KR20080098066A - 림프구 제거제를 ｃｔｌ 및 사이토카인과 결합한 암 치료 - Google Patents
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Abstract
세포 요법과 화학요법을 결합한 암 치료에서, 자가 조직의 CD8+ T 세포를 환자로부터 수득하고, 이들을 선택된 펩티드 항원으로 적재된 이종 항원 제시 세포와 접촉시켜 생체 외에서 활성화시켜, 항원 특이적 활성화 세포독성 T 림프구를 생성한다. 이러한 활성화된 CTL은 환자에게 골수비파괴성이나 림프구를 고갈시키는 제제, 예컨대, 클라드리빈 또는 데닐루킨 디프티톡스, 및 인터루킨-2 및 인터페론-α-2b 자극 사이토카인을 포함하는 림프구 고갈제 및 CTL 유지 요법과 함께 투여된다.
Description
관련된 출원의 교차 참조
본 출원은 2006년 3월 1일자로 출원된 미국 가출원 번호 60/778,516호를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 활성화된 세포독성 T 림프구, 사이토카인, 예컨대, IL-2 및 IFN-알파-2b, 및 림프구 제거제로서 클라드리빈 또는 데닐루킨 디프티톡스의 투여를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 이해를 돕기 위하여, 이 부분은 발명자에게 유일할 수 있는 관점, 관찰 및 결론을 포함하여, 본 발명의 전개를 이끄는 역사 및 배경 기술을 논하고자한다. 따라서, 본원의 배경 설명은 종래 기술의 내용에 관한 승인으로서 해석하여서는 안된다.
다수의 요법이 다양한 암을 치료하기 위하여 개발되어 왔다. 이들 노력의 대부분은 화학요법 요법에 집중해 있다. 전이성 흑색종을 위한 치료로서 디자인된 하나의 특정한 배합 화학요법 요법에서, "Dartmouth 요법"(DTIC, 시스플라틴, BCNU 및 타목시펜의 배합)으로 35-50%의 반응률이 보고되었지만, 생존 기간이 6 내지 10 개월에 머물렀다. 또한 높은 경감 비율이 적극적인 고용량 강도 화학요법1 및 자가 조직의 골수 이식에 의한 혈구생성과정의 과다에 대하여 보고되었다. 그럼에도불구하고, 생존 기간의 중간값이 약 4개월로 짧다2.
최근 몇 년 동안 특정 면역요법을 받은 흑색종 환자의 작은 비율에서 생존자 중 중요한 개선이 보고되었다. 이는 암 백신을 이용한 활성의 특정 면역요법 뿐만 아니라 면역 시스템의 비특정 촉진제, 예컨대, 인터루킨-2(IL-2) 및 인터페론-알파(IFN-α)를 포함한다.3-5
흑색종에서 T-세포 한정 종양 항원의 확인은 항원-특이성 세포 면역 반응을 증대시키는 시도로 암 세포를 표적으로 하는 임상적 시도를 이끌었다. 이 접근은 생체 내에서 효능 있는 T 세포 반응을 유도하기 위한 시도에서 면역원성 환경에 항원을 전달하는 많은 백신화 방법에서 추구되었다. 일부 임상적 반응이 백신 시도에서 관찰되었지만, 유도된 T-세포 반응의 크기는 일반적으로 낮거나 검출불가능하였고 임상적 반응과 상관관계가 부족하였다. 암 항원을 갖는 흑색종 환자의 면역은 순환하는 CTL 전구체의 수를 증가시킬 수 있으나 이는 임상적 종양 퇴보와는 상관없으며, 생체 내에서 작용 또는 활성에서의 결점이라고 제안되었다.
마우스 종양 모델에서의 연구는 하나 이상의 종양 항원에 대해 특이적인 T세 포의 시험관 내 면역과 관련된 양자 면역요법이 최소의 독성으로 효과적일 수 있음을 증명하였다. 인간 종양의 치료에 대한 이 방법의 적용에서 방해물은 종양 세포를 CTL로 중재되는 파괴에 감수성이게 할 수 있는 면역원성 항원의 확인이다. 흑색종 환자로부터 종양-반응성 T 세포의 분리는 CTL에 직접적인 종양 항원(에피토프)의 일부의 확인을 유도하였다. 이들은 티로시나아제, MART-1/Melan A, gp100 및 MAGE를 포함한다. 이들 중에서, 티로시나아제 및 MART-1은 흑색종 상에 거의 전반적으로 발현되므로 양자 면역요법에 대하여 원하는 표적 선택을 나타낸다.6-13
양자 T 세포 요법은 관용 기작이 암 환자의 생체 내에서 활성인 숙주 환경으로부터의 T 세포의 제거와 관련 있고 이 환자 집단에서 증명된 무효한 반응에 기여한다. CD8+ T 세포는 항원-특이 CTL을 생산하기 위하여 생체 외에서 자극될 수 있다(예: 미국 특허 번호 6,225,042호 참조). 앞선 양자 면역요법 접근은 다양한 암에 대한 치료로서 활성화된 림프구를 사용하였다.14 처음으로, EL-2로 생체 외에서 활성화된, 후기 종양-침윤 림프구(TIL) 및 림포카인으로 활성화된 살해 세포(LAK)를 사용하였으나, 효율의 증거는 확실하지 않았다. 이들은 앞서, 실패된 임상적 시도를 조절하여 흑색종 환자에게 IL-2를 직접적으로 투여하는 것을 통하여 생체 외에서 활성화된 세포를 이용하는데 이점을 보였다. Yee 등(Fred Hutchinson Cancer Research Center)15 및 Dudley 등(NCI)16의 최근 연구는 특정 양자 T-세포 치료 접근에 대하여 효과적임을 증명하였다. 이들 연구는 MART-1 또는 gp100 및 저 용량 IL-2에 특이적인 T-세포 클론 또는 동종이계의 영양 세포 및 고용량 IL-2로 생체 외에서 증식되는 TIL의 사용과 관련 있다. 이들 연구는 양자 면역요법이 암의 치료를 보증함을 확인하였지만, 이의 전체 개발은 항원-특이성 CD8+ CTL의 치료적 수의 생체 외 발생을 위해 재현할 수 있는 방법의 부족으로 방해받아 왔다.17
세포용해(cytotolytic) CD8+T 세포는 바이러스 감염에 대한 주요 방어주이다. CD8+ 림프구는 바이러스로 감염된 숙주세포를 특이적으로 인식하고 용해한다. 이는 CTL의 세포독성 활성을 이용하는데 바람직하지만, 약간의 시험관 내/생체 외 절차는 특이적으로 CTL을 활성화시키는데 이용가능하다. 흑색종과 관련된 주요 항원의 확인 및 CTL의 시험관 내 특이 활성에 대한 방법은 전이성 흑색종에 대한 양자 면역요법의 유효한 평가를 하게 한다.15-18
시험관 내 CD8+ 활성에 대하여 자연적으로 발생하는 항원 제시 세포(APC)를 사용(예: 수지상세포, 대식세포, 자가 조직의 종양 세포)하는 것이 가능하지만, 활성의 효율은 원래 APC의 MHC 클래스 I 분자는 다른 많은 펩티드 에피토프를 포함하고 있으므로 낮고, 따라서, 종양과 관련된 펩티드 에피토프의 최소의 표시를 허락한다. 이 문제에 대한 더욱 직접적인 접근은 질병과 싸우는 것과 관련된 그들의 에피토프, 이 특이한 경우에서는 흑색종과 관련된 항원에 특이적으로 CD8+ T 세포를 활성화시키는 것이다.
