CN101469019B

CN101469019B - 细胞膜蛋白derlin-1及其制备和用途

Info

Publication number: CN101469019B
Application number: CN 200710160196
Authority: CN
Inventors: 杨治华; 冉宇靓; 胡海
Original assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Current assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Priority date: 2007-12-26
Filing date: 2007-12-26
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2027-12-26
Also published as: CN101469019A

Abstract

本发明涉及新的人肿瘤抗原细胞膜蛋白DERLRN-1以及其在筛选和/或制备用于治疗和/或诊断肿瘤的药物中的用途。其中，DERLIN-1蛋白作为新的肿瘤治疗靶蛋白，其特征在于其作为肿瘤诊断和/或治疗中的靶蛋白的高效性以及特异性。

Description

细胞膜蛋白DERLIN-1及其制备和用途

技术领域

本发明涉及新的人肿瘤抗原细胞膜蛋白DERLIN-1、其结合配体以及它们在筛选和/或制备用于治疗和/或诊断肿瘤的药物中的用途。

背景技术

肿瘤是人类最常见的疾病之一，其死亡率在世界和我国的各种疾病中分别排在第二位和第三位，严重影响着人类的健康。在我国随着社会的发展，肿瘤的发病率还在逐年上升。我国目前有肿瘤患者约450万人，死亡率在30％以上，而且每年新增的患者人数高达200万人以上。有效地医治肿瘤已是科学研究中的当务之急。临床治疗肿瘤的方法主要是手术切除和放、化疗，但是，放、化疗在杀死癌细胞的同时，给人体正常细胞也带来了严重的损伤。此外，目前治疗恶性肿瘤的手术，放疗，化疗三大常规治疗手段并没有明显的降低肿瘤的死亡率，其5年生存率仅达10-30％，因此全世界各国均在始终不懈的探索，力图寻找出更有效的治疗手段。随着对肿瘤研究的不断深入，人们开始尝试采用生物方法针对肿瘤发展进程中的不同层面进行治疗并且已经取得了一定效果，肿瘤的生物靶向治疗必将成为最有前景和最活跃的领域。

肿瘤的靶向治疗很重要，“靶向”是肿瘤治疗中必须遵守的原则，高效、准确地命中肿瘤这个“靶”，实现有的放矢是肿瘤治疗的关键所在。因此，找到高效、特异的靶点是肿瘤生物靶向治疗的关键。目前，已经公开报道了一些肿瘤治疗靶点，它们或者参与了肿瘤的生长过程，或者在肿瘤的转移、耐药性的诱导的过程中发挥作用，并且针对所述的靶点也设计了一些新的药物，例如针对CD20分子的抗体类抗淋巴瘤靶向药物Rituxan，针对EGFR的小分子化合物类抗肺癌靶向药物Iressa。但是，目前开发的抗肿瘤药物对临床的需要来说仍然是远远不够的，因此仍然亟需发展更多的抗体类抗肿瘤药物。

现有技术中显示DERLIN-1是位于细胞内质网膜上的蛋白，它参与了内质网内部错误折叠蛋白向胞浆中转运的过程(Yihong Yel，Yoko Shibata1，Chi Yun2，David Ron2 & Tom A.Rapoport1.Amembrane protein complex mediates retro-translocation from the ERlumen into the cytosol NATURE.2004；(429)：841-847)。由于人们仅仅发现DERLIN-1位于内质网膜，且没有如上所述肿瘤靶标方面的研究，因此目前本领域均认为该蛋白不能用作肿瘤治疗的靶点。

发明内容

本发明基于以下新发现：DERLIN-1位于肿瘤的细胞膜上，并且参与肿瘤的生长过程，因此可以作为肿瘤诊断和/或治疗中的靶点。

一方面，本发明涉及细胞膜蛋白形式的DERLIN-1及其制备，其中DERLIN-1蛋白的序列为SEQ ID NO：1。

另一方面，本发明涉及细胞膜DERLIN-1蛋白作为新的肿瘤诊断和/或治疗靶点的用途。具体地，本发明的细胞膜DERLIN-1蛋白可以作为肿瘤靶蛋白用来筛选用于治疗肿瘤的药物。

本发明还涉及DERLIN-1蛋白结合配体，其在制备肿瘤诊断剂和/或治疗药物中的用途，以及包含抗DERLIN-1蛋白的单克隆抗体的肿瘤诊断剂和/或治疗药物。具体地，所述DERLIN-1蛋白结合配体是抗DERLIN-1蛋白的单克隆抗体，其可获自稳定分泌抗DERLIN-1单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆HEC252/9F12，所述杂交瘤细胞于2007年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.2242。

