 簡言之，以IgG1-huCD3-FEAL型式的所選擇之CD3抗體對重組可溶性CD3ε (CD3E27-GSKa)(SEQ ID NO：13之成熟蛋白)之結合親和性係在ForteBio Octet HTX (ForteBio)上使用生物膜干涉法測定。將抗人類Fc捕獲生物感測器(ForteBio，目錄號18-5060)以hIgG (1 μg/mL)經600 s裝填。在基線測量(200 s)後，CD3E27-GSKa之締合(1000 s)及解離(2000 s)係使用以三倍稀釋步驟(樣品稀釋液，ForteBio，目錄號18-5028)的 27.11 µg/mL至0.04 µg/mL (1000 nM至1.4 nM)之CD3E27-GSKa濃度範圍測定。使用CD3E27-GSKa基於胺基酸序列之理論分子量(亦即27.11 kDa)進行計算。實驗係同時在30℃及1000 rpm下以搖動進行。各抗體係以至少兩個獨立的實驗測試。數據係以ForteBio數據分析軟體v8.1分析，使用1000 s之締合時間及100 s之解離時間的1:1之模式及全面完全擬合。數據追蹤係藉由減去參考曲線(在生物感測器上的抗體，僅以樣品稀釋液測量)來校正，Y軸係對準基線的最後10 s，且應用步間校正以及Savitzky-Golay濾波。具有反應＜0.05 nm之數據追蹤自分析排除。 表10顯示以生物膜干涉法所測定之重組CD3ε之締合速率常數k a (1/Ms)、解離速率常數k d (1/s)及平衡解離常數K D (M)。與IgG1-huCD3-H101G-FEAL (K D ：683 nM)相比，IgG1-huCD3-FEAL顯示對重組CD3ε相對高的結合親和性(K D ：15 nM)。 表10：以無標記生物膜干涉法所測定之單特異性、雙價CD3抗體對重組CD3ε之結合親和性。
Figure 02_image038
實施例5 - 以生物膜干涉法所測定之B7H4抗體之交叉阻斷 以經典的夾層型式之抗體交叉阻斷分析(表位分倉)係在Octet HTX儀器(FortéBio)上以BLI執行。以IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR、IgG1-B7H4-C2-FEAR、IgG1-B7H4-C3-FEAR及IgG1-B7H4-C4-FEAR之第一交叉阻斷實驗係同時在1,000 RPM及30℃下以搖動進行。 將胺反應性第二代(AR2G)生物感測器(FortéBio，目錄號18-5092)以20 mM EDC (N-(3-二甲基胺基丙基）-N’-乙基碳二醯亞胺鹽酸鹽)(Sigma-Aldrich，目錄號03449)及10 mM s-NHS (N-羥基磺基琥珀醯亞胺鈉鹽)(Sigma-Aldrich，目錄號56485)之溶液經300 s活化。將活化之AR2G感測器以10 mM乙酸鈉pH 6.0 (FortéBio，目錄號18-1068)中的20 µg/mL之第一抗體經600 s裝填且以1 M乙醇胺pH 8.5 (FortéBio，目錄號18-1071)經300 s淬滅。在樣品稀釋液中進行基線測量後(50 s；FortéBio，目錄號18-1048)，將含有經固定之抗體的AR2G生物感測器以人類B7H4 (在樣品稀釋液中稀釋之100 nM或2.68 µg/mL；Sino Biological，目錄號10738-H08H)經300 s裝填。使用人類B7H4基於胺基酸序列之理論分子量(26.8 kDa)進行計算。測定第二抗體(10 µg/mL於樣品稀釋液中)之締合(300 s)。感測器係藉由暴露於10 mM甘胺酸(Riedel-de Haën，目錄號15527)緩衝液pH 2.5中5 s，隨後在樣品稀釋液中經5 s中和而再生；將兩個步驟重複兩次。隨後以基線步驟開始再使用含有經固定之第一抗體的感測器。 數據係使用數據擷取軟體v9.0.0.49d (FortéBio)擷取且以數據分析HT軟體v10.0.17 (FortéBio)分析。數據追蹤係藉由減去參考曲線(樣品稀釋液代替第二抗體)來校正，以便於校正自經固定之抗體的B7H4解離。Y軸係對準締合步驟的開始且應用Savitzky-Golay濾波。將第二抗體的經校正之締合反應以矩陣格式繪圖。通常反應＞ 0.05 nm被認為是非交叉阻斷抗體，而反應＜0.05 nm被認為是阻斷抗體配對。 交叉阻斷實驗亦以包括IgG1-B7H4-C5-FEAR重複進行且如上述方式執行，稍作修改。實驗係同時在1,000 RPM及22℃下以搖動進行。數據係使用數據擷取軟體v12.0.1.8 (ForteBio)擷取且以數據分析HT軟體v12.0.1.55 (ForteBio)分析。通常反應＞ 0.1 nm被認為是非交叉阻斷抗體，而反應＜0.1 nm被認為是阻斷抗體配對。 初步的交叉阻斷實驗係對抗體IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR、IgG1-B7H4-C3-FEAR、IgG1-B7H4-C4-FEAR及IgG1-B7H4-C2-FEAR來執行。將結果總結於表11中。第二組交叉阻斷實驗亦以包括IgG1-B7H4-C5-FEAR來執行。將該等結果總結於表12中。第一列顯示經固定之抗體；第一行顯示溶液中的抗體(在上文稱為「第二抗體」)。顯示溶液中的抗體經校正之締合反應。抗體之交叉阻斷係以深灰色表示及非阻斷抗體組合未被標記(透明背景)，顯示IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR、IgG1-B7H4-C3-FEAR及IgG1-B7H4-C5-FEAR相互交叉阻斷，而不與IgG1-B7H4-C4-FEAR及IgG1-B7H4-C2-FEAR交叉阻斷，且反之亦然。 表11：使用生物膜干涉法之第一抗體交叉阻斷實驗 第一列顯示經固定之抗體及第一行顯示溶液中的抗體。顯示溶液中的抗體經校正之締合反應。抗體之交叉阻斷係以深灰色表示，非阻斷抗體組合未被標記(透明背景)。
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表12：使用生物膜干涉法之第二抗體交叉阻斷實驗 第一列顯示經固定之抗體及第一行顯示溶液中的抗體。顯示溶液中的抗體經校正之締合反應。抗體之交叉阻斷係以深灰色表示，非阻斷抗體組合未被標記(透明背景)。
Figure 02_image042
實施例6 - 藉由經2-MEA誘導之Fab臂交換來產生雙特異性抗體 雙特異性抗體係使用DuoBody®平臺技術於試管內產生，亦即如WO2011147986、WO2011131746和WO2013060867 (Genmab)及Labrijn等人(Labrijn等人之PNAS 2013, 110: 5145-50；Gramer等人之MAbs 2013, 5: 962-973)中所述的經2-MEA誘導之Fab臂交換。為了能以此方法產生雙特異性抗體，產生在CH3結構域中攜有特異性點突變之IgG1分子：在一個親本IgG1抗體中的F405L突變(亦即本申請案中的CD3抗體)、在其他親本IgG1抗體中的K409R突變(亦即本申請案中的B7H4或對照組，HIV-1 gp120特異性抗體)。除了該等突變以外，親本IgG1抗體包括取代L234F、L235E、D265A (FEA)。 為了產生雙特異性抗體，將兩種親本抗體以等質量在PBS緩衝液(磷酸鹽緩衝鹽水；8.7 mM HPO4 2- 、1.8 mM H2 PO4 - 、163.9 mM Na+ 、140.3 mM Cl- ，pH 7.4)中混合。將2-巰乙胺-HCl (2-MEA)添加至75 mM之最終濃度且將反應混合物在31℃下培育5 h。將2-MEA使用10 kDa分子量截留Slide-A-Lyzer架(Thermo Fisher Scientific)根據製造商方案透析至PBS緩衝液中而移除，以容許鏈間雙硫鍵再氧化及形成完整的雙特異性抗體。 在實施例中使用以下的抗體： B7H4抗體 IgG1-B7H4-C1-FEAR (具有以SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：33所列之VH及VL序列)。 IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (具有以SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：33所列之VH及VL序列)。 IgG1-B7H4-C2-FEAR (具有以SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：47所列之VH及VL序列)。 IgG1-B7H4-C3-FEAR (具有以SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：40所列之VH及VL序列)。 IgG1-B7H4-C4-FEAR (具有以SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：54所列之VH及VL序列)。 IgG1-B7H4-C5-FEAR (具有以SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：69所列之VH及VL序列)。 註釋IgG1表示製得IgG1同型之全長抗體，及FEAR註釋表示重鏈恆定區含有胺基酸取代L234F、L235E、D265A和K409R，且輕鏈恆定區屬於kappa型(分別為SEQ ID NO：61和63)。 CD3抗體 IgG1-huCD3-FEAL (具有以SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：22所列之VH及VL序列)。 IgG1-huCD3-H101G-FEAL (具有以SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：22所列之VH及VL序列)。 註釋IgG1表示製得IgG1同型之全長抗體，及FEAR註釋表示重鏈恆定區含有胺基酸取代L234F、L235E、D265A和F405L，且輕鏈恆定區屬於lambda型(分別為SEQ ID NO：60和64)。 對照抗體 IgG1-b12-K409R (具有以SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所列之VH及VL序列)。 註釋IgG1表示製得IgG1同型之全長抗體，及K409R註釋表示重鏈恆定區含有胺基酸取代K409R，且輕鏈恆定區屬於kappa型(分別為SEQ ID NO：63和63)。 雙特異性抗體 將上述CD3與B7H4抗體組合以產生雙特異性抗體，具有一個能夠結合人類CD3之抗原結合區及另一個能夠結合B7H4之抗原結合區，提供同型IgG1之雙特異性抗體，將其註釋為bsIgG1。 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-FEAR bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C3-FEAR bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C4-FEAR bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C2-FEAR bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C3-FEAR bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C4-FEAR bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR (關於b12臂，具有以SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所列之VH及VL序列) bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR 實施例7 - 使用B7H4-B7H3嵌合分子及B7H4丙胺酸掃描庫(scanning library)測定涉及結合之B7H4結構域及功能性表位 使用終點分析使用B7H4-B7H3嵌合分子之結構域對映(Domain mapping) B7H4抗體之B7H4結構域特異性係使用一組經轉染以表現人類B7H4、人類B7H3 (在細胞外結構域中具有足夠的胺基酸序列差異之結構上可相比的蛋白質)或兩種不同的人類B7H4-B7H3嵌合分子之細胞測定。