최근, 인공적 APC가 Drosophila melanogaster(초파리) 배아 세포주를 사용하여 개발되어 왔고, 이는 주요 조직 적합 유전자 복합체(MHC) 클래스 I 분자를 발현한다.18,19 또한 미국 특허 번호 6,225,042 및 6,355,479호를 참조할 수 있다. 곤충 초파리는 진보된 면역 시스템이 결여되어 있으므로, 펩티드 에피토프를 인간 클래스 I 분자로 적재하는데 관련된 TAP-1,2 펩티드 수송자가 없다. 결과적으로, 형질전환된 클래스 I 분자는 공기(empty vessel)로서 초파리 세포 표면 상에 나타난다. 이들 형질전환된 초파리 세포를 특정 클래스 I 분자(예: 종양 항원 T-세포 펩티드 에피토프)에 결합하는 외인성 합성 펩티드와 배양시킴으로써, 이용가능한 모든 클래스 I 분자는 MHC로 한정된, 특정 펩티드 에피토프(들)로 채워질 수 있다. 이들 초파리 APC 상의 주요 공동 자극 분자 B7-1(CD80), CD70, LFA-3(CD58) 및 ICAM-1(CD54)의 첨가 및 단독 또는 다중의 에피토프를 나타내는 클래스 I 분자의 고밀도 발현은 항원성 펩티드에 대하여 특이적인 자가 조직의, 효능 있는 세포독성 CD8+ T 세포의 시험관 내 발생을 가능하게 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 다양하고 일반적인 관점 및 바람직한 구체예는 본원의 청구항에 반영되고, 본원에 참조로서 통합된다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예, 특성 및 다양한 관점의 이점은 하기 도면과 함께 상세한 설명으로부터 나타내고자 한다.
도 1은 펩티드가 적재된 표적 세포에 대하여 생체 외에서 생성된 CTL의 세포독성 활성을 나타낸다. 흑색종 환자로부터 분리된 CD8+ T 세포를 시험관 내에서 5개의 상이한 흑색종-관련 펩티드 에피토프가 적재된 초파리 APC로 면역화시켰다. 활성화된 CD8+ T 세포를 IL-2 및 IL-7를 사용하여 시험관 내에서 배양하여 흑색종-특이 CTL을 선택적으로 증식시켰다. 활성을 각각의 펩티드(Tyr-1689, Tyr-2792, gp100-1817, gp100-2853 또는 MART-1819 대 HLA-A2 대조 펩티드가 적재된 T2 세포)를 개별적으로 적재한 51Cr-표지 T2 표적 세포의 특이적 용해로서 측정하였다.
도 2는 대조군 요법과 함께 본 발명의 치료 요법의 두 바람직한 구체예의 개략적인 도식을 제공한다.
본 발명의 상세한 설명 및 그의 바람직한
구체예
본 발명의 다양한 관점은 명세서의 상세한 설명 및 바람직한 구체예를 통하여 하기에 설명된다. 간결함을 위하여, 본원에 인용된 모든 특허의 명세서 및 기타 문헌은 참고로 포함된다. 본원에서 달리 정의하지 않거나 문맥으로부터 벗어나는 일이 없다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 일반적으로 사용되는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
용어 "포함하는 및 함유하는(including, comprising 및 containing)"은 그의 공개된, 비한정적인 의미로 본원에 사용된다.
클라드리빈 및 DAB-IL2로부터 선택된 적어도 하나의 림프구 제거제와 선택된 펩티드가 사이토카인과 결합하여 적재된 xAPC를 접촉시켜 활성화시킨 CTL 투여를 포함하는, 본 발명의 치료적 요법은 이러한 치료를 요하는 대상에서 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 바람직하게 암은 악성 흑색종, 다발성 골수종, 전립선암, 임파종, 비호지킨스씨 임파종, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림푸구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 버킷 임파종, 갑상선암, 자궁암, 신장암, 난소암, 폐암, 유방암, 간암, 췌장암, 전립선암, 대장암, 피부암, 위암 및 자궁경부암으로부터 선택된다.
따라서, 본 발명의 일 구체예는 하기를 포함하는 전이성 흑색종을 치료 또는 개선하기 위한 양자 CTL 요법 요법을 제공한다: 대상으로부터 나이브(
) CD8+ T 세포를 수득하는 단계; 나이브 CD8+ T 세포를 선택된 펩티드 항원으로 적재된 이종 항원 제시 세포(xAPC)와 접촉시켜, 선택된 펩티드 항원을 발현하는 세포를 표적으로 하는 활성화된 CTL을 생성하는 단계; 원래의 대상에 상기 활성화된 CTL을 투여하는 단계; 클라드리빈 및 DAB-IL2로부터 선택되는 적어도 하나의 림프구 제거제를 투여하는 단계; 및 CTL 유지에 유효한 적어도 두개의 사이토카인을 투여하는 단계. 양자 CTL 요법 요법은 바람직하게 생체 외에서 활성화된 자가 조직의 CD8+ T 세포를 사용하고, 이는 본 발명에 따라 대상에 투여되고 활성화될 경우 생체 내에서 암과 관련된 항원성 에피토프를 가지는 종양 세포의 파괴가 가능하다.
본 문맥에서 용어 "대상"은 암의 치료를 요하는 포유류 환자를 의미한다. 예를 들어, 대상은 흑색종, 예컨대 진행성 악성 전이성 흑색종으로 진단된 인간, 예를 들어, HLA-A2 양성으로 진단되고 절제불가능한 III/IV기 질환을 지닌 환자일 수 있다.
CTL 시약은 xAPC로부터 제조된다. 사용하기에 적절한 예시의 이종 항원 제시 세포(xAPC)는 하기의 성분을 포함할 수 있다: 외인성 MHC I 분자; 나이브 T 세포의 활성을 돕기 위한 하나 이상의 외인성 보조 분자; 및 그들의 표면에서 외인성 분자를 발현할 수 있는 숙주 세포. 바람직하게, 외인성 분자는 숙주 세포로 도입되는 이종 핵산에 의해 코딩된다. 또한 xAPC는 바람직하게 외인성 공동자극제 및 부착 분자를 발현하고, 이는 xAPC의 T 세포 활성 능력을 강력하게 한다. 바람직하게, 숙주 세포는 곤충 세포이고, 더욱 바람직하게 초파리 세포, 예컨대, Schneider 2(S2) 세포이다. 예시의 xAPC 및 그들의 제조 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,225,042호 및 6,355,479호에 개시되어 있다.
xAPC는 당업계에 공지되거나 이용가능한 다양한 방법에 의해 펩티드 항원으로 적재될 수 있다. 펩티드는 빈(empty) MHC 클래스 I 분자에 결합가능한 것이 선택된다. 선택된 펩티드는 바람직하게 세포의 표면 상에 발현된 단백질로부터 유래된 항원성 또는 면역원성 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 상응하고, 이는 양자 CTL 요법에 사용된 T 세포에 대하여 표적으로서 제공될 것이다. 빈 MHC 클래스 I 분자를 선택된 펩티드로 적재하기 위하여, 빈 MHC 클래스 I 분자에 결합하는 하나 이상의 항원성 또는 면역원성 펩티드 종은 결합이 일어나기에 적절한 조건 하에 xAPC와 접촉될 수 있다.