此外，本发明还涉及利用DERLIN-1蛋白结合配体诊断和/或治疗肿瘤的方法。

附图说明

图1显示DERLIN-1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。

图2显示用DERLIN-1蛋白多克隆抗体通过免疫组化方法检测肿瘤组织及配对的癌旁正常组织中DERLIN-1蛋白表达情况。

图3和4分别显示用活细胞免疫荧光法检测肿瘤细胞和正常永生化细胞中DERLIN-1蛋白基因的亚细胞定位的结果。

图5显示用激光共聚焦法检测DERLIN-1蛋白在肿瘤细胞膜表面的表达的结果。

图6显示用DERLIN-1蛋白多克隆抗体通过免疫组化方法检测正常人体组织中DERLIN-1蛋白表达情况。

图7是DERLIN-1蛋白多克隆抗体体内分布实验，显示DERLIN-1蛋白特异分布于肿瘤细胞表面，而不在正常组织细胞表面

图8是DERLIN-1蛋白单克隆抗体体内显影的分子影像学实验，靶向DERLIN-1蛋白的抗体在荷瘤小鼠的显像可以确定肿瘤的部位及大小。

具体实施方式

根据本发明的第一个方面，本发明涉及细胞膜DERLIN-1蛋白(SEQ ID NO：1)及其制备，例如可通过重组方法进行制备。一个优选的实施方案中，细胞膜DERLIN-1蛋白通过如下方法制备并纯化：

(1)构建derlin-1基因的cDNA的表达序列；

(2)将所述cDNA克隆入表达载体，并将所述表达载体转入原核细胞或真核细胞中；

(3)使DERLIN-1蛋白在所述的宿主细胞中表达；

(4)纯化所表达的DERLIN-1蛋白。

其中，所述表达载体优选pET-30b载体或其他真核载体。所述宿主细胞是本领域常用的原核或真核宿主细胞，优选原核宿主细胞，例如BL21E3细菌，中国仓鼠卵巢癌细胞CHO。所述的蛋白的纯化方法可采用本领域常规的方法，例如参见Novagen公司编写的pET系统操作手册。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及细胞膜DERLIN-1蛋白作为新的肿瘤诊断和/或治疗靶点的用途。具体地，本发明的细胞膜DERLIN-1蛋白可以作为肿瘤靶蛋白筛选用于诊断或治疗肿瘤的药物。筛选药物的方法可以利用本领域技术人员已知的筛选方法，例如参见“开发小肽，筛选新药”，王克夷等，中国生化药物杂志2003年第24卷第1期，48-50页；“噬菌体随机肽库的应用”，免疫学杂志2000年第5期第16卷，李华朱锡华等；“小分子活性肽筛选方法”，生命的化学》2004年24卷1期，第16-18页，罗以勤，王梁华，焦炳华等。根据本发明上述筛选方法得到的抗肿瘤药物可以是例如单克隆抗体，或者与DERLIN-1蛋白结合的其他类型的分子，如多肽或其他小分子药物等。此外，可以将一些治疗性物质偶联于与细胞膜DERLIN-1蛋白具有高亲和力的靶向药物上以达到治疗的效果，如将放射性核素偶联于抗DERLIN-1蛋白单克隆抗体上。

根据本发明的又一方面，本发明涉及DERLIN-1蛋白结合配体，在一个实施方案中，所述DERLIN-1蛋白结合配体是抗DERLIN-1蛋白的单克隆抗体。本发明术语“DERLIN-1蛋白结合配体”与本领域技术人员通常理解的那样，意指能与DERLIN-1蛋白高效特异性结合的配体分子，包括例如单克隆抗体、多肽或者小分子化合物等肿瘤靶向药物。在一个实施方案中，所述DERLIN-1蛋白结合配体是单克隆抗体，其可获自稳定分泌抗DERLIN-1单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆HEC252/9F12，所述杂交瘤细胞于2007年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.2242。