製備表現構築體，其編碼人類B7H4、人類B7H3 (Uniprot登錄號Q5ZPR3-1；SEQ ID NO：9)或含有B7H3之IgV結構域和B7H4之IgC結構域的嵌合分子(B7H3-IgV/B7H4-IgC；SEQ ID NO：11)或含有B7H4之IgV結構域和B7H3之IgC結構域的嵌合分子(B7H4-IgV/B7H3-IgC；SEQ ID NO：10)。HEK細胞係經瞬時轉染以表現該等構築體。 將細胞(3x104 個細胞/孔)在聚苯乙烯96孔圓底盤(Greiner bio-one，目錄號650101)中與在50 µL之PBS/0.1%之BSA/0.02%之疊氮化物(FACS緩衝液)中的抗體之系列稀釋液(以3倍稀釋步驟的0.0046至10 µg/mL之範圍)在4℃下培育30 min。在以FACS緩衝液清洗兩次後，將細胞與二級抗體在4℃下培育30 min。使用經R-藻紅素(PE)-共軛之山羊抗人類IgG F(ab’)2 (1：500於染色緩衝液中；Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.，West Grove, PA，目錄號109-116-098)作為二級抗體。接下來，將細胞以FACS緩衝液清洗兩次，再懸浮於20 μL之FACS緩衝液中且在iQue Screener (Intellicyt Corporation, USA)上分析。以10 μg/mL之bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR、bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C4-FEAR、bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C3-FEAR及bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR之結合係由10 μg/mL之以下結合的平均螢光強度(MFI) %測定： • IgG1-B7H3-BRCA84D (如上述所產生之B7H3特異性IgG1抗體，具有如WO2011109400中的抗體BRCA84D所述之CDR序列)結合至表現B7H3之細胞， • bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C4-FEAR結合至表現B7H3-IgV/B7H4-IgC之細胞， • bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR結合至表現B7H4-IgV/B7H3-IgC之細胞， • 及bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C3-FEAR結合至表現B7H4之細胞。 圖1顯示B7H4之IgC結構域涉及bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR及bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C4-FEAR之結合，B7H4之IgC和IgV結構域兩者皆涉及bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C3-FEAR之結合，且B7H4之至少IgV結構域涉及bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR之結合。關於使用可變結構域來創造bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR之C2抗體，已說明其結合至IgV結構域；在圖1中的數據表示IgC結構域亦涉及結合(WO2014159835及Leong等人之2015, Mol. Pharmaceutics 12, 1717-1729)。 使用完全劑量反應曲線分析使用B7H4-B7H3嵌合分子之結構域對映 進行另外的實驗，藉由完全劑量反應曲線之分析而更詳細地研究B7H4抗體之B7H4結構域特異性。在該等實驗中，亦測定bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR之結構域特異性。如上述測定bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR、bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C2-FEAR、bsIgG1-huCD-H101G-FEALxB7H4-C3-FEAR、bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C4-FEAR及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR之系列稀釋液(以3倍稀釋步驟的0.014至30 µg/mL)與經瞬時轉染以表現人類B7H4或B7H4-B7H3嵌合分子B7H3-IgV/B7H4-IgC或B7H4-IgV/B7H3-IgC之HEK細胞之結合。圖2顯示劑量反應曲線，其顯示B7H4之IgC結構域涉及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR之結合，與丙胺酸掃描庫實驗的發現一致。此外，IgV結構域涉及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C2-FEAR、bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C4-FEAR及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR之結合，而IgC和IgV結構域兩者似乎涉及bsIgG1-huCD3-H101GFEALxB7H4-C3-FEAR之結合。 使用B7H4丙胺酸掃描庫測定B7H4胺基酸殘基對B7H4抗體之結合的貢獻 庫設計 合成人類B7H4 (Uniprot Q7Z7D3-1)單一殘基丙胺酸庫(GeneArt)，其中使人類B7H4之細胞外結構域中的所有胺基酸殘基個別地突變成丙胺酸，除了含有丙胺酸或半胱胺酸的位置以外。半胱胺酸未經突變，使抗原之結構破壞的機會降至最低。將庫選殖至含有CMV/TK-polyA表現卡匣、Amp抗性基因和pBR322複製起始序列之pMAC表現載體中。 庫生產及篩選 產生抗體C1-N52S、C2及C3作為具有mNeonGreen標籤之重組單價抗體，如WO2007059782中所述。將野生型B7H4及丙胺酸突變體根據製造商的用法說明個別地表現在FreeStyle HEK293細胞中(Thermo Scientific)。在轉染後一天收穫細胞。將約50,000個細胞與20 µL經mNeoGreen標記之關注抗體培育。將細胞在室溫下培育1小時。隨後添加150 µL之FACS緩衝液且將細胞以FACS緩衝液清洗兩次。將細胞再懸浮於30 µL之新鮮FACS緩衝液中且以流動式細胞測量術使用iQue Screener (Intellicyt Corporation, USA)分析。 整個實驗係以一式兩份執行2次。 數據分析 對每個樣品，每一細胞之平均抗體結合係以未閘控之細胞群的螢光強度之幾何平均值(gMFI)測定。gMFI受到抗體對每一細胞的B7H4突變體之親和性及B7H4突變體之表現水平的影響。因為特異性丙胺酸突變可衝擊突變體B7H4之表面表現水平，且為了校正各B7H4突變體之表現差異，數據通常係使用以下公式對比未交叉阻斷之B7H4特異性參考抗體之結合強度正規化：
Figure 02_image044
其中C2被用作為C1-N52S和C3之參考抗體，及C1-N52S被用作為C2之參考抗體，且其中「aa位置」係指B7H4或野生型(wt) B7H4之特定的ala突變體。 為了表示基於線性差異倍數量度之抗體結合的失去或增加，使用以下計算：
Figure 02_image046
在大多數的例子中，結合增加係由參考抗體與特定的ala突變體之結合失去而引起。 根據該等計算，在胺基酸經丙胺酸置換後，以特定抗體未失去或未增加結合之胺基酸位置給出結果「0」，而增加結合得到「＞0」及失去結合得到「＜0」。為了校正樣品變異，在結合差異倍數小於平均差異倍數-1.5 x SD (其中SD為自特定的試驗抗體之四次獨立實驗所計算之差異倍數的標準偏差)的情況下，僅B7H4胺基酸殘基被認為是「失去結合的突變體」。 若參考抗體對特定的B7H4突變體之gMFI小於平均gMFI - 平均gMFI對照 Ab 的2.5 x SD，則將數據自分析排除(至於那些B7H4突變體，假設為表現水平不足夠)。 圖3顯示B7H4抗體與ECD中具有ala突變之B7H4變異體結合之差異倍數，註釋其中結合之差異倍數小於平均差異倍數-1.5 x SD之胺基酸殘基。差異倍數係於圖3中以Z分數表示。結果表示： • 抗體C1-N52S之結合至少依賴於aa S151、V157、D158、Y159、E164、L166、W173、P175、P177、V179、W181、F199、M208、V210、T222、Y223、V240、E242和I245，彼等係在人類B7H4之IgC結構域中， • 抗體C2之結合至少依賴於aa R98、G99、R116、K118、N119和D124，彼等係在人類B7H4之IgV中，及 • 抗體C3之結合至少依賴於aa N156、E164、V217和R248，彼等係在人類B7H4之IgC結構域中，且 • 抗體C1-N52S、C2及C3識別在B7H4上不同的功能表位。 實施例8 - B7H4單特異性及CD3xB7H4雙特異性抗體與來自各種物種的B7H4之結合 首先，將雙特異性CD3xB7H4抗體及單特異性B7H4抗體與經人類B7H4或經食蟹猴(食蟹獼猴) B7H4瞬時轉染之HEK-293F細胞之結合以流動式細胞測量術分析。未經轉染之HEK-293F細胞被用作為陰性對照組；該等細胞(亦)經確認不表現CD3。 將細胞(3x104 個細胞/孔)在聚苯乙烯96孔圓底盤(Greiner bio-one，目錄號650180)中與100 µL之PBS/0.1%之BSA/0.02%之疊氮化物(染色緩衝液)中的抗體之系列稀釋液(以4倍稀釋步驟的0.000458至30 µg/mL之範圍)在4℃下培育30 min。實驗係以一式兩份的技術執行。在以染色緩衝液清洗兩次後，將細胞在50 µL之二級抗體中於4℃下培育30 min。使用經R-藻紅素(PE)-共軛之山羊抗人類IgG F(ab’)2 (1：500於FACS緩衝液；Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.，West Grove, PA，目錄號109-116-098)作為二級抗體。將細胞以染色緩衝液清洗兩次，再懸浮於含有Topro-3的30 μL之FACS緩衝液(1：10,000稀釋)中且在iQue Screener (Intellicyt Corporation, USA)上分析。結合曲線係使用非線性迴歸(具有可變斜率的S形劑量反應)，使用GraphPad Prism V7.02軟體(GraphPad Software，San Diego, CA, USA)分析。 