MXPA03010254A

MXPA03010254A - Metodo de terapia celular para el tratamiento de tumores.

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Publication number: MXPA03010254A
Application number: MXPA03010254A
Authority: MX
Inventors: A Peterson Per
Original assignee: Johnson & Johnson
Priority date: 2002-11-07
Filing date: 2003-11-07
Publication date: 2005-06-06
Also published as: EP1470821A2; US20040071671A1; EP1470821A3; AU2003261546A1; US9222070B2; US20090004142A1; AU2003261546B2; CA2448481A1; NZ529404A

Abstract

Las respuestas de celulas T disminuyen con frecuencia en humanos con un sistema inmune comprometido; se ha desarrollado un metodo para aislar, estimular y expandir precursores de linfocitos T citotoxicos no afectados (CTLp) para efectores especificos de antigenos, capaces de lisar celulas tumorales in vivo; este protocolo ex vivo produce efectores totalmente funcionales; se usan celulas artificiales que presentan antigenos (APCs; Drosophila melanogaster) transfectadas con moleculas accesorias definidas y HLA clase I humanas, para estimular celulas T CD8+ de donadores normales y pacientes con cancer; las moleculas HLA clase I expresadas a una alta densidad sobre la superficie de las celulas de Drosophila estan vacias, permitiendo la carga eficiente de peptidos multiples que da como resultado la generacion de respuestas policlonales que reconocen celulas tumorales que expresan endogenamente los peptidos especificos; las respuestas generadas son solidas, especificas del antigeno y reproducibles, si el epitope peptidico es un inmunogeno definido; este sistema artificial de expresion de antigenos puede adaptarse para tratar la mayoria de los canceres en una porcion significativa de la poblacion.

Description

METODO DE TERAPIA CELULAR PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES REFERENCIA RECIPROCA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente de E.U.A. No. de serie 10/080,013, titulada "A CELL THERAPY METHOD FOR THE TREATMENT OF TUMORS", a LeTurcq et al., presentada el 19 de febrero de 2002, que a su vez reclama prioridad de la solicitud de patente provisional 60/270,252, cuyo contenido se incorpora en su totalidad en la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un método de terapia celular para el tratamiento de tumores. En particular, la presente invención se refiere a un régimen de tratamiento para melanoma usando linfocitos T autólogos generados ex vivo, con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El cáncer continúa siendo un problema de salud importante, a pesar del progreso significativo logrado en el área de tratamiento. Los regímenes de tratamiento normales de quimioterapia, radioterapia, intervención quirúrgica y combinaciones de los mismos, fracasan con frecuencia para producir una curación duradera. En muchos casos, el paciente canceroso que ha sufrido el tratamiento, con frecuencia vuelve a recaer a la condición de enfermedad después de cierto período, exacerbando más el problema. Otro factor que complica el desarrollo de un tratamiento del cáncer, es que se ha encontrado que los cánceres son causados no por un agente o factor biológico individual, sino más bien por una combinación de agentes y factores. A diferencia de la mayoría de los tratamientos médicos en donde un agente o evento causal individual es el foco del tratamiento, la terapia del cáncer requiere destacar una pluralidad de factores biológicos. En años recientes, la investigación se ha dirigido a desarrollar terapias del cáncer que usan el propio sistema inmune del paciente. Una de dichas alternativas, es la inmunoterapia adoptiva. La inmunoterapia adoptiva requiere usar las propias células del paciente para generar linfocitos T citotóxicos (CTLs) para tratar un tumor o células cancerosas. Puesto que el melanoma es conocido por su potencial para inducir respuestas inmunes, y es resistente a los regímenes de tratamiento sistémico usados actualmente, tales como quimioterapia y terapia hormonal, la mayoría de los estudios preclínicos y clínicos de regímenes de inmunoterapia se dirigen hacia esta malignidad. El melanoma es un problema de salud importante. Durante las pasadas cuatro décadas, la incidencia del melanoma ha estado aumentando a un índice mayor que cualquier otro tipo de cáncer. Aunque la mayoría de los melanomas se manejan mediante excisión quirúrgica de rutina, para pacientes con melanoma maligno no sujetos a extirpación quirúrgica, las opciones de tratamiento son limitadas. La dacarbazina continúa siendo el fármaco de elección en el melanoma diseminado, pero las remisiones usualmente duran poco tiempo. La interleucina y la bioquimioterapia han dado buenos resultados, pero el porcentaje de pacientes que se benefician de esta terapia es pequeño. Aunque el interferon a altas dosis aumenta los índices de supervivencia en algunos pacientes, el interferon continúa siendo un fármaco polémico que no es fácilmente tolerado. La quimioterapia secuencial es promisoria, pero las opciones de tratamiento actuales para individuos que sufren de melanoma metastásico, son insatisfactorias. Las alternativas inmunoterapéuticas actuales para tratar el melanoma metastásico, incluyen la administración de péptidos asociados con melanoma solos o en combinación con citocinas exógenas, células tumorales modificadas con genes, células dendríticas cargadas con péptidos definidos, o células dendríticas que presentan un complemento completo de epítopes antigénicos que resultan de proteínas procesadas internamente. Estas alternativas intentan intensificar las respuestas de células T y/o B en un esfuerzo por curar la enfermedad. Estas alternativas continúan siendo principalmente no comprobadas como regímenes de tratamiento clínico viables para pacientes humanos. Además del problema de identificar los epítopes adecuados con los cuales se inmunizan los CTLs, las alternativas actuales no proveen un método para presentar un número suficiente de diferentes epítopes para APCs, para dirigir adecuadamente antígenos múltiples para tratar eficazmente el cáncer. La presente invención satisface las necesidades no cubiertas, al proveer un método de terapia celular para el tratamiento de tumores. En particular, la presente invención se refiere a un régimen de tratamiento para melanoma, usando linfocitos T autólogos generados ex vivo con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. La administración concomitante de IFN-a o IL-2, o ambas citocinas en tiempos y dosis específicos, puede beneficiar la cebadura de células tumoraies para lisis por las células T específicas del antígeno y la persistencia in vivo de los CTLs.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee una célula que presenta antígenos de ocurrencia no natural (nnAPC), capaz de presentar simultáneamente hasta diez o más péptidos diferentes, métodos para obtener nnAPC, y métodos para usar dicha nnAPC para el tratamiento de cáncer, en particular melanoma maligno. En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para tratar una infección viral en un sujeto, el cual comprende: preparar una línea de células que presentan antígenos de ocurrencia no natural (nnAPC), en donde dicha nnAPC es capaz de presentar simultáneamente hasta alrededor de 15 moléculas peptídicas diferentes asociadas con dicha infección viral, en donde dichas moléculas peptídicas tienen cada una aproximadamente 6 a 12 aminoácidos de longitud, cosechar células CD8+ del sujeto o un donador adecuado; estimular dichas células CD8+ con una línea de células nnAPC; añadir las células CD8+ a medios que contengan una citocina seleccionada del grupo que consiste de IL-2, IL-7 o medio de crecimiento acondicionado (CGM), en donde dichas citocinas puedan usarse individualmente o en combinación; mezclar monocitos de sangre periférica no suspendidos o monocitos de sangre periférica agotados en CD-8, colectados de dicho sujeto o un donador adecuado, con aproximadamente 1 a 50 µg/mL de uno de los péptidos que la nnAPC pueda presentar simultáneamente; irradiar la suspensión de monocitos de sangre periférica con una dosis suficiente de radiación gamma necesaria para esterilizar todos los componentes en la suspensión, salvo los monocitos de sangre periférica deseados; aislar monocitos de sangre periférica adherentes; cargar los monocitos de sangre periférica adherentes con aproximadamente 1 ug/mL a 50 µg/?rL· de cada péptido; combinar las células CD8+ con los monocitos de sangre periférica adherentes a una relación de alrededor de diez células CD8+: un monocito de sangre periférica; e introducir la suspensión de células CD8+ en el sujeto. En una modalidad de este método, la nnAPC es capaz de presentar hasta alrededor de diez moléculas peptídicas, y de preferencia la molécula peptídica tiene alrededor de ocho a diez aminoácidos de longitud. De preferencia, las moléculas están a una escala de concentración de alrededor de 10 nM a 100 µ?. También de preferencia, el componente de citocina es IL-2 o IL-2 e IL-7 en combinación. En otra modalidad de este método, la dosis de radiación gamma es de aproximadamente 3,000 a 7,000 rads, y de preferencia de alrededor de 5,000 rads. La invención se refiere también a un método para tratar a un sujeto con melanoma, el cual comprende los pasos de: administrar al sujeto una cantidad efectiva de interferón-alfa que sea capaz de mejorar la expresión del antígeno tumoral sobre la superficie del tumor; e inocular a dicho sujeto con una cantidad efectiva de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. En una modalidad preferida de este método, el método comprende además el paso de administrar al sujeto una cantidad efectiva de interleucina-2 que sea capaz de mejorar el mantenimiento ¡n vivo de los linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. De preferencia, el interferón-alfa se selecciona de interferón-alfa-2a o interferón-alfa-2b, y la cantidad efectiva de interferón-alfa es de aproximadamente 10 MU/m2/día, y se administra subcutáneamente al sujeto consecutivamente del día 5 al día 1 antes de inocular a dicho sujeto con la cantidad efectiva de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. También de preferencia, la cantidad efectiva de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma, es de alrededor de 1-10 x 109 células/infusión. También de preferencia, los linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma, se obtienen mediante un método que comprende los pasos de: preparar una línea de células que presentan antígenos de ocurrencia no natural (nnAPC), en donde la nnAPC es capaz de presentar simultáneamente hasta alrededor de quince epítopes diferentes asociados con melanoma, en donde cada epítope es un péptido de ocho a diez aminoácidos de longitud; cargar la nnAPC con hasta aproximadamente quince epítopes diferentes asociados con el melanoma; cosechar células CD8+ del sujeto; estimular las células CD8+ con la línea de células nnAPC cargada con los epítopes, para obtener células CD8+ específicas del melanoma; desarrollar las células CD8+ específicas del melanoma en medios que contengan IL-2 e IL-7; mezclar monocitos de sangre periférica agotados en CD8 colectados del sujeto, con cada epítope con el que la nnAPC se ha cargado; irradiar los monocitos de sangre periférica agotados en CD8 con radiación gamma; aislar monocitos de sangre periférica cargados con CD8 adherentes; cargar los monocitos de sangre periférica adherentes con cada epítope con el que la nnAPC se ha cargado; reestimular las células CD8+ específicas del melanoma con los monocitos de sangre periférica adherentes cargados con los epítopes; desarrollar las células CD8+ reestimuladas específicas del melanoma en medios que contengan IL-2 e IL-7; y expandir las células CD8+ reestimuladas específicas del melanoma mediante estimulación con anticuerpos OKT3. De preferencia, el paso de reestimulación puede repetirse por lo menos una vez más. En otra modalidad preferida de este método, la línea de células que presentan antígenos de ocurrencia no natural se carga con epítopes que son péptidos derivados de tirosinasa, gp100 y MART-1 , y de preferencia la línea de células que presentan antígenos de ocurrencia no natural, se carga con epítopes que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. También de preferencia, la cantidad efectiva de ¡nterleucina-2 es de aproximadamente 3 MlU/día, y se administra subcutáneamente al sujeto consecutivamente del día 0 al día 28 después de inocular a dicho sujeto con la cantidad efectiva de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. También de preferencia, el método se repite a un intervalo de alrededor de 2 meses. En una modalidad preferida, el método se repite durante por lo menos dos ciclos, y comprende además el paso de evaluar una respuesta en dicho sujeto después de cada ciclo. En otra modalidad preferida de este método, el método comprende los pasos de administrar subcutáneamente al sujeto 10 MU/m2/día de interferón-alfa-2b consecutivamente del día 5 al día 1 antes de inocular a dicho sujeto con linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma; infundir alrededor de 1-10 x 109 células/infusión de los linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma; y administrar subcutáneamente al sujeto alrededor de 3 MlU/día de interleucina-2 consecutivamente del día 0 al día 28 después de inocular a dicho sujeto con los linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1 : Esta figura es una ilustración gráfica de la interacción entre células CD8+, conocidas también como linfocitos T citotóxicos, con células que presentan antígenos o células objetivo, en este caso células tumorales. Figura 2, paneles A y B: Esta figura es una ilustración gráfica de dos paneles de mecanismos de citosis mediada por linfocitos. Figura 3: Esta figura muestra el resultado de un experimento en donde varios péptidos diferentes se pusieron a prueba en una prueba de competencia para identificar enlazadores de péptidos que pudieran usarse para cargar péptidos múltiples en células de Drosophila que expresan moléculas de clase I vacías humanas. Figura 4, paneles A, B y C: Esta figura muestra el resultado de un experimento en donde se pusieron a prueba tres péptidos de melanoma para la capacidad para exponer CTLs cuando se añaden como epítopes individuales en células de Drosophila. En este donador (#60), se indujo la actividad de CTLs para cada uno de los péptidos cuando se añadieron solos a tres preparaciones de Drosophila diferentes. El carácter específico de la respuesta se comparó con el péptido HBc control, un enlazador de alta afinidad. Figura 5, paneles A, B y C: Esta figura muestra los resultados de una serie de experimentos en donde hasta cuatro péptidos diferentes se añadieron a células Drosophila individuales. Se observó la actividad de CTLs contra cada uno de los péptidos representados después de un protocolo de estimulación de tres semanas, y se ilustra gráficamente en esta figura. Se representan los resultados de tres donadores diferentes (#93, 94, 95). Figura 6, paneles A, B y C: Esta figura muestra la actividad de CTLs después de dos protocolos de estimulación in vitro primarios diferentes. Figura 7, paneles A y B: Esta figura compara la capacidad de células de Drosophila contra células dendríticas para inducir respuestas de CTLs a un epítope peptídico individual después de protocolos de estimulación normales. Figura 8: Esta figura muestra que las células dendríticas que exhiben un fenotipo maduro o inmaduro, no fueron tan eficientes como las células de Drosophila para inducir respuestas de CTLs específicas cuando se usaron péptidos definidos para pulsar las células. Figura 9, paneles A, B y C: Esta figura muestra la actividad de CTLs generada por un donador individual a tres protocolos de estimulación in vitro diferentes que presentan cuatro péptidos. Figura 0: Esta figura muestra la actividad de CTLs generada para diez (10) péptidos cargados, en combinación, a células de Drosophila. Figura 11: Esta figura muestra la capacidad de unión a péptidos de los péptidos HER-2 (826, 835, 861 y 863) en las células de Drosophila transfectadas con las moléculas de clase I HLA-A2.1 humana. Figura 12: Esta figura demuestra la respuesta antipeptídica y antitumoral para células efectoras específicas de MART-1. Se cargaron células T2 con péptido MART-1 o un control negativo (HBc). Malme3M es una línea de melanoma, y Malme3 es una línea de células no tumorales. Figura 13, paneles A y B: Esta figura muestra la tinción de tetrámeros de las células efectoras CD8 específicas de HER-2 de dos donadores diferentes. Figura 14: Esta figura revela la respuesta antipeptídica para las células efectoras de HER-2 evaluadas en células T2 cargadas con péptidos. Figura 15, paneles A, B, C y D: Esta figura demuestra la destrucción mejorada de una línea de células de tumor de ovario (HTB-77) cuando fue transfectada con HLA-A2.1. Figura 16: Esta figura muestra la destrucción mejorada de una línea de células de cáncer de mama (HTB-133) cuando fue transfectada con HLA-A2.1. Figura 17: Esta figura muestra que se requiere pretratamiento con IFNy para demostrar lisis de la línea de células tumorales HTB-77/A2.1. Figura 18, paneles A y B: Esta gráfica demuestra que la expresión de superficie de HLA-A2 y HER-2 no es afectada por la inducción de IFNy en las dos líneas de células (HTB-77 y HTB-77/A2.1). Figura 19: Esta gráfica muestra que los niveles de ARN mensajero para proteína se elevan en las células HTB-77/A2.1 después de una inducción con IFNy. Figura 20: Esta gráfica muestra el esbozo experimental de CTL-03 del estudio clínico. Figura 21 : A) muestra la curva de crecimiento in vitro de CTLs aislados de un paciente (15-RT) bajo CTL-02 del estudio clínico. Las células se aislaron del paciente en el día 0 de cada uno de los tres ciclos de tratamiento, partiendo en: 9/28/99 (15-RT-1 ), 1 1/22/99 (15-RT-2) y 2/15/99 (15-RT-03), y se cultivaron in vitro. B) muestra la curva de crecimiento in vitro de CTLs aislados de un paciente (01 -KN) bajo CTL-03 del estudio clínico. Las células se aislaron del paciente en el día 0 de cada uno de los tres ciclos de tratamiento, partiendo en: 10/30/00 (01-KN-1), 1/30/01 (01-KN-2) y 4/9/0 (01- KN-3), y se cultivaron in vitro. Figura 22: Esta figura muestra que el número de células T específicas de antígeno de melanoma aumentó en el paciente después de un ciclo de tratamiento en CTL-03 del estudio. Se usaron moléculas tetraméricas de HLA-A2.1 preparadas con péptidos gp100 o MART-1 , para monitorear la presencia de células T específicas de antígeno en preparaciones de células CD8+ purificadas obtenidas de las muestras de leucoféresis. Se registró el por ciento (%) de células positivas a las moléculas tetraméricas al momento de la primer (I) y segunda (II) muestra de leucoféresis, que podrían estar separadas tanto como dos (2) meses. Figura 23: Esta figura muestra la correlación entre tres diferentes pruebas in vitro usadas para medir actividad citolítica, carácter específico por el antígeno y proliferación celular de CTLs. Se realizaron tres pruebas diferentes en todas las preparaciones de CTLs CD8+ al final del protocolo de estimulación ex vivo (CTL-03). Las tres pruebas están en general de acuerdo para determinar la formación del cultivo global final. En esta preparación particular, la mayoría de las células T en el producto fueron dirigidas hacia el péptido gp100 (817). La actividad de CTL define la función citolítica y efectora de las células. La tinción de los tetrámeros determina la frecuencia de las células específicas del antígeno, y la tinción del IFN-gamma intraceiular refleja la capacidad de las células T para responder a un péptido particular. Figura 24: Esta figura muestra un incremento en la cantidad de interferón gamma en el mismo punto de tiempo del ciclo con cada ciclo de tratamiento repetitivo en el CTL-03 del estudio, sugiriendo la presencia de células T de memoria en el mismo punto de tiempo del ciclo. Se midió el interferón gamma en el sobrenadante de los cultivos ex vivo seis (6) días después de la estimulación primaria con las células de Drosophila. Figura 25: Esta figura ilustra el número de ciclos y dosis de células administradas a cada paciente en el estudio clínico descrito en el ejemplo 2. La potencia de cada dosis se calculó multiplicando el número de células CD8+ por las unidades líticas registradas para la lisis de una combinación de los péptidos cargados en las células objetivo.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención provee un método para tratar a un sujeto con cáncer, el cual comprende: a. preparar una línea de células que presentan antígenos de ocurrencia no natural (nnAPC), en donde dicha nnAPC es capaz de presentar simultáneamente hasta alrededor de 15 moléculas peptídicas diferentes que se asocian con cáncer, de preferencia aproximadamente diez moléculas peptídicas diferentes, en donde cada péptido tiene aproximadamente 6 a 12 aminoácidos de longitud, de preferencia alrededor de 8 a 10 aminoácidos de longitud, y a una escala de concentración de aproximadamente 10 nM a 100 µ?; b. cosechar células CD8+ de dicho sujeto o un donador adecuado; c. estimular dichas células CD8+ con dicha línea de células nnAPC; d. añadir dichas células CD8+ a medios que contengan una citocina, tal como IL-2, IL-7 o medio de crecimiento acondicionado (CGM), de preferencia IL-2, o IL-2 e IL-7 en combinación; e. mezclar monocitos de sangre periférica no suspendidos o, en forma alternativa, monocitos de sangre periférica agotados en CD-8 colectados de dicho sujeto o un donador adecuado, con aproximadamente 5 a 50 µg/mL· de un péptido; f. irradiar dicha suspensión de monocitos de sangre periférica con una dosis suficiente de radiación gamma necesaria para prevenir la proliferación de estas células en la suspensión, tal como una dosis en la escala de alrededor de 3,000 a 7,000 rads, de preferencia aproximadamente 5,000 rads; en forma alternativa, la suspensión de linfocitos de sangre periférica puede tratarse con agentes citostáticos que incluyen, pero no están limitados a, mitomicina C; g. aislar monocitos de sangre periférica adherentes; h. cargar dichos monocitos de sangre periférica adherentes con aproximadamente 5 g/mL a 50 µg/mL de cada uno de dichos péptidos; i. combinar dichas células CD8+ con dichos monocitos de sangre periférica adherentes a una relación de aproximadamente diez células CD8+: un monocito de sangre periférica; j. estimular opcionalmente dicha suspensión combinada de células CD8+ y monocitos de sangre periférica durante aproximadamente seis a nueve días; k. estimular opcionalmente dicha suspensión de células CD8+ y monocitos de sangre periférica con IL-2 e IL-7 en medios; I. poner a prueba opcionalmente la suspensión de células CD8+ para actividad de CTLs adecuada, y poner a prueba opcionalmente la pureza, esterilidad y contenido de endotoxinas de los CTLs; y m. inocular a dicho sujeto con dicha suspensión de células CD8+. Otra modalidad de la presente invención, provee un método para tratar a un sujeto con cáncer, el cual comprende: a. preparar una línea de células que presentan antígenos de ocurrencia no natural (nnAPC), en donde dicha nnAPC es capaz de presentar simultáneamente hasta alrededor de quince moléculas peptídicas diferentes que se asocian con cáncer, de preferencia aproximadamente diez péptidos, en donde cada péptido tiene de ocho a diez aminoácidos de longitud; b. cosechar células CD8+ de dicho sujeto; c. estimular dichas células CD8+ con dicha línea de células nnAPC durante aproximadamente seis a nueve días; d. estimular dichas células CD8+ con IL-2 e IL-7 en medios; e. mezclar los monocitos de sangre periférica colectados de dicho sujeto, con alrededor de 10 µg/mL de cada péptido; f. irradiar dicha suspensión de monocitos de sangre periférica agotados en CD8 con aproximadamente 5,000 rads de radiación gamma; g. aislar monocitos de sangre periférica adherentes; h. cargar dichos monocitos de sangre periférica adherentes con alrededor de 10 ug/mL de dicho epítope; i. combinar dichas células CD8+ con dichos monocitos de sangre periférica adherentes a una relación de aproximadamente diez células CD8+: un monocito de sangre periférica; j. estimular dicha suspensión combinada de células CD8+ y monocitos de sangre periférica durante aproximadamente seis a nueve días; k. estimular dicha suspensión de células CD8+ y monocitos de sangre periférica con IL-2 e IL-7 en medios; I. poner a prueba dicha suspensión de células CD8+ para actividad, pureza, esterilidad y contenido de endotoxinas adecuados de los CTLs; y m. inocular a dicho sujeto con la suspensión de células CD8+. Otra modalidad de la presente invención, provee un método para tratar a un sujeto con melanoma, el cual comprende: a. preparar una línea de células que presentan antígenos de ocurrencia no natural (nnAPC), en donde dicha nnAPC es capaz de presentar simultáneamente hasta alrededor de quince moléculas peptídicas diferentes que se asocian con melanoma, de preferencia aproximadamente diez péptidos, en donde cada péptido tiene de ocho a diez aminoácidos de longitud; b. cosechar células CD8+ de dicho sujeto; c. estimular dichas células CD8+ con dicha línea de células nnAPC durante aproximadamente seis a nueve días; d. estimular dichas células CD8+ con IL-2 e IL-7 en medios; e. mezclar los monocitos de sangre periférica colectados de dicho sujeto, con alrededor de 20 g/mL de cada péptido que dicha nnAPC puede presentar; f. irradiar dicha suspensión de monocitos de sangre periférica agotados en CD8 con aproximadamente 5,000 rads de radiación gamma; g. aislar monocitos de sangre periférica adherentes; h. cargar dichos monocitos de sangre periférica adherentes con alrededor de 10 ug/mL de dicho epítope; i. combinar dichas células CD8+ con dichos monocitos de sangre periférica adherentes a una relación de aproximadamente diez células CD8+: un monocito de sangre periférica; j. estimular dicha suspensión combinada de células CD8+ y monocitos de sangre periférica durante aproximadamente seis a nueve días; k. estimular dicha suspensión de células CD8+ y monocitos de sangre periférica con IL-2 e IL-7 en medios; I. poner a prueba la suspensión de células CD8+ para actividad, pureza, esterilidad y contenido de endotoxinas adecuados de los CTLs; y m. inocular a dicho sujeto con la suspensión de células CD8+. Otra modalidad de la presente invención, es un método para tratar melanoma, en donde la nnAPC presenta los siguientes péptidos, t¡rosinasa369-377, tirosinasa207-2i6, gp100209-2i7, gp100i54-i62, MART-127.35, HER-2/neu789-797, HER-2/neu36M77» C-Iectina8-16, Pec6020-29 y Pec6025-33. Otra modalidad de la presente invención, es un método para tratar una enfermedad o condición de enfermedad que da como resultado una respuesta inmune inadecuada o insuficiente que se asocia normalmente con moléculas HLA de clase I, en donde el tratamiento elimina células infectadas o transformadas. Otra modalidad de la presente invención, es un método para tratar una enfermedad o condición de enfermedad que da como resultado una respuesta inmune insuficiente o inadecuada que se asocia normalmente con moléculas HLA de clase I, en donde células infectadas o transformadas que se ha mostrado son susceptibles a la eliminación por CTLs, se tratan mediante el método que comprende: a. preparar una línea de células que presentan antígenos de ocurrencia no natural (nnAPC), en donde dicha nnAPC es capaz de presentar simultáneamente hasta alrededor de 15 moléculas peptídicas diferentes asociadas con dicha enfermedad o condición de enfermedad, de preferencia aproximadamente diez moléculas peptídicas diferentes, en donde cada péptido tiene aproximadamente 6 a 12 aminoácidos de longitud, de preferencia alrededor de 8 a 10 aminoácidos de longitud, y a una escala de concentración de aproximadamente 10 nM a 100 µ?; b. cosechar células CD8+ de dicho sujeto o un donador adecuado; c. estimular dichas células CD8+ con dicha línea de células -nnAPC; d. añadir dichas células CD8+ a medios que contengan una citocina, tal como IL-2, 1L-7 o medio de crecimiento acondicionado (CGM), de preferencia IL-2, o IL-2 e IL-7 en combinación; e. mezclar monocitos de sangre periférica no suspendidos o, en forma alternativa, monocitos de sangre periférica agotados en CD-8 colectados de dicho sujeto o un donador adecuado, con aproximadamente 5 a 50 9?t??_ de un péptido; f. irradiar dicha suspensión de monocitos de sangre periférica con una dosis suficiente de radiación gamma necesaria para prevenir la proliferación mientras se mantiene la capacidad de estimulación de los monocitos de sangre periférica, tal como una dosis en la escala de alrededor de 3,000 a 7,000 rads, de preferencia aproximadamente 5,000 rads; g. aislar monocitos de sangre periférica adherentes; h. cargar dichos monocitos de sangre periférica adherentes con aproximadamente 5 µg/mL a 50 µg/mL de cada uno de dichos péptidos; i. combinar dichas células CD8+ con dichos monocitos de sangre periférica adherentes a una relación de aproximadamente diez células CD8+: un monocito de sangre periférica; j. estimular opcionalmente dicha suspensión combinada de células CD8+ y monocitos de sangre periférica durante aproximadamente seis a nueve días; k. estimular opcionalmente dicha suspensión de células CD8+ y monocitos de sangre periférica con IL-2 e IL-7 en medios; I. poner a prueba opcionalmente la suspensión de células CD8+ para actividad de CTLs adecuada, y poner a prueba opcionalmente la pureza, esterilidad y contenido.de endotoxinas de los CTLs; y m. inocular a dicho sujeto con dicha suspensión de células CD8+. La presente invención provee una célula que presenta antígenos de ocurrencia no natural (nnAPC), derivada de células de Drosophila melanogaster transfectadas con ADN que codifica para moléculas HLA clase I de unión y co-estimulantes humanas para expresión, en donde la nnAPC es capaz de presentar hasta quince moléculas peptídicas diferentes, de preferencia diez moléculas peptídicas. Otra modalidad de la presente invención, provee una nnAPC que presenta péptidos que se asocian con varias funciones deseadas que mejoran el tratamiento del sujeto. Por ejemplo, además de los péptidos asociados con la enfermedad o condición de enfermedad que se está tratando, la nnAPC puede expresar proteínas asociadas con moléculas accesorias tales como antígenos con función de linfocitos (LFA-1 , LFA-2 y LFA-3), moléculas de adhesión intercelular 1 y 2 (ICAM-1 e ICAM-2) y factores co-estimulantes de células T (CD40, CD70, B7) que mejoran la adhesión entre células o transducen otras señales de activación celular.