在一个实施方案中，所述的单克隆抗体的制备和纯化包括如下步骤：

(1)用通过本发明所述方法制备并纯化的DERLIN-1蛋白免疫动物，获得免疫血清；

(2)利用间接ELISA测定免疫血清中抗DERLIN-1蛋白抗体的滴度；

(3)收集其中所述抗体的滴度达到10⁸以上的免疫血清；

(4)通过亲和层析法纯化所得的免疫血清。

其中所述的动物为哺乳动物，包括例如鼠、猴、兔、马、牛、羊、猪、人等。

根据本发明的一个优选的方面，本发明的DERLIN-1蛋白结合配体可用于制备肿瘤的治疗药物。在一个优选实施方案中，所述DERLIN-1蛋白结合配体是本发明的单克隆抗体，具体可为保藏号CGMCC No.2242的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。所述的单克隆抗体也可以包含在药物组合物中。所述组合物可包含治疗有效量的DERLIN-1蛋白单克隆抗体及其他治疗性药物，从而提高治疗效果。治疗效果的提高可体现为使得达到相同的治疗效果所用的DERLIN-1蛋白单克隆抗体或其他治疗性药物的剂量更少或将DERLIN-1蛋白单克隆抗体与其他治疗性药物组合后可以得到更好的肿瘤抑制效果。本发明所述药物组合物可用于治疗肿瘤，在一个优选实施方案中，所述肿瘤是胰腺癌。在另一个优选实施方案中，所述肿瘤是结肠癌。本发明所述的组合物还可以用于其他高表达DERLIN-1蛋白肿瘤的治疗，包括：卵巢癌、乳腺癌、皮肤癌、肝癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌，肺癌、子宫癌、前列腺癌、脑癌、胸腺癌、胃肠道肿瘤等。所述组合物可以通过常规给药途径给予受试者。所述的给药途径例如经胃肠外给药，例如经静脉、经输注、口服等。

在另一优选的方面中，本发明涉及用DERLIN-1蛋白结合配体进行肿瘤诊断。将包含DERLIN-1蛋白结合配体的药物导入人体后，由于DERLIN-1蛋白特异的高表达于肿瘤细胞膜，因此药物能与肿瘤细胞结合而不与正常细胞结合，因此通过分析药物在体内的滞留部位即可知道肿瘤的分布，大小等信息，即分子显影。在一个实施方案中，将DERLIN-1蛋白单克隆抗体标记¹²⁵I后能够短时间内清楚的显示实验动物体内的肿瘤影像。

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限定。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。

实施例

实施例1：新的人肿瘤抗原DERLIN-1的制备

按照现有技术(分子克隆第三版)，克隆DERLIN-1基因的cDNA编码序列，并将其构建在表达载体PET-30b(购自Novagen公司)上，在BL21E3细菌(购自北京全事金生物技术有限公司)中表达DERLIN-1蛋白。

表达得到的DERLIN-1蛋白氨基酸序列如下：(SEQ ID NO：1)

H2N-MSDIGDWFRSIPAITRYWFAATVAVPLVGKLGLISPAYLFL

WPEAFLYRFQIWRPITATFYFPVGPGTGFLYLVNLYFLYQYSTRLET

GAFDGRPADYLFMLLFNWICIVITGLAMDMQLLMIPLIMSVLYVW

AQLNRDMIVSFWFGTRFKACYLPWVILGFNYIIGGSVINELIGNLV

GHLYFFLMFRYPMDLGGRNFLSTPQFLYRWLPSRRGGVSGFGVPP

ASMRRAADQNGGGGRHNWGQGFRLGDQ-COOH

实施例2 DERLIN-1蛋白多克隆抗体的制备

采用实施例1中表达的DERLIN-1蛋白免疫家兔(新西兰兔，购置维通利华公司)制备抗DERLIN-1蛋白多克隆抗体。具体步骤如下：免疫前自兔耳缘静脉取血备检。第一次免疫：DERLIN-1蛋白与弗氏完全佐剂按1∶1的比例充分混匀后经皮内注射免疫家兔，每只注射200μg DERLIN-1蛋白的KLH偶联物。第二次免疫：第一次免疫后14天，取200μg DERLIN-1蛋白与弗氏不完全佐剂充分混匀后再次经皮内注射免疫家兔。注射卡介苗：第二次免疫后5天，按每只兔子50mg卡介苗(购自北京市生物制品研究所)的剂量经趾皮下多点注射免疫家兔，以进一步激活家兔免疫系统。第三次免疫：自注射卡介苗之日算起10天后，按每只兔子200μgDERLIN-1蛋白的剂量与弗氏不完全佐剂充分混匀后皮内注射免疫家兔。效价测定：第三次免疫后10天自兔耳缘静脉取血，以测定免疫血清的抗体滴度。当免疫血清中目标抗体的滴度达到10⁸以上时，自兔颈动脉取血，并置于直径为180mm的干净平皿中，4℃过夜。次日，离心分离血清.用偶联有DERLIN-1蛋白的亲和层析柱(参照美国安玛西亚公司产品CNBr-activated Sepharose4B使用说明书制备)纯化了得到的免疫兔血清，从中分离出只与DERLIN-1蛋白结合的抗体。所得的多克隆抗体为纯化的多克隆抗体，用于以下的实验中。