圖4顯示IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR兩者結合至表現人類B7H4或食蟹猴B7H4之細胞。 接下來，如上述測定與經來自狗、兔、大鼠、小鼠或豬的B7H4瞬時轉染之HEK-293F細胞之結合。圖5顯示IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR以不同程度結合至來自狗、兔、大鼠和小鼠之B7H4；各者的bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR之表觀親和性(EC50)小於IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR。bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR不能夠結合至豬B7H4，而IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR弱結合且僅在最高的抗體測試濃度下結合。 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR及IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR結合至人類及食蟹猴B7H4之EC50係在類似的範圍內。 執行類似的研究以比較IgG1-B7H4-C1-052S-FEAR、IgG1-B7H4-C3-FEAR、IgG1-B7H4-C4-FEAR、IgG1-B7H4-C2-FEAR及IgG1-B7H4-C5-FEAR與來自不同物種(人類、食蟹猴、小鼠、大鼠、兔、狗和豬)的B7H4之結合。圖6顯示經人類和食蟹猴B7H4轉染之HEK細胞對所測試之抗體的結合類似。以表現兔和狗B7H4之細胞獲得類似的結果。然而，結合到IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR之小鼠B7H4相對於IgG1-B7H4-C3-FEAR、IgG1-B7H4-C4-FEAR、IgG1-B7H4-C2-FEAR及IgG1-B7H4-C5-FEAR之結合看似較低，其與實施例3的結果一致。再者，gG1-B7H4-C1-N52S-FEAR及IgG1-B7H4-C3-FEAR與大鼠B7H4之結合相對於IgG1-B7H4-C4-FEAR、IgG1-B7H4-C2-FEAR及IgG1-B7H4-C5-FEAR看似較低。此外，儘管IgG1-B7H4-C4-FEAR、IgG1-B7H4-C2-FEAR及IgG1-B7H4-C5-FEAR結合至豬B7H4，但是IgG1-B7H4-C1-052S-FEAR之結合非常弱且僅在最高的抗體測試濃度下為明顯的。未檢測到IgG1-B7H4-C3-FEAR與豬B7H4之結合。 實施例9 - B7H4單特異性及CD3xB7H4雙特異性抗體與表現B7H4之人類腫瘤細胞株之結合 測定IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR及/或bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR及/或bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR與表現B7H4之人類腫瘤細胞株MCF-7 (乳腺癌；ATCC，目錄號HTB-22)、MDA-MB-468 (乳腺癌；ATCC，目錄號HTB-132)和SK-BR3 (乳腺癌；ATCC，目錄號HTB-30)之結合，及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR與表現B7H4之人類腫瘤細胞株NIH-OVCAR-3 (卵巢腺癌；ATCC，目錄號HTB-161)或HCC1954 (乳導管癌; ATCC，目錄號CRL-2338)之結合。此外，測定IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR、bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR、IgG1-B7H4-C2-FEAR、bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR或bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C2-FEAR、IgG1-B7H4-C3-FEAR、bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C3-FEAR、IgG1-B7H4-C4-FEAR、bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C4-FEAR、IgG1-B7H4-C5-FEAR及/或bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR與MDA-MB-468和HCC1954細胞之結合。實性腫瘤細胞株典型地不表現CD3。使用顯示未檢測到的B7H4表現之腫瘤細胞株HeLa (子宮頸腺癌；ATCC，目錄號CCL-2)作為陰性對照組。結合係以流動式細胞測量術分析，如上述。 圖7顯示IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR顯示與MCF-7和MDA-MB-468細胞可相比的劑量依賴性結合，具有可相比的最大結合水平。 圖8顯示bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR與NIH-OVCAR-3和HCC1954細胞的劑量依賴性結合，且與不表現B7H4之細胞株HeLa缺乏可檢測的結合。 bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR及bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR與表現B7H4之腫瘤細胞之結合係使用MDA-MB-486和SK-BR3細胞進行比較。圖9顯示bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR及bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR顯示與該等細胞可相比的劑量依賴性結合，具有可相比的最大結合水平。 圖10顯示呈同二聚體或雙特異性抗體型式的C1-N52S、C2、C3、C4及C5 B7H4抗體與MDA-MB-468和HCC1954細胞之劑量依賴性結合。基於C4及C5之抗體顯示最有效的結合，基於C1-N52S及C2之抗體顯示中等結合效率，及基於C3之抗體顯示最低的結合效率。最大的結合在基於C1-N52S、C2、C4及C5之抗體之間為可相比的，但以基於C3之抗體較低。 實施例10 - B7H4抗體與原發性腫瘤細胞之結合 來自卵巢癌患者之原發性腫瘤細胞係自Discovery Life Sciences (Huntsville, AL, USA；患者ID 110045042)獲得。IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR與腫瘤細胞之結合係以流動式細胞測量術評定：將細胞以2x104 個細胞/孔接種在聚苯乙烯96孔圓底盤(Greiner bio-one，目錄號650180)中，離心且與PBS中以1：1000稀釋的50 μl之Fixable Viability染劑FVS-BV510 (BD Biosciences，目錄號564406)在4℃下培育30 min。在以染色緩衝液清洗後，將細胞與經FITC標記之IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR及一組CD3 (經EF450標記；eBioscience，目錄號48-0037-42)、CD45 (經BV786標記；Biolegend，目錄號304048)、CD14 (經PE-Cy7標記；BD Biosciences，目錄號557742)、CD86 (經PerCP-Cy5.5標記；Biolegend，目錄號305420)、CD163 (經APC-Cy7標記；Biolegend，目錄號333622)和EpCAM (經AF700標記；R&D systems，目錄號FAB9601N)特異性抗體在4℃下培育30 min。在清洗後，將細胞再懸浮於染色緩衝液中且使用FACS Fortessa (BD Biosciences)分析。單細胞係基於散射FSC/SSC來閘控及活細胞係藉由排除FVS-BV510陽性細胞來鑑定。腫瘤細胞經鑑定為EpCAM陽性細胞。 流動式細胞測量分析顯示IgG1-B7H4-N52S-FEAR結合EpCAM陽性活腫瘤細胞，但是不結合卵巢癌樣品的經解離之腫瘤細胞懸浮液中的單核細胞或T細胞。 實施例11 - 使用經純化之T細胞作為效應子細胞在不同的效應子對標靶之比率下以CD3xB7H4雙特異性抗體於試管內誘導經T細胞媒介之細胞毒性 為了測定在雙特異性抗體bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR的存在下經T細胞媒介之腫瘤細胞毒殺的效率，使用B7H4陽性腫瘤細胞株作為標靶細胞及經純化之T細胞作為效應子細胞以不同的效應子對標靶細胞(E：T)之比率執行試管內細胞毒性檢定。 T細胞係自健康的人類捐贈者膚色血球層(Sanquin，Amsterdam，荷蘭)獲得且使用RosetteSep™人類T細胞富集混合液(Stemcell Technologies，法國，目錄號15061)根據製造商的用法說明單離。將SK-BR3細胞(16,000個細胞/孔)接種在96孔平底盤(Greiner-bio-one，荷蘭，目錄號655180)且處於37℃下經4小時黏附。將T細胞以2：1、4：1或8：1的效應子對標靶(E：T)之比率添加至腫瘤細胞中。添加bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR或bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR之系列稀釋液(10,000至0.0128 ng/mL之最終濃度範圍；5倍稀釋)且將盤在37℃下培育72小時。將盤以PBS清洗3次且將細胞與150 µl/孔的10%之阿拉瑪藍(alamarBlue)(r)溶液(Invitrogen，目錄號DAL1100)在37℃下培育4小時。將細胞與16 μg/mL之氧化苯胂(PAO；Sigma-Aldrich，目錄號P3075；溶解在二甲亞碸[DMSO；Sigma-Adrich，目錄號D2438]中)培育，作為細胞毒性之陽性對照物。作為腫瘤細胞培養物及因此為活腫瘤細胞的代謝活性量度之阿拉瑪藍螢光係在EnVision讀盤機(PerkinElmer)上以615 nm (OD615)測量。經PAO處理之腫瘤細胞樣品的吸光度被設定為0%之生存力及未經處理之腫瘤細胞樣品的吸光度被設定為100%之生存力。「活細胞百分比」係如下計算： 活細胞% = ([樣品吸光度-經PAO處理之標靶細胞吸光度]/[未經處理之標靶細胞吸光度-經PAO處理之標靶細胞吸光度]) x 100。 劑量反應曲線及IC50值係使用非線性迴歸分析(具有可變斜率的S形劑量反應)，使用GraphPad Prism V7.02軟體(GraphPad Software，San Diego, CA, USA)產生。 圖11顯示在所有的E：T之比率下觀察到經T細胞媒介之細胞毒性，以8：1的E：T之比率下觀察到最大的腫瘤細胞毒殺(少於10%之活腫瘤細胞)。 實施例12 - 以CD3xB7H4雙特異性抗體於試管內在各種腫瘤細胞株中誘導細胞毒性及與B7H4表現水平的相關性 以雙特異性抗體bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR對各種表現B7H4之腫瘤細胞株經T細胞媒介之毒殺係使用8：1的E：T之比率以如上述之試管內細胞毒性檢定法測定。