Otra modalidad de la presente invención, provee una nnAPC que presenta péptidos que se asocian con varios tipos de cánceres. Por ejemplo, los péptidos asociados o derivados de un polipéptido relacionado con cáncer de mama, tal como HER-2/neu, puede presentarse con péptidos asociados o derivados de un polipéptido relacionado con melanoma, tal como MART-1 o MAGE. Otra modalidad de la presente invención, provee un método para obtener una célula que presenta antígenos de ocurrencia no natural (nnAPC) capaz de presentar simultáneamente hasta diez moléculas peptídicas diferentes, dicho método comprendiendo los pasos de: a. preparar una línea de células de insecto a partir de huevos de Drosophila melanogaster, en forma alternativa, preparar una línea de células de insecto que exprese moléculas MHC clase I humanas y moléculas de adhesión co-estimulantes; b. desarrollar dichas células de insecto en medios que sean adecuados para desarrollar células de insecto, de preferencia medio de Schneider™ para Drosophila; c. obtener un plásmido pRmHa-3 de un vector de expresión de pRmHa-1 , en donde dicho plásmido pRmHa-3 incluya un promotor de metalotioneína, secuencias consenso de respuesta a metal y un gen de alcohol deshidrogenase que posea una señal de poliadenilación aislada de Drosophila melanogaster, d. insertar en dicho plásmido pRmHa-3 ADN complementario para HLA clase I humana, A2.1 , B7.1 , B7.2, ICAM-1 , microglobulina ß-2 y LFA-3, en donde A2.1 pueda ser sustituida con cualquier secuencia de ADN clase I de humano; e. transfectar dichas células de insecto con un plásmido phshneo, y dicho plásmido pRmHa-3 conteniendo ADN complementario; y f. crear una nnAPC poniendo en contacto dichas células de insecto con sulfato de cobre, para inducir la expresión de los genes transfectados en dichas células de insecto. Las células de insecto de la presente invención se desarrollan en medios adecuados para el desarrollo de células de insecto, referidos en lo sucesivo como "medios para el desarrollo de células de insecto". Medios para el desarrollo de células de insecto están disponibles comercialmente de un número de proveedores, como es el caso de medio de Schneider™ para Drosophila, medio de Grace para insectos y medio TC-100 para insectos. En forma alternativa, los medios para el desarrollo de células de insecto pueden ser preparados por los expertos en la técnica. Típicamente, los medios incluirán componentes necesarios para promover y sustentar el crecimiento de células de insecto, tales como sales inorgánicas (por ejemplo, cloruro de calcio, sulfato de magnesio, cloruro de potasio, fosfato de potasio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio y fosfato de sodio), varios aminoácidos, carbohidratos y especies químicas (Imogene Schneider, Exp. Zool. (1964) 156(1): pág. 91). En forma alternativa, los medios pueden incluir también vitaminas, minerales y otros componentes que faciliten el desarrollo de las células de insecto. La presente invención provee además un método para tratar a un sujeto con cáncer, el cual comprende los pasos de: a) administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de interferón-alfa que sea capaz de mejorar la expresión de moléculas HLA clase I y de antígeno tumoral sobre la superficie del tumor; y b) inocular a dicho sujeto con una cantidad efectiva de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con cáncer. En una modalidad preferida, el método de tratamiento comprende además el paso de administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de interleucina-2 que sea capaz de mejorar el mantenimiento in vivo de los linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. A continuación se da una lista de abreviaturas y definiciones que se usan en la presente especificación: Abreviaturas APC Células que presentan antígeno CD8+ Células T CD8+ CTLs Linfocitos T citotóxicos E Efector Fas Conocido también como CD95, epítope en células T ICAM Molécula de adhesión intercelular IL Interleucina LAK Células asesinas activadas por linfocinas LFA Antígenos con función de linfocitos MHC Complejo de histocompatibilidad mayor nnAPC Célula que presenta antígenos de ocurrencia no natural NP Proteína nuclear PBMC Célula mononuclear de sangre periférica PBS Solución salina regulada en su pH con fosfato PCR Reacción en cadena de polimerasa RPMI Roswell Park Memorial Institute RWJPRI The R. W. Johnson Pharmaceutical Research Institute T Objetivo TCR Receptor de antígenos de células T TIL Linfocitos de infiltración en tumores A continuación se da una lista de abreviaturas usadas en la presente especificación para varios epítopes peptídicos. Los residuos de aminoácido individuales se identifican de acuerdo a un código de una sola letra que es fácilmente conocido y usado por los expertos en la técnica.

Aminoácido Abreviaturas Tres letras Una letra alanina ala A valina val V leucina leu L isoleucina lie I prolina pro P fenilalanina phe F triptófano tyr W metionina met M glicina g'y G serina ser S treonina thr T cisteína cys c tirosina tyr Y asparagina asn N glutamina gln Q ácido aspártico asp D ácido glutámico glu E lisina lys K arginina arg R histidina his H Abreviaturas de epítopes peptídicos Como se usa en la presente, el término "tirosinasa 369-377" o "tirosinasa369-377" se refiere a la secuencia de aminoácidos YMNGTMSQV (SEQ ID NO: 1). Incluido también dentro de esta definición, es el péptido de la secuencia YMDGTMSQV (SEQ ID NO: 2), que resulta de un evento de posttraducción que modifica el residuo de aminoácido "N" de la secuencia YMNGTMSQV (SEQ ID NO: 1 ) a "D", dando como resultado la secuencia de aminoácidos YMDGTMSQV (SEQ ID NO: 2) (Skipper et al., J. Exp. Med. (1996) 183:527-534). Como se usa en la presente, el término "tirosinasa 207-216" o "tirosinasa207-2i6" se refiere a la s.ecuencia de aminoácidos FLPWHRLFLL (SEQ ID NO: 3).

Como se usa en la presente, el término "gp100 209-217" o "gp1002?9-2?7" se refiere a la secuencia de aminoácidos ITDQVPFSV (SEQ ID NO: 4). Como se usa en la presente, el término "gp100 154-162" o "gp100-154.162" se refiere a la secuencia de aminoácidos KTWGQYWQV (SEQ ID NO: 5). Como se usa en la presente, el término "MART-1 27-35" o "MART-I 27-35" se refiere a la secuencia de aminoácidos AAGIGILTV (SEQ ID NO: 6). Como se usa en la presente, el término "HER-2/neu 789-797" o "HER-2/neu789.797" se refiere a la secuencia de aminoácidos CLTSTVQLV (SEQ ID NO: 7). Como se usa en la presente, el término "HER-2/neu 369-377" o "HER-2/neu369-377" se refiere a la secuencia de aminoácidos KIFGSLAFL (SEQ ID NO: 8). Como se usa en la presente, el término "C-lectina 8-16" o "C-Iectina8-16" se refiere a la secuencia de aminoácidos KMASRSMRL (SEQ ID NO: 9). Como se usa en la presente, el término "Pec60 20-29" o "Pec602o-29" se refiere a la secuencia de aminoácidos ALALAALLW (SEQ ID NO: 10). Como se usa en la presente, el término "Pec60 25-33" o "Pec6025-33" se refiere a la secuencia de aminoácidos ALLVVDREV (SEQ ID NO: 11 ). Como se usa en la presente, el término "péptido 59-70 de CD8" o "péptid059-7o de CD8" se refiere a la secuencia de aminoácidos AAEGLDTQRFSG (SEQ ID NO: 12).

Términos y definiciones Como se usa en la presente, el término "inmunoterapia adoptiva" se refiere a la administración de linfocitos T del donador o autólogos para el tratamiento de una enfermedad o condición de enfermedad, en donde la enfermedad o condición de enfermedad da como resultado una respuesta inmune insuficiente o inadecuada que se asocia normalmente con moléculas HLA clase I. La inmunoterapia adoptiva es un tratamiento adecuado para cualquier enfermedad o condición de enfermedad, en donde se ha demostrado que se logrará la eliminación de células infectadas o transformadas mediante CTLs. Por ejemplo, la enfermedad o las condiciones de enfermedad incluyen, pero no están limitadas a, cáncer y/o tumores tales como, por ejemplo, melanoma, leucemia y cáncer de próstata, mama, huesos, pulmón, estómago, garganta y cuello, colorrectal, pancreático, cervical y de ovario; infecciones virales tales como hepatitis B y hepatitis C; virus de inmunodeficiencia humana; infecciones bacterianas tales como tuberculosis, lepra y listeriosis, e infecciones parasitarias tales como malaria. Como se usa en la presente, los términos "B7.1 y B7.2" se refieren a moléculas co-estimulantes asociadas con células que presentan antígenos. Como se usa en la presente, el término "BCNU" se refiere a carmustina, conocida también como 1 ,3-bis (2cloroetil)-1-nitrosourea. Como se usa en la presente, el término "BSE" se refiere a encefalitis espongiforme de bovinos. Como se usa en la presente, el término "CD" se refiere (originalmente) a grupos de linfocitos T de diferenciación, linfocitos B, monocitos, macrófagos y granulocitos agrupados por epítopes y función de antígeno. Como se usa en la presente, el término "DTIC" se refiere a dacarbazina, 5-(3,3-dimetil-1 -triazeno)-imidazol-4-carboxamida. Como se usa en la presente, el término "ex vivo" o "terapia ex vivo" se refiere a un terapia en donde materiales biológicos, típicamente células, se obtienen de un paciente o una fuente alterna adecuada tal como un donador adecuado, y se modifican, de modo que las células modificadas pueden usarse para tratar una condición patológica que mejorará gracias a la liberación a largo plazo o constante del beneficio terapéutico producido por las células modificadas. El tratamiento incluye la reintroducción de los materiales biológicos modificados, obtenidos del paciente o de la fuente alterna, en el paciente. Un beneficio de la terapia ex vivo, es la capacidad para proveer al paciente con el beneficio del tratamiento, sin exponer al paciente a los efectos secundarios no deseables del tratamiento. Por ejemplo, se administran con frecuencia altas dosis de citocinas a pacientes con cáncer o infecciones virales, para estimular la expansión de los CTLs del paciente. Sin embargo, las citocinas causan con frecuencia el inicio de síntomas tipo influenza en los pacientes. En un procedimiento ex vivo, se usan citocinas para estimular la expansión de los CTLs fuera del cuerpo del paciente, y se libera al paciente de la exposición y los efectos secundarios consecuentes de las citocinas. En forma alternativa, bajo situaciones o condiciones adecuadas, cuando sea adecuado y en donde el sujeto pueda obtener algún beneficio, el sujeto puede tratarse concurrentemente con dosificaciones de bajo nivel de interferón-?, ¡nterferón-a y/o IL-2. El efecto esperado de los interferones, es sensibilizar posiblemente a las células tumorales a la lisis por CTLs específicos de antígenos, y el efecto de la IL-2 es mejorar posiblemente la persistencia de CTLs específicos para el antígeno. Como se usa en la presente, el término "HEPES" se refiere a regulador de pH de ácido N-2-hidroxietilpiperazino-N'2-etansu!fónico. Como se usa en la presente, el término "HLA-A2.1" se refiere a una molécula HLA clase I presente en aproximadamente 45% de los caucásicos. Como se usa en la presente, el término " ART-1" o "antígeno de melanoma reconocido por células T1 ", se refiere a un antígeno asociado con melanoma. La secuencia de aminoácidos y de ácido nucleico, así como varias características de este antígeno, se describen en la patente de E.U.A. No. 5,994,523, expedida en noviembre 30, 1999, titulada "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods"; patente de E.U.A. No. 5,874,560, expedida en febrero 23, 1999, titulada "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods"; y patente de E.U.A. No. 5,844,075, expedida en diciembre 1 , 1998, titulada "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods". En particular, la patente de E.U.A. No. 5,994,523 describe secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos de longitud completa de MART-1 en la figura 1 , como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente. La figura 1 mencionada anteriormente, se incorpora en la presente como referencia. Como se usa en la presente, el término "MAGE" se refiere a un antígeno asociado con melanoma. Las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico, así como varias características de este antígeno, se describen en la patente de E.U.A. No. 6,140,050, expedida en octubre 31 , 2000, titulada "Melanoma for Determining Breast Cáncer and Melanoma by Assaying for a Plurality of Antigens Associated Therewith"; patente de E.U.A. No. 5,759,783, expedida en junio 2, 1998, titulada "Method of Screening for Cáncer by Detecting Messenger RNA for a MAGE-XP Gene"; y patente de E.U.A. No. 5,662,907, expedida en septiembre 2, 1997, titulada "Induction of Anti-Tumor Cytotoxic TLymphocytes in Humans Using Synthetic Peptide Epitopes". Como se usa en la presente, el término "MPC- 0" se refiere a un concentrador de partículas magnéticas. Como se usa en la presente, el término "células NK" se refiere a células asesinas naturales. Como se usa en la presente, el término "OKT3" se refiere a ORTHOCLONE OKT3, muromonab-CD3, anticuerpo monoclonal anti-CD3. Como se usa en la presente, el término "TAP-1 ,2" se refiere a transportador asociado con procesamiento de antígenos 1 ,2. Como se usa en la presente, el término "células Th" se refiere a células T auxiliares, CD4+. Como se usa en la presente, el término "tirosinasa" se refiere a una proteína asociada con melanoma (Brichard et al., J. Exp. Med. (1993) 178: 489-495; Robbins et al., Cáncer Res. (1994) 54: 3124-3126). La patente de E.U.A. No. 5,843,648, expedida en diciembre 1 , 1998, titulada "P15 and Tyrosinase Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods", describe péptidos antigénicos y ácidos polinucleicos asociados relacionados con tirosinasa en la figura 7, paneles A a D, la figura mencionada anteriormente siendo incorporada en la presente como referencia. La patente de E.U.A. No. 5,487,974, expedida en enero 30, 1996, titulada "Method for Detecting Complexes Containing Human Leukocyte Antigen A2 (HLA-A2) Molecules and a Tyrosinase Derived Peptlde on Abnormal Cells", describe un péptido adicional que se asocia con tirosinasa y melanoma en el ejemplo 9, en el cuadro 3, la figura mencionada anteriormente siendo incorporada en la presente como referencia. Como se usa en la presente, el término "gp100" se refiere a un antígeno de melanoma reconocido por linfocitos de infiltración en tumores (TIL). Los TIL que reconocen a gp 00 se asocian con el rechazo del tumor in vivo (Bakker et al, J. Exp. Med. (1994) 179: 1005-1009; Kawakami et al., J.

