CN113166260B - 人源化抗pd-1抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗程序性死亡受体‑1(Programmed cell death protein‑1，PD‑1)的重组人源化单克隆抗体或其抗原结合片段，其可用于肿瘤或癌症免疫治疗。本发明还提供了编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸序列、含有所述核酸序列的载体、药物组合物和试剂盒。

Description

人源化抗PD-1抗体及其用途
技术领域
本发明涉及肿瘤或癌症免疫治疗领域。具体而言，本发明提供了一种抗程序性死亡受体-1(Programmed cell death protein-1，PD-1)的重组人源化抗体，其可用于肿瘤或癌症免疫治疗。本发明还提供了编码所述抗体的核酸序列、含有所述核酸序列的载体、药物组合物和试剂盒。
背景技术
PD-1是由288个氨基酸构成，分子量约为50kDa的I型跨膜糖蛋白，为CD28家族成员之一，又名CD279。它的功能为调控细胞程序性死亡，主要表达于成熟的CD4+和CD8+T细胞表面，在天然杀伤T细胞、B细胞、单核细胞和一些树突状细胞上也有表达。
PD-1有两个配体，分别是PD-L1(即B7-H1，又名CD274)和PD-L2(即B7-DC，又名CD273)，二者均是B7家族的跨膜蛋白分子。从含量和作用角度看，PD-L1为主要的PD-1配体。PD-L1广泛表达于各种类型细胞表面，包括树突状细胞、B细胞和T细胞等造血细胞以及上皮和内皮细胞等非造血细胞。PD-L1也在肿瘤细胞表面呈现高表达，而且IFN-γ和TNF-α等炎性细胞因子能促进肿瘤细胞表面PD-L1的表达上调。PD-L2配体与PD-L1有很高的相似性，但其分布相对局限，主要表达于巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞等免疫细胞表面，且表达量较低。PD-L2与PD-1结合的亲和力更高，约为PD-L1的3倍。
PD-1通过与其配体相结合行使生物功能，可抑制T细胞受体介导的T细胞增殖、活化和细胞因子的分泌，从而抑制免疫应答的初始与效应阶段，维持机体的免疫稳定，防止自身免疫性疾病的发生。当PD-1与其配体结合时，其胞质区免疫受体酪氨酸转化基序(Immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM)结构域中的酪氨酸发生磷酸化。磷酸化的ITSM会募集SHP-2磷酸酶，通过去磷酸化作用抑制下游重要通路，阻断磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)及其下游蛋白激酶B(PKB或Akt)的激活，抑制糖代谢和细胞因子白细胞介素-2(IL-2)的产生及抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达，从而抑制T、B细胞的增殖、活化以及免疫球蛋白的分泌，抑制自身免疫反应。肿瘤细胞利用此免疫抑制机制，通过高表达PD-L1，使其与淋巴细胞表面的PD-1分子结合，逃避机体对它们的免疫识别和清除，从而实现免疫逃逸。
以PD-1为靶点的单克隆抗体研究是目前肿瘤或癌症免疫治疗研究的热点。这些单克隆抗体通过阻断PD-1与其配体的结合，能够增加肿瘤部位的T细胞和IFN-γIL-2的分泌量，减少髓系来源的抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cell，MDSC)的比例，改变肿瘤微环境，恢复和提高T细胞的免疫杀伤功能，从而抑制肿瘤的增长。目前，美国食品药品管理局(FDA)已批准上市的PD-1抗体药物包括美国百时美施贵宝公司(Bristol-MyersSquibb)的Opdivo(通用名Nivolumab)和美国默克公司的Keytruda(通用名Pembrolizumab)。Opdivo获批用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈鳞细胞癌、经典型霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、高微卫星不稳定性癌、晚期肾细胞癌和肝细胞癌的治疗；Keytruda获批用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈鳞细胞癌、经典型霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、高微卫星不稳定性癌和胃癌的治疗。另外，国内外进入临床研究的PD-1靶点抗体药物包括再生元/赛诺菲的REGN2810、君实的JS001、恒瑞的SHR-1210、百济神州的BGB-A317、信达的IBI308和恒誉/药明康德的GLS-010，还有更多此类和抗PD-L1抗体药物处临床前研究阶段。
总之，以PD-1为靶点的单克隆抗体研究已经取得了一定的进展。然而，肿瘤或癌症免疫治疗中仍然需要药效更好、安全性更高、市场竞争力更强的优质单抗生物药。
发明内容
本发明中使用的术语的中文名称及其对应的英文缩写形式如表1所示。
表1：术语中英文对照表
本发明第一方面提供了一种分离的PD-1抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区或其部分和/或重链可变区或其部分，
其中轻链可变区或其部分包含氨基酸序列为SEQ ID NO：10的轻链CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO：11的轻链CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO：12的轻链CDR3；且
重链可变区或其部分包含氨基酸序列为SEQ ID NO：13的重链CDR1氨基酸序列为SEQ ID NO：14的重链CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO：15的重链CDR3。
在一个具体实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含、由以下组成或基本上由以下组成：与PD-1抗体轻链可变区序列SEQ ID NO：23具有至少90％，92％，95％，98％或100％序列同一性的氨基酸序列和与PD-1抗体重链可变区序列SEQ ID NO：22具有至少90％，92％，95％，98％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一个具体实施方案中，所述抗体进一步包含轻链恒定区和重链恒定区；在一个具体实施方案中，其中所述抗体进一步包含轻链恒定区和重链恒定区，优选地所述轻链恒定区为氨基酸序列为与SEQ ID NO：25的kappa轻链恒定区具有至少90％，92％，95％，98％或100％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述重链恒定区为与氨基酸序列为SEQ ID NO：24的IgG4重链恒定区具有至少90％，92％，95％，98％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述抗体为IgG抗体。在一个具体实施方案中，所述抗体为IgG4抗体。
在一个具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一个具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段与重组人PD-1蛋白结合亲和力KD平均值为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200pM或更高，或者任意前述值作为端点构成的范围，例如约20-200pM，或约60-70pM等，或其中的任意值，例如约64.8pM或约108pM等。该结合亲和力KD测定方法如本申请实施例部分所述。
在一个具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段与含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的PD-1蛋白分子或与SEQ ID NO：1具有至少90％，92％，95％，98％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白分子特异性结合。
本发明第二方面提供一种分离的PD-1抗体或其抗原结合片段，其特异性结合选自PD-1蛋白胞外区60SESFV64、78KLAAFPEDRSQP89、128LAPKAQI134中至少一种的肽序列。
在一个具体实施方案中，提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合选自PD-1蛋白胞外区E61、K78、D85、P130中至少一种的氨基酸残基。在一个具体实施方案中，抗原结合片段的形式为Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fd片段、Fd′片段、单链抗体分子或单域抗体；在一个具体实施方案中，单链抗体分子为scFv、di-scFv、tri-scFv、双体抗体或scFab。
在又一具体实施方案中，上述方案中的抗体或其抗原结合片段与另一分子形成共价或非共价连接物或形成重组多靶点融合药物从而生成改构药物分子，所述另一分子选自小分子化合物和/或生物大分子。
本发明的第三方面提供了一种分离的核酸，其核苷酸序列编码第一和第二方面的抗体和/或抗原结合片段。
本发明的第四方面提供了一种载体，其包含第三方面的核酸。
本发明的第五方面提供了一种分离的细胞，其表达第一和第二方面的抗体和/或抗原结合片段，和/或包含第三方面的核酸或第四方面的载体。
在一个具体实施方案中，所述细胞为原核细胞或真核细胞。
本发明的第六方面提供了一种产生第一和第二方面的抗体和/或抗原结合片段的方法，所述方法包括培养第五方面的细胞和纯化所述抗体。
本发明的第七方面提供了第一和第二方面的抗体和/或抗原结合片段和/或改构药物分子制备用于治疗肿瘤或癌症的药物的用途。
在一个具体实施方案中，所述肿瘤或癌症为结肠癌。
本发明的第八方面提供了第一方面的抗体和/或抗原结合片段和/或改构药物分子用于治疗肿瘤或癌症的用途。
在一个具体实施方案中，所述肿瘤或癌症为结肠癌。
本发明的第九方面提供了一种药物组合物，其包含第一和第二方面的抗体和/或抗原结合片段和/或改构药物分子。
本发明的第十方面提供了第九方面的药物组合物与一种或多种治疗活性化合物的药物组合。
本发明的第十一方面提供了一种试剂盒，其包含第一和第二方面的抗体和/或抗原结合片段和/或改构药物分子，或第九方面的药物组合物或第十方面的药物组合，优选地，还进一步包含给药的装置。
本发明的第十二方面提供了一种治疗肿瘤或癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的第一和第二方面的分离的PD-1抗体或其抗原结合片段或改构药物分子、或第九方面的药物组合物、或第十方面的药物组合、或第十一方面的试剂盒，由此治疗所述肿瘤或癌症，优选地其中所述肿瘤或癌症为结肠癌。
附图说明
图1：鼠抗体PD1-M944阻断PD-L1(A)和PD-L2(B)与PD-1蛋白的结合。
图2：DLISA检测人源化抗体PD1-H944与重组人PD-1蛋白的结合(A，B，C，n＝3)。
图3：FACS检测PD1-H944与重组Jurkat/PD-1细胞的结合。
图4：Octet检测PD1-H944(A1、B1、C1，n＝3)和Nivolumab(A2、B2、C2n＝3)与重组人PD-1蛋白的亲和力。
图5：ELISA检测PD1-H944(A)、Nivolumab(B)和阴性对照(C)与重组人、猴、小鼠PD-1蛋白的结合。
图6：不同浓度的PD1-H944和Nivolumab与猴PD-1蛋白(A)和小鼠PD-1蛋白(B)的结合。
图7：ELISA检测PD1-H944阻断人PD-L1(A)和人PD-L2(B)与重组人PD-1蛋白的结合。
图8：FACS检测PD1-H944阻断人PD-L1与人Jurkat/PD-1细胞的结合。
图9：ELISA检测PD1-H944与重组CD16a蛋白的结合。
图10：ELISA检测PD1-H944与重组C1q蛋白的结合。
图11：ELISA检测PD1-H944与人FcRn蛋白的结合。
图12：混合淋巴实验中PD-1抗体促进IL-2(上)及IFN-γ(下)分泌(A，B，C为3位献血者的CD4+T细胞)。
图13：PD1-H944在重组人PD-1报告基因细胞系统中的活化功能。
图14：重组CD16a报告基因系统检测PD1-H944的ADCC功能(A、B为不同次实验结果；C、D为抗体浓度最高点的生物发光强度数值；＊＊表示P＜0.01)。
图15：PD1-H944对CHO-PD-1细胞的CDC效应。
图16：给药后动物体重变化趋势图。
图17：给药后肿瘤体积增长趋势图。
图18：实验结束时肿瘤重量图(＊P＜0.05)。
图19：给药后动物体重变化趋势图。
图20：给药后的肿瘤体积增长趋势图。
图21：实验终点肿瘤重量图。
图22：PD1-H944的同源建模与PD1的晶体结构对接。
图23：显示了突变位点的PD1蛋白模型。
图24：显示了PD-1蛋白突变体与PD-L1、Nivolumab以及PD1-H944的结合。
图25A-C显示了PD1-H944、PD-L1以及Nivolumab与P-1的特异性结合的氨基酸位点。