使用下列細胞株：MCF-7、MDA-MB-486、SK-BR3、NIH-OVCAR-3、HCC1954和NCI-H1650。在清洗及阿拉瑪藍培育前，將來自各培育的150 µL之含有T細胞的上清液轉移至96孔U底培養盤(CellStar，目錄號650180) (以測定T細胞活化及細胞激素釋放，如下述)。 該等腫瘤細胞株的B7H4表現係以定量的流動式細胞測量術(Human IgG calibrator，BioCytex)根據製造商的用法說明，使用bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR來量化以檢測B7H4。 圖12顯示兩種bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR於試管內誘導在MCF-7、MDA-MB-486、SK-BR3、NIH-OVCAR-3和HCC1954細胞中經劑量依賴性T細胞媒介之細胞毒性。儘管對兩種bsAb變異體達到最大細胞毒性活性(＜10%之活腫瘤細胞)，但是與bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR相比，這以較低濃度的bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR發生(表13)。 以bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR或bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (圖13B)未在腫瘤細胞溶解與B7H4表現水平之間觀察到顯著的關係(圖13A)。圖13B顯示使用源自4至6位捐贈者的T細胞在bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR或bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR存在下對各細胞株的經T細胞媒介之毒殺的IC50，細胞株係以最低至最高的B7H4表現水平排列。這意指經T細胞媒介之毒殺可發生在範圍廣泛的B7H4表現水平內。 表13總結一組5個細胞株及4位捐贈者的結果。 表13.以CD3xB7H4雙特異性抗體於試管內在各種腫瘤細胞株中誘導細胞毒性。
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bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR亦誘導所測試之NCI-H1650 NSCLC細胞株經劑量依賴性T細胞媒介之細胞毒性。 實施例13 - 在B7H4陽性腫瘤細胞存在下以CD3xB7H4雙特異性抗體於試管內誘導T細胞活化及細胞激素生成 將含有以實施例12所述之試管內經T細胞媒介之細胞毒性實驗期間所收集的上清液之96孔U底培養盤在4℃下離心(300 x g) 3 min，隨後將75 µL之上清液轉移至新盤中以測量細胞激素生成且保留T細胞以評定T細胞活化(下述)。細胞激素生成係以多工U-plex檢定法(MeSo Scale Discovery, USA，目錄號K15049K)根據製造商的用法說明進行分析。 將T細胞染色以得到T細胞標誌物CD3 (1：200；eBioscience，選殖株OKT3，與eFluor450共軛)、CD4 (1：50；eBioscience，選殖株OKT4，與APC-eFluor780共軛)、CD8 (1：100；Biolegend，選殖株RPA-T8，與AF700共軛)和T細胞活化標誌物CD69 (1：50；BD Biosciences，選殖株AB2439，與APC共軛)、CD25 (1：50；eBioscience，選殖株BC96，與PE-Cy7共軛)和CD279/PD1 (1：50；Biolegend，選殖株EH12.2H7，與BV605共軛)。將具有Ultracomp磁珠的單染色樣品(5 µL；Invitrogen，目錄號01-2222-42)納入且用於流動式細胞測量儀之補償調整。在4℃下培育30 min後，將盤以PBS/0.1%之BSA/0.02%之疊氮化物(染色緩衝液)清洗三次。將細胞再懸浮於120 µL之染色緩衝液中且使用FACS Fortessa (BD Biosciences)分析。數據係使用FlowJo (BD Biosciences)處理。 劑量反應曲線、EC50、EC90及EC99值係使用非線性迴歸分析(具有可變斜率的S形劑量反應)，使用GraphPad Prism V7.02軟體(GraphPad Software，San Diego, CA, USA)計算。 圖14A顯示B7H4陽性腫瘤細胞株在bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR或bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR存在下的T細胞活化，如以活化標誌物CD69在CD8+T細胞上的表現所定義(以流動式細胞測量術測定)。圖14B顯示使用源自3至4位捐贈者的T細胞，對腫瘤細胞株之各者的T細胞活化之EC50。 總體而言，CD8+T細胞亞群(在最高的抗體濃度下約20至50%)係在bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR或bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR存在下活化。經bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR誘導之T細胞活化通常發生在比經bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR誘導更高的濃度下(圖14A)。兩種雙特異性抗體的T細胞活化之EC50在所使用的標靶細胞之間及在捐贈者之間為可變的(圖14B)。 細胞激素生成係在腫瘤細胞-T細胞培養物之上清液中以Mesoscale Discovery U-plex多工ELISA評定。在使用來自4位捐贈者的T細胞之整個細胞株組所分析的10種細胞激素之中，主要觀察到 IFN-γ和IL-8 (＞2000 pg/ml)之顯著增加的細胞激素水平。IL-4、IL-6和IL-13係在還更低的水平下調節(＜500 pg/ml)，而IL-1β、IL-2、IL-10、IL-12p70和TNFα水平通常低於50 pg/ml。因為穩定且一致地檢測出IFN-γ變化且IFN-γ為患有細胞激素釋放症候群的患者之血清中升高的核心細胞激素之一，所以呈示此細胞激素的數據。 圖15顯示使用每一細胞株所分析的來自至少3位捐贈者的T細胞在bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR存在下，在誘導50%、90%和99%之腫瘤細胞的經T細胞媒介之細胞毒性的抗體濃度下(分別為EC50、EC90、EC99)於T細胞-腫瘤細胞共培養物之上清液中的IFN-γ水平。每一捐贈者及每一標靶腫瘤細胞之細胞激素生成水平不同。不過，在誘導相同的腫瘤細胞毒殺水平(%)的抗體濃度下，在T細胞-腫瘤細胞共培養物暴露於bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR後觀察到細胞激素生成水平通常比暴露於bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR後的該水平低。因此，在相同的腫瘤細胞毒殺水平下，與bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR培育得到比bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR低的細胞激素生成。 實施例14 - CD3xB7H4雙特異性抗體在食蟹猴中的非臨床安全性研究 bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR之非臨床安全性輪廓係在法國Citoxlab於非人類靈長類動物(食蟹猴，源自模里西斯的食蟹獼猴)中評估。食蟹猴係基於bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR的CD3臂之物種特異性，且此外由於B7H4臂與人類和食蟹猴B7H4類似的結合及進一步的藥理學發現而被認為是非臨床安全性研究的唯一相關物種。該等研究係服從動物健康規則(基於保護用於科學目的之動物的2010年9月22日之理事會指令第2010/63/EU號及 2013年2月1日之法國法規第2013-118 號)進行。 研究的目標為測定CD3xB7H4雙特異性抗體的潛在毒性及毒物動力學。在此僅說明毒物動力學及血漿中的細胞激素水平測定的結果。 在兩個單獨的研究中，將動物以0.1、1、3或10 mg/kg之bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR或bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR的單一劑量(每一劑量用於一隻雌性動物)經靜脈內(IV)輸液處理。將輸液日表示為研究中的第1天。在給藥前及給藥後0.5h、2h、4h、12h、24h和48h採集兩次血液樣品以評估毒物動力學輪廓及血漿細胞激素水平，及另外在給藥後168、336和504小時進行毒物動力學評估。 細胞激素水平 血漿樣品之細胞激素水平(IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、TNF、IL-12p70、IL-15和CCL2/ MCP1)係使用Luminex xMAP技術分析。 投予食蟹猴之BsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR僅產生微小變化的血漿細胞激素水平，其被認為與試驗化合物無關，而bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR之投予 導致劑量依賴性增加的IL-6和MCP-1含量，如圖16中所示。 與BsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR抗體相比，在以雙特異性BsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR治療後產生較低的細胞激素水平可能提供優勢的臨床設定。 毒物動力學 CD3xB7H4雙特異性抗體的血漿濃度係使用通用的IgG PK ECLIA方法測定。毒物動力學參數係使用Certara Phoenix WinNonlin藥物動力學軟體8.1版，使用與靜脈內輸液注射投予途徑一致的非隔室方法評估。圖17顯示兩種CD3xB7H4雙特異性抗體之毒物動力學輪廓在劑量後長達7天具有高度可比性，兩者皆顯示與劑量相關的血漿暴露量。 進行藥物動力學建模實習以評定具有較低的CD3親和性之BsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR變異體所需的預計臨床劑量範圍是否可能不持續為高劑量。使用觀察食蟹猴獲知的PK模式。導出臨床劑量範圍，預期得到與試管內觀察的經T細胞媒介之細胞毒殺的EC50至EC90相等的一週平均血漿暴露量。所得劑量範圍被認為是可行的，且沒有理由以此觀點先驗地偏袒一種類型的雙特異性抗體而不是另一抗體(BsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR相對於BsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR)。 