하나 이상의 항원성 또는 면역원성 펩티드 종이 선택될 수 있다. 하나 이상의 종이 선택될 경우, 이들은 동시에 또는 다른 단계에서 xAPC와 접촉될 수 있고, xAPC 상에 다중-항원성 또는 다중-면역원성 MHC-펩티드 복합체를 생산한다.
선택된 펩티드의 빈 MHC 분자로의 적재는 바람직하게 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 접근될 수 있는, 생물학적 결합 조건에 근접하는 조건 하에서 일어난다. 펩티드를 선택하는데 있어서, 당업자는 하나 이상의 인자, 예컨대, 열역학, 정전기학, 효과적 및 엔트로픽적인 고려뿐만 아니라, MHC 분자에 유효하게 결합하는데 필요한 선택된 펩티드 내의 특정 아미노산을 고려할 수 있다.
바람직한 펩티드는 예를 들어, 티로시나아제 단백질, gp100 단백질 및 MART-1 단백질로부터 선택된 아미노산 서열에 상응하는 펩티드를 포함한다. 다른 바람직한 펩티드는 YMNGTMSQV (서열번호 1), YMDGTMSQV (서열번호 2), AAGIGILTV (서열번호 3), ITDQVPFSV (서열번호 4), YLEPGPVTA (서열번호 5) 및 KTWGQYWQV (서열번호 6)를 포함한다. 선택될 수 있는 부가의 예시 펩티드는, 예를 들어, 하기 아미노산 서열을 포함하고, 각 펩티드로부터 유래된 단백질을 삽입구로 기록하였다: SILSLKEAST (C-렉틴; 서열번호 1), KMASRSMRL (C-렉틴; 서열번호 2 ), ALALAALLVV (Pec60; 서열번호 3), ALLVVDREV (Pec60; 서열번호 4), YMNGTMSQV (티로시나아제; 서열번호 5), YMDGTMSQV (티로시나아제; 서열번호 6), ITDQVPFSV (gp100; 서열번호 7), YLEPGPVTA (gp100; 서열번호 8), AAGIGILTV (MART-1; 서열번호 9), ELAGIGILTV (MART-1; 서열번호 10), CLTSTVQLV (Her-2/neu; 서열번호 11), HLYQGCQVV (Her-2/neu; 서열번호 12), KIFGSLAFL (Her-2/neu; 서열번호 13), IISAVVGIL (Her-2/neu; 서열번호 14), PLTSIISAV (Her-2/neu; 서열번호 15), VMAGVGSPYV (Her-2/neu; 서열번호 16), VLVKSPNHV (Her-2/neu; 서열번호 17), ELVSEFSRM (Her-2/neu; 서열번호 18), YLSGANLNL (CEA; 서열번호 19), GPLTPLPV (AES; 서열번호 20), SLLMWITQC (NY-ESO-1; 서열번호 21), KALFAGPPV (CA-125; 서열번호 22), YLETFREQV (CA-125; 서열번호 23), GLQSPKSPL (CA-125; 서열번호 24), VLLKLRRPV (CA-125; 서열번호 25), ELYIPSVDL (CA-125; 서열번호 26), SLLMWITQV (NY-ESO-1; 서열번호 27), ILAKFLHWL (텔로머라아제; 서열번호 28), STAPPVHNV (MUC-1; 서열번호 29), FLWGPRALV (MAGE-3; 서열번호 30), FMWGNLTLA (CA-125; 서열번호 31), RLVDDFLLV (텔로머라아제; 서열번호 32), HLSTAFARV (G250; 서열번호 33), QLSLLMWIT (NY-ESO-1; 서열번호 34), ELWTHSYKV (FBP; 서열번호 35), KVAELVHFL (MAGE-3; 서열번호 36), YIFATCLGL (MAGE-3; 서열번호 37), HLYIFATCL (MAGE-3; 서열번호 38), MLMAQEALAFL (CAMEL; 서열번호 39), STLEKINKT (SSX-4; 서열번호 40), KASEKIFYV (SSX-2; 서열번호 41), SLLMWITQCFL (NY-ESO-1; 서열번호 42), ELTLGEFLKL (서바이빈; 서열번호 43), LTLGEFLKL (서바이빈; 서열번호 44), SLLEKREKT (SP17; 서열번호 45), TLGEDDPWL (SART-1; 서열번호 46), KLGLKPLEV (SART-1; 서열번호 47), YLWTSAKNT (SCP-1; 서열번호 48), STAPPAHGV (MUC-1; 서열번호 49), GMGSEELRL (LIVIN; 서열번호 50), SLGSPVLGL (LIVIN; 서열번호 51), YLFFYRKSV (hTRT; 서열번호 52), CQQEETFLL (CA-125; 서열번호 53), TLAKFSPYL (PRAME; 서열번호 54), NLTHVLYPV (PRAME; 서열번호 55), STFKNWPFL (서바이빈; 서열번호 56), SLLQHLIGL (PRAME; 서열번호 57), FLDQRVFFV (gp100; 서열번호 58), FLDQRVFVV (gp100; 서열번호 59), FLDQVAFVV (gp100; 서열번호 60), GLDREQLYL (MUC-16; 서열번호 61), VMQHLLSPL (MUC-16; 서열번호 62), QQTHGITRL (MUC-16; 서열번호 63), LQPLSGPGL (MUC-16; 서열번호 64), TLDRDSLYV (MUC-16; 서열번호 65), QLYLELSQL (MUC-16; 서열번호 66), KVLEYVIKV (MAGE-1; 서열번호 67), KVADLVGFL (MAGE-1; 서열번호 68) 및 KTWGQYWQV (서열번호 70).
선택된 펩티드는 당업계의 다양한 수단 및 방법을 통하여 세포에 나타낼 수 있다. 선택된 펩티드는 그들이 세포 내 펩티드의 풀에 들어가는 방식으로 나타낼수 있다. 예를 들어, 펩티드는 삼투 적재를 통하여 나타낼 수 있다. 바람직하게, 펩티드는 xAPC 시스템 배양 배지에 첨가된다. 펩티드는 세포 공정, 예컨대, 예를 들어, 효소적 분해를 통하여 이어서 분해되는 손상되지 않은 폴리펩티드 또는 단백질의 형태로 배양 배지에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 손상되지 않은 폴리펩티드 또는 단백질은 xAPC 시스템 배양 배지에 첨가하기에 앞서 다른 수단, 예컨대, 화학적 소화(예; 시아노겐 브로마이드) 또는 프로테아제(예; 트립신 및 키모트립신)를 통하여 분해될 수 있다. 대안적으로, 총 단백질 또는 폴리펩티드 서열은 적절한 벡터로 클론될 수 있고 원핵 세포로 도입될 수 있고, 이로써 세포는 이어서 배양, 정제 및 이어서 xAPC 시스템 배양 배지에 첨가되는 펩티드로 소화되는 유의한 양의 항원성 폴리펩티드를 생성한다.