具体实施方式
定义
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的技术领域的普通技术人员通常理解的含义。为了本发明的目的，进一步定义以下术语。
当用于本文和所附权利要求书中时，单数形式“一”、“一种”、“另一”和“所述”包括复数指代对象，除非上下文明确地另有指示。
术语“抗体”意指免疫球蛋白分子，是指表现所需生物学活性的抗体的任何形式。包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)，甚至包括抗体片段。典型地，全长抗体结构优选包含4条多肽链，通常通过二硫键相互连接的2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链包含重链可变区和重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区和轻链恒定区。在此典型全长抗体结构外，其结构还包括其他衍生形式。
术语“可变区”指抗体重链或轻链中涉及抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)一般具有类似的结构可进一步细分为穿插在更保守的区域(称为框架区(FR))中的高变区(称为互补决定区(CDR))。
术语“互补决定区”(CDR，例如CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区的这样一些氨基酸残基，其存在对于抗原结合来说是必需的。每个可变区通常具有3个被鉴别为CDR1、CDR2和CDR3的CDR区域。每个互补决定区可包含来自如Kabat所定义的“互补决定区”的氨基酸残基(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immulological Interest，5th Ed.PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.1991))和/或来自“高变环”的那些残基(Chothia and Lesk；J Mol Biol 196：901-917(1987))。
术语“构架”或“FR”残基是如本文中所定义的CDR残基之外的那些可变区残基。
每个重链可变区和轻链可变区通常包含3个CDR和最多达4个FR，所述CDR和FR从氨基末端至羧基末端以例如以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3FR4。
给定抗体的互补性决定区(CDR)和框架区(FR)可以使用Kabat体系标识(Kabat等：Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生和公众服务部，PHS，NIH，NH出版编号91-3242，1991)。
术语“恒定区”是指抗体的轻链和重链上的这样一些氨基酸序列，不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，完整的抗体可归属于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五类抗体，其中IgG和IgA还可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。相应地，五类抗体的重链分别归入α、δ、ε、γ和μ链。根据其轻链恒定区的氨基酸序列，抗体的轻链可归入κ和λ。。
“抗体的抗原结合片段”包含完整抗体分子的一部分，其保留母体抗体的至少某些结合特异性，通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fd片段、Fd′片段、单链抗体分子(例如scFv，di-scFv或tri-scFv、双体抗体或scFab)、单域抗体。
“抗体片段”是保留母体抗体的至少某些生物学特性的非完整抗体分子，其实例除上述“抗原结合片段”所述及的那些之外，还包括但不限于Fc片段。
术语“改构药物分子”是指抗体或其片段，如抗原结合片段与另一分子形成共价或非共价连接物或形成重组多靶点融合药物，另一分子选自小分子化合物或生物大分子。
术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而其余部分来源于不同来源或物种的抗体。“人源化抗体”是“嵌合抗体”的子集。
术语“人源化抗体”或“人源化抗原结合片段”在本文中被定义为这样的抗体或抗体片段：(i)来源于非人来源(例如，携带异源免疫系统的转基因小鼠)且基于人种系序列的抗体；或(ii)可变区是非人来源而恒定区是人来源的嵌合抗体；或者(iii)CDR移植的，其中可变区的CDR来自非人来源，而可变区的一个或多个构架区为人来源的，并且恒定区(如果有的话)是人来源的。“人源化”的目的是消除非人来源抗体在人体内的免疫原性，而同时最大可能地保留亲和力。选择与非人来源抗体构架序列最相似的人构架序列为模板进行人源化改造是有利的。在某些情况下，可能需要用非人构架中相应的残基替换人类构架序列中的一个或多个氨基酸，以避免亲和性的丧失。
“单克隆抗体”是指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即，所述包含单一抗体的群体除了可能以极少量存在的可能突变(例如天然突变)之外是相同的。因此，所述术语“单克隆”表明所述抗体的性质，即不是不相关抗体的混合物。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体均针对抗原上的单独一个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制剂的优点在于它们通常不会被其他抗体污染。所述术语“单克隆”不应被理解为需要通过任何特定的方法产生所述抗体。所述术语单克隆抗体具体地包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
抗体“特异性结合”目的抗原例如肿瘤相关的多肽抗原靶(本文中，PD-1)，即以足够的亲和力结合所述抗原以使得所述抗体可用作治疗剂，靶向表达所述抗原的细胞或组织，并且与其他蛋白质无显著交叉反应或者与除了上文提到的抗原靶的同源体和变体(例如突变形式、剪接变体，或蛋白水解作用截短的形式)以外的蛋白质无显著交叉反应。
术语“结合亲和力”是指分子的单个结合位点与其结合伴侣之间非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，用于本文时“结合亲和力”是指固有的结合亲和力，其反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间1∶1的相互作用。“KD”、“结合速率常数kon”和“解离速率常数koff”通常用于描述分子(例如抗体)与其结合伴侣(例如抗原)之间的亲和力，即，配体结合特定蛋白的紧密程度。结合亲和力受非共价分子间相互作用的影响，例如氢键，静电相互作用，两个分子之间的疏水和范德华力。另外，配体与其靶分子之间的结合亲和力可能受到其他分子的存在的影响。亲和力可通过本领域中已知的常规方法来分析，包括本文描述的ELISA。
术语“表位”包括能够特异性结合至抗体或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链，或其组合)组成，并且通常具有特定三维结构特征以及特定的电荷特征。
“分离的”抗体是已经被鉴别并且从天然表达该抗体的细胞中分离的抗体。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体以及通常通过至少一个纯化步骤进行制备的抗体。
两条多肽或核酸序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同的残基的数目占残基总数的百分比。在计算同一性百分数时，将正在比较的序列以产生序列之间最大匹配的方式比对，通过特定算法解决比对中的空位(如果存在的话)。确定两个序列之间同一性的优选计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包，包括GAP、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)。上述程序可以公开地从国际生物技术信息中心(NCBI)和其他来源得到。熟知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。
术语“Fc受体”或“FcR”指与抗体Fc区结合的受体。优选天然序列的人FcR，且优选与IgG抗体结合的受体(γ受体)，其包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII亚型，以及这些受体的变体。其它FcR均被包含在术语“FcR”中。该术语也包括新生儿受体(FcRn)，其负责将母体的IgG转运至胎儿(Guyer等，免疫学杂志117：587(1976)和Kim等，免疫学杂志24：249(1994))。
术语“新生儿Fc受体”、简称“FcRn”，其结合IgG抗体Fc区。新生儿Fc受体(FcRn)在体内IgG类抗体的代谢命运中起重要作用。FcRn行使功能以从溶酶体降解途径营救IgG，从而降低其在血清中的清除率并加长半衰期。因此，IgG体外FcRn结合性质/特征指示它在血液循环中的体内药代动力学性质。
术语“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性，其随抗体同种型而不同。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和依赖补体的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、依赖抗体的细胞毒性(ADCC)、依赖抗体的吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞激活。
术语“效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应子功能的白细胞。在一个方面，所述效应细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从天然来源，例如，血液中分离。效应细胞通常是与效应子阶段相关联的淋巴细胞，并发挥作用，以产生细胞因子(辅助T细胞)、杀死被病原体感染的细胞(细胞毒性T细胞)或分泌抗体(分化的B细胞)。
“免疫细胞”包括具有造血的起源并在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞包括：淋巴细胞，例如B细胞和T细胞；天然杀伤细胞；髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中结合到在某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fcγ受体上的分泌Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合至承载抗原的靶细胞，随后使用例如细胞毒素杀死所述靶细胞。为了评估目的抗体的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，例如记载于美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056(Presta)中的体外ADCC测定法、本申请的实施例中记载的方法。用于这类测定法的有用效应细胞包括PBMC和NK细胞。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体的存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的活化由补体系统的第一组分(C1q)与(适当亚类的)抗体结合起始，其中该抗体与其相应抗原结合。为了评估补体活化，可进行CDC测定法，例如记载于Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol Methods 202：163(1996)中的CDC测定法、例如本申请的实施例中记载的方法、例如在美国专利No.6,194,551 Bl和WO1999/51642中记载的方法，其中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列的多肽变体(具有变体Fc区的多肽)和具有增强或降低的C1q结合的多肽变体。
本发明的抗体的氨基酸序列和核苷酸序列
本发明首先采用重组人PD-1蛋白来免疫小鼠，然后通过噬菌体抗体库筛选获得与重组人PD-1特异性结合的高结合力抗体M944scFv抗体克隆。之后采用PCR方法将编码M944scFv抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列分别与编码小鼠IgG1重链恒定区和小鼠kappa轻链恒定区的核苷酸序列进行拼接，插入瞬转表达载体HEK-293，进行培养表达。采用蛋白A纯化柱进行纯化获得高纯度鼠抗体PD1-M944。ELISA测试表明，鼠抗体PD1-M944能够很好地阻断PD-1与其配体的结合。