實施例15 - 在各種人類癌適應症中的B7H4表現 B7H4 mRNA水平係自Omicsoft TCGA數據庫擷取且使用Oncoland軟體(Qiagen, USA)顯現。 圖18顯示在一系列原發性實性腫瘤中的B7H4 mRNA表現水平，根據表現的中位數排序。在各種廣泛的癌適應症中發現mRNA表現且其表現在各適應症內皆不同，在子宮癌肉瘤(UCS)、膀胱泌尿上皮癌(BLCA)、胰腺癌(PAAD)、肺鱗狀細胞癌(LUSC)、侵襲性乳癌(BRCA)、子宮體子宮內膜癌(UCEC)、卵巢漿液囊腺癌(OV)和膽管癌(CHOL)中發現最高的中位數表現。 在結腸癌、肺癌(小細胞肺癌，SCLC和非小細胞肺癌，NSCLC)、胃癌、胰臟癌、膀胱癌、子宮頸癌、頭與頸癌、乳癌(包括三陰性乳癌，TNBC)、卵巢癌、食道癌、腎臟癌、前列腺癌和子宮癌及膽管癌中的B7H4之蛋白表現係在組織微陣列(TMA；全部購自BioMax)上以免疫組織化學法(IHC)分析。在染色前，將新鮮切割的TMA切片(5 μm)脫蠟且與標的修復溶液pH9 (DAKO，S2367；97℃下30分鐘，冷卻60分鐘)培育。B7H4 IHC係使用市售兔抗人類B7-H4單株抗體(選殖株D1M8I，#14572，Cell Signaling Technologies)以最適化稀釋(1：25；最終濃度2.6 µg/mL)在LabVision自動化染色平臺上執行30 min (RT)。隨後將切片與抗兔IgG聚合物(EnvisionTM FLEX+兔(DAKO，S2022))培育，清洗且與DAKO液體DAB+受質色素原系統(DAKO，K3468)培育。使用蘇木素(DAKO，S3301)檢測有核細胞。細胞角蛋白(測定關注之腫瘤區域，ROI) IHC係以小鼠抗細胞角蛋白抗體混合物(選殖株AE1/AE3)在Ventana Benchmark上使用OptiView檢測來執行。細胞角蛋白係以DAB顯現，且細胞核係使用預設的Ventana試劑以蘇木精對比染色。將經染色之TMA切片在AxioScan (Zeiss)上以20倍放大率數位化。最初執行手動計分以測定平均B7H4染色強度(陰性-低-中-高)及具有＞10%之B7H4陽性腫瘤細胞的腫瘤核心百分比。 隨後執行自動計分。腫瘤ROI係使用在與那些因B7H4染色之切片相鄰的TMA切片上的細胞角蛋白遮蔽來定義。將腫瘤ROI中的B7H4染色強度量化(陰性、弱(1)、中(2)或強(3))且將B7H4陽性腫瘤細胞百分比使用HALO影像分析軟體測定(範圍0至100%)。測定各適應症具有＞10%之B7H4陽性腫瘤細胞的腫瘤核心百分比。 表14顯示以BioMax TMA之IHC分析所測定之B7H4蛋白表現。在結腸癌、前列腺癌、腎臟癌和小細胞肺癌樣品中觀察沒有至非常低的B7H4表現。在來自其他適應症的樣品中，B7H4表現不同，在胃癌、胰臟癌、膽管癌、食管癌、膀胱癌、非小細胞肺癌(特別為鱗狀NSCLC)、子宮頸癌、頭與頸癌、乳癌(三重陰性乳癌[TNBC]和非TNBC)、卵巢癌及子宮癌中發現增加的B7H4表現。 表14. 以BioMax TMA之IHC分析所測定之B7H4蛋白表現。ND = 未測定。
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[圖1.]使用B7H4-B7H3嵌合分子測定涉及結合之B7H4結構域。B7H4抗體之B7H4結構域特異性係使用一組經轉染以表現人類B7H4 (I)、人類B7H4-B7H3嵌合分子B7H3-IgV/B7H4-IgC (II)或B7H4-IgV/B7H3-IgC (III)或人類B7H3 (IV)之細胞測定。結合係以流動式細胞測量術測定。A = bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C4-FEAR；B = bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C3-FEAR；C = bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR；D = bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-FEAR；E = IgG1-B7H3-BRCA84D。 [圖2.] B7H4抗體與B7H4、B7H3或B7H4-B7H3嵌合分子之結合。bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR、bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C2-FEAR、bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C3-FEAR、bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C4-FEAR及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR與經瞬時轉染以表現人類B7H4或B7H4-B7H3嵌合分子B7H3-IgV/B7H4-IgC或B7H4-IgV/B7H3-IgC的HEK細胞之結合係以流動式細胞測量術評定。 [圖3.] B7H4抗體與ECD中具有丙胺酸突變的B7H4變異體之結合。結合係以與參考抗體相比的差異倍數表示。差異倍數經定義為Log10(正規化gMFI[ala突變體]/正規化gMFI[wt])。其中結合差異倍數小於平均差異倍數-1.5 x SD之殘基被認為是「失去結合之突變體」。具有正的結合差異倍數之殘基為對參考抗體失去結合之殘基。在x軸以下的數字係指胺基酸位置。(A) C1-N52S的結果，以C2作為參考抗體。(B) C2的結果，以C1-N52S作為參考抗體。(C) C3的結果，以C2作為參考抗體。 [圖4.] B7H4抗體及CD3xB7H4雙特異性抗體與人類和食蟹猴B7H4之結合。IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (A)及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)與經人類B7H4或食蟹猴B7H4瞬時轉染之HEK-293F細胞之結合係以流動式細胞測量術測定。未經轉染之HEK-293F細胞(C)被用作為陰性對照組；顯示bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR之該等結合。 [圖5.] B7H4抗體及CD3xB7H4雙特異性抗體與來自兔、大鼠、小鼠、狗和豬的B4H7之結合。IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (A)及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)與經來自兔、大鼠、小鼠、狗或豬的B7H4瞬時轉染之HEK-293F細胞之結合係以流動式細胞測量術測定。未經轉染之HEK-293F細胞(C)被用作為陰性對照組；顯示bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR之該等結合。 [圖6.] B7H4抗體與經來自不同物種的B7H4瞬時轉染之HEK-293F細胞之結合。IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (A)、IgG1-B7H4-C3-FEAR (B)、IgG1-B7H4-C2-FEAR (C)、IgG1-B7H4-C4-FEAR (D)及IgG1-B7H4-C5-FEAR (E)與經來自人類、食蟹猴、小鼠、大鼠或豬的B7H4轉染之HEK-293F細胞或與未經轉染之HEK-293F細胞之結合係以流動式細胞測量術測定。IgG1-b12被用作為未結合之對照抗體(未顯示)。 [圖7.] IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (A)及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)與MCF-7及MDA-MB-468細胞之結合。結合係以流動式細胞測量術測定。IgG1-b12 (C)及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR (D)被用作為未結合之對照抗體。 [圖8.] bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A)與NIH-OVCAR-3、HCC1954及HeLa細胞之結合。結合係以流動式細胞測量術測定。BsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR (B)被用作為未結合之對照抗體。 [圖9.] bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A)及bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)與SK-BR3及MDA-MB-486細胞之結合。結合係以流動式細胞測量術測定。bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR (C)及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR (D)被用作為未結合之對照抗體。 [圖10.] 呈同二聚體的各種B7H4抗體及bsAb型式與MDA-MB-486及HCC1954細胞之結合。IgG1-B7H4-C1-N52S-FEAR (A同二聚體)、IgG1-B7H4-C2-FEAR (B同二聚體)、IgG1-B7H4-C3-FEAR (C同二聚體)、IgG1-B7H4-C4-FEAR (D同二聚體)、IgG1-B7H4-C5-FEAR (E同二聚體)、bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A bsAb)、bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C2-FEAR [MDA-MB-468]或bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C2-FEAR [HCC1954] (B bsAb)、bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C3-FEAR (C bsAb)、bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C4-FEAR (D bsAb)及bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C5-FEAR (E bsAb)之結合係以流動式細胞測量術測定。bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR (F bsAb)或IgG1-b12-K409R (F同二聚體)被用作為未結合之對照抗體。 [圖11.]以CD3xB7H4雙特異性抗體使用經純化之T細胞作為效應子細胞以不同的效應子對標靶之比率(E:T)於試管內誘導SK-BR3細胞的經T細胞媒介之細胞毒性。bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR被用作為未結合之對照抗體。A = bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR；B = bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR；C = bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR。 [圖12.]在具有不同的CD3臂之CD3xB7H4雙特異性抗體存在下於試管內誘導在各種腫瘤細胞株中的經T細胞媒介之細胞毒性。bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR被用作為未結合之對照抗體。A = bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR；B = bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR；C = bsIgG1-huCD3-FEALxb12-FEAR，D = bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxb12-FEAR。 [圖13.]經T細胞媒介之腫瘤細胞毒殺的B7H4表現水平及IC50。(A)在腫瘤細胞株上的B7H4表現水平之定量流動式細胞測量術分析。所顯示的是個別的量度(點)、幾何平均值(棒)及標準偏差(誤差棒)。sABC = 特異性抗體結合能力。(B)在bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (I)或bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (II)存在下對不同腫瘤細胞株的經T細胞媒介之腫瘤細胞毒殺的IC50。各點代表以個別的T細胞捐贈者(每一細胞株4至6位捐贈者)執行的實驗，水平線表示中位數。細胞株係根據B7H4表現水平排序。 [圖14.]在T細胞-腫瘤細胞共培養物中以B7H4雙特異性抗體之T細胞活化。(A)在bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (I)或bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (II)存在下對各種B7H4陽性腫瘤細胞株之T細胞活化(在CD8+細胞上的CD69之%)，以流動式細胞測量術測定。(B)使用源自3至5位捐贈者的T細胞對每一標靶細胞株之T細胞活化的EC50。各點代表以個別的T細胞捐贈者執行的實驗；水平線表示幾何平均值。 [圖15.]使用來自3至4位捐贈者的T細胞在bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A)及bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)之EC50、EC90和EC99下的T細胞-腫瘤細胞共培養物之上清液中的IFNγ，以多工U-plex檢定法測定。所顯示的是個別的量度(點)、幾何平均值(水平線)及標準偏差(誤差棒)。 [圖16.]在以bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A)或bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)之單一劑量IV輸液處理之食蟹猴的血漿中之IL-6及MCP-1量。 [圖17.]在bsIgG1-huCD3-H101G-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (A)或bsIgG1-huCD3-FEALxB7H4-C1-N52S-FEAR (B)之單一IV輸液後的平均血漿濃度-時間輪廓。 [圖18.]在一原發性實性腫瘤範圍中的B7H4 mRNA表現水平。B7H4 mRNA水平係自Omicsoft TCGA數據庫擷取且使用Oncoland軟體顯現。適應症係根據B7H4 mRNA表現的中位數排序。THYM = 胸腺瘤，UVM = 葡萄膜黑色素瘤，PCPG = 嗜鉻細胞瘤及副神經節瘤，ACC = 腎上腺皮質癌，MESO = 中皮瘤，SKCM = 皮膚黑色素瘤，READ = 直腸腺癌，COAD = 結腸腺癌，GMB = 多形性神經膠質母細胞瘤，SARC = 肉瘤，LIHC = 肝臟肝細胞癌，LGG = 腦低級別膠質瘤，KIRC = 腎臟腎透明細胞癌，TGCT = 睪丸生殖細胞腫瘤，KICH = 腎臟嫌色細胞，STAD = 胃腺癌，THCA = 甲狀腺癌，HNSC = 頭與頸鱗狀細胞癌，PRAD = 前列腺腺癌，LUAD = 肺腺癌，ESCA = 食道癌，CESC = 子宮頸鱗狀細胞癌及子宮頸內腺癌，KIRP = 腎臟乳頭狀細胞癌，UCS = 子宮癌肉瘤，BLCA = 膀胱泌尿上皮癌，PAAD = 胰臟腺癌，LUSC = 肺鱗狀細胞癌，BRCA = 侵襲性乳癌，UCEC = 子宮體子宮內膜癌，OV = 卵巢漿液囊腺癌，及CHOL = 膽管癌。
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Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050

Claims (78)

  1. 一種抗體，其包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區及能夠結合至人類CD3之抗原結合區，其中該抗原結合區包含重鏈及輕鏈可變區，其中該重鏈及輕鏈可變區係經人源化及/或為人類。
  2. 如請求項1之抗體，其為雙特異性抗體。
  3. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體能夠結合癌細胞及T細胞。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體，其中該癌細胞表現該人類B7H4。
  5. 如請求項3或4之抗體，其中該癌細胞為實性腫瘤。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體，其中該抗體能夠誘導經T細胞媒介之細胞毒殺。
  7. 如前述請求項中任一項之抗體，其中能夠結合CD3之該抗原結合區能夠結合人類CD3ε (epsilon)，諸如以SEQ ID NO：13指定之人類CD3ε (epsilon)。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗體，其中結合至CD3之該抗原結合區包含 重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17之CDR1、CDR2和CDR3區，及 輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：22之CDR1、CDR2和CDR3區。
  9. 如請求項1至7中任一項之抗體，其中結合至CD3之該抗原結合區包含 重鏈可變區(VH)，其包含分別以SEQ ID NO：18、19和20或18、19和21之CDR1、CDR2和CDR3序列；及 輕鏈可變區(VL)，其包含分別以SEQ ID NO：23、GTN和24之CDR1、CDR2和CDR3序列。
  10. 如請求項1至7中任一項之抗體，其中結合至CD3之該抗原結合區包含 重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO：16之序列或與SEQ ID NO：16之序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%之胺基酸序列同一性之序列；及 輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO：22之序列或與SEQ ID NO：22之序列具有至少90%、至少95%、至少97%或至少99%之胺基酸序列同一性之序列。
  11. 如請求項7至10中任一項之抗體，其中在結合至CD3之該抗原結合區與CD3之間的該解離平衡常數K D 係在1至100 nM之範圍內，諸如在5至100 nM之範圍內、在10至100 nM之範圍內、在1至80 nM之範圍內、在1至60 nM之範圍內、在1至40 nM之範圍內、在1至20 nM之範圍內、在5至80 nM之範圍內、在5至60 nM之範圍內、在5至40 nM之範圍內、在5至20 nM之範圍內、在10至80 nM之範圍內、在10至60 nM之範圍內、在10至40 nM之範圍內，或諸如在內10至20 nM之範圍。
  12. 如請求項7至10中任一項之抗體，其中該抗體對人類CD3ε具有比具有包含以SEQ ID NO：16所列之VH序列及以SEQ ID NO：22所列之VL序列的抗原結合區之抗體低的結合親和性，較佳地其中該親和性低至少5倍，諸如低至少10倍，例如低至少20倍、低至少30倍、低至少40倍、低至少45倍，或諸如低至少50倍。
  13. 如請求項7至10中任一項之抗體，其中結合至CD3之該抗原結合區具有在200至1000 nM之範圍內的平衡解離常數K D ，諸如在300至1000 nM之範圍內、在400至1000 nM之範圍內、在500至1000 nM之範圍內、在300至900 nM之範圍內、在400至900 nM之範圍內、在400至700 nM之範圍內、在500至900 nM之範圍內、在500至800 nM之範圍內、在500至700 nM之範圍內、在600至1000 nM之範圍內、在600至900 nM之範圍內、在600至800 nM之範圍內，或諸如在600至700 nM之範圍內。
  14. 如請求項11至13中任一項之抗體，其中 結合至CD3之該抗原結合區包含重鏈可變(VH)區，其包含CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列， 當該重鏈可變(VH)區與包含以SEQ ID NO：16所列之序列的重鏈可變(VH)區相比時，其具有在選自由下列所組成的群組之位置上的胺基酸取代：T31、N57、H101、G105、S110和Y114，該位置係根據SEQ ID NO：16之序列編號；及 野生型輕鏈可變(VL)區包含分別以SEQ ID NO：23、GTN和SEQ ID NO：24所列之CDR1、CDR2和CDR3序列。
  15. 如請求項14之抗體，其中結合至CD3之該抗原結合區包含在該重鏈可變(VH)區中選自由下列所組成的群組之取代：T31M、T31P、N57E、H101G、H101N、G105P、S110A、S110G、Y114M、Y114R、Y114V。
  16. 如請求項8至10中任一項之抗體，其中當結合至CD3之該抗原結合區的該重鏈可變(VH)區之CDR1、CDR2和CDR3與SEQ ID NO：16之序列的CDR1、CDR2和CDR3相比時，其包含總共最多1、2、3、4或5個胺基酸取代，該胺基酸取代較佳地包含如請求項14或請求項15中所定義之胺基酸取代。
  17. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該人類B7H4為SEQ ID NO：1之人類B7H4。
  18. 如前述請求項中任一項之抗體，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區能夠結合至人類B7H4之細胞外結構域。
  19. 如請求項17或請求項18之抗體，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區能夠結合至人類B7H4之IgC樣恆定區。
  20. 如前述請求項中任一項之抗體，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區能夠結合至具有SEQ ID NO：11之序列的B7H3-IgV/B7H4-IgC。
  21. 如請求項20之抗體，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區不能夠結合至具有SEQ ID NO：10之序列的B7H4-IgV/B7H3-IgC。
