CN115838427A - 针对cd40的抗体 - Google Patents

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Abstract

本文提供结合人CD40的激动性抗体或其抗原结合部分。此类抗体任选地包含具有增强的对FcγRIIb的特异性的Fc区。本发明还提供通过向有需要的主体施用本发明的抗体来治疗癌症或慢性感染的方法。

Description

针对CD40的抗体
本申请是申请日为2016年6月28日、申请号为201680037548.0(国际申请号为PCT/US2016/039754)、名称为“针对CD40的抗体”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的引用
本申请要求享有于2015年11月9日提交的美国临时申请号62/252,615和2015年6月29日提交的美国临时申请号62/186,076的优先权，所述申请的公开内容通过引用并入本文。
背景
近期研究已揭示人癌症和慢性感染可以用调节患者对恶性或感染细胞的免疫应答的药剂来治疗。参见例如，Reck和Paz-Ares(2015)Semin.Oncol.42:402。已尝试将激动性抗CD40抗体诸如CP-870893和达西珠单抗(dacetuzumab)(SGN-40)用于治疗癌症，这基于认为它们可以增强此类免疫应答。参见例如，Kirkwood等人(2012)CA Cancer J.Clin.62:309；Vanderheide和Glennie(2013)Clin.Cancer Res.19:1035。在小鼠中的近期实验已揭示对抑制性Fc受体FcγRIIb具有增强的特异性的抗CD40抗体的抗肿瘤效力增加。参见例如，WO 2012/087928；Li和Ravetch(2011)Science 333:1030；Li和Ravetch(2012)Proc.Nat’l Acad.Sci USA 109:10966；Wilson等人(2011)Cancer Cell 19:101；White等人(2011)J.Immunol.187:1754。
存在对于改进的激动性抗人CD40抗体用于治疗人主体中的癌症和慢性感染的需求。此类抗体将优选相比于活化Fc受体具有对抑制性Fc受体FcγRIIb的增强的特异性，并且将展示出增强的抗肿瘤和/或抗感染活性。
发明概述
本文提供这样的分离的人源化鼠单克隆抗体，所述抗体特异性结合人CD40(SEQID NO:1的成熟序列)，任选具有增强结合FcγRIIb受体的特异性的修饰的Fc区。在某些实施方案中，本发明涉及与抗体12D6(SEQ ID NOs:3和4)、5F11(SEQ ID NOs:23和24)、8E8(SEQ ID NOs:40和41)、5G7(SEQ ID NOs:52和53)和19G3(SEQ ID NOs:58和59)中的一种或多种竞争结合、交叉阻断、或结合相同的表位的抗huCD40抗体或其抗原结合片段，包括嵌合、人或人源化抗体。
在某些实施方案中，本发明的抗人CD40抗体或其抗原结合片段结合包含以下或由以下组成的表位：选自WGCLLTAVHPEPPTACRE(SEQ ID NO:1的残基11-28)(抗体12D6)、EPPTACREKQYLINS(SEQ ID NO:1的残基21-35)(抗体12D6、5G7和19G3)和ECLPCGESE(SEQ IDNO:1的残基58-66)(抗体5F11)的一种或多种序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含CDRH1、CDRH2和CDRH3序列并且所述轻链包含CDRL1、CDRL2和CDRL3序列，其至少部分源自如抗huCD40抗体12D6、5F11、8E8、5G7或19G3的相同小鼠种系V区基因区段和J区基因区段，如表3所公开。具体而言，抗体可以包含源自如抗体12D6(重链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VH1-39_01和J区种系IGHJ4和轻链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VK1-110_01和J区种系IGKJ1)、抗体5F11(重链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VH1-4_02和J区种系IGHJ3和轻链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VK3-5_01和J区种系IGKJ5)、抗体8E8(重链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VH1-80_01和J区种系IGHJ2和轻链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VK1-110_01和J区种系IGKJ2)、抗体5G7(重链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VH1-18_01和J区种系IGHJ4和轻链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VK10-96_01和J区种系IGKJ2)或抗体19G3(重链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VH5-9-4_01和J区种系IGHJ3和轻链CDR序列至少部分源自鼠V区种系VK1-117_01和J区种系IGKJ2)的相同鼠种系的CDR序列。
在各种实施方案中，本发明的抗体包含重链和轻链，其中所述重链包含CDRH1、CDRH2和CDRH3序列且所述轻链包含CDRL1、CDRL2和CDRL3序列，其选自：抗体12D6-03的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:5的残基31-35、50-66和99-108且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:6的残基24-39、55-61和94-102；抗体12D6-22的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:7的残基31-35、50-66和99-108且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:9的残基24-39、55-61和94-102；抗体12D6-23的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:10的残基31-35、50-66和99-108且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:11的残基24-39、55-61和94-102；抗体12D6-24的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:12的残基31-35、50-66和99-108且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:9的残基24-39、55-61和94-102；抗体5F11-17的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:25的残基31-35、50-66和99-106且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:26的残基24-38、54-60和93-101；抗体5F11-23的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:27的残基31-35、50-66和99-106且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:28的残基24-38、54-60和93-101；抗体5F11-45的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:29的残基31-35、50-66和99-106且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:30的残基24-38、54-60和93-101；抗体8E8-56的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:42的残基31-35、50-66和99-11且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:43的残基24-39、55-61和94-102；抗体8E8-62的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:44的残基31-35、50-66和99-111且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:45的残基24-39、55-61和94-102；抗体8E8-67的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:46的残基31-35、50-66和99-111且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:47的残基24-39、55-61和94-102；抗体8E8-70的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:48的残基31-35、50-66和99-111且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:49的残基24-39、55-61和94-102；抗体8E8-71的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:50的残基31-35、50-66和99-111且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:51的残基24-39、55-61和94-102；抗体5G7-22的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:54的残基31-35、50-66和99-102且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:55的残基24-34、50-56和89-97；抗体5G7-25的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:56的残基31-35、50-66和99-102且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQID NO:57的残基24-34、50-56和89-97；抗体19G3-11的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:60的残基31-35、50-66和99-101且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ IDNO:62的残基24-39、55-61和94-102；和抗体19G3-22的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:63的残基31-35、50-66和99-101且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ IDNO:64的残基24-39、55-61和94-102。
在各种实施方案中，本发明的抗体包含含有选自12D6(SEQ ID NO:3的残基1-119)、5F11(SEQ ID NO:23的残基1-117)、8E8(SEQ ID NO:40的残基1-122)、5G7(SEQ IDNO:52的残基1-113)和19G3(SEQ ID NO:58的残基1-112)的可变结构域以及含有选自IgG1f(SEQ ID NO:65)、SE(SEQ ID NO:66)、SELF(SEQ ID NO:67)、P238D(SEQ ID NO:68)、V4(SEQID NO:69)、V4 D270E(SEQ ID NO:70)、V7(SEQ ID NO:71)、V8(SEQ ID NO:72)、V9(SEQ IDNO:73)、V9 D270E(SEQ ID NO:74)、V11(SEQ ID NO:75)和V12(SEQ ID NO:76)的FcγRIIb特异性Fc区的恒定区的重链。
在一些实施方案中，抗体包含选自以下的特异性重链可变结构域和轻链可变结构域：12D6-03(分别SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的残基1-119和1-112)、12D6-22(分别SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:9的残基1-119和1-112)、12D6-23(分别SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的残基1-119和1-112)、12D6-24(分别SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:9的残基1-119和1-112)、5F11-17(分别SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的残基1-117和1-111)、5F11-23(分别SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:28的残基1-117和1-111)、5F11-45(SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的残基1-117和1-111)、8E8-56(分别SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43的残基1-122和1-112)、8E8-62(分别SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45的残基1-122和1-112)、8E8-67(分别SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47的残基1-122和1-112)、8E8-70(SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49的残基1-122和1-112)、8E8-71(分别SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51的残基1-122和1-112)、5G7-22(分别SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55的残基1-113和1-107)、5G7-25(分别SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57的残基1-113和1-107)、19G3-11(分别SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:62的残基1-112和1-112)和9G3-22(分别SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的残基1-112和1-112)。这些抗体的任一种可以还包含含有FcγRIIb特异性Fc区的重链恒定区，所述重链恒定区选自IgG1f(SEQ ID NO:65)、SE(SEQ ID NO:66)、SELF(SEQ ID NO:67)、P238D(SEQ ID NO:68)、V4(SEQ ID NO:69)、V4 D270E(SEQ ID NO:70)、V7(SEQ ID NO:71)、V8(SEQ ID NO:72)、V9(SEQ ID NO:73)、V9 D270E(SEQ ID NO:74)、V11(SEQ ID NO:75)和V12(SEQ ID NO:76)。这些抗体中的任一种可以还包含SEQ ID NO:77的轻链κ恒定区。
在具体的实施方案中，本发明的抗体包含含有SEQ ID NO:9的轻链和选自SEQ IDNO:13-22中任一种的重链的人源化12D6-24抗体或含有SEQ ID NO:30的轻链和选自SEQ IDNO:31-39中任一种的重链的人源化5F11-45抗体。具体的抗体包括12D6-24 SE(SEQ IDNOs:9和14)、12D6-24 SELF(SEQ ID NOs:9和15)、12D6-24 P238D(SEQ ID NOs:9和13)、12D6-24 V4(SEQ ID NOs:9和16)、12D6-24 V4 D270E(SEQ ID NOs:9和17)、12D6-24 V8(SEQ ID NOs:9和18)、12D6-24 V9(SEQ ID NOs:9和19)、12D6-24 V9 D270E(SEQ ID NOs:9和20)、12D6-24 V11(SEQ ID NOs:9和21)、12D6-24 V12(SEQ ID NOs:9和22)、5F11-45SE(SEQ ID NOs:30和31)、5F11-45 SELF(SEQ ID NOs:30和32)、5F11-45 V4(SEQ ID NOs:30和33)、5F11-45 V4 D270E(SEQ ID NOs:30和34)、5F11-45 V8(SEQ ID NOs:30和35)、5F11-45 V9(SEQ ID NOs:30和36)、5F11-45 V9 D270E(SEQ ID NOs:30和37)、5F11-45 V11(SEQID NOs:30和38)和5F11-45 V12(SEQ ID NOs:30和39)，其中分别提供轻链和重链的序列。
在进一步的实施方案中，本发明的抗huCD40抗体包含与以下的重链和轻链序列具有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的重链和轻链：12D6-24 SE(SEQ ID NOs:9和14)、12D6-24 SELF(SEQ ID NOs:9和15)、12D6-24 P238D(SEQ ID NOs:9和13)、12D6-24 V4(SEQ ID NOs:9和16)、12D6-24 V4 D270E(SEQ ID NOs:9和17)、12D6-24 V8(SEQ ID NOs:9和18)、12D6-24 V9(SEQ ID NOs:9和19)、12D6-24 V9 D270E(SEQ ID NOs:9和20)、12D6-24V11(SEQ ID NOs:9和21)、12D6-24 V12(SEQ ID NOs:9和22)、5F11-45 SE(SEQ ID NOs:30和31)、5F11-45 SELF(SEQ ID NOs:30和32)、5F11-45 V4(SEQ ID NOs:30和33)、5F11-45V4 D270E(SEQ ID NOs:30和34)、5F11-45 V8(SEQ ID NOs:30和35)、5F11-45V9(SEQ IDNOs:30和36)、5F11-45 V9 D270E(SEQ ID NOs:30和37)、5F11-45 V11(SEQ ID NOs:30和38)或5F11-45 V12(SEQ ID NOs:30和39)。
在仍进一步的实施方案中，本发明的抗huCD40抗体包含基本上由以下的重链和轻链序列组成的重链和轻链：12D6-24 SE(SEQ ID NOs:9和14)、12D6-24 SELF(SEQ ID NOs:9和15)、12D6-24 P238D(SEQ ID NOs:9和13)、12D6-24 V4(SEQ ID NOs:9和16)、12D6-24V4D270E(SEQ ID NOs:9和17)、12D6-24 V8(SEQ ID NOs:9和18)、12D6-24 V9(SEQ ID NOs:9和19)、12D6-24 V9 D270E(SEQ ID NOs:9和20)、12D6-24 V11(SEQ ID NOs:9和21)、12D6-24 V12(SEQ ID NOs:9和22)、5F11-45 SE(SEQ ID NOs:30和31)、5F11-45 SELF(SEQ IDNOs:30和32)、5F11-45 V4(SEQ ID NOs:30和33)、5F11-45 V4 D270E(SEQ ID NOs:30和34)、5F11-45 V8(SEQ ID NOs:30和35)、5F11-45 V9(SEQ ID NOs:30和36)、5F11-45V9D270E(SEQ ID NOs:30和37)、5F11-45 V11(SEQ ID NOs:30和38)或5F11-45 V12(SEQ IDNOs:30和39)。
在一些实施方案中，含有V4或V9 Fc序列变体的本发明的抗huCD40抗体进一步包含D270E序列变体。此类抗体包括人源化的12D6-24 V4 D270E(SEQ ID NOs:9和17)、12D6-24 V9 D270E(SEQ ID NOs:9和20)、5F11-45 V4 D270E(SEQ ID NOs:30和34)和5F11-45V9D270E(SEQ ID NOs:30和37)，其中分别提供轻链和重链序列。在可选的实施方案中，本发明的抗人CD40抗体包括含有基本上由这些重链和轻链的序列组成的重链和轻链或含有与这些序列具有至少80％、85％、90％和95％序列同一性的重链和轻链的抗体。在一些实施方案中，本发明的抗huCD40抗体包含比具有天然存在的Fc区的抗体具有相对于结合活化受体对于结合FcγRIIb更高的特异性的经修饰的Fc区。在某些实施方案中，本发明的抗huCD40抗体的A/I比小于5，且在优选的实施方案中，小于1。
在一些实施方案中，本发明的抗huCD40抗体包含一个或多个重链和一个或多个轻链，诸如两个重链和两个轻链。
本发明进一步提供编码本发明的抗CD40抗体的重链和/或轻链可变区或其抗原结合片段的的核酸、包含所述核酸分子的表达载体、转化有所述表达载体的细胞和通过从转化有表达载体的细胞表达抗体并回收抗体来产生抗体的方法。
本发明还提供包含本发明的抗huCD40抗体、或其抗原结合片段和载体的药物组合物。
本发明提供增强主体中的免疫应答的方法，其包括向主体施用有效量的本发明的抗huCD40抗体或其抗原结合片段，使得所述主体中的免疫应答得到增强。在某些实施方案中，主体具有肿瘤并且针对肿瘤的免疫应答得到增强。在另一实施方案中，主体具有病毒感染，例如慢性病毒感染，和抗病毒免疫应答得到增强。
本发明还提供抑制主体中的肿瘤生长的方法，其包括向主体施用本发明的抗huCD40抗体或其抗原结合片段，使得肿瘤生长得到抑制。
本发明还提供治疗癌症的方法，例如，通过免疫疗法，其包括向有需要的主体施用治疗有效量的本发明的抗huCD40抗体或其抗原结合片段，例如，作为药物组合物，由此治疗癌症。在某些实施方案中，癌症是膀胱癌、乳腺癌、子宫/子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈部癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤和病毒相关的癌症。在某些实施方案中，癌症是转移性癌症、难治性癌症或复发性癌症。
在某些实施方案中，本文所述的调节免疫功能的方法和治疗方法包括施用本发明的抗huCD40抗体，并组合有以下一种或多种治疗剂或作为双特异性试剂与一种或多种治疗剂一起施用，例如抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG3抗体、抗GITR抗体、抗OX40抗体、抗CD73抗体、抗TIGIT抗体、抗CD137抗体、抗CD27抗体、抗CSF-1R抗体、抗CTLA-4抗体、TLR激动剂或IDO或TGFβ的小分子拮抗剂。在具体的实施方案中，抗huCD40疗法组合有抗PD1和/或抗PD-L1疗法，例如，用结合人PD1的抗体或其抗原结合片段或结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段治疗。
附图简述
图1显示重新编号118-446的人IgG1f恒定结构域(SEQ ID NO:65)的序列以更好说明本文公开的Fc序列变体(表4)。经受改变的残基以粗体显示，并且改变后的氨基酸在该残基下以粗体提供。将D270E取代加下划线。C末端赖氨酸(K)残基已在图1和SEQ ID NO:65以及序列表中公开的所有其他重链和重链恒定结构域序列中去除。然而，在其他实施方案中，尤其是编码本发明的抗huCD40抗体的重链和重链恒定结构域的核酸构建体，这些序列包含蛋白C末端处的额外赖氨酸残基或编码核酸的3'端处的另外赖氨酸的核苷酸。
图2是说明由本发明的抗体结合的人CD40上的表位组(“箱(bins)”)以及阻断CD40L结合的维恩图。具有重叠的椭圆或圆的抗体竞争结合人CD40，并且落入矩形内的抗体阻断CD40L结合人CD40。
图3A和3B显示如通过IL-6分泌所测量的由根据Fc序列的激动剂抗CD40抗体的树突细胞的活化。参见实施例7。构建包含mAb 12D6-24可变结构域和各种人IgG1f恒定区包括IgG1f、SE、SELF、P238D、V4、V8、V9和V12变体的一系列抗体。图3A呈现使用来自一种供体的细胞获得的数据，和图3B呈现使用来自另一种供体的细胞获得的数据。
图4显示如通过细胞表面CD54所测量的，由根据可变结构域序列的激动剂抗CD40抗体的细胞活化。参见实施例7。构建包含人IgG1f-V12恒定区和来自亲代(鼠)抗CD40mAbs12D6、5G7、8E8、19G3和5F11的可变结构域的一系列抗体。将结果作为根据抗体浓度的中值荧光强度(MFI)来作图。
图5显示通过各种本发明的抗体包括具有D270取代的抗体的％FcγR结合。参见实施例8。包括“-sup”的抗体名称代表来自抗体产生细胞的上清液，而其他为经纯化的抗体。数据呈现为抗体和受体的每一组合的最大受体结合值的百分比，如在ForteBio Octet系统中所测量。例如参见实施例3。三个柱的每个簇从左至右代表结合hCD32a/FcγRIIa-H131(10μM)(阴影线柱)、hCD32b/FcγRIIa-R131(10μM)(黑色柱)和hCD32b/FcγRIIb(1μM)(白色柱)。
详细描述
本发明提供特异性结合人CD40(“huCD40”)并且具有激动剂活性的分离的抗体，特别是单克隆抗体，例如，人源化或人单克隆抗体。提供各种人源化鼠抗huCD40单克隆抗体的序列。在某些实施方案中，本文描述的抗体来源于特定的鼠重链和轻链种系序列和/或包含含有特定氨基酸序列的特定结构特征诸如CDR区。在其他实施方案中，抗体与本文提供其序列的抗CD40抗体竞争CD40结合或者与本文提供其序列的抗CD40抗体结合相同的表位。在一些实施方案中，重链Fc区的序列经修饰以特异性增强对FcγRIIb的结合。
本文进一步提供制备此类抗体、包含此类抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物和双特异性分子以及经配制以含有该抗体或片段的药物组合物的方法。本文还提供单独或与其他免疫刺激剂(例如抗体)和/或癌症或抗感染疗法组合使用抗体来免疫应答增强的方法。因此，本文所述的抗huCD40抗体可以用于多种多样的治疗应用中的治疗，包括例如抑制肿瘤生长和治疗慢性病毒感染。
定义
为了使本说明书可以更易于理解，首先定义某些术语。另外的定义描述于整个详述中。
CD40指“TNF受体超家族成员5”(TNFRSF5)。除非另有说明，或从上下文是清楚的，否则本文提及CD40指人CD40(“huCD40”)并且抗CD40抗体指抗人CD40抗体。人CD40进一步描述于GENE ID NO:958和MIM(人中的孟德尔遗传):109535。人CD40(NP_001241.1)的序列(包括20个氨基酸的信号序列)提供于SEQ ID NO:1。
CD40与CD40配体(CD40L)相互作用，其也称为TNFSF5、gp39和CD154。除非另有说明，或从上下文中是清楚的，否则本文提及CD40L指人CD40L(“huCD40L”)。人CD40L进一步描述于GENE ID NO:959和MIM:300386。人CD40L(NP_000065.1)的序列提供于SEQ ID NO:2。
除非另有说明或从上下文中是清楚的，否则本文使用的术语“抗体”可包括完整抗体和其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。在一个实施方案中，“抗体”指包含通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合片段。每一重链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。在某些天然存在的IgG、IgD和IgA抗体中，重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。在某些天然存在的抗体中，每一轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变的区域，其散布于由称为框架区(FR)的更保守的区域。每一VH和VL由三个CDR和四个框架区(FR)构成，从氨基端向羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)的结合。
抗体通常以高亲和力特异性结合其同源抗原，通过107-10-11M-或更低的解离常数(KD)来反映。任何大于约10-6M的KD通常被认为表明非特异性结合。如本文所用，“特异性结合”抗原的抗体指以高亲和力结合抗原和实质上相同的抗原但不以高亲和力结合不相关抗原的抗体，所述高亲和力意指具有10-7M或更低、优选10-8M或更低、甚至更优选5x 10-9M或更低、且最优选10-8M至10-10M或更低的KD。如果抗原展示出与给定抗原高度的序列同一性，例如，如果其展示出与给定抗原序列至少80％、至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、或甚至更优选至少99％的序列同一性，则所述抗原与给定抗原是“实质上相同的”。例如，特异性结合人CD40的抗体还可以与来自某些非人灵长类物种(例如食蟹猴)的CD40交叉反应，但可以不与来自其他物种的CD40或除CD40之外的抗原交叉反应。
除非另有说明，免疫球蛋白可以来自于任何通常已知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG同种型在某些物种中分为亚类：在人中为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，和在小鼠中为IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。免疫球蛋白例如人IgG1以若干同种异型存在，其彼此之间在至多几个氨基酸上有所不同。除非另有说明，否则本发明的抗体包含IgG1f恒定结构域(SEQ ID NO:65)。除非另有说明，“抗体”可以包括例如单克隆和多克隆抗体；嵌合和人源化抗体；人和非人抗体；全合成抗体；和单链抗体。