实施例3 DERLIN-1蛋白在多种肿瘤组织中表达的检测

1.免疫组化法

石蜡包埋的肿瘤组织(肿瘤组织标本采集于中国医学科学院肿瘤医院)进行常规石蜡切片，经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。3％过氧化氢室温10min，阻断内源性过氧化物酶的活性。切片在枸橼酸缓冲液(0.01M，pH6.0)中用微波加热法进行抗原修复。用10％正常山羊血清(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)室温封闭30min。弃封闭液，加入1μg/ml的抗DERLIN-1蛋白多克隆抗体，4℃孵育过夜。然后用PBS洗3遍，每遍5min。加入适当浓度生物素标记的羊抗兔二抗室温孵育30min。然后PBS洗3遍，每遍5min，加入HRP标记的链霉卵白素(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育30min。DAB染色，苏木素复染，封片。设正常兔IgG为阴性对照。显微镜下观察结果。在胰腺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌中，DERLIN-1蛋白的表达明显高于对应的正常组织，且可见一定程度的细胞膜表达，而在正常组织中弱表达的DERLIN-1不在正常细胞的细胞膜表达(图2)。另外通过免疫组化还发现在肺癌中DERLIN-1表达明显高于对应正常组织，且也见DERLIN-1蛋白表达于肿瘤细胞膜(图2)。

2.活细胞免疫荧光和激光共聚焦检测法

应用实施例2中制备的DERLIN-1蛋白多克隆抗体检测了DERLIN-1基因在正常细胞和肿瘤细胞中的表达的亚细胞定位。用活细胞免疫荧光和激光共聚焦研究了DERLIN-1蛋白在细胞膜的表达情况。通过上述实验，发明人发现，DERLIN-1蛋白在卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞系、胰腺癌细胞、肺癌细胞的细胞膜上表达，不在永生化细胞的细胞膜上表达。

通过活细胞免疫荧光法检测

细胞在存活时具有完整的细胞膜，抗体大分子不能直接透过细胞膜而进入到细胞中，而仅能与位于细胞膜外膜面的蛋白分子的表位反应，而用于对照的抗α-微管蛋白抗体不能与活细胞膜呈阳性反应，仅当细胞不完整时抗α-微管蛋白抗体能进入细胞与细胞内的α-微管蛋白反应。因此以抗α-微管蛋白抗体为阴性对照可反映细胞膜的完整性，而抗DERLIN-1蛋白抗体的活细胞免疫荧光研究阳性结果则显示DERLIN-1蛋白位于细胞外膜面。具体的活细胞免疫荧光实验步骤如下：

将肿瘤细胞(人胰腺癌细胞SuitII，购自中国医学科学院基础医学研究所)接种于培养皿，培养至70％满。将肿瘤细胞轻轻从培养皿中刮下，细胞用PBS洗涤一次，再用含10％马血清(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)的PBS室温封闭，之后加入实施例2制备的抗DERLIN-1蛋白兔多抗(1μg/ml)和鼠抗α-微管蛋白抗体(sigma，稀释1∶1000)室温孵育1h，洗涤后加入Cy3标记的羊抗兔IgG(美国Jackson免疫实验公司)和Cy2标记的羊抗小鼠IgG(美国Jackson免疫实验公司)，室温孵育30min，PBS洗涤，用含10μg/mlDAPI(美国SIGMA公司)和50％甘油的PBS覆盖细胞，将细胞封闭于载波片上，在荧光显微镜下观察。

胰腺癌SuitII的活细胞免疫荧光为阳性表明DERLIN-1蛋白表达于细胞外膜面(图3)，而正常永生化细胞HEK293活细胞免疫荧光为阴性，表明DERLIN-1蛋白不表达于细胞外膜面(图4)。

通过激光共聚焦法检测DERLIN-1蛋白在肿瘤细胞膜表面的表达

将上述的用活细胞免疫荧光检测的细胞置于激光共聚焦显微镜下进行观察，通过激光共聚焦法检测DERLIN-1蛋白在胰腺癌细胞膜表面的表达。结果显示：免疫荧光在胰腺癌SuitII活细胞膜表面呈典型的环状膜表达，如图5所示。另外，在结肠癌细胞系HCT116，Ls180，Sw116(购自中国医学科学院基础医学研究所)等细胞中也能观察到DERLIN-1蛋白表达于细胞外膜面(图5)。

实施例4 DERLIN-1基因在人多种正常组织中的表达谱

用实施例2中制备的纯化的DERLIN-1蛋白多克隆抗体检测了DERLIN-1基因在多种人体正常组织中的表达情况。正常组织中，DERLIN-1在十二指肠、睾丸、肝中均有表达，表达阳性率分别为75％、60％、63.2％(图6)。其中多种组织中的表达情况总结如表1。DERLIN-1虽然在这些正常组织中表达，表达强度明显较肿瘤组弱，且不见细胞膜表达。