然后，采用经典的人源化方式CDR移植方法，首选与鼠轻链或重链可变区最接近的人抗体轻链或重链可变区为模板，在一个实施方案中，选择IGKV3-11*01为轻链可变区的人源模板，IGHV3-21*02为重链可变区的人源模板，将鼠抗体轻链/重链的各3个CDR分别插入到上述人源模板的相应位置，获得人源化的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)序列。由于鼠源框架区的关键位点对于支撑CDR的活性至关重要，因此将关键点回复突变为鼠抗体的序列。分别将轻链/重链信号肽序列、回复突变的人源化抗体轻链/重链的可变区序列、人IgG4重链恒定区/人kappa轻链恒定区序列依次拼接，获得人源化抗体PD1-H944的氨基酸序列和核苷酸序列。
本发明的核酸
本发明还涉及编码本发明的抗体或其部分的核酸分子。这些核酸分子的序列包括但不限于SEQ ID NO：3-7和26-33。
本发明的核酸分子不限于本文公开的序列，还包括其变体。本发明中变体可以参照它们在杂交中的物理特性来描述。本领域技术人员会认识到利用核酸杂交技术，核酸可用于鉴别其互补物以及其等同物或同系物。还会认识到杂交可以以低于100％互补性发生。然而，考虑到条件的适当选择，杂交技术可用于基于DNA序列与特定探针的结构相关性来区分所述DNA序列。对于这类条件的指导参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，1989和Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Sedman，J.G.，Smith，J.A.，&Struhl，K.eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.NewYork：John Wiley and Sons。
重组载体和表达
本发明还提供了包含本发明的一个或多个核苷酸序列的重组构建体。本发明的重组构建体可与载体一起使用，所述载体例如质粒、噬粒、噬菌体或病毒载体，编码本发明的抗体的核酸分子被插入所述载体中。
本文提供的抗体可通过在宿主细胞中重组表达编码轻链和重链或其部分的核苷酸序列来制备。为了以重组方法表达抗体，可用携带编码轻链和/或重链或其部分的核苷酸序列的一个或多个重组表达载体转染宿主细胞，以使得所述轻链和重链在所述宿主细胞中表达。标准重组DNA方法学被用于制备和/或获得编码重链和轻链的核酸、将这些核酸纳入重组表达载体中并且将所述载体引入至宿主细胞中，例如Sambrook，Fritsch andManiatis(eds.)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor，N.Y.，(1989)、Ausubel，F.M.et al.(eds.)Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates，(1989)和Boss et al.的美国专利No.4,816,397中记载的那些。
此外，可将编码所述重链和/或轻链的可变区的核苷酸序列转化为例如编码全长抗体链、Fab片段或ScFv的核苷酸序列：例如可以将编码轻链可变区或重链可变区的DNA片段可操作地连接(以使得所述两个DNA片段编码的氨基酸序列都在框架中)至编码例如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。人重链和轻链恒定区的序列是本领域中已知的(参见，例如Kabat，E.A.，el al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242)，包括这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。
为了表达所述抗体，可使用标准重组DNA表达方法(参见，例如Goeddel；GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))。例如，可将编码所需抗体的核苷酸序列插入至表达载体中，随后将所述表达载体转染至合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞为原核细胞和真核细胞。原核宿主细胞的实例为细菌，真核宿主细胞的实例为酵母、昆虫或哺乳动物细胞。应理解，包括选择调节序列的表达载体的设计受到多种因素的影响，例如宿主细胞的选择、所需的蛋白质的表达水平以及表达是组成型的还是可诱导型的。
本发明的抗体可通过公知方法从重组细胞培养物回收和纯化，所述公知方法包括但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、蛋白A亲和层析、蛋白G亲和层析、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟磷灰石色谱法以及凝集素色谱法。高效液相色谱法(“HPLC”)也可用于纯化。参见例如，Colligan，CurrentProtocols in Immunology，或Current Protocols in Protein Science，John Wiley&Sons，NY，N.Y.，(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各自以引用的方式全文纳入本文。
本发明的抗体包括天然纯化的产物、化学合成方法的产物和通过重组技术从原核及真核宿主产生的产物，所述真核宿主包括，例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。本发明的抗体可以是糖基化的，或者可以是非糖基化的。这类方法记载于许多标准实验室手册中，例如上文的Sambrook，第17.37-17.42节；上文的Ausubel，第10、12、13、16、18和20章。
因此，本发明的实施方案还为包含所述载体或核酸分子的宿主细胞，其中所述宿主细胞可为高等真核宿主细胞例如哺乳动物细胞、低等真核宿主细胞例如酵母细胞，并可为原核细胞例如细菌细胞。
本发明的抗体的特性和功能
对所述PD1-H944抗体进行特性分析和功能分析。分析结果表明，本发明的抗体具备以下优势：(1)能够与人PD-1高亲和力特异性结合，具有低解离速率，从而提供良好的抗肿瘤药效；(2)与Nivolumab相比，能够更完全地阻断PD-L1与PD-1的结合；(3)与Nivolumab相比，与重组人PD-1的结合更灵敏、更具特异性；与重组猴PD-1有与Nivolumab类似的交叉结合，且均不结合鼠PD-1；(4)能够有效阻断重组人PD-1与其配体PD-L1和PD-L2的结合；(5)能够有效地再激活免疫抑制的T细胞，活化重组人PD-1报告基因细胞系统；(6)在嵌合PD-1小鼠的结肠癌MC38荷瘤小鼠模型中具有优异的抑瘤作用，远好于Nivolumab(来源：北京义翘神州科技有限公司)，且与Pembrolizumab(来源：北京义翘神州科技有限公司)相当；(7)ADCC和CDC活性均很低，其中ADCC活性低于Nivolumab。
用途
本发明的抗体可用于治疗多种肿瘤或癌症或制备治疗多种肿瘤或癌症的药物，其特异性针对异常表达的PD-1受体。所述肿瘤或癌症的非限制性实例包括结肠癌。
药物组合物
可将本发明的抗体与至少一种其他试剂(例如稳定化合物)制备成药物组合物，其包括本发明的抗体和一种或多种药物可接受载体、稀释剂或赋形剂。
试剂盒
本发明还涉及药物包装和包含一个或多个容器的试剂盒，所述容器装有上文提到的本发明的药物组合物。与这类容器相关的可可以是管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的提示，其反映被所述产品的生产、使用或销售的机构批准用于人类给药。
制备和储存
本发明的药物组合物可以以本领域中已知的方式制备，例如通过常规的混合、溶解、造粒、锭剂制备、研磨、乳化、包裹、包埋或冻干方法。
在已经制备包含配制于可接受的载体中的本发明化合物的药物组合物之后，可以将它们放置在适当的容器中并贴上标签用于治疗所标明的病症。这类标签会包括给药的量、频率和方法。
药物组合
上述包含本发明的抗体的药物组合物还与一种或多种其他治疗剂，例如抗肿瘤剂组合，其中所得组合不会引起不可接受的不利影响。
以下实施例用于示例性地说明本发明，而非对本发明进行限制。
实施例
实施例1：采用噬菌体抗体展示文库筛选阻断PD-1与PD-L1/PD-L2结合的鼠源抗体
1.1小鼠免疫
采用重组人PD-1蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司，Cat.10377-H08H)来免疫小鼠。该人PD-1蛋白(UniProtKB Q15116)的胞外区氨基酸序列为Met 1-Gln167(SEQ IDNO：1)。
具体方法为：将重组人PD-1蛋白与弗氏佐剂混合，使用混合物进行五次免疫，每次免疫剂量为20μg，皮下注射，免疫间隔依次为2周，3周，2周，3周。从第二次免疫起，每次免疫后七天经眼眶内眦静脉丛采血。采用ELISA方法，包被重组人PD-1蛋白以检测小鼠抗PD-1的血清效价。第五次免疫血清滴度达到8000倍稀释，第五次免疫9周后使用25μg重组人PD-1蛋白进行静脉注射加强，4天之后处死小鼠，取小鼠的脾脏组织冻存于液氮中。
1.2噬菌体抗体库筛选
小鼠的脾组织用TriPure Isolation Reagent试剂(来源：Roche)进行RNA提取，用反转录试剂盒(来源：Invitrogen)进行反转录获得cDNA，PCR扩增分别获得编码小鼠抗体的轻链和重链可变区序列的核苷酸序列，采用重叠延伸拼接PCR法将编码小鼠抗体的轻链和重链可变区序列的核苷酸序列拼接成编码scFv的核苷酸序列，轻重链可变区通过接头(linker)：TCTAGTGGTGGCGGTGGTTCGGGCGGTGGTGGAGGTGGTAGTTCTAGATCTTCC(SEQ ID NO：2)进行连接(参考文献：Rapid PCR-cloning of full-length mouse immunoglobulinvariable regions；Cloning immunoglobulin variable domains for expression bythe polymerase chain reaction T Joneset.al Bio/Technolgy 9(6)：579·July1991)，再通过限制性内切酶Sfi I(来源：Fermentas)酶切连接到噬菌体载体pComb3x(来源：北京义翘神州科技有限公司)中，电转化X-Blue感受态构建免疫小鼠的噬菌体展示scFv抗体库。将重组人PD-1蛋白包被在ELISA板上，按照噬菌体抗体淘选的流程，筛选获得抗PD-1阳性抗体富集的噬菌体文库(参考文献：Antibody Phage Display：Methods andProtocols，Philippa M.O’Brien and Robert Aitken(Eds)，Humana Press，ISBN：9780896037113)。从富集的文库中挑取单克隆噬菌体进行表达，用ELISA方法检测与重组人PD-1蛋白的结合，筛选获得与重组人PD-1特异性结合的高结合力抗体M944 scFv抗体克隆，该克隆送测序公司测序获得M944 scFv抗体的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。
1.3鼠抗体PD1-M944的生产
采用PCR方法将M944 scFv抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：4/5)分别与小鼠IgG1重链恒定区(SEQ ID NO：6)和小鼠kappa轻链恒定区(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列进行拼接，分别用Hind III和Xba I(来源：Fermentas)酶切插入瞬转表达载体pSTEP2中(来源：北京义翘神州科技有限公司)，提质粒后转染HEK-293细胞进行培养表达7天，培养上清采用蛋白A纯化柱进行纯化获得高纯度抗体。
1.4鼠抗体PD1-M944功能检测
(1)阻断重组人PD-1与PD-L1的结合：将浓度为1μg/mL的重组人PD-1蛋白包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温阻断1小时后，同时加入100μL 10μg/mL的生物素化蛋白PD-L1-Fc-biotin(来源：北京义翘神州科技有限公司)与不同浓度(0.4μg/mL、2μg/mL和10μg/mL)的PD1-M944或Nivolumab(来源：北京义翘神州科技有限公司)共同孵育，洗板去除未结合抗体。加入抗生蛋白链菌素/HRP(来源：北京中杉金桥生物技术有限公司)孵育后重复洗板，加入底物显色液进行显色，终止后检测OD450。结果显示，重组PD-L1蛋白可有效结合包被的PD-1蛋白，加入不同浓度的PD1-M944或Nivolnmab时均可有效地抑制重组PD-L1蛋白与PD-1的结合(图1A)。该结果表明鼠抗体PD1-M944具有很好的阻断PD-1与其配体PD-L1结合的功能。
(2)阻断重组人PD-1与PD-L2的结合：将浓度为1μg/mL的重组人PD-1蛋白包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温阻断1小时后，同时加入100μL 0.5μg/mL的生物素化蛋白PD-L2-Fc-生物素(来源：北京义翘神州科技有限公司)，与不同浓度(0.5μg/mL、2.5μg/mI和12.5μg/mL)的PD1-M944或Nivolumab(来源：北京义翘神州科技有限公司)共同孵育，洗板去除未结合抗体，加入抗生蛋白链菌素/HRP(来源：北京中杉金桥生物技术有限公司)孵育后重复洗板，加入底物显色液进行显色，终止后检测OD450。结果显示，重组PD-L2蛋白可有效结合包被的PD-1蛋白，加入不同浓度的PD1-M944或Nivolumab时均可有效的抑制重组PD-L2与PD-1的结合(图1B)。该结果表明鼠抗体PD1-M944具有很好的阻断PD-1与其配体PD-L2结合的功能。