각각의 선택된 펩티드의 충분한 양은 세포 배양에 첨가되어 클래스 I MHC 분자에 결합한 다음 인간 클래스 I MHC-발현 세포의 표면 상에 고밀도의 펩티드를 나타낼 수 있다.
xAPC는 비이종 또는 내인성 항원 제시 세포의 APC 기능과 비교하여 증진된 APC 기능에 대하여 평가될 수 있다. 증진된 APC 기능은 다양한 CD8+ T 세포 활성의 파라미터, 예컨대, 예를 들어, 하나 이상의 세포 표면 단백질의 발현 정도를 측정함으로써 결정될 수 있고, 이는 CD8+ T 세포 활성, 예컨대, CD69 세포 표면 발현, 분화의 정도, 세포독성 살해 능력의 정도, 특정 세포 용해의 정도 및 사이토카인 생산의 정도를 나타낸다.
단백질 및 펩티드의 정제는 당업계에 공지된 다양한 기술, 예컨대, 면역친화성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 단백질 침전, 버퍼 교환, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 결합 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피를 통하여 이루어 질 수 있다. 항원으로 자극된 CTL은 펩티드-MHC pMHC 테트라머 염색으로 검출 또는 분리될 수 있고, 검출된 CTL은 xAPC에 의해 나타내어지는 선택된 펩티드에 대하여 특이하다.
말초 혈액 백혈구(PBL)는 대상으로부터 수득되고, 바람직하게 실질적으로 정제된다. PBL의 정제 방법은 이 목적에 사용될 수 있는 피콜 기울기를 사용하는 방법을 포함한다. 이어서 정제된 PBL은 적절한 항원성 펩티드로 미리 배양된 xAPC 세포와 혼합된다. 바람직하게, PBL은 당업계에서 자석 비드 정제 시스템, 예컨대, Miltenyi 비드(Myltenyi Biotec) 및 Dynabead 시스템(Dynal Biotech)에 의해 정제된다. PBL은 또한 세포 분리 절차, 예컨대, FACS(fluorescence assisted cell sorter) 기반의 방법 또는 다른 적절한 세포 분리 장치 및 방법론을 통하여 정제될 수 있다. 이러한 세포 분리 방법 또는 적혈구의 분리는 다양한 세포-특이 단백질의 마커로서 녹색 형광 단백질(GFP)을 사용한다.
나이브 T 세포를 적절한 xAPC와 배양하고 CD8+ 세포의 집단이 활성화되고 풍부해지기 위한 충분한 시간 동안 선택된 펩티드로 적재하였다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,690,915호에 림프구방출(lymphocytopheresis)을 통하여 많은 림프구를 수득하는 방법이 기재되어 있다. 바람직하게, CD8+ 세포는 항원-특이적 방식으로 활성화된다. 휴지기 또는 전구체 CD8+(작동체) 세포 대 항원-제시 세포의 비는 개별적으로 다양할 수 있고 또한 배양 조건에 대하여 개별적인 림프구의 순종 및 암의 성질 및 심각성과 같은 변수에 달려있을 수 있다. 그러나, 바람직하게, 림프구:항원-제시 세포(예: 초파리 세포)의 비는 약 30:1 내지 300:1의 범위이다. 예를 들어, 일 구체예에서, 3 x 107 인간 PBL 및 1 x 1O6 살아있는 초파리 세포는 혼합되고 20 ㎖의 RPMI 1640 배양 배지에서 유지된다.
작동체/항원-제시 배양은 CD8+ 세포의 치료적으로 사용가능하거나 유효한 수의 집단에 대하여 활성화시키고 풍부하게 하는데 필요한 시간 동안 유지될 수 있다. 최대의 특정 CD8+ 활성 수준은 일반적으로 배양 1 내지 10일 후, 예를 들어, 배양 5일 후에 관찰됨으로, 바람직한 시간은 약 3 내지 7일이다. 본 발명의 일 구체예에서, CD8+ T 세포의 시험관 내 활성은 세포주의 트랜스펙션 후의 짧은 시간 내에 검출될 수 있다. 일 구체예에서, CD8+ T 세포의 활성이 가능한 트랜스펙션된 세포주에서의 한시적인 발현은 트랜스펙션 48 시간 내에 검출 가능하다. 따라서, 인간 클래스 I MHC 분자를 발현하는 형질전환된 세포의 안정적이거나 한시적인 배양은 CD8+ T 세포를 활성화시키는데 유효하다.
활성화된 세포독성 T 림프구는 당업계에 공지된 적절한 방법 또는 이용가능한 방법을 사용하여 xAPC(예: 초파리 세포)로부터 효과적으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 인공적 APC, 인공적 APC로 적재된 펩티드 또는 CTL(또는 이의 단편)에 특이적인 단일클론 항체는 그들의 적절한 상보성 리간드와 결합하는데 사용될 수 있다. 이어서 항체가 태그된 세포는 자극-작동체 세포 혼합물로부터 당업계의 임의의 다양한 방법, 예컨대, 예를 들어, 면역침전 및 면역어세이 방법으로 추출될 수 있다. 대안적으로, 분리 단계는 완전히 생략될 수 있고 비활성화된 xAPC는 활성화된 CTL와 함께 배양될 수 있다.
활성화된 CTL의 치료적 유효성, 세포독성 양은 기술된 시험관 내 및 생체 내 사용, 예를 들어, 이들 CTL 세포의 궁극적 표적인 세포의 양 및 타입의 관점에서 적절하게 선택될 수 있다. 양은 또한 환자 상태의 관점에서 선택될 수 있고 개업의에 의해 적절한 모든 인자의 고려를 통하여 결정될 수 있다. 바람직하게, 약 1 x 106 내지 약 1 x 1012, 더욱 바람직하게 약 1 x 108 내지 약 1 x 1011 및 더더욱 바람직하게 약 1 x 109 내지 약 1 x 1O10의 활성화된 CD8+ 세포가 인간 성인에 대하여 사용되고, 상대적으로 약 5 x 106 - 5 x 107 세포가 마우스에서 사용된다.
바람직하게, CTL인 활성화된 CD8+ 세포는 상술한 바와 같이, 처리될 개별적인 CTL 세포의 투여 전에 xAPC 배양으로부터 수확된다. 세포 배양 시스템은 바람직하게 종양형성성이 아니다. 그러므로, 초파리 세포 및 활성화된 CD8+ 세포의 완전한 분리가 이루어지지 않는다면, 작은 수의 초파리 세포의 투여와 관련된 유전적 위험은 없다.
나이브 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포, 또는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 둘 모두, 세포는 바람직하게 xAPC 배양 전에 대상으로부터 추출될 수 있다. 대상은 백혈구를 수집하기 위하여 임의의 다양한 공지된 혈구 분리 절차 또는 이용가능한 혈구 분리 절차를 겪을 수 있다.
나이브 T 세포는 본 발명에서 제공하는 나이브 T 세포의 특이 활성 방법 및 용도를 제한하는 임의의 방법, 방해 또는 약화시키는 다른 치료 또는 요법의 개시 전에 대상으로부터 수확될 수 있다. 예를 들어, 종양형성 또는 종양을 갖는 개인의 치료에서, 나이브 T 세포의 샘플은 화학요법 또는 방사선 치료의 개시 전에 수득될 수 있고 배양은 유지된다. 나이브 T 세포가 펩티드가 적재된 xAPC로 활성화된 후, 나이브 T 세포는 증식되고 활성화되고, 활성화된 CTL은 대상으로 다시 도입될 수 있다. 대안적으로, 나이브 T 세포는 활성화될 수 있고, 활성화된 CTL은 다른 임의의 형태의 치료, 예컨대, 화학요법 또는 방사선과 함께, 전 또는 후에 나이브 T 세포를 수득한 대상으로 다시 도입될 수 있다.