Immunol. (1995) 154: 3961-3968). Péptidos antigénicos relacionados con gp100, se describen en la patente de E.U.A. No. 5,994,523, expedida en noviembre 30, 1999, titulada "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods"; patente de E.U.A. No. 5,874,560, expedida en febrero 23, 1999, titulada "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods"; y patente de E.U.A. No. 5,844,075, expedida en diciembre 1 , 1998, titulada "Melanoma Antigens and Their Use in Diagnostic and Therapeutic Methods". En particular, la patente de E.U.A. No. 5,994,523 describe secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos, relacionadas con GP100 en las figuras 4 y 5, respectivamente. Descritos también son péptidos antigénicos derivados de las secuencias de aminoácidos que incluyen las secuencias identificadas como SEQ ID NOs: 27, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 y 41. Las figuras 4 y 5 mencionadas anteriormente, y los péptidos identificados por SEQ ID NOs, se incorporan en la presente como referencia. Como se usa en la presente, el término "melanoma" se refiere, pero no está limitado a, melanomas, melanomas metastásicos, melanomas derivados de melanocitos o células de nevus relacionadas con melanocitos, melanosarcomas, melanocarcinomas, melanoepiteliomas, melanoma de extensión superficial in situ, melanoma nodular, melanoma de lentícula maligna, melanoma lentiginoso acral, melanoma invasivo o síndrome de mola y melanoma familiar (FAM-M) atípico. Dichos melanomas en mamíferos pueden ser causados por anormalidades cromosómicas, trastornos degenerativos del desarrollo y el crecimiento, agentes mitogénicos, radiación ultravioleta (UV), infecciones virales, expresión inadecuada de un gen en tejidos, alteraciones en la expresión de un gen y presentación de agentes carcinógenos en una célula. Los melanomas mencionados anteriormente pueden diagnosticarse, evaluarse o tratarse mediante los métodos descritos en la presente solicitud. Como se usa en la presente, el término "C-lectina" se refiere a un péptido de la secuencia que se ha encontrado está asociada con cáncer de ovario. Como se usa en la presente, el término "complejo de histocompatibilidad mayor" o " HC", es una designación genérica que se usa para abarcar los sistemas de antígenos de histocompatibilidad descritos en diferentes especies, incluyendo los antígenos de leucocitos humanos (HLA). Como se usa en la presente, los términos "epítope", "epítope peptídico", "péptido antigénico" y "péptido inmunógeno", se refieren a un péptido derivado de un antígeno capaz de causar una respuesta inmune celular en un mamífero. Dichos péptidos pueden ser también reactivos con anticuerpos de un animal inmunizado con los péptidos. Dichos péptidos pueden tener alrededor de cinco a veinte aminoácidos de longitud,- de preferencia aproximadamente 8 a 15 aminoácidos de longitud, y más preferiblemente alrededor de 9 a 10 aminoácidos de longitud. Como se usa en la presente, el término "Pec60" se refiere a un péptido de la secuencia que se ha encontrado se asocia con cáncer de ovario y de mama.

Como se usa en la presente, el término "análogo" incluye cualquier polipéptido que tenga una secuencia de residuos de aminoácido sustancialmente idéntica a las secuencias de la presente invención mostradas específicamente en la presente, en las cuales uno o más residuos han sido sustituidos conservativamente con un residuo funcionalmente similar y exhiben los aspectos funcionales de la presente invención, como se describe en la presente. Ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrofóbico) tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, la sustitución de un residuo polar (hidrofílico) por otro, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina, la sustitución de un residuo básico tal como lisina, arginina o histidina por otro, o la sustitución de un residuo ácido tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro. Como se usa en la presente, el término "sustitución conservativa" incluye también el uso de un residuo químicamente derivatizado en lugar de un residuo no derivatizado. Como se usa en la presente, el término "derivado químico" se refiere a un polipéptido que tiene uno o más residuos químicamente derivatizados por reacción de un grupo lateral funcional. Ejemplos de dichas moléculas derivatizadas incluyen, por ejemplo, las moléculas en las cuales grupos amino libres han sido derivatizados para formar clorhidratos de amina, grupos t-toluensulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden ser derivatizados para formar sales, ésteres metílicos y etílicos, u otros tipos de esteres o hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres pueden ser derivatizados para formar derivados de O-acilo u O-alquilo. El nitrógeno del imidazol de la histidina puede ser derivatizado para formar N-im-bencilhistina. Incluidos también como derivados químicos, son los péptidos o proteínas que contienen uno o más derivados de aminoácido de ocurrencia natural de los veinte aminoácidos normales. Por ejemplo: la 4-hidroxiprolina puede sustituir a la prolina; la 5-hidroxilisina puede sustituir a la Usina; la 3-metilhistidina puede sustituir a la histidina; la homoserina puede sustituir a la serina; y la ornitina puede sustituir a la lisina. Las proteínas o polipéptidos de la presente invención incluyen también cualquier polipéptido que tenga una o más adiciones y/o deleciones o residuos respecto a la secuencia de un polipéptido, cuya secuencia codificada sea la secuencia de ácido nucleico correspondiente de la presente invención, en tanto se conserve la actividad requerida. Como se usa en la presente, el término "HER-2/neu" se refiere a un oncogen que expresa o sobreexpresa una o más proteínas del oncogen tipo receptor asociadas con membrana. Entre los cánceres que se ha encontrado están asociados con la expresión o sobreexpresión de HER-2/neu, están ciertos cánceres de mama, estómago, ovario, colon y glándulas salivales. El oncogen HER-2/neu es un miembro de la familia de oncogenes de tirosina proteína cinasa, y comparte un alto grado de homología con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Se ha mostrado que HER-2/neu desempeña una función en el crecimiento y/o diferenciación celular. HER-2/neu parece inducir malignidades a través de mecanismos cuantitativos que resultan de la expresión incrementada o desregulada de un producto génico esencialmente normal. La patente de E.U.A. No. 6,075,122, expedida en junio 13, 2000, titulada "Immune Reactivity to HER-2/neu Protein for Diagnosis and Treatment of Malignancies in Which the HER-2 neu Oncogen is Associated', describe péptidos que inducen respuestas de células T CD8+, en la columna 12, renglón 31 a columna 13, renglón 7, identificados de acuerdo a los números de SEQ ID, y se incorporan en la presente como referencia. HER-2/neu (p 85) es el producto de proteína del oncogen HER-2/neu. El gen HER-2/neu se amplifica, y la proteína de HER-2/neu se sobreexpresa en una variedad de cánceres que incluyen cáncer de mama, ovario, colon, pulmón y próstata. HER-2/neu se relaciona con una transformación maligna. Se encuentra en 50% a 60% del carcinoma ductal in situ, y 20% a 40% de todos los cánceres de mama, así como una fracción sustancial de adenocarcinomas que surgen en los ovarios, próstata, colon y pulmón. HER-2/neu se asocia íntimamente no sólo con el fenotipo maligno, sino también con la agresividad de la malignidad, estando presente en una cuarta parte de todos los cánceres de mama invasivos. La sobreexpresion de HER-2/neu se correlaciona con un mal pronóstico en cáncer de mama y ovario. HER-2/neu es una proteína de transmembrana con una masa molecular relativa de 185 Kd, y tiene aproximadamente 1255 aminoácidos (aa) de longitud. Tiene un dominio de unión extracelular (ECD) de aproximadamente 645 aa, con 40% de homología con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), un dominio de ancla de transmembrana altamente hidrofóbico (TMD) y un dominio citoplásmico (CD) carboxi-terminal de aproximadamente 580 aminoácidos, con 80% de homología con EGFR. Como se usa en la presente, el término "interferón-alfa (IFN-a)" se refiere a una familia de proteínas altamente homologas específicas de especie que inhiben la replicación viral y la proliferación celular, y modulan la respuesta inmune. Interferones alfa adecuados típicos para el método de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, interferón alfa-2b recombinante, tal como interferón Intron-A®, disponible de Schering Corporation, Kenilworth, N.J., interferón alfa-2a recombinante, tal como interferón Roferon, disponible de Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J., interferón alfa-2c recombinante, tal como interferón Berofor alfa 2, disponible de Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc., Ridgefield, Conn., interferón alfa-n1 , una mezcla purificada de interferones alfa naturales tales como Sumiferon, disponible de Sumitomo, Japón, o como interferón alfa-n1 Wellferon (INS), disponible de Glaxo-Wellcome Ltd., Londres, Gran Bretaña, o un interferón alfa consenso tal como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 4,897,471 y 4,695,623 (especialmente los ejemplos 7, 8 ó 9 de las mismas, y el producto específico disponible de Amgen, Inc., Newbury Park, California, o interferón alfa-n3, una mezcla de interferones alfa naturales fabricados por Interferón Sciences, y disponible de Purdue Frederick Co., Norwalk, Conn, bajo la marca comercial Alferon. Se prefiere el uso de interferón alfa-2a o alfa-2. Puesto que el interferón alfa-2b, entre todos los interferones, tiene la aprobación más amplia a través del mundo para el tratamiento de infección por hepatitis C crónica, es el más preferido. La fabricación del interferón alfa-2b, se describe en la patente de E.UA No. 4,530,901. Como se usa en a presente, el término "interleucina-2 (IL-2)", se refiere a una citocina que estimula al sistema inmune y ejerce sus efectos biológicos después de su unión a receptores específicos sobre la superficie de células objetivo. La IL-2 tiene muchos efectos biológicos; por ejemplo, se sabe que induce la estimulación de células B y T activadas (incluyendo células T citotóxicas), células asesinas naturales (NK) y células asesinas activadas por linfocinas (LAK). La IL-2 puede obtenerse como un fármaco de prescripción, por ejemplo, PROLEUKIN®, fabricado por Chiron Corporation (Emeryville, CA). La IL-2 puede prepararse de varias fuentes y mediante diferentes métodos, tal como se describe en numerosas patentes de E.U.A. Estas patentes incluyen, pero no están limitadas a, la preparación de IL-2 a partir de células T, tal como a partir de líneas de células T híbridas de murino o líneas de células T malignas humanas, como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 4,407,945, 4,473,642 y 4,401 ,756, respectivamente, y la preparación de IL-2 humana recombinante, como se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 4,992,367, 4,407,945 y 4,473,642. La investigación en curso que implica oncogenes, ha permitido identificar por lo menos cuarenta oncogenes que operan en células malignas y que causan, o están asociados con, transformación. Los oncogenes se han clasificado en diferentes grupos con base en la función o ubicación putativa de sus productos génicos (tales como la proteína expresada por el oncogen). Se piensa que los oncogenes son esenciales para ciertos aspectos de la fisiología celular normal. El cáncer continúa siendo un problema de salud importante, a pesar de los progresos significativos logrados en el área de tratamiento. Los regímenes de tratamiento normales de quimioterapia, radioterapia, intervención quirúrgica y combinaciones de las mismas, fracasan con frecuencia para producir una curación duradera. En muchos casos, el paciente canceroso que se ha sometido al tratamiento con frecuencia vuelve a recaer a la condición de enfermedad después de cierto período. Exacerbando aún más el problema, es la severidad de estos regímenes de tratamiento para el paciente. En el caso del melanoma, no se ha logrado una cura para el melanoma metastásico usando quimioterapia convencional. Se han reportado índices de respuesta de 35% a 50% con el régimen de quimioterapia de combinación de Dartmouth (DTIC, cis-platina, BCNU y tamoxifeno), pero la duración de la supervivencia ha permanecido en seis a diez meses. Se han reportado altos índices de remisión para la quimioterapia agresiva de "intensidad a altas dosis", y repleción de hematopoyesis con transplantes autólogos de médula ósea. La duración media de supervivencia en estos pacientes tratados fue corta, de aproximadamente cuatro meses. Rosen berg y colaboradores han intentado usar la infusión de linfocitos activados como un tratamiento para varios cánceres. Inicialmente, se usaron células asesinas activadas por linfocinas (LAK), y después linfocitos de infiltración en tumores (TIL) activados ex vivo con IL-2, pero la evidencia de su eficacia es equívoca. De hecho, las pruebas clínicas controladas no han podido mostrar una ventaja para el uso de células activadas ex vivo sobre la administración directa de IL-2 a pacientes. De esta manera, los beneficios de la terapia con LAK y TIL son marginales, y los efectos secundarios típicamente son tan severos, que muchas pruebas se han descontinuado prematuramente. Estudios en modelos de tumores en ratones, han demostrado que la inmunoterapia adoptiva, la inmunización in vivo de células T específicas de antígenos tumorales, es muy eficaz con toxicidad mínima. Un obstáculo importante a la aplicación de esta estrategia al tratamiento de tumores humanos, es la identificación de antígenos inmunógenos que hacen que las células tumorales sean susceptibles a la destrucción mediada por linfocitos T citotóxicos, (CTLs). El aislamiento de células T reactivas a tumores de pacientes con melanoma, ha llevado a la identificación de algunos de los antígenos tumorales (epítopes) contra los cuales los CTLs se han dirigido. Estos incluyen tirosinasa (Brichard et al., J. Exp. Med. ( 993) 178: 489-495; Robbins et al., Cáncer Res. (1994) 54: 3124-3126), MART-1/Melan A (Kawakami et al., J. Exp. Med. (1994) 180: 347-352), gp 100 (Bakker et al., J. Exp. Med. (1994) 179: 1005-1009; y Kawakami et al., J. Immunol. (1995) 154: 3961-3968) y MAGE (Gauqler et al., J. Exp. Med. (1994) 179: 921-930). De estos, tirosinasa y MART-1 se expresan casi umversalmente en melanomas, y de esta manera son la elección lógica para la inmunoterapia adoptiva.

En años recientes, se han observado mejoras significativas en supervivencia en el orden de varios años en un pequeño porcentaje de pacientes con melanoma que se someten a terapia inmunológica. Esta incluye inmunoterapia específica activa con "vacunas contra el cáncer", así como el uso de intensificadores no específicos del sistema inmune, tales como las citocinas IL-2, interferón-a e in.terferón-?. Sin embargo, el beneficio de las citocinas es aminorado por los efectos secundarios que acompañan con frecuencia a su uso, tales como náusea, fiebre y síndrome tipo influenza. Las células T citolíticas (CD8+) son la principal línea de defensa contra las infecciones virales. Los linfocitos CD8+ reconocen y destruyen específicamente células hospederas que son infectadas por un virus. Teóricamente, debe ser posible usar el sistema inmune para combatir otros tipos de enfermedades que incluyen cáncer. Sin embargo, se ha contado con pocos procedimientos in vitro/ex vivo para activar específicamente los CTLs. La identificación de los antígenos de melanoma claves indicados anteriormente, y un método para la activación in vitro específica de CTLs descrita a continuación, permite ahora poner a prueba el concepto de la inmunoterapia adoptiva de melanoma metastásico. Todas las células T no afectadas requieren dos señales de activación para inducir una respuesta inmune. Para linfocitos CD8+ (CTLs), la primer señal que imparte el carácter específico, consiste de presentación, a la célula CD8+, de un fragmento peptídico inmunógeno (epítope) del antígeno unido al complejo de moléculas MHC clase I (HLA) presente sobre la superficie de las células que presentan antígenos (APCs). Este complejo es reconocido específicamente por un receptor de antígenos de células T (TCR), que comunica la señal intracelularmente. La unión al receptor de células T es necesaria, pero no suficiente para inducir la activación de células T, y usualmente no llevará a proliferación celular o secreción de citocinas. La activación completa requiere una segunda señal co-estimulante, y estas señales sirven para mejorar aún más la cascada de activación. Entre las moléculas co-estimulantes en células que presentan antígenos, B7 y moléculas de adhesión celular (¡ntegrinas) tales como ICAM-1 facilitan este proceso, uniéndose a CD28 y LFA-1 , respectivamente, en la célula T. Cuando una célula CD8+ ¡nteractúa con una célula que presenta antígenos y que posee un péptido ínmunógeno (epítope) unido por una molécula MHC clase I en presencia de interacciones de moléculas coestimulantes adecuadas, la célula CD8+ se convierte en una célula T citolítica totalmente activada. La destrucción de células mediada por linfocitos, implica una secuencia de eventos biológicos que comienzan con la unión del CTL CD8+ a una célula objetivo (célula tumoral) que posee antígenos, mediante el proceso de reconocimiento descrito anteriormente, para la activación de células T. La interacción entre células CD8+ y células que presentan antígenos o células objetivo (células tumorales) descritas anteriormente, se ilustra en la figura 1. La interacción comienza con la unión del antígeno en asociación con una molécula MHC clase I en la APC o célula objetivo, al receptor de antígenos de células T (TCR). Moléculas accesorias tales como antígenos con función de linfocitos (LFA-1 , LFA-2 y LFA-3), molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1 e ICAM-2) y factores co-estimulantes de células T (CD40, CD70, B7), mejoran la adhesión entre células o transducen otras señales de activación celular. Sin embargo, el requisito de destrucción de células mediada por linfocitos, puede ocurrir sólo en presencia del complejo de molécula MHC/péptido, una situación común para la mayoría de las células tumorales. Después de la interacción entre células, el CTL destruye la célula objetivo mediante la acción de mediadores citolíticos solubles (perforina y granzimas almacenadas en granulos citoplásmicos en la célula T) y una molécula de superficie del CTL (ligando Fas). Después del ataque citolítico, las células objetivo mueren por necrosis (perforación de membrana y destrucción de organelos) o apoptosis (condensación de cromatina, fragmentación de ADN y vesiculación de membrana). Los mecanismos de la citólisis mediada por linfocitos, se ilustran gráficamente en la figura 2. El panel A de la figura 2, después de la unión a la célula objetivo, los gránulos citoplásmicos en el CTL se reorientan rápidamente hacia la célula objetivo para liberar los gránulos que contienen perforina y granzimas en el espacio intercelular. Estas enzimas proteolíticas forman poros en la membrana plasmática de la célula objetivo, llevando finalmente a necrosis de la célula. En el panel B, después de la unión a la célula objetivo, el nivel de expresión del ligando Fas en el CTL aumenta. La interacción del ligando Fas y el receptor de Fas en la célula objetivo, lleva a apoptosis. Proteasas tales como CPP32 y otras relacionadas con la enzima de conversión de IL-1 b (ICE), se han implicado en la inducción de apoptosis. Es posible usar células que presentan antígenos de ocurrencia natural, por ejemplo, células dendríticas, macrófagos y células tumorales autólogas para la activación de células CD8+ in vitro. Sin embargo, la eficiencia de activación siguiendo esta alternativa, es reducida. Esto es porque las moléculas MHC clase I de APCs nativas, contienen muchos otros tipos de epítopes peptídicos además de epítopes tumorales. La mayoría de los péptidos se derivan de proteínas de células inocuas normales, dando como resultado una dilución del número de APCs nativas activas que en realidad serán efectivas contra un tumor (Allison et al., Curr. Op. Immunol. (1995) 7: 682-686). Una alternativa más directa y eficiente a este problema, es activar específicamente células CD8+ sólo con epítopes relevantes que combatan una enfermedad específica (tal como cáncer) o antígenos específicos de tumores (tales como antígenos específicos de melanoma). Para este fin, se crea una célula artificial que presenta antígenos, expresando moléculas MHC clase I en células de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta). Puesto que Drosophila carece de sistema inmune, los transportadores de péptidos TAP-12 que intervienen en la carga de epítopes peptídicos en moléculas MHC clase I, están ausentes. Debido a ello, las moléculas MHC clase I aparecen sobre la superficie de células de Drosophila como vasos vacíos. Al incubar estas células de Drosophila transfectadas con péptidos exógenos que se unen a las moléculas MHC clase I, tales como epítopes específicos de tumores o cáncer incluyendo, pero no limitados a, epítopes específicos de melanoma, es posible ocupar cada molécula MHC clase I con el mismo péptido. La expresión de alta densidad de moléculas MHC clase I que contienen un péptido individual en estas APCs de Drosophila, permite la generación de células T CD8+ citotóxicas ¡n vitro, las cuales son completamente específicas del péptido antigénico. Métodos y procedimientos para preparar células de Drosophila, se describen en la patente de E.U.A. No. 5,529,921 , expedida en junio 25, 1996, titulada "In Vitro Activation of Cytotoxic T-Cells Using Insect Cells Expressing Human Class I MHC and ß2-Microglobulin" , y en la patente de E.U.A. No. 5,314,813, expedida en mayo 24, 1994, titulada "Drosophila Cell Lines Expressing Genes Encoding MHC Class I Antigens And 2-M¡croglobulin and Capable of Assembling Empty Complexes and Methods of Making Said Cell Lines". En particular, la patente de E.U.A. No. 5,529,921 describe en la columna 26, renglón 56 a columna 28, renglón 22, varios métodos para separar y/o enriquecer cultivos de células precursoras. Además, esta característica elimina la necesidad de la estimulación in vivo del sistema inmune con altas dosis de varias citocinas, dando como resultado de esta manera un tratamiento que antecede a los efectos secundarios causados por las citocinas. En forma alternativa, bajo situaciones o condiciones adecuadas, cuando sea adecuado y en donde el sujeto pueda lograr beneficios, el sujeto puede tratarse concurrentemente con dosificaciones de bajo nivel de interferón-a, interferón-? y/o IL-2. La eliminación de la necesidad de la estimulación ¡n vivo con citocinas, provee una mejora a la calidad del cuidado del paciente. Los regímenes de tratamiento que incluyen la administración de citocinas a pacientes, con frecuencia hacen que el paciente desarrolle síntomas tipo influenza, tales como náusea, vómito y fiebre. Estas reacciones secundarias en general no ponen en riesgo la vida, aunque una reacción particularmente severa que ocurre en un paciente que ya está en una condición débil, daría como resultado una situación que pone en riesgo la vida. Otra consideración es el impacto adverso que dichas reacciones secundarias tienen sobre la aceptación y acatamiento por el paciente, de un régimen de tratamiento de otra manera benéfico. La eliminación de la necesidad de la estimulación in vivo con citocinas, da como resultado un régimen de tratamiento que mejora el confort del paciente, y provee al médico clínico con un método de tratamiento efectivo que es más probable que su paciente cumpla. La utilidad de este método de inmunoterapia adoptiva de tumores, se ha demostrado en ratones usando células de Drosophila transfectadas como APCs y células CD8+ de la línea 20 de receptores de células T (TCR) de ratones transgénicos. En este sistema, células 20 CD8+ purificadas son altamente sensibles a péptidos ¡n vitro presentados por células de Drosophila MHC clase I transfectadas con (Ld), que poseen también las moléculas co-estimulantes B7-1 e ICAM-1. Células transfectadas de Drosophila se usan como sonda para definir los requisitos mínimos para estimular células T CD8+ no cebadas (Cal et al., P. N. A. S. USA (1996) 93: 14736-14741 ). En forma alternativa, cuando se usan células de bazo de ratón no separadas como células de respuesta en lugar de células 2C purificadas, la necesidad de moléculas co-estimulantes no se aplica. En este caso, las células CD8+ en la población de células del bazo, reciben co-estimulación "circunstante" de células B activadas. Mediante el uso de este hallazgo, ha sido posible mostrar que las células de Drosophila MHC clase I transfectadas con (Ld), son capaces de inducir a células DBA/2 normales de bazo de ratón, para que respondan a péptidos singénicos específicos de tumores de mastocitoma P815 in vitro, en ausencia de linfocinas agregadas. La inyección de estos CTLs en ratones DBA/2 que poseen mastocitoma P815, llevó a regresión rápida del tumor (Sun et al., Immunity (1996) 4: 555-564). Siguiendo un procedimiento, se cultivaron células DBA/2 normales de bazo de ratón in vitro con células de Drosophila MHC clase I transfectadas con (Ld) cargadas con péptido PIA.35-43, un epítope específico de tumores de la línea de células de mastocitoma P8 5 derivada de DBA/2. Los Iinfocitos cosechados de los cultivos después de cinco días, exhibieron fuerte actividad de Iinfocitos T citotóxicos (CTLs) hacia las células tumorales P815 in vitro, pero no pudieron lisar a P1024, una línea de células mutantes de P815 que no expresa PIA.35-43, como se muestra en la figura 3, panel A. Cuando estos CTLs se inyectaron en ratones DBA/2 inoculados previamente con células P815 tres días antes, los tumores crecieron libremente durante la primer semana, pero después fueron eliminados dentro de la siguiente semana, como se muestra en la figura 3, panel B. El carácter específico se demostró por la presencia de todo efecto sobre el crecimiento de P815 cuando los CTLs fueron inmunizados in vitro contra un antígeno ¡rrelevante tal como péptido de nucleoproteína viral, como se muestra en la figura 3, panel B. En resumen, células de Drosophila HC clase I del complejo de histocompatibilidad mayor transfectadas con (Ld), indujeron a las células DBA 2 normales de bazo de ratón para que respondieran a péptidos singénicos específicos del tumor de mastocitoma P815 in vitro en ausencia de linfocinas agregadas. La inyección de estos CTLs en ratones DBA/2 que poseen el mastocitoma P815, llevó a regresión rápida del tumor (Wolfel et al., J. Exp. Med. (1993) 178: 489-495).