实施例2：人源化改造鼠抗体PD1-M944的序列以产生人源化抗体PD1-H944的序列
2.1鼠抗体PD1-M944轻链及重链的各3个CDR的确定
在实施例1.2中测定了M944 scFv抗体的核苷酸序列，据此核苷酸序列推导出PD1-M944 scFv抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列，见SEQ ID NO：8/9。
参考Kabat编号方式确定鼠抗体PD1-M944轻链及重链各3个CDR的氨基酸序列，参见表1。上述的轻链及重链各3个CDR在后续步骤中被移植且保留在最终获得的人源化抗体PD1-H944中，见实施例2.2和2.3。
表1：PD1-M944/PD1-H944轻链及重链CDR序列
2.2将鼠抗体PD1-M944人源化CDR移植
鼠抗体人源化采用经典的人源化方式CDR移植方法，首选与鼠轻链或重链可变区最接近的人抗体轻链或重链可变区为模板，将鼠抗体轻链或重链的各3个CDR(表1)插入到该人抗体的可变区中，获得人源化的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)序列。所用PD1-M944的轻链可变区的人源模板为IGKV3-11＊01，该模板与PD1-M944轻链的同源性为73.48％，重链可变区的人源模板为IGHV3-21＊02，该模板与PD1-M944重链的同源性为81.94％。
2.3将人源化可变区序列的框架区回复突变
由于鼠源框架区有关键点对于支撑CDR的活性至关重要，因此将关键点回复突变为鼠抗体的序列，其中轻链的第89位回复突变为M，第91位回复突变为F，重链的第44位回复突变为R，第78位回复突变为N。
经CDR人源化移植和框架区回复突变获得人源化抗体PD1-H944，其重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO：16/17所示；其含有信号肽的形式的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO：18/19所示，分别包含依次连接的重链/轻链信号肽序列(SEQ ID NO：20/21)；其人源化抗体重链/轻链的可变区序列(SEQ ID NO：22/23)；其人源化抗体的恒定区为人IgG4重链恒定区/人kappa轻链恒定区序列(SEQ ID NO：24/25)。
表2：鼠源和人源化抗体的氨基酸序列和核苷酸序列
实施例3：人源化抗体PD1-H944的生产
将上述含有信号肽的PD1-H944抗体的重/轻链核苷酸序列(SEQ ID NO：26/27)PCR扩增后，其中包含依次连接的重链/轻链信号肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：28/29)、人源化抗体重链/轻链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：30/31)和人IgG4重链恒定区/人kappa轻链恒定区的核苷酸序列(SEQ ID NO：32/33)，分别通过限制性内切酶Hind III和Xba I(来源：Fermentas)双酶切插入商业载体pcDNA3(来源：Invitrogen)中，提质粒后pCDNA3轻链载体用Nru I+Nae I+Dra I三酶切回收1.8kb条带插入CHO/dhfr系统的表达载体pSSE中，再将pCDNA3重链载体用Nru I+Nae I+Dra I(来源：Fermentas)三酶切回收2.5kb插入前一步构建好的pSSE(来源：北京义翘神州科技有限公司)轻链载体中获得完整载体，该表达载体包含DNA扩增元件dhfr基因、NeoR抗性基因和抗体轻链和重链的表达元件的真核细胞表达载体。将该表达载体转染至dhfr-DG44细胞中，经G418筛选获得PD1-H944阳性细胞株，经MTX逐步加压筛选获得PD1-H944高表达细胞株，再经无血清培养驯化进行克隆筛选。每个步骤都采用ELISA检测选取抗体高表达的克隆，并结合细胞生长的状态和抗体药物的关键质量属性分析结果筛选获得高表达细胞株。
采用无血清加料悬浮培养的方式培养PD1-H944生产CHO细胞株，获得高纯度和高质量的PD1-H944抗体。
实施例4：人源化抗体PD1-H944的特性分析
4.1 PD1-H944对人、小鼠和猴PD-1抗原结合亲和力分析
(1)PD1-H944与重组人PD-1蛋白的结合能力
采用间接ELISA检测PD1-H944与重组人PD-1蛋白的特异性结合。将不同浓度(0.16ng/mL、0.49ng/mL、1.48ng/mL、4.44ng/mL、13.33ng/mL、40ng/mL、120ng/mL、360ng/mL、1080ng/mL、3240ng/mL和9720ng/mL)的重组人PD-1蛋白包被于96孔板上，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1小时后，分别加入100μL 2μg/mL的PD1-H944、Nivolumab(来源：Bristol-Myers Squibb)和阴性对照抗体H7N9-R1-IgG4(来源：北京义翘神州科技有限公司)孵育，洗板去除未结合抗体。加入山羊抗人IgG F(ab)2/HRP(来源：JACKSON)孵育后重复洗板，加入底物显色液进行显色，检测OD450。结果显示，PD1-H944和Nivolumab与重组人PD-1蛋白的特异性结合EC50分别为31.5ng/mL，R2＝0.998和179.0ng/mL，R2＝0.997。这说明PD1-H944结合重组人PD-1蛋白的能力明显好于Nivolumab(图2A-C)。
(2)PD1-H944与重组Jurkat/PD-1细胞的结合能力
以对数生长期的重组人PD-1稳定表达细胞株Jurkat/PD-1(来源：神州细胞工程有限公司)为实验材料，通过流式细胞仪检测PD1-H944与重组Jurkat/PD-1细胞的结合能力。取5×105个/管处于对数生长期的重组Jurkat/PD-1细胞，加入不同浓度(0.195μg/mL、0.391μg/mL、0.781μg/mL、1.562μg/mL、3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL)的PD1-H944、Nivolumab和阴性对照抗体H7N9-R1-IgG4，4℃混合孵育后清洗，离心去除未结合抗体。加入山羊抗人IgG Fc-FITC(来源：北京义翘神州科技有限公司)检测抗体在细胞上结合。结果显示，PD1-H944与Jurkat/PD-1细胞特异性结合EC50＝9.63μg/mL，R2＝1.000，Nivolumab与Jurkat/PD-1细胞特异性结合EC50＝10.18μg/mL，R2＝0.994，阴性对照抗体H7N9-R1-IgG4与Jurkat/PD-1细胞无结合(图3)。这说明PD1-H944与Jurkat/PD-1细胞表达的PD-1有良好的结合能力，并且其结合能力略好于Nivolumab。
(3)PD1-H944与重组人PD-1蛋白的结合亲和力
利用Octet生物分子相互作用分析系统测定多个浓度点的PD1-H944(0.90nM、1.79nM、3.66nM、7.24nM)、Nivolumab(0.51nM、1.02nM、2.05nM、4.10nM)与PD-1的亲和力，以H7N9-R1-IgG4(13.30nM)为阴性对照抗体。结果显示，PD1-H944与重组人PD-1蛋白结合亲和力KD平均值为64.8pM，结合速率常数kon平均值为3.01E+05M-1s-1，解离速率常数koff平均值为1.95E-05s-1；Nivolumab与PD-1蛋白结合亲和力KD平均值为74.1pM，结合速率常数kon平均值为6.92E+05M-1s-1，解离速率常数koff平均值为5.12E-05s-1(图4)。PD1-H944亲和力强于Nivolumab的亲和力，约为其亲和力的1.14倍，并且PD1-H944具有更慢的解离速率，因此PD1-H944比Nivolumab具有更强的结合PD-1蛋白的能力。
(4)PD1-H944与重组猴、小鼠PD-1蛋白的结合能力
采用间接ELISA检测PD1-H944与重组猴、小鼠PD-1蛋白的特异性结合。将不同浓度(0.16ng/mL、0.49ng/mL、1.48ng/mL、4.44ng/mL、13.33ng/mL、40ng/mL、120ng/mL、360ng/mL、1080ng/mL、3240ng/mL和9720ng/mL)的重组人、猴和小鼠PD-1蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司)包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1小时后，分别加入100μL 2μg/mL的PD1-H944、Nivolumab和阴性对照抗体H7N9-R1-IgG4孵育后洗板，加入检测二抗——山羊抗人IgG F(ab)2/HRP，显色，检测OD450，每组3次平行检测。结果显示，PD1-H944能结合重组人PD-1蛋白和重组猴PD-1蛋白，抗原EC50分别为25.8ng/mL(R2＝0.999)和32.7ng/mL(R2＝0.997)，与重组小鼠PD-1蛋白无交叉结合(图5A)；Nivolumab能结合重组人PD-1蛋白和重组猴PD-1蛋白，EC50分别为113.2ng/mL(R2＝0.997)和80.2ng/mL(R2＝0.997)，与小鼠PD-1蛋白无结合(图5B)；阴性对照抗体与重组人PD-1蛋白、重组猴PD-1蛋白和重组小鼠PD-1蛋白均无结合(图5C)。PD1-H944与猴PD-1的良好结合支持猴可用于该药物安全性评价。
(5)PD1-H944与重组猴、小鼠PD-1蛋白的结合亲和力
利用Octet测定不同浓度梯度(参见图6A-B)的PD1-H944、Nivolumab与生物素化的猴、小鼠PD-1蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司)的亲和力，分析获得KD值。结果显示，PD1-H944与重组猴PD-1蛋白的亲和力KD值为108pM，Nivolumab与重组猴PD-1蛋白的亲和力KD值为131pM，两者亲和力相近(图6A)；PD1-H944与Nivolumab与重组小鼠PD-1蛋白均无结合(图6B)。
4.2 PD1-H944阻断人PD-1配体(PD-L1和PD-L2)与人PD-1蛋白的结合
将重组人PD-1蛋白包被于96孔板上，每孔100uL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1小时后，加入1μg/mL的人PD-L1-生物素(来源：北京义翘神州科技有限公司)或2μg/mL的人PD-L2-生物素(来源：北京义翘神州科技有限公司)，再加入不同浓度(0.003μg/mL、0.008μg/mL、0.025μg/mL、0.074μg/mL、0.222μg/mL、0.667μg/mL、2μg/mL、6μg/mL、18μg/mL)的PD1-H944、Nivolumab或阴性对照抗体H7N9-R1-IgG4共同孵育，加入抗生蛋白链菌素/HRP孵育检测OD450，每组2次平行检测。结果显示，生物素化的重组人PD-L1和PD-L2蛋白可有效结合包被的人PD-1蛋白，加入不同浓度的PD1-H944和Nivolumab均可有效的抑制重组人PD-L1蛋白(图7A)和重组人PD-L2蛋白(图7B)与人PD-1的结合。PD1-H944和Nivolumab对重组人PD-L1的半抑制浓度IC50分别为0.116μg/mL(R2＝0.995)和0.129μg/mL(R2＝0.997)，对重组人PD-L2的半抑制浓度IC50分别为0.446μg/mL(R2＝0.994)和0.486μg/mL(R2＝0.996)。PD1-H944对人PD-1与人PD-L1或人PD-L2结合的抑制能力与Nivolumab无明显差异，阴性对照抗体无明显抑制作用。
4.3 PD1-H944阻断人PD-1配体(PD-L1)与人PD-1表达细胞的结合
取5×105个/管处于对数生长期的重组人PD-1稳定表达Jurkat/PD-1细胞，加入不同浓度(0.260μg/mL、0.390μg/mL、0.585μg/mL、0.878μg/mL、1.317μg/mL、1.975μg/mL、2.963μg/mL、4.444μg/mL、6.667μg/mL或10.000μg/mL)的PD1-H944、Nivolumab和阴性对照抗体H7N9-R1-IgG4，4℃混合孵育。加入10μL 0.4μg/mL的B7H1-Fc-生物素(来源：北京义翘神州科技有限公司)，PBS清洗，离心去除未结合抗体。加入StreptavidinAlexa488Conjugate(来源：Life Technologies)，4℃孵育20分钟，重复清洗并离心，加入200μL PBS重悬细胞，在流式细胞仪上进行检测。结果显示，重组人PD-L1蛋白可有效结合Jurkat/PD-1细胞，加入不同浓度的PD1-H944和Nivolumab时，能有效抑制重组人PD-L1蛋白与Jurkat/PD-1细胞的结合(图8)。PD1-H944和Nivolumab对重组人PD-L1蛋白的半抑制浓度IC50分别为1.78μg/mL(R2＝0.994)和2.48μg/mL(R2＝0.989)。PD1-H944对人PD-1和人PD-L1结合的抑制能力略好于Nivolumab，阴性对照抗体无明显抑制作用。
