CN116063534A - Braf单克隆抗体制备方法以及干细胞制备的皮肤细胞修复的药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及BRAF单克隆抗体制备方法以及干细胞制备的皮肤细胞修复的药物。本发明根据人BRAF不同突变体的序列，通过序列比对筛选保守性较好，具有种属特异性的序列，并且根据亲水性、免疫原性以及结果分析，最终筛选一段高免疫活性肽BRAF‑BST，以该免疫活性肽免疫小鼠并通过杂交瘤技术制备蝴蝶特异性的具有抑制BRAF活性的单克隆抗体，所述抗体能够在细胞层面抑制黑色素瘤细胞的增殖，同时，在动物模型层面通过单独或者与间充质干细胞联用后也能够具有较好的抑制肿瘤增殖的效果。

Description

BRAF单克隆抗体制备方法以及干细胞制备的皮肤细胞修复的药物

技术领域

本发明涉及生物领域，更具体的涉及BRAF单克隆抗体制备方法以及干细胞制备的皮肤细胞修复的药物。

背景技术

恶性黑色素瘤(malignantmelanoma，MM)是发生于黑色素细胞的恶性肿瘤。MM一直是西方人的常见病，随着我国人口疾病谱的变化，似有不断上升趋势，且有自身特点，如肢端皮肤和黏膜来源居多，而西方人以头颈、躯干皮肤为主。美国癌症数据库(NCDB)统计：皮肤91.2％，眼5.3％，黏膜1.3％，原发部位不明2.2％。广泛的局部切除是MM的基本治疗原则。手术后病理分期决定MM的预后和治疗方式。本病的突出特点是发病早期转移率高，致死性强，对单纯化、放疗敏感性差，也容易对目前化疗产生耐药。

黑色素瘤的基因突变发生率比较高，常见的突变基因包括BRAF、MAPK和NRAS等，其中BRAF是一种原癌基因，约50％黑色素瘤患者携带BRAF^V600E突变。BRAF突变后可激活RAS/RAF/MEK/ERK通路，从而促进肿瘤发生。对携带BRAF^V600E的黑色素瘤患者，BRAF靶向抑制剂可使黑色素瘤转移灶快速消退并取得了较好疗效。其有效率高且起效快，属临床一线用药。常见的BRAF抑制剂有索拉非尼、威罗菲尼和达拉菲尼。索拉非尼是一种新颖靶向治疗药物，能抑制B-Raf和C-Raf的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，以及血小板源性生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、p38和c-Kit的多靶点酪氨酸激酶抑制剂。它通过抑制FLT3和BRAF用于黑色素瘤的治疗，是第一个在黑色素瘤患者中被研究的Raf抑制剂。但是它具有轻至中度的不良反应，主要包括皮肤毒性，腹泻和疲劳。威罗菲尼是最早进入临床的BRAF抑制剂，对携带BRAF^V600E患者，它显示出比野生型高30倍的选择性抗增殖活性，起效快，有效率达48％，但是存在关节痛、光敏、疲劳和脱发等副作用。达拉菲尼与威罗菲尼疗效相当，但副作用更小。达拉菲尼也是一种强效BRAF抑制剂，对BRAF突变型的选择性是野生型BRAF基因的100倍，除此之外，还显示出显著的抗脑转移的临床活性。它常见的副作用包括角化过度、皮疹、头痛、发烧、脱发和周围神经病变。相对于传统治疗，BRAF抑制剂靶向治疗起效更快，有效率也高，但绝大多数患者都存在耐药问题，从而限制了远期疗效。除了BRAF抑制剂以外，还有RAS/RAF/MEK/ERK级联信号中的MEK抑制剂，其中最常用的就是曲美替尼。曲美替尼是一种口服的双重激酶抑制剂，通常与达拉菲尼联合用于治疗晚期恶性黑色素瘤。有研究比较了曲美替尼与化疗的疗效，发现曲美替尼6个月生存率为81％，而使用达卡巴嗪或紫杉醇的6个月生存率为67％。曲美替尼治疗黑色素瘤的良好效果，在2013年被FDA批准用于治疗BRAFV600E的转移性黑色素瘤。BRAF抑制剂单一治疗的局限性在于患者对治疗反应的差异性、几乎所有患者都会出现的耐药性以及BRAF抑制剂相关的毒性。在临床上，耐药性也会表现为异质性，有些转移性黑色素瘤天生对治疗药物有耐药性，而比较常见的耐药表现为最初对治疗有反应，而后产生耐药，继而出现新的转移瘤。