Estudios in vitro en humanos Se inmunizaron CTLs humanos de sujetos sanos in vitro contra tirosinasa, MART-1 y gp 00 cuando se cargaron por separado en APCs de Drosophila, y se evaluaron para lisis en células JY (figura 4). Los mismos péptidos pueden añadirse en conjunto en APCs individuales de Drosophila, para generar una preparación de CD8 global multiespecífica. Se indujeron CTLs específicos de melanoma de sujetos sanos usando el protocolo completo de estimulación/reestimulación, y se pusieron a prueba para determinar su capacidad para lisar células de Jurkat cargadas con cada uno de los péptidos usados en las estimulaciones (figura 5). La figura 6 muestra la actividad de CTL después de dos diferentes protocolos de estimulación in vltro, uno en el cual los péptidos múltiples se cargaron en células de Drosophila individuales, y se mezclaron antes de la estimulación primaria (mezcla de combinación), o los péptidos múltiples se mezclaron y se cargaron entonces en las APCs de Drosophila (carga de combinación). El panel A representa los resultados del protocolo de la mezcla de combinación sobre células objetivo cargadas con péptidos. El panel B representa los resultados del protocolo de carga de combinación sobre células objetivo cargadas con péptidos. El panel C representa la destrucción en objetivos de melanoma generados de ambos protocolos. El uso de cualquier sistema de células que presentan antígenos (APC), natural o artificial, para generar linfocitos T citotóxicos in vitro, es limitado por el carácter específico por el antígeno que estos sistemas son capaces de generar. Los siguientes sistemas de APC se han usado para generar CTLs específicos de antígeno para epítopes individuales: 1 ) células dendríticas (DC) humanas pulsadas con péptidos definidos; 2) células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) que han sido llevadas a linfoblastos y pulsadas con péptidos; 3) líneas de células linfoblastoides (LCL), en donde los péptidos naturales se separan con ácido y se cargan con los péptidos de interés; 4) células de Drosophila diseñadas para expresar moléculas MHC clase I vacías, y células 3T3 de ratón transfectadas con moléculas co-estimulantes y MHC clase I humanas (J. B. Latouche y M.

Sadelain, Nature Biotech (2000) 18: 405-409). Se considera a las células dendríticas (DCs) como el sistema primario de células que presentan antígenos en humanos, debido a su amplia aplicación en células primarias que presentan antígenos. Se procesan proteínas propias o extrañas dentro de una DC. Los epítopes del péptido resultante se presentan mediante moléculas HLA, y se transportan hacia la superficie de la DC. Sin embargo, se encontró que las DCs no generarían consistentemente in vitro CTLs dirigidos contra cuatro péptidos diferentes. Esto habría provisto CTLs que tienen actividad que corresponde a cada uno de los cuatro péptidos. Además, se encontró también que el fenotipo de la DC al momento de la pulsación con péptidos, maduros o inmaduros, no afectó el resultado. En forma alternativa, la estimulación de células de Drosophila dio como resultado usualmente CTLs dirigidos contra hasta diez diferentes tipos de péptidos. Esto provee CTLs que son activos para cada uno de los diez péptidos. La capacidad de las células de Drosophila y DC para inducir respuestas por CTLs se evaluó, inicialmente, para un epítope peptídico individual, siguiendo los protocolos de estimulación normales para cada uno. Para comparar DCs y células de Drosophila transfectadas, se generaron DCs inmaduras cultivando durante una semana monocitos autólogos en presencia de IL-4 y GM-CSF. Se obtuvieron DCs maduras a partir de DCs inmaduras mediante la adición de FNTa al medio de cultivo, veinticuatro horas antes de la cosecha. Las DCs (inmaduras y maduras) fueron cosechadas, pulsadas con péptidos y mezcladas con células CD8 purificadas siguiendo el procedimiento usado para la estimulación de células CD8 y células de Drosophila pulsadas con péptidos. Se encontró que las células de Drosophila son en general mejor estimulantes que las DCs cuando se evaluaron para el epítope peptídico 689 de tirosinasa, como se muestra en la figura 7. Además, DCs que exhiben el fenotipo inmaduro o maduro (figura 8), no fueron tan eficientes como las células de Drosophila para inducir respuestas específicas de CTL cuando se usaron péptidos definidos para pulsar las APCs. Esto es particularmente sorprendente, debido a la función dominante desempeñada por las DCs en el sistema inmune. Se llevó a cabo un estudio comparativo con un donador, como se muestra en la figura 9. Se generó destrucción específica contra cuatro péptidos diferentes cuando se usaron células de la mosca de la fruta como estimulantes, mientras que las DCs inmaduras dieron como resultado destrucción específica marginal, y las DCs maduras dieron como resultado destrucción específica contra sólo uno de los cuatro péptidos usados para la estimulación.

Preparación de linfocitos citotóxicos Se estimula a células CD8+ aisladas de muestras de leucoféresis, mediante selección positiva con anticuerpos anti-CD8 contra cuatro diferentes péptidos asociados con melanoma presentados por células de Drosophila que expresan moléculas humanas clase I (HLA-A2.1 ), B7.1 , ICAM-1 , LFA-3 y B7.2 Se reestimulan células CD8+ durante dos ciclos con monocitos autólogos cargados con el epítope peptídico, en presencia de IL-2 e IL-7. Los CTLs son expandidos no específicamente con OKT3 e IL-2. La actividad de los CTLs se mide contra células Malme 3M, y la pureza de células T CD8+ se evalúa mediante citometría de flujo. Los procedimientos y protocolos de fabricación se llevan a cabo de acuerdo a buenas prácticas de laboratorio y buenas prácticas de fabricación. "Buenas prácticas de laboratorio" y "buenas prácticas de fabricación", son patrones de laboratorio y prácticas de fabricación que son establecidos por la Dirección de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los Estados Unidos, y son fácilmente conocidos por los expertos en la técnica. Los CTLs se monitorean para identidad, viabilidad, actividad de CTL, esterilidad y contenido de endotoxinas. Un listado de epítopes peptídicos adecuados para su uso en los métodos de la presente invención para tratar cánceres de mama y de ovario, se muestra en el cuadro 1 siguiente. Es fácilmente evidente para los expertos en la técnica que una amplia variedad de epítopes peptídicos, además de los incluidos en el cuadro 1 siguiente, será también adecuada para su uso en los métodos de la presente invención para tratar cánceres de mama y de ovario, siempre que dichos péptidos sean epítopes de células T.

CUADRO 1 Epítopes de HLA-A2.1 restringidos identificados para antígenos asociados con tumores, como objetivos para cánceres de mama y de ovario Predicción de Objetivo Secuencia ia unión al Nombre PRI# AKA (residuos) ÍSEQ ID NO:) Déotido de HLA Régimen de tratamiento para melanoma maligno usando linfocitos T autólogos generados ex vivo con carácter especifico por antígeno objetivo asociado con melanoma Se han llevado a cabo estudios clínicos en pacientes de melanoma metastásico avanzado, usando linfocitos T citotóxicos (CTLs) autólogos generados ex vivo con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. Por lo menos una infusión individual de los CTLs generados ex vivo, se administró al paciente por ciclo de tratamiento. Se observó que la administración concomitante de IFN-a o IL-2 a los pacientes en dosis y tiempos específicos, benefició la cebadura de células tumorales para lisis por los CTLs específicos de antígeno y la persistencia in vivo de los CTLs.

Terapia combinada de interferón y CTLs El interferón-alfa (IFNa) tiene un amplio espectro de efectos inmunomoduladores y antiproliferativos en una variedad de malignidades. Varias pruebas clínicas en la década pasada, han provisto evidencia clara de que el IFNa tiene actividad antitumoral en melanoma (Legha, Cáncer (1986) 57: 1675-1677). Cuando se usa como una terapia de agente individual, el rlFN- -2a y el rlFN-a-2b han producido un índice de respuesta media de 15% (escala, 6%-27%) con duración de respuesta que varía de 1 a 60+ meses. Un resumen de varias pruebas de IFN-oc de agente individual en melanoma metastásico, se da en los cuadros 2 y 3.

CUADRO 2 Pruebas de IFN-ct de agente individual en IFN-ot-2a de melanoma metastásico Fecha Duración Estudio Dosis (MU) Vía/horario de CR PR % (meses) ingreso* IM, TIW Creagan et al, 12/m2 durante 12 30/30/ 1 5 20 2 a 13+ 19842 semanas IM, TIW Creagan et al, 50/m2 durante 2 31/31 3 4 23 3 a 11 19843 semanas IV, Coates et al, diariamente 20/m2 16/15 0 0 0 19864 durante 5 de 14 días Hersey et al, 15 a 50/m2 IM, TIW 20/18 11 6 a 12 19855 IM, Legha et al, diariamente 18 a 36/m2 35/31 10 6 a 7 19876 durante 10 semanas Stetner et al, IM, 9 a 36/m2 12/12 1 19877 diariamente o 8 4+ IM, Elsasser-Beile diariamente 12+ a 18/m2 21/21 3 et al, 19878 durante 10 o 14 16+ semanas IFN-a-2a Subtotal 196/189 10 14 12 2Creagan et al., J. Clin Oncol (1984) 2: 1002-1005; 3Creagan et al., Cáncer (1984) 54: 2844-2849; "Coates et al., J Inferieron Res (1986) 6: 1 -4; 5Hersey et al., BrJ Cáncer (1985) 51 : 815-826; 6Legha et al., J. Clin Oncol (1987) 5: 1240-1246; 7Steiner et al., J Cáncer Res Clin Oncol (1987) 113: 459-465; 8Elsasser-Beile et al., Fortschr Med (1987) 105: 401-403.

CUADRO 3 Pruebas de IFN-a de agente individual en IFN-oc-2b de melanoma metastásico Fecha Duración Estudio Dosis (MU) Vía/horario de ¦ CR PR % (meses) ingreso* IM o IV, Kirkwood et al, 10 a diariamente ¿. I ¿. 22 3 a 60+ 19859 100/m2 durante 28 días Dorval et al, 10/m2 SC, TIW 24/22 2 4 27 2 a 5 198610 Sertoli et al, 10/m2 IM, TIW 21/21 0 3 14 7 a 13 198911 SC, TIW Robinson et al, 10/m2 durante 12 51/40 4 6 25 1 a 54+ 198612 semanas IFN-a-2b Subtotal 119/106 9 15 20 9Kirkwood et al., Ann Intern Med (1985) 103: 32-36; 10Dorval et al., Cáncer (1986) 58: 215-218; 1Sertoli et al., Oncology (1989) 46: 96-98; 12Robincon et al., Immunobiology (1986) 172: 275-282.

Un mecanismo de acción del IFN-a parece ser la sobrerregulación de la expresión del antígeno tumoral sobre las células de melanoma, es decir, tiene la capacidad de mejorar la expresión de moléculas inmunológicamente importantes sobre la superficie del tumor. Dichas moléculas inmunológicamente importantes incluyen, pero no están limitadas a, los antígenos de histocompatibilidad (H-2 de ratón o HLA de humano), moléculas accesorias tales como la molécula de adhesión intracelular 1 (ICAM-1/CD54), así como antígenos asociados con tumores (Robincon et al., Immunobiology (1986) 172:275-282; Borden et al., en Mitchell, S (ed.): Biological Approaches to Cáncer Treatment; Biomodulation, New York, NY, McGraw-Hill (1992) pp. 440-476). Los efectos inmunomoduladores del IFN-a pueden mejorar potencialmente la capacidad del sistema inmune, incluyendo anticuerpos y linfocitos, para reconocer y atacar al tumor in vivo. La inmunoterapia específica activa ha demostrado actividad clínica significativa en el tratamiento de melanoma diseminado. Los resultados de los estudios de la función, inmune, han mostrado que el tratamiento con vacuna de melanoma aumenta la frecuencia de CTLs anti-melanoma (Carrel et al., Eur J Immunol (1985) 15: 1 18-123). Se están usando actualmente regímenes de inmunoterapia combinada (IFN- y vacuna de melanoma) en el tratamiento de melanoma diseminado (Agarwala et al., BioDrugs (1999) 12: 193-208). Se piensa que estas dos modalidades de inmunoterapia, pueden actuar sinergísticamente. El Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) concluyó un estudio controlado aleatorizado prospectivo del interferón alfa-2b (IFN-a-2b) contra observación, como terapia adyuvante quirúrgica en 287 pacientes con melanoma (Kirkwood et al., J Clin Oncol (1996) 14: 7-17). La dosis usada en el estudio fue la dosis tolerada máxima: 20MU/m2/d intravenosamente (IV) cinco días por semana durante cuatro semanas, seguida de 10MU/m2 tres veces por semana subcutáneamente (SC) durante 48 semanas. Los resultados mostraron que hubo una prolongación significativa de supervivencia libre de recidivas y supervivencia general en el grupo que recibió IFN- -2b. Sin embargo, la toxicidad fue considerable: 67% de los pacientes mostró toxicidad severa (grado 3), y 9% mostró toxicidad que ponía en riesgo la vida. Se requirió modificar la dosis en la mayoría de los pacientes. El tratamiento fue también costoso. Con base en el estudio del ECOG, la FDA aprobó al interferón como un tratamiento adyuvante quirúrgico para melanoma en 1996. En un gran estudio prospectivo, prueba aleatorizada en pacientes con melanoma de alto riesgo, 642 participantes fueron aleatorizados hacia tres brazos: recibieron interferón-alfa-2a a altas dosis: 20MU/m2 intramuscularmente tres veces por semana durante 12 semanas, interferón a bajas dosis, u observación. El tiempo para la progresión (TTP) se prolongó sólo en el grupo de altas dosis, aunque la supervivencia general fue igual para los tres grupos (Kirkwood et al., J Clin Oncol (2000) 18:2444-2458). La Organización Mundial de la Salud (OMS), llevó a cabo una prueba de interferón alfa-2a a bajas dosis: 3 MU/m2 SC tres veces por semana durante 3 años, contra observación como terapia adyuvante en 427 pacientes con melanoma de alto riesgo (Cascinelli, Proc Am Soc Clin Oncol (1995) pp. 410 (resumen)). No hubo diferencia en la supervivencia libre de enfermedad o la supervivencia en los pacientes que recibían interferón. La presente invención provee un método para tratar a un sujeto con melanoma, el cual comprende los pasos de: a) administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de interferón-alfa que sea capaz de mejorar la expresión del antígeno tumoral sobre la superficie del tumor; y b) inocular a dicho sujeto con una cantidad efectiva de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. Puede usarse IFN-a-2a o IFN- -2b en el presente método de tratamiento. Puede administrarse IFN-oc al paciente vía SC, IM o IV. La cantidad efectiva de interferón-alfa para el presente método, es la cantidad de IFN- que es suficiente para sobrerregular la expresión de HLA (clase I) y la expresión del antígeno asociado con melanoma, dos requisitos clave para reconocimiento y lisis por células T específicas de antígeno. Esta cantidad efectiva puede ser determinada por los expertos en la técnica. El ejemplo 5 (descrito anteriormente) describe algunas consideraciones para determinar la cantidad efectiva de IFN-a que se usará en el presente método de tratamiento. De preferencia, para disminuir los efectos secundarios causados por el IFN- , la cantidad efectiva de IFN-a-2a es de alrededor de 5-20 MU/m2/día, y la cantidad efectiva de IFN- -2b es de aproximadamente 5-15 MU/m2/día. También de preferencia, la cantidad efectiva de IFN-oc se administra al paciente sólo durante un período relativamente corto, por ejemplo, 3 a 7 días, inmediatamente antes de inocular al sujeto con una cantidad efectiva de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. En una modalidad preferida, la cantidad efectiva de interferón-alfa es de alrededor de 10 MU/m2/día que se administra subcutáneamente al sujeto consecutivamente del día 5 al día 1 antes de inocular a dicho sujeto con la cantidad efectiva de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. La cantidad efectiva de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma, es la cantidad de los CTLs generados ex vivo con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma, que es suficiente para detener el crecimiento o causar una disminución en tamaño de una lesión de melanoma cuando los CTLs se inoculan al sujeto. De preferencia, la cantidad efectiva de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma, es de aproximadamente 1-10 x 109 células/infusión. Los linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma, se obtienen mediante un método que comprende los pasos de: a) preparar una línea de células que presentan antígenos de ocurrencia no natural (nnAPC), en donde dicha nnAPC es capaz de presentar hasta simultáneamente hasta alrededor de 15 epítopes diferentes asociados con dicho melanoma, en donde cada epítope es un péptido que tiene de 8 a 10 aminoácidos de longitud; b) cargar la nnAPC con hasta aproximadamente 15 epítopes diferentes asociados con dicho melanoma; c) cosechar células CD8+ de dicho sujeto; d) estimular dichas células CD8+ con la línea de células nnAPC cargadas con epítopes, para obtener células CD8+ específicas del melanoma; e) desarrollar las células CD8+ específicas del melanoma en medios que contengan IL-2 e IL-7; f) mezclar monocitos de sangre periférica agotados en CD8 colectados de dicho sujeto, con cada epítope con que dicha nnAPC se ha cargado; g) irradiar dichos monocitos de sangre periférica agotados en CD8 con radiación gamma; h) aislar monocitos de sangre periférica adherentes agotados en CD8; i) cargar dichos monocitos de sangre periférica adherentes con cada epítope con que dicha nnAPC se ha cargado; j) reestimular dichas células CD8+ específicas del melanoma, con los monocitos de sangre periférica adherentes cargados con epítopes e irradiados con radiación gamma; k) desarrollar las células CD8+ reestimuladas específicas del melanoma en medios que contengan IL-2 e IL-7; I) expandir las células CD8+ reestimuladas específicas del melanoma mediante estimulación con anticuerpos OKT3; m) poner a prueba las células CD8+ expandidas para actividad, pureza, esterilidad y contenido de endotoxinas adecuados de linfocitos T citotóxicos; en donde el paso (j) puede repetirse cuando menos una vez más. De preferencia, la línea de células que presentan antígenos de ocurrencia no natural, se carga con epítopes que son péptidos derivados de tirosinasa, gp100 y MART-1 , tal como se ilustra en SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