활성화된 CTL은 또한 전달 및 대상으로의 융합을 위하여 적절한 비히클로 현탁될 수 있다. 세포 성분의 재도입 기술은 당업계에 공지되어 있고 미국 특허 번호 4,844,893호 및 4,690,915호에 예시된 절차를 포함한다. 예를 들어, 정맥 주사를 통한 활성화된 CTL 세포의 투여가 사용될 수 있다. 연속 주사가 요구될 수 있고, 이들 주사는 몇 주 또는 더 긴 시간 동안 일어날 수 있다.
본 발명의 치료 요법에서, 사이토카인은 또한 CTL 유지를 위하여 투여될 수 있고 이로써 대상에 투여된 CTL의 반감기, 활성, 효능 및/또는 선택성이 증진된다. 이러한 유지는 CTL 상에 직접적인 효과에 기인하거나 CTL의 표적 세포 상의 항원 발현의 상향조절과 관련된 간접적인 효과에 기인할 수 있다. 바람직한 사이토카인은 IFN-α-2b 및 IL-2이다.
클라드리빈(2-CdA, 류스타틴®) 및/또는 DAB IL-2(ONTAK®) 림프구 제거제가 또한 본 발명의 치료 요법에 투여된다. 이들 시약은 골수비파괴성이고 CTL 요법을 받은 대상에서 한시적인 면역억제를 유도한다.
각각의 CTL, 사이토카인 및 림프구 제거제의 투여 시간 및 기간은 하기 실시예를 포함하는 본원의 지침 및 일반적인 실험을 바탕으로 하여 당업자에 의해 선택될 수 있다.
본 발명의 다양한 관점 및 특징을 설명하기 위하여, 하기 실시예를 제공한다.
CTL
의
셍체
외 제조
이종 APC(xAPC)주는 Schneider S2 세포 (S2 세포)로부터 생산되고, 이는 공개된 절차(Schneider, J. Embryol. Morph. 27:353-365,1972)에 따라 수 백 20- 내지 24-시간의 Oregon-R(야생형) Drosophila melanogaster(Oregon-R) 배(ATCC CRL-1963)로부터 1969년에 확립되었다. S2 세포주는 American Type Culture Collection (CRL10974)에 기탁되었다. S2 세포의 원래 공급은 이 공급원으로부터 수득된 유도된 xAPC로부터 세포주를 얻기 위하여 사용되었다. xAPC를 생산하기 위하여, S2 세포를 플라스미드 벡터 pRMHa-3(참조 예: 미국 특허 번호 6,225,042호)으로부터 유래된 벡터로 트랜스펙션하였다. 클론 A를 나타내는 하나의 xAPC주는 HLA-A2.1 클래스 I, B7.1 및 ICAM-1을 코딩하는 벡터로 트랜스펙션하였다. 클론 B를 나타내는 두번째의 xAPC주는 HLA-A2.1 클래스 I, B7.1, B7.2, ICAM-1 및 LFA-3을 코딩하는 벡터로 트랜스펙션하였다. 클론 C를 나타내는 세번째의 xAPC주는 HLA-A2.1 클래스 I, B7.1, ICAM-1, LFA-3 및 CD70을 코딩하는 벡터로 트랜스펙션하였다. 따라서, 클론 A는 HLA-A2, B7.1 및 ICAM-1을 발현하고, 클론 B는 HLA-A2.1 클래스 I, B7.1, B7.2, ICAM-1 및 LFA-3을 발현하며, 클론 C는 HLA-A2.1 클래스 I, B7.1, ICAM-1, LFA-3, 및 CD70.B7.2 및 LFA-3을 발현한다.
클론 A- 및 클론 B-유래 세포의 독립적인 연속 배양은 10% 우태아혈청 및 500 μg/㎖ 제네티신(G418)이 보충된 Schneider's 배지에서 유지되고 각각의 분할을 약 1 x 106 세포 /mL의 세포 밀도로 조정하는 동안에 첨가된 새로운 배지로 한주에 두번 분할된다. 배양하기 약 하루 앞서(-2일 내지 -4일; 0일은 외인성 분자의 발현을 위하여 테스트되고 펩티드로 적재된 세포 일수로서 정의됨), 3 x T75 플라스크를 1.5 x 107 세포/플라스크에 대한 스톡 배양 당량으로 유지되는 세포 현탁액의 부피로 접종하였다. G418이 없는 완전 초파리-SFM배지를 15 ㎖/플라스크 부피까지 첨가하였다. 이어서 플라스크를 약 27℃의 챔버에서 배양하였다. 이어서 약 -1 내지 -3일에, 세포를 최종 농도 1.0 mM(CuSO4의 200 mM 스톡의 1:200 희석; 15 ㎖의 세포 현탁액을 포함하는 각각의 T75 플라스크에 대하여 75 ㎕의 CuSO4)로 황산구리(CuSO4)의 첨가로 유도하고 27℃ 챔버에 다시 두었다. 배양 시간을 약 24 내지 72 시간 동안 지속하였다.
0일에, 유도된 세포 배양액을 포함하는 플라스크를 오염의 증거에 대하여 시각적 및 현미경으로 체크하였다. 오염되지 않은 플라스크를 풀화하고 살아있는 세포를 세었다. 약 6 x 106 세포의 풀화된 세포 배양액의 샘플을 외인성 분자의 발현 수준을 결정하기 위하여 FACS(fluorescence assisted cell sorter)를 사용하는 유 세포 분석으로 평가하였다. 이어서 세포 배양액(약 1 x 1O7 세포/mL)을 펩티드 적재에 앞서 외인성 HLA-A2.1, B7.1 및 ICAM-1(클론 A 세포에 대하여) 또는 HLA-A2.1, B7.1, B7.2, ICAM-1 및 LFA-3(클론 B 세포에 대하여) 발현을 확인하기 위하여 테스트하였다. 외인성 분자의 발현이 확인되면, 각각의 세포 배양액을 두개의 살균 50 ㎖ 코니칼 튜브로 분할하여 세정한다. 이어서 각 튜브를 HYQ SFX-Insect 배지(Hyclone)로 채우고 약 7분 동안 1,700 rpm(600 x g)에서 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. 상청액을 버리고 세포 펠렛을 포함하는 튜브를 다시 약 1분 동안 1,700 rpm(600 x g)에서 원심분리하였다. 상청액을 미세한 팁 피펫으로 제거하였다. 이어서 각각의 분할된 세포 배양액의 펠렛을 재결합하고 8 mL의 SFX Insect 배지에 재현탁하여 약 1 x 107 세포/mL의 세포 밀도가 되도록 하였다. 각각의 펩티드에 대하여 1.0 mg/mL의 약 40 ㎕의 β2 마이크로글로불린 스톡 용액 및 1.67 mg/mL의 24 ㎕의 스톡 펩티드 콤보 용액의 1:50 희석액을 재현탁된 각 배양액에 첨가하였다. 따라서, 각 세포 배양 현탁액은 약 5 μg/mL의 최종 농도로 β2 마이크로글로불린을 포함하고 선택된 각각의 펩티드는 펩티드 당 약 0.1 μg/mL의 최종 농도로 xAPC로 적재된다. 세포 배양액을 적어도 4 시간 내지 8 시간 이하 동안 상온에서 매 30분 마다 와동시키면서 β2 마이크로글로불린 및 펩티드를 포함하는 현탁액에서 배양하였다. 펩티드 배양 기간 후, 각 세포 배양액의 약 1 mL 분취물을 8개의 폴리프로필렌 튜브(Falcon 2006)로 개별적으로 분배하였다. 임의의 잔여 세포 배양 현탁액은 버렸다.