MSCs是一类具有跨胚层分化潜能和自我更新能力的成纤维样组织干细胞，能够从骨髓、脂肪、巧带、胎盘、羊膜和牙髓在内的多种基质组织分离。大量实验证明，MSCs通过信号通路、分泌细胞因子和分泌微泡等方式可W直接抑制肿瘤的生长。研究表明，MSCs通过下调Wnt/β-catenin信号通路抑制肿瘤细胞增殖，将荧光标记的MSCs通过尾静脉注射入己通过药物刺激形成的肝细胞肝癌模型大鼠体内。通过实时定量聚合酶链式反应检测大鼠肝癌细胞信使RNA水平发现，在经过MSCs处理后，反应肿瘤细胞增殖情况的增殖细胞核抗原、细胞周期蛋白、促进肿瘤细胞增殖的β-catenin和调亡抑制蛋白(Survivin)的mRNA水平均有所下降。这些实验结果表明，MSCs能够影响肝癌细胞的增殖分裂与细胞周期，并且通过下调Wnt信号通路抑制肿瘤细胞的增殖。

但是目前针对黑色素瘤的治疗还没有将BRAF抑制剂与MSCs一起使用来治疗，该疗法有待于进一步的开展。

发明内容

本发明一方面，提供一种脂肪间充质干细胞在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。

本发明另外一方面，提供一种特异性针对BRAF的单克隆抗体。

具体的，所述BRAF单克隆抗体是BRAF-D6。

进一步的，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列为

AYQMTQSPSSVSASVGDRVTITCFAANDTFQTCGWYQQKPGKAPKLLIYQAGDLVAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCIVIGTVHNVEVWAFGGGTKVEIK；

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其氨基酸序列为

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSDMGNQWVRQAPGKGLEWVGVFQQCYIQSRQGSCKYRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWFVQFDFLSWDDGWGQGTLVTVSS。

在本发明中，本发明的抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据本领域常规的氨基酸替换而产生。

进一步的，本发明还提供了所述的BRAF的单克隆抗体在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。

进一步的，本发明还提供了所述的BRAF的单克隆抗体和脂肪间充质干细胞在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途。

其中，黑色素瘤是A375细胞导致的。

进一步的，本发明的药物是包含稳定剂的纳米混悬液。

在一些实施方案中，稳定剂包括有机聚合物。在一些实施方案中，稳定剂包括含有纤维素或其衍生物的有机聚合物。在一些实施方案中，稳定剂包括羟丙基纤维素(HPC)或羟丙基甲基纤维素(HPMC)。在一些实施方案中，稳定剂包括有机聚合物。在一些实施方案中，有机聚合物包括聚环氧丙烷，聚环氧乙烷或其组合。在一些实施方案中，稳定剂包括含有聚乙烯吡咯烷酮或其衍生物的有机聚合物。在一些实施方案中，稳定剂包括聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯吡咯烷酮共聚物。在一些实施方案中，稳定剂包括聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯(PVP/VA)共聚物。在一些实施方案中，稳定剂包括重均分子量为约45,000至约70,000的聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯(PVP/VA)共聚物。在一些实施方案中，稳定剂包括乙酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯。

在一些实施方案中，稳定剂是通常用于口服给药的药物组合物制剂中的任何稳定剂。

在一些实施方案中，药物组合物包含选自聚氧乙烯硬脂酸酯，失水山梨醇硬脂酸酯，失水山梨醇倍半油酸酯，失水山梨醇单油酸酯，聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80，十二烷基硫酸钠(SDS)的表面活性剂；或者称作月桂基硫酸钠，缩写为SLS)和双(2-乙基己基)磺基琥珀酸酯，也称作磺基琥珀酸二辛酯(DOSS)。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯80。在一些实施方案中，表面活性剂是SDS。在一些实施方案中，表面活性剂是DOSS。在一些实施方案中，表面活性剂是聚氧乙烯烷基醚，烷基苯基聚氧乙烯醚或聚山梨酯。