表1 DERLIN-1在人体各种正常组织中的表达

类型	检测例数	阳性例数	阳性率(％)
				十二指肠睾丸肝胰腺胃食管子宫肺结直肠乳腺前列腺小肠脾肾淋巴结皮肤脑骨髓胸腺卵巢甲状腺	8519172222832231275555555552	6312433132001111100000	756063.223.513.613.612.59.48.700202020202000000

实施例5 利用免疫荧光法检测DERLIN-1蛋白细胞在多种人肿瘤细胞和正常细胞的细胞膜和细胞浆中的表达谱

利用实施例2制备的抗体，通过活细胞免疫荧光和固定细胞免疫荧光的办法(胡海，冉宇靓，陈立钊，遇珑，孙立新，杨治华采用抗体库技术筛选抑制肺癌的功能性抗体肿瘤防治研究200736(6)：395-8)，我们研究了DERLIN-1蛋白在多种人肿瘤细胞和正常细胞膜和细胞浆中的表达。

活细胞免疫荧光的方法参见实施例3，固定细胞免疫荧光的方法如下：按4×10³/孔将如表2中所列的肿瘤细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所)接种入96孔细胞培养板(美国Axygen公司产品)培养。细胞汇合后以PBS洗三遍，用丙酮/甲醇(acetone/methanol)(1∶1)室温下固定10min。用3％过氧化氢(hydrogen peroxide)作用10min以灭活内源性过氧化物酶，用10％正常马血清(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)作用10min以阻断非特异结合位点。抗DERLIN-1蛋白多克隆抗体(1μg/ml)与细胞在室温下孵育1h，以PBS洗三遍。用5μg/ml生物素标记的马抗小鼠IgG(美国Jackson免疫实验公司)(biotinylatedhorse anti-mouse IgG)作用30min后以以PBS洗三遍，用Cy3标记的Aviding(美国Jackson免疫实验公司)(1μg/ml)作用30min，PBS洗三遍。加入含有10μg/mlDAPI(美国SIGMA公司)的50％的甘油/PBS作用10min。

实验结果总结在表2中。从表中我们可以发现，在正常的永生化细胞如HEK293中，DERLIN-1蛋白仅表达于细胞浆，一般不表达于细胞膜，而在肿瘤细胞中DERLIN-1蛋白在细胞膜有一定阳性比例的表达，其阳性率从100％到18％不等，在检测的细胞中以卵巢癌细胞系SKOV3最高达98％，乳腺癌细胞系MDA-MB-453次之约90％，结肠癌细胞系LS180约70％，胰腺癌细胞SuitII约50％左右。

表2 DERLIN-1在各种细胞中的表达情况

细胞类型	细胞膜表达	阳性率	细胞浆表达	阳性率
					SKOV3(卵巢癌细胞)MDA-MB-453(乳腺癌细胞)	++++	9890	++++	100100

LS180(结肠癌细胞)SuitII(胰腺癌)ASPC1(胰腺癌)PANC1(胰腺癌)HEK293

+++++++-

705032180

+++++++++++++++

100100100100100

实施例6 DERLIN-1蛋白在肿瘤病人血清中的表达

利用Western方法检测10例结肠癌患者血清，每例结肠癌上样约5μl，同时以结肠癌细胞Ls180(中国医学科学院基础医学研究所)中提取的蛋白上样10μg作为阳性对照。结果，所有肿瘤病人血清中不能检测到DERLIN-1蛋白的表达，而Ls180细胞中能够检测到DERLIN-1的表达。由于Western检测敏感性达纳克级，因此可以推断，结肠癌患者血清中DERLIN-1含量低于每毫升1μg。采用同样的方法，我们还检测了肝癌、胰腺癌、胃癌、肺腺癌、肺鳞癌、食管癌、前列腺癌和乳癌患者血清中DERLIN-1蛋白的含量。通过上述实验，本发明人发现，DERLIN-1在肝癌、胰腺癌、胃癌、肺腺癌、肺鳞癌、食管癌、前列腺癌和乳癌患者血清中均不能被检测到，推测其含量均低于每毫升1μg。