Terapia combinada de interferón, CTLs e interleucina-2 La interleucina-2 recombinante humana, es una linfocina producida mediante tecnología de ADN recombinante que se ha mostrado exhibe una variedad de actividades biológicas. In vitro, se ha mostrado que mejora la mitogénesis de linfocinas, mejora la citotoxicidad de linfocitos, induce la actividad asesina de células asesinas naturales y células asesinas activadas por linfocinas, e induce también la producción de interferón-gamma. Se ha investigado en pruebas clínicas para el tratamiento de cáncer metastásico de células renales, sarcoma de Kaposi, cáncer colorrectal, linfoma no de Hodgkin, así como melanoma metastásico. Se ha usado sola o en combinación con quimioterapia, células asesinas activadas por linfocinas (LAK) o linfocitos de infiltración en tumores (TlLs), o productos biológicos tales como interferón. Se ha administrado a altas y bajas dosis y mediante varios programas de infusión (bolo y continuo). Los índices de respuesta variaron de 15 a 20%. Un repaso hecho por Phillip en 1997, consideró 540 pacientes en 15 pruebas realizadas en la década de los noventa con el agente individual IL-2 (Phillip et al., Semin Oncol (1997) 14: Supl. 4: 32-38). La dosificación varió de bolos de 12 MIU/m2 tres veces por semana, a infusión continua de 3-7 MIU/m2/día. El índice de respuesta general en el estudio fue de 15%, con una escala de 3 a 50% y remisión completa de 2%. En un estudio de 134 pacientes reportado por Rosenberg et al (JAMA- (1994) 271 : 907-913) en 994, el bolo de IL-2 a altas dosis produjo un índice de remisión de 7% con 9 remisiones completas. De las 9 remisiones completas, 8 estuvieron libres de enfermedad durante 9-91+ meses. El Cytokine Working Group realizó un análisis retrospectivo de 266 pacientes tratados con terapia de bolo de IL-2 a altas dosis que produjo remisiones completas en 16 pacientes (6%), y 69% de ellos estaban vivos y libres de progresión en 5 años (Atkins et al., Proc Am Soc Clin Oncol (1997) 16: 494a). Un meta-análisis de 91 1 pacientes que se trataron con la combinación de IFN-a e IL-2, produjo un índice de respuesta de 17% (Alien et al., Proc Am Soc Clin Oncol (1997) 16: 494a (1781 )). La supervivencia media fue de 11 meses, la cual no es significativamente mayor que la terapia con agente individual. La administración de IL-2 puede usarse de inmediato después de la infusión de CTLs para mejorar la mitogénesis de linfocitos, la citotoxicidad de linfocitos y la producción de interferón-gamma en un esfuerzo por mantener las células T específicas de antígeno in vivo. En una modalidad preferida, la presente invención provee un método para tratar a un sujeto con melanoma, el cual comprende los pasos de: a) administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de interferón- alfa que sea capaz de mejorar la expresión de antígeno tumoral sobre la superficie del tumor; b) inocular a dicho sujeto con una cantidad efectiva de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma; y c) administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de interleucina-2 que sea capaz de mejorar el mantenimiento in vivo de los linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. La interleucina-2 puede administrarse al paciente vía SC, IM o IV. La cantidad efectiva de interleucina-2, es la cantidad de IL-2 que es suficiente para mantener in vivo los CTLs específicos de antígeno generados ex vivo. Esta cantidad efectiva puede ser determinada por los expertos en la técnica. El ejemplo 5 (citado más adelante) describe algunas consideraciones para determinar la cantidad efectiva de IL-2 que se usará en el presente método de tratamiento. De preferencia, para disminuir los efectos secundarios causados por la IL-2, la cantidad efectiva de IL-2 es de alrededor de 2-10 MlU/día. También, de preferencia, la cantidad efectiva de IL-2 se administra al paciente inmediatamente después de inocular al sujeto con una cantidad efectiva de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. En una modalidad más preferida, la cantidad efectiva de interleucina-2 es de aproximadamente 3 MlU/día que se administra subcutáneamente al sujeto consecutivamente del día 0 al día 27 después de inocular a dicho sujeto con la cantidad efectiva de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. En una modalidad muy preferida, la presente invención provee un método para tratar a un sujeto con melanoma, el cual comprende los pasos de: a) administrar subcutáneamente al sujeto 10 MU/m2/día de ¡nterferón-alfa-2b consecutivamente del día 5 al día 1 antes de inocular a dicho sujeto con linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma; b) inocular al sujeto alrededor de 1-10 x 109 células/infusión de los linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma; y c) administrar subcutáneamente al sujeto alrededor de 3 MlU/día de ¡nterleucina-2 consecutivamente del día 0 al día 28, después de inocular a dicho sujeto con los linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. Al final de cada ciclo del tratamiento, se evaluará una respuesta completa o parcial en dicho paciente. El ciclo de tratamiento puede repetirse a un intervalo de aproximadamente 2 meses. Esta invención se entenderá mejor haciendo referencia a los detalles experimentales siguientes, pero los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que estos son sólo ilustrativos de la invención, como se describe en más detalle en las reivindicaciones más adelante. Además, a lo largo de esta solicitud, se citan varias publicaciones. La descripción de estas publicaciones se incorpora de esta manera como referencia en esta solicitud, para describir en mayor detalle el estado de la técnica a la cual esta invención pertenece.

EJEMPLO 1 Obtención de células de Drosophila que presentan antíqenos Se preparó la línea de células S2 de Schneider a partir de huevos de Drosophila melanogaster (Oregon-R) de acuerdo a procedimientos publicados, y se ha depositado con la American Type Culture Collection (CRL 10974). Se desarrollan células S2 en medio comercial de Schneider para Drosophila complementado con suero de bovino fetal a 10%. El vector de plásmido pRmHa-3 para expresar proteínas co-estimulantes y MHC clase I en células S2, se derivó del vector de expresión pRmHa-1 construido como se describe en la literatura. Contiene un promotor de metalotioneína, secuencias consenso de respuesta a metal y un gen de alcohol deshidrogenasa que posee una señal de poliadenilación aislada de Drosophila melanogaster. Las moléculas de ADN complementarias para transfección, se prepararon de la manera siguiente: HLA-A2.1 y ß-2 microglobulina: transcripción inversa-PCR de células K562 usando iniciadores derivados de la secuencia publicada.

B7.1 : transcripción inversa-PCR de células K562 usando iniciadores derivados de la secuencia publicada. ICAM- : transcripción inversa-PCR de células K562 usando iniciadores derivados de la secuencia publicada. B7.2: transcripción inversa-PCR de células HL-60 (ATCC CCL- 240), usando iniciadores derivados de la secuencia publicada. LFA-3: transcripción inversa-PCR de células HL-60 (ATCC CCL-240), usando iniciadores derivados de la secuencia publicada. Se insertaron individualmente moléculas de ADN complementarias en el vector pRmHa-3. Se transfectaron células S2 con una mezcla de moléculas de ADN de plásmido de HLA-A2.1 , B7.1 e ICAM-1 y plásmido phshneo, usando el método de precipitación con fosfato de calcio. Se seleccionaron células establemente transfectadas mediante cultivo en medio de Schneider que contenía geneticina. Veinticuatro horas antes del uso, la expresión de los genes transfectados se indujo mediante la adición de sulfato de cobre. El nivel de expresión se evaluó mediante citometría de flujo usando anticuerpos anti-HLA-A2.1 , anti-B7.1 y anti-ICAM-1. La expresión de HLA en más de 30% de las células, es necesaria para la activación eficiente in vitro de linfocitos CD8+.

Aislamiento de células CD8* humanas Se aislan células CD8+ de muestras de leucoféresis mediante selección positiva, usando el procedimiento de aislamiento con Dynabeads™ (Dynal). Un anticuerpo monoclonal de ratón de CD8 anti-humano (50 g/mL en gamma-globulina humana [Gammagard®]), se añade a células lavadas en PBS de Dulbecco complementado con albúmina de suero humano a 1 % (Baxter-Hyland) y citrato de sodio a 0.2%. Después de incubación a 4°C durante 45 minutos con mezclado suave, las células se lavan y se vuelven a suspender en el mismo regulador de pH que contiene perlas magnéticas Dynal (Dynabeads™) recubiertas con IgG anti-ratón de oveja, a una relación de perla: célula de 1 :1. Las células y perlas se colocan en un tubo estéril y se mezclan suavemente a 4°C durante 45 minutos. Al final de este período, las células unidas al anticuerpo se remueven magnéticamente usando el separador de MPC-1® de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Dynal). La disociación del complejo de célula CD8-perla, se logra mediante incubación a 37°C durante 45 minutos en presencia del péptido56-7o de CD8 (AAEGLDTQRFSG; SEQ ID NO: 12). Las perlas libres se remueven magnéticamente, y las células CD8 se cuentan y analizan mediante citometría de flujo, para evaluar su pureza. La recuperación de células CD8+ es típicamente mayor de 80%. El cuadro 4 resume la composición de células de catorce preparaciones separadas de CD8+ de preparaciones de PBMC humanas normales, mediante selección positiva con anticuerpo anti-CD8.

CUADRO 4 Purificación de células CD8+ mediante selección positiva analizada mediante citometría de flujo PBMC POST-SELECCION Tipo de célula % de la (escala) /o de la (escala) media media ' Células T CD8 15% (7-24) 82% (56-95) Células T CD4 36% (14-52) 2% (0.1-10) Monocitos CD14 15% (7-26) 0.8% (0.2-2) Neutrófilos CD15 12% (8-21) 0.6% (0.1-3) Células B CD19 2% (0.4-7) 3% (0.5-9) Células NK CD56 6% (2-17) 6% (0.1-20) Inmunización in vitro de células CD8+ humanas purificadas Estimulación primaria Se incuban células S2 de Drosophila transfectadas en medio de Schneider (106 células/mL) complementado con suero de ternera fetal a 10% y CuS0 a 27°C durante 24 horas. Las células se cosechan, se lavan y se vuelven a suspender en medio para insectos X-press (BioWhittaker) que contiene 100 µ p\1. de tirosinasa369-377 humana. Después de incubación a 27°C durante 3 horas, las células S2 se mezclan con células CD8+ a una relación de 1 :10 en medio del RPMI (Gibco) complementado con suero autólogo a 10%. La mezcla de células se incuba durante cuatro días a 37°C, tiempo durante el cual las células de Drosophila mueren. En el día cinco, se añaden IL-2 (20 U/mL) e IL-7 (30 U/mL) para expandir selectivamente la población de CTLs específicos de tirosinasa.

Reestimulación PBMCs autólogas congeladas agotadas en CD8, obtenidas al momento de leucoféresis, se descongelan, se lavan y se vuelven a suspender a 106 células/mL en medio del RPMI que contiene suero autólogo a 10% (como una fuente de microglobulina ß2) y 20 µ^G?? de tirosinasa369-377-Después de irradiación gamma (5,000 rads), las células se incuban a 37°C durante 2 horas. Las células no adherentes se remueven mediante lavado con PBS de Dulbecco. Los monocitos adherentes se cargan con el epítope de tirosinasa mediante incubación durante 90 minutos en medio del RPMI regulado en su pH con HEPES que contiene suero autólogo a 10% y 10 g/mL de tirosinasa369-377. Se remueve el sobrenadante, y la suspensión de células CD8+ activadas con células de Drosophila (3 x 106 células/mL en medio del RPMI con suero autólogo a 0%) se añade a una relación de 10 células CD8+: 1 monocito adherente. Después de tres a cuatro días de cultivo a 37°C, se añaden IL-2 (20 U/mL) e IL-7 (30 U/mL) con un cambio de medio para expandir selectivamente la población de CTLs específicos de tirosinasa.

Expansión no específica Se expanden no específicamente células efectoras cultivándolas en medio del RPMI complementado con suero autólogo, anticuerpo monoclonal anti-CD3 (OKT®3), IL-2 y PBMCs autólogas irradiadas con radiación gamma.

Pruebas para actividad y pureza Prueba de CTL Se usan células Malme 3M como células objetivo en una prueba de liberación de 5 Cr. 5 x 106 células Malme 3M en medio del RPMI que contiene suero de ternera fetal a 4%, regulador de pH de HEPES a 1 % y gentamicina a 0.25%, se marcan a 37°C durante 1 hora con 0.1 mCi de 51Cr. Las células se lavan cuatro veces, y se diluyen hasta 105 células/mL en medio del RPMI con suero de bovino fetal a 10% (HyCione). En una placa de microtítulo de 96 cavidades, 100 µ? de CTLs efectores y 100 µ? de células objetivo Malme 3M cargadas con péptidos marcadas con 51 Cr, se combinan a relaciones de 100:1 , 20:1 y 4:1 (efector: objetivo). Se añaden células K562 a una relación de 20:1 (K562: Malme 3M) para reducir la lisis de fondo de células asesinas naturales. Se evalúa la lisis no específica usando la línea de fibroblastos HLA-A2.1 no tumoral, Malme 3. Se incluyen por duplicado controles para medir la liberación espontánea y liberación máxima de 51Cr.

Después de incubación a 37°C durante seis horas, las placas se centrifugan, y los sobrenadantes se cuentan para medir la liberación de 51Cr. El por ciento de lisis específica se calcula usando la siguiente ecuación: cpm de la muestra - cpm de la liberación espontánea x -| oo cpm de la liberación máxima - cpm de la liberación espontánea Citometría de flujo Se analizaron células CD8+, antes y después de activación in vitro, para un número de marcadores de superficie celular usando anticuerpos monoclonales fluorescentes y análisis de FACS. Los resultados de un protocolo de activación típico usando células de un donador sano, se muestran en el cuadro 5.

CUADRO 5 Análisis de citometría de flujo de células CD8+ activadas in vitro Además de actividad y pureza, las preparaciones de CTLs se ponen a prueba para esterilidad y contenido de endotoxinas.

Reactivos ATCC: American Type Culture Collection.

EJEMPLO 2 Prueba de infusiones de células T cítotóxicas contra melanoma Propósito de la prueba Este ejemplo describe la eficacia de infusiones de células T cítotóxicas en el tratamiento de melanoma, evaluado de acuerdo a los siguientes factores: 1. seguridad y tolerancia de CTLs autólogos reinfundidos después de inmunización in vitro; 2. cinética de CTLs infundidos en la factorización de la circulación sistémica en el análisis de dilución limitativo; 3. disposición completa de CTLs del cuerpo mediante radioescintigrafía; 4. composición celular de nodulos para biopsia mediante ¡nmunohistología (CTLs y células TH, NK y B); y 5. regresión de lesiones mensurables y duración de respuesta en dos meses.

Población de pacientes La idoneidad para el tratamiento, requirió que los pacientes tuvieran melanoma maligno no resecable histológicamente documentado, que fuera mensurable o de otra manera capaz de evaluación, y el haplotipo de HLA-A2. La evaluación de pretratamiento incluyó evaluación radiológica del cerebro mediante MRI o exploración por tomografía computada, exploración por tomografía computada del tórax y abdomen, y examen físico, especialmente de la piel y los nodulos linfáticos. El número de total de pacientes tratados fue de 15 (nueve hombres y seis mujeres). Las edades variaron de 33 a 75 años, con un promedio de 58 años. La duración promedio de la enfermedad metastásica fue de 1.5 años. Se llevó a cabo una prueba de pretratamiento de la piel para determinar si existía un estado de alergia en 14 de 15 pacientes, siendo negativos 5 de 14 para los siete antígenos comunes evaluados. Se seleccionaron los pacientes para el haplotipo de HLA-A2 mediante análisis de FACS, con un anticuerpo monoclonal específico de HLA-A2 (BB7.2). Se llevó a cabo sub-tipificación mediante análisis de PCR. Todos los pacientes, salvo uno, fueron HLA-A*0201 , y la excepción (paciente 08) fue HLA-A*0205.

Tratamiento con CTLs autóloqos generados ex vivo Se trataron quince pacientes con este protocolo clínico. Todos los pacientes recibieron, por lo menos, una infusión individual de CTLs autólogos. El número de ciclos y la dosis de células administradas a cada paciente, se resumen en la figura 25. El número de células generadas in vitro dependió de factores relacionados con el paciente, tales como los números de PBMCs aisladas del procedimiento de aféresis y el número de células T CD8+ presentes en cada preparación de PBMCs. Puesto que todas las células generadas in vitro fueron reinfundidas en el donador, necesariamente variaron las dosis administradas a cada paciente. En un intento por normalizar las dosis entre los pacientes, se registró una puntuación de "potencia" calculada para cada dosis. El valor se obtuvo multiplicando el número total de células por la actividad lítica obtenida con las células objetivo cargadas con péptidos. Las dosis de células T infundidas variaron de un mínimo de 4 x 107 (paciente 08) a un máximo de 3.2x109 (paciente 13). Se incorporó a los pacientes en un segundo, tercer o cuarto ciclo de tratamiento, con base en su estado clínico al final de cada ciclo. El número de PBMCs obtenidas de las muestras de aféresis, tendió a ser menor en pacientes que sufren ciclos adicionales, especialmente si el inicio del ciclo subsecuente estaba próximo al final del ciclo previo. Esto se atribuye a linfopenia persistente debido al IFNct-2b administrado durante el ciclo previo. El número total de células T CD8+ no afectadas aisladas, dependió en su porcentaje en cada una de las preparaciones de PBMCs. El porcentaje de células T CD8+ varió entre 8% a 31 % entre los pacientes. El factor de expansión obtenido favoreció también el número total de células, y varió de 0.1-6.0 veces. El procedimiento para generar CTLs ex vivo, se describió en la especificación y el ejemplo 1 anterior.

Sobrerrequlación de antígenos asociados con melanoma y células MHC clase I en respuesta a IFNot-2b En un intento por mejorar la capacidad de los CTLs específicos de antígeno para lisar células de melanoma in vivo, se administró IFNa-2b a bajas dosis durante cinco días consecutivos antes de la infusión de CTLs, y tres veces por semana durante otras cuatro semanas. Una forma de medir una respuesta ¡n vivo a la citocina, es evaluar biopsias obtenidas en puntos de tiempo graduales mediante análisis inmunohistoquímico para tinción positiva con anticuerpos específicos. Se obtuvieron biopsias graduales en un paciente con lesiones múltiples de la piel (paciente 04) para evaluación de la expresión del antígeno y de células MHC clase I. Las biopsias indicaron que la expresión de las células MHC clase I y MART-1 fue débilmente positiva antes de cualquier tratamiento (biopsia A). Después de cinco días de inyecciones subcutáneas de 10MU/m2, se observó un incremento dramático en estos dos marcadores (biopsia B). Para tirosinasa y gp100, la tinción inmunohistoquímica fue de negativa a débilmente positiva, respectivamente, en las muestras de pretratamiento (biopsia A). Después de la dosis inicial de IFNa de cinco días y trece tratamientos adicionales, la expresión de estos últimos antígenos aumentó en las muestras de tejido teñido (biopsia C).