在一些实施方案中，药物组合物任选地包含稀释剂，填充剂或填料。在一些实施方案中，稀释剂选自山梨醇，异麦芽糖醇，甘露醇，淀粉，纤维素或其组合。

]在一些实施方案中，药物组合物任选地包含pH调节剂。在一些实施方案中，pH调节剂是药学上可接受的酸或碱。在一些实施方案中，pH调节剂是缓冲液。在一些实施方案中，pH调节剂是柠檬酸缓冲液，苹果酸缓冲液，马来酸缓冲液或酒石酸缓冲液。在一些实施方案中，pH调节剂是抗坏血酸，谷胱甘肽，半胱氨酸，蛋氨酸，柠檬酸，EDTA，苹果酸，苹果酸钠，酒石酸，酒石酸二钠或其任意组合。在一些实施方案中，pH调节剂选自维生素A，维生素C，维生素E，维生素ETPGS，棕榈酸视黄酯，硒，半胱氨酸，蛋氨酸，柠檬酸，柠檬酸钠，尼泊金甲酯，尼泊金丙酯，依地酸二钠，丁基化羟基甲苯，核黄素，抗坏血酸或其组合。

在一些实施方案中，药物组合物任选地包含一种或多种甜味剂和调味剂以改善组合物的适口性。在一些实施方案中，所述药物组合物包含调味料，例如但不限于香草调味料或草莓调味料。在一些实施方案中，药物组合物包含甜味剂，例如但不限于三氯半乳蔗糖，阿斯巴甜，糖精钠或糖精钙。

在在一个实施例中，药物中的间充质干细胞使用量为0.1×10⁶/kg至5×10⁶/kg，1×10⁶/kg至5×10⁶/kg，2×10⁶/kg至5×10⁶/kg，3×10⁶/kg至5×10⁶/kg，4×10⁶/kg至5×10⁶/kg，0.1×10⁶/kg至4×10⁶/kg，0.1×10⁶/kg至3×10⁶/kg，0.1×10⁶/kg至2×10⁶/kg，0.1×10⁶/kg至1×10⁶/kg，1×10⁶/kg至4.5×10⁶/kg，1×10⁶/kg至4×10⁶/kg，1×10⁶/kg至3.5×10⁶/kg，1×10⁶/kg至3×10⁶/kg。

同时，该药物以药学有效量给药。术语“药学有效量”是指足以以适用于医疗的合理的利益/风险比治疗疾病且不会引起副作用的量，并且有效剂量水平由患者的性别，年龄和体重确定。健康状况，疾病类型，严重程度，药物活性，对药物的敏感性，给药方法，给药时间，给药途径，排泄速率，治疗周期，包括联合或伴随使用的药物在内的因素，以及其它医学领域。本领域普通技术人员可以根据已知因素容易地确定。在药物组合物的说明书中提到的术语或要素中，与已经提到的相同的术语或要素与上述相同。

另外，药物可以通过任何能够将活性物质转运到靶细胞的装置给药。优选的给药方式和制剂是静脉注射，皮下注射，皮内注射，肌肉注射，滴注等。注射时，水性溶剂如生理盐水溶液和林格氏溶液，植物油，高级脂肪酸酯(例如，油酸乙酯)，和非水溶剂如醇(例如，乙醇，苯甲醇，丙二醇，可包括用于防止变质的稳定剂(例如抗坏血酸，亚硫酸氢钠，焦亚硫酸钠，BHA，生育酚，EDTA等)，乳化剂，pH控制缓冲剂，以抑制微生物药物载体如防腐剂(例如苯基硝酸汞，硫柳汞，苯扎氯铵，苯酚，甲酚，苯甲醇等)的生长。

进一步的，本发明的药物或药物组合物中还含有治疗活性的第二治疗剂，为本领域公知的治疗活性药物都落在本发明的范围。

有益效果

本发明根据人BRAF不同突变体的序列，通过序列比对筛选保守性较好，具有种属特异性的序列，并且根据亲水性、免疫原性以及结果分析，最终筛选一段高免疫活性肽BRAF-BST，以该免疫活性肽免疫小鼠并通过杂交瘤技术制备蝴蝶特异性的具有抑制BRAF活性的单克隆抗体，所述抗体能够在细胞层面抑制黑色素瘤细胞的增殖，同时，在动物模型层面通过单独或者与间充质干细胞联用后也能够具有较好的抑制肿瘤增殖的效果。