항-CD8 항체에 의한 양성 선택으로 림프구성분채집(leukapheresis) 샘플로부터 분리된 CD8+ 세포를, 초파리 세포를 발현하는 인간 클래스 I 및 공동자극/부착 분자 HLA-A2.1, B7.1, CD70, LFA-3 및 ICAM-1에 의해 제시되는 인간 흑색종-관련 펩티드(티로시나아제-689369-377, 티로시나아제-792369-377, MART-1-81927-35, gp100-817209-217, gp100-818280-288 및 gp100-853154-162)에 대하여 자극시켰다. CD8+ 세포를 IL-2 및 IL-7 존재 하에 자가 조직의 단핵백혈구(상술한 에피토프로 펄스됨)로 두개의 라운드에 대하여 재자극시켰다. 이어서 작동체 세포의 수가 감마-방사 자가 조직의 영양 세포(feeder cell) 및 IL-2의 존재 하에 항-CD3 단일클론 항체에 의한 비특이적 자극으로 증가되었다. 세포독성 T 림프구 활성을 펩티드가 적재된 T2 세포 및 흑색종 세포의 패널에 대하여 측정하고, 시험관 내에서 자극된 CD8+ T 세포의 순도는 유세포 분석으로 측정하였다.
재료.
| 세포주 | 공급원 |
| 초파리 S2 | ATCC |
| Malme 3 | ATCC (흑색종 환자의 정상 피부 섬유아세포) |
| Malme 3M | ATCC (Malme 3으로서 동일한 환자 폐의 전이성 흑색종) |
| M14 | UCSD; 미국 5,208,146호 및 Cahan et al., PNAS U.S.A. 1982, vol. 79(24), pp. 7629-7633 (HLA-A2.1 인간 흑색종) 참조 |
| 01-KN | J&JPRD; 미국 2004-0071671호(흑색종 세포주 HLA-A2.1, 흑색종 항원 음성) 참조 |
| K562 | ATCC(인간 적백혈병 세포주; NK 세포에 대한 표적) |
| T2 세포 | ATCC(인간 B 및 T 림프아구 하이브리드, 클래스 II 음성) |
시약
rhIL -7. 재조합 인간 인터루킨-7(IL-7)은 E. coli에서 생산된 림포카인이고 항체가 아닌 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하는 기기에 의해 정제된다. 분말로서 제공받은 IL-7을 1% 인간 혈청 알부민을 포함하는 살균된 DPBS 중에 희석시켰다. 이어서 벌크 용액을 0.2-μm 필터를 통하여 여과하고, 살균된 바이얼로 분취(30,000 U/mL, 1OOO X 농도)하고, 사용에 앞서 -80℃에 저장하였다.
rhIL -2. 재조합 인간 인터루킨-2(IL-2)를 재조합 DNA 기술로 생산하고 Chiron Corporation (Proleukin®)으로 적용하였다. 분말로서 제공받은 IL-2를 IL-2 희석액(50 mM 아세트산 중의 0.5% 인간 혈청 알부민)에 희석시키고, 0.2-μm 필터를 통하여 여과하고, 살균된 바이얼로 분취(20,000 U/mL, 1OOO X 농도)한 다음, 사용에 앞서 -80℃에 저장하였다.
티로시나아제 펩티드 YMNGTMSQV. 인간 티로시나아제의 아미노산 369-377에 상응하는 티로시나아제 펩티드(tyr 369-377)를 제조하고 GLP 순응 기준(Synpep Corporation)을 사용하여 정제하였다. 제조자(Synpep Corporation)로부터 제공받은 펩티드 분말을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해하여 10 mg/mL 농도의 스톡 펩티드 용액을 제조하고, 사용에 앞서 -72℃ 내지 -88℃에 저장하였다. 이 스톡 펩티드 용액을 다른 펩티드 스톡 용액(또한 10 mg/mL 농도)과 동일한 부분으로 혼합하여 xAPC 적재용 배합 펩티드 용액을 생산하였다. 배합 펩티드 용액을 클래스 10,000 무균실에서 무균의 조건 하의 클래스 II 생물안전 작업대에서 살균한 바이얼로 분취하였다.
티로시나아제 펩티드 YMDGTMSQV. 펩티드의 위치 3에서 아스파라긴 잔기 대신에 아스파르트산 잔기를 포함하는 상술한 tyr 369-377 펩티드의 탈아미드화 형태를 제조하고 GLP 순응 기준(Synpep Corporation)을 사용하여 정제하였다. 이 탈아미드화 형태를 tyr 369-377d라고 칭하였다. 제조자로부터 제공받은 펩티드 분말을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해하여 10 mg/mL 농도의 스톡 펩티드 용액을 제조하고, 사용에 앞서 -72℃ 내지 -88℃에 저장하였다.
gp100 펩티드 ITDQVPFSV. 인간 gp-100의 아미노산 209-217에 상응하는 gp100 펩티드(gp100209 -217)를 제조하고 GLP 순응 기준(Synpep Corporation)을 사용하여 정제하였다. 펩티드 분말을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해하여 10 mg/mL 농도의 스톡 펩티드 용액을 제조하고, 사용에 앞서 -72℃ 내지 -88℃에 저장하였다.
gp100 펩티드 KTWGQYWQV. 인간 gp100의 아미노산 154-162에 상응하는 gp100 펩티드(gp 100154-162)를 제조하고 GLP 순응 기준(Synpep Corporation)을 사용하여 정제하였다. Synpep Corporation으로부터 제공받은 펩티드 분말을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해하여 10 mg/mL 농도의 스톡 펩티드 용액을 제조하고, 사용에 앞서 -72℃ 내지 -88℃에 저장하였다.
gp100 펩티드 YLEPGVTA. 인간 gp100의 아미노산 280-288에 상응하는 gp100 펩티드(gp100280 -288)를 제조하고 Synpep Corporation에 의한 GLP 순응 기준을 사용하 여 정제하였다. 펩티드 분말을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해하여 10 mg/mL 농도의 스톡 펩티드 용액을 제조하고, 사용에 앞서 -72℃ 내지 -88℃에 저장하였다.
MART-1 펩티드 AAGIGILTV. 인간 MART-1의 아미노산 27-35에 상응하는 A MART-1 펩티드(MART-127-35)를 제조하고 GLP 순응(Synpep Corporation)을 사용하여 정제하였다. 펩티드 분말을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해하여 10 mg/mL 농도의 스톡 펩티드 용액을 제조하고, 사용에 앞서 -72℃ 내지 -88℃에 저장하였다.
DYNABEADS ® M-450. DYNABEADS® M-450(SAM) IgG는 주로 마우스 IgG와 결합하는 다중클론 양 항-마우스 IgG로 코팅된 살균한 자석 비드이다. Baxter Oncology Inc.,로부터 이용가능한 DYNABEADS를 Isolex 300i Magnetic cell Selector를 사용하는 T 세포 분리에 사용하기에 앞서 4℃에 저장하였다.