实施例7 DERLIN-1蛋白的体内分布实验

已有研究表明人DERLIN-1蛋白与小鼠DERLIN-1蛋白具有98％的同一性并且DERLIN-1的C末端在物种间完全保守。如预期那样，抗DERLIN-1蛋白抗体也识别小鼠DERLIN-1。因此，荷有人源肿瘤的小鼠可以看作人的同源基因模型，用来检测DERLIN-1蛋白在体内作为肿瘤治疗靶点的能力。将¹²⁵I-放射标记的实施例2制备的抗DERLIN-1蛋白多克隆兔抗体经静脉内给药于荷有LS-180人结肠癌细胞系移植瘤的裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。给药后第1，3，5和7天处死小鼠，用于分析注射的剂量每克的百分比(％ID/g)以及肿瘤∶正常组织比(T/NT)。肿瘤中的％ID/g增加而所有正常器官和血液中的％ID/g随时间降低。注射后7天，所有观察到的器官中的％ID/g明显低于肿瘤中的情况(图7A)。T/NT也指示体内抗DERLIN-1蛋白多克隆兔抗体能够特异性免疫靶向肿瘤，因为这些值在七天中持续增加(图7B)。将正常兔IgG用125I-放射标记后作为对照用IgG于所述分析。所有观察的器官中的％ID/g包括肿瘤中的情况，随时间减小。从未免疫过的新西兰兔(购买于北京维通利华实验动物技术有限公司)血清中纯化获得对照IgG。将¹²⁵I-放射标记的对照IgG的T/NT不随时间增加；表明使用正常兔IgG不能特异的靶向肿瘤细胞。这些体内研究表明DERLIN-1蛋白能够作为肿瘤靶向治疗的靶，靶向DERLIN-1蛋白的选择性亲和DERLIN-1蛋白的药物如抗体等能够在活体内特异地聚积于肿瘤局部。

实施例8 DERLIN-1蛋白单克隆抗体的制备

采用实施例1得到100μg人肿瘤抗原蛋白DERLIN-1，混合完全弗氏佐剂皮下免疫BALB/C小鼠(5-6周龄的雌性BALB/c裸小鼠(nu/nu)，购于维通利华生物公司，清洁饲养于中国协和医科大学实验动物研究所)，4周后采用50μg抗原蛋白混合完全弗氏佐剂腹腔加强免疫，4周后再次采用50μg抗原蛋白混合完全弗氏佐剂腹腔加强免疫，总共3次加强免疫。10天后，利用间接ELISA法测定免疫血清抗体滴度，测定所述抗体的效价＞1∶10⁶。处死动物，收集脾组织，使其通过100目的筛网分离为单细胞。采用50％的PEG促融合法将500万脾细胞与100万SP2/0细胞(购自ATCC)融合，融合后采用HAT培养基对杂交瘤细胞进行筛选培养。培养1周后采用人肿瘤抗原蛋白DERLIN-1包被的ELISA进行筛选，对阳性克隆连续进行亚克隆，筛选稳定分泌特异抗体的克隆，从而获得了稳定分泌抗DERLIN-1单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆HEC252/9F12，其于2007年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.2242。

实施例9：抗DERLINDERLIN-1蛋白单克隆抗体HEC252/9F12的衍生物的制备

核素-抗体偶联物的制备

(1)¹⁸⁸Re标记的HEC252/9F12单抗

SnCl2直接还原法(杨志，刘元方，王祥云，吴永慧，王东琪，范莉。¹⁸⁸Re直接法标记抗人结肠癌单克隆抗体CL-3的研究。同位素2000年，第02期，13卷，83-87页)标记抗DERLIN-1蛋白单克隆抗体HEC252/9F12，立即通过快速薄层层析(ITLC)测定抗体的标记效率及放化纯度。标记后，ITLC实验表明：¹⁸⁸Re-抗体标记率为90％，放化纯度大于95％。¹⁸⁸Re-抗体比活为356MBq/mg。ELISA测得¹⁸⁸Re-抗体免疫活性为65％。标记抗体的体外稳定性实验表明，抗体在37℃孵育24小时，无论是在生理盐水还是人血清白蛋白中，放射性脱落都小于5％，示其在体外稳定。

(2)¹³¹I标记的HEC252/9F12单抗

氯胺T法(Fraker，P.J.，and Speck，J.C.，Jr.1978.Protein and cellmembrane iodinations with a sparingly soluble chloroamide，1，3，4，6-tetrachloro-3a，6a-diphrenylglycoluril.Biochem Biophys ResCommun 80：849-857.)标记抗DERLIN-1蛋白单克隆抗体HEC252/9F12，立即快速薄层层析(ITLC)测定抗体的标记效率及放化纯度。标记后，ITLC实验表明¹³¹I-抗体标记率为90％，放化纯度大于95％。¹³¹I-抗体比活为74MBq/mg，ELISA测得¹³¹I-抗体免疫活性67.3％。

纳米磁性颗粒-HEC252/9F12单抗偶联物的制备

以纯水将直径约20-50nm的铁氧化物磁性颗粒(中科院化学所提供)超声分散，形成胶体状。按0.2g纳米磁性颗粒加入16mg抗DERLIN-1蛋白单克隆抗体HEC252/9F12的比例加入溶于纯水的所述抗体，迅速搅拌混合，5min后加入终浓度为1％的BSA，离心并采用1％的BSA洗涤后备用。