附图说明

图1 BRAF单抗特异性鉴定结果图

图2 BRAF单抗对黑色素瘤细胞抑制率结果图

图3 BRAF单抗联合干细胞对小鼠肿瘤抑制率的影响结果图

具体实施方式

本发明可通过后续对于本发明一些实施方案描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。在进一步叙述本发明之前，应明了本发明不会被局限于所述特定实施方案中，因为这些实施方案必然是多样的。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案，而非作为限制，因为本发明的范围将会被仅仅界定在所附的权利要求中。

实施例1脂肪间充质干细胞的分离与制备

将已经离体的人皮下脂肪组织约100mg，尽量剔除软组织和小血管，PBS反复冲洗以去除血细胞，用眼科剪剪成小块后以0.1％I型胶原酶消化，10％FCS的IMEM中和终止胶原酶的作用，3000r/min离心10min，去除细胞外基质，移人离心管中，IMEM重悬细胞，3000r/min离心10min，10％FCS的IMEM重悬，接种至培养瓶中。置入37℃，5％CO₂的培养箱中培养。48h后去除未贴壁的细胞，以后3日换液并逐日在相差显微镜下观察并拍摄细胞生长情况，培养l4天左右，贴壁细胞基本长满培养瓶的底壁(80％～90％)，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA液将上述原代细胞消化分离(37℃，1min)，然后按1：3的比例进行传代接种培养并记为P1；传代培养3日换液，至贴壁细胞长满瓶底，再用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA液将贴壁细胞消化分离，按1：3的比例进行传代并计为P2。重复上述操作。0.25％的胰蛋白酶EDTA消化传代，取3代进行免疫细胞化学鉴定。

取生长状态良好的第3代脂肪问充质干细胞，通过流式细胞仪测定hASCs刺激组与对照组表面标记物CD105、CD73、CD34、CD14、CD45、HLA-DR和HLA-ABC的表达情况。取消化待测细胞，用D-PBS缓冲液清洗两次。调整细胞浓度为3×10⁵个/mL，加入适量荧光标记的单克隆抗体，室温，避光孵育30min。再清洗一次，重悬，上机检测，运用BD FACSDIVA软件进行分析。流式细胞仪检测结果显示，第3代脂肪间充质干细胞表面标志CD73、HLA-ABC、CD105均呈阳性表达，阳性率分别为96.7％、98.8％和92.5％；而造血干细胞表面标志CD31、CD34、CD106阳性率分别为3.0％、2.8％、8.9％。

将鉴定好的hASCs细胞取hASCs第3代细胞2×10⁴个的密度1mL接种于SonaCell细胞扩增仪的12孔板相应的孔中，所述培养基为人脂肪间充质干细胞完全培养基(广州赛业生物科技有限公司)；细胞培养24h后换液，然后使用SonaCell设备的LIPUS刺激部件于细胞培养箱中刺激，5min/d，连续刺激4d，第5d收集细胞即获得扩增后的hASCs，收集备用。

实施例2BRAF单克隆抗体的制备及特性鉴定

根据人BRAF不同突变体的序列，经过比对，发现保守性较好，具有种属特异性的序列，并且通过抗原表位等特性预测，根据亲水性、免疫原性以及结果分析，最终筛选一段高免疫活性肽BRAF-BST：ehhpipqeeaslaetaltsgss。该多肽的抗原指数预测达到了1.028，亲水性预测达到了2.164，将该多肽委托国肽生物进行合成，HPLC分析其纯度>99.5％。随后将该多肽与KHL偶联。

选取3只6周龄健康雌性Balb/c小鼠，编号为1、2、3号小鼠，饲养两周适应环境，然后进入免疫阶段。初次免疫，取100μgBRAF-BST多肽-KLH偶联物(溶于250μl生理盐水)等剂量福氏完全佐剂皮下多点注射，3周后取相同剂量BRAF-BST-KLH偶联物+福氏不完全佐剂皮下多点注射，3周后，再次重复前述免疫1次，3周后通过间接ELISA法测定小鼠血清效价，结果显示3号小鼠加强免疫后血清抗体效价最高达到了1:12800，比1号和2号的效价要高，因此，以3号小鼠进行加强免疫：偶联物剂量100μg腹腔注射，免疫后3d，进行细胞融合。