术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”如本文所用指保留特异性结合抗原(例如，人CD40)的能力的抗体的一种或多种片段。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分/片段”中的结合片段的实例包括(i)Fab片段-由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)aF(ab')2片段-包含通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段和(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546)。分离的互补决定区(CDR)或通过合成接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合，可以包含抗体的抗原结合结构域(如果其能够结合抗原的话)。
单链抗体构建体也包括在本发明内。尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但可以使用重组方法通过能够使其成为单一蛋白链的合成接头将它们连接，在所述单一蛋白链中VL和VH区配对以形成称为单链Fv(scFv)的单价分子；参见例如Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体还旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分/片段”中。这些和其他可能的构建体描述于Chan和Carter(2010)Nat.Rev.Immunol.10:301。这些抗体片段使用本领域技术人员公知的常规技术获得，并且以如完整抗体的相同方式筛选片段的功效。抗原结合部分/片段可以通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割来产生。
除非另有说明，当用于指抗体时，诸如在权利要求中，词语“片段”指抗体的抗原结合片段，从而使得“抗体或片段”具有如“其抗体或其抗原结合片段”的相同含义。
“双特异性的”或“双功能抗体”是具有两个不同的重/轻链对的人工杂种抗体，产生具有对不同抗原的特异性的两个抗原结合位点。双特异性抗体可以通过多种方法包括杂交瘤融合或连接Fab'片段来产生。参见例如，Songsivilai和Lachmann(1990)Clin.Exp.Immunol.79:315-321；Kostelny等人(1992)J.Immunol.148,1547-1553。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指展示单一结合特异性和对于特定表位的亲和力的抗体或者抗体的组合物，在所述组合物中所有抗体均展示单一结合特异性和对于特定表位的亲和力。通常此类单克隆抗体将来源于单细胞或编码抗体的核酸，并且将在无有意引入任何序列改变的情况下增殖。因此，术语“人单克隆抗体”指具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和任选恒定区的单克隆抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体通过杂交瘤，例如通过将获自转基因或转染色体的非人动物(例如，具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因小鼠)的B细胞融合至无限增殖化细胞获得的杂交瘤，来产生。
如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如(a)从对于人免疫球蛋白基因为转基因的或转染色体的动物(例如小鼠)或从该动物制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞(例如从转染瘤)分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式来制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体包含可变和恒定区，所述可变和恒定区利用由种系基因编码的特定人种系免疫球蛋白序列，但包括例如在抗体成熟过程中发生的随后的重排和突变。如现有技术(参见例如，Lonberg(2005)Nature Biotech.23(9):1117-1125)中已知，可变区包含抗原结合结构域，其由重排以形成对外源抗原特异性的抗体的各种基因编码。除了重排，可变区还可以进一步通过多个单一氨基酸改变(称为体细胞突变或超突变)来修饰以增加抗体对外源抗原的亲和力。恒定区将在进一步响应抗原中改变(即，同种型转换)。因此，编码响应于抗原的轻链和重链免疫球蛋白多肽的重排的和体细胞突变的核酸可以不与原始种系序列相同，而是会实质上相同或相似(即，具有至少80％同一性)。
“人”抗体(HuMAb)指具有其中框架区和CDR区域均来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点定向诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”并不旨在包括这样的抗体，其中来源于另一哺乳动物物种诸如小鼠的种系的CDR序列已经连接至人框架序列上。术语“人”抗体和“完全人”抗体同义使用。
“人源化”抗体指这样的抗体，所述抗体中一些、大部分或所有非人抗体(例如小鼠抗体)的CDR结构域外面的氨基酸被来源于人免疫球蛋白的相应氨基酸所替代。在抗体的人源化形式的一个实施方案中，CDR结构域外部的一些、大部分或所有氨基酸已被来自人免疫球蛋白的氨基酸所替代，而一个或多个CDR区内的一些、大部分或所有氨基酸没有改变。氨基酸的小的添加、缺失、插入、取代或修改是容许的，只要它们没有消除抗体结合特定抗原的能力。“人源化”抗体保留与原始抗体类似的抗原特异性。
“嵌合抗体”指这样的抗体，其中可变区来源于一个物种且恒定区来源于另一物种，诸如其中可变区来源于小鼠抗体且恒定区来源于人抗体的抗体。“杂种(hybrid)”抗体指具有不同类型的重链和轻链，诸如小鼠(亲代)重链和人源化轻链或反之亦然的抗体。
如本文所用，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE抗体)。
“同种异型”指特定同种型组内天然存在的变体，所述变体在一个或几个氨基酸上不同。参见例如，Jefferis等人(2009)mAbs 1:1。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异性的抗体”本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
如本文所用，“分离的抗体”指实质上没有具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合CD40的分离的抗体实质上没有特异性结合CD40之外的抗原的抗体)。然而，特异性结合CD40的表位的分离的抗体可以具有与来自不同物种的其他CD40蛋白的交叉反应性。
来源于抗体Fc区与某些Fc受体的相互作用的“效应子功能”包括但不必须限于Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、FcγR介导的效应子功能诸如ADCC和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和细胞表面受体的下调(例如，B细胞受体；BCR)。此类效应子功能通常需要Fc区与抗原结合结构域(例如抗体可变结构域)组合。
“Fc受体”或“FcR”是结合免疫球蛋白的Fc区的受体。结合IgG抗体的FcR包含FcγR家族的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪切形式。FcγR家族由三个活化性(小鼠中的FcγRI、FcγRIII和FcγRIV；人中的FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA)和一个抑制性(FcγRIIb或等同地FcγRIIB)受体组成。人FcγR的各种性质概述于表1中。大部分先天效应子细胞类型共表达一种或多种活化性FcγR和抑制性FcγRIIb，而天然杀伤(NK)细胞在小鼠和人中选择性表达一种活化性Fc受体(小鼠中的FcγRIII和人中的FcγRIIIA)但不表达抑制性FcγRIIb。人IgG1结合大部分人Fc受体并且认为在其结合的活化Fc受体的类型方面等同于鼠IgG2a。
表1
人FcγR的性质
Figure BDA0003868948590000121
“Fc区”(片段可结晶区域)或“Fc结构域”或“Fc”指抗体的重链的C末端区域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括结合位于免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)上的Fc受体或结合经典补体系统的第一组分(Clq)。因此，Fc区包含排除第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如CH1或CL)的抗体的恒定区。在IgG、IgA和IgD同种型中，Fc区包含抗体的两条重链各自中的CH2和CH3恒定区；IgM和IgE Fc区包含各多肽链中的三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。对于IgG，Fc区包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ2之间的铰链。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以改变，但人IgG重链Fc区通常定义为从位置C226或P230处的氨基酸残基(或这两个氨基酸之间的氨基酸)至重链的羧基末端的片段(strech)，其中编号根据Kabat中的EU索引。Kabat等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,MD；还参见美国专利申请公开号2008/0248028的图3c-3f。人IgG Fc区的CH2结构域从约氨基酸231延伸至约氨基酸340，而CH3结构域位于Fc区中CH2结构域的C末端侧，即，其从IgG的约氨基酸341延伸至约氨基酸447(包括C末端赖氨酸)。如本文所用，Fc区可以为天然序列Fc，包括任何同种异型变体，或变体Fc(例如非天然存在的Fc)。Fc也可以孤立地或在含Fc蛋白多肽诸如“包含Fc区的结合蛋白”也称为“Fc融合蛋白”(例如抗体或免疫黏附素)的背景下指这一区域。
“天然序列Fc区”或“天然序列Fc”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列一致的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区；和天然序列人IgG4 Fc区，以及其天然存在的变体。天然序列Fc包括Fc的各种同种异型。参见例如，Jefferis等人(2009)mAbs 1:1。
术语“表位”或“抗原决定簇”指抗原(例如huCD40)上的位点，免疫球蛋白或抗体特异性结合所述位点。蛋白抗原内的表位可以从连续的氨基酸(通常为线性表位)或通过蛋白的三级折叠而并列的不连续氨基酸(通常为构象表位)形成。由连续的氨基酸形成的表位通常(但并非总是如此)对变性溶剂保持暴露，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位通常包括独特空间构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。
术语“表位作图”指鉴定参与抗体-抗原识别的抗原上的分子决定簇的方法。用于确定哪种表位被给定抗体所结合的方法是本领域中众所周知的并且包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定，其中测试来自(例如来自CD40)的重叠或连续肽与给定抗体(例如抗CD40抗体)的反应性；x射线晶体学；二维核磁共振；酵母展示(参见实施例6)；和HDX-MS(参见例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,编辑(1996))(参见实施例5)。
关于两种或多种抗体的术语“结合相同表位”意指抗体结合氨基酸残基的相同区段，如通过给定方法所测定的。用于确定抗体是否与本文所述抗体结合“CD40上相同的表位”的技术包括例如表位作图方法，诸如，抗原：抗体复合物的晶体的x射线分析，其提供表位的原子分辨率，和氢/氘交换质谱法(HDX-MS)。其他方法监测抗体与抗原片段(例如蛋白水解片段)或抗原突变的变化形式(其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰导致的结合丧失通常认为是表位组分的指示)的结合，诸如丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells(1985)Science 244:1081)或突变体靶序列变体的酵母展示(参见实施例6)。此外，还可以使用用于表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于目标抗体亲和力分离来自组合噬菌体展示肽文库的特异性短肽的能力。预期具有相同或密切相关的VH和VL或相同的CDR序列的抗体结合相同的表位。
“与另一抗体竞争结合靶标”的抗体指(部分或完全)抑制其他抗体与靶标结合的抗体。两种抗体是否彼此竞争结合靶标，即一种抗体是否抑制另一抗体结合靶标且至何种程度，可以使用已知的竞争实验来测定。在某些实施方案中，抗体与另一抗体竞争结合靶标并和抑制另一抗体结合靶标至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。抑制或竞争的水平可以取决于何种抗体是“封闭抗体”(即，首先与靶标孵育的冷抗体(cold antibody))而不同。竞争测定可以如例如以下中所述进行：Ed Harlow和DavidLane,Cold Spring Harb.Protoc.；2006；doi:10.1101/pdb.prot4277或“UsingAntibodies”，Ed Harlow和David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,USA 1999的第11章。竞争抗体结合相同表位、重叠表位或邻近表位(例如，如通过位阻所证明)。
其他竞争性结合测定包括：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见Stahli等人(1983)Methods in Enzymology 9:242)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等人(1986)J.Immunol.137:3614)；固相直接标记测定，固相直接标记夹心测定(参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等人(1988)Mol.Immunol.25(1):7)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人(1990)Virology176:546)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等人(1990)Scand.J.Immunol.32:77)。
如本文所用，术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”指抗体结合预定抗原上的表位但不结合其他抗原。通常，抗体(i)以约小于10-7M、诸如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的平衡解离常数(KD)结合预定抗原，当通过例如表面等离子共振(SPR)技术在
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2000表面等离子共振仪器中使用预定抗原(例如重组人CD40)作为分析物和抗体作为配体、或抗体结合抗原阳性细胞的Scatchard分析所测定时，和(ii)以是其对预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的亲和力的至少两倍的亲和力结合预定抗原。因此，“特异性结合人CD40”的抗体指以10-7M或更低，诸如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的KD结合可溶性或细胞结合的人CD40的抗体。“与食蟹猴CD40交叉反应”的抗体指以10-7M或更低，诸如约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的KD结合食蟹猴CD40的抗体。
如本文所用，术语“kassoc”或“ka”指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数，而如本文所用的术语“kdis”或“kd,”指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。如本文所用，术语“KD”指平衡解离常数，其获自kd比ka(即，kd/ka)的比率并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域充分建立的方法来确定。用于测定抗体的KD的优选方法是生物层干涉法(BLI)分析，优选使用ForteBio Octet RED装置(参见实施例3)、表面等离子共振，优选使用生物传感器系统诸如
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表面等离子共振系统(参见实施例4)、或流式细胞术和Scatchard分析。
在使用抗体或其抗原结合片段的体外或体内测定的上下文中的术语“EC50”指诱导为50％最大应答的应答(即，最大应答和基线之间的一半)的抗体或其抗原结合片段的浓度。
术语“结合固定的CD40”指本文所述抗体结合CD40，例如表达于细胞表面或连接于固体支持物的CD40的能力。
如本文所用，术语“交叉反应”指本文所述抗体结合来自不同物种的CD40的能力。例如，结合人CD40的本文所述的抗体也结合来自另一物种的CD40(例如食蟹猴CD40)。如本文所用，交叉反应性可以通过在结合测定(例如SPR、ELISA)中用纯化的抗原检测特异性反应性或结合或以其他方式功能性地与生理表达CD40的细胞相互作用来测量。用于测定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如通过
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表面等离子共振(SPR)分析使用/>
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2000SPR仪器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)或流式细胞术技术。
术语“天然存在的”如本文所用应用于对象来指对象在自然界中可发现的事实。例如，存在于可以从自然界的来源中分离的生物(包括病毒)中且尚未在实验室中由人有目的地改变的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
“多肽”指包含至少两个连续连接的氨基酸残基的链，其对于链长度没有上限。蛋白中的一个或多个氨基酸残基可以含有修饰诸如但不限于糖基化、磷酸化或二硫键。“蛋白”可以包含一种或多种多肽。
如本文所用的术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，并且可以是cDNA。
还提供的是对本文提供的抗体序列的“保守序列修饰”，即不消除由核苷酸序列编码的或含有氨基酸序列的抗体对抗原的结合的核苷酸和氨基酸序列修饰。例如，可以通过本领域公知的标准技术诸如定点诱变和PCR介导的诱变来引入修饰。保守序列修饰包括保守氨基酸取代，其中将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，抗CD40抗体中预测的非必需氨基酸残基优选用来自相同侧链家族的另一氨基酸残基替代。鉴定不会消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域中众所周知的。参见例如，Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)。
可选地，在另一实施方案中，可以将突变连同抗CD40编码序列的全部或部分随机地引入，诸如通过饱和诱变，并且所得的修饰的抗CD40抗体可以筛选改进的结合活性。
对于核苷酸，术语“实质上同源性”表示当最优比对和比较时，两个核酸或其指定序列在至少约80％的核苷酸，通常至少约90％至95％、且最优选至少约98％至99.5％的核苷酸上是相同的，且具有合适的核苷酸插入或缺失。可选地，当区段在选择性杂交条件下将于链的互补体杂交时，存在实质上同源性。
对于多肽，术语“实质上同源性”表示当最优比对和比较时，两个多肽或其指定序列在至少约80％的氨基酸，通常至少约90％至95％、且最优选至少约98％至99.5％的氨基酸上是相同的，且具有合适的氨基酸插入或缺失。
两条序列之间的百分比同一性是当序列最优比对时序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同位置的#/位置的总#x 100)，且确定的最优比对考虑缺口的数目和每一缺口的长度，其需要被引入到两条序列的最优比对中。序列比较和两条序列之间的百分比同一性的确定可以使用数学算法完成，如在下文的非限制性实例中所述。
两条核苷酸序列之间的百分比同一性可以使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定。两条核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性还可以使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))的算法来确定，所述算法已并入ALIGN程序(2.0版)中，其使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12且缺口罚分为4。此外，两条氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法测定，所述算法已并入GCG软件包中的GAP程序，其使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，和16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重。
本文所述的核酸和蛋白序列可以进一步用作“询问序列”以进行针对公共数据库的检索以例如鉴定相关序列。此类序列可以使用以下的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)来进行：Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序、评分＝100、字长＝12来进行以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白检索可以用XNBLAST程序、评分＝50、字长＝3来进行以获得与本文所述的蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得比较目的的有缺口的比对，可以利用Gapped BLAST，如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，各程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数可以使用。
核酸可以存在于完整细胞中、细胞裂解物中、或部分纯化或实质上纯化形式中。当通过标准技术包括碱性/SDS处理、CsCl条带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域中公知的其他技术将核酸从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸(例如，染色体的其他部分)或蛋白中纯化时，所述核酸“被分离”或使所述核酸“实质上纯的”。参见Ausubel等人,编辑Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and WileyInterscience,New York(1987)。
如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其指另外的DNA区段可以连入其中的环状双链的DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接入病毒基因组中。某些载体可以在它们导入其中的宿主细胞(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中时可以整合入宿主细胞的基因组中，并由此随宿主基因组进行复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简单称为“表达载体”)。通常，重组DNA技术中采用的表达载体一般是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，还包括其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，其起同样的功能。
如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)旨在指包含天然不存在于细胞中的核酸的细胞，并且可以是重组表达载体已引入其中的细胞。应理解此类术语旨在不仅指具体的主体细胞还指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可以在后代中发生，此类后代实际上可能与母细胞不相同，但仍包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
“免疫应答”指脊椎动物中针对外源物(foreign agent)的生物应答，所述应答保护生物体免于这些物质和由其引起的疾病。免疫应答由免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)和由这些细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导，其导致从脊椎动物机体选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或消除入侵病原体、细胞或感染有病原体的组织、癌性或其他异常细胞、或者(在自身免疫或病理性炎症的情况下)正常人细胞或组织。免疫反应包括例如活化或抑制T细胞，例如，效应T细胞或Th细胞，诸如CD4+或CD8+T细胞，或者抑制或耗尽Treg细胞。“T效应”(“Teff”)细胞指具有细胞溶解活性的T细胞(例如CD4+和CD8+T细胞)以及T辅助(Th)细胞(其分泌细胞因子并活化和引导其他免疫细胞)，但不包括调节性T细胞(Treg细胞)。
如本文所用，术语“T细胞介导的应答”指由T细胞介导的应答，包括效应T细胞(例如，CD8+细胞)和辅助T细胞(例如，CD4+细胞)。T细胞介导的应答包括例如T细胞细胞毒性和增殖。
如本文所用，术语“细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答”指由细胞毒性T细胞诱导的免疫应答。CTL应答主要由CD8+T细胞介导。
“免疫调节剂(immunomodulator)”或“免疫调节剂(immunoregulator)”指这样的试剂，例如可以参与调节、调控或修饰免疫应答的信号传导途径的组分。“调节”、“调控”或“修饰”免疫应答指免疫系统的细胞中的任何改变或此类细胞(例如效应T细胞)的活性中的任何改变。此类调节包括刺激或抑制免疫系统，其可以显示为各种细胞类型的数目中的增加或降低、这些细胞活性中的增加或降低、或可以在免疫系统内发生的任何其他改变。抑制性和刺激性免疫调节剂两者均已被鉴定，其中的一些可以在肿瘤微环境中具有增强的功能。在优选的实施方案中，免疫调节剂位于T细胞的表面。“免疫调节靶标”或“免疫调节性靶标”是这样的免疫调节剂，其靶向被物质、试剂、部分、化合物或分子所结合并且其活性受所述物质、试剂、部分、化合物或分子的结合而改变。免疫调节靶标包括例如细胞表面上的受体(“免疫调节受体”)和受体配体(“免疫调节配体”)。
“免疫疗法”指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答的方法治疗患有疾病或者处于感染疾病或经受疾病复发的风险中的主体。
“免疫刺激疗法(Immunostimulating therapy)”或“免疫刺激疗法(immunostimulatory therapy)”指导致主体中免疫应答增加(诱导或增强)用于例如治疗癌症的疗法。
“加强内源性免疫应答”意指增加主体中现有免疫应答的效力或效能。效力或效能中的这种增加可以例如通过克服抑制内源性宿主免疫应答的机制或通过刺激增强内源性宿主免疫应答的机制来实现。
如本文所用，术语“连接的”指两个或多个分子的缔合。连接可以是共价的或非共价的。连接也可以是基因的(即重组融合的)。此类连接可以使用各种各样的本领域公认技术诸如化学缀合和重组蛋白产生来实现。
如本文所用，“施用”指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统的任何向主体身体引入包含治疗剂的组合物。用于本文所述的抗体的优选施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊椎或其他肠胃外施用途径，例如，通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。可选地，本文所述的抗体可以经非肠胃外途径使用，诸如施用的局部、表皮或粘膜途径，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部地。施用还可以例如一次、多次、和/或经一个或多个延长的周期来进行。
如本文所用，术语“抑制”或“阻断”可互换使用，并且包括部分和完全抑制/阻断至少约50％，例如，至少约60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。
如本文所用，“癌症”指特征在于体内异常细胞不受控的生长的疾病的宽范围的组。不受调节的细胞分裂可导致形成恶性肿瘤和细胞，其侵入邻近组织并可以经淋巴系统或血流转移至身体的远端部分。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指向主体进行的任何类型的干预或处理，或对主体施用活性药剂，目标在于逆转、减轻、改善、抑制、或减缓或防止与疾病相关的症状、并发症、病况或生物化学指标的进展、发生、加重或复发。预防指向不患有疾病的主体施用，以防止疾病发生或如果发病将其影响降至最低。
术语“有效剂量(dose)”或“有效剂量(dosage)”定义为足以实现或至少部分实现期望效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是这样的药物的任何量，当单独或与另一治疗剂组合使用时，所述量促进由疾病症状严重度降低所证明的疾病消退、无疾病症状的时期的频率和持续时间的增加、或防止由于疾病折磨的损伤或失能。药物的“预防有效量”或“预防有效剂量”是药物这样的量，当单独或与另一治疗剂组合施用于处于发生疾病或患有疾病复发的风险中的主体时，所述量抑制疾病的发生或复发。治疗剂或预防剂促进疾病消退或抑制疾病发生或复发的能力可以使用从业医师已知的多种方法来评价，诸如在临床试验过程中在人中，在预测在人中的效力的动物模型系统中，或通过测定体外测定中药剂的活性。