Carácter específico antigénico de CTLs generados ex vivo Se evaluaron los CTLs generados de todos los pacientes en el día de liberación contra objetivos de T2 cargados con péptidos, una línea de células de melanoma HLA-A2 (Malme 3M) y una línea autóloga de melanoma, si se contaba con material para biopsia para establecer una línea. Cada dosis de células preparada se evaluó para determinar su actividad citolítica. Se usaron células 12 cargados con péptidos, que presentan cada péptido solo, o los cuatro péptidos simultáneamente, para determinar el carácter específico de la respuesta de los CTLs generados para cada paciente. Se evaluó la capacidad para lisar células que poseen antígenos, asociadas con melanoma y expresadas endógenamente, con una línea duplicada de HLA-A2 o una línea de tumores autólogos. Además de actividad citolítica, se evaluó el carácter específico por el antígeno con un método establecido para detectar la producción de ¡nterferón gamma intracelular obtenido en respuesta a un estímulo específico de péptidos. Los CTLs generados al final del protocolo ex vivo, se evaluaron mediante este método. Se registró individualmente el por ciento de células específicas para cada uno de los péptidos. El número total de células específicas en cada cultivo global de células CD8 del paciente 13, se calculó añadiendo cada uno de los valores del carácter específico por el péptido detectado en la población de células T. Un incremento en el número total de células específicas, podría detectarse con cada ciclo de tratamiento sucesivo.

Detección de biopsias de células CD8 y CD4 de infiltración en tumores, después de terapia con CTLs Muestras para biopsia de todos los pacientes antes, durante y después del tratamiento, habrían sido ideales. Sin embargo, las condiciones experimentales permitieron obtener muestras para biopsia sólo de un número limitado de pacientes. El tejido tumoral se obtuvo de cinco de los quince pacientes enrolados en el estudio. En dos pacientes (pacientes 08 y 13), se contó con muestras para biopsia en cinco y seis semanas después de terapia con células T, respectivamente. El examen de las muestras de tejido, reveló la presencia de células CD8 y CD4 de infiltración. Una de las muestras de tumor se tomó de una lesión de la piel en la región occipital del cuero cabelludo, cuyo tamaño aumentó para cuando se realizó el examen del tratamiento complementario, cuatro semanas después de una segunda infusión de células T. La biopsia reveló necrosis del tejido que se infiltró notablemente con linfocitos. La otra biopsia fue de la cabeza de un hueso del fémur, removida durante cirugía de reemplazo de cadera. La lesión de la piel del paciente 08 fue fuertemente positiva (4+) para un marcador general de células MHC clase I y un marcador específico de HLA-A2. La tirosinasa y gp100 fueron débilmente positivas (1 + y 2+, respectivamente), mientras que MART-1 fue negativa en esta misma muestra. Las regiones de la biopsia del paciente 13 fueron también necróticas, con tinción más heterogénea: poblaciones diferentes de células tumorales que carecen de expresión de la molécula HLA-A2.1, y una o más de las MAAs. Sin embargo, las regiones de tejido intactas relevaron antígenos fuertes de células MHC clase I (4+) y todos los antígenos asociados con melanoma. Las infiltraciones linfocíticas en esta última muestra parecieron rodear a los nodulos tumorales, más que infiltrarlos profundamente. Sin embargo, el porcentaje más alto de células asociadas directamente con el tumor, eran células CD8. La falta de muestras para biopsia de pretrata miento de estos pacientes, evitó confirmar tipos similares de células de infiltración en muestras de tejido antes del tratamiento.

Las exploraciones por tomoqrafía computada después de terapia con células T, confirman una respuesta objetiva Las exploraciones por tomografía computada fueron parte de los criterios de selección del pretratamiento y el examen de tratamiento complementario después del tratamiento. El paciente 10 recibió una infusión individual de 8x108 CTLs (7/27/99) cinco semanas después de la exploración del pretratamiento (6/23/99). Cuando se repitió una exploración por tomografía computada del tórax un mes después de la infusión (8/27/99), se observó una disminución dramática en el tamaño de una lesión pulmonar. En forma similar, el paciente 14 fue sometido a una exploración por tomografía computada del tórax como parte del procedimiento de enrolamiento (9/10/99), tres y media semanas antes de una primera infusión con 6.6x108 células (10/5/99). Una exploración por tomografía computada para tratamiento complementario (1/7/99), un mes después de una segunda infusión con 11.5x108 células, reveló una disminución dramática en tres lesiones separadas. El paciente 13 tuvo también una respuesta objetiva medida en pre- y post-exploraciones por tomografía computada. La adenopatía paratraqueal fue de 7.8 cm2 (antes del estudio) a 4.4 cm2 después del ciclo I, y desapareció después del ciclo II.

La presencia de un estado anérqico no excluyó la capacidad para generar CTLs o para prevenir una respuesta clínica La mayoría de los pacientes tratados bajo este protocolo, habían recibido intervención médica previa. Se llevó a cabo una prueba de pretratamiento de la piel para determinar si una respuesta anérgica a un panel de siete antígenos comunes se correlacionaba con una incapacidad para generar CTLs ex vivo, o prevenir una respuesta clínica documentada. La capacidad para generar CTLs ex vivo no se correlacionó con los resultados de la prueba de pretratamiento de la piel del paciente. Debe observarse que los pacientes 03 y 04 (ambos de respuesta mixta) tuvieron pruebas de la piel repetidas antes del inicio del segundo ciclo, y continuaron siendo anérgicos.

EJEMPLO 3 Generación de CTLs específicos de HER-2/neu capaces de lisar células tumorales de mama y de ovario Los autores se interesaron en aplicar la tecnología de generación de CTLs a otros tipos de tumor, para determinar si todas las formas de cáncer pueden abordarse con esta alternativa. HER-2/neu es un proto-oncogen con homología con EGFR que se amplifica y sobreexpresa en muchos cánceres humanos, principalmente adenocarcinomas de mama, ovario y colon. Se asocia con frecuencia con enfermedad agresiva, y puede ser un indicador de un mal pronóstico. Se ha estudiado en varias pruebas clínicas como un objetivo posible para estos tipos de cáncer. A principios de la década de los noventa, se identificaron epítopes peptídicos restringidos en HER-2/neu HLA-A2.1 identificados mediante algoritmos de unión de péptidos asistidos por computadora, o mediante mapeo de CTLs aislados de ascitis de pacientes con cáncer de ovario (cuadro 6).

CUADRO 6 Péptidos de HER-2/neu restringidos en HLA-A2.1 Todos los péptidos se sintetizaron, se les dio un número de identificación (PRI#), y se evaluaron para determinar la capacidad para generar CTLs ex vivo, usando el mismo método que se usó para epítopes peptídicos de células T asociados con melanoma. Se aislaron células CD8 de donadores normales para determinar la capacidad para generar habitualmente CTLs ex vivo con células de Drosophila cargadas con epítopes peptídicos de CTLs conocidos. Los péptidos 826, 835, 861 y 863 tuvieron la frecuencia más alta de generación de CTLs (cuadro 7).

CUADRO 7 Frecuencia de generación de CTLs HER-2/neu en donadores normales Aunque las células de Drosophila transfectadas tienen la capacidad única de presentar hasta 10 epítopes peptídicos diferentes (figura 10), los autores seleccionaron los cuatro péptidos de HER-2 826, 835, 861 y 863 debido a la frecuencia para generar CTLs para estos péptidos ex vivo. Estos cuatro péptidos de HER-2 diferentes, representan enlazadores débiles a moderados a la molécula de HLA-A2.1 presentada sobre la superficie de las células de Drosophila transfectadas. Los autores tendieron a incluir enlazadores A2 que son débiles, ya que su experiencia con péptidos asociados con melanoma sugiere que enlazadores débiles de moléculas MHC clase I generan en general CTLs potentes que reconocen células tumorales, si por supuesto representan epítopes nativos de células T. La mayoría de las proteínas asociadas con tumores que los autores seleccionaron son auto-antígenos y, como era de esperarse, tienen la alta afinidad por la molécula MHC clase I que se observa con péptidos virales. Los enlazadores débiles a moderados generan en general CTLs que lisan las células tumorales muy eficazmente. Esto se demostró con el péptido de MART-1 que es un enlazador de poca afinidad en las células de Drosophila (figura 3), y sin embargo representa un epítope que genera habitualmente CTLs potentes capaces de lisar células objetivo (T2) cargadas con péptidos, o lo que es más importante, células de melanoma (Malme 3M) (figura 12). HER-2/neu es un miembro de la familia de EGF-R, y funciona como un receptor del factor de crecimiento. La proteína HER-2 se expresa durante el desarrollo fetal en humanos. En adultos, la proteína se detecta débilmente en células epiteliales de muchos tejidos normales. En células normales, el gen de HER-2 está presente como una sola copia. Se ha identificado la amplificación del gen y/o la sobreexpresión de la proteína asociada en muchos cánceres humanos que incluyen cánceres de mama, ovario, útero y estómago, y adenocarcinoma de pulmón. Las diferencias de secuencias entre HER-2 y el receptor de EGF-R, se dan en el cuadro 8. Tres de los cuatro péptidos de HER-2 que los autores han evaluado, tienen tres o más cambios de aminoácidos entre las dos proteínas. Un cambio de aminoácido individual es suficiente para discriminar entre las dos proteínas.

CUADRO 8 HER-2/neu contra EGF-R Una vez que se generaron los CTLs después del protocolo de estimulación ex vivo de cuatro semanas, los autores evaluaron si las células específicas de péptidos estaban presentes usando moléculas tetraméricas de HLA-A2.1 preparadas con los péptidos inmunizantes. Como se demuestra en la figura 13, la capacidad para generar CTLs específicos de péptidos dependió del donador. En el panel A (donador 261 ), el donador mostró una fuerte respuesta de CTL al péptido 835 (37.55%). En el panel B (donador 262), pueden detectarse CTLs específicos de péptidos con las moléculas tetraméricas 835 y 861 (3.6% y 15.1 %, respectivamente). Esto sustenta el uso de péptidos múltiples para garantizar CTLs específicos de péptidos al final del protocolo de estimulación. Este protocolo ex vivo permite generar relativamente fácil múltiples CTLs específicos.

Respuestas antipeptídicas y antitumorales Después de concluir el protocolo ex vivo completo, se evaluaron los CTLs generados para determinar su carácter específico por el antígeno. Para generar los CTLs, se cargaron en el día 0 células de Drosophila con una combinación de los cuatro péptidos de HER-2. Al final del protocolo de estimulación ex vivo de cuatro semanas, el cultivo global de células CD8 se evaluó para determinar su carácter específico por el antígeno. Como células objetivo, se usaron células 12 cargadas con cada uno de los péptidos inmunizantes. En la figura 14, se ilustra una respuesta típica. El cultivo global contiene carácter específico para cada uno de los cuatros péptidos de HER-2. Se evaluó la respuesta antitumoral en una línea de células de tumor de ovario (ATCC HTB-77). Cuando una línea de células objetivo no está restringida en HLA-A2.1 , los autores transfectaron la línea de células para que tuviera un sistema de prueba +/-. Cuando se transfectó a HLA-A2.1 en la línea HTB-77, se observó una destrucción mejorada por células efectoras CD8 (figura 15, paneles A a D). Se evaluaron efectores específicos de HER-2 que representan los péptidos individuales, para confirmar la presentación de cada uno de los epítopes peptídicos sobre esta línea de células tumorales. Se evaluó también una línea de células de adenocarcinoma de mama (ATCC HTB-131), transfectada con HLA-A2.1 , para determinar la capacidad para demostrar lisis del tumor con los efectores peptídicos específicos de HER-2. CTLs específicos para el péptido 861 , podrán lisar esta línea de células tumorales cuando se transfectan con HLA-A2.1 (figura 16).

El tratamiento con IFNy requiere lisis de células tumorales La línea de células HTB-77/A2.1 requiere un pretratamiento con IFNy para demostrar lisis específica de péptidos. Las células se trataron con 500 U/mL de IFNy (actividad específica de 25 ng/mL) durante 24 horas antes del inicio de la prueba de liberación de 51Cr. En la figura 17, la adición del IFNy dio como resultado lisis mejorada de la línea de células transfectadas HLA-A2.1. Para determinar el efecto de esta dosis de IFNg sobre la expresión de superficie de HLA-A2.1 y HER-2, se llevó a cabo un análisis de FACS para determinar los niveles de estas moléculas después de 24 y 48 horas de inducción. La figura 18, paneles A y B, ¡lustra los resultados del análisis de FACS. En el panel A, no hubo mejora de la molécula de HER-2 sobre la superficie de las células HTB-77 a 24 horas y 48 horas después de la inducción con IFNg. En las células transfectadas con HLA-A2.1 , ni HER-2 ni HLA-A2.1 demostraron un incremento en el nivel de expresión de superficie después de un protocolo de tratamiento similar. Lo que se observó, fue un incremento en el nivel de expresión de TAP-1 , así como HLA-DM y -DR, catepsina S y D y caspasa 5, cuando se evaluaron los niveles de ARN mensajero mediante análisis de chips de ADN en microdisposiciones (figura 19). Esto explicaría por qué existe una destrucción mejorada de las células HTB-77/A2.1 en presencia de IFNy. Una sobrerregulación de esta molécula particular, daría como resultado un procesamiento más eficiente de la molécula HER-2, permitiendo mejor presentación de los péptidos de interés.

Péptidos Se obtuvieron péptidos sintéticos mediante química de Fmoc normal, usando un sintetizador de péptidos (Gilson Company, Inc.). Todos los péptidos se purificaron hasta más de 95% de pureza mediante CLAR de fase invertida sobre una columna C-8. Se establecieron la pureza e identidad usando un espectrómetro de masas con ionización por electroaspersión. Los péptidos asociados con melanoma incluyeron: el péptido 819 fue específico de MART- (AAGIGILTV SEQ ID NO: 6), 817 y 853 fueron péptidos de gp100 (ITDQVPFSV SEQ ID NO: 4 y KTWGQYWQV SEQ ID NO: 5, respectivamente), los péptidos específicos de tirosinasa fueron 689 y 792, representando 792 la versión modificada de post-traducción (Y DGTMSQV SEQ ID NO: 2) de la secuencia nativa (YMNGTMSQV SEQ ID NO: 1 ) representada por el péptido 689. Los péptidos 826 (CLTSTVOLV SEQ ID NO: 7) y 835 (KIFGSLAFL SEQ ID NO: 8) representaron secuencias de HER-2/neu de los dominios ¡ntracelular y extraceluiar, respectivamente, de la proteína p185. Pec6020 (ALALAALLVV SEQ ID NO: 10) y Pec6025 (ALLVVDREV SEQ ID NO: 11) eran secuencias traslapantes que representaban una proteína mucinosa detectada en líneas de tumores de ovario. La C-lectina era también una proteína detectada en líneas de células de tumor de ovario, y un péptido de su secuencia (C-lectinas) se representa mediante KMASRSMRL SEQ ID NO: 9).

Prueba de citotoxicidad in vitro Se llevaron a cabo pruebas normales de liberación de 5 Cr para determinar el reconocimiento de células efectoras de CTLs de epítopes peptídicos asociados con melanoma cargados sobre células T2. Las 3x106 células T2 cosechadas se desarrollaron en medios del RPMI + FBS a 10%. Se añadieron 0.1 mCi de 5 Cr, y se incubaron a 37°C en un baño de agua. Las células marcadas se añadieron a 10 mL de solución de lavado a 4% (RPMI + FBS a 4%) y se transformaron a pellas (nodulos), se lavaron otras dos veces, y se resuspendieron en medios hasta una concentración final de 0.2x 06/mL para registrar la radiactividad de células lisadas espontáneamente contra células lisadas con detergente. Las células se pulsaron con los péptidos adecuados a 20 g/mL durante 30 minutos. Se añadieron 50 a cada placa de 96 cavidades que contenía células efectoras CD8 a 10, 2, 0.4 y 0.08 x 106/mL, las cuales se incubaron a 37°C durante seis horas, se centrifugaron y se cosecharon para sobrenadante.

Citometría de flujo y tinción de tetrámeros Las células se marcaron con anticuerpos monoclonales conjugados con FITC o PE mediante incubación a 4°C durante 30 minutos en regulador de pH de FACS (BSA a 1 %, NaN3 a 0.02% en PBS), seguida de un lavado en el mismo regulador de pH. Las células se fijaron en formaldehído a 0.5% antes de la adquisición de datos y análisis en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson) con su programa CellQuest. Se midió la tinción no específica con el mismo anticuerpo secundario usado para marcar anticuerpos primarios purificados, o un control duplicado en isotipos cuando los anticuerpos primarios se marcaron directamente. La tinción de tetrámeros se llevó a cabo con moléculas tetraméricas de W/gag específicas de HLA-A2.1 (Beckman Coulter) que alojan la secuencia SLYVTVATL SEQ ID NO: 43 como control negativo. Se obtuvieron tetrámeros específicos de HER-2 con las secuencias CLTSTVQLV (826 SEQ ID NO: 7), KIFGSLAFL (835 SEQ ID NO: 8), o péptidos de VMAGVGFSPYV (861 SEQ ID NO: 16). Los complejos de HLA-A2.1-péptido tetraméricos marcados con PE, se usaron en conjunto con anticuerpos monoclonales CD8a anti-humanos (BD PharMagin) marcados con isotiocianato de fluoresceína (FITC), para teñir células T CD8+ específicas de epítopes como se describe en el inserto del empaque. Las muestras se analizaron mediante citometría de flujo de dos colores en un FACScan de Becton Dickinson, y las células T CD8+ ingresadas se examinaron para tinción con complejos tetraméricos de HLA-A2.1 -péptido.

EJEMPLO 4 Generación de CTLs adicionales de mama y de ovario específicos, con el protocolo de estimulación ex vivo Se ha demostrado la capacidad para generar respuestas de CTL a todos los epítopes peptídicos restringidos en HLA-A2.1 conocidos, para varios antígenos tumorales de diferentes orígenes tumorales. Los estudios iniciales de los autores se enfocaron en melanoma, en donde pudieron demostrarse respuestas clínicas objetivas en pacientes tratados con CTLs específicos de cuatro epítopes peptídicos diferentes específicos de las proteínas asociadas con melanoma MART- , gp100 y tirosinasa [Richards et al., Amer. Soc. Clin. Oncol., San Francisco, California (mayo de 2001 )]. Para extender la capacidad para exponer CTLs a otros antígenos tumorales presentes en una amplia variedad de otros cánceres, se han seleccionado secuencias publicadas y novedosas para antígenos tumorales comunes a varios tipos de tumor diferentes. Incluyen AE5, MUC-1 , CEA, FBP, C-Lectina, NY-ESQ-1 , Pec60, CA-125, MAGE-3, telomerasa y G250. . EI cuadro 10 describe estos antígenos, la frecuencia de expresión y los cánceres que expresan. La frecuencia de respuesta a estos péptidos con el protocolo de estimulación ex vivo, se da en el cuadro 9.

CUADRO 9 Frecuencia de respuesta a epítopes peptídicos de mama y de ovario en donadores normales CUADRO 10 Descripción de antígenos tumorales Antíqeno Descripción CA-125 El antígeno canceroso 125 es un marcador de células epiteliales expresado por tumores de ovario y algunas líneas de células de ovario. Aproximadamente 85% de los pacientes con cáncer de ovario tienen un nivel incrementado de CA-125 en suero, y se usa por lo tanto comúnmente como un marcador tumoral en suero. (Cáncer Letters (1999, octubre) 145 (1 -2), págs. 133-141 ) MUC-1 La mucina es una glucoproteína de transmembrana expresada en epitelio normal y maligno. La forma subglucosilada de MUC-1 se sobreexpresa sobre la superficie celular de muchos adenocarcinomas humanos tales como cáncer de mama y de ovario, así como malignidades hematológicas que incluyen mieloma múltiple y linfoma de células B. (Blood (1999, junio) 93(12), págs. 4309-4317) G250 Antígeno asociado con carcinoma de células renales expresado en 85% de RCC's, pero no en tejido normal de riñon. Es idéntico al antígeno asociado con tumores MN/CAIX, que se expresa en aproximadamente 50% de los cánceres de mama invasivos. {Cáncer Research (1999, noviembre); 99(21 ), págs. 5554-5559) FBP La proteína de unión a folato, es un receptor que interviene en el transporte de folato. Se sobreexpresa en más de 90% de los tumores de ovario y 20 a 50% de los cánceres de mama. (Anticancer Research (1999 julio-agosto) 19 (4B), págs. 2907-2916) HE -2/neu Proto-oncogen (HER-2) que codifica para una proteína de transmembrana similar en secuencia y estructura a EGF-R. HER- 2/neu se sobreexpresa tanto como 200 veces más respecto a tejidos normales, en tumores de mama y de ovario. Se ha identificado también en carcinomas de pulmón y de células renales. (J. Exp. Med. (1995, junio) Vol. 181 , págs. 2109-21 17) NY-ESQ-1 Antígeno canceroso de testículo presente en 30% de los cánceres de mama, próstata y de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello y melanoma. Los pacientes que tienen cánceres con tumores que expresan este antígeno, tienen también usualmente anticuerpos circulantes contra el mismo. (J Immunology (2000) Vol. 165, págs. 948-955) CEA El antígeno carcinoembrionario es un antígeno asociado con tumores que se expresa con frecuencia en tumores epiteliales (colon, mama, pulmón). Los niveles de CEA en suero pueden correlacionarse con la etapa de la enfermedad, y se usan con frecuencia para mon ¡torear el tratamiento y recidiva de la enfermedad. (Human Immunology (1998) Vol. 59, págs. 1 -14) MAGE-3 Antígeno canceroso de testículo que se expresa en 70 a 80% de líneas de células y lesiones de melanoma metastásicas. Es un miembro de la familia de proteínas MAGR o asociadas con melanoma. Además, MAGE-3 se ha encontrado en 20 a 60% de los tumores epiteliales (carcinomas de colon, mama, pulmón y gástrico). (Human Immunology (1998) Vol. 59, págs. 1-14) AES El intensificador amino de la proteína de separación, forma parte de una serie de represores de transcripción codificados por el intensificador de genes de separación. Este antígeno tumoral se identificó en linfocitos asociados con tumores de tumores de ovario y de mama. (Molecular Immunology (1998) 35 (17), págs. 1121-1 133) HTR La telomerasa (hTR), es un tipo especializado de transcriptasa inversa (hTRT o hTERT) que cataliza la síntesis y extensión de ADN telomérico. La actividad esta enzima aumenta en aproximadamente 90% de los tumores humanos que incluyen cánceres de mama, tiroides, vejiga, cerviz, próstata, colon, páncreas y estómago. (Cáncer Research (2001 , diciembre) 61 (23), págs. 8366-8370) EJEMPLO 5 Tratamiento de melanoma maligno usando infusión de CTLs acoplada con interferón e interleucina-2 Propósito del estudio Este ejemplo describe la eficacia de infusiones de células T citotóxicas en el tratamiento de melanoma, según se evalúa de acuerdo a los siguientes factores: 1. Establecer la eficacia de CTLs autólogos reinfundidos después de inmunización in vitro con células de Drosophila transfectadas con moléculas co-estimulantes y MHC clase I humanas, y cargadas con epítopes peptídicos asociados con melanoma; 2. Establecer la seguridad y tolerancia de administración de ¡nterferón-oc-2b (IFN-a), interleucina-2 (IL-2) y CTLs autólogos generados ex vivo, mediante inmunización con células de Drosophila a la dosis y en el programa prescrito; 3. Determinar si células T de infiltración en tumores están presentes en biopsias de tumores, después del tratamiento; 4. Demostrar la presencia y persistencia de células CD8 específicas de antígenos en la sangre periférica de pacientes tratados; 5. Confirmar que cinco (5) inyecciones subcutáneas diarias consecutivas de IFN (10Mu/m2), pueden sobrerregular antígenos asociados con melanoma y moléculas MHC clase l sobre la superficie del melanoma in vivo. Una descripción de CTL-03 del estudio clínico, se da en la figura 20.