4.4 PD1-H944与CD16a的结合
亲和力受体CD16a(FcγRIIIa)蛋白是介导ADCC效应的主要Fc受体，其中含V158SNP位点的受体为相对高亲和力的受体。通过ELISA检测PD1-H944与重组CD16a(V158)蛋白的结合，进而评估PD1-H944可能产生抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)效应的能力。
本实验中所用的阳性对照PD1-H944-1-IgG1(o)为PD1-H944的可变区连接天然IgG1，阴性对照PD1-H944-1-IgG1为PD1-H944的可变区连接N297A突变IgG1，其N糖的缺失使Fc段失去了与CD16a结合的功能。将浓度为10μg/mL的重组人PD-1蛋白包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1小时后，分别加入不同浓度(0.020μg/mL、0.078μg/mL、0.3125μg/mL、1.25μg/mL、5μg/mL、20μg/mL和80μg/mL)(参见图9)的PD1-H944、Nivolumab、阳性对照抗体PD1-H944-1-IgG1(o)(来源：北京义翘神州科技有限公司)和阴性对照抗体PD1-H944-1-IgG1(来源：北京义翘神州科技有限公司)，孵育后洗板去除未结合抗体。将10μg/mL的重组CD16a-AVI-His(V158)+BirA蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司)与1μg/mL的抗生蛋白链菌素/HRP共同孵育后加入孔中，孵育后显色检测OD450。
结果显示，阳性对照抗体与重组CD16a蛋白结合随抗体浓度升高而增强。PD1-H944、Nivolumab和阴性对照抗体在检测的各浓度条件下均与重组CD16a蛋白无结合(图9)。这说明构建为IgG4亚型抗体的PD1-H944和Nivolumab都具有非常低的与CD16a结合的能力，预测PD1-H944没有或具有非常低ADCC效应。
4.5 PD1-H944与C1q的结合
通过ELISA检测PD1-H944与重组C1q蛋白的结合，进而评估PD1-H944可能产生补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity，CDC)效应的能力。
以PD1-H944的可变区连接天然IgG1所得PD1-H944-1-IgG1(o)为阳性对照抗体(来源：北京义翘神州科技有限公司)，以H7N9-R1-IgG4(来源：北京义翘神州科技有限公司)为同型对照抗体。将不同浓度(20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.313μg/mL、0.156μg/mL和0.078μg/mL)(参见图10)的PD1-H944、Nivolumab、阳性对照抗体及同型对照抗体包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1小时后，分别加入100μL的5μg/mL重组C1q蛋白(来源：Quidel Corporation)，孵育3小时洗板。加入100μL按1∶400倍稀释的二抗——抗C1q/HRP(来源：Abcam)，孵育1小时，显色，检测OD450。
结果显示，阳性对照抗体与重组C1q蛋白结合随抗体浓度升高而增强。PD1-H944、Nivolumab和同型对照抗体与重组C1q蛋白结合能力相近，结合能力比IgG1型阳性对照明显降低(图10)。
4.6 PD1-H944与FcRn的结合
通过ELISA检测PD1-H944与重组人Fc受体(FcRn)蛋白结合，进而评估PD1-H944在人体中的药代动力学。
将浓度为10μg/mL的抗生物素蛋白Avidin(来源：Thermo Fisher Scientific)包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1小时后，分别加入10μg/mL的生物素化FCGRT-His+B2M-蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司)孵育1小时，再加入不同浓度(0.123μg/mL、0.37μg/mL、1.11μg/mL、3.33μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、90μg/mL、270μg/mL)(参见图11)的PD1-H944、Nivolumab或同型对照抗体H7N9-R1-IgG4(来源：北京义翘神州科技有限公司)孵育1小时，洗板后加入250ng/mL的山羊抗人IgG Fc/HRP(来源：北京义翘神州科技有限公司)。从抗体稀释到二抗孵育的过程都维持在pH 6.0条件下进行，检测OD450。
结果显示，PD1-H944和Nivolumab能结合重组人FcRn蛋白，且结合能力随浓度升高而增强；在高浓度(270μg/mL)下，PD1-H944与重组人FcRn蛋白的结合约为Nivolumab的1.62倍(图11)。根据该结果推测PD1-H944在人体中有较好的药代动力学。
实施例5：人源化抗体PD1-H944的功能分析
5.1 PD1-H944刺激混合淋巴反应中CD4+T细胞的活化
通过CD4+T淋巴细胞与DCs混合实验检测抗人PD-1抗体的中和活性。采用Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)，然后用贴壁粘附法获得单核细胞，加入含有160ng/mL rhIL-4(来源：北京义翘神州科技有限公司)和20ng/mLrhGM-CSF(来源：R&D Systems)的1640细胞培养基(来源：GIBCO)(含10％FBS，100单位/mL青霉素，100μg/mL链霉素)，置CO2培养箱内培养至第三天半量换液。培养6天后，收集悬浮细胞，此细胞即为DCs。将DCs密度调整为2×106个细胞/mL，加入终浓度为50μg/mL的丝裂霉素，在37℃处理20分钟，1640培养基洗涤三次后备用。
用CD4+T淋巴细胞分选试剂盒(来源：Miltenyi Biotec)从另一人外周血分离的PBMC中分选CD4+T淋巴细胞。本实验的不同批次中，分别采用分别来自三位献血者的CD4+T淋巴细胞。
将分选的CD4+T淋巴细胞与先前经50μg/mL丝裂霉素处理的DCs按10∶1的比例混合，105/孔均匀接种于96孔板中，分别加入PD1-H944、Nivolumab、阴性对照抗体H7N9-R1-IgG4(来源：北京义翘神州科技有限公司)，另设混合淋巴细胞对照组，即不加抗体只有CD4+T淋巴细胞和DCs混合液的组，DCs细胞对照组，即只加DCs细胞不加抗体及CD4+T淋巴细胞组，CD4+T细胞对照组，即只加CD4+T细胞不加抗体及DCs细胞组，加相同体积的样品稀释剂1640培养基，各个抗体的终浓度梯度为1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL，于CO2培养箱内37℃、5％CO2培养5天。收集培养上清，ELISA检测培养上清中IL-2及IFN-γ的表达水平。
结果显示，在无DCs混合的CD4+T细胞培养上清中，无法检测到IFN-γ及L-2的分泌，而在混合淋巴细胞对照组中，CD4+T细胞和DCs混合后能明显提高CD4+T细胞的IFN-γ及IL-2分泌量。当在混合淋巴细胞系统中加入抗PD-1的抗体后，能更明显地促进CD4+T和DC混合淋巴反应中CD4+T细胞的活化，获得了更高的IFN-γ及IL-2分泌量，阴性对照抗体则没有该效果，而PD1-H944及Nivolumab均有明显的效果，结果如图12所示。该结果表明PD1-H944比Nivolumab具有更良好的功能活性，可以有效地再激活免疫抑制的T细胞。
5.2 PD1-H944刺激PD1下游IL2信号通路的报告基因的活化
本实验以效应细胞Jurkat-NFAT-Luc2p-PD-1(来源：神州细胞工程有限公司)及靶细胞CHO-K1-PD-L1-CD3E(来源：神州细胞工程有限公司)为实验材料，当两种细胞共同培养时会使PD-1/PD-L1相互作用而抑制TCR信号及NFAT-RE介导的生物发光，加入PD-1抗体后可阻断PD-1/PD-L1相互作用从而释放了这种抑制作用。通过检测效应细胞的生物发光的强度(Bioluminescence，RLU)来测定PD1-H944在重组人PD-1报告基因细胞系统中的活化功能。
以2×104/孔接种靶细胞CHO-K1-PD-L1-CD3E细胞于96孔板，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养过夜，然后去掉上清。以40μL/孔加入不同浓度(0.007μg/mL、0.023μg/mL、0.082μg/mL、0.286μg/mL、1.000μg/mL、3.499μg/mL、12.245μg/mL、42.857μg/mL、150μg/mL)(参见图13)的PD1-H944、Nivolumab及阴性对照抗体H7N9-R1-IgG4(来源：北京义翘神州科技有限公司)随后以40μL/孔加入7.5×104个效应细胞Jurkat-NFAT-Luc2p-PD-1，置于CO2培养箱，37℃、5％CO2条件下培养6小时。每个测定设3复孔，同时设靶细胞、效应细胞和阴性对照孔M。6小时作用结束，以20μL/孔加入被动裂解5X缓冲液(来源：Promega)，然后将96孔板置于-80℃冰箱待检。检测时，将放置于-80℃冰箱的96孔板解冻至室温，震板混匀后每孔取20μL上清液转移至96孔白底板，通过LB960-微孔板式发光检测仪进行发光检测。
结果显示，PD1-H944及对照抗体Nivolumab均具有明显活化重组人PD-1报告基因细胞系统的作用，如图13所示。在0.007-150μg/mL浓度范围内，PD1-H944作用的EC50为0.49μg/mL，Nivolumab为1.08μg/mL。PD1-H944的EC50显著低于Nivolumab，其活性是Nivolumab的2.21倍。阴性对照抗体在重组人PD-1报告基因细胞系统中无活化功能。
5.3 PD1-H944不明显刺激Fc受体CD16a通路的ADCC功能
本实验以效应细胞Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A(来源：神州细胞工程有限公司)和靶细胞CHO-PD-1(来源：神州细胞工程有限公司)为实验材料，采用重组高活性CD16a(V158)报告基因系统方法测定PD1-H944介导的ADCC效应。其原理是当两种细胞共同培养并同时加入PD1-H944时，PD1-H944的Fab段与靶细胞上过表达的PD-1结合，其Fc段可与有Fcγ受体CD16A的效应细胞结合，从而激活效应细胞Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A并促进NFAT-RE介导的化学发光。
以2×104/孔接种靶细胞CHO-PD-1细胞于96孔板，在含有10％FBS的DMEM培养基中培养过夜后，去掉上清。用含0.1％BSA的RPMI 1640(无酚红)培养基清洗两遍，然后以40μL/孔加入不同浓度(参见图14A-B)的阳性对照抗体PD1-H944-1-IgG1(o)、PD1-H944、Nivolumab和阴性对照抗体H7N9-R1-IgG4(来源：北京义翘神州科技有限公司)，随后以40μL/孔加入1×106个效应细胞Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A，置于CO2培养箱，37℃、5％CO2条件下作用4小时。每个测定设3复孔，同时设靶细胞、效应细胞和阴性对照抗体对照孔。4小时作用结束，以20μL/孔加入被动裂解5X缓冲液(来源：Promega)，将96孔板置于-80℃冰箱待检。检测时，将放置-80℃冰箱的96孔板解冻至室温，震板混匀后每孔取20μL上清液转移至96孔白底板，通过LB960-微孔板式发光检测仪进行发光检测。
结果显示，在0.018-300ng/mL浓度范围内，阳性对照抗体PD1-H944-1-IgG1(o)具有明显的介导ADCC的作用，Nivolumab有较弱的ADCC效应，PD1-H944有弱于Nivolumab的ADCC效应(p＜0.01)。图14A和图14B为不同次的实验结果。图14C和14D分别表示A和B中抗体最高浓度点(300ng/mL)对应生物发光强度(RLU)。在该灵敏的ADCC功能实验中，PD1-H944与CD16a结合所引发的细胞活化明显低于Nivolumab，并且结果稳定。PD1-H944药物的低ADCC活性对该抗体在临床中的药效和安全性都是很好的支持。
5.4 PD1-H944不明显激活补体C1q通路的CDC功能
PD1-H944与PD-1过表达的肿瘤细胞结合后，可激活经典补体通路杀伤肿瘤细胞，导致肿瘤细胞的死亡。本试验采用WST-8法对PD1-H944的CDC效应进行研究。