인간 혈청 알부민. 25 % HSA, USP(Baxter Fenwal Laboratories; HIV-1, HIV-2, HCV 및 HBV에 대하여 음성으로 테스트된 각 롯트에 대한 혈장 공급원)를 이어서 T 세포 제조 및 하기 단계를 활성화시키는 동안 단백질 버퍼의 공급원으로서 사용하기에 앞서 상온에서 저장하였다: CD8+ T 세포 및 CD8- T 세포의 정제; 부착 세포의 펩티드-적재; 및 활성화된 T 세포의 최종 제제.
항- CD8 항체. 항-CD8 단일클론 항체(37B1A)는 T 세포의 CD8 항원에 대하여 직접적인 뮤린 단일클론 항체이고, 이는 Isolex 300i Magnetic cell Selector 시스템으로 CD8+ T 세포를 선택하는데 사용된다. 농축 용액을 CD8+ T 세포 분리 또는 활성 프로세스에 사용을 위한 살균 DPBS 중에 희석하였다. 벌크 용액을 0.2-μm 필터를 통하여 여과시킨 다음 클래스 10,000 무균실에서 무균의 조건 하의 클래스 II 생물안전 작업대에서 1회 사용 바이얼로 분취하였다. 분취물(10.0 mg/mL)을 사용하기에 앞서 -80℃에 저장하였다.
CD8 알파 쇄 펩티드- AAEGLDTQRFSG. CD8 알파 경쇄 펩티드(AAEGLDTQRFSG)를 GLP 순응 기준 하에 정제하고 제조하였다. CD8 알파 쇄 펩티드를 CD8(37B1A) 항체 및 Isolex 30Oi Magnetic cell Selector를 사용하여 캡쳐된 CD8+ T 세포를 방출하기 위하여 CD8+ T 세포 분리 프로세스에 사용하였다. 각각의 많은 펩티드를 Synpep Corporation에 의해 약제학적 등급 기준을 만족하도록 제조하고, 펩티드 서열, 순도, 분자량 및 외양에 대하여 테스트하였다. 분말로서 제공받은 CD8 알파 쇄 펩티드를 더욱 프로세스하여 10 mg/㎖의 스톡 용액을 제조하였다. 이 스톡 용액을 DPBS 중에 희석하고, 0.2-μm 필터를 통하여 여과시키고, 살균한 바이얼에 분취하고, 사용에 앞서 -72℃ 내지 -88℃에 저장하였다. 펩티드 시약의 바이얼링을 클래스 10,000 무균실에서 무균의 조건 하의 클래스 II 생물안전 작업대에서 수행하였다.
인간 β2M 마이크로글로불린. 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 인간 베타-2 마이크로글로불린(β2M)의 농축물을 살균한 DPBS 중에 희석하여 1.0 mg/mL의 농도가 되도록 하였다. 이어서 벌크 용액을 0.2-μm 필터를 통하여 여과시키고, 살균한 바이얼에 분취하고, 부착 세포의 펩티드 적재 및 xAPC의 펩티드-적재 및 제조 동안의 사용에 앞서 -80℃에 저장하였다.
구연산나트륨 용액. 살균한 비발열성 항응고물질 구연산나트륨 용액, USP (Baxter Fenwal)를 CD8+ T 세포 및 CD8- T 세포의 선택을 위하여 Isolex 30Oi Magnetic cell Selector를 작동시기기 위한 버퍼 첨가제로서 사용하기에 앞서 상온(RT)에 저장하였다.
Schneider's 배지. Schneider's 초파리 배지는 초파리 세포를 배양하는데 사용하는 배양 배지이다. 공급자(Invitrogen Corporation)는 각각의 많은 배지를 초파리 세포의 성장을 유지하기 위한 능력, 삼투질농도, pH 및 살균성에 대하여 테스트하였다. Schneider's 초파리 배지(1 X 농도)를 사용에 앞서 2℃ 내지 6℃에 저장하였다.
우태아혈청. 숙주 세포 또는 xAPC 세포의 성장을 위한 단백질 공급원으로서 사용되는 우태아혈청 (FBS)을 -80℃에 저장하였다. Gemini Bioproducts로부터 이용가능한 FBS는 미국이 원산지인 동물의 우 태아 혈액으로부터 프로세스하였다. 혈액을 제공한 모체 동물은 감염 및 전염병 및 해로운 기생충이 없었다.
HYQ SFX Insect 배지. Hyclone's SFX Insect 배지(Hyclone Corporation)는 xAPC의 펩티드 적재 동안에 사용되는 혈청이 없는 배양 배지(1 X 농도)이고, 사용에 앞서 2℃ 내지 6℃에 저장하였다. 이 배지는 소 기원의 산물을 포함하지 않는다.
황산구리. 황산구리(II) 오수화물(Aldrich)을 인간 HLA, 공동 자극 및 부착 분자를 발현시키기 위하여, 변형된 숙주 세포의 유도를 위해 사용하였다. 스톡 용액을 내독소가 없는 증류수 중에 결정질 CuSO4를 용해하여 제제화시켜 200 mM의 농도로 제조하고 용액을 클래스 II 생물안전 작업대에서 살균 컨테이너로 0.2-μm 필터를 통하여 무균 필터하였다. 필터된 스톡 용액을 사용에 앞서 2℃ 내지 6℃에 저장하였다.
RPMI . 혈청 및 항생제가 없는(1 X 농도) RPMI 배양 배지(Invitrogen Corporation 또는 Gibco에서 입수가능한)를 T 세포를 성장시키는데 사용하였다. RPMI 배양 배지를 사용에 앞서 2℃ 내지 6℃에 저장하였다.
Dulbecco's 인산완충식염수 ( DPBS ). 살균된 비발열성 Dulbecco's 인산완충식염수(DPBS) 용액(Invitrogen Corporation 또는 Gibco에서 입수가능함, 1 X 농도) 을 사용에 앞서 상온에 저장하였다. DPBS는 하기 절차를 위하여 사용하였다: CD8+ T 세포 및 CD8- T 세포를 선택하는 동안 Isolex 300i Magnetic Cell Selector 기구를 작동시키는 단계; 재자극 단계에서 비부착 세포를 세정하고 비특이 증식 동안에 유리 OKT3 단일클론 항체를 세정하는 단계; 인간 β2 마이크로글로불린, IL-7, CD8 펩티드 및 OKT3를 희석하는 단계.
Leibovitz's 배지. Sigma-Aldrich로부터 입수가능한 Leibovitz's L-15 배지(L-글루타민 무함유; 1 X 농도)를 T 세포 활성 프로세스의 펩티드-적재 동안 사용하기에 앞서 2℃ 내지 6℃에 저장하였다.
OKI ® 3 항체. 임상용으로 제공되는 살균 용액으로서 앰플로 제공되는 T 세포의 CD3 항원에 대하여 뮤린 단일클론 항체 특이성인 오르토클론 OKT®3(1.0 mg/mL)(Ortho로부터 입수가능함)를 살균 조건 하에 1회 사용 바이얼에 분취하고 T 세포의 활성에 사용하기에 앞서 -80℃에 냉동 저장하였다.