Población de pacientes La selección del tratamiento requirió que los pacientes tuvieran melanoma maligno no resecable histológicamente documentado, que pudiera medirse y someterse fácilmente a evaluación. Además, se requirió que los pacientes tuvieran un haplotipo de HLA-A2. La evaluación de pretratamiento incluyó evaluación radiológica del cerebro mediante RI o exploración por CT, exploración por CT del tórax y abdomen, y examen físico, especialmente de la piel y los nodulos linfáticos. El número total de pacientes que se enrolarán, es de 42. Veintiún (21 ) pacientes están sólo en el brazo de citocina control, y veintiún (21 ) pacientes están en el brazo de terapia con células T + citocina. Hasta la fecha, se han enrolado treinta y un (31) pacientes (17 ingresados en el brazo control, y 14 han ingresado en el brazo de tratamiento con células T). A los pacientes que progresan en el brazo control, se les ofrece un cruce hacia el brazo de células T, si así lo desean (1 1 pacientes así lo hicieron). El número total de pacientes tratados hasta la fecha es de treinta y un (31 ) (16 hombres y 15 mujeres). Las edades variaron de 27 a 80 años, con un promedio de 52 años. Se seleccionó a los pacientes para el haplotipo de HLA-A2 mediante análisis de FACS con un anticuerpo monoclonal específico de HLA-A2 (ATCC BB7.2). La subtipificación se llevó a cabo mediante análisis de PCR. Todos los pacientes, salvo dos, fueron positivos a HLA-A*0201. Los otros subtipos de HLA-A2 fueron HLA-A2*0202 y HLA-A2*0205.

Administración de fármacos Se administró interferón- -2b (Intron-A®; interferón alfa-2b recombinante, Schering Corporation, Kenilworth, NJ) subcutáneamente al paciente a 10 MU/m2 durante 5 días consecutivos, antes de la infusión de CTLs. Se infundieron ex vivo linfocitos autólogos activados por células de Drosophila (1-10x109) al paciente en el día después de la administración de IFN-oc. Se administró subcutáneamente ¡nterleucina-2 (PROLEUKIN®; Aldesleukin, IL-2 recombinante, Chiron Corporation, Emeryville, CA) al paciente a 3 MIU diariamente de inmediato después de la infusión de CTLs, y se continuó durante otros 27 días consecutivos. El cuadro 1 muestra una comparación de la dosis de citocinas usada en el CTL-03 del estudio, con las dosis usadas en protocolos aprobados por la FDA para la administración individual de IFN-a en el ambiente adyuvante (remoción post-quirúrgica de todo tumor detectable) o IL-2 a altas dosis.

CUADRO 11 Comparación de la dosis de citocinas usada en el CTL-03 del estudio, con las dosis usadas en protocolos aprobados por la FDA Inmunización ¡n vitro de células CD8 purificadas Estimulación primaría Se incuban células S2 de Drosophila transfectadas en medio de Schneider (106 células/mL) complementado con suero de ternera fetal a 10% y sulfato de cobre a 27-28°C durante 24-72 ¦ horas. Las células S2 se cosechan, se lavan y se vuelven a suspender en medio para insectos X-press (BioWhittaker) que contiene 0.1 µ^?p . de cada péptido; tirosinasa humana 369-377 (SEQ ID NO: 1 YMNGTMSQV y SEQ ID NO: 2 YMDGTMSQV), gp100 209-217 (SEQ ID NO: 4 ITDQVPFSV), gp 00 154-162 (SEQ ID NO: 5 KTWGQYWQV) y MART-1 27-35 (SEQ ID NO: 6 AAGIGILTV) y 5 ng/mL de microglobulina ß2 humana. Después de incubación a temperatura ambiente (23-25°C) durante tres a cuatro horas, las células S2 se mezclan con células CD8+ a una relación de 1 :10 en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (un medio definido, Gibco) complementado con suero autólogo a 5 a 10%. La mezcla de células se incuba durante cuatro días a 37°C, tiempo durante el cual las células de Drosophila mueren. En el día cuatro ó cinco, se añaden IL-2 (20 U/mL) e IL-7 (30 U/mL) con un cambio de medio para expandir selectivamente la población de CTLs específicos de antígenos que consiste de células con carácter específico por los antígenos asociados con melanoma (MART-1 , gp100 y tirosinasa).

Reestimulación PBMCs autólogas agotadas en CD8, obtenidas al momento de la leucoféresis y congeladas para uso futuro, se descongelan, se lavan y se resuspenden a 106-107 células/mL (dependiendo del número de PBMCs agotadas en CD8 colectadas al momento del paso de aislamiento de CD8) en medio del RPMI que contenía suero autólogo a 10%, 5 µg/mL de microglobulina ß2 humana recombinante y 5-20 µg/mL (dependiendo del número total de péptidos que se añadirán) de péptidos de tirosinasa, gp100 y MART-1 que se usaron en la estimulación descrita anteriormente. Después de irradiación con radiación gamma (5,000 rads), las células se incuban a 37°C durante dos horas. Las células no adherentes se remueven mediante lavado con PBS de Dulbecco. Los monocitos adherentes se cargan con los cinco epítopes peptídicos descritos anteriormente, mediante incubación durante 90 minutos en medio de Leibowitz que contenía 5 µ?/???- de microglobulina ß2 humana en HSA a 1 % (en lugar de suero autólogo, para evitar la posibilidad de introducir proteasas potenciales, que podrían estar presentes en el suero) y 5- 0 µg/mL de cada uno de los cinco epítopes peptídicos. El sobrenadante se remueve, y se añade la suspensión de células CD8 activadas por Drosophila (2.5 x 106 células/mL en medio del RPMI con suero autólogo a 10%) a una relación de 10 células CD8: 1 monocito adherente. Después de tres a cuatro días de cultivo a 37°C, se añaden IL-2 (20 U/mL) e IL-7 (30 U/mL) con un cambio de medio para expandir selectivamente la población de CTLs específicos de melanoma. Ocurre un total de dos de dichos pasos de reestimulación de células adherentes específicas de péptidos, uno casi una semana después de la estimulación primaria, y el segundo casi una semana después. Un paso de expansión no específico ocurre al inicio de la semana 4 del protocolo ex vivo.

Expansión no específica Las células efectoras CD8+ que han sufrido dos ciclos de reestimulación, se expanden en bolsas de cultivo de células junto con células nutricias (células CD8+ no seleccionadas irradiadas) después de ser estimuladas con anticuerpos OKT3. Las células CD8+ no seleccionadas congeladas se descongelan, se lavan, y se irradian entonces con radiación gamma (3500 rads). Se aplica una relación de 4:1 (células nutricias: efector) en matraces T-225 que han sido recubiertos con anticuerpos OKT3. La estimulación con OKT3 se lleva a cabo sobre medio del RPMI completo que contiene suero autólogo a 10% complementado con 20 U/mL de lL-2. Dos días después, las células T estimuladas se diluyen con medio fresco, y se transfieren a bolsas de cultivo de células para expansión. Se complementan medios frescos e IL-2 casi cada dos días para alimentar a las células T en rápida expansión.

Análisis fenotípico de células CD8 después del protocolo de estimulación ex vivo Se llevó a cabo análisis fenotípico, medido mediante citometría de flujo, en células CD8+ purificadas en el día de aislamiento a partir de la muestra de leucoféresis, y en el día en que las células se liberaron para infusión otra vez en el paciente. Se realizó un análisis estadístico con muestras de pacientes y de donadores normales, que habían sido sometidos al mismo protocolo de estimulación ex vivo. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre las muestras de células CD8+ no afectadas y las células efectoras CD8+ obtenidas al final del protocolo de estimulación ex vivo, sin importar si las muestras se derivaban de pacientes o de donadores normales. Se encontró que marcadores de activación (por ejemplo, CD69, que no se expresa en linfocitos en reposo, pero se induce rápidamente después de activación; HLA-DR, una molécula clase II expresada en células T activadas), marcadores de memoria (por ejemplo, CD45RO expresado en células activadas y la mayoría de las células de la memoria), marcadores de integrina (por ejemplo, CD49d/CD29 que interviene en la migración de linfocitos de la sangre a los tejidos en sitios de inflamación), moléculas accesorias (por ejemplo, CD11a/CD18 que favorece la destrucción de linfocitos citotóxicos y media la adhesión a muchas células, incluyendo endotelio) y marcadores de receptores de citocinas (por ejemplo, el receptor de IL-2R funcional de alta afinidad se forma de un heterodímero de CD25/CD122/CD132 asociado no covalentemente), son sobrerregulados en las células efectoras CD8 después de concluir el protocolo de estimulación ex vivo. El cuadro 12 resume los resultados del análisis.

CUADRO 12 Análisis fenotípico de células CD8+ después del protocolo ex vivo Los resultados del análisis fenotípico sustentan la idea de que las células efectoras CD8+ son activadas por el protocolo ex vivo descrito en la presente. Estas células efectoras CD8+ activadas son capaces de migrar de la sangre al sitio del tumor in vivo, y son capaces de destruir las células tumorales objetivo con sensibilidad exquisita, y pueden proliferar potencialmente en presencia de una baja dosis de IL-2 cuando la IL-2R de alta afinidad está presente en estas células. CD122 se expresa constitutivamente en una subpoblación de células T en reposo. En el cuadro 12, las áreas de color blanco son valores estadísticamente significativos, las cuales son sobrerreguladas después de concluir el protocolo de estimulación de células CD8+ ex vivo. Las áreas de color gris claro no muestran sobrerregulación o subregulación significativa. Las áreas de color gris oscuro muestran una subregulación estadísticamente significativa de las moléculas reportadas. La regulación de estos marcadores es consistente con la inducción de células T activadas totalmente capaces de rastrear y lisar células tumorales in vivo, según se evalúa mediante análisis fenotípico. Citometría de flujo: Obtener aproximadamente 1 x 107 de células CD8+ purificadas a partir de la leucoféresis del donador. Poner cada muestra en tubos estériles a 1x106 por 100 µ? de regulador de pH de lavado (PBS+BSA a 1 %+NaN3 a 0.02%). En cada tubo con 100 µ? de suspensión de células, añadir 0 µ? del anticuerpo adecuado marcado directamente con FITC o PE, o si el anticuerpo primario no está marcado, añadir un anticuerpo secundario marcado (IgG anti-ratón de cabra). Incubar cada paso de anticuerpo a 40°C durante 30 minutos. Lavar con 1 a 2 mL de regulador de pH de lavado entre cada paso de anticuerpo. Transformar las células a pellas durante 7 minutos a 600 x g. Desechar el sobrenadante. Resuspender cada pella de células en 0.5 mL de fijador de formaldehído a 0.5%/PBS, y leer en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson) a los valores adecuados.

Sobrerrequiación de antígenos asociados con melanoma y moléculas MHC clase I en respuesta a la administración de IFN- -2b A partir de un estudio clínico descrito en el ejemplo 2 en la presente, se observó que un curso de cinco días de IFN-ot-2b (Intron-A®) administrado subcutáneamente a 10 MU/m2 en los días 17 a 21 del protocolo clínico, fue suficiente para sobrerregular la expresión de moléculas HLA (clase I) y la expresión de antígenos asociados con melanoma, dos requisitos clave para el reconocimiento y lisis por células T específicas de antígenos. Este hallazgo se registró en biopsias secuenciales obtenidas de un paciente individual (04-MJ) con lesiones subcutáneas múltiples de la piel, disponibles para análisis. Las cuatro muestras se marcaron como (A) pretratamiento; (B) después del inicio del tratamiento con IFN (5 dosis consecutivas); (C) después de la infusión 1 de CTLs; y (D) después de la infusión 2. Los resultados del análisis de inmunohistoquímica sobre la expresión de HLA (HLA-A2.1 ) y antígeno asociado con melanoma (MART-1) de las cuatro muestras para biopsia, se resumen en el cuadro 13, en donde el número mayor indica un nivel de expresión mayor de la proteína respectiva. Los resultados mostraron que no hubo incremento adicional en la expresión de HLA (HLA-A2.1 ) y antígeno asociado con melanoma (MART-1 ) después de los primeros cinco días de tratamiento consecutivo con IFN-a, indicando que el tratamiento con interferón-a2b más allá de 5 días consecutivos, no fue necesario para alcanzar niveles óptimos de expresión de HLA-A2.1 y MART-1.

CUADRO 13 El tratamiento con ¡nterferón-g-2b durante cinco días consecutivos, fue suficiente para obtener niveles óptimos de expresión de HLA-A2.1 y ART-1 Se enviaron muestras para biopsia con tinción ¡nmunohistoquímica durante la noche a 4°C en medio del RPMI. El tejido se colocó en medio de inclusión de OCT® (Tissue-Tek) para muestras de tejido congelado. La matriz de tejido: OCT se colocó sobre papel filtro antes de un paso rápido de congelación en NO2 líquido. Las muestras congeladas se almacenaron a -80°C antes de hacer los cortes. Se colocaron secciones mantenidas en un crióstato (5 µ??) sobre portaobjetos cargados con Superfrost™ (Fisher). Los portaobjetos se fijaron en acetona fría (-20°C), y se almacenaron a -80°C hasta su tinción. La actividad de peroxidasa endógena se bloqueó mediante incubación en H2O2 a 0.3% en metanol durante 10 minutos. Se añadió el anticuerpo primario durante 1 hora en una cámara humidificada. Se añadió anticuerpo secundario biotinilado, y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se añadió estreptavidina-HRP bajo las mismas condiciones. Se añadió substrato de DAB durante hasta 5 minutos, y se enjuagó en agua. Los portaobjetos se hidrataron a través de 4 ciclos de alcohol (70-95-95-100%), seguidos de 3 ciclos de xüeno. Los anticuerpos usados en el análisis inmunohistoquímico fueron de ATCC (específicos de HLA clase I, W6/32 y HLA-A2, BB7.2) o neomarcadores (MART-1 , M2-7C10).

Incremento en el número de células con ciclos de tratamiento repetitivos En CTL-03 del estudio clínico, se observó que el conteo de células registrado en el día 6 de los ciclos de cultivo in vitro, aumentó más que disminuyó, según se detectó en CTL-02 en cada ciclo de tratamiento (figura 21 ). La figura 21 A representa una curva de crecimiento típica para las células CD8+ generadas ex vivo en el estudio de CTL-02. Una disminución típica en el día 6, reflejó la muerte de células no específicas. Las células CD8 de cada ciclo de tratamiento repetitivo para el paciente 15-RT mostraron curvas de crecimiento similares, sugiriendo que no hubo células de memoria que quedaran en la sangre periférica después de cada ciclo de tratamiento. Este no fue el caso en CTL-03 del estudio. La disminución típica en el número de células se observa con 01-KN-1 , que refleja la disminución observada en las células que se obtienen durante el primer ciclo. Sin embargo, cuando se hizo el conteo de células en células obtenidas al inicio de los ciclos 2 y 3 (figura 21 B; 01-KN-2 y 01-KN-03), las curvas de crecimiento fueron más representativas de la presencia de célula de memoria. Esto se observó en todas las muestras de pacientes que eran del segundo y tercer ciclos de tratamiento en CTL-03 del estudio. Este resultado puede atribuirse a la adición de IL-2 a pacientes a la hora de la infusión de los CTLs, y 27 días después de la infusión de CTLs. Conteo de células: Se preparó una solución de azul trípano a 0.2%. Se hizo el conteo de células usando un hemocitómetro. Se registraron los conteos de por lo menos 100 células viables (células no teñidas) en por lo menos un cuadro completo (9 cuadros de 1 mm en total). Se registró el número de células vivas, y se contó el número de cuadros completos de 1 mm, es decir, el número de células/cuadro. El cálculo que se usa para determinar el número de células por mL es: (número de células/cuadro de 1 mm) (factor de dilución) (1x104) = células/mL.

El análisis de tetrámeros confirma la presencia de células T específicas de antíqeno después de la infusión de CTLs Para CTL-03 del estudio, podían obtenerse en el comercio moléculas tetraméricas que contienen MART- o gp100, péptidos asociados con melanoma, para el análisis de células T específicas de antígeno (Beckman Coulter, Immunomics). Estas moléculas tetraméricas no pudieron obtenerse para CTL-02 del estudio. En seis (6) pacientes que sufrieron un segundo ciclo de terapia en CTL-03 del estudio, como se muestra en la figura 22, 6 de 6 pacientes mostraron incrementos en el nivel de células T específicas de MART-1 , del momento de la primer toma de muestras para leucoféresis, al inicio del segundo ciclo de tratamiento, que es en general un período de dos meses. Cuando se usaron moléculas tetraméricas de gp100 para evaluar células T específicas de antígeno, 5 de 6 pacientes mostraron niveles elevados de células T específicas de gp100 al momento de la segunda leucoféresis (figura 22). El inicio del procedimiento de leucoféresis, marca el inicio de un ciclo de terapia celular. En un paciente ( 5-DC), se realizó un total de 6 ciclos de terapia con células T. Aunque cada ciclo estaba separado por casi dos (2) meses, el marco de tiempo entre los ciclos 4 y 5 fue de cinco (5) meses cuando el paciente deseaba tomarse un descanso. Las células T específicas de antígeno para MART-1 y gp100 al inicio del ciclo 4, fueron de 0.26% y 0.65%, respectivamente. Cuando se evaluaron las células CD8 al inicio del ciclo 5, las células específicas de antígeno para MART-1 fueron 0.29% y 0.46% para gp100. Esto sugeriría que las células específicas de antígeno estaban manteniéndose ¡n vivo, aún después de que se suspendiera la terapia celular y con citocinas. Tinción de tetrámeros: Se obtuvieron casi 1x 07 de células CD8+ purificadas del donador mediante leucoféresis. Cada muestra se colocó en tubos estériles a 1x105 por 100 µ? de regulador de pH de lavado (PBS+BSA a 1 %+NaN3 a 0.02%). En cada tubo con 100 µ? de suspensión de células, se añadieron 5 µ? de las moléculas marcadas HLA-A2.1-tetrámero-estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE) (cargadas con el péptido de interés (específico de MART- 1 , gp100 o tirosinasa), y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadió anticuerpo monoclonal anti-CD8+ (marcado con FITC), y la incubación se continuó durante otros 30 minutos. Se usaron de 1 a 2 ml_ de regulador de pH de lavado para lavar las muestras al final del período de incubación. Las células se transformaron a pellas durante 10 minutos a baja velocidad (400 x g), y se desechó el sobrenadante. Cada pella de células se resuspendió en 0.5 ml_ de fijador de formaldehído a 0.5%/PBS, y se leyó en un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson) a los valores adecuados.