例如，抗癌剂是减缓主体中癌症进展或促进主体中癌症消退的药物。在优选的实施方案中，治疗有效量的药物促进癌症消退至消除癌症的点。“促进癌症消退”意指单独或与抗肿瘤剂组合施用有效量的药物导致在患者中肿瘤生长或尺寸减少、肿瘤坏死、至少一种疾病症状严重性降低、无疾病症状时期的频率和持续时间增加、防止由于疾病折磨所致的伤残或残疾、或以其他方式改善疾病症状。药理有效性指药物促进患者中癌症消退的能力。生理安全性指由于施用药物导致的毒性、或其他细胞、器官和/或生物体水平的不利生理效应(不良作用)的可接受的低水平。
对于治疗肿瘤，例如，药物的治疗有效量或剂量优选相对于未治疗的主体抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，和仍更优选至少约80％。在最优选的实施方案中，药物的治疗有效量或剂量完全抑制细胞生长或肿瘤生长，即，优选抑制细胞生长或肿瘤生长100％。化合物抑制肿瘤生长的能力可以使用下文所述的测定来评估。肿瘤生长的抑制可以不是在治疗后马上出现的，并且可以只在一定时期后或在重复施用后出现。可选地，组合物的这一特性可以通过检查化合物抑制细胞生长的能力来评估，此类抑制可以通过技术人员所知的测定体外测量。在本文所述的其他优选实施方案中，肿瘤消退可以被观察到并且可以持续至少约20天、更优选至少约40天、或甚至更优选至少约60天的时期。
除非从上下文是明显的，否则如本文所用的“组合”疗法意在涵盖以协同方式施用两种或多种治疗剂，并且包括但不限于同时给药。具体而言，组合疗法涵盖共施用(例如，施用共制剂或同时施用分开的治疗组合物)和连续或顺序施用，条件是施用一种治疗剂以某种方式受制于施用另一治疗剂。例如，一种治疗剂可以仅在不同治疗剂已经施用并允许作用规定时期之后来施用。参见例如，Kohrt等人(2011)Blood 117:2423。
术语“患者”和“主体”指任何接受预防性或治疗性治疗的人。例如，本文所述的方法和组合物可以用于治疗具有癌症的主体。
本文所述的各个方面在以下子部分中进一步详述。
I.抗CD40抗体
本申请公开了具有期望特性的激动性抗huCD40抗体，其用作治疗疾病诸如癌症中的治疗剂。这些特性包括以高亲和力结合人CD40的能力、在人主体中的可接受的低免疫原性、优先结合FcγRIIb的能力和不存在可能降低抗体的化学稳定性的序列缺陷(sequenceliabilities)中的一种或多种。
本文以序列公开的抗CD40抗体结合人CD40上的特异性表位，如可以如实施例5和6中所述进行测定。结合相同或密切相关表位的其他抗体可能享有这些期望的特性，并且可以进行竞争实验来发现。
与本文公开的抗huCD40抗体竞争的抗huCD40抗体
与本发明的抗体竞争结合huCD40的抗huCD40抗体可以使用与本文所述的那些(实施例1和2)类似的免疫方案来产生。与本文以序列公开的抗huCD40抗体竞争结合的抗体也可以通过用人CD40或包含其胞外结构域(SEQ ID NO:1的残基21-193)的构建体免疫小鼠或其他非人动物、或通过用含有本文公开的抗huCD40抗体所结合的表位的人CD40的片段免疫来产生。所得的抗体可以通过本领域众所周知的方法例如在ELISA中的阻断结合至CD40的胞外结构域和免疫球蛋白Fc结构域的融合蛋白、或例如通过FACS的阻断结合至在其表面上表达huCD40的细胞的能力来筛选阻断12D6、5F11、8E8、5G7和/或19G3结合人CD40的能力。在各种实施方案中，在添加12D6、5F11、8E8、5G7或19G3之前、同时或之后将测试抗体与CD40-Fc融合蛋白(或与在其表面上表达huCD40的细胞)接触。例如，“装箱(binning)”实验可以进行(实施例4)以确定测试抗体是否落入与本文以序列公开的抗体的相同“箱(bin)”内，其中本文以序列公开的抗体作为“参考”抗体且待测试的抗体作为“测试”抗体。降低本文以序列公开的抗体结合人CD40(作为Fc融合体或在细胞上)(特别是以粗略地化学计量浓度)的抗体可能结合在相同、重叠或邻近表位上，并因此可能具有12D6、5F11、8E8、5G7或19G3的期望的功能特性。
因此，本文提供抗huCD40抗体，其抑制本文所述的抗huCD40抗体结合细胞上的huCD40至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，和/或其与细胞上的huCD40的结合被本文所述的抗huCD40抗体抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，例如，如通过ELISA或FACS所测量，诸如通过使用以下段落中所述的测定。
测定测试抗体是否阻断参考抗体的结合(即，与其竞争)的示例性竞争实验可以如下进行：将表达CD40的细胞以105个细胞/样品孔接种于96孔板中。将板放置在冰上，随后添加浓度范围为0-50μg/mL(自50μg/mL的最高浓度开始的三倍滴定)的未缀合的测试抗体。不相关的IgG可以用作第一抗体的同种型对照并以相同浓度(自50μg/mL的最高浓度开始的三倍滴定)添加。与50μg/mL未标记的参考抗体预孵育的样品可以包括作为完全阻断(100％抑制)的阳性对照，并且在一级孵育中无抗体的样品可以用作阴性对照(无竞争；0％抑制)。孵育30分钟后，将标记的(例如生物素化的)参考抗体以每孔2μg/mL的浓度添加，不洗涤。将样品在冰上再孵育30分钟。通过用FACS缓冲液洗涤细胞将未结合的抗体去除。用检测标记的试剂例如用于检测生物素的PE缀合的链霉抗生物素(Invitrogen,目录号S21388)检测细胞结合的标记的参考抗体。在FACS Calibur Flow Cytometer(BD,San Jose)上获得样品并用Flowjo软件(Tree Star,Inc,Ashland,OR)分析。结果可以表示为％抑制。
通常，随后颠倒(in the reverse)进行相同实验，即，测试抗体为参考抗体且参考抗体为测试抗体。在某些实施方案中，抗体至少部分地(例如，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)或完全(100％)阻断其他抗体与靶标(例如人CD40或其片段)的结合，而与当一种或另一种抗体为参考抗体时是否发生抑制无关。当抗体两种方式彼此竞争时(即，在其中首先加入参考抗体的竞争实验中和在其中首先加入测试抗体的竞争实验中)，参考抗体和测试抗体“交叉阻断”彼此与靶标的结合。
如果例如在如实施例4中所述的那些的竞争实验中，当以粗略相等浓度呈现时，抗huCD40抗体抑制12D6、5F11、8E8、5G7和/或19G3对人CD40的结合至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，则认为它们与本文公开的抗huCD40抗体竞争。除非另有说明，否则如果如在之前两段中概述的竞争ELISA实验中测量的，当以与选自本发明的抗CD40抗体的抗体粗略相等摩尔浓度使用时，抗体降低所选抗体与人CD40(SEQ IDNO:1)的结合至少20％，则认为该抗体与所选抗体竞争。
结合相同表位的抗huCD40抗体
与本文公开的抗体结合相同或相似表位的抗huCD40抗体可以使用与本文所述的那些(实施例1和2)类似的免疫方案来产生。可以就结合人CD40的高亲和力(实施例3)筛选所得抗体。所选抗体可以随后在其中huCD40的序列变体呈现于酵母细胞表面上的酵母展示测定中(实施例6)或通过氢-氘交换实验(实施例5)来研究以确定抗体结合的精确表位。
表位确定可以通过本领域已知的任何方法来进行。在各种实施方案中，如果抗huCD40抗体与在huCD40的至少一个区域内的相同残基中的一个或多个接触；如果抗huCD40抗体与在huCD40的至少一个区域内的大部分残基接触；如果抗huCD40抗体与在huCD40的每一区域内的大部分残基接触；如果抗huCD40抗体与沿huCD40的整个长度的大部分接触接触；如果抗huCD40抗体与在人CD40的所有相同的不同区域内接触；如果抗huCD40抗体与在huCD40上的任一区域处的所有残基接触；或如果抗huCD40抗体与在所有相同区域处的所有相同残基接触，则认为抗huCD40抗体与本文公开的抗huCD40 mAb结合相同的表位。表位“区域”是沿一级序列的残基簇。
用于确定与本文所述抗体结合“huCD40上的相同表位”的技术包括抗原：抗体复合物的晶体的x射线分析，其提供表位的原子分辨率。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原的突变变化形式的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基修饰导致的结合丧失通常被认为是表示表位组分。方法还可以依赖于目标抗体从组合噬菌体展示肽文库或从靶蛋白的蛋白酶消化产物中亲和力分离特异性短肽(以天然三维形式或以变性形式)的能力。随后将肽认为是对应于用于筛选肽文库的抗体的表位定义的引导。对于表位作图，还已经开发了计算算法，其已显示对构象不连续表位进行定位。
表位或包含表位的区域也可以通过筛选结合跨越CD40的一系列重叠肽来鉴定。可选地，Jespers等人(1994)Biotechnology 12:899的方法可以用于引导选择具有相同表位从而具有与本文所述的抗CD40抗体的相似特性的抗体。使用噬菌体展示，将抗CD40抗体的第一重链与全部的(repertoire)(优选人)轻链配对以选择CD40结合抗体，并随后将新的轻链与全部(优选人)重链配对以选择具有如本文所述的抗huCD40抗体的相同表位或表位区域的(优选人)CD40结合抗体。可选地，本文所述的抗体的变体可以通过诱变编码抗体的重链和轻链的cDNA来获得。
丙氨酸扫描诱变，如Cunningham和Wells(1989)Science 244:1081中所述，或一些其他形式的CD40中氨基酸残基的点诱变(诸如实施例6提供的酵母展示方法)也可用于确定抗CD40抗体的功能表位。
由特异性抗体结合的表位或表位区域(“表位区域”是包含表位的区域或与表位重叠的区域)也可以通过评价抗体与包含CD40片段的肽的结合来测定。含有CD40(例如人CD40)序列的一系列重叠肽可以合成并筛选结合，例如在直接ELISA、竞争ELISA(其中评价肽阻止抗体与结合至微量滴定板的孔的CD40的结合的能力)中或在芯片上。此类肽筛选方法可能无法检测一些不连续功能表位，即，涉及在CD40多肽链的一级序列上不连续的氨基酸残基的功能表位。
表位还可以通过基于MS的蛋白足迹法诸如氢/氘交换质谱法(HDX-MS)和蛋白快速光化学氧化法(Fast Photochemical Oxidation of Proteins,FPOP)来鉴定。HDX-MS可以例如如Wei等人(2014)Drug Discovery Today 19:95进一步所述的来进行，所述方法具体地通过引用并入本文。还参见实施例5。FPOP可以如例如描述于Hambley和Gross(2005)J.American Soc.Mass Spectrometry 16:2057中所述进行，所述方法具体地通过引用并入本文。
由抗CD40抗体结合的表位也可以通过结构方法来测定，诸如X射线晶体结构测定(例如WO 2005/044853)、分子建模和核磁共振(NMR)光谱学，包括当游离时和当结合在目标抗体的复合物中时不稳定的酰胺氢的H-D交换速率的NMR测定(Zinn-Justin等人(1992)Biochemistry 31:11335；Zinn-Justin等人(1993)Biochemistry 32:6884)。
关于X射线晶体学，结晶可以使用本领域任何已知方法来完成(例如Giege等人(1994)Acta Crystallogr.D50:339；McPherson(1990)Eur.J.Biochem.189:1)，包括微配液结晶法(microbatch)(例如Chayen(1997)Structure 5:1269)、悬滴蒸汽扩散(例如McPherson(1976)J.Biol.Chem.251:6300)、引晶种(seeding)和透析。期望使用具有至少约1mg/mL且优选约10mg/mL至约20mg/mL的浓度的蛋白制剂。结晶可以在含有聚乙二醇1000-20,000(PEG；平均分子量范围为约1000至约20,000Da)、优选约5000至约7000Da、更优选约6000Da，且浓度范围为约10％至约30％(w/v)的沉淀剂溶液中最佳实现。还可以期望包含蛋白稳定剂，例如，浓度范围为约0.5％至约20％的甘油。合适的盐诸如氯化钠、氯化锂或柠檬酸钠在沉淀剂溶液中也是期望的，优选浓度范围为约1mM至约1000mM。沉淀剂优选缓冲至约3.0至约5.0的pH，优选约4.0。可用于沉淀剂溶液中的具体缓冲液可以改变并且是本领域公知的(Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,第三版,(1994)Springer-Verlag,New York)。可用的缓冲液的实例包括但不限于HEPES、Tris、MES和乙酸盐。晶体可以在宽范围温度下生长，包括2℃、4℃、8℃和26℃。
抗体：抗原晶体可以使用众所周知的X射线衍射技术研究并可以使用计算机软件诸如X-PLOR细化(Yale University,1992,由Molecular Simulations,Inc.发布；参见例如Blundell和Johnson(1985)Meth.Enzymol.114&115,H.W.Wyckoff等人,编辑,AcademicPress；美国专利申请公开号2004/0014194)和BUSTER(Bricogne(1993)Acta Cryst.D49:37-60；Bricogne(1997)Meth.Enzymol.276A:361-423,Carter和Sweet,编辑；Roversi等人(2000)Acta Cryst.D56:1313-1323)，其公开内容以其整体通过引用并入本文。
除非另有说明，否则关于权利要求，由抗体结合的表位是如通过HDX-MS方法实质上如实施例5中所述来测定的表位。
以高亲和力结合的抗CD40抗体
在一些实施方案中，本发明的抗huCD40抗体以高亲和力结合huCD40，如本文公开的抗huCD40抗体，增加其成为有效治疗剂的可能性。在各种实施方案中，本发明的抗huCD40抗体结合huCD40，且KD为小于10nM、5nM、2nM、1nM、300pM或100pM。在其他实施方案中，本发明的抗huCD40抗体结合huCD40，且KD为2nM-100pM。用于评价抗体对huCD40的结合能力的标准测定包括ELISA、RIA、蛋白质印迹、生物层干涉法(BLI)(参见实施例3)和
Figure BDA0003868948590000241
SPR分析(参见实施例4)。
抗CD40抗体序列变体
本文公开的抗体序列中的一些改变可以容忍且仍保留抗体的期望特性。CDR区使用Kabat系统描绘(Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242)。因此，本发明进一步提供抗huCD40抗体，其包含与本文公开的抗体(即12D6、5F11、8E8、5G7和19G3及其人源化衍生物)的CDR序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的CDR序列。本发明还提供抗huCD40抗体，其包含与本文公开的抗体(即12D6、5F11、8E8、5G7和19G3及其人源化衍生物)的重链和/或轻链可变结构域序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链和/或轻链可变结构域序列。
共有CDR序列或来源于相同鼠种系的抗CD40抗体
考虑到抗原结合特异性主要由CDR决定，因此共有本文公开的抗体(即12D6、5F11、8E8、5G7和19G3)的CDR序列的抗体可能共有其期望的特性。在一些实施方案中，本发明的抗huCD40抗体包含来源于如抗体12D6、5F11、8E8、5G7或19G3相同的鼠V区和J区种系序列的重链和轻链可变区。抗体12D6具有来源于鼠种系VH1-39_01和IGHJ4的重链和来源于种系VK1-110_01和IGKJ1的轻链。抗体5F11具有来源于鼠种系VH1-4_02和IGHJ3的重链和来源于种系VK3-5_01和IGKJ5的轻链。抗体8E8具有来源于鼠种系VH1-80_01和IGHJ2的重链和来源于种系VK1-110_01和IGKJ2的轻链。抗体5G7具有来源于鼠种系VH1-18_01和IGHJ4的重链和来源于种系VK10-96_01和IGKJ2的轻链。抗体19G3具有来源于鼠种系VH5-9-4_01和IGHJ3的重链和来源于种系VK1-117_01和IGKJ2的轻链。重链D区种系序列(CDRH3的组成部分)并无规定，因为由于其高可变性，它们通常难以指定，并且因此本发明的抗体可以包含来源于所列的V和J区种系和任何D区种系的重链。结合人CD40且来源于这些种系序列中的一些或全部的其他抗体可能在序列上密切相关，尤其是来源于相同V区基因的那些，并因此将预期共有相同的期望特性。
如本文所用，如果鼠抗体的可变区获自使用鼠种系免疫球蛋白基因的系统并且该抗体序列与种系足够相关使得其更可能来源于给定的种系而非任何其他种系，则该抗体包含“来源于”特定种系序列的重链或轻链可变区。此类系统包括用目标抗原免疫小鼠。抗体序列所“来源”的鼠种系免疫球蛋白序列可以通过将抗体的氨基酸序列与鼠种系免疫球蛋白的氨基酸序列比较并选择在序列上与抗体序列最接近的(即最大的％同一性)种系免疫球蛋白序列来鉴定。“来源于”特定种系免疫球蛋白序列的鼠抗体当相比于种系序列时可以包含氨基酸差异，其由于例如天然存在的体细胞突变或定点突变的有意引入。然而，所选的鼠抗体通常在氨基酸序列上与由种系免疫球蛋白基因(例如V区)编码的氨基酸序列具有至少90％同一性。在某些情况下，鼠抗体可以在氨基酸序列上与由种系免疫球蛋白基因(例如V区)编码的氨基酸序列具有至少95％、或甚至至少96％、97％、98％或99％的同一性。通常，来源于特定鼠种系序列的抗体将展示出与由种系免疫球蛋白基因(例如V区)编码的氨基酸序列的不超过10个氨基酸差异。在某些情况下，鼠抗体可以包含与由种系免疫球蛋白基因(例如V区)编码的氨基酸序列的不超过5个、或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。
II.工程化且修饰的抗体
VH和VL区
还提供工程化且修饰的抗体，其可以使用具有本文公开的VH和/或VL序列中的一种或多种的抗体作为起始材料以工程化修饰的抗体来制备，所述修饰的抗体可以具有自起始抗体的改变的特性。可以通过在一个或两个可变区(即VH和/或VL)内，例如在一个或多个CDR区和/或在一个或多个框架区内改变一个或多个残基来将抗体工程化。另外地或可选地，可以通过在恒定区内修饰残基例如以改变抗体的效应子功能来将抗体工程化。
可以进行的一种类型的可变区工程化是CDR移植。此类移植在人源化非人抗CD40抗体中特别有用，所述非人抗CD40抗体与本文公开的抗huCD40抗体竞争结合和/或结合如本文公开的抗huCD40抗体的相同表位。抗体经位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基主要地与靶抗原相互作用。为此原因，CDR内的氨基酸序列在不同抗体之间比CDR之外的序列更加多变。由于CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，因此可以通过构建表达载体来表达模拟特定参考抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包括移植至来自具有特性的不同抗体的框架序列的特定参考抗体的CDR序列(参见例如，Riechmann,L.等人(1998)Nature 332:323-327；Jones,P.等人(1986)Nature 321:522-525；Queen,C.等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539和Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
此类框架序列可以获自公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的公开的参考。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以发现于"VBase"人种系序列数据库以及Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242；Tomlinson,I.M.,等人(1992)"The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about FiftyGroups of VH Segments with Different Hypervariable Loops"J.Mol.Biol.227:776-798；和Cox,J.P.L.等人(1994)"A Directory of Human Germ-line VH Segments Revealsa Strong Bias in their Usage"Eur.J.Immunol.24:827-836；其各自内容通过引用明确地并入本文。
用于本文所述抗体的优选的框架序列是结构上类似于由本文所述的抗体使用的框架序列的那些。VH CDR1、2和3序列以及VL CDR1、2和3序列可以移植至具有与发现于框架序列所来源的种系免疫球蛋白基因中的相同序列的框架区上，或者CDR序列可以移植至相比于种系序列含有最多20个(优选保守的)氨基酸取代的框架区上。例如，已发现在某些情况下，在框架区内突变残基对于维持或增强抗体的抗原结合能力是有利的(参见例如Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
本文所述的工程化的抗体包括其中已对VH和/或VL内的框架残基进行修饰例如以改进抗体特性的那些。通常进行此类框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是“回复突变(backmutate)”一个或多个框架残基至相应的种系序列。更具体而言，已进行体细胞突变的抗体可以含有与抗体所来源的种系序列不同的框架残基。此类残基可以通过将抗体框架序列与抗体所来源的种系序列进行比较来鉴定。为了使框架区返回至其种系构象，可以将体细胞突变“回复突变”至种系序列，例如通过定点诱变或PCR介导的诱变。此类“回复突变的”抗体也旨在被涵盖。
另一类型的框架修饰涉及在框架区内或甚至在一个或多个CDR区内突变一个或多个残基，以去除T细胞表位，由此降低抗体的潜在免疫原性。这种方法也称为“去免疫化(deimmunization)”，且进一步详细描述于Carr等人的美国专利公开号2003/0153043中。
另一类型的可变区修饰是在CDR区内突变氨基酸残基以改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。定点诱变或PCR介导的诱变可以进行以引入突变和对抗体结合的作用或其他目标功能特性。优选地，引入保守修饰。突变可以是氨基酸添加、缺失或优选取代。此外，通常改变CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
抗体的CDR中的甲硫氨酸残基可以被氧化，导致潜在的化学降解和随之抗体效能的降低。因此，还提供抗CD40抗体，其在重链和/或轻链CDR中用不经受氧化降解的氨基酸残基替换一个或多个甲硫氨酸残基。类似地，脱酰胺位点可以从抗CD40抗体尤其是CDR中去除。优选消除抗原结合结构域内的潜在糖基化位点以防止可能干扰抗原结合的糖基化。参见例如美国专利号5,714,350。
靶向的抗原结合
在各种实施方案中，本发明的抗体经修饰以选择性阻断其中抗原结合将是有害的组织和环境中的抗原结合，但允许在抗原结合是有利的情况下的抗原结合。在一个实施方案中，产生阻断肽“掩蔽物(mask)”，其特异性结合抗体的抗原结合表面并且干扰抗原结合，所述掩蔽物通过肽酶可切割的接头与抗体的每一结合臂连接。参见例如CytomX的美国专利号8,518,404。此类构建体可用于治疗癌症，在所述癌症中蛋白酶水平在肿瘤微环境中相比于非肿瘤组织极大增加。肿瘤微环境中可切割接头的选择性切割允许掩蔽/阻断肽的解离，允许选择性地在肿瘤中而非在抗原结合可以引起不想要的副作用的外周组织中的抗原结合。
可选地，在相关的实施方案中，开发包含两个抗原结合结构域的二价结合化合物(“掩蔽配体”)，其结合(二价)抗体的两个抗原结合表面并且干扰抗原结合，其中两个结合结构域掩蔽物通过可切割接头(例如可通过肽酶切割)彼此(但非抗体)连接。参见例如国际专利申请公开号WO 2010/077643(属于Tegopharm Corp)。掩蔽配体可以包含或者来源于抗体旨在结合的抗原，或者可以独立地产生。此类掩蔽配体可用于治疗癌症，在所述癌症中蛋白酶水平在肿瘤微环境中相比于非肿瘤组织极大增加。肿瘤微环境中选择性切割可切割接头允许两个结合结构域彼此解离，降低抗体对抗原结合表面的抗体亲抗原性。掩蔽配体从抗体的该解离允许选择性地在肿瘤中而非在抗原结合可以引起不想要的副作用的外周组织中的抗原结合。
Fc和修饰的Fc
本发明的抗体可以包含本发明的可变结构域与包含不同Fc区的恒定结构域的组合，其基于抗体对于预期用途的生物活性(如有的话)来选择。Salfeld(2007)Nat.Biotechnol.25:1369。人IgG例如可以分为四个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，并且这些中的每一种包含这样的Fc区，所述Fc区具有结合Fcγ受体(活化性受体FcγRI(CD64)、FcγRIIA,FcγRIIC(CD32a,c)；FcγRIIIA和FcγRIIIB(CD16a,b)和抑制性受体FcγRIIB(CD32b)的一种或多种和第一补体组分(C1q)的独特概况。人IgG1和IgG3结合所有Fcγ受体；IgG2结合FcγRIIAH131，和以较低亲和力结合FcγRIIAR131 FcγRIIIAV158；IgG4结合FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC和FcγRIIIAV158；和抑制性受体FcγRIIB比所有其他Fcγ受体具有对于IgG1、IgG2和IgG3的较低的亲和力。Bruhns等人(2009)Blood 113:3716。研究已显示FcγRI不结合IgG2，和FcγRIIIB不结合IgG2或IgG4。同上。通常，关于ADCC活性，人IgG1≧IgG3＞＞IgG4≧IgG2。因此，例如，IgG1恒定区而非IgG2或IgG4，可以被选择用于其中期望ADCC的药物中；如果活化表达FcγRIIIA的NK细胞、单核细胞或巨噬细胞，IgG3可以被选择；和如果将抗体用于将过敏患者脱敏，则可以选择IgG4。如果期望抗体缺乏所有效应子功能，也可以选择IgG4。
本文描述的抗huCD40可变区可以连接(例如共价连接或融合)至Fc，例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc，其可以是例如任何同种异型或异同种异型(isoallotype)，例如，对于IgG1：G1m,G1m1(a),G1m2(x),G1m3(f),G1m17(z)；对于IgG2:G2m,G2m23(n)；对于IgG3:G3m,G3m21(g1),G3m28(g5),G3m11(b0),G3m5(b1),G3m13(b3),G3m14(b4),G3m10(b5),G3m15(s),G3m16(t),G3m6(c3),G3m24(c5),G3m26(u),G3m27(v)。参见例如，Jefferis等人(2009)mAbs 1:1)。同种异型的选择可能受潜在的免疫原性考量的影响，例如，以将抗药物抗体的形成降至最低。
在优选的实施方案中，本发明的抗CD40抗体具有结合FcγRIIb或具有对FcγRIIb结合增强的Fc，其可以提供增强的激动作用。参见例如，WO 2012/087928；Li和Ravetch(2011)Science 333:1030；Wilson等人(2011)Cancer Cell 19:101；White等人(2011)J.Immunol.187:1754。本文所述的可变区可以连接增强对抑制性受体FcyRIIb的亲和力的Fc变体，例如，以增强凋亡诱导或辅助活性。Li和Ravetch(2012)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA109:10966；美国专利申请公开2014/0010812。此类变体可以提供具有关于FcγRIIb+细胞包括例如B细胞和单核细胞的免疫调节活性的抗体。在一个实施方案中，Fc变体提供相对于一种或多种活化性受体的对于FcγRIIb的选择性增强的亲和力。此类变体也可以展示增强的FcR介导的交联，导致增强的治疗效力。改变与FcγRIIb结合的修饰包括在选自根据EU索引的位置234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328和332处的一个或多个修饰。增强FcγRIIb亲和力的示例性取代包括但不限于234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和332E。示例性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W和328Y。增强结合FcγRIIb的其他Fc变体包括235Y-267E、236D-267E、239D-268D、239D-267E、267E-268D、267E-268E和267E-328F。具体而言，人IgG1的S267E、G236D、S239D、L328F和I332E变体包括S267E-L328F双变体在特异性增强对于抑制性FcγRIIb受体的亲和力中特别有价值。Chu等人(2008)Mol.Immunol.45:3926；美国专利申请公开2006/024298；WO 2012/087928。对于FcγRIIb增强的特异性(如与FcγRIIaR131区分)可以通过添加以下来获得：P238D取代和其他突变(Mimoto等人(2013)Protein.Eng.Des.&Selection 26:589；WO 2012/1152410)以及V262E和V264E(Yu等人(2013)J.Am.Chem.Soc.135:9723和WO 2014/184545。参见表4。
半衰期延长
在某些实施方案中，修饰抗体以增加其生物半衰期。多种方法是可以的。例如，这可以通过增加Fc区对FcRn的结合亲和力来完成。在一个实施方案中，在CH1或CL区内改变抗体以包含获自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的挽救受体(salvage receptor)结合表位，如在Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。其他增加对FcRn结合和/或改进药代动力学特性的示例性Fc变体包括在位置259、308和434处的取代，包括例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y和434M。其他增加Fc结合FcRn的变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人(2004)J.Biol.Chem.279(8):6213-6216,Hinton等人(2006)Journal of Immunology 176:346-356)、256A、272A、305A、307A、31 1A、312A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人(2001)Journal of Biological Chemistry276(9):6591-6604)、252F、252Y、252W、254T、256Q、256E、256D、433R、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H(Dall’Acqua等人(2002)Journal of Immunology 169:5171-5180,Dall’Acqua等人(2006)Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)。参见美国专利号8,367,805。