实施例10：采用HEC252/9F12抗体对肿瘤进行治疗

取荷人结肠癌裸小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)24只，测量并计算肿瘤体积后，按肿瘤体积随机分为3组，每组8只。第一组为PBS对照组，每只腹腔注射200μlPBS；第二组为正常鼠IgG对照组，每只腹腔注射0.2mg正常小鼠IgG(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)；第三组为HEC252/9F12单克隆抗体治疗组，每只腹腔注射0.2mg HEC252/9F12单克隆抗体。每两天给药一次，治疗后10次后，处死动物，分离肿瘤，称取肿瘤重量，计算抑瘤率，抑瘤率＝(对照组瘤重量-治疗组瘤重量)/对照组瘤重量×100％。显著性检验采用t检验。

结果PBS组瘤重1.62±0.81g，正常小鼠IgG对照组瘤重1.53±0.67g，HEC252/9F12单克隆抗体治疗组瘤重0.84±0.21g，HEC252/9F12单克隆抗体的抑瘤率为45.1％，P值小于0.01。这些结果显示HEC252/9F12单克隆抗体在免疫导向治疗结肠癌中有重要的应用价值。

实施例11：抗DERLIN-1抗体治疗肿瘤无明显副作用

携带LS180人结肠癌异种移植物的裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)用DERLIN-1靶向型抗体包括抗-DERLIN-1多克隆兔抗体和HEC252/9F12单克隆抗体进行治疗。用抗-DERLIN-1多克隆兔抗体或HEC252/9F12治疗后平均肿瘤体积明显低于用正常兔抗体或PBS的对照中的情况(参照实施例10)。在完成上述治疗后对器官，包括心、肺、肾、和肠进行病理学分析。在治疗的小鼠的器官中没有观察到明显的系统性副作用。治疗组和对照组的平均小鼠体重，除了肿瘤体重以外，在治疗结束时没有明显差异。

实施例12：采用抗DERLIN-1相应抗体衍生物体内导向治疗肿瘤

取荷人结肠癌裸小鼠24只，测量并计算肿瘤体积后，按肿瘤体积随机分为3组，每组8只。第一组为PBS对照组，每只腹腔注射200μlPBS；第二组为正常鼠IgG对照组，每只腹腔注射9.25MBq(200μl)¹³¹I-正常鼠IgG(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)；第三组为偶联¹³¹I的HEC252/9F12单克隆抗体治疗组，每只腹腔注射9.25MBq(200μl)¹³¹I-抗体。治疗后10天，处死动物，分离肿瘤，称取肿瘤重量，计算抑瘤率，抑瘤率＝(对照组瘤重量-治疗组瘤重量)/对照组瘤重量×100％。显著性检验采用t检验。

结果PBS组瘤重1.26±0.57g，鼠IgG对照组瘤重1.20±0.51g，标记抗体治疗组瘤重0.32±0.13g，标记抗体的抑瘤率为73.3％，P值小于0.01。这些结果显示HEC252/9F12单克隆抗体偶联核素在免疫导向治疗结肠癌中有重要的应用价值。

实施例13 利用DERLIN-1蛋白作为肿瘤靶标诊断肿瘤(分子显影)

将¹²⁵I-标记的抗DERLIN-1蛋白单克隆兔抗体经由尾静脉注入取荷人结肠癌裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)用于闪烁显像。给药后24，72，120和168小时记录自动放射摄影(图8)。生物分布显像显示肿瘤中的抗DERLIN-1蛋白单克隆兔抗体的累积增加，肿瘤被显现出来。¹²⁵I-标记的抗DERLIN-1蛋白单克隆兔抗体的肿瘤靶向可通过过量10倍的未标记抗DERLIN-1蛋白单克隆兔抗体竞争来抑制，而不会受到正常兔IgG的抑制。