Correlación entre tres pruebas in vitro diferentes usadas para medir actividad citolítica, carácter específico por el antígeno y proliferación de células Con la llegada de la tecnología de tetrámeros para evaluar células específicas de antígeno, muchas publicaciones reportaron números significativos de células T específicas de antígeno en la sangre periférica de pacientes con melanoma (Lee et al., Nature Medicine (1999) 5: 677-685). Cuando estas células específicas de antígeno se aislaron, y se hicieron intentos por expandir las células en una forma específica de antígenos, hubo una cantidad considerable de fracasos. Aunque la tinción de tetrámeros permitirá detectar la presencia de células T específicas de antígeno, otras pruebas tales como pruebas de lisis de CTLs, son útiles para determinar si las células pueden destruir adecuadamente objetivos específicos de péptidos. Pueden usarse pruebas de ¡nterferón-gamma intracelular para determinar si las células pueden proliferar en respuesta al antígeno. Estas tres pruebas se llevaron a cabo en el producto final de células T CD8+ (figura 23) para asegurar que el número de células T específicas de antígeno detectadas reflejara exactamente el número de células T que son capaces de lisar las células tumorales in vivo, y proliferarán en respuesta a la estimulación antigénica.

El interferón-gamma medido en sobrenadantes de células después de la estimulación primaria (día 6), aumenta con ciclos repetidos de terapia con células T Otra indicación de que la IL-2 estaba teniendo efectos dramáticos sobre la persistencia de células T in vivo, se observó al medir la producción de IFN-gamma en sobrenadantes de células (figura 24). Seis (6) días después de la estimulación primaria con células de Drosophila en cada uno de los ciclos de tratamiento, los sobrenadantes de células se colectaron y evaluaron para determinar el nivel de interferón-gamma, una citocina liberada por células CD8+ en respuesta a la estimulación específica del antígeno. En ciclos repetidos de cuatro (4) pacientes, se observó que el nivel de producción de IFN-gamma, en este marco de tiempo, aumentó con cada ciclo de terapia con células T. En todos los casos, los niveles de IFN-gamma fueron de bajos a no detectables. Con cada ciclo adicional de terapia con células T, se detectaron niveles mayores de IFN-gamma, sugiriendo que números mayores de células T específicas de antígeno estaban presentes en las poblaciones de células CD8+, aisladas al momento de cada leucoféresis.

Detección de células T de infiltración en células tumorales En un paciente (04-AD) que había sufrido tres (3) ciclos de terapia con células T y con citocinas en el estudio de CTL-03, se obtuvo una biopsia de una lesión de la piel seis (6) semanas después del final del tercer ciclo. Se detectó la presencia de antígenos asociados con melanoma y moléculas MHC clase I MART-1 y gp100 en el análisis de tinción ¡nmunohistoquímica. Se observó también la presencia de células T de infiltración (CD3+). La tinción ¡nmunohistoquímica positiva del tumor, sugiere que los antígenos asociados con melanoma y moléculas MHC clase I se mantuvieron y/o fueron sobrerregulados durante la dosis de cinco (5) días de IFNa. La presencia de estos marcadores en las células de melanoma, permite que las células T específicas de antígeno lisen las células tumorales en una forma específica del antígeno. La presencia de células T de infiltración dentro de la masa tumoral, seis semanas después de una infusión de células T, sugiere que las células T persisten ¡n vivo, si por supuesto estas células representan un subconjunto de la población de células T infundidas. Prueba de citotoxicidad in vitro: Se realizaron pruebas normales de liberación de 5 Cr para determinar el reconocimiento de células efectoras CTLs de epítopes peptídicos asociados con melanoma cargados en células T2. Se desarrollaron 3x106 células T2 (deficientes en TAP, positivas a HLA-A2.1) en medio del RPMI + FBS a 0%, y se cosecharon. Se añadieron 100 mL de Cr por objetivo, y se incubaron a 37°C en un baño de agua. Se añadieron las células marcadas a un volumen de 10 mL de solución de lavado a 4% (RPMI con FBS a 4%), y se transformaron a pellas. Se realizaron lavados dos veces más. Las células se resuspendieron en medios a una concentración final de 0.2x106/mL, y se registró la radiactividad de células espontáneas contra el máximo de células (células lisadas con detergente). Las células se pulsaron con los péptidos adecuados a 10-20 µg/mL durante 30 minutos. Cada placa de 96 cavidades/50 µ? contenía células efectoras CD8+ a diferentes relaciones de efector: objetivo. La mezcla se incubó a 37°C durante 6 horas. Las placas se centrifugaron, y se cosechó el sobrenadante. Se contaron los sobrenadantes radiactivos en un contador gamma Cobra. Se calculó la liberación específica de 51Cr usando la fórmula (liberación de 51Cr-liberación espontánea)/(liberación máxima-liberación espontánea) X 100. Prueba de interferón-gamma intracelular: Se estimularon células efectoras con células T2 pulsadas con péptidos (la relación de CD8:T2 fue de 2:1 ) durante 5 horas en presencia de GlogiStop (PharMingen). Las células estimuladas se tiñeron superficialmente con anti-CD8-PE, se fijaron y se permeabilizaron con Cytofix/Cytoperm (PharMingen, número de catálogo 2076KK), seguido de tinción con anti-IFND-FITC. Las células marcadas doblemente se analizaron mediante citometría de flujo (FACScan de Becton Dickson), y se expresaron como por ciento de la expresión máxima. Se midió la expresión máxima de IFNDD como la cantidad expresada en respuesta a la activación por OKT3 (Orthoclone) de las mismas células efectoras.

Toxicidad asociada con modificadores de la respuesta biológica El propósito de la investigación clínica con modificadores de la respuesta biológica (por ejemplo, IFNa e IL-2), es determinar las condiciones óptimas que mantienen el beneficio del tratamiento, mientras reducen la toxicidad a un nivel mínimo. Aunque el IFN-a-2b a dosis y programas de administración actualmente aprobados puede prolongar significativamente la supervivencia en pacientes con melanoma, la administración puede asociarse también con toxicidad severa. Altas dosis de IL-2 parecen ser más efectivas que infusiones continuas a bajas dosis, pero altas dosis de IL-2 son también más tóxicas. Los efectos secundarios más comunes, son síntomas tipo influenza. Los efectos secundarios más severos son hipotensión, síndrome de fuga capilar y perfusión reducida de órganos. La IL-2 se ha usado clínicamente para tratar carcinoma de células renales y melanoma maligno. La combinación de IFN-a-2b e IL-2 en regímenes subcutáneos a bajas dosis, se ha descrito en otros ambientes clínicos (Pectasides et al, Oncology (1998) 55: 10-15; Piga et al., Cáncer Immunol Immunotherapy (1997) 44: 348-351 ). En un estudio, (Pectasides, 1998, citado anteriormente), se administraron IFN- -2b e IL-2 en un régimen de inmunoquimioterapia de combinación de 3 fármacos, en pacientes con cáncer metastásico de células renales (RCC). El estudio de fase II se llevó a cabo para definir la actividad de la administración subcutánea a bajas dosis de IL-2 [4.5 mU x 2/24 horas tres veces por semana durante 2 semanas] e IFN- -2b [3MU/24 horas tres veces por semana (en días alternos con IL-2) durante 2 semanas] y vinblastina (VLB) [4 mg/m2 cada 3 semanas]. Los pacientes tuvieron un descanso de citocinas de una semana, tiempo en el cual recibieron la VLB. El tratamiento se repitió cada 3 semanas, con una duración máxima de 1 año. La toxicidad fue de leve a moderada (grados I y II), consistiendo de fiebre, anorexia, malestar y náusea-vómito en más de 80% de los pacientes. Ninguno de los pacientes experimentó toxicidad mayor relacionada con VLB. Se propuso que la combinación de 3 fármacos podría ser un régimen promisorio (índice de respuesta general de 38.7%), con toxicidad moderada en RCC avanzado. En otro estudio (Piga, 1997, citado anteriormente) que evaluaba bajas dosis de IFN-ct-2b e IL-2 en RCC, se prescribieron IFN- -2b [3MU/m2 diariamente, intramuscularmente en forma continua] e IL-2 (0.5 MU/m2 x 2/24 horas subcutáneamente en los días 1 a 5 durante la primer semana, y 1MU/m2x2/24 horas durante 5 días en las siguientes tres semanas. Se dijo que los efectos secundarios eran reducidos (grados I y II) en la mayoría de los pacientes, con anormalidades en las pruebas de función hepática y renal observadas. Aunque se dijo que el régimen es de toxicidad moderada, de bajo costo y no requería hospitalización, el síndrome tipo influenza observado en la mayoría de los pacientes fue suficiente para hacer que una tercera parte de los pacientes rechazara el tratamiento subsecuente. Se consideró que los efectos secundarios del régimen de IFN e IL-2 descrito para el estudio de CTL-03, eran efectos de leves a moderados similares a los detectados en los estudios de RCC mencionados anteriormente. Sin embargo, el régimen de citocina de los autores dura un total de 33 días (5 con IFNa y 28 con IL-2), haciéndolo más atractivo si los resultados deseados pueden lograrse en este marco de tiempo más corto. En CTL-02 del estudio clínico, pudo alcanzarse el efecto deseado con una dosificación durante cinco (5) días consecutivos, y no se requirieron las once dosis adicionales. En CTL-03 del estudio, sólo uno de 31 pacientes enrolados en el estudio se rehusó a concluir un ciclo individual de terapia con citocinas. En general, la dosis de IL-2 fue bien tolerada por la mayoría de los pacientes.

Cantidades de citocinas que se requieren para lograr los efectos deseados En el estudio de fase I, la dosis mínima de IL-2 en un protocolo de inmunoterapia combinada, administrando factor de estimulación de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF) e IFN-a-2b además de IL-2, fue de 2-4 IU/m2, subcutáneamente durante 12 días cada 3 semanas. Se monitoreó la activación inmune, y se encontraron incrementos significativos en linfocitos, células T CD4+ y CD8+ activadas, células NK y la expresión de DR de monocitos. La dosificación de la IL-2 en este estudio, fue similar a la que se ha usado en CTL-03 del estudio (3MIU administradas subcutáneamente a diario durante cuatro semanas consecutivas); sin embargo, se tiene el beneficio agregado de proveer a los pacientes con números significativos de células T específicas de antígeno al inicio del tratamiento con IL-2. Se inició otro estudio para evaluar la influencia de la administración concomitante de la melatonina de hormona pineal (MLT) e IL-2 a bajas dosis, en pacientes cancerosos que habían progresado durante una inmunoterapia previa sólo con IL-2. Los tumores sólidos avanzados incluyeron tumores de pulmón, riñon, estómago e hígado, y melanoma. La IL-2 se administró a una dosis diaria de 3MIU, subcutáneamente durante 6 días por semana durante 4 semanas, una dosificación que es casi idéntica a la usada en CTL-03. La MLT se administró oralmente a una dosis diaria de 40 mg/día, partiendo 7 días antes de IL-2. Se observó regresión del tumor objetivo en 3 de 14 pacientes (21 %). Los pacientes con enfermedad estable, o demostrando una respuesta, se asociaron con incrementos significativamente mayores en números promedio de linfocitos y eosinófilos, con respecto a pacientes con progresión de la enfermedad, indicando que neoplasmas sólidos avanzados resistentes a IL-2, podrían ser sensibles a la terapia con IL-2 mediante la administración concomitante de MLT. Es posible que MLT mejorara el efecto inmune antitumoral de IL-2 y/o incrementara la susceptibilidad de las células cancerosa a citólisis mediada por linfocitos citotóxicos inducidos por IL-2. La sincronización y dosificación de IFN-a-2b e IL-2, según se define en CTL-03 del estudio, ceba posiblemente las células de melanoma para lisis sobrerregulando marcadores clave de tumores (expresión de antígenos asociados con melanoma y moléculas MHC clase I), y dan como resultado persistencia de células T específicas de antígeno. Esta conclusión es apoyada por las observaciones de que: 1 ) se detectó la presencia de células positivas tetraméricas detectadas al inicio de cada tratamiento sucesivo de terapia celular; 2) se observaron curvas de crecimiento que asemejaban respuestas secundarias o de memoria; y 3) se produjo interferón gamma en sobrenadantes de cultivo evaluados en el día 6 del protocolo ex vivo para cada ciclo de terapia celular. Los avances en el conocimiento de la biología celular y molecular de IL-2 y su complejo de receptores, han provisto la razón fundamental para utilizar mejor a IL-2 para expandir y activar efectores inmunes en pacientes con cáncer. El protocolo ex vivo descrito en ía presente para generar células T específicas de antígeno, da como resultado una preparación global de células CD8+ que tiene todas las moléculas de superficie necesarias para ir hacia el sitio del tumor, reconocer y lisar las células tumorales que expresan los antígenos asociados con melanoma, con selectividad exquisita. La presencia del receptor de IL-2 de alta afinidad (CD25/CD122/CD132) sobre la superficie de células CD8+, sugiere que estas células son capaces de responder a dosis menores de IL-2 in vivo. La combinación de la terapia con citocínas en conjunto con la terapia con células T agregada, representa una forma novedosa de tratar melanoma metastásico avanzado. Aunque la especificación anterior describe los principios de la presente invención, con ejemplos provistos con propósitos de ilustración, se entenderá que la -práctica de la invención abarca todas las variaciones, adaptaciones y/o modificaciones usuales que estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Leturcq, cidier J, Morlarty, Ann M. Jackaon, Kíc eel R. Feceroon, fer ?. Kie arde, jors K. <120 METODO DE TERAPIA CELULAR PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES <I30> ORT 1342CIP <H0> US ÍC/239,566 <141> 07-11-2002 <X50> US 60/270,252 <l$l> 20-02-2001 <i50> l¡3 10/080,013 <ISX> 19-02-2002 <160> 43 <170> 2lO> 1 <211 9 <212 FRT <2Í3> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <2Z3> CONSTRUCCION SINTETICA <400> 1 Me¾ Asn Gly Thr Met Ser GIrt V»l 5 <210> 2 <211> 3 <213> PRT <2l3> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> CONSTRUCCION SINTETICA «00> 2 Ket ftsp Gly Thx Ket Ser Gln VBI 5 21 > SECUENCIA ARTIFICIAL <220> 223> CONSTRUCCION SINTETICA «100> 3 Phe Lou Pro Trp Hls Arg Leu Phe *u ¿.eu 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220 <223> CONSTRUCCION SINTETICA <*QO> 4 lie Thi- Aap Gln Val Pro Phe Ser Val 5 <210> 5 <2ll> 9 <212> PRT <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> CONSTRUCCION SINTETICA <«00> 5 Lya Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val 1 5 <210 6 <2Ji> 9 <212> PRT <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> CONSTRUCCION SINTETICA <400> 6 Al* Ala Gly lie Gly Ti* -.eu Thr Val 1 5 <210> ? <2J1> 9 <2i?> PRT <2¿3> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> CONSTRUCCION SINTETICA <400? 7 Cyo Leu Thr Sor Thr Val Sin L#u Val 1 5 <2X0> 8 <211> 9 <212> PR7 <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <770> <?23> CONSTRUCCION SINTETICA <4G0> 8 Lyc He P e Gly 3er Leu Ala Ph« Leu i 5 <213> <211> Z11> <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <22t» <223t> CONSTRUCCION SINTETICA <tOO> 9 Lys K«t Ala Ser Arg 3er Haz Arg 1 ¦ 5 <210> 10 <2?> 10 <212> JRT <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <72 > <7Z3> CONSTRUCCION SINTETICA <<CC> 13 Ala L«u Alo Lou Ala Ala Leu Lwu Val Val 1 5 10 <210> 11 <2U> 9 <212> PKT <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> CONSTRUCCION SINTETICA <ÁQ > 11 Ala Leu Val Val Asp Arg G <2".0> i2 <2U> 12 <212> PRT <213> SECUENCIA ARTIFICIAL <220> <223> CONSTRUCCION SINTETICA <<C0> 12 Ala ??? 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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para preparar linfocitos T autólogos con especificidad para antígeno objetivo asociado con meoanoma, que comprende: a. preparar una línea de células que presentan antígenos de ocurrencia no natural (nnAPC), en donde dicha nnAPC es capaz de presentar simultáneamente hasta alrededor de 15 moléculas peptídicas diferentes asociadas con dicha infección viral, en donde dichas moléculas peptídicas tienen cada una aproximadamente 6 a 12 aminoácidos de longitud; b. cosechar células CD8+ de dicho sujeto o un donador adecuado; c. estimular dichas células CD8+ con dicha línea de células nnAPC; d. añadir dichas células CD8+ a medios que contengan una citocina seleccionada del grupo que consiste de IL-2, IL-7 o medio de crecimiento acondicionado (CGM), en donde dichas citocinas puedan usarse individualmente o en combinación; e. mezclar monocitos de sangre periférica no suspendidos, o monocitos de sangre periférica agotados en CD-8 colectados de dicho sujeto o un donador adecuado, con alrededor de 1 a 50 µg/mL de uno de dichos péptidos que dicha nnAPC puede presentar simultáneamente; f. irradiar dicha suspensión de monocitos de sangre periférica con una dosis suficiente de radiación gamma necesaria para esterilizar todos los componentes en la suspensión, salvo los monocitos de sangre periférica deseados; g. aislar monocitos de sangre periférica adherentes; h. cargar dichos monocitos de sangre periférica adherentes con aproximadamente 1 ug/mL a 50 µg/mL de cada uno de dichos péptidos; e i. combinar dichas células CD8+ con dichos monocitos de sangre periférica adherentes a una relación de aproximadamente diez células CD8+: un monocito de sangre periférica.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha nnAPC es capaz de presentar hasta aproximadamente diez moléculas peptídicas.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichas moléculas peptídicas tienen aproximadamente ocho a diez aminoácidos de longitud.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dichas moléculas peptídicas están a una escala de concentración de alrededor de 10 n a 100 µ?.

5.- El método, de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho componente de citocina es IL-2.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho componente de citocina es IL-2 e IL-7 en combinación.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la dosis de radiación gamma es de aproximadamente 3,000 a 7,000 rads.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la dosis de radiación gamma es de alrededor de 5,000 rads.

9. - El uso de interferón-alfa que sea capaz de mejorar la expresión del antígeno tumoral sobre la superficie de un tumor; para preparar un medicamento para tratar a un sujeto con melanoma, en donde el medicamento es administrable a dicho sujeto antes de inocular a dicho sujeto con una cantidad efectiva de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. 0. - El uso como se reclama en la reivindicación 9, en donde el medicamento también es administrable con interleucina-2 que sea capaz de mejorar el mantenimiento in vivo de los linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. 1. - El uso como se reclama en la reivindicación 10, en donde el interferón-alfa se selecciona de interferón-alfa-2a o interferón-alfa-2b. 12.- El uso como se reclama en la reivindicación 10, en donde el medicamento provee aproximadamente 10 MU de interferón alfa por m2 al día, y es administrable subcutáneamente al sujeto consecutivamente del día 5 al día 1 antes de inocular a dicho sujeto con la cantidad efectiva de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma. 13.- El uso como se reclama en la reivindicación 10, en donde el medicamento provee aproximadamente 1-10 x 109 células de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma por infusión. 14.- El uso como se reclama en la reivindicación 10, en donde los linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma, se obtienen mediante un método que comprende los pasos de: a) preparar una línea de células que presentan antígenos de ocurrencia no natural (nnAPC), en donde dicha nnAPC es capaz de presentar simultáneamente hasta alrededor de quince epítopes diferentes asociados con dicho melanoma, y en donde cada epítope es un péptido que tiene de ocho a diez aminoácidos de longitud; b) cargar la nnAPC con hasta aproximadamente quince epítopes diferentes asociados con dicho melanoma; c) cosechar células CD8+ de dicho sujeto; d) estimular dichas células CD8+ con la línea de células nnAPC cargada con epítopes, para obtener células CD8+ específicas del melanoma; e) desarrollar las células CD8+ específicas del melanoma en medios que contengan IL-2 e IL-7; f) mezclar monocitos de sangre periférica agotados en CD8 colectados de dicho sujeto, con cada epítope usado para cargar la nnAPC; g) irradiar dichos monocitos de sangre periférica agotados en CD8 con radiación gamma; h) aislar monocitos de sangre periférica agotados en CD8 adherentes; i) cargar dichos monocitos de sangre periférica adherentes con cada epítope usado para cargar la nnAPC; j) reestimular dichas células CD8+ específicas del melanoma con los monocitos de sangre periférica adherentes cargados con epítopes; k) desarrollar las células CD8+ reestimuladas específicas del melanoma en medios que contengan JL-2 e IL-7; y I) expandir las células CD8+ reestimuladas específicas del melanoma mediante estimulación con anticuerpos OKT3. 15. - El uso como se reclama en la reivindicación 14, en donde el paso 0) puede repetirse cuando menos una vez más. 16. - El uso como se reclama en la reivindicación 14, en donde dicha línea de células que presentan antígenos de ocurrencia no natural, se carga con epítopes que son péptidos derivados de tirosinasa, gp100 y MART-1. 17. - El uso como se reclama en la reivindicación 16, en donde dicha línea de células que presentan antígenos de ocurrencia no natural, se carga con epítopes que comprenden secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. 18. - El uso como se reclama en la reivindicación 14, en donde la cantidad efectiva de interleucina-2 es de aproximadamente 3 MlU/día, y es administrable subcutáneamente al sujeto consecutivamente del día 0 al día 28 después de inocular a dicho sujeto con la cantidad efectiva de linfocitos T citotóxicos autólogos con carácter específico por antígeno objetivo asociado con melanoma.