  22. 如請求項17至20中任一項之抗體，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區包含： a)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：25之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； b)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：29之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； c)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：36之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：40之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； d)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：43之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：47之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； e)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：50之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：54之分別的CDR1、CDR2和CDR3區；或 f)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：31之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； g)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：65之CDR1、CDR2和CDR3區；及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：69之分別的CDR1、CDR2和CDR3區。
  23. 如請求項17至20中任一項之抗體，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區包含： a)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、27和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； b)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、30和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； c)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：37、38和39之分別的CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：41、DTS和SEQ ID NO：42之分別的CDR1、CDR2和CDR3； d)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：44、45和46之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：48、YTS和SEQ ID NO：49之分別的CDR1、CDR2和CDR3； e)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：51、52和53之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：55、GAS和SEQ ID NO：56之分別的CDR1、CDR2和CDR3；或 f)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、32和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； g)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：66、67和68之分別的CDR1、CDR2和CDR3，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：70、GAS和SEQ ID NO：71之分別的CDR1、CDR2和CDR3。
  24. 如請求項17至20中任一項之抗體，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區包含： a)SEQ ID NO：25之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； b)SEQ ID NO：29之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； c)SEQ ID NO：36之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：40之可變輕鏈區； d)SEQ ID NO：43之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：47之可變輕鏈區； e)SEQ ID NO：50之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：54之可變輕鏈區；或 f)SEQ ID NO：29之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區； g)SEQ ID NO：65之可變重鏈(VH)區；及SEQ ID NO：69之可變輕鏈區。
  25. 如前述請求項中任一項之抗體，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區具有對應於5E-7 M或更小的K D 值之結合親和性，諸如1E-7 M或更小，諸如具有對應於在5E-7至2E-10 M之範圍內的K D 值之結合親和性，諸如在2E-7至1E-10 M或1E-7至5E-9 M之範圍內。
  26. 如請求項25之抗體，其中該結合親和性係以生物膜干涉法測定，視需要地如本文實施例3中所提出。
  27. 如請求項25及26中任一項之抗體，其中該結合親和性係使用生物膜干涉法測定，其包含以下步驟： I)   將該抗體以1 µg/mL的量固定在抗人類IgG Fc捕獲生物感測器(Capture biosensor)上600秒； II)  使用1.56 nM至100 nM之範圍的2倍稀釋系列測定經人類重組His標籤化之B7H4蛋白質(Sino Biological目錄號10738-H08H；自編碼具有C端多組胺酸標籤的人類VTCN1 (Uniprot登錄號Q7Z7D3)(Phe29-Ala258)之DNA序列的構築體所表現之蛋白質)在300秒時間段內之締合及在1000秒時間段內之解離； III) 引用該數據至緩衝對照物(0 nM)。
  28. 如請求項25至27中任一項之抗體，其中該結合親和性係使用如前述請求項中任一項所定義之抗體測量，該抗體為單特異性、雙價抗體，諸如其為全長IgG1之抗體。
  29. 如請求項1至28中任一項之抗體，其包含能夠結合至人類B7H4之抗原區，該抗原結合區能夠交叉阻斷 包含SEQ ID NO：29之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區的抗體；及 包含SEQ ID NO：36之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：40之可變輕鏈區的抗體；且 其中該抗原結合區不能夠交叉阻斷 包含SEQ ID NO：43之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：47之可變輕鏈區的抗體； 包含SEQ ID NO：50之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：54之可變輕鏈區的抗體；及 包含SEQ ID NO：65之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：69之可變輕鏈區的抗體。
  30. 如請求項1至28中任一項之抗體，其包含能夠結合至人類B7H4之抗原區，該抗原結合區能夠交叉阻斷 包含SEQ ID NO：43之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：47之可變輕鏈區的抗體； 包含SEQ ID NO：50之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：54之可變輕鏈區的抗體；及 包含SEQ ID NO：65之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：69之可變輕鏈區的抗體； 且其中該抗原結合區不能夠交叉阻斷包含以下的抗體： 包含SEQ ID NO：29之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區的抗體；及 包含SEQ ID NO：36之可變重鏈(VH)區及SEQ ID NO：40之可變輕鏈區的抗體。
  31. 如請求項29或請求項30之抗體，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區能夠結合至SEQ ID NO：11之B7H3-IgV/B7H4-IgC，且視需要地不能夠結合至SEQ ID NO：10之B7H4-IgV/B7H3-IgC。
  32. 如前述請求項中任一項之抗體，其中各抗原結合區包含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，且其中該可變區各自包含分別三個CDR序列：CDR1、CDR2和CDR3及分別四個框架序列：FR1、FR2、FR3和FR4。
  33. 如前述請求項中任一項之抗體，其中 c) 能夠結合至B7H4之該抗原結合區為人類；且 d) 能夠結合至CD3之該抗原結合區係經人源化。
  34. 如請求項1至32中任一項之抗體，其中 b) 能夠結合至B7H4之該抗原結合區為人類；及/或 c) 能夠結合至CD3之該抗原結合區係經人源化。
  35. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含兩個重鏈恆定區(CH)及兩個輕鏈恆定區(CL)。
  36. 如請求項35之抗體，其中該兩個重鏈恆定結構域及兩個輕鏈恆定區係衍生自人類。
  37. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體為全長抗體。
  38. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體為IgG1同型。
  39. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含第一和第二重鏈，該第一和第二重鏈中各者包含至少鉸鏈區、CH2和CH3區，其中在該第一重鏈中，在對應於選自由人類IgG1重鏈中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409所組成的群組之位置的位置上之胺基酸中至少一者已經取代，及在該第二重鏈中，在對應於選自由人類IgG1重鏈中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409所組成的群組之位置的位置上之胺基酸中至少一者已經取代，其中該第一和該第二重鏈之該取代不在相同的位置上，且其中該胺基酸位置係根據Eu編號進行編號。