修饰IgG Fc中的某些保守残基(I253、H310、Q311、H433、N434)诸如N434A变体(Yeung等人(2009)J.Immunol.182:7663)已经提出作为增加FcRn亲和力由此增加抗体在循环中的半衰期的方式。参见WO 98/023289。包含M428L和N434S的组合Fc变体已经显示增加FcRn结合并增加血清半衰期最高五倍。Zalevsky等人(2010)Nat.Biotechnol.28:157。包含T307A、E380A和N434A修饰的组合Fc变体也延长IgG1抗体的半衰期。Petkova等人(2006)Int.Immunol.18:1759。此外，包含M252Y-M428L、M428L-N434H、M428L-N434F、M428L-N434Y、M428L-N434A、M428L-N434M和M428L-N434S变体的组合Fc变体也已显示延长半衰期。参见WO2009/086320。
此外，包含M252Y、S254T和T256E的组合Fc变体增加半衰期近四倍。Dall’Acqua等人(2006)J.Biol.Chem.281:23514。提供增加的FcRn亲和力但降低的pH依赖性的相关IgG1修饰(M252Y-S254T-T256E-H433K-N434F)已经用于产生IgG1构建体(“MST-HN Abdeg”)，其用作阻止其他抗体结合FcRn的竞争物，导致其他抗体-内源性IgG(例如在自免疫背景下)或另一外源(治疗性)mAb的清除增加。Vaccaro等人(2005)Nat.Biotechnol.23:1283；WO2006/130834。
增加FcRn结合的其他修饰描述于Yeung等人(2010)J.Immunol.182:7663-7671；6,277,375；6,821,505；WO 97/34631；和WO 2002/060919。
在某些实施方案中，杂种IgG同种型可用于增加FcRn结合，并且潜在地增加半衰期。例如，可以通过用来自IgG3的其中两种同种型不同的位置处的氨基酸取代IgG1的CH2和/或CH3区域中的位置来构建IgG1/IgG3杂种变体。因此，可以构建包含一个或多个取代例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435R和436F的杂种变体IgG抗体。在本文所述的其他实施方案中，可以通过用来自IgG1的其中两种同种型不同的位置处的氨基酸取代IgG2的CH2和/或CH3区域中的位置来构建IgG1/IgG2杂种变体。因此，可以构建包含一个或多个取代、例如以下氨基酸取代中的一个或多个取代的杂种变体IgG抗体：233E、234L、235L、–236G(指在位置236处插入甘氨酸)和327A。参见美国专利号号8,629,113。已经产生据称增加血清半衰期并改进表达的IgG1/IgG2/IgG4序列的杂合体。美国专利号7,867,491(其中序列编号18)。
本发明的抗体的血清半衰期也可以通过PEG化来增加。例如，可以将抗体PEG化以增加抗体的生物(例如血清)半衰期。为了将抗体PEG化，通常将抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)试剂诸如PEG的反应性酯或醛衍生物反应，在其中一个或多个PEG基团与抗体或抗体片段接触的条件下。优选地，经与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)酰化反应或烷基化反应来进行PEG化。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖可用于衍生化其他蛋白的任何形式的PEG，诸如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，待PEG化的抗体是非糖基化(aglycosylated)抗体。用于将蛋白PEG化的方法是本领域已知的且可应用于本文所述的抗体。例如参见Nishimura等人的EP 0154316和Ishikawa等人的EP 0401384。
可选地，在某些情况下，可以期望降低本发明的抗体的半衰期而非增加半衰期。人IgG1的Fc中的修饰诸如I253A(Hornick等人(2000)J.Nucl.Med.41:355)和H435A/R、I253A或H310A(Kim等人(2000)Eur.J.Immunol.29:2819)可以降低FcRn结合，因此降低半衰期(增加清除)，其用于其中优选快速清除的情况(诸如医学成像)。还参见Kenanova等人(2005)Cancer Res.65:622。其他增强清除的方式包括将本发明的抗原结合结构域如缺乏结合FcRn能力的抗体片段如Fab片段进行格式化。此类修饰可以将抗体的循环半衰期从几周减少至几个小时。抗体片段的选择性PEG化可以随后用于精细调节(增加)抗体片段的半衰期(如需要的话)。Chapman等人(1999)Nat.Biotechnol.17:780。抗体片段也可以与人血清白蛋白融合，例如在融合蛋白构建体中，以增加半衰期。Yeh等人(1992)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 89:1904。可选地，双特异性抗体可以用本发明的第一抗原结合结构域和结合人血清白蛋白(HSA)的第二抗原结合结构域来构建。参见国际专利申请公开WO 2009/127691及其中引用的专利文献。可选地，专门的多肽序列可以添加至抗体片段以增加半衰期，例如“XTEN”多肽序列。Schellenberger等人(2009)Nat.Biotechnol.27:1186；国际专利申请公开WO 2010/091122。
额外的Fc变体
当使用IgG4恒定结构域时，通常优选包括取代S228P，其模拟IgG1中的铰链序列并由此稳定IgG4分子，例如降低治疗性抗体和所治疗的患者内的内源性IgG4之间的Fab臂交换。Labrijn等人(2009)Nat.Biotechnol.27:767；Reddy等人(2000)J.Immunol.164:1925。
IgG1构建体的铰链中的潜在蛋白酶切割位点可以通过D221G和K222S修饰来消除，增加抗体的稳定性。WO 2014/043344。
Fc变体对其配体(Fc受体)的亲和力和结合特性可以通过本领域中已知的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来测定，包括但不限于：平衡法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射性免疫测定(RIA))、或动力学(例如
Figure BDA0003868948590000311
SPR分析)，和其他方法诸如间接结合测定、竞争性抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和层析(例如凝胶过滤)。这些和其他方法可以使用所检测的组分中的一种或多种上的标记和/或采用多种检测方法，包括但不限于发色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力和动力学的详述可见于Paul,W.E.,编辑,Fundamental Immunology,第4版,Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)，其关注于抗体-免疫原相互作用。
在仍其他实施方案中，抗体的糖基化经修饰以增加或降低效应子功能。例如，可以制备非糖基化抗体，其通过突变位置297处的保守天冬酰胺残基(例如N297A)因此消除补体和FcγRI结合而缺少所有效应子功能。Bolt等人(1993)Eur.J.Immunol.23:403。还参见Tao和Morrison(1989)J.Immunol.143:2595(使用IgG1中的N297Q以消除位置297处的糖基化)。
尽管非糖基化抗体通常缺乏效应子功能，但可以引入突变以恢复该功能。非糖基化抗体例如从N297A/C/D/或H突变中产生的或者在不糖基化蛋白的系统(例如大肠杆菌)中产生的那些抗体可以进一步突变以恢复FcγR结合，例如S298G和/或T299A/G/或H(WO2009/079242)或E382V和M428I(Jung等人(2010)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 107:604)。
糖工程化也可用于修饰IgG构建体的抗炎特性，其通过改变Fc区的Asn297处连接的碳水化合物链的α2,6唾液酸含量，其中α2,6唾液酸化形式比例增加导致抗炎作用增强。参见Nimmerjahn等人(2008)Ann.Rev.Immunol.26:513。相反，具有α2,6唾液酸化碳水化合物的抗体比例减少可以用于其中不想要抗炎特性的情况中。修饰抗体的α2,6唾液酸含量的方法，例如通过选择性纯化α2,6唾液酸化形式或通过酶促修饰，提供于美国专利申请公开号2008/0206246。在其他实施方案中，Fc区的氨基酸序列可以被修饰以模拟α2,6唾液酸化的效果，例如通过包含F241A修饰。WO 2013/095966。
III.抗体物理特性
本文描述的抗体可以在轻链或重链可变区中包含一个或多个糖基化位点。此类糖基化位点可以导致抗体的免疫原性增加或改变抗体的pK，这是由于抗原结合改变(Marshall等人(1972)Ann.Rev.Biochem.41:673-702；Gala和Morrison(2004)J.Immunol.172:5489-94；Wallick等人(1988)J.Exp.Med.168:1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R；Parekh等人(1985)Nature 316:452-7；Mimura等人(2000)MolImmunol 37:697-706)。已经知晓糖基化在含有N-X-S/T序列的基序处发生。在一些情况下，优选抗huCD40抗体不包含可变区糖基化。这可以通过选择在可变区中不包含糖基化基序的抗体或者通过在糖基化区域内突变残基来实现。
在某些实施方案中，本文所述的抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可以在N-G或D-G序列上发生并且导致产生引入扭结(kink)至多肽链并降低其稳定性(异天冬氨酸作用)的异天冬氨酸残基。
每一抗体将具有独特的等电点(pI)，其一般落入6-9.5的pH范围。IgG1抗体的pI通常落入7-9.5的pH范围并且IgG4抗体的pI通常落入6-8的pH范围。推测具有正常范围之外的pI的抗体可能在体内条件下具有一些解折叠和不稳定性。因此，优选抗CD40抗体包含落入正常范围内的pI值。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变带电荷的表面残基来实现。
每一抗体具有特征性解链温度，且更高的解链温度表明更高的体内总体稳定性(Krishnamurthy和Manning(2002)Curr.Pharm.Biotechnol.3:361-71)。通常，优选TM1(初始解折叠的温度)高于60℃，优选高于65℃，甚至更优选高于70℃。抗体的解链点可以使用差示扫描量热法(Chen等人(2003)Pharm Res 20:1952-60；Ghirlando等人(1999)ImmunolLett.68:47-52)或圆二色性(Murray等人(2002)J.Chromatogr.Sci.40:343-9)来测量。在优选的实施方案中，选择不快速降解的抗体。抗体的降解可以使用毛细管电泳(CE)和MALDI-MS来测量(Alexander和Hughes(1995)Anal Chem.67:3626-32)。
在另一优选的实施方案中，选择具有最小聚集作用的抗体，所述聚集作用可以导致引起不想要的免疫应答和/或改变的或不利的药代动力学特性。通常，具有25％或更低、优选20％或更低、甚至更优选15％或更低、甚至更优选10％或更低和甚至更优选5％或更低的聚集的抗体是可接受的。聚集可以通过若干技术来测量，包括尺寸排阻柱(SEC)、高效液相层析(HPLC)和光散射。
IV.核酸分子
本文所述的另一方面涉及编码本文所述的抗体的核酸分子。核酸可以存在于完整细胞中、细胞裂解物中、或部分纯化或实质上纯化形式中。当通过标准技术包括碱性/SDS处理、CsCl条带、柱层析、限制酶、琼脂糖凝胶电泳和本领域中公知的其他技术将核酸从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸(例如，其他染色体DNA，例如天然连接到分离的DNA上的染色体DNA)或蛋白中纯化出时，所述核酸“被分离”或使所述核酸“实质上纯的”。参见F.Ausubel,等人,编辑(1987)Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing and Wiley Interscience,New York。本文所述的核酸例如可以是DNA或RNA且可以包含或可以不包含内含子序列。在某些实施方案中，核酸是cDNA分子。
本文所述的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如从携带有如下文进一步所述的人免疫球蛋白基因的转基因小鼠中制备的杂交瘤)表达的抗体，编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于获自免疫球蛋白基因文库(例如使用噬菌体展示技术)的抗体，可以从文库中回收编码抗体的核酸。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如，以转变可变区基因为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段可操作地连接至编码另一蛋白的另一DNA片段，诸如抗体恒定区或柔性接头。如本上下文中所用的术语“可操作地连接”旨在意指将两个DNA片段连接，使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持框内(in-frame)。
编码VH区的分离的DNA可以转变为全长重链基因，其通过将编码VH的DNA可操作地连接至编码重链恒定区(铰链、CH1、CH2和/或CH3)的另一DNA分子。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242)并且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，例如，IgG1区。对于Fab片段重链基因，编码VH的DNA可以可操作地连接至仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子。
编码VL区的分离的DNA可以转变为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)，其通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242)并且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段可操作地连接至编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段，使得VH和VL序列可以表达为连续单链蛋白，且VL和VH区由柔性接头连接(参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等人(1990)Nature 348:552-554)。
V.抗体产生
本发明的各种抗体例如与本文公开的抗人CD40抗体竞争或如本文公开的抗人CD40抗体结合相同表位的那些抗体可以使用各种已知技术产生，诸如由Kohler和Milstein,Nature 256:495(1975)所述的标准体细胞杂交技术。尽管优选体细胞杂交程序，但原则上，其他用于产生单克隆抗体的技术也可以采用，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌性转化、使用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。
用于制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。在小鼠中的杂交瘤产生是非常完善的程序。用于分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域中已知的。融合伴侣(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
本文所述的嵌合或人源化抗体可以基于如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以使用标准分子生物学技术获自目标鼠杂交瘤并且经工程化以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域中已知的方法将鼠可变区连接至人恒定区(参见例如Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人框架中(参见例如Winter的美国专利号5,225,539和Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
在一个实施方案中，本文所述的抗体是人单克隆抗体。此类针对人CD40的人单克隆抗体可以使用携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生。这些转基因和转染色体小鼠包括本文分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文中一并称为“人Ig小鼠”。
HuMAb小鼠
Figure BDA0003868948590000351
(Medarex,Inc.)含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因迷你基因座(miniloci)，连同失活内源μ和κ链基因座的靶向突变(参见例如，Lonberg,等人(1994)Nature 368(6474):856-859)。因此，小鼠展示出小鼠IgM或κ的表达降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力的人IgGκ单克隆(Lonberg,N.等人(1994),上文；综述于Lonberg,N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93,和Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。制备和使用HuMab小鼠和通过此类小鼠携带的基因组修饰进一步描述于Taylor,L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等人(1993)International Immunology 5:647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics4:117-123；Chen,J.等人(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等人(1994)International Immunology 6:579-591；和Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851，所有参考文献的内容以其整体通过引用在此具体地并入本文。进一步参见美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；均属于Lonberg和Kay；Surani等人的美国专利号5,545,807；PCT公开号WO 92/03918、WO93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884和WO 99/45962,均属于Lonberg和Kay；和Korman等人的PCT公开号WO 01/14424。/>
在某些实施方案中，本文所述的抗体使用携带转基因和转染色体上的人免疫球蛋白基因的小鼠诸如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠来产生。此类小鼠在本文称为“KM小鼠”，详细描述于Ishida等人的PCT公开WO 02/43478中。
仍进一步，表达人免疫球蛋白基因的可选转基因动物系统是本领域可获得的并且可用于产生本文所述的抗huCD40抗体。例如，可以使用称为
Figure BDA0003868948590000361
(Abgenix,Inc.)的可选转基因系统；此类小鼠描述于例如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963。
此外，表达人免疫球蛋白基因的可选转染色体动物系统是本领域可获得的并且可用于产生本文所述的抗CD40抗体。例如，可以使用称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；此类小鼠描述于Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727。此外，本领域中已经描述了携带人重链和轻链转染色体的牛(Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology 20:889-894)并且其可用于产生本文所述的抗huCD40抗体。
本领域中所述的用于产生人抗体(例如人抗huCD40抗体)的另外的小鼠系统包括：(i)
Figure BDA0003868948590000362
小鼠(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)，其中已经经同源重组用可操作地连接至内源小鼠恒定区的人重链和轻链可变区替代内源小鼠重链和轻链可变区，使得在小鼠中产生嵌合抗体(人V/小鼠C)，并随后使用标准重组DNA技术转换为完全人抗体；和(ii)/>
Figure BDA0003868948590000363
小鼠(Merus Biopharmaceuticals,Inc.)，其中小鼠包含未重排的人重链可变区但单一重排的人共同轻链可变区。此类小鼠及其产生抗体的用途描述于例如WO 2009/15777、US 2010/0069614、WO 2011/072204、WO 2011/097603、WO 2011/163311、WO 2011/163314、WO 2012/148873、US 2012/0070861和US 2012/0073004。
本文所述的人单克隆抗体还可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。用于分离人抗体的此类噬菌体展示方法在本领域中已建立。参见例如：Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
本文所述的人单克隆抗体也可以使用SCID小鼠来制备，已经将人免疫细胞重构入所述SCID小鼠，使得免疫后可以产生人抗体应答。此类小鼠描述于例如Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767中。
免疫
为了产生针对人CD40的完全人抗体，含有人免疫球蛋白基因的小鼠或转基因小鼠或转染色体小鼠(例如HCo12、HCo7或KM小鼠)可以用纯化的或富集的CD40抗原制备物和/或表达CD40的细胞免疫，如例如通过以下对于其他抗原所述的：Lonberg等人(1994)Nature368(6474):856-859；Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851和WO98/24884。可选地，可以用编码人CD40的DNA免疫小鼠。优选地，小鼠将在第一次输注时为6-16周龄。例如，重组人CD40抗原的纯化的或富集的制备物(5-50μg)可用于腹膜内免疫小鼠。在使用纯化的或富集的CD40抗原制备物免疫不产生抗体的情况中，还可以用表达CD40的细胞例如细胞系免疫小鼠以促进免疫应答。
用各种抗原的经验累积已显示用在Ribi氏佐剂中的抗原腹膜内(IP)或皮下(SC)初始免疫随后每隔一周用Ribi氏佐剂中的抗原IP/SC免疫(最高至总共10次)时，HuMAb转基因小鼠应答最好。免疫应答可以随免疫方案过程用通过框后出血获得的血浆样品来监测。血浆可以通过ELISA和FACS(如下文所述)来筛选并且具有抗CD40人免疫球蛋白的足够滴度的小鼠可用于融合。可以在处死并移除脾和淋巴结前3天用抗原静脉内对小鼠加强。预期对于每一免疫可能需要进行2-3次融合。对于每一抗原通常免疫6-24只小鼠。通常，使用HCo7、HCo12和KM品系。此外，HCo7和HCo12转基因可以一同繁殖为具有两种不同人重链转基因(HCo7/HCo12)的单一小鼠。
生产针对CD40的单克隆抗体的杂交瘤的产生
为了产生生产本文所述的单克隆抗体的杂交瘤，可以从经免疫的小鼠分离脾细胞和/或淋巴结细胞并融合至合适的无限增殖化细胞系，诸如小鼠骨髓瘤细胞系。所得的杂交瘤可以筛选抗原特异性抗体的产生。例如，来自经免疫的小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液可以用50％PEG融合至Sp2/0非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC,CRL 1581)。将细胞以大约2x105铺板于平底微量滴定板，随后在选择性培养基中孵育两周，所述选择性培养基包含10％胎儿克隆血清、18％"653"条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1X HAT(Sigma)。大约两周后，在其中用HT替换HAT的培养基中培养细胞。各个孔可以随后通过用于人单克隆IgM和IgG抗体的ELISA来筛选。一旦出现大量杂交瘤生长，通常在10-14天后可以观察培养基。将分泌抗体的杂交瘤再铺板，再次筛选，并且如果仍对于人IgG为阳性，则可以通过有限稀释将单克隆抗体亚克隆至少两次。稳定的亚克隆可以随后体外培养以在组织培养基中产生少量的抗体用于表征。
VI.抗体制备
生产针对CD40的单克隆抗体的转染瘤的产生
本发明的抗体包括提供其序列的特异性抗体和其他相关的抗CD40抗体可以使用例如本领域中众所周知的重组DNA技术和基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生(Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。
例如，为了表达抗体或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如，使用表达目标抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可以将DNA插入表达载体中，从而将基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。在本上下文中，术语“可操作地连接”旨在意指将抗体基因连接入载体内使得载体内的转录和翻译控制序列行使其调节转录和翻译抗体基因的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以与所用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入单独的载体或者将两个基因插入同一表达载体。通过标准方法(例如，抗体基因片段和载体上的互补性限制位点连接或平端连接(如果不存在限制性位点的话))将抗体基因插入表达载体中。本文所述的抗体的轻链和重链可变区可用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因，其通过将它们插入已经编码期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体内，使得VH区段可操作地连接至载体内的CH区段并且VL区段可操作地连接至载体内的CL区段。另外地或可选地，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆入载体中，使得信号肽框内连接至抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因外，重组表达载体可以携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”旨在包括控制抗体链基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。此类调节序列例如描述于Goeddel(GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))。本领域技术人员将理解设计表达载体包括选择调节序列可以依赖于作为待转化的宿主细胞的选择、期望蛋白的表达水平等的此类因素。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括指导哺乳动物细胞中高水平蛋白表达的病毒元件，诸如衍生自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒)的启动子和/或增强子。可选地，可以使用非病毒调节序列，诸如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。还进一步，调节元件由来自不同来源的序列构成，诸如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病病毒1型的长末端重复(Takebe,Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol.8:466-472)。
除了抗体链基因和调节序列，重组表达载体可以携带额外序列，诸如调节载体在宿主细胞中复制(例如复制起点)和可选标记基因的序列。可选标记基因促进选择其中已引入载体的宿主细胞(参见例如美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017，均属于Axel等人)。例如，通常可选标记基因赋予其中已引入载体的宿主细胞对药物诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的可选标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于用甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(待用于G418选择)。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染入宿主细胞。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞的各种各样的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。尽管理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本文所述的抗体，但在真核细胞且最优选在哺乳动物宿主细胞中表达抗体是最优选的，因为此类真核细胞特别是哺乳动物细胞比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠且免疫学有活性的抗体。已报道抗体基因的原核表达无法有效产生高产量的活性抗体(Boss,M.A.和Wood,C.R.(1985)Immunology Today 6:12-13)。本发明的抗体也可以在酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的糖工程化菌株中产生。Li等人(2006)Nat.Biotechnol.24:210。