用含0.1％BSA的RPMI 1640培养基重悬CHO-PD-1细胞(来源：神州细胞工程有限公司)，以5×104/孔均匀接种于96孔板中，随后以50μL/孔加入不同浓度(参见图15)的抗体，然后以50μL/孔加入1∶4稀释的补体C1q(来源：One lambda)。其中抗体为阳性对照抗体PD1-H944-1-IgG1(o)(来源：北京义翘神州科技有限公司)、PD1-H944、Nivolumab和阴性对照抗体PD1-H944-1-IgG1(来源：北京义翘神州科技有限公司)，设置检测空白孔B(无细胞)和阴性对照组M(接种细胞，不加抗体)。37℃作用3小时后，每孔加入15μL的WST-8显色液，显色稳定后置酶标仪上于450nm、630nm处测定吸光度。结果以吸光度值OD450-OD630，并减去检测空白孔B的读值来计算，杀伤率％＝(阴性对照M组OD值-样品OD值)/阴性对照M组OD值×100％。
结果显示，PD1-H944、Nivolumab和阴性对照抗体对过表达PD-1的肿瘤细胞CHO-PD-1无CDC效应，而阳性对照抗体对CHO-PD-1具有一定的杀伤作用，其最大杀伤率达到82.1％，结果如图15所示。CDC实验也证实了PD1-H944对表达PD-1的靶细胞没有CDC效应，该抗体具有良好的安全性。
5.5 PD1-H944有效抑制人源化PD-1小鼠体内MC38结肠癌皮下移植瘤模型的生长
(1)PD1-H944在人源化PD-1小鼠体内MC38结肠癌皮下移植瘤模型中的药效学研究一
将处于对数生长期的MC38细胞(舜冉上海生物科技有限公司)用于肿瘤接种，将PBS重悬的MC38细胞以5×105个/0.1mL接种于B-hPD-1人源化小鼠(百奧赛图)(将C57BL/6小鼠PD-1基因的外显子2部分片段用人PD-1基因组的相应部分替代而得到的小鼠)的右侧胁肋部皮下，共接种47只。当肿瘤体积约100mm3左右时分组给药，根据个体肿瘤体积挑选小鼠入组，采用excel软件将动物按瘤体积随机分组分配到5个组中，每组8只。其中第4、5组为与本申请无关的其他抗PD-1抗体，因此不呈现其相关数据。分组当天开始给药，给药途径为腹腔注射(I.P.)，每3天给药1次，连续给药6次，末次给药后10天处死小鼠，取瘤组织进行称重。具体给药方案见下表3。通过计算肿瘤生长抑制率(TGI(％))来评价药物的抗肿瘤作用：TGI(％)＜60％为无效；TGI(％)≥60％，且经统计学处理治疗组瘤体积显著低于溶剂对照组(P＜0.05)为有效，即对肿瘤生长具有显著抑制作用。TGI(％)的计算方法如下：
TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100，其中：
Ti：治疗组在给药第i天的肿瘤体积均值，
T0：治疗组在给药第0天的肿瘤体积均值，
Vi：溶剂对照组在给药第i天的肿瘤体积均值，
V0：溶剂对照组在给药第0天的肿瘤体积均值。
实验结束后处死动物，称瘤重，计算瘤重抑制率IRTW％，以IRTW％＞60％为有效性参考指标，计算公式如下：
瘤重抑制率IRTW(％)＝(W溶剂对照组-W治疗组)/W溶剂对照组×100，W为肿瘤重量。
表3：试验分组及给药
注：a：给药容积依实验动物体重按10μL/g计算。
所有实验动物在给药期间活动、进食等一般状态良好，体重均有一定程度的上升，受试药(组3)和对照药(组2)给药后动物体重无显著性差异(P＞0.05)。所有动物体重变化情况见图16及表4。
表4.PD1-H944对MC38结肠癌移植B-hPD-1人源化小鼠体重的影响
a：均数±标准误；
b：治疗组体重与溶剂对照组体重在给药25天后统计学比较，t检验；
c：组2实验终点为7只小鼠。
试验中的各组肿瘤体积结果见表5和图17。
表5：PD1-H944对MC38结肠癌移植B-hPD-1人源化小鼠肿瘤体积的影响
注：与溶剂对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与Nivolumab组比较，ΨP＜0.05，ΨΨP＜0.01；
天数：细胞接种后天数
首次给药25天后，对所有动物实施安乐死，剥取肿瘤称重照相。各组肿瘤重量进行统计比较，结果总结在表6和图18。
表6：PD1-H944对MC38结肠癌移植B-hPD-1人源化小鼠肿瘤重量的影响
注：与溶剂对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与Nivolumab组比较，ΨP＜0.05，ΨΨP＜0.01
与肿瘤体积结果相同，Nivolumab对该模型的肿瘤抑制不明显，而PD1-H944组平均瘤重为0.044±0.017克，其瘤重抑制率(IRTW)达到97.4％。经过数据分析，PD1-H944组肿瘤与溶剂对照组比较有显著不同(P＜0.05)，证明PD1-H944有明显抗肿瘤药效。
实验结束时，溶剂对照组平均肿瘤体积为2171±430mm3，瘤重为1.719±0.310g，阳性对照组Nivolumab(20mg/kg)平均肿瘤体积为1802±228mm3，TGI为17.8％，瘤重为1.492±0.274g，瘤重抑制率IRTW为13.2％，与溶剂对照组的肿瘤体积相比无显著差异(P＝0.480)。而PD1-H944的平均肿瘤体积为171±51mm3，TGI％为96.7％，瘤重为0.044±0.017g，瘤重抑制率IRTW为97.4％，与溶剂对照组的肿瘤体积相比有明显差异(P＜0.05)，表明供试抗体PD1-H944结合PD-1表位在该模型上是有效的，在20mg/kg剂量水平下对MC38结肠癌皮下移植瘤有明显的抑制作用。
(2)PD1-H944在人源化PD-1小鼠体内MC38结肠癌皮下移植瘤模型中的药效学研究二
将处于对数生长期的MC38细胞(舜冉上海生物科技有限公司)用于肿瘤接种，将PBS重悬的MC38细胞以5×105个/0.1mL接种于B-hPD-1人源化小鼠(百奥赛图)的右侧胁肋部皮下，共接种80只。当肿瘤体积约150mm3左右时分组给药，根据个体肿瘤体积挑选小鼠入组，采用excel软件将动物按瘤体积随机分组分配到8个组中，每组8只。其中第3、4、7、8组为与本申请无关的其他抗PD-1抗体，因此不呈现其相关数据。分组当天开始给药，给药途径为腹腔注射(I.P.)，每3天给药1次，连续给药6次，末次给药后10天处死小鼠，取瘤组织进行称重。具体给药方案见下表7。
表7：试验分组及给药
注：a：给药容积依实验动物体重按10μL/g计算；
b：Pembrolizumab来源：北京义翘神州科技有限公司，下同。
通过计算肿瘤生长抑制率(TGI(％))来评价药物的抗肿瘤作用：TGI(％)＜60％为无效；TGI(％)≥60％，且经统计学处理治疗组瘤体积显著低于溶剂对照组(P＜0.05)为有效，即对肿瘤生长具有显著抑制作用。TGI(％)的计算方法如下：
TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100，其中：
Ti：治疗组在给药第i天的肿瘤体积均值，
T0：治疗组在给药第0天的肿瘤体积均值，
Vi：溶剂对照组在给药第i天的肿瘤体积均值，
V0：溶剂对照组在给药第0天的肿瘤体积均值。
实验结束后处死动物，称瘤重，计算瘤重抑制率IRTW％，以IRTW％＞60％为有效性参考指标，计算公式如下：
瘤重抑制率IRTW(％)＝(W溶剂对照组-W治疗组)/W溶剂对照组×100，W为肿瘤重量。
所有实验动物在给药期间活动、进食等一般状态良好，体重均有一定程度的上升，受试药和对照药给药后动物体重无显著性差异(P＞0.05)。见表8和图19。
表8：PD1-H944对MC38结肠癌移植B-hPD-1人源化小鼠体重的影响
注：a：均数±标准误；
b：治疗组体重与溶剂对照组体重在给药23天后统计学比较，t检验。
实验中，各组肿瘤体积见表9和图20。
表9：PD1-H944对MC38结肠癌移植B-hPD-1人源化小鼠肿瘤体积的影响(均数±标准误)
注：与溶剂对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；
天数：细胞接种后天数；N：参加统计的该组动物数。
首次给药24天后，对所有动物实施安乐死，剥取肿瘤称重照相。
各组肿瘤重量进行统计比较，结果总结在表10和图21。
表10：PD1-H944对MC38结肠癌移植B-hPD-1人源化小鼠肿瘤重量的影响(均数±标准误)
注：与溶剂对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。
实验结果表明：
溶剂对照组：分组后肿瘤体积持续增长，试验结束时的平均肿瘤体积是3405±624mm3。
阳性对照组：Pembrolizumab以20mg/kg给药后，与溶剂对照组相比，瘤体积增长缓慢，给药第5天开始瘤体积即表现出显著差异(P＜0.05)；试验结束时TGI为97.0％，瘤重抑制率为93.5％，与溶剂对照组相比P＜0.05。这表明Pembrolizumab在此药效模型上抑瘤作用明显，说明该模型可用于Keytruda结合PD-1表位的抗体药物的药效评价。
PD1-H944 8mg/kg组：PD1-H944以8mg/kg给药后，与溶剂对照组相比，瘤体积增长缓慢，给药第5天开始瘤体积即表现出显著差异(P＜0.05)；试验结束时TGI为89.7％，瘤重抑制率为87.8％，与溶剂对照组相比P＜0.05。
PD1-H944 2mg/kg组：PD1-H944以2mg/kg给药后，与溶剂对照组相比，瘤体积增长缓慢，给药第5天开始瘤体积即表现出显著差异(P＜0.05)；试验结束时TGI为85.3％，瘤重抑制率为84.7％，与溶剂对照组相比P＜0.05。这再次表明供试PD1-H944结合PD-1表位的抗体在该模型上是有效的，对MC38结肠癌皮下移植瘤有明显的抑瘤作用并呈现一定的剂量相关性。PD1-H944及Pembrolizumab在本实验的抗肿瘤药效结果在瘤重上也得到证实。
本次试验结果显示，腹腔给予小鼠PD1-H944 8mg/kg或2mg/kg，每3天给药1次，连续给药6次，均能显著抑制PD-1人源化小鼠MC38移植瘤的生长(P＜0.05)，并且给药组动物表征和体重均与模型组无差异。考虑模型设计对不同表位抗体的偏好性，本实验并不评价PD1-H944与Pembrolizumab的药效差异。
体内药效学研究采用人源化PD-1的C57BL/6小鼠体内MC38结肠癌皮下移植瘤模型为动物模型，研究了PD1-H944单用对人源化PD-1小鼠MC38结肠癌皮下移植瘤的抗瘤作用。B-hPD-1人源化小鼠是在C57BL/6小鼠背景上对小鼠PD-1基因进行人源化改造，使该小鼠适用于抗人PD-1抗体药物的体内药效评估。该模型对不同表位PD-1抗体的药效有一定的选择性，Pembrolizumab在该模型研究中有明显的肿瘤抑制效果。研究结果显示，PD1-H944单用(2、8、20mg/kg，每3天给药1次，连续给药6次)可显著抑制MC38移植瘤的生长，总结数据见表11和12。
表11：PD1-H944对MC38结肠癌移植B-hPD-1人源化小鼠的抗瘤作用
表12：不同剂量PD1-H944对人源化PD-1小鼠结肠癌移植瘤的抗肿瘤作用
实施例6 PD1-H944特异性结合的氨基酸位点的鉴定
实施例4.2的数据表明，PD1-H944与PD-L1(参见图7A)或PD-L2(参见图7B)有效竞争与PD-1蛋白的结合，证明了PD1-H944与配体PD-L1或PD-L2在PD-1的结合表位存在重叠交叉。
6.1分子模拟预测PD1-H944构象表位
为了深入了解PD1-H944与PD-1蛋白界面相互作用，本实施例对PD1-H944和PD-1蛋白进行ZDOCK对接。基于PD1-H944与配体PD-L1在PD-1蛋白结合表位有重叠交叉这一事实，利用DS 4.0(Accelrys Software Inc.)中的Antidody model程序对PD1-H944进行同源建模，最终模型经过拉氏图验证结构的合理性。PD-1蛋白三维结构从PDB数据库中提取(PDBID：4ZQK)，经过Protein Preparation程序初始化。PD1-H944模型和PD-1结构通过ZDOCK程序对接结合模式，打分函数前十位进行RDOCK优化，最优的模型经Protein InterfaceAnalysis程序进一步分析(参见图22)。对接模型界面作用显示PD1-H944与PD-1蛋白主要结合的肽序列为CC′及FG片层(参见表13)。
表13分子模拟预测PD1-H944与PD-1蛋白主要结合的肽序列(下划线)
6.2 PD-1蛋白突变体验证PD1-H944结合表位
为了进一步确认PD1-H944的功能表位，根据表13中预测的PD1-H944与PD-1蛋白主要结合的肽序列，制备一系列丙氨酸突变的PD-1蛋白突变体，结合ELISA测定分析。为了验证模型的准确性，本研究同时选择了几个实施例6.1模型之外的位点(参见表14)，这些突变位点大致分为五个空间构象表位(参见图23)。
表14.重组PD-1蛋白胞外区突变体设计
根据实施例4.2的方法，ELISA测定表14中各突变体与PD1-H944的结合，与未突变的PD-1蛋白相比，突变体结合有不同程度的降低。以PD-1蛋白突变体类型为横坐标，结合率为纵坐标，利用Excel 2007进行数据分析并作图【结合率＝OD(PD-1蛋白突变体)/OD(PD-1蛋白)×100％)】。结果表明，配体PD-L1结合PD-1蛋白的主要结合位点位于PD-1蛋白的CC′及FG片层上的Site 2、Site 3、Site 4、Site 5，该结果与其复合物晶体吻合(PDB ID：4ZQK)；阳性对照Nivolumab与PD-1蛋白的结合位点主要位于其N-loop及FG片层的Site 1和Site 4上，该结果也与其复合物晶体的分析结果吻合(PDB ID：5WT9)；PD1-H944与PD-1蛋白的主要结合位点是E61、K78、D85、P130位于Site 3和Site 4上，该结果也与上述例中对接模型分析结果基本吻合(参见图24及表15)，结果验证了PD1-H944与PD-1蛋白对接模型的准确性。