取小鼠脾细胞方法同饲养细胞，获得免疫小鼠脾细胞悬液，补加培养液10ml，离心1500转/分，5分钟；弃去上层液，沉淀的细胞再用培养液洗一次，最后加适量培养液后计算活细胞数量，在50ml离心管中混合免疫鼠脾细胞(5×10⁷)和骨髓瘤细胞SP2/0(1×10⁷)比例为5:1，加入不完全培养液25ml，离心1000转/分，10分钟，弃去液体；用手轻击管底，使细胞沉淀物流动如糊状，离心管放37℃水浴的烧杯中；吸取1ml的PEG4000，边加边轻摇，一分钟加完；慢慢加入无血清1640稀释，终止PEG4000的作用，一分钟滴加1ml，边加边摇；再加1ml/分钟，滴加一分钟；再加1ml/分钟，滴加一分钟；慢慢加入无血清1640(15ml)，一共加了18ml的1640,终止PEG4000作用；离心沉淀，1000转/分，10分钟，吸去上清液；轻轻敲击管底，渐渐加入50mlHAT培养液，混匀，分装培养板中，每孔0.1ml，分装4板；放5％CO₂，饱和湿度的37℃培养箱中培养，每隔3天换HAT培养液一次，共两周；两周之后用HT培养液培养代替HAT，每隔3天换液培养一周，之后改用正常培养液。经过选择性培养基的筛选后，克隆生长数达到了136孔，取出培养液100μl进行单克隆抗体的检测，检测方法为间接ELISA法，其中阳性孔数达到了22孔，阳性率达到了5.7％，采用有限稀释法4次杂交瘤细胞的亚克隆以阳性率为100％作为标准，共筛出2株稳定分泌抗BRAF-BST单克隆抗体的细胞株，分别命名为BRAF-D6和BRAF-H13。采用小鼠腹水来大量制备二种单抗，低温保存备用。

采用小鼠免疫球蛋白(IgG)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒，按照使用说明书操作，经过ELISA亚型分析，结果如表1所示。

表1 Ig类及亚类特异性抗体的ELISA检测

亚型	BRAF-D6	BRAF-H13	阳性对照	阴性对照
					IgG1	2.67	2.78	2.09	0.13
IgG2a	0.09	0.10	2.15	0.12
					IgG2b	0.07	0.08	2.23	0.08
IgG3	0.09	0.12	2.30	0.09
					IgM	0.08	0.09	2.32	0.11
IgA	0.07	0.06	2.24	0.09
					Igκ	2.79	2.85	2.44	0.12
Igλ	0.08	0.07	0.09	0.09

最终的2株杂交瘤细胞重链均为IgG1，轻链均为κ型，结果见表1。

实施例3 BRAF-D6单抗特性鉴定

(1)特异性鉴定：用包被物稀释液将BRAF-BST多肽溶解稀释至10μg/ml，每孔加入100μl，4℃静置过夜；同时将黑色素瘤细胞A375细胞裂解液(Procell)进行全蛋白提取，随后用包被液稀释至30μg/ml，每孔加入100μl，4℃静置过夜；用包被物稀释液将BSA溶解稀释至10μg/ml，每孔加入100μl，4℃静置过夜；用包被物稀释液将重组PD-1蛋白溶解稀释至10μg/ml，每孔加入100μl，4℃静置过夜；

浸泡洗涤3次，每次3分钟；

每孔加入封闭液200μl，37℃孵育2小时；

浸泡洗涤3次，每次3分钟；

加入稀释的1:4000的单抗，37℃孵育1小时；

浸泡洗涤3次，每次3分钟；

再加入羊抗小鼠酶标抗体(1:5000稀释)，37℃孵育1小时；

浸泡洗涤3次，每次3分钟；

加入OPD显色，反应10分钟后用终止液停止反应；

马上测OD值，自动酶标仪上读波长490nm处的OD值，打印输出结果供分析、判断。以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。结果如图1所示。

从图1的结果可以看出，BRAF-D6单抗特能够特异性的结合BRAF抗原肽(9.23±0.29)，同时也能够结合A375细胞中的BRAF(8.36±0.25)，而不与BSA和PD-1结合，表现了较好的特异性。