用于表达本文所述的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，其描述于Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220，使用时具有DHRF可选标记，例如如描述于R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。具体地，与NSO骨髓瘤细胞使用，另一优选的表达系统是描述于WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体进入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以允许抗体在宿主细胞中表达或更优选地分泌抗体至宿主细胞生长的培养基中的时期来产生抗体。抗体可以使用标准蛋白纯化方法从培养基中回收。
本发明的抗体多肽链的N末端和C末端可以由于通常观察到的翻译后修饰而与预期序列不同。例如，C末端赖氨酸残基通常从抗体重链中缺失。Dick等人(2008)Biotechnol.Bioeng.100:1132。N末端谷氨酰胺残基且在更小程度上谷氨酸残基经常在治疗性抗体的轻链和重链上转变为焦谷氨酸残基。Dick等人(2007)Biotechnol.Bioeng.97:544；Liu等人(2011)J.Biol.Chem.286:11211。
本发明的各种激动性抗huCD40抗体的氨基酸序列提供于序列表中，其概述于表8中。对于上述原因，C末端赖氨酸不包括在序列表中重链或重链恒定结构域的任何序列中。然而，在可选的实施方案中，本发明的抗huCD40抗体的每一重链和/或编码此类抗体或其重链或轻链的遗传构建体包括一个或两个重链的C末端处的该额外赖氨酸残基。
VII.测定
本文所述的抗体可以例如通过标准ELISA测试与CD40的结合。简言之，将微量滴定板用PBS中1-2μg/ml的经纯化的CD40包被，并随后用PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。将抗体稀释液(例如，来自CD40免疫小鼠的血浆稀释液)添加至每一孔并在37℃下孵育1-2小时。将板用PBS/Tween洗涤并随后与缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的二级试剂(例如，对于人抗体，或另外具有人重链恒定区的抗体而言，山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)在37℃下孵育1小时。洗涤后，将板用ABTS底物(Moss Inc,产品:ABTS-1000)显色并通过分光光度计在OD415-495分析。来自经免疫小鼠的血清随后进一步通过流式细胞术筛选与表达人CD40的细胞系但不与不表达CD40的对照细胞系的结合。简言之，抗CD40抗体的结合通过将表达CD40的CHO细胞与以1：20稀释的抗CD40抗体孵育来评估。将细胞洗涤并用PE标记的抗人IgG Ab检测结合。使用FACScan流式细胞术进行流式细胞术分析(Becton Dickinson,San Jose,CA)。优选地，将发生最高滴度的小鼠用于融合。类似实验可以使用抗小鼠检测抗体来进行，如果将检测小鼠抗huCD40抗体。
上文所述的ELISA可用于筛选抗体并且因此筛选产生显示与CD40免疫原的阳性反应性的抗体的杂交瘤。产生(优选以高亲和力)结合CD40的抗体的杂交瘤可随后进行亚克隆并进一步表征。来自每一杂交瘤的一个克隆(其保留亲代细胞的反应性(通过ELISA))可以选择用于产生细胞库和抗体纯化。
为了纯化抗CD40抗体，所选的杂交瘤可以在两升旋转瓶(spinner-flask)中生长用于单克隆抗体纯化。可以将上清液过滤并浓缩，随后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia,Piscataway,NJ)亲和层析。洗脱的IgG可以通过凝胶电泳和高效液相层析检查以确保纯度。可以将缓冲液交换至PBS并可以使用1.43消光系数通过OD280测定浓度。可以将单克隆抗体进行等分并存储于-80℃。
为了确定所选的抗CD40单克隆抗体是否结合独特表位，可以将每一抗体使用可商购试剂(Pierce,Rockford,IL)进行生物素化。生物素化的MAb结合可以用链霉抗生物素标记的探针检测。使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究可以使用如上所述的CD40包被的ELISA板进行。
为了确定纯化抗体的同种型，可以使用对于特定同种型的抗体特异性的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，可以将微量滴定板的孔用1μg/ml的抗人免疫球蛋白在4℃包被过夜。用1％BSA封闭后，将板与1μg/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在室温下反应1至2小时。孔随后可以与人IgG1或人IgM特异性的碱性磷酸酶缀合的探针反应。将板显色并如上所述分析。
为了测试单克隆抗体与表达CD40的活细胞的结合，可以使用流式细胞术。简言之，将表达膜结合的CD40的细胞系(在标准生长条件下生长)与各种浓度的在含0.1％BSA的PBS中的单克隆抗体在4℃下混合1小时。洗涤后，将细胞与藻红蛋白(PE)标记的抗IgG抗体在如一级抗体染色的相同条件下反应。样品可以通过FACScan仪器使用光和侧散射性质分析以门控单细胞，并且测定经标记抗体的结合。(除了流式细胞术测定之外，或代替流式细胞术)使用荧光显微术的可选测定可以使用。细胞可如上所述准确染色并通过荧光显微术来检查。该方法允许个别细胞的显色，但取决于抗原密度，可以具有减少的灵敏度。
抗huCD40抗体可以进一步通过蛋白质印迹测试与CD40抗原的反应性。简言之，来自表达CD40的细胞的细胞提取物可以制备并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移至硝酸纤维素膜，用20％小鼠血清封闭，并用待测试的单克隆抗体探测。IgG结合可以使用抗IgG碱性磷酸酶检测并且用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO)来显色。
用于分析各种抗CD40抗体的结合亲和力、交叉反应性和结合动力学的方法包括本领域已知的标准测定，例如，生物层干涉法(BLIA)分析和
Figure BDA0003868948590000411
表面等离子共振(SPR)分析(其使用/>
Figure BDA0003868948590000412
2000SPR仪器(Biacore AB,Uppsala,Sweden))。
在一个实施方案中，抗体特异性结合人CD40的胞外区。抗体可以特异性结合CD40的胞外结构域内的特定结构域(例如，功能结构域)。在某些实施方案中，抗体特异性结合人CD40的胞外区和食蟹猴CD40的胞外区。优选地，抗体以高亲和力结合人CD40。
VIII.双特异性分子
本文所述的抗体可以用于形成双特异性分子。抗CD40抗体或其抗原结合片段可以衍生化或连接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白(例如另一抗体或受体的配体)以产生结合至少两个不同结合位点或靶分子的双特异性分子。本文所述的抗体可以实际上衍生化或连接至多于一种其他功能分子以产生结合多于两种不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；此类多特异性分子也旨在被如本文所用的术语“双特异性分子”所涵盖。为了产生本文所述的双特异性分子，本文所述的抗体可以功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价连接或其他方式)至一种或多种其他结合分子，诸如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，从而产生双特异性分子。
因此，本文提供包含至少对于CD40的第一结合特异性和对于第二靶表位的第二结合特异性的双特异性分子。在其中双特异性分子是多特异性的本文所述的一个实施方案中，分子可以进一步包含第三结合特异性。
在一个实施方案中，本文所述的双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段作为结合特异性，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv。抗体还可以是轻链或重链二聚体或其任何最小片段，诸如Fv或单链构建体，如描述于Ladner等人美国专利号4,946,778，其内容通过引用明确并入。
尽管优选人单克隆抗体，但可用于本文所述的双特异性分子的其他抗体是鼠、嵌合和人源化单克隆抗体。
本文所述的双特异性抗体可以通过使用本领域已知的方法缀合成分结合特异性来制备。例如，双特异性分子的每一结合特异性可以单独产生并随后彼此缀合。当结合特异性为蛋白或肽时，多种偶联或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见例如Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括描述于以下中的那些：Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78,118-132；Brennan等人(1985)Science 229:81-83)和Glennie等人(1987)J.Immunol.139:2367-2375)。优选的缀合剂为SATA和磺基-SMCC，均可得自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)。
当结合特异性为抗体时，它们经两条重链的C末端铰链区的巯基键合进行缀合。在特别优选的实施方案中，铰链区经修饰以在缀合前包含奇数数目的巯基残基，优选一个。
可选地，两种结合特异性可以在相同的载体中编码并且在相同的宿主细胞中表达并装配。该方法尤其可用于双特异性分子为mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab')2或配体xFab融合蛋白的情况。本文所述的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子或包含两种结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203；5,455,030；4,881,175；5,132,405；5,091,513；5,476,786；5,013,653；5,258,498；和5,482,858。
双特异性分子与其特定靶标的结合可以使用本领域公认的方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定来验证。这些测定的每一种通常通过采用对于目标复合物特异性的经标记的试剂(例如抗体)来检测特定目标蛋白-抗体复合物的存在。
IX.组合物
进一步提供组合物，例如药物组合物，其包含连同药学上可接受的载体一起配制的一种或多种如本文所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段。此类组合物可以包含一种或(例如两种或多种不同)抗体或免疫缀合物或本文所述的双特异性分子的组合。例如，本文所述的药物组合物可以包含结合靶抗原上的不同表位或者具有互补活性的抗体(或免疫缀合物或双特异性分子)的组合。
在某些实施方案中，组合物包含抗CD40抗体，浓度为至少1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml，或为1-300mg/ml或100-300mg/ml。
本文所述的药物组合物还可以以组合疗法例如与其他药剂组合施用。例如，组合疗法可以包括组合有至少一种其他抗癌剂和/或T细胞刺激(例如活化)剂的本文所述的抗CD40抗体。可用于组合疗法中的治疗剂的实例更详细地描述于下文关于使用本文所述抗体的部分中。
在一些实施方案中，本文公开的治疗组合物可以包括用于治疗癌症的其他化合物、药物和/或药剂。此类化合物、药物和/或药剂可以包括例如化疗药物、小分子药物或刺激对给定癌症的免疫应答的抗体。在一些情况下，治疗组合物可以包括例如以下中的一种或多种：抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40(也称为CD134、TNFRSF4、ACT35和/或TXGP1L)抗体、抗LAG-3抗体、抗CD73抗体、抗CD137抗体、抗CD27抗体、抗CSF-1R抗体、TLR激动剂、或IDO或TGFβ的小分子拮抗剂。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，其是生理学上可接受的。优选地，载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊椎或表皮施用(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，活性化合物即抗体、免疫缀合物或双特异性分子可以包被在材料中以保护所述化合物免于酸和其他可能失活化合物的天然条件的作用。
本文所述的药物化合物可以包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”指保留母体化合物的期望的生物活性且不产生任何不想要的毒性作用的盐(参见例如Berge,S.M.,等人(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等的酸加成盐以及衍生自无毒有机酸诸如脂族一元和二元羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族磺酸和芳族磺酸等的酸加成盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属诸如钠、钾、镁、钙等的碱加成盐以及衍生自无毒有机胺诸如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的碱加成盐。
本文所述的药物组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
可用于本文所述的药物组合物的合适的含水和非含水载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油诸如橄榄油和可注射有机酯诸如油酸乙酯。可以例如通过使用涂覆材料诸如卵磷脂，通过在分散剂的情况下维持期望的颗粒大小和通过使用表面活性剂，维持适当的流动性。
这些组合物还可以包含辅助剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止存在微生物可以通过灭菌程序(上文)和通过包括多种抗细菌剂和抗真菌剂来确保，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。还可以期望包括等渗剂例如，糖、氯化钠等在组合物中。此外，可注射的药物形式延长的吸收可以通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。使用此类介质和试剂用于药学上有活性的物质是本领域已知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂范围之外，其在本文所述的药物组合物中的使用均被考虑。还可以将补充的活性化合物掺入组合物中。
治疗组合物通常必须是无菌的且在制造和储存的条件下是稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其合适的混合物。可以例如通过使用涂料诸如卵磷脂，通过在分散的情况下维持期望的颗粒大小和通过使用表面活性剂，维持适当的流动性。
无菌的可注射溶液可以通过将活性化合物以需要的量掺入具有一种上文列举的成分或其组合的合适的溶剂中(如需要，随后为灭菌微滤)来制备。通常，分散剂通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备，所述无菌的媒介物含有基础分散介质和上文列出的那些中的需要的其他成分。在用于制备无菌的可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从其之前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何另外的期望的成分的粉末。
可与载体物质组合以产生单一剂型的活性组分的量将取决于所治疗主体和具体施用模式而不同。可与载体物质组合以产生单一剂型的活性组分的量将通常为产生治疗效果的组合物的那种量。通常，以百分之百计，这一量范围将为活性组分的约0.01％至约99％，优选约0.1％至约70％，最优选活性组分与药学上可接受的载体的组合的约1％至约30％。
给药方案进行调整以提供最佳的期望应答(例如，治疗性应答)。例如，单次大剂量(bolus)可以施用，几次分开的剂量可以随时间施用，或者剂量可以随治疗情形的紧急情况所示而按比例降低或增加。为了容易施用和剂量的一致性，尤其有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物。如本文所用的剂量单位形式指适合作为用于待治疗的主体的单一剂量的物理上分离的单位(physically discrete units)；每一单位含有经计算产生期望的治疗效果的预定量的活性化合物和必需的药物载体。对本文所述的剂量单位形式的规格由(a)活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗效果以及(b)在调配此类用于治疗个体中敏感性的活性化合物的领域中固有的限制所指明且直接取决于它们。
对于施用抗体，剂量范围为约0.0001-100mg/kg，且更通常0.01-5mg/ml的宿主体重。例如，剂量可以为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案包括每周施用一次、每两周施用一次、每三周施用一次、每四周施用一次、每月一次、每3个月一次或每3-6个月一次。
在一些方法中，具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体同时施用，在这种情况下施用的每一抗体的剂量落入所示范围内。治疗性抗体通常在多次时机施用。单一剂量之间的间隔例如可以是每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以如测量患者中抗体对靶抗原的血液水平所示是不规律的。在一些方法中，调节剂量以实现约1-1000μg/ml且在一些方法中约25-300μg/ml的血浆抗体浓度。
抗体可以作为缓释制剂施用，在这种情况下需要较低频率施用。剂量和频率取决于抗体在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体显示最长的半衰期，随后为人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。施用的剂量和频率可以取决于治疗为预防性或治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时期以相对较少的间隔施用相对低剂量。一些患者持续接受治疗，持续其一生。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔的相对高剂量，直至疾病进展减轻或终止，并且优选直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。随后，患者可以任选施用预防性方案，尽管在许多免疫肿瘤学适应症中持续治疗不是必需的。
本文所述的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变，从而获得这样的活性成分的量，其有效地实现对特定患者、组合物和施用模式而言的期望的治疗应答，而无对患者的毒性。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用的本文所述的具体组合物的活性、其酯、盐或酰胺、施用途径、施用时间、所用的具体化合物的排泄速率、治疗持续时间、其他药物、与所用的具体化合物组合使用的化合物和/或材料，被治疗的患者的年龄、性别、体重、病况和一般健康和早期医疗史，和医疗领域熟知的其他因素。
本文所述的抗CD40抗体的“治疗有效剂量”优选导致疾病症状降低、无疾病症状时期的频率和持续时间增加或防止由于疾病折磨所致的伤残或残疾。在癌症的背景中，治疗有效量优选防止与癌症相关的身体症状的进一步恶化。癌症症状在本领域中是众所周知的，并且包括例如不正常的痣特征，包括不对称性、边界、颜色和/或直径在内的痣外观的改变，新染色的皮肤区域、异常的痣、指甲下的变黑区域、乳房肿块、乳头变化、乳房囊肿、乳房疼痛、死亡、体重减轻、无力、过度疲劳、进食困难、食欲不振、慢性咳嗽、呼吸困难加重、咳血、尿血、便血、恶心、呕吐、肝转移、肺转移、骨转移、腹部饱胀感、腹胀、腹腔积液、阴道出血、便秘、腹部膨大、结肠穿孔、急性腹膜炎(感染、发热、疼痛)、疼痛、吐血、大量出汗、发热、高血压、贫血、腹泻、黄疸、头晕、寒战、肌肉痉挛、结肠转移、肺转移、膀胱转移、肝转移、骨转移、肾转移和胰腺转移、吞咽困难等。治疗效力可以在第一次施用本发明的激动性抗huCD40mAb后可以立即观察到，或者其可以仅在一定时期和/或一系列剂量后观察到。此类延迟的效力可以仅在几个月治疗(最多6、9或12个月)后观察到。关键是不要根据一些免疫肿瘤学药剂展示的效力延迟而过早地决定本发明的激动性抗huCD40mAb缺乏治疗效力。
治疗有效剂量可以防止或延迟癌症发生，诸如可以在出现疾病的早期或初步体征时需要。诊断癌症中利用的实验室测试包括化学(包括测量可溶性CD40或CD40L水平)(Hock等人(2006)Cancer 106:2148；Chung和Lim(2014)J.Trans.Med.12:102)、血液学、血清学和放射学。因此，监测前述任一者的任何临床或生物化学测定可以用于确定特定治疗是否是治疗癌症的治疗有效剂量。本领域普通技术人员将能够基于因素诸如主体大小、主体症状的严重程度和具体组合物或所选施用途径来确定此类量。
本文所述的组合物可以使用本领域已知的多种方法的一种或多种经一种或多种施用途径来施用。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或模式将根据期望的结果而不同。用于本文所述的抗体的优选施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊椎或其他肠胃外施用途径，例如，通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除肠内和局部施用外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、和胸骨内注射和输注。
可选地，本文所述的抗体可以经非肠胃外途径施用，诸如施用的局部、表皮或粘膜途径，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部地。
活性化合物可以与载体来制备，所述载体将保护化合物免于快速释放，诸如受控释放制剂，包括植入物、透皮贴剂和微囊化的递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、和聚乳酸。许多用于此类制剂制备的方法是获专利的或本领域技术人员通常已知的。参见例如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,编辑,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
治疗组合物可以用本领域已知的医疗装置施用。例如，在优选的实施方案中，本文所述的治疗组合物可以用无针皮下注射装置施用，诸如公开于以下中的装置：美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556。与本文所述的抗huCD40抗体使用的众所周知的植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开以控制速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利号4,486,194，其公开用于经皮肤施用药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开以精确输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开用于持续药物递送的变速流可植入输注设备；美国专利号4,439,196，其公开具有多室隔室的渗透药物递送系统；和美国专利号4,475,196，其公开渗透药物递送系统。这些专利通过引用并入本文。许多其他此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，本文所述的抗huCD40抗体可以配制以确保体内合适分配。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高亲水性化合物。为了确保本文所述的治疗化合物穿过BBB(如需要的话)，它们可以例如配制在脂质体中。对于制备脂质体的方法，参见例如美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以包含选择性转运入特定细胞或器官因而增强靶向药物递送的一种或多种部分(参见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233:134)；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
X.用途和方法
本文所述的抗体、抗体组合物和方法具有大量涉及例如通过影响(agonizing)CD40信号传递增强免疫应答的体外和体内应用。在优选的实施方案中，本文所述的抗体是人或人源化抗体。例如，本文所述的抗huCD40抗体可以体外或离体施用于培养中的细胞，或者施用于人主体(例如体内)以增强多种疾病中的免疫。因此，本文提供改变主体中的免疫应答的方法，其包括向主体施用本文所述的抗体或其抗原结合片段，使得主体中的免疫应答增强、刺激或上调。
优选的主体包括人患者，在所述人患者中增强免疫应答将是期望的。方法特别适合于治疗具有这样的病症的人患者，所述病症可以通过增加免疫应答(例如，T细胞介导的免疫应答)来治疗。在具体的实施方案中，方法特别适合于体内治疗癌症。为了实现抗原特异性免疫增强，本文所述的抗huCD40抗体可以与目标抗原一同施用，或者抗原可以已经存在于待治疗的主体(例如，携带肿瘤或携带病毒的主体)中。当针对CD40的抗体与另一药剂一同施用时，这两者可以分开或同时施用。
还涵盖的是用于检测样品中存在人CD40抗原或测量人CD40抗原的量的方法，其包括在允许所述抗体或其片段与人CD40之间形成复合物的条件下，将样品和对照样品与特异性结合人CD40的人单克隆抗体或其抗原结合片段接触。随后检测复合物的形成，其中样品相比于对照样品之间复合物形成差别表明样品中存在人CD40抗原。此外，本文所述的抗CD40抗体可以用于经免疫亲和纯化来纯化人CD40。
考虑到本文所述的抗huCD40抗体增强T细胞应答例如抗原特异性T细胞应答的共刺激的能力，本文提供使用本文所述的抗体刺激、增强或上调抗原特异性T细胞应答例如抗肿瘤T细胞应答的体外和体内方法。CD4+和CD8+T细胞应答可以使用抗CD40抗体增强。T细胞可以是Teff细胞，例如CD4+Teff细胞、CD8+Teff细胞、T辅助(Th)细胞和T毒性(Tc)细胞。
进一步涵盖增强主体中免疫应答(例如抗原特异性T细胞应答)的方法，其包括向主体施用本文所述的抗huCD40抗体，使得主体中的免疫应答(例如抗原特异性T细胞应答)得到增强。在优选的实施方案中，主体为携带肿瘤的主体并且针对肿瘤的免疫应答得到增强。肿瘤可以是实体瘤或液体瘤，例如恶性血液肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是免疫原性肿瘤。在某些实施方案中，肿瘤是非免疫原性的。在某些实施方案中，肿瘤是PD-L1阳性的。在某些实施方案中，肿瘤是PD-L1阴性的。主体还可以是携带病毒的主体并且针对病毒的免疫应答得到增强。
进一步提供用于抑制主体中的肿瘤细胞生长的方法，其包括向主体施用本文所述的抗huCD40抗体，使得主体中肿瘤生长得到抑制。还提供用于治疗主体中的慢性病毒感染的方法，其包括向主体施用本文所述的抗huCD40抗体，使得主体中的慢性病毒感染得到治疗。
在某些实施方案中，将抗huCD40抗体作为辅助疗法给予主体。用抗huCD40抗体治疗具有癌症的主体可以导致相对于目前护理标准的长期持久的应答；至少1、2、3、4、5、10或更多年的长期存活、至少1、2、3、4、5或10或更多年的无复发存活。在某些实施方案中，用抗huCD40抗体治疗具有癌症的主体防止癌症复发或延迟癌症复发例如1、2、3、4、5、或10或更多年。抗CD40治疗可用作一线或二线治疗。
这些和其他本文所述的方法在下文进一步详细讨论。
癌症
本文提供治疗具有癌症的主体的方法，其包括向主体施用本文所述的抗huCD40抗体，使得主体得到治疗，例如，使得癌性肿瘤的生长受到抑制或降低和/或肿瘤退化。抗huCD40抗体可以单独使用以抑制癌性肿瘤的生长。可选地，抗huCD40抗体可以与另一药剂联合使用，例如，其他免疫原性剂、标准癌症治疗或其他抗体，如下文所述。还提供与PD-1的抑制剂诸如抗PD-1或抗PD-L1抗体的组合。参见例如Ellmark等人(2015)OncoImmunology4:7e1011484。
因此，本文提供例如通过抑制肿瘤细胞生长来治疗主体中的癌症的方法，其包括向主体施用治疗有效量的本文所述的抗huCD40抗体，例如12D6、5F11、8E8、5G7或19G3的人源化形式，或其抗原结合片段。抗体可以是人源化抗huCD40抗体(诸如本文所述的任何人源化抗huCD40抗体)、人嵌合抗huCD40抗体、或人源化非人抗huCD40抗体，例如与本文具体所述的抗huCD40抗体的至少一种竞争结合相同表位或结合相同表位的人、嵌合或人源化抗huCD40抗体。