  40. 如請求項39之抗體，其中在對應於人類IgG1重鏈中之K409的位置上之該胺基酸為該第一重鏈中的R，及在對應於人類IgG1重鏈中之F405的位置上之該胺基酸為該第二重鏈中的L，或反之亦然。
  41. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含第一和視需要的第二重鏈，且其中該第一重鏈及若存在的該第二重鏈係經修飾，使得該抗體誘導經Fc媒介之效應子功能至在程度上比相同的未經修飾之抗體小。
  42. 如請求項41之抗體，其中該抗體包含第一和第二重鏈，且其中在該第一和該第二重鏈兩者中，在對應於人類IgG1重鏈中根據Eu編號之位置L234和L235的位置上之該胺基酸殘基分別為F和E。
  43. 如請求項41或請求項42之抗體，其中該抗體包含第一和第二重鏈，且其中在該第一和該第二重鏈兩者中，在對應於人類IgG1重鏈中根據Eu編號之位置D265的位置上之該胺基酸殘基為A。
  44. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含kappa (κ)輕鏈。
  45. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含lambda (λ)輕鏈。
  46. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含lambda (λ)輕鏈和kappa (κ)輕鏈；例如包含能夠結合至CD3之結合區的具有重鏈及lambda輕鏈之抗體，及包含能夠結合至B7H4之結合區的具有重鏈及kappa輕鏈之抗體。
  47. 如前述請求項中任一項之抗體，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區包含在重鏈及輕鏈中，該重鏈包含該VH區和IgG1重鏈恆定區，及該輕鏈包含該VL區和kappa輕鏈恆定區；且其中能夠結合至人類CD3之該抗原結合區包含在重鏈及輕鏈中，該重鏈包含該VH區和IgG1重鏈恆定區，及該輕鏈包含該VL區和lambda輕鏈恆定區。
  48. 如請求項47之抗體，其中一個IgG1重鏈恆定區係如SEQ ID NO：60中所定義及其他係如SEQ ID NO：61中所定義，且其中該kappa輕鏈恆定區係如SEQ ID NO：63中所定義及該lambda輕鏈恆定區係如SEQ ID NO：64中所定義。
  49. 如請求項48之抗體，其中如SEQ ID NO：60和61中所定義之該IgG1重鏈恆定區具有經刪除之彼等末端離胺酸。
  50. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體缺乏或具有降低的經Fc媒介之效應子功能，且該抗體： a) 能夠結合至表現B7H4之人類腫瘤細胞，諸如本文實施例9和10中所述， b) 當使用例如PBMC或T細胞作為效應子細胞時，當如本文實施例11和12中所述方式檢定時，在表現B7H4之人類腫瘤細胞中媒介濃度依賴性細胞毒性， c) 當使用例如PBMC或T細胞作為效應子細胞時，當如本文實施例11和12中所述方式檢定時，能夠在一或多種選自由MCF-7、MDA-MB-468、SK-BR3、NIH-OVCAR-3、HCC1954和NCI-H1650所組成的群組之表現人類B7H4之腫瘤細胞株中媒介濃度依賴性細胞毒性， d) 例如當如在本文實施例13中所述方式檢定時，能夠在表現B7H4之人類腫瘤細胞存在下於試管內活化T細胞， e) 例如當如本文實施例13中所述方式檢定時，能夠在一或多種選自由MCF-7、MDA-MB-468、SK-BR3、NIH-OVCAR-3、HCC1954和NCI-H1650所組成的群組之表現B7H4之人類腫瘤細胞株存在下於試管內活化T細胞， f) 例如當如本文實施例11和12中所述方式檢定時，能夠誘導表現B7H4之人類腫瘤細胞之細胞毒性；及/或 g) 例如當如本文實施例11和12中所述方式檢定時，能夠在一或多種選自由MCF-7、MDA-MB-468、SK-BR3、NIH-OVCAR-3、HCC1954和NCI-H1650所組成的群組之表現B7H4之人類腫瘤細胞株中誘導經T細胞媒介之細胞毒性。
  51. 如請求項47之抗體，其中該抗體具有在0.001至5微克/ml之範圍內的IC50，其中該IC50係以包含以下步驟之試管內細胞毒性檢定法測定： i)   提供來自健康的人類捐贈者膚色血球層的經單離之周邊血液單核細胞(PBMC)或經純化之T細胞， ii)   提供表現B7H4之腫瘤細胞； iii)  將PBMC或經純化之T細胞及選自由MCF-7、MDA-MB-468、SK-BR3、NIH-OVCAR-3、HCC1954和NCI-H1650所組成的群組之表現人類B7H4之腫瘤細胞株組合成複數個樣品，其中來自該PBMS之T細胞或經純化之T細胞對所選擇之腫瘤細胞的數目比為8：1； iv)  將例如0.0128 ng/mL至10,000 ng/mL之範圍的稀釋系列之該抗體提供至該樣品中，且 v)   將該樣品在37℃下培育例如72小時，且隨後 vi)  評定該表現B7H4之腫瘤細胞的生存力， vii) 測定各稀釋樣品之活細胞百分比，且 viii) 測定該IC50。
  52. 如請求項48之抗體，其中該IC50係在0.001至0.03微克/ml之範圍內。
  53. 如請求項48之抗體，其中該IC50係在0.05至5微克/ml之範圍內。
  54. 一種抗體，其包含能夠結合至人類B7H4之抗原結合區，其中能夠結合至人類B7H4之該抗原結合區包含 a)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：25之CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； b)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：29之CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：33之分別的CDR1、CDR2和CDR3區； c)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、27和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； d)可變重鏈(VH)區，其包含SEQ ID NO：26、30和28之分別的CDR1、CDR2和CDR3區，及可變輕鏈區，其包含SEQ ID NO：34、GAS和SEQ ID NO：35之分別的CDR1、CDR2和CDR3； e) SEQ ID NO：25之可變重鏈(VH)區，及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區；或 f) SEQ ID NO：29之可變重鏈(VH)區，及SEQ ID NO：33之可變輕鏈區。
  55. 如請求項54之抗體，其中該抗體為單特異性抗體。
  56. 如請求項54或請求項55之抗體，其中該抗體為雙價抗體。
  57. 如請求項56之抗體，其中該抗體為雙特異性抗體，其包含能夠結合至人類CD3之另外抗原結合區，其中較佳地能夠結合至CD3之該另外抗原結合區為如請求項7至16中任一項所定義能夠結合至人類CD3之抗原結合區。
  58. 一種組成物，其包含如請求項1至57中任一項所定義之抗體。
  59. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至58中任一項所定義之抗體及醫藥上可接受的載劑。
  60. 如請求項1至57中任一項所定義之抗體，其係用作為藥劑。
  61. 如請求項60用作為藥劑之抗體，其係用於治療疾病。
  62. 如請求項61用作為藥劑之抗體，其中該疾病為癌症。
  63. 如請求項62用作為藥劑之抗體，其中該癌症係以B7H4於癌細胞中之表現為特徵。
  64. 如請求項63用作為藥劑之抗體，其中B7H4之該表現係在自患者獲得的癌細胞中測定。
  65. 如請求項62至64中任一項用作為藥劑之抗體，其中該癌症為實性腫瘤。
  66. 如請求項62至65中任一項所用之抗體，其中該癌症係選自由下列所組成的群組：肺癌、NSCLC (ADC或SQCC)、胃癌、胰臟癌、膽管癌、膀胱癌、子宮頸癌、頭與頸癌、乳癌、卵巢癌和子宮癌。
  67. 一種治療疾病之方法，該方法包含對其有需要的個體投予如請求項1至57中任一項所定義之抗體、如請求項58中所定義之組成物或如請求項59中所定義之醫藥組成物。
  68. 如請求項67之方法，該方法係用於治療癌症。
  69. 如請求項68之方法，其中該癌症係選自由下列所組成的群組：子宮癌肉瘤(UCS)、膀胱泌尿上皮癌(BLCA)、胰臟腺癌(PAAD)、肺鱗狀細胞癌(LUSC)、侵襲性乳癌(BRCA)、子宮體子宮內膜癌(UCEC)、卵巢漿液囊腺癌(OV)和膽管癌(CHOL)。
  70. 一種核酸，其包含： a)  編碼如請求項54所定義之能夠結合至B7H4之抗原結合區的重鏈可變區序列之核酸序列，及/或 b)  編碼如請求項54所定義之能夠結合至B7H4之該抗原結合區的對應輕鏈可變區序列之核酸序列。
  71. 一或多種核酸，其包含 a)  編碼抗體的重鏈序列之核酸序列，該抗體包含如請求項22至24中任一項所定義之能夠結合至B7H4之抗原結合區， b)  編碼抗體的對應輕鏈序列之核酸序列，該抗體包含如請求項22至24中任一項所定義之能夠結合至B7H4之該抗原結合區， c)  編碼抗體的重鏈序列之核酸序列，該抗體包含如請求項8至10中任一項所定義之能夠結合至CD3之抗原結合區；及 d)  編碼抗體的對應輕鏈序列之核酸序列，該抗體包含如請求項8至10中任一項所定義之能夠結合至CD3之該抗原結合區。
  72. 如請求項70或71所定義之核酸或一或多種核酸，其中該核酸為RNA或DNA。
  73. 如請求項70至72中任一項之核酸或一或多種核酸，其係用於哺乳動物細胞中表現。
  74. 一種細胞，其包含核酸或包含一或多種核酸，如請求項70至73中任一項所定義。
  75. 如請求項74之細胞，其中該細胞為人類起源，諸如人類胚胎腎(HEK)細胞，諸如HEK/Expi細胞，或為囓齒動物起源，諸如中國倉鼠卵巢細胞，諸如CHO/N50細胞。
  76. 一種生產如請求項1至53中任一項之能夠結合至B7H4及CD3兩者之抗體之方法，其包含以下步驟： a)  提供能夠結合至B7H4之抗體，該抗體包含如請求項1至6及17至34中任一項所定義之能夠結合至B7H4之抗原結合區； b)  提供能夠結合至CD3之抗體，該抗體包含如請求項1至16及32至34中任一項所定義之能夠結合至CD3之抗原結合區； c)  將能夠結合至B7H4之該抗體與能夠結合至CD3之該抗體一起在足以容許在該鉸鏈區中的半胱胺酸經歷雙硫鍵異構化之還原條件下培育，且 d)  獲得能夠結合至B7H4及CD3之該抗體。
  77. 如請求項76之生產能夠結合至B7H4及CD3兩者之抗體之方法，其中該步驟a)及/或b)包含： - 提供用於生產該抗體或該抗體類的包含表現載體之細胞；及 - 容許該細胞生產該抗體或該抗體類，且隨後 - 獲得該抗體或該抗體類，從而提供該抗體或該抗體類。
  78. 一種配件套組(kit-of-parts)，諸如用作為伴隨診斷/用於鑑定在患者群體內對如請求項1至57中任一項所定義之抗體的治療具有反應傾向的那些患者之套組，其包含如請求項1至57中任一項所定義之抗體；及使用該套組之用法說明。
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