(2)单抗亲和能力鉴定：利用Biacore 8K进行表面等离子共振分析。具体步骤如下：首先，将anti-human IgG的抗体以氨基偶联的方式固定在CM5芯片的通道。固定量控制在8,000响应值。然后，以抗体捕获的方式，结合纯化的BRAF-D6抗体。另外，以20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4溶液连续倍比稀释BRAF-BST多肽。然后，将连续稀释的BRAF-BST多肽依次通过各通道(从低浓度开始逐一上样)。记录BRAF-D6抗体结合BRAF-BST多肽的动力学曲线，并利用BIAevaluation software 8K软件计算动力学常数(如表2所示)。

表2抗体与BRAF-BST多肽的结合动力学常数

抗体名称	解离常数(nM)
		BRAF-D6抗体	4.38±0.14

结果显示，BRAF-D6抗体能够以较高的亲和力结合BRAF-BST多肽。

(3)采用试剂盒提取杂交瘤细胞的总RNA，逆转录合成cDNA。设计引物，扩增重链和轻链，测序，测序结果用软件进行分析，经过序列鉴定，获得了单克隆的轻重链序列，其轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例4 BRAF-D6单抗抑制黑色素瘤细胞A375实验

黑色素瘤细胞A375用含5％胎牛血清的DMFM培养基(含100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素)37℃、5％CO₂条件下常规培养。待生长至融合状态，以0.25％胰酶和0.02％EDTA消化，台盼蓝染色法计数活细胞数，然后接种至96孔细胞培养板。接种浓度为5000个/孔。液体量200μL/孔，过夜、待细胞贴壁、吸去培养液，分别加如不同的浓度的单抗药物各200μL(0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL)，空白对照组仅加入培养基和相应溶媒，阳性对照为等量的威罗菲尼100μg/mL、继续培养96h，药物处理结束时，每孔加5mg/mL MTT 20μL，继续置CO₂培养箱培养4h，然后吸去培养液，每孔加入200μL DMSO，中速振荡1min，用酶标仪测定吸光度OD570nm值，细胞抑制率以(l-药物处理组A570nm/空白对照组A570nm)×100％来表示。

从图2的结果可以看出，本发明制备的BRAF-D6单抗对于黑色素瘤细胞的增殖具有浓度依赖性，随着浓度的升高，细胞抑制率也逐渐上升，与阳性对照组相比，在100μg/mL的BRAF-D6单抗处理条件下，细胞抑制率达到了较高的(92.32±1.86)％，具有显著的抑制效果。

实施例5 BRAF-D6单抗和/或脂肪间充质干细胞小鼠实验

雌性BALB/c裸鼠、5周大小，约15g左右，分为如下各组，将生长状态良好的A375细胞，用膜蛋白酶消化、计数，各组按照细胞5×10⁶个/mL分别注射200μL细胞悬液到裸鼠右前肢腋下。没有注射A375细胞的裸鼠作为空白对照，其他实验组同时按照如下各组分别给药。

表3各组给药情况

最后一次给药后1周，测量肿瘤大小。肿瘤的大小测量方法为：游标卡尺测量肿瘤长轴a和短轴b，根据公式V＝0.5a×b²计算肿瘤体积。并且肿瘤抑制率＝(l-实验组肿瘤体积/实验模型组肿瘤体积)×100％来表示。结果如图3所示。

从图3的结果可以看出，单独使用脂肪间充质干细胞和单独使用单抗治疗小鼠黑色素瘤都有较好的效果，特别是采用单抗联合干细胞一起治疗，肿瘤抑制率达到了(86.37±2.92)％，比阳性对照的(73.62±2.37)％效果要好。从这个结果可以看出，采用单抗和干细胞一起，可以用于黑色素瘤的治疗。

同时所述治疗组的小鼠通过检测也发现肝脏、脾脏等器官也无明显的损伤，侧面证明药物具有较好的安全性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种特异性针对人BRAF的单克隆抗体BRAF-D6，其特征在于所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于抑制人BRAF蛋白活性的药物中的用途。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于抑制人黑色素瘤的药物中的用途。

4.如权利要求1所述的单克隆抗体以及人脂肪间充质干细胞在制备用于抑制人黑色素瘤的药盒中的用途。

5.如权利要求2-4任一所述的用途，其特征在于所述药物或药盒中含有药学上可接受的载体。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述药物或药盒中含有pH调节剂。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于所述药物或药盒中的pH调节剂为柠檬酸缓冲液，苹果酸缓冲液，马来酸缓冲液或酒石酸缓冲液。

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