使用本发明的抗体可以抑制其生长的癌症包括通常响应于免疫治疗的癌症。用于治疗的癌症的非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非NSCLC、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌(例如透明细胞癌)、卵巢癌、肝癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌(例如肾细胞癌(RCC))、前列腺癌(例如激素难治性前列腺癌)、甲状腺癌、成神经细胞瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤(多形性成胶质细胞瘤)、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和头颈癌(或恶性肿瘤)、胃癌、生殖细胞肿瘤、小儿肉瘤、鼻窦天然杀伤细胞、黑素瘤(例如转移性恶性黑色素瘤、如皮肤或眼内恶性黑素瘤)、骨癌、皮肤癌、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤(spinalaxis tumor)、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症包括由石棉诱导的那些、病毒相关癌症(例如、人乳头瘤病毒(HPV)相关肿瘤)、和源自两种主要血细胞谱系即骨髓细胞系(其产生粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞)或淋巴细胞系(其产生B、T、NK和浆细胞)中的任一种的血液恶性肿瘤、诸如所有类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤、例如急性、慢性、淋巴细胞和/骨髓性白血病，诸如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和慢性骨髓性白血病(CML)、未分化的AML(M0)、成髓细胞性白血病(M1)、成髓细胞性白血病(M2；具有细胞成熟)、前髓细胞性白血病(M3或M3变体[M3V])、骨髓单核细胞白血病(M4或具有嗜酸性粒细胞增多的M4变体[M4E])、单核细胞白血病(M5)、红白血病(M6)、巨核细胞白血病(M7)、分离的粒细胞肉瘤和绿色瘤；淋巴瘤如霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、间变性(例如Ki 1+)大细胞淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤/白血病、套细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、肠T细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、前体T淋巴母细胞性淋巴瘤、T-淋巴母细胞；和淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、外周T细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤、移植后淋巴增生性障碍、真性组织细胞性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴母细胞性淋巴瘤(LBL)、淋巴谱系的血液肿瘤、急性成淋巴细胞性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性组织细胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞性淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTLC)(也称为蕈样霉菌病或塞扎里综合征)和具有华氏巨球蛋白血症的淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，例如IgG骨髓瘤、轻链骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(也称为惰性骨髓瘤)、孤立性浆细胞瘤和多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞淋巴瘤；骨髓谱系的造血肿瘤、间充质来源的肿瘤包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；精原细胞瘤、畸胎癌、中枢和外周神经肿瘤包括星形细胞瘤、神经鞘瘤；间充质来源的肿瘤包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其他肿瘤包括黑素瘤、色素性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌、淋巴谱系造血肿瘤例如T细胞和B细胞肿瘤，包括但不限于T细胞病症诸如T幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、包括小细胞和脑形细胞型；大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)、优选T细胞型；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；外周/胸腺后T细胞淋巴瘤(多形性和免疫母细胞性亚型)；血管中心性(鼻)T细胞淋巴瘤；头颈癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌；急性骨髓性淋巴瘤、以及所述癌症的任何组合。本文所述的方法也可以用于治疗转移性癌症、难治性癌症(例如，对于之前免疫疗法例如用阻断性CTLA-4或PD-1抗体难治的癌症)和复发性癌症。
尽管如上所述，本发明的激动性抗huCD40抗体将不会用于治疗具有CD40表达的血液癌症，其可能被用CD40激动剂治疗而恶化。某些癌症可能已知表达CD40并且因此经历此类恶化，因此可以类别上被排除。在其他实施方案中，测试特异性肿瘤样品的CD40表达并且基于测试结果从用本发明的激动性抗huCD40抗体的疗法中排除。
抗huCD40抗体可以作为单一疗法施用，或者作为仅免疫刺激疗法施用，或者其可以与免疫原性剂在癌症疫苗策略中组合，诸如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化物分子)、细胞和转染有编码免疫刺激细胞因子的基因的细胞(He等人(2004)J.Immunol.173:4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，诸如gp100的肽、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶、或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞。已经设计许多针对肿瘤接种的实验策略(参见Rosenberg,S.,2000,Developmentof Cancer Vaccines,ASCO Educational Book Spring:60-62；Logothetis,C.,2000,ASCOEducational Book Spring:300-302；Khayat,D.2000,ASCO Educational Book Spring:414-428；Foon,K.2000,ASCO Educational Book Spring:730-738；还参见Restifo,N.和Sznol,M.,Cancer Vaccines,Ch.61,第3023-3043页，于DeVita等人(编辑),1997,Cancer:Principles and Practice of Oncology,第五版)。在这些策略之一中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。这些细胞疫苗已显示当肿瘤细胞转导以表达GM-CSF时最有效。GM-CSF已显示为用于肿瘤接种的抗原呈递的有效激活物。Dranoff等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3539-43。
在各种肿瘤中基因表达和大规模基因表达模式的研究已导致定义所谓的肿瘤特异性抗原。Rosenberg,S A(1999)Immunity 10:281-7。在许多情况下，这些肿瘤特异性抗原是表达于肿瘤中和肿瘤产生的细胞中的分化抗原，例如黑素细胞gp100、MAGE抗原和Trp-2。更重要的是，许多这些抗原可以显示为宿主中发现的肿瘤特异性T细胞的靶标。CD40激动剂可以与许多表达于肿瘤中的重组蛋白和/或肽联合使用，以产生针对这些蛋白的免疫应答。这些蛋白通常被免疫系统视为自体抗原，因而对其耐受。肿瘤抗原可以包括蛋白端粒酶，其对于染色体端粒合成是必需的并且表达于超过85％的人癌症中和仅有限数目的体细胞组织中(Kim等人(1994)Science 266:2011-2013)。肿瘤抗原也可以是由于改变蛋白序列或产生不相关序列之间的融合蛋白(即费城染色体中的bcr-abl)的体细胞突变而表达于癌细胞中的“新抗原(neo-antigen)”或来自B细胞肿瘤的独特型。
其他肿瘤疫苗可以包括来自涉及人癌症中的病毒的蛋白，诸如人类乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV和HCV)和卡波西氏疱疹肉瘤病毒(KHSV)。可以与CD40抑制联合使用的另一形式的肿瘤特异性抗原是分离自肿瘤组织自身的纯化的热休克蛋白(HSP)。这些热休克蛋白包含来自肿瘤细胞的蛋白的片段并且这些HSP在递送至抗原呈递细胞以引起肿瘤免疫中是高度有效的(Suot和Srivastava(1995)Science 269:1585-1588；Tamura等人(1997)Science 278:117-120)。
树突细胞(DC)是可用于引发抗原特异性应答的有效抗原呈递细胞。DC可以离体产生并且用各种蛋白和肽抗原以及肿瘤细胞提取物装载(Nestle等人(1998)NatureMedicine4:328-332)。DC还可以通过基因方法转导以还表达这些肿瘤抗原。DC也可以直接与肿瘤细胞融合用于免疫目的(Kugler等人(2000)Nature Medicine 6:332-336)。作为接种方法，DC免疫可以与CD40激动作用有效组合以活化(发动)更有效的抗肿瘤应答。
CD40的激动作用也可以与标准癌症治疗(例如，手术、放射和化疗)组合。CD40的激动作用可以与化疗方案有效组合。在这些情况下，可能可以减少施用的化疗试剂的剂量(Mokyr等人(1998)Cancer Research 58:5301-5304)。此类组合的实例是抗huCD40抗体和氮烯咪胺的组合用于治疗黑素瘤。此类组合的另一实例是抗huCD40抗体和白细胞介素-2(IL-2)的组合用于治疗黑素瘤。CD40激动剂和化疗的组合使用背后的科学原理是细胞死亡(这是大部分化疗化合物的细胞毒性作用的结果)应导致抗原呈递途径中肿瘤抗原水平增加。其他可经细胞死亡导致与CD40激动作用的协同作用的组合疗法是放射、手术和激素剥夺。这些方案中的每种产生宿主中的肿瘤抗原的来源。血管发生抑制剂也可以与CD40激动剂组合。抑制血管发生导致肿瘤细胞死亡，其可以将肿瘤抗原供给至宿主抗原呈递途径中。
本文所述的抗huCD40抗体也可以与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用(参见例如美国专利号5,922,845和5,837,243)。双特异性抗体可以用于靶向两种单独的抗原。例如，抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性抗体已经用于将巨噬细胞靶向肿瘤部位。该靶向可以更有效地活化肿瘤特异性应答。这些应答的T细胞臂将通过CD40的激动作用而增加。可选地，抗原可以直接递送至DC，其通过结合肿瘤抗原和树突细胞特异性细胞表面标记物的双特异性抗体。
肿瘤通过许多种机制逃避宿主免疫监视。这些机制中的许多种可以通过失活由肿瘤表达的免疫抑制性蛋白而克服。这些尤其包括TGF-β(Kehrl等人(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard和O'Garra(1992)Immunology Today 13:198-200)和Fas配体(Hahne等人(1996)Science 274:1363-1365)。针对这些实体的每一种的抗体可以与抗huCD40抗体组合使用以抵消免疫抑制剂的作用并促进宿主的肿瘤免疫应答。
抗CD40抗体能够有效代替辅助性T细胞活性。Ridge等人(1998)Nature 393:474-478。针对T细胞共刺激分子诸如CTLA-4(例如美国专利号5,811,097)、OX-40(Weinberg等人(2000)Immunol.164:2160-2169)、CD137/4-1BB(Melero等人(1997)Nature Medicine 3:682-685(1997)和ICOS(Hutloff等人(1999)Nature 397:262-266)的活化性抗体也可以提供T细胞活化水平增加。PD1或PD-L1的抑制剂也可以与抗huCD40抗体联合使用。
存在若干实验治疗方案，其涉及离体活化和扩增抗原特异性T细胞和将这些细胞过继转移至受体中以刺激针对肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg和Riddell(1999)Science285:546-51)。这些方法也可以用于活化针对传染源诸如CMV的T细胞应答。存在抗CD40抗体的情况下离体活化可以增加过继转移的T细胞的频率和活性。
慢性病毒性感染
在另一方面，本文所述的本发明提供治疗主体中的传染病的方法，其包括向主体施用抗huCD40抗体或其抗原结合片段，使得对所述主体治疗传染病。
与其对上述肿瘤的应用类似，抗体介导的CD40激动作用可以单独使用、或作为辅助剂与疫苗组合使用，以增强对病原体、毒素和自体抗原的免疫应答。该治疗方法可以特别有用的病原体的实例包括目前尚无有效疫苗的病原体或常规疫苗对其不是完全有效的病原体。这些包括但不限于HIV、肝炎(甲肝、乙肝和丙肝)、流感、疱疹、贾第鞭毛虫、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。CD40激动作用针对由病原体诸如随感染过程呈递改变的抗原的HIV建立的感染特别有用。这些新表位在抗人CD40抗体施用时被识别为外源的，因此激发强T细胞应答。
引起可由本文所述方法治疗的感染的病原性病毒的一些实例包括HIV、肝炎(甲肝、乙肝和丙肝)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒和虫媒脑炎病毒。
引起可由本文所述的方法治疗的感染的病原性细菌的一些实例包括衣原体、立克次体、分枝杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎球菌和淋球菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、沙雷菌、假单胞菌、军团菌、白喉、沙门氏菌、芽孢杆菌、霍乱、破伤风、肉毒中毒、炭疽、鼠疫、钩端螺旋体病和莱姆病病菌。
引起可由本文所述的方法治疗的感染的病原性真菌的一些实例包括假丝酵母(白色念珠菌、克柔假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母等)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、曲霉(烟曲霉、黑曲霉等)、属毛霉目(毛霉属、犁头霉属、根霉属)、申克氏胞丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可由本文所述的方法治疗的感染的病原性寄生虫的一些实例包括痢疾变形虫(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏耐格里变形虫(Naegleriafowleri)、棘阿米巴属种(Acanthamoeba sp.)、蓝氏贾第虫(Giardia lambia)、隐孢子虫属种(Cryptosporidium sp.)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微小巴贝虫(Babesia microti)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有上述方法中，CD40激动作用可以与其他形式的免疫疗法诸如细胞因子治疗(例如干扰素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或双特异性抗体疗法组合，其提供增强的肿瘤抗原呈递。参见例如Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak(1994)Structure 2:1121-1123。
疫苗佐剂
本文所述的抗huCD40抗体可以用于通过共施用抗huCD40抗体和目标抗原例如疫苗来增强抗原特异性免疫应答。因此，本文提供增强主体中针对抗原的免疫应答的方法，其包括向主体施用：(i)抗原；和(ii)抗huCD40抗体或其抗原结合片段，使得主体中针对抗原的免疫应答增强。抗原例如可以是肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或来自病原体的抗原。此类抗原的非限制性实例包括以上部分中讨论的那些，诸如上文讨论的肿瘤抗原(或肿瘤疫苗)或来自病毒、细菌或上述的其他病原体的抗原。
体内和体外施用本文所述的抗体组合物(例如人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫缀合物)的合适途径是本领域众所周知的并且可由普通技术人员选择。例如，抗体组合物可以通过注射(静脉内或皮下)施用。所用分子的合适剂量将取决于主体的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或制剂。
如前所述，本文所述的抗huCD40抗体可以与一种或多种治疗剂诸如细胞毒性剂、放射毒性剂或免疫抑制剂共同施用。抗体可以与药剂连接(作为免疫复合物)或可以与药剂分开施用。在后一种情况下(分开施用)，抗体可以在药剂之前、之后或同时施用，或者可以与其他已知疗法例如抗癌疗法例如放射共同施用。此类治疗剂尤其包括抗肿瘤药诸如多柔比星(阿霉素)、顺铂硫酸博莱霉素、卡莫司汀、瘤可宁、达卡巴嗪和环磷酰胺羟基脲，其单独时仅在对患者有毒或亚毒性的水平下是有效的。顺铂以100mg/ml剂量每四周静脉内施用一次并且阿霉素以60-75mg/ml剂量每21天静脉内施用一次。共施用本文所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段与化疗剂提供两种抗癌剂，其经对人肿瘤细胞产生细胞毒性作用的不同机制运作。此类共施用可以解决由于发展对药物抗性或将使肿瘤细胞对于抗体无反应性的肿瘤细胞抗原性的改变引起的问题。
还在本文所述的范围内的是包含本文所述的抗体组合物(例如，人抗体、双特异性或多特异性分子、或免疫缀合物)及使用说明书的试剂盒。试剂盒可以进一步包含至少一种额外试剂、或一种或多种本文所述的额外的人抗体(例如，具有结合与第一人抗体不同的CD40抗原中的表位的互补活性的人抗体)。试剂盒通常包含说明试剂盒的内含物的预期用途的标签。术语标签包括提供于试剂盒上或连同试剂盒提供的或以其他方式伴随试剂盒提供的任何书写的或记录的材料。
组合疗法
除了上文提供的组合疗法外，本文所述的抗CD40抗体还可以用于组合疗法中，例如用于治疗癌症，如下文所述。
本发明提供组合疗法的方法，其中将抗huCD40抗体与一种或多种额外药剂例如抗体(其有效刺激免疫应答，以由此进一步增强、刺激或上调主体中的免疫应答)共同施用。
通常，本文所述的抗huCD40抗体可以与(i)另一共刺激受体的激动剂和/或(ii)T细胞上抑制信号的拮抗剂(其任一者导致放大抗原特异性T细胞应答(免疫检验点调节剂))组合。大部分共刺激或共抑制分子是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员，并且本文所述的抗CD40抗体可以与靶向IgSF家族成员以增加免疫应答的药剂施用。结合共刺激或共抑制受体的膜结合配体的一个重要家族是B7家族，其包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)和B7-H6。结合共刺激或共抑制受体的膜结合配体的另一家族是结合同族TNF受体家族成员的TNF家族的分子，其包括CD40和CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137/4-1BB、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDAR、EDA1、XEDAR、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY、NGFR(参见例如，Tansey(2009)Drug Discovery Today 00:1)。
在另一方面，抗huCD40抗体可以与抑制T细胞活化的细胞因子(例如IL-6、IL-10、TGF-β、VEGF)的拮抗剂；或其他“免疫抑制细胞因子”或刺激T细胞活化的细胞因子组合使用，用于刺激免疫应答，例如，用于治疗增殖性疾病，诸如癌症。
在一方面，T细胞应答可以通过本发明的抗huCD40 mAb与以下的一种或多种的组合来刺激：(i)抑制T细胞活化的蛋白(例如免疫检验点抑制剂)诸如CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、TIM-3、半乳凝素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1和TIM-4的拮抗剂和(ii)刺激T细胞活化的蛋白诸如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、OX40、OX40L、GITR、GITRL、CD70、CD27、CD40、DR3和CD28H的激动剂。
调节上述蛋白之一并且可以与激动剂抗huCD40抗体例如本文所述的那些组合用于治疗癌症的示例性药剂，包括：
Figure BDA0003868948590000561
易普利姆玛或替西木单抗(针对CTLA-4)、galiximab(针对B7.1)、BMS-936558(针对PD-1)、皮地珠单抗(pidilizumab)/CT-011(针对PD-1)、/>
Figure BDA0003868948590000562
派姆单抗/MK-3475(针对PD-1)、AMP224(针对B7-DC/PD-L2)、BMS-936559(针对B7-H1)、MPDL3280A(针对B7-H1)、MEDI-570(针对ICOS)、AMG557(针对B7H2)、MGA271(针对B7H3–WO 11/109400)、IMP321(针对LAG-3)、乌瑞鲁单抗(Urelumab)/BMS-663513和PF-05082566(针对CD137/4-1BB)、varlilumab/CDX-1127(针对CD27)、MEDI-6383和MEDI-6469(针对OX40)、RG-7888(针对OX40L–WO 06/029879)、阿塞西普(针对TACI)、莫罗单抗-CD3(针对CD3)、伊匹单抗(针对CTLA-4)。
可以与激动剂抗huCD40抗体组合用于治疗癌症的其他分子包括NK细胞上的抑制性受体的拮抗剂或NK细胞上的活化性受体的激动剂。例如，激动剂抗huCD40抗体可以与KIR的拮抗剂(例如lirilumab)组合。
用于组合疗法的仍其他药剂包括抑制或消耗巨噬细胞或单核细胞的药剂，包括但不限于CSF-1R拮抗剂诸如CSF-1R拮抗剂抗体，包括RG7155(WO 11/70024、WO 11/107553、WO11/131407、WO 13/87699、WO 13/119716、WO 13/132044)或FPA-008(WO 11/140249；WO 13/169264；WO 14/036357)。
通常，本文所述的激动剂抗huCD40抗体可以与以下中的一种或多种一同使用：连接阳性共刺激性受体的激动剂、削弱经抑制性受体的信号传导的阻断剂、和一种或多种系统性增加抗肿瘤T细胞频率的药剂、在肿瘤微环境内克服不同免疫抑制途径(例如，阻断抑制性受体接合(例如，PD-L1/PD-1相互作用)、消耗或抑制Tregs(例如，使用抗CD25单克隆抗体(例如达利珠单抗)或通过离体抗CD25珠消耗)、抑制代谢酶诸如IDO、或逆转/防止T细胞无能或耗尽)的药剂和引发在肿瘤部位的先天免疫活化和/或炎症的药剂。
本文提供在主体中刺激免疫应答的方法，其包括向主体施用CD40激动剂，例如抗体，和一种或多种额外的免疫刺激性抗体，诸如PD-1拮抗剂例如拮抗剂抗体，PD-L1拮抗剂例如拮抗剂抗体，CTLA-1拮抗剂例如拮抗剂抗体和/或LAG3拮抗剂例如拮抗剂抗体，使得主体中的免疫应答得到刺激，例如，以抑制肿瘤生长或刺激抗病毒应答。在一个实施方案中，向主体施用激动剂抗huCD40抗体和拮抗剂抗PD-1抗体。在一个实施方案中，向主体施用激动剂抗huCD40抗体和拮抗剂抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，向主体施用激动剂抗huCD40抗体和拮抗剂抗CTLA-4抗体。在一个实施方案中，至少一种额外的免疫刺激性抗体(例如，拮抗剂抗PD-1、拮抗剂抗PD-LA、拮抗剂抗CTLA-4和/或拮抗剂抗LAG3抗体)是人抗体。可选地，至少一种额外的免疫刺激性抗体可以是例如嵌合或人源化抗体(例如，从小鼠抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4和/或抗LAG3抗体制备)。
本文提供治疗增殖性疾病(例如癌症)的方法，其包括向主体施用激动剂抗huCD40抗体和拮抗剂PD-1抗体。在某些实施方案中，激动剂抗huCD40抗体以亚治疗剂量施用，抗PD-1抗体以亚治疗剂量施用，或者两者以亚治疗剂量施用，其中亚治疗指定指代用所讨论的药剂的单一疗法。本文还提供改变与用免疫刺激剂治疗增殖性疾病相关的不利事件的方法，其包括向主体施用激动剂抗huCD40抗体和亚治疗剂量的抗PD-1抗体。在某些实施方案中，主体是人。在某些实施方案中，抗PD-1抗体是人序列单克隆抗体并且激动剂抗huCD40抗体是人源化单克隆抗体，诸如包含本文公开的抗体的CDR或可变区的抗体。
用于本文所述的方法中的合适的PD-1拮抗剂包括但不限于配体、抗体(例如单克隆抗体和双特异性抗体)和多价试剂。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂是融合蛋白，例如Fc融合蛋白，诸如AMP-244。在一个实施方案中，PD-1拮抗剂是抗PD-1或抗PD-L1抗体。
示例性抗PD-1抗体是
Figure BDA0003868948590000571
纳武单抗(BMS-936558)或包含描述于WO 2006/121168中的抗体17D8、2D3、4H1、5C4、7D3、5F4和4A11之一的CDR或可变区的抗体。在某些实施方案中，抗PD-1抗体是描述于WO 2012/145493的MK-3475(/>
Figure BDA0003868948590000572
派姆单抗/之前的兰利珠单抗(lambrolizumab))；描述于WO 2012/145493的AMP-514/MEDI-0680和CT-011(皮地珠单抗；之前的CT-AcTibody或BAT；参见例如，Rosenblatt等人(2011)J.Immunotherapy 34:409)。还已知的PD-1抗体和其他PD-1抑制剂包括描述于以下中的那些：WO 2009/014708、WO 03/099196、WO 2009/114335、WO 2011/066389、WO 2011/161699、WO 2012/145493、美国专利号7,635,757和8,217,149和美国专利号2009/0317368。公开于WO 2013/173223中的任何抗PD-1抗体也可以使用。与这些抗体之一竞争结合PD-1上的相同表位和/或与这些抗体之一结合PD-1上的相同表位的抗PD-1抗体也可以用于组合治疗中。/>
在某些实施方案中，抗PD-1抗体以5×10-8M或更低的KD结合人PD-1，以1×10-8M或更低的KD结合人PD-1，以5×10-9M或更低的KD结合人PD-1，或以1×10-8M-1×10-10M或更低的KD结合人PD-1。
本文提供治疗增殖性疾病(例如癌症)的方法，其包括向主体施用激动剂抗huCD40抗体和拮抗剂PD-L1抗体。在某些实施方案中，激动剂抗huCD40抗体以亚治疗剂量施用，抗PD-L1抗体以亚治疗剂量施用，或者两者均以亚治疗剂量施用。本文提供改变与用免疫刺激剂治疗增殖性疾病相关的不利事件的方法，其包括向主体施用激动剂抗huCD40抗体和亚治疗剂量的抗PD-L1抗体。在某些实施方案中，主体是人。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体是人序列单克隆抗体并且激动剂抗huCD40抗体是人源化单克隆抗体，诸如包含本文公开的抗体的CDR或可变区的抗体。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体是BMS-936559(在WO 2007/005874和美国专利号7,943,743中称为12A4)、MSB0010718C(WO 2013/79174)或包含3G10、12A4、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4的CDR或可变区的抗体，其描述于PCT公开WO 07/005874和美国专利号7,943,743中。在某些实施方案中，抗PD-L1抗体是MEDI4736(也称为抗B7-H1)或MPDL3280A(与称为RG7446)。也可以使用公开于WO 2013/173223、WO 2011/066389、WO2012/145493、美国专利号7,635,757和8,217,149以及美国公开号2009/145493中的任何抗PD-L1抗体。与任何这些抗体竞争和/或结合相同表位的抗PD-L1抗体也可以用于组合治疗中。
在还进一步的实施方案中，本发明的激动剂抗huCD40抗体与PD-1/PD-L1信号传导的拮抗剂诸如PD-1拮抗剂或PD-L1拮抗剂组合，并组合有第三免疫治疗剂。在一个实施方案中，第三免疫治疗剂是GITR拮抗剂或OX-40拮抗剂，诸如本文公开的抗GITR或抗OX40抗体。
在另一方面，免疫肿瘤剂是GITR激动剂，诸如激动性GITR抗体。合适的GITR抗体包括例如BMS-986153、BMS-986156、TRX-518(WO 06/105021、WO 09/009116)和MK-4166(WO11/028683)。
在另一方面，免疫肿瘤剂是IDO拮抗剂。合适的IDO拮抗剂包括例如INCB-024360(WO 2006/122150、WO 07/75598、WO 08/36653、WO 08/36642)、indoximod、或NLG-919(WO09/73620、WO 09/1156652、WO 11/56652、WO 12/142237)。
本文提供治疗增殖性疾病(例如癌症)的方法，其包括向主体施用本文描述的激动剂抗huCD40抗体和CTLA-4拮抗剂抗体。在某些实施方案中，激动剂抗huCD40抗体以亚治疗剂量施用，抗CTLA-4抗体以亚治疗剂量施用，或者两者以亚治疗剂量施用，其中亚治疗指定指代用所讨论的药剂的单一疗法。本文提供改变与用免疫刺激剂治疗增殖性疾病相关的不利事件的方法，其包括向主体施用激动剂抗huCD40抗体和亚治疗剂量的抗CTLA-4抗体。在某些实施方案中，主体是人。在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体是选自以下的抗体：
Figure BDA0003868948590000591
(易普利姆玛或抗体10D1，描述于PCT公开WO 01/14424)、替西木单抗(之前的ticilimumab,CP-675,206)和描述于以下公开中的抗CTLA-4抗体：WO 98/42752；WO 00/37504；美国专利号6,207,156；Hurwitz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(17):10067-10071；Camacho等人(2004)J.Clin.Oncology 22(145):Abstract No.2505(抗体CP-675206)和Mokyr等人(1998)Cancer Res.58:5301-5304。公开于WO 2013/173223中的任何抗CTLA-4抗体也可以使用。/>
本文提供治疗增殖性疾病(例如癌症)的方法，其包括向主体施用激动剂抗huCD40抗体和抗LAG-3抗体。在进一步的实施方案中，激动剂抗huCD40抗体以亚治疗剂量施用，抗LAG-3抗体以亚治疗剂量施用，或者两者均以亚治疗剂量施用。本文提供改变与用免疫刺激剂治疗增殖性疾病相关的不利事件的方法，其包括向主体施用激动剂抗huCD40抗体和亚治疗剂量的抗LAG-3抗体。在某些实施方案中，主体是人。在某些实施方案中，抗LAG-3抗体是人序列单克隆抗体并且激动剂抗huCD40抗体是人源化单克隆抗体，诸如包含本文公开的抗体的CDR或可变区的抗体。抗LAG-3抗体的实例包括含有抗体25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5的CDR或可变区的抗体，其描述于美国专利公开号US 2011/0150892和WO 2014/008218。在一个实施方案中，抗LAG-3抗体是BMS-986016。可以使用的其他领域公认的抗LAG-3抗体包括US 2011/007023中描述的IMP731。也可以使用IMP-321。与任何这些抗体竞争和/或结合相同表位的抗LAG-3抗体也可以用于组合治疗中。