序列表

<110>中国医学科学院肿瘤医院

<120>细胞膜蛋白DERLIN-1及其制备和用途

<130>I200701722CB

<160>1

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>251

<212>PRT

<213>Artificial

<400>1

Met Ser Asp Ile Gly Asp Trp Phe Arg Ser Ile Pro Ala Ile Thr Arg

1 5 10 15

Tyr Trp Phe Ala Ala Thr Val Ala Val Pro Leu Val Gly Lys Leu Gly

20 25 30

Leu Ile Ser Pro Ala Tyr Leu Phe Leu Trp Pro Glu Ala Phe Leu Tyr

35 40 45

Arg Phe Gln Ile Trp Arg Pro Ile Thr Ala Thr Phe Tyr Phe Pro Val

50 55 60

Gly Pro Gly Thr Gly Phe Leu Tyr Leu Val Asn Leu Tyr Phe Leu Tyr

65 70 75 80

Gln Tyr Ser Thr Arg Leu Glu Thr Gly Ala Phe Asp Gly Arg Pro Ala

85 90 95

Asp Tyr Leu Phe Met Leu Leu Phe Asn Trp Ile Cys Ile Val Ile Thr

100 105 110

Gly Leu Ala Met Asp Met Gln Leu Leu Met Ile Pro Leu Ile Met Ser

115 120 125

Val Leu Tyr Val Trp Ala Gln Leu Ash Arg Asp Met Ile Val Ser Phe

130 135 140

Trp Phe Gly Thr Arg Phe Lys Ala Cys Tyr Leu Pro Trp Val Ile Leu

145 150 155 160

Gly Phe Asn Tyr Ile Ile Gly Gly Ser Val Ile Asn Glu Leu Ile Gly

165 170 175

Asn Leu Val Gly His Leu Tyr Phe Phe Leu Met Phe Arg Tyr Pro Met

180 185 190

Asp Leu Gly Gly Arg Asn Phe Leu Ser Thr Pro Gln Phe Leu Tyr Arg

195 200 205

Trp Leu Pro Ser Arg Arg Gly Gly Val Ser Gly Phe Gly Val Pro Pro

210 215 220

Ala Ser Met Arg Arg Ala Ala Asp Gln Asn Gly Gly Gly Gly Arg His

225 230 235 240

Asn Trp Gly Gln Gly Phe Arg Leu Gly Asp Gln

245 250

Claims

1.细胞膜蛋白的形式的DERLIN-1蛋白在筛选抗肿瘤药物中的用途，其中所述的肿瘤是结肠癌。

2.权利要求1的用途，其中所述DERLIN-1蛋白如SEQ ID NO：1所示。

3.权利要求1的用途，其中所述的抗肿瘤药物是DERLIN-1蛋白的抗体。

4.权利要求3的用途，其中所述DERLIN-1蛋白的抗体是抗DERLIN-1蛋白的单克隆抗体。

5.保藏号为CGMCC No.2242的杂交瘤细胞，其产生抗DERLIN-1蛋白的单克隆抗体。

6.用于治疗对象中的肿瘤的药物组合物，其包含DERLIN-1蛋白的抗体，并任选包含适宜的载体或赋形剂，其中所述的肿瘤是结肠癌。

7.权利要求6的药物组合物，其中所述DERLIN-1蛋白的抗体是抗DERLIN-1蛋白的单克隆抗体。

8.权利要求6的药物组合物，其可为与其他抗肿瘤药剂的组合的形式，其中所述DERLIN-1蛋白结合配体是抗DERLIN-1蛋白的单克隆抗体，其他抗癌药剂为放射性核素。

9.权利要求8的药物组合物，其中所述对象是哺乳动物。

10.权利要求9的药物组合物，其中所述对象是人。

11.DERLIN-1蛋白结合的抗体在制备用于治疗对象中的肿瘤的药物组合物中的用途，其中所述的肿瘤是结肠癌。

12.权利要求11的用途，其中所述DERLIN-1蛋白的抗体是抗DERLIN-1蛋白的单克隆抗体。

13.权利要求11的用途，其中所述对象是哺乳动物。

14.权利要求13的用途，其中所述对象是人。

15.用于诊断对象中的肿瘤的诊断剂，其包含DERLIN-1蛋白结合配体，其中所述的肿瘤是表达细胞膜形式的DERLIN-1蛋白的肿瘤，并且其中所述肿瘤选自胰腺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌。

16.权利要求15的诊断剂，其中所述的DERLIN-1蛋白结合配体是抗DERLIN-1蛋白的单克隆抗体。

17.权利要求15的诊断剂，其中所述DERLIN-1蛋白结合配体用放射性同位素标记。

18.权利要求17的诊断剂，其中所述放射性同位素是¹²⁵I。

19.DERLIN-1蛋白结合配体在制备用于诊断对象中的肿瘤的诊断剂中的用途，其中所述的肿瘤是表达细胞膜形式的DERLIN-1蛋白的肿瘤，并且其中所述肿瘤选自胰腺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、食管癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌。

20.权利要求19的用途，其中所述DERLIN-1蛋白结合配体是抗DERLIN-1蛋白的单克隆抗体。

21.权利要求19的用途，其中所述DERLIN-1蛋白结合配体用放射性同位素标记。

22.权利要求21的用途，其中所述放射性同位素是¹²⁵I。

23.权利要求19的用途，其中所述对象是哺乳动物。

24.权利要求23的用途，其中所述对象是人。