表15：PD-L1、Nivolumab和PD1-H944与PD-1各突变体的结合
PD1-H944与PD-1蛋白对接模型显示，PD1-H944与配体PD-L1的PD-1蛋白结合表位重叠。这一事实支持PD1-H944通过直接的空间位阻发挥作用这一观点。同时，PD1-H944也与Nivolumab存在表位交叉，而且具有更大的阻断配体PD-L1结合表位区域(参见图25A-C)。因此PD1-H944在肿瘤治疗可能具有更优秀的治疗效果。
序列表
<110> 神州细胞工程有限公司
<120> 人源化抗PD-1抗体及其用途
<130> FP1180486P
<141> 2018-12-21
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 167
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
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Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
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Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
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Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
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Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln
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<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
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gatattgtgc taactcaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac 120
cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180
ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240
cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaatctagtg gtggcggtgg ttcgggcggt 360
ggtggaggtg gtagttctag atcttccgag gtgcaactgg tggaatctgg gggaggctta 420
gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc tgtgcagcct ctggattcac tttcagttcc 480
tatggcatgt cttgggttcg tcagactccg gagaagaggc tggagtgggt cgcgaccatt 540
agtggtggtg gtcgtgacac ctactattca gacagtgtga aggggcggtt caccgtctcc 600
agagacaatg ccaagaacaa cctgttcctg caaatgagca gtctgaggtc tgaagacacg 660
gccttgtatt attgttcacg tcaatatggt acggtctggt tttttaactg gggccagggg 720
actctggtca ctgtctctgc a 741
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
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tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt tcctatggca tgtcttgggt tcgtcagact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcgacc attagtggtg gtggtcgtga cacctactat 180
tcagacagtg tgaaggggcg gttcaccgtc tccagagaca atgccaagaa caacctgttc 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaagac acggccttgt attattgttc acgtcaatat 300
ggtacggtct ggttttttaa ctggggccag gggactctgg tcactgtctc tgca 354
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
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atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agttatggca atagttttat gcactggtac 120
cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180
ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240
cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300
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<212> DNA
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
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Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
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Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 17
<211> 218
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 18
<211> 464
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ser
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Asn Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ser Arg Gln Tyr Gly Thr Val Trp Phe Phe Asn Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
225 230 235 240
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
245 250 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
260 265 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
275 280 285
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
290 295 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305 310 315 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
325 330 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
340 345 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
355 360 365
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
370 375 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385 390 395 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
405 410 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
420 425 430
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
435 440 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
450 455 460
<210> 19
<211> 237
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu
20 25 30
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val
35 40 45
Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Phe Cys Gln
100 105 110
Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165 170 175
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 22
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Gln Tyr Gly Thr Val Trp Phe Phe Asn Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 111
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 24
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 26
<211> 1395
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgtctgag 60
gtccaacttg tggagtctgg aggaggactg gtgaagcctg gaggctccct gagactgtcc 120
tgtgctgcct ctggcttcac cttctcctcc tatgggatga gttgggtgag acaggctcct 180
gggaagagat tggagtgggt ggctaccatc tctggaggag gcagggacac ctactactct 240
gactctgtga agggcaggtt cacaatcagc agggacaatg ccaagaacaa cctgtacctc 300
caaatgaact ccctgagggc tgaggacaca gcagtctact actgtagcag acaatatggc 360
acagtgtggt tcttcaactg gggacaaggc accctggtga cagtgtcctc tgctagcacc 420
aagggcccat cggtcttccc gctggcgccc tgctccagga gcacctccga gagcacagcc 480
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacgaagac ctacacctgc 660
aacgtagatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga gagttgagtc caaatatggt 720
cccccatgcc caccctgccc agcacctgag ttcctggggg gaccatcagt cttcctgttc 780
cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 840
gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 900
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgta ccgtgtggtc 960