在某些实施方案中，抗LAG-3抗体以5×10-8M或更低的KD结合人LAG-3，以1×10-8M或更低的KD结合人LAG-3，以5×10-9M或更低的KD结合人LAG-3，或以1×10-8M-1×10-10M或更低的KD结合人LAG-3。
施用本文所述的激动剂抗huCD40抗体和针对一种或多种第二靶抗原诸如LAG-3和/或CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1的拮抗剂例如拮抗剂抗体可以增强患者中针对癌细胞的免疫应答。使用本发明的抗体可以抑制其生长的癌症包括通常响应于免疫治疗的癌症。用本发明的组合疗法治疗的癌症的代表性实例包括上文具体在用激动剂抗huCD40抗体的单一疗法的讨论中列出的那些癌症。
在某些实施方案中，本文讨论的治疗性抗体的组合可以作为在药学上可接受的载体中的单一组合物同时施用，或者作为各自抗体在药学上可接受的载体中的单独的组合物同时施用。在另一个实施方案中，治疗性抗体的组合可顺序施用。例如，抗CTLA-4抗体和激动剂抗huCD40抗体可以顺序施用，诸如首先施用抗CTLA-4抗体其次施用激动剂抗huCD40抗体，或者首先施用激动剂抗huCD40抗体其次施用抗CTLA-4抗体。此外或可选地，抗PD-1抗体和激动剂抗huCD40抗体可以顺序施用，诸如首先施用抗PD-1抗体其次施用激动剂抗huCD40抗体，或者首先施用激动剂抗huCD40抗体其次施用抗PD-1抗体。此外或可选地，抗PD-L1抗体和激动剂抗huCD40抗体可以顺序施用，诸如首先施用抗PD-L1抗体其次施用激动剂抗huCD40抗体，或者首先施用激动剂抗huCD40抗体其次施用抗PD-L1抗体。此外或可选地，抗LAG-3抗体和激动剂抗huCD40抗体可以顺序施用，诸如首先施用抗LAG-3抗体其次施用激动剂抗huCD40抗体，或者首先施用激动剂抗huCD40抗体其次施用抗LAG-3抗体。
此外，如果多于一个剂量的组合疗法顺序施用，顺序施用的次序可以在每个施用时间点反转或保持相同次序，顺序施用可以与同时施用组合，或其任何组合。例如，首先施用组合抗CTLA-4抗体和激动剂抗huCD40抗体可以是同时的，第二施用可以与首先的抗CTLA-4抗体和其次的激动剂抗huCD40抗体是连续的，并且第三施用可以与首先的激动剂抗huCD40抗体和其次的抗CTLA-4抗体是连续的，等等。另外或可选地，首先施用组合抗PD-1抗体和激动剂抗huCD40抗体可以是同时的，第二施用可以与首先的抗PD-1抗体和其次的激动剂抗huCD40抗体是连续的，并且第三施用可以与首先的激动剂抗huCD40抗体和其次的抗PD-1抗体是连续的，等等。另外或可选地，首先施用组合抗PD-L1抗体和激动剂抗huCD40抗体可以是同时的，第二施用可以与首先的抗PD-L1抗体和其次的激动剂抗huCD40抗体是连续的，并且第三施用可以与首先的激动剂抗huCD40抗体和其次的抗PD-L1抗体是连续的，等等。另外或可选地，首先施用组合抗LAG-3抗体和激动剂抗huCD40抗体可以是同时的，第二施用可以与首先的抗LAG-3抗体和其次的激动剂抗huCD40抗体是连续的，并且第三施用可以与首先的激动剂抗huCD40抗体和其次的抗LAG-3抗体是连续的，等等。另一代表性给药方案可以涉及首先施用(其与首先的激动剂抗huCD40和其次的抗CTLA-4抗体(和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体)是连续的)，并且随后施用可以是同时的。
任选地，作为单一免疫治疗剂的激动剂抗huCD40、或激动剂抗huCD40抗体和一种或多种额外的免疫治疗性抗体(例如，抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3)的组合可以进一步与免疫原性剂诸如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽、和碳水化合物分子)、细胞和转染有编码免疫刺激性细胞因子的基因的细胞组合(He等人(2004)J.Immunol.173:4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原的肽，诸如gp100的肽、MAGE抗原、Trp-2、MART1和/或酪氨酸酶、或经转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(下文进一步讨论)。CD40激动剂和一种或多种额外的抗体(例如，CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断)也可以进一步与标准癌症治疗组合。例如，CD40激动剂和一种或多种额外的抗体(例如，CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断)可以有效地与化疗方案组合。在这些情况中，可以减少与本发明的组合施用的其他化疗剂的剂量(Mokyr等人(1998)Cancer Research 58:5301-5304)。此类组合的实例是CD40激动剂抗体与或不与额外抗体诸如抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体)并进一步组合达卡巴嗪(decarbazine)的组合，其用于治疗黑素瘤。另一个实例是激动剂抗huCD40抗体与或不与抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3抗体并进一步组合白细胞介素-2(IL-2)的组合，其用于治疗黑素瘤。CD40激动作用和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断与化疗的组合使用背后的科学原理是细胞死亡(这是大部分化疗化合物的细胞毒性作用的结果)应导致抗原呈递途径中肿瘤抗原水平增加。可以与组合的CD40激动作用与或不与CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断经细胞死亡导致协同作用的其他组合疗法包括放射、手术或激素剥夺。这些方案中的每种产生宿主中的肿瘤抗原的来源。血管发生抑制剂也可以与组合的CD40激动作用和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断组合。抑制血管发生导致肿瘤细胞死亡，其可以是供给至宿主抗原呈递途径中的肿瘤抗原的来源。
作为单一免疫治疗剂的激动剂抗huCD40抗体或CD40激动剂和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断抗体的组合也可以与将表达Fcα或Fcγ受体的效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体组合使用。参见例如美国专利号5,922,845和5,837,243。双特异性抗体可以用于靶向两种单独的抗原。这些应答的T细胞臂将通过组合的CD40激动作用和CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断而增加。
在另一实例中，作为单一免疫治疗剂的激动性抗CD40抗体或抗CD40抗体和额外的免疫刺激剂例如抗CTLA-4抗体和/或PD-1和/或抗PD-L1抗体和/或抗LAG-3试剂例如抗体的组合可以与抗肿瘤抗体诸如
Figure BDA0003868948590000611
(利妥昔单抗)、/>
Figure BDA0003868948590000612
(曲妥珠单抗)、
Figure BDA0003868948590000621
(托西莫单抗)、/>
Figure BDA0003868948590000622
(替伊莫单抗)、/>
Figure BDA0003868948590000623
(阿仑单抗)、
Figure BDA0003868948590000624
(依帕珠单抗)、/>
Figure BDA0003868948590000625
(贝伐单抗)和/>
Figure BDA0003868948590000626
(埃罗替尼)等联合使用。借助实例并且不希望受理论束缚，用抗癌抗体或缀合至毒素的抗癌抗体治疗可以导致癌细胞死亡(例如肿瘤细胞)，这将增强由免疫刺激剂例如CD40、TIGIT、CTLA-4、PD-1、PD-L1或LAG-3试剂例如抗体介导的免疫应答。在示例性实施方案中，增殖性疾病(例如癌症肿瘤)的治疗可以包括抗癌剂，例如抗体，并组合激动剂抗huCD40抗体和任选地额外的免疫刺激剂例如抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3试剂例如抗体，以同时地或顺序地或其任何组合，其可以增强由宿主的抗肿瘤免疫应答。
本文提供改变与用免疫刺激剂治疗增殖性疾病(例如癌症)相关的不利事件的方法，其包括向主体施用激动剂抗huCD40抗体与或不与亚治疗剂量的抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3试剂例如抗体。例如，本文所述的方法提供通过向患者施用不可吸收的类固醇来降低免疫刺激性治疗抗体诱导的结肠炎或腹泻的发病率的方法。如本文所用，“不可吸收的类固醇”是这样的糖皮质激素，其展示大量首过代谢，使得在肝中代谢后，该类固醇的生物利用率低，即低于约20％。在本文所述的一个实施方案中，不可吸收的类固醇是布地奈德。布地奈德是局部作用的糖皮质激素，其在口服施用后被大量代谢，主要经肝。
Figure BDA0003868948590000627
(Astra-Zeneca)是开发用于优化药物递送至回肠和经结肠的药物递送的布地奈德的pH和时间依赖型口服制剂。/>
Figure BDA0003868948590000628
在美国获批用于治疗涉及回肠和/或升结肠的轻度至中度克罗恩病。/>
Figure BDA0003868948590000629
用于治疗克罗恩病的通常口服剂量是6-9mg/天。/>
Figure BDA00038689485900006210
在肠中释放，随后被吸收并保留在肠粘膜中。一旦其经过肠粘膜靶组织，/>
Figure BDA00038689485900006211
被肝中的细胞色素P450系统大量代谢成具有可忽略的糖皮质激素活性的代谢物。因此，生物利用率低(约10％)。布地奈德的低生物利用率导致相比于其他具有较低大量首过代谢的糖皮质激素的改进的治疗比。布地奈德比全身作用的皮质类固醇导致较少不良反应，包括较低的下丘脑抑制。然而，/>
Figure BDA00038689485900006212
的慢性施用可以导致全身性糖皮质激素作用，诸如肾上腺功能亢进(hypercorticism)和肾上腺抑制。参见PDR第58版2004；608-610。
在仍进一步的实施方案中，联合有不可吸收的类固醇的CD40激动剂与或不与CTLA-4和/或PD-1和/或PD-L1和/或LAG-3阻断(即针对CD40的免疫刺激性治疗抗体和任选地抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体)可以进一步与水杨酸盐组合。水杨酸盐包括5-ASA试剂，诸如例如：柳氮磺吡啶(
Figure BDA00038689485900006213
Pharmacia&UpJohn)；奥沙拉秦(/>
Figure BDA00038689485900006214
Pharmacia&UpJohn)；巴柳氮(/>
Figure BDA00038689485900006215
Salix Pharmaceuticals,Inc.)和氨水杨酸(/>
Figure BDA0003868948590000631
Procter&Gamble Pharmaceuticals；/>
Figure BDA0003868948590000632
Shire US；
Figure BDA0003868948590000633
Axcan Scandipharm,Inc.；/>
Figure BDA0003868948590000634
Solvay)。
根据本文所述的方法，与激动剂抗huCD40抗体且与或不与抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体以及不可吸收的类固醇组合施用的水杨酸盐可以包括用于降低由免疫刺激性抗体诱导的结肠炎发病率的目的的任何重叠或顺序施用水杨酸盐和不可吸收的类固醇。因此，例如，本文所述的用于降低由免疫刺激性抗体诱导的结肠炎的发病率的方法包括同时或顺序(例如，在不可吸收的类固醇后6小时施用水杨酸盐)或其任何组合来施用水杨酸盐和不可吸收的类固醇。进一步，水杨酸盐和不可吸收的类固醇可以通过相同途径(例如均为口服施用)或通过不同途径(例如，水杨酸盐口服施用且不可吸收的类固醇直肠施用)施用，其可以与用于施用抗huCD40和抗CTLA-4和/或抗PD-1和/或抗PD-L1和/或抗LAG-3抗体的途径不同。
本文所述的激动剂抗huCD40抗体和组合抗体疗法也可以与其他众所周知的可对于其针对所治疗的适应症(例如癌症)的特定有用性而选择的疗法联合使用。本文所述的激动剂抗huCD40抗体的组合与已知的药学上可接受的药剂可以顺序使用。
例如，本文所述的激动剂抗huCD40抗体和联合抗体疗法可以与另外的治疗组合(例如同时或分别)使用，所述另外的治疗例如放射、化学疗法(例如使用喜树碱(CPT-11)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂、多柔比星、伊立替康、紫杉醇、吉西他滨、顺铂、紫杉醇、卡铂-紫杉醇(紫杉酚)、多柔比星、5-fu或喜树碱+apo21/TRAIL(6X组合)、一种或多种蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米或MG132)、一种或多种Bcl-2抑制剂(例如BH3I-2'(bcl-x1抑制剂)、吲哚胺双加氧酶-1(IDO1)抑制剂(例如INCB24360)、AT-101(R-(-)-棉酚衍生物)、ABT-263(小分子)、GX-15-070(奥巴克拉(obatoclax))或MCL-1(髓样白血病细胞分化蛋白-1)拮抗剂)、iAP(凋亡蛋白抑制剂)拮抗剂(例如smac7、smac4、小分子smac模拟物、合成smac肽(参见Fulda等人,Nat Med 2002；8:808-15)、ISIS23722(LY21813)或AEG-35156(GEM-640))、HDAC(组蛋白脱乙酰酶)抑制剂、抗CD20抗体(例如利妥昔单抗)、血管生成抑制剂(例如贝伐单抗)、靶向VEGF和VEGFR的抗血管生成剂(例如
Figure BDA0003868948590000635
)、合成三萜类(参见Hyer等人,Cancer Research 2005；65：4799-808)、c-FLIP(细胞FLICE抑制蛋白)调节剂(例如PPARγ的天然和合成配体(过氧化物酶体增殖物活化受体γ)、5809354或5569100)、激酶抑制剂(例如索拉非尼)、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、西罗莫司脂化物、mTOR抑制剂如雷帕霉素和西罗莫司脂化物、硼替佐米、JAK2抑制剂、HSP90抑制剂、PI3K-AKT抑制剂、来那度胺、GSK3β抑制剂、IAP抑制剂和/或遗传毒性药物。
本文所述的激动剂抗huCD40抗体和联合抗体疗法可以进一步与一种或多种抗增殖性细胞毒性剂组合使用。可以用作抗增殖性细胞毒性剂的化合物的类别包括但不限于以下：烷化剂(包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)：尿嘧啶氮芥、氮芥(Chlormethine)、环磷酰胺(CYTOXANTM)、异环磷酰胺(fosfamide)、美法仑、苯丁酸氮芥、胍血生、三乙撑蜜胺、三亚乙基硫代磷胺(Triethylenethiophosphoramine)、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲霉素、达卡巴嗪和替莫唑胺。
抗代谢物(包括但不限于叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂)：甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、喷司他丁(Pentostatine)和吉西他滨。
除了本领域已知的其他微管稳定剂外，与激动剂抗huCD40抗体组合的合适的抗增殖剂不限于紫杉烷、紫杉醇(紫杉醇市售为TAXOLTM)、多西他赛、圆皮海绵内酯(DDM)、dictyostatin(DCT)、Peloruside A、埃博霉素、埃博霉素A、埃博霉素B、埃博霉素C、埃博霉素D、埃博霉素E、埃博霉素F、富马酸埃博霉素D(furanoepothilone D)、脱氧埃博霉素B1、[17]-脱氢脱氧埃博霉素B、[18]脱氢脱氧埃博霉素B、C12,13-环丙基-埃博霉素A、C6-C8桥联埃博霉素A、反式-9,10-脱氢埃博霉素D、顺式-9,10-脱氢埃博霉素D、16-脱甲基埃博霉素B、埃博霉素B10、discoderomolide、帕土匹龙(EPO-906)、KOS-862、KOS-1584、ZK-EPO、ABJ-789、XAA296A(圆皮海绵内酯)、TZT-1027(soblidotin)、ILX-651(tasidotin盐酸盐)、软海绵素B、甲磺酸艾日布林(E-7389)、Hemiasterlin(HTI-286)、E-7974、鱼藤素、LY-355703、美登木素生物碱免疫缀合物(DM-1)、MKC-1、ABT-751、T1-38067、T-900607、SB-715992(伊斯平斯)、SB-743921、MK-0731、STA-5312、eleutherobin、17β-乙酰氧基-2-乙氧基-6-氧代-B-高-雌甾-1,3,5(10)-三烯-3-醇、cyclostreptin、isolaulimalide、laulimalide、4-表-7-脱羟基-14,16-二去甲基-(+)-圆皮海绵内酯和cryptothilone1。
在期望使异常增殖细胞伴随用本文所述的抗huCD40抗体治疗时或在所述治疗之前休眠的情况下，也可以将激素和类固醇(包括合成类似物)诸如17a-乙炔雌二醇、己烯雌酚、睾酮、泼尼松、氟甲睾酮、丙酸屈他雄酮、睾内酯、醋酸甲地孕酮、甲基强的松龙、甲基睾酮、氢化泼尼松、去炎松、氯烯雌醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、醋酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他胺、托瑞米芬、ZOLADEXTM施用于患者。当采用本文所述的方法或组合物时，在临床环境中用于调节肿瘤生长或转移的其他药剂诸如抗模拟物(antimimetics)也可以在期望时施用。
化疗剂的安全且有效施用的方法是本领域技术人员已知的。此外，其施用描述于标准文献中。例如，许多化疗剂的施用描述于Physicians'Desk Reference(PDR),例如，1996年版(Medical Economics Company,Montvale,N.J.07645-1742,USA)；其公开内容对其通过引用并入本文。
化疗剂和/或放射治疗可以根据本领域众所周知的治疗方案来施用。对于本领域技术人员将明显的是施用化疗剂和/或放射疗法可以根据所治疗的疾病和化疗剂和/或放射疗法对该疾病的已知作用而不同。而且，根据临床医师的知识，治疗方案(例如，施用的剂量和时机)可以鉴于所施用的治疗剂对患者所观察到的效果和鉴于疾病对所施用的治疗剂的观察到的响应而不同。
XI.本发明的特异性激动剂抗CD40抗体的表征
如实施例1中所述获得本发明的激动剂抗CD40抗体。本发明的示例性抗体的可变结构域和CDR序列区域提供于序列表中，并概述于表2中。可变结构域和CDR区编号对于所有来源于相同原始克隆的抗体都是相同的，即本文提供的人源化变体不包括任何插入或缺失。
表2
抗体可变结构域和CDR
克隆 链 可变结构域 CDR1 CDR2 CDR3
12D6 重链 1-119 31–35 50–66 99–108
12D6 轻链 1-112 24–39 55–61 94–102
5F11 重链 1-117 31–35 50–66 99–106
5F11 轻链 1-111 24–38 54–60 93–101
8E8 重链 1-122 31–35 50–66 99–111
8E8 轻链 1-112 24–39 55–61 94–102
5G7 重链 1-113 31–35 50–66 99–102
5G7 轻链 1-107 24–34 50–56 89–97
19G3 重链 1-112 31–35 50–66 99–101
19G3 轻链 1-112 24–39 55–61 94–102
。
本发明还提供与本文公开的那些抗体在序列上相关的抗huCD40抗体，所述序列来源于相同的鼠种系序列，特别是V和J区基因区段。本文公开的抗体的每一种的鼠种系序列提供于表3中。
表3
抗huCD40 mAb的小鼠种系序列
Figure BDA0003868948590000651
Figure BDA0003868948590000661
本发明进一步提供来源于本文公开的鼠亲代抗体的人源化抗huCD40抗体，其通过用人框架序列替换鼠框架序列，具有或不具有额外突变(“回复突变”)以恢复会另外在人源化中丧失的抗原(人CD40)亲和力或以去除序列缺陷(sequence liabilities)。参见实施例3。
本发明还提供包含本文公开的新的可变结构域序列和具有经修饰的Fc区的恒定结构域的抗体构建体，所述经修饰的Fc区相比于其对其他Fc受体(即活化受体)的亲和力，具有对FcγRIIb增强的亲和力。预期具有增强的FcγRIIb特异性的此类激动性抗huCD40抗体在癌症治疗和慢性感染中展示出优秀的效力。Li和Ravetch(2011)Science 333:1030；White等人(2011)J.Immunol.187:1754。旨在不受理论束缚，此类FcγRIIb特异性激动性抗CD40mAb可以通过增加促进细胞毒性CD8+T细胞的增殖和活化的树突细胞的成熟、导致抗肿瘤应答增强来展示出增强的辅助作用。同上。旨在不受理论束缚，由于本发明的增加的受体聚簇或“交联”导致的FcR介导的激动剂CD40抗体的信号增强可以是治疗效力的主要促进因素。通过抗体的Fc部分的经FcR接合的CD40激动剂抗体的交联可以增加信号强度并由此增强细胞活化。
抗体对于活化性(A)相对于抑制性(I)Fc受体的相对结合亲和力可以表示为“A/I”比，并且通常是IgG抗体的Fc区结构的功能。参见WO 2012/087928。具有结合抑制性受体FcγRIIb的增强的特异性的抗体具有较低的A/I比。本发明的激动性抗huCD40抗体的优选抗体例如具有小于5、4、3、2、1、0.5、0.3、0.1、0.05、0.03或0.01的A/I比。
包含增强FcγRIIb特异性的突变的人IgG1恒定结构域也提供在序列表中，并且概述于表4中且图示于图1。参考SEQ ID NO:65中提供的人IgG1f恒定结构域序列限定序列变体。关于Fc区中突变的位置(编号)的命名法根据EU索引，如在Kabat等人(1981)Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.)，其便于比较具有不同可变结构域长度的抗体中等同位置处的Fc序列。还参见Edelman等人(1969)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 63:78；WO2012/130831(使用相同的编号系统)。其不匹配序列表中的序列编号。图1提供表4的Fc序列变体的图示，本领域技术人员从中可以容易地认出本文公开的抗体序列中的相应位置。SE和SELF变体描述于Chu等人(2008)Mol.Immunol.45:3926。P238D、V4、V7、V8、V9、V11和V12变体描述于Mimoto等人(2013)Protein Engineering Design&Selection 26:589(例如，在其中的表1处)。
表4
Fc序列变体
Figure BDA0003868948590000671
具有对FcγRIIb增强的亲和力的另外的Fc序列变体公开于Yu等人(2013)J.Am.Chem.Soc.135:9723(和WO 2014/184545)，包括V262E和V264E，例如用于与S267E和L328F组合使用。
产生具有D270E突变的另外的变体以减少在V4和V9 Fc序列变体中发生的D270异构化，其另外在加速降解研究中展示出增强的异构化速率，表明在PBS中4℃下两年后，相比于其他变体的～5-7％，～12-16％的异构化。参见表5(提供来自单一实验的数据，但重复实验显示相当的值)。在位置270用谷氨酸取代天冬氨酸消除了此类DG异构化的可能性，产生化学上更稳定的抗体和更均质的抗体制剂。V9的其他D270取代，诸如D270A、D270Q、D270S和D270T，有效地消除了与FcγRIIa和FcγRIIb受体的结合(KD大于5μM)。尽管D270E突变将与FcγRIIb受体的结合降低了一个数量级，但与FcγRIIa相比，V9-D270E变体对FcγRIIb受体的亲和力保持有利的偏好，并且对FcγRIIb的绝对亲和力是可接受的。参见实施例8。
表5
对Fcγ受体的Fc序列变体亲和力(KD，以nM计)
Figure BDA0003868948590000681
测量本发明的各种抗CD40抗体的激动剂活性。参见实施例7和图3A、3B和4。发现激动剂活性取决于可变结构域序列(mAb克隆数)(其决定抗原(人CD40)结合)和Fc区的序列(其决定Fc受体(FcγRIIb)结合)。
本发明在以下实施例中进一步说明，所述实施例不应该解释为进一步限定。整个本申请中引用的所有附图和所有参考、GenBank序列、专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。
实施例
实施例1
生成针对人CD40的小鼠单克隆抗体
使用表达小鼠抗体基因的野生型Balb/c小鼠(Charles Rivers Labs)如下产生鼠抗人CD40单克隆抗体。
抗原
将huCD40-muFc可溶重组蛋白用作免疫的抗原。可溶融合蛋白具有91.6kD的MW并且由在其C末端连接至小鼠IgG2b Fc的huCD40的细胞外部分构成。该融合蛋白在本文称为“huCD40-muFc融合蛋白”。通过标准重组DNA方法生成融合蛋白并且表达于转染的CHO细胞，其将可溶融合蛋白分泌入培养上清液中。用于转染的CHO宿主细胞可获自Invitrogen(目录号11619-012)。将分泌的可溶融合蛋白纯化用作免疫原。
小鼠的免疫
为了产生针对人CD40的小鼠单克隆抗体，将Balb/c小鼠用纯化的huCD40-muFc融合蛋白免疫。小鼠在第一次输注抗原时大约2-4月龄。将纯化的重组huCD40-muFc抗原制剂(10μg纯化自表达融合蛋白的转染的哺乳动物细胞)用于使用两种免疫方案(A和B)来免疫小鼠。方案A由四次每周足垫(FP)免疫组成，和方案B由七次每周皮下(SC)/腹膜内(IP)/跗免疫组成。在两种情况下，将免疫原与RIBI佐剂(Sigma目录号M6536)1：1混合。
所有小鼠在第四次免疫后一周放血以评估抗原特异性效价。在处死时从每只小鼠还获得最终的放血。通过眶后放血监测免疫应答。使用用于免疫的重组蛋白通过ELISA分析筛选血浆。来自方案A的小鼠在融合前第-2和-3天用可溶抗原静脉内(IV)和在足垫中(FP)接受两次最终加强。来自方案B的小鼠在融合前第-2和-3天用可溶抗原静脉内以及IP和在跗中接受两次最终加强。
将来自方案A的所有四只小鼠(ID 291763、291764、291765、291766)均处死。取出淋巴结和脾细胞并混合用于融合(融合体3582和3583)。将来自方案B的仅两只小鼠(ID294286和294288)处死。将来自每只小鼠的脾和淋巴结混合并融合(融合体3716和3717)。
生产针对人CD40的单克隆抗体的杂交瘤的产生
将从高效价Balb/c小鼠分离的小鼠脾细胞和淋巴结使用基于电场的电融合Hybrimune仪器和大的0.9ml融合室(BTX Harvard Apparatus,Inc.,Holliston,MA)与小鼠骨髓瘤融合配偶体融合。将来自免疫小鼠的淋巴细胞的单细胞悬浮液与等同数目的P3X63Ag8.6.53(ATCC CRL 1580)非分泌小鼠骨髓瘤细胞融合。将所得细胞以2.0x 104个细胞/孔铺板于平底微量滴定板的选择性ClonaCell-HY培养基E(目录号03805；STEMCELLTechnologies Inc.,Vancouver BC,Canada)中，所述培养基添加有氨基蝶呤以选择杂交瘤。约7天后，将培养基用培养基E(无氨基蝶呤)替换。
10-12天后，使用同质HTRF测定筛选单独孔的小鼠IgG/小鼠κ轻链抗体的存在。在该测定中，将来自96孔融合板的上清液与定制标记的铽-穴状化合物山羊抗小鼠IgG(Fcγ特异性)(Cisbio US Inc.Bedford,MA)和标记有AlexaFluor 647的山羊抗小鼠IgG Fab’2(Jackson ImmunoResearch；目录号109-605-098)混合。孵育1小时。将板随后在Rubystar读数器上阅读。随后通过FACS使用转染有人CD40的CHO细胞和作为对照的CHO未转染细胞(融合体3582/3583)或通过ELISA使用重组蛋白随后对作为阴性对照的Daudi B细胞和JurkatT细胞(融合体3716/3717)的FACS来筛选来自对小鼠IgG/小鼠κ轻链抗体阳性的孔的杂交瘤细胞。将FACS阳性亲代系转移至24孔板。几天后，将来自单独孔的细胞上清液通过FACS再次筛选以证实对人CD40的IgG特异性。
通过系列稀释将一组抗原特异性杂交瘤克隆并使用CHO转染子或Daudi细胞通过FACS再筛选。来自融合体3582/3583的19种抗体和来自融合体3716/3717的20种抗体进行纯化并测试功能活性。从这组抗体中，选择五种强激动剂用于第二次亚克隆。这五种抗体即1802.3582.19G3.F10.E1、1802.3583.5G7.F12.G3、1802.3583.8E8.C10.G2、1802.3716.12D6.B1.E3和1802.3717.5F11.A11.E7进行测序并进一步分析。
实施例2
完全人抗huCD40抗体的生成
与本文公开的人源化抗CD40抗体结合相同表位和/或交叉阻断本文公开的人源化抗CD40抗体的结合的完全人抗huCD40单克隆抗体可以用于本发明的方法中。此类抗体可以使用表达人抗体基因的转基因小鼠如下产生。
抗原
将huCD40可溶重组蛋白用作用于免疫的抗原。可溶融合蛋白由在其C末端连接至小鼠IgG2a Fc的huCD40的细胞外部分构成。该融合蛋白在本文称为“huCD40-muFc融合蛋白”。通过标准重组DNA方法生成融合蛋白并且表达于转染的CHO细胞，其将可溶融合蛋白分泌入培养上清液中。用于转染的CHO宿主细胞获自Invitrogen(目录号11619-012)。将分泌的可溶融合蛋白纯化用作免疫原。包括信号序列的全长人CD40的序列提供于SEQ ID NO:1。
转基因小鼠
使用来自CMD++；JKD++；KCo5(9272)+^；SC20+基因型(下文称为
Figure BDA0003868948590000701
小鼠)的小鼠制备针对人CD40的完全人单克隆抗体。各个转基因名称在括号中，随后为行号用于随机整合的转基因。符号++和+表示纯合或杂合的；然而，由于使用基于PCR的测定来常规筛选小鼠，所述基于PCR的测定不允许我们对于随机整合的人Ig转基因区分杂合性和纯合性，因此+指代可能会给予对于这些元件实际上是纯合的小鼠。在该品系中，内源小鼠κ轻链基因已经被纯合断裂，如Chen等人(1993)EMBO J.12:811-820中所述，并且内源小鼠重链基因已经如WO 2001/09187的实施例1中所述被纯合断裂。此外，该小鼠品系携带人κ轻链转基因KCo5，如描述于Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851，携带大部分人κ轻链基因座的酵母人工染色体(YAC)，如描述于WO 2000/026373。