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020
tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080
cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1140
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggaaagc 1200
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260
ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1320
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1380
tctctgggta aataa 1395
<210> 27
<211> 714
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcattctgag 60
attgtgctga cccagagccc tgccaccctg tccctgagcc ctggagagag ggctaccctg 120
tcctgtaggg catctgagtc tgtggactcc tatggcaact cctttatgca ctggtatcaa 180
cagaagcctg gacaaccacc aagactgctg atttatgctg ccagcaacca gggctctgga 240
gtgcctgcca ggttctctgg ctctggctct ggcacagact tcaccctgac catctcctcc 300
ttggaacctg aggactttgc tatgtacttc tgtcaacaga gcaaggaggt gccatggacc 360
tttggacaag gcaccaaggt ggagattaag cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttag 714
<210> 28
<211> 57
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgtct 57
<210> 29
<211> 57
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcattct 57
<210> 30
<211> 354
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
gaggtccaac ttgtggagtc tggaggagga ctggtgaagc ctggaggctc cctgagactg 60
tcctgtgctg cctctggctt caccttctcc tcctatggga tgagttgggt gagacaggct 120
cctgggaaga gattggagtg ggtggctacc atctctggag gaggcaggga cacctactac 180
tctgactctg tgaagggcag gttcacaatc agcagggaca atgccaagaa caacctgtac 240
ctccaaatga actccctgag ggctgaggac acagcagtct actactgtag cagacaatat 300
ggcacagtgt ggttcttcaa ctggggacaa ggcaccctgg tgacagtgtc ctct 354
<210> 31
<211> 333
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
gagattgtgc tgacccagag ccctgccacc ctgtccctga gccctggaga gagggctacc 60
ctgtcctgta gggcatctga gtctgtggac tcctatggca actcctttat gcactggtat 120
caacagaagc ctggacaacc accaagactg ctgatttatg ctgccagcaa ccagggctct 180
ggagtgcctg ccaggttctc tggctctggc tctggcacag acttcaccct gaccatctcc 240
tccttggaac ctgaggactt tgctatgtac ttctgtcaac agagcaagga ggtgccatgg 300
acctttggac aaggcaccaa ggtggagatt aag 333
<210> 32
<211> 984
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccg ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60
agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc 240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc 300
aaatatggtc ccccatgccc accctgccca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc 360
ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat 480
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac 540
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600
tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 660
gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 720
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780
tgggaaagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 840
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 900
aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 960
ctctccctgt ctctgggtaa ataa 984
<210> 33
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg ttag 324
<210> 34
<211> 247
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 34
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser
115 120 125
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly
130 135 140
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser
145 150 155 160
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp
165 170 175
Val Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu
195 200 205
Phe Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ser Arg Gln Tyr Gly Thr Val Trp Phe Phe Asn Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
245
<210> 35
<211> 18
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 35
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
1 5 10 15
Ser Ser

Claims (22)

1.一种分离的PD-1抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区或其部分和重链可变区或其部分，
其中轻链可变区或其部分包含氨基酸序列为SEQ ID NO:10的轻链CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO:11的轻链CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO:12的轻链CDR3；且
重链可变区或其部分包含氨基酸序列为SEQ ID NO:13的重链CDR1、氨基酸序列为SEQID NO:14的重链CDR2和氨基酸序列为SEQ ID NO:15的重链CDR3。
2.权利要求1的分离的PD-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含或由以下组成：与PD-1抗体轻链可变区序列SEQ ID NO:23具有至少90％，92％，95％，98％或100％序列同一性的氨基酸序列，和/或与PD-1抗体重链可变区序列SEQ ID NO:22具有至少90％，92％，95％，98％或100％序列同一性的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的分离的PD-1抗体，其中所述抗体进一步包含轻链恒定区和重链恒定区。
4.权利要求3的分离的PD-1抗体，其中所述轻链恒定区为氨基酸序列为与SEQ ID NO:25的kappa轻链恒定区具有至少90％，92％，95％，98％或100％序列同一性的氨基酸序列，和/或所述重链恒定区为与氨基酸序列为SEQ ID NO:24的IgG4重链恒定区具有至少90％，92％，95％，98％或100％序列同一性的氨基酸序列。
5.权利要求1-4中任一项的分离的PD-1抗体，其为IgG抗体。
6.权利要求5中的分离的PD-1抗体，其为IgG4抗体。
7.权利要求1-6中任一项的分离的PD-1抗体，其为单克隆抗体。
8.权利要求1-7中任一项的分离的PD-1抗体或其抗原结合片段，其与重组人PD-1蛋白的结合亲和力KD平均值为20-200pM。
9.权利要求8中的分离的PD-1抗体或其抗原结合片段，其与重组人PD-1蛋白的结合亲和力KD平均值为60-70pM。
10.权利要求9中的分离的PD-1抗体或其抗原结合片段，其与重组人PD-1蛋白的结合亲和力KD平均值为64.8pM。
11.权利要求1-10中任一项的分离的PD-1抗体或其抗原结合片段，其与含有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的PD-1蛋白分子或与SEQ ID NO:1具有至少90％，92％，95％，98％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白分子特异性结合。
12.权利要求1-11中任一项的分离的PD-1抗体或其抗原结合片段，其中抗原结合片段的形式为Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2或单链抗体分子。
13.权利要求12中的分离的PD-1抗体或其抗原结合片段，其中单链抗体分子优选为scFv、di-scFv、tri-scFv、双体抗体或scFab。
14.一种分离的核酸，其包含或由以下组成：编码权利要求1-13中任一项的分离的PD-1抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
15.权利要求14中的分离的核酸，其包含或由以下组成：SEQ ID NO:26和/或SEQ IDNO:27的核苷酸序列。
16.一种载体，其包含权利要求14或15的分离的核酸。
17.一种分离的细胞，其包含权利要求14或15的分离的核酸，和/或包含权利要求16的载体。
18.一种产生权利要求1-13中任一项的分离的PD-1抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养权利要求17的分离的细胞和纯化所述分离的PD-1抗体或其抗原结合片段。
19.权利要求1-13中任一项的分离的PD-1抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗结肠癌的药物的用途。
20.一种药物组合物，其包含权利要求1-13中任一项的分离的PD-1抗体或其抗原结合片段。
21.一种试剂盒，其包含权利要求1-13中任一项的分离的PD-1抗体或其抗原结合片段或权利要求20的药物组合物。
22.权利要求21中的试剂盒，其进一步包含给药的装置。
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