小鼠的免疫
为了产生针对人CD40的完全人单克隆抗体，将
Figure BDA0003868948590000702
小鼠用纯化的huCD40-muFc融合蛋白免疫。一般免疫方案描述于Lonberg等人(1994)Nature 368(6474):856-859；Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14:845-851和WO 98/24884。小鼠在第一次输注抗原时大约4月龄。将纯化的重组huCD40-muFc抗原制剂(10μg纯化自表达融合蛋白的经转染的哺乳动物细胞)或转染有人CD40的300-19细胞用于腹膜内或皮下免疫小鼠。将免疫原与RIBI佐剂(Sigma目录号M6536)1：1混合。
将小鼠以5-7天间隔免疫五次。第一和第二次免疫用重组蛋白进行。第三次免疫用细胞进行，第四次免疫用蛋白进行且第五次免疫用细胞进行。将小鼠在最后一次免疫后一周放血以评估抗原特异性效价。通过眶后放血监测免疫应答。使用转染的300-19细胞通过FACS分析筛选血浆，并且将具有最高的针对抗人CD40人IgG效价的小鼠用于融合。小鼠通过静脉内(IV)和腹膜内(IP)注射可溶抗原两天和经转染的细胞三天接受最后加强，随后处死并移除脾。
生产针对人CD40的人单克隆抗体的杂交瘤的产生
将分离自高效价
Figure BDA0003868948590000711
小鼠的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤融合配偶体用基于电场的电融合使用细胞脉冲大室细胞融合电转化仪(Cyto Pulse large chamber cell fusionelectroporator)(Cyto Pulse Sciences,Inc.,Glen Burnie,MD)进行融合。将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与等同数目的P3X63 Ag8.6.53(ATCC CRL 1580)非分泌小鼠骨髓瘤细胞融合(融合体号：2541)。将所得细胞以2.0x 104个细胞/孔铺板于平底微量滴定板的选择性DMEM培养基中，所述培养基含有高葡萄糖(Cellgro#10-013-CM)和10％胎牛血清(Hyclone#SH30071.03)，并补充有β巯基乙醇(1000X,Gibco#21985-023)、7mM HEPES(Cellgro 25-060-Cl)、额外的2mM L-谷氨酰胺(Cellgro 25-005-Cl)、HAT(50X,Sigma#H-0262)、5％杂交瘤克隆因子(BioVeris#210001)、10％P388DI(ATCC#CRL TIB-63)条件培养基和青霉素-链霉素(100x,Cellgro#30-002-CI)。约7天后，将一些含有HAT的培养基用含有HT的培养基(Cellgro#25-047-CI)替换。
10-12天后，使用同质HTRF测定筛选单独孔的人IgG/人κ轻链抗体的存在。在该测定中，将来自96孔融合板的上清液与铕-穴状化合物标记的山羊抗人IgG(Fc片段特异性的)、生物素化的山羊抗人κ轻链(Bethyl#A80-115B)、链霉抗生物素-XLent混合并孵育1小时。将板随后在RUBYstar读数器上阅读。
随后通过FACS使用转染有人CD40的300-19细胞和作为对照的300-19未转染的细胞筛选来自对于人IgG/人κ轻链或人IgG/人λ轻链抗体阳性的孔的杂交瘤细胞。将FACS阳性亲代系转移至24孔板。几天后，将来自单独孔的细胞上清液通过FACS再次筛选以证实对人CD40的IgG特异性。
通过系列稀释克隆杂交瘤并通过FACS再筛选。
实施例3
抗huCD40抗体的人源化
将本发明的亲代(鼠)抗体人源化用于潜在用作人治疗剂。选择每一小鼠可变结构域的最接近匹配的人种系区序列，并且将这些人框架区用于替代抗体的“CDR移植”版本中的鼠框架。额外的氨基酸取代诸如框架回复突变需要时可以随后进行以恢复人源化抗体的结合亲和力。进行进一步的氨基酸取代以消除序列缺陷。本发明抗体的不同形式之间的序列关系提供于表6。各种激动性抗huCD40抗体与可溶人CD40的结合通过生物层干涉法(BLI)分析使用Fortebio Octet RED(快速系统-扩展检测)无标记相互作用分析仪器来测定。所有研究均在25℃下在10mM NaxPO4、130mM NaCl、0.05％表面活性剂P20(pH 7.1)中进行。简言之，将抗huCD40抗体上清液(稀释至10μg/ml或捕获的未稀释的，如果上清液浓度低于10μg/ml)在蛋白A包被的生物传感器(Pall Fortebio#18-5010)上捕获，其使用90s的装载时间和1000rpm的振荡速度。将上清液首先使用180s结合和解离时间以1000rpm且在结合周期之间具有两个使用10mM甘氨酸pH 1.5的15s调节步骤来筛选与1μM重组人CD40单体(huCD40-单体)的结合。在1μM huCD40单体实验中证实结合信号的所有上清液随后测试在三倍稀释系列中与七种不同浓度的huCD40单体的结合，其中取决于在1μM筛选实验中的结合信号的强度，最高浓度为10μM huCD40单体或1μM huCD40单体。所选抗体及其序列变体的结果显示于表6。
表6
抗CD40抗体的结合亲和力
Figure BDA0003868948590000731
/>
Figure BDA0003868948590000741
*＝对于比较目的，当在相同测定中与5F11-45抗体平行运行时，亲代5F11展示出8.2nM(而不是4.7nM)的KD。
对于人源化抗体，VH和VL列提供框架区所基于的人可变结构域种系。“CDR移植”指包含直接移植至所述人框架序列上的未修饰的亲代(小鼠)CDR的可变结构域。表6中所有序列变体的残基编号均根据Kabat，并因此表6中的序列改变的位置不匹配序列表中抗体序列的残基编号。下划线用于指示旨在校正潜在的序列缺陷(即经历化学修饰和可能降解导致产物异质性的残基)的序列修饰。其他序列修饰旨在恢复亲和力，通常为框架回复突变(从人种系框架序列回复为原始鼠框架残基)。抗体5G7的重链中的M69L修饰既是框架回复突变也是缺陷校正。
实施例4
抗CD40抗体表位分箱实验
进行表位分箱实验(binning experiments)以确定哪一抗人CD40抗体与其他抗体竞争结合huCD40，并因此结合相似表位。抗huCD49抗体之间的成对竞争如下测定，其中将参考抗体结合至传感器芯片表面，将测试抗体与huCD40多肽构建体在混合物中预孵育，并且将预孵育的混合物流过传感器芯片上以测定测试抗体干扰huCD40多肽构建体结合芯片表面上的参考抗体的程度。可以使用
Figure BDA0003868948590000742
SPR仪器进行此类竞争实验。简言之，将参考抗huCD40抗体固定在传感器芯片CM5芯片(Series S,GE Healthcare CAT#BR-1005-30)表面、流动室2、流动室3和流动室4(5000RUs)，并且流动室1用作负对照。将测试抗体在起始浓度稀释至120μg/mL(2X)。通过用缓冲液1：3稀释抗体浓度为七个不同浓度以及对照样品(具有0μg/ml)来制备测试抗体的稀释系列以获得滴定曲线。将每一抗体浓度系列分为两个半份。在浓度系列的第一半份中，将40nM(2X)人CD40抗原(例如huCD40/Fc)加入以制备每个孔中的最终浓度序列(60μg/ml–0.0μg/ml)和20nM的最终抗原浓度。在浓度系列的第二半份中，代替抗原，将缓冲液加入以将抗体稀释至相同浓度，并且这一半作为空白处理。
将测试抗CD40抗体和huCD40/Fc的复合物孵育2小时。将40μL复合物以30μL/min注射到参考抗体包被的表面上。使用
Figure BDA0003868948590000751
T200表面等离子共振仪器并且运行缓冲液为HBE-EP,GE Healthcare CAT#BR-1001-88,过滤的,脱气的,0.01M HEPES,pH7.4,0.15NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P20。将表面用25mM NaOH(订购码：BR-1003-58,GEHealthcare)以100μL/min持续5秒再生。使用Microsoft Excel分析数据，其中将抗体浓度针对对应的响应单位作图以获得滴定曲线。/>
本发明的抗CD40抗体的此类表位分箱实验结果提供于图2。抗体5F11和8E8阻断配体(CD40L)结合。本发明的五种抗CD40抗体落入三个表位组-12D6/5G7/19G3、5F11/5G7/19G3和8E8。
实施例5
通过HDX的表位作图
本发明的抗huCD40抗体12D6、5G7、19G3和5F11的表位通过氢/氘交换质谱法(HDX-MS)测定。HDX-MS通过监测骨架酰胺氢原子的氘交换速率和程度来探测溶液中的蛋白构象和构象动力学。Huang和Chen(2014)Anal.Bioanalytical Chem.406:6541；Wei等人(2014)Drug Disc.Today 19:95。HDX的水平取决于骨架酰胺氢原子和蛋白氢键的溶剂可及性。HDX时蛋白的质量增加可以通过MS精确测量。当该技术与酶促消化配对时，肽水平的结构特征可以解析，从而能够区分表面暴露的肽和折叠在内部的那些或在蛋白-蛋白复合物的界面处隔离的那些。通常，进行氘标记和随后的淬火实验，然后是酶促消化、肽分离和MS分析。
表位作图实验之前，进行非氘化实验以产生一系列重组人CD40单体的普通肽(10μM)和CD40与mAb 12D6、5G7、19G3和5F11(1：1摩尔比)的蛋白复合物。在HDX-MS实验中，将5μL的各样品(分别CD40或具有mAb 12D6、5G7、19G3和5F11的CD40)稀释至55μL的D2O缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，D2O,pH7.0)以开始标记反应。将反应进行不同时期：20秒、1分钟、10分钟和240分钟。各标记反应期结束时，通过添加淬灭缓冲液(100mM磷酸盐缓冲液，并具有4MGdnCl和0.4M TCEP,pH 2.5,1:1,v/v)将反应淬灭，并将50μL的淬灭样品注射入WatersHDX-MS系统用于分析。在不存在/存在CD40 mAb的情况下监测普通消化的肽(pepticpeptide)的氘摄取水平。获得序列覆盖率为82％。
抗CD40 mAb 12D6、5G7、19G3和5F11的HDX表位提供于表7中。抗体12D6保护两种肽，其中之一(残基11-28)包括信号序列的部分并因此不可能本身生理学相关，但表明12D6在mAb 5G7和19G3不接触的区域21-28中进行接触。
表7
HDX表位
Figure BDA0003868948590000761
实施例6
通过酵母展示的表位作图
本发明的所选嵌合或人源化抗huCD40抗体的表位如下测定：通过在酵母上展示随机诱变的huCD40细胞外区域变体并基于其无法结合特定抗体将这些酵母分选。将无法结合的所选酵母细胞扩增并进行额外轮次的选择，这基于其无法结合本发明的抗体的特定嵌合或人源化形式。参见例如，Chao等人(2004)J.Mol.Biol.342:539。测定所得酵母的huCD40变体的序列并分析每一残基对抗体结合的作用。本发明的抗体的结合表位测定为在huCD40序列内的基因座，其中单个氨基酸突变破坏与本发明的抗huCD40抗体的结合。
简言之，将易错PCR用于克隆编码人CD40的DNA至构建体中，允许表达huCD40变体作为还包含c-myc标签序列和酵母细胞壁蛋白Agalp的融合蛋白的氨基末端部分。此类构建体当在酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中表达时，在酵母细胞表面上展示出变体huCD40多肽，其通过AgalP多肽锚定到细胞表面。c-myc标签可任选地用作在给定酵母细胞上展示huCD40融合蛋白的正对照。将酵母细胞通过FACS分选，并且将表达为正确折叠的huCD40融合蛋白(如通过经别藻蓝蛋白(APC)标记的山羊抗小鼠IgG二抗检测的对照小鼠抗huCD40抗体的结合所测定的)但不结合本发明的抗体(如通过用藻红蛋白(PE)标记的山羊抗人IgG作为二抗检测所测定的)的那些酵母细胞合并、扩增并且用于后续轮次的选择中。测定来自从几轮选择后剩下的酵母的构建体的huCD40序列。进行无抗huCD40抗体选择的对照实验以证实沿huCD40序列的每一位置处的良好突变体覆盖，并且提供将用所选文库获得的结果标准化的基线。
实施例7
抗CD40抗体的激动剂活性
Fc序列改变对本发明的所选抗Cd40抗体的激动剂活性的影响通过测量未成熟树突细胞(DC)的活化来评估。用具有人IgG1f(对照)、SE、SELF、P238D、V4、V8和V12 Fc序列的抗CD40 mAb 12D6-24构建体进行实验。使用塑料粘附或人CD14-微珠(Miltenyi Biotec)从健康正常供体分离人单核细胞(CD14+)。用100ng/mL GM-CSF(Miltenyi Biotec)和100ng/mL IL-4(Miltenyi Biotec)培养单核细胞。在第2天和第5天将一半培养基去除并补充。在第6-7天收获未成熟树突细胞。将来自两个供体的DC与指定浓度的抗体在37℃下孵育过夜。收集细胞培养上清液并测定人IL-6产生(Cisbio)。参见图3A和3B。
当在最高100nM下使用时，对照人IgG1f抗体不诱导IL-6分泌，并且P238D变体仅弱诱导。相反，SE、SELF、V9和V12变体均显著增强IL-6分泌，且V8和V4展示出中度的作用。这些结果粗略地与对FcγRIIb的结合亲和力相关，并且证实使用合适的Fc序列变体可以导致具有增强的激动剂活性的抗CD40抗体。
此外，在使用具有普通人IgG1f V12恒定结构域的嵌合抗CD40 mAb构建体的实验中评价具有8E8、5G7、12D6、19G3和5F11可变区的抗体之间的激动剂活性中的差异。通过将细胞铺板在96孔板，加入所示抗体并在37℃下孵育过夜来测量体外对未成熟树突细胞(如之前段落中所述分离的)的活化。随后收获细胞并用荧光抗CD54抗体染色，其通过荧光活化的细胞分选(FACS)检测。参见图4。
对照人IgG1f抗体不显著引起CD54上调，而12D6引起显著CD54上调。抗体19G3和8G8有点比12D6效力更低，且抗体5G7和5F11与各个其他抗体类似且展示出相对低的刺激。活化结果不必然与对CD40的结合亲和力关联，因为抗体5F11具有几乎最高的结合亲和力，但仍是弱的激动剂，而抗体19G3正相反。不管差别的原因，这些结果证实使用合适的抗原结合结构域序列对于获得激动剂活性增强的抗CD40抗体是重要的。
实施例8
DG异构化的修复
具有V4和V9 Fc变体序列的本发明的抗体展示在位置D270处DG异构化的不可接受的水平。此类异构化是不期望的，因为其导致产物异质性和可能降低的效力。为了减少此类异构化，V4 Fc的位置270处的天冬氨酸残基改变为谷氨酸(D270E)，且V9 Fc的位置270改变为丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸(D270A、D270E、D270Q、D270S、D270T)。上清液获自表达这些抗体的细胞并且测定与hCD32/FcγRII的结合。将在位置270处没有突变的所选的经纯化抗体用作对照。这些实验对具有来自mAb 12D6-24和5F11-45的可变结构域的抗体进行。结果提供于图5。
对于V4和V9 Fc变体，D270E取代导致受体结合中适度的降低。测试的其他V9 Fc变体(D270A、D270Q、D270S、D270T)导致受体结合中更大的降低。结果不依赖于抗体是否为12D6或5F11。在所有情况中，与测试的这些受体(FcγRIIa-H131、FcγRIIa-R131和FcγRIIb)的相对(等级次序)结合保持相似，且与FcγRIIa-R131和FcγRIIb的结合大概相同，与FcγRIIa-H131的结合显著更弱。
对于V4和V9变体，D270E取代保留可接受的高FcγR亲和力，且保留对FcγRIIb的特异性(这对增强本发明的抗CD40抗体的激动性活性是期望的)。
表8
序列表的概述
Figure BDA0003868948590000781
/>
Figure BDA0003868948590000791
序列表提供成熟重链和轻链的序列(即，序列不包括信号肽)。用于产生本发明抗体的信号序列(例如在人细胞中)提供于SEQ ID NO:78。
等同方案：
在使用不超过常规实验的情况下，本领域技术人员将认识到或能够确定本文公开的具体实施方案的许多等同方案。此类等同方案旨在被以下权利要求书所涵盖。
本申请还涉及以下项：
项1.分离的抗体或其抗原结合部分，其特异性结合人CD40并在交叉阻断测定中与选自以下的一种或多种抗体竞争结合人CD40：12D6(SEQ ID NO:3和4)、5F11(SEQ ID NO:23和24)、8E8(SEQ ID NO:40和41)、5G7(SEQ ID NO:52和53)和19G3(SEQ ID NO:58和59)。项2.项1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中交叉阻断测定中的所述竞争包括当以与所选抗体相等的摩尔浓度使用时，降低所选抗体在竞争ELISA中与人CD40的结合至少20％的能力。
项3.分离的抗体或其抗原结合部分，其在以下处特异性结合人CD40：
a.包含以下序列或由以下序列组成的表位：EPPTACREKQYLINS(SEQ ID NO:1的残基21-35)(抗体12D6、5G7和19G3)；或
b.包含以下序列或由以下序列组成的表位：ECLPCGESE(SEQ ID NO:1的残基58-66)(抗体5F11)。
项4.特异性结合人CD40的分离的抗体或其抗原结合部分，其包含：
a)至少部分来源自鼠V区种系VH1-39_01和J区种系IGHJ4的重链CDR序列和至少部分来源自鼠V区种系VK1-110_01和J区种系IGKJ1的轻链CDR序列(12D6)；
b)至少部分来源自鼠V区种系VH1-4_02和J区种系IGHJ3的重链CDR序列和至少部分来源自鼠V区种系VK3-5_01和J区种系IGKJ5的轻链CDR序列(5F11)；
c)至少部分来源自鼠V区种系VH1-80_01和J区种系IGHJ2的重链CDR序列和至少部分来源自鼠V区种系VK1-110_01和J区种系IGKJ2的轻链CDR序列(8E8)；
d)至少部分来源自鼠V区种系VH1-18_01和J区种系IGHJ4的重链CDR序列和至少部分来源自鼠V区种系VK10-96_01和J区种系IGKJ2的轻链CDR序列(5G7)；或
e)至少部分来源自鼠V区种系VH5-9-4_01和J区种系IGHJ3的重链CDR序列和至少部分来源自鼠V区种系VK1-117_01和J区种系IGKJ2的轻链CDR序列(19G3)。
项5.项1的分离的抗体或其抗原结合部分，其包含重链和轻链，其中所述重链包含选自以下的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列且所述轻链包含选自以下的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列：
a)抗体12D6-03的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:5的残基31-35、50-66和99-108，且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:6的残基24-39、55-61和94-102；
b)抗体12D6-22的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:7的残基31-35、50-66和99-108，且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:9的残基24-39、55-61和94-102；
c)抗体12D6-23的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:10的残基31-35、50-66和99-108，且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:11的残基24-39、55-61和94-102；
d)抗体12D6-24的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:12的残基31-35、50-66和99-108，且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:9的残基24-39、55-61和94-102；
e)抗体5F11-17的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:25的残基31-35、50-66和99-106，且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:26的残基24-38、54-60和93-101；
f)抗体5F11-23的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:27的残基31-35、50-66和99-106，且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:28的残基24-38、54-60和93-101；
g)抗体5F11-45的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:29的残基31-35、50-66和99-106，且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:30的残基24-38、54-60和93-101；
h)抗体8E8-56的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:42的残基31-35、50-66和99-111，且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:43的残基24-39、55-61和94-102；
i)抗体8E8-62的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:44的残基31-35、50-66和99-111，且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:45的残基24-39、55-61和94-102；
j)抗体8E8-67的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:46的残基31-35、50-66和99-111，且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:47的残基24-39、55-61和94-102；
k)抗体8E8-70的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:48的残基31-35、50-66和99-111，且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:49的残基24-39、55-61和94-102；
l)抗体8E8-71的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:50的残基31-35、50-66和99-111，且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:51的残基24-39、55-61和94-102；
m)抗体5G7-22的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:54的残基31-35、50-66和99-102，且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:55的残基24-34、50-56和89-97；
n)抗体5G7-25的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:56的残基31-35、50-66和99-102，且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:57的残基24-34、50-56和89-97；
o)抗体19G3-11的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:60的残基31-35、50-66和99-101，且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:62的残基24-39、55-61和94-102；和
p)抗体19G3-22的CDR，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3分别包含SEQ ID NO:63的残基31-35、50-66和99-101，且CDRL1、CDRL2和CDRL3分别包含SEQ ID NO:64的残基24-39、55-61和94-102。
项6.项5的抗体，其包含选自以下的重链和轻链可变结构域序列：
a)抗体12D6-03的重链和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的残基1-119和1-112；
b)抗体12D6-22的重链和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的残基1-119和1-112；
c)抗体12D6-23的重链和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的残基1-119和1-112；
d)抗体12D6-24的重链和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:9的残基1-119和1-112；
e)抗体5F11-17的重链和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的残基1-117和1-111；
f)抗体5F11-23的重链和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的残基1-117和1-111；
g)抗体5F11-45的重链和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的残基1-117和1-111；
h)抗体8E8-56的重链和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43的残基1-122和1-112；
i)抗体8E8-62的重链和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45的残基1-122和1-112；
j)抗体8E8-67的重链和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47的残基1-122和1-112；
k)抗体8E8-70的重链和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:49的残基1-122和1-112；
l)抗体8E8-71的重链和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51的残基1-122和1-112；
m)抗体5G7-22的重链和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55的残基1-113和1-107；
n)抗体5G7-25的重链和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57的残基1-113和1-107；
o)抗体19G3-11的重链和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:62的残基1-112和1-112；和
p)抗体19G3-22的重链和轻链可变区，其分别包含SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的残基1-112和1-112。
项7.核酸，其编码项1-6中任一项的抗体或其抗原结合部分的重链和/或轻链可变区。
项8.表达载体，其包含项7的核酸分子。
项9.细胞，其转化有项8的表达载体。
项10.制备抗人CD40抗体或其抗原结合部分的方法，其包括：
a)在项9的细胞中表达抗体或其抗原结合部分；和
b)从所述细胞分离所述抗体或其抗原结合部分。
项11.药物组合物，其包含：
a)项1-6中任一项的抗体或其抗原结合部分；和
b)载体。
项12.在主体中刺激免疫应答的方法，其包括向所述主体施用项11的药物组合物。
项13.项12的方法，其中所述主体具有肿瘤并且刺激针对肿瘤的免疫应答。
项14.项12的方法，其中所述主体具有慢性病毒感染并且刺激针对病毒感染的免疫应答。
项15.治疗癌症的方法，其包括向有其需要的主体施用治疗有效量的项11的药物组合物。项16.项15的方法，其中所述癌症选自：膀胱癌、乳腺癌、子宫/子宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、食道癌、胃肠癌、胰腺癌、结直肠癌、结肠癌、肾癌、头颈部癌、肺癌、胃癌、生殖细胞癌、骨癌、肝癌、甲状腺癌、皮肤癌、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤和病毒相关的癌症。
项17.治疗慢性病毒感染的方法，其包括向有其需要的主体施用治疗有效量的项11的药物组合物。

Claims (8)

1.分离的抗体或其抗原结合部分，其特异性结合人CD40，其包含抗体5F11-45的重链和轻链，其中：
a)所述重链包含CDRH1、CDRH2和CDRH3序列，CDRH1序列由SEQ ID NO:29的残基31-35组成，CDRH2序列由SEQ ID NO:29的残基50-66组成，CDRH3序列由SEQ ID NO:29的残基99-106组成，且
b)所述轻链包含CDRL1、CDRL2和CDRL3序列，CDRL1序列由SEQ ID NO:30的残基24-38组成，CDRL2序列由SEQ ID NO:30的残基54-60组成，CDRL3序列由SEQ ID NO:30的残基93-101组成。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其包含抗体5F11-45的重链和轻链可变结构域序列，其分别由SEQ ID NO:29的残基1-117和SEQ ID NO:30的残基1-111组成。
3.核酸，其编码权利要求2的抗体或其抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区。
4.表达载体，其包含权利要求3的核酸分子。
5.细胞，其转化有权利要求4的表达载体。
6.制备抗人CD40抗体或其抗原结合部分的方法，其包括：
a)在权利要求5的细胞中表达抗体或其抗原结合部分；和
b)从所述细胞分离所述抗体或其抗原结合部分。
7.药物组合物，其包含：
a)权利要求1的抗体或其抗原结合部分；和
b)载体。
8.药物组合物，其包含：
a)权利要求2的抗体或其抗原结合部分；和
b)载体。
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