제네티신 ( G418 ). 제네티신(Invitrogen Corporation)은 이종 핵산에 의해 코딩되는 외인성 분자의 발현을 유지하기 위하여 초파리 세포의 배양에 사용되는 선택적 항생제이다. 제네티신을 살균 스톡 용액(50 mg/mL)으로서 제공하고 사용에 앞서 2℃ 내지 6℃에 저장하였다.
염화칼슘. 염화칼슘 수화물을 CD8+ T 세포 분리 또는 활성 프로세스에 사용되는 자가 조직의 혈청을 생산하기 위한 림프구성분채집 산물로부터 수득된 자가 조직의 혈장의 응고를 위하여 사용하였다. 염화칼슘 수화물을 결정질 분말로서 제공받고, 스톡 용액(1 M)으로 혼합하고, 사용에 앞서 2℃ 내지 6℃에 저장하였다. 스톡 용액을 내독소가 없는 증류수 중에 염화칼슘을 용해하여 제제화하고 클래스 II 생물안전 작업대에서 살균 컨테이너로 0.2-μm 필터를 통하여 무균 필터하였다.
아세트산. IL-2의 스톡 용액의 제조에 사용되는 아세트산(17.4 M)을 Sigma Corporation으로부터 입수하고 사용에 앞서 상온에 저장하였다.
FICOLL - PAQUE ® 플러스. Isolex 300i cell Selector 시스템으로 CD8+ T 세포 및 CD8- T 세포의 하기 분리, 비-CD8+ 분획으로부터의 단핵 세포를 또한 FICOLL- PAQUE® 플러스 (1 X 농도), 죽은 세포, 호중성 백혈구 및 적혈구를 제거하기 위하여 사용되는 Amersham Pharmacia Biotech으로부터 입수가능한 임의의 동물 성분이 없는 피콜 기울기 시약을 사용하여 분획하였다.
PENTASPAN ® . PENTASPAN(B. Braun Medical Inc)은 임상의 사용을 위하여 0.9% 염화나트륨 중 10% 펜타스타치의 살균 용액(NDC 0264-1972-10)이고, 사용에 앞서 상온에 저장하였다. 이는 분리된 CD8- T 세포 및 CD8 T+ 세포의 냉동 보존에서 항냉동제로서 사용(1 X 농도)된다.
디메틸 술폭시드 ( DMSO ). Sigma-Aldrich로부터 입수가능한 DMSO는 분리된 CD8- T 세포 및 CD8 T+ 세포의 냉동 보존에서 항냉동제로서 사용(1 X 농도)하고, 사용에 앞서 상온에 저장하였다.
L-글루타민. Invitrogen Corporation으로부터 입수가능한 L-글루타민(USP), 20O mM(100 X 농도)을 RPMI 배양 배지 보충물로서 사용하고, 사용에 앞서 -8O℃에 저장하였다.
MEM 피루브산나트륨 용액. Invitrogen Corporation으로부터 입수가능한 MEM 피루브산나트륨 용액(10O mM, 100 X 농도)을 RPMI 배지에 보충물로 사용하고, 사용에 앞서 2 내지 6℃에 저장하였다.
비필수 아미노산. Invitrogen Corporation으로부터 입수가능한 비필수 아미노산(1O mM; 100 X 농도)을 RPMI 배지에 보충물로 사용하고, 사용에 앞서 2 내지 6 ℃에 저장하였다.
HEPES 용액. 1 M(200 X 농도) HEPES 버퍼 용액(Invitrogen Corporation)을 RPMI 배지에 보충물로 사용하고, 사용에 앞서 2 내지 6℃에 저장하였다.
X- Vivo 10-세포 배지. BioWhittaker로부터 공급되는 X-vivo 10-세포 배양 배지를 사용에 앞서 2 내지 6℃에 저장하였다. 혈청-, 페놀 레드- 및 항생제-를 함유하지 않은 이 배지(1 X 농도)를 펩티드가 로딩된 xAPC에 대한 노출에 의해 활성화된 T 세포의 비특이적 증식기 동안 사용하였다.
염화나트륨 주입. 0.9% 염화나트륨 용액, Baxter Fenwal Laboratories로부터 입수가능한 USP를 T 세포를 배양하는 동안 세포 세정 과정에 사용하였다. 살균되고 비발열성이며, 동물 성분은 없는 이 용액을 사용에 앞서 상온에 저장하였다.
덱스트로스 + 염화나트륨 용액. 5% 덱스트로스 및 0.9% 염화나트륨의 주사가능한 용액, USP(Baxter Fenwal Laboratories)를 동물 성분이 없고, 살균성이며, 비발열성 용액으로서 수득하였다. 활성화된 T 세포를 위한 저장 버퍼로서 사용되는 이 용액을 사용에 앞서 상온에 저장하였다.
Lactated Ringer's 용액. 주입을 위하여(동물 성분 무함유) 수 중 젖산 나트륨, 살균된, 염화칼슘의 저-내독소 용액, 염화칼륨 및 염화나트륨의 0.9% Lactated Ringer's 용액, USP(Baxter Healthcare Laboratories)를 T 세포의 배양 및 현탁에 사용하기 전에 상온에 저장하였다.
증류수. 막-필터 및 내독소-스크리닝(Invitrogen Corporation)에 의해 수득되는 세포 배양급 증류수를 황산구리, 염화칼슘 및 인터루킨-2(IL-2)의 스톡 용액 제조를 위한 용매로서 사용하고 사용에 앞서 상온에 저장하였다.
기타 재료.
림프구성분채집 산물을 흑색종으로 진단된 인간 대상으로부터 수집하고 자가 조직의 발생, 환자-특이성 세포 산물을 위한 사용에 앞서 상온에 저장하였다.
자가 조직의 인간 혈청을 분리된 T 세포를 배양하기 위한 단백질 공급원으로서 사용하였다. 자가 조직의 인간 혈장을 피브린 응고를 달성하기 위하여 염화칼슘을 첨가한 다음 액상 혈청을 수집함으로써 림프구성분채집 산물로부터 제조하였다. 수집한 액상 혈청을 짧은 저장 기간 동안에는 4℃에 저장하고 긴 기간 동안에는 -80℃에 저장하였다.
이종 초파리 클론 B에서 유래되고, 지속적인 초파리 xAPC 배양을 생성하기 위한 종자로서 사용되는 초파리 xAPC주를 하기와 같은 절차에 의해 수득하였다.
절차
인간 CD8 + 세포의 분리.
항-CD8 단일클론 항체(항체 1)로 양성 선별한 다음 자석 비드(SAM 비드) 상에 코팅된 양 항-마우스 IgG(항체 2)를 사용하는 Dynabeads™ (Dynal) 분리 절차에 의한 Isolex 30Oi 기기(Baxter)를 사용하여 림프구성분채집 샘플로부터 CD8+ 세포를 분리하였다. 항-인간 CD8 마우스 단일클론 항체를 1% HSA(Baxter-Hyland) 및 0.2% 구연산나트륨으로 보충된 Dulbecco's PBS 중에 현탁되고, 세정된 세포에 첨가하였다. Dynal 자석 비드(Dynabeads™)를 PBMC의 수에 따라 1:1 내지 1:2의 비드 대 세포 비로 첨가하였다. 분리된 CD8+ 세포를 자력 선별로 제거하였다. 남아있는 비-CD8 분획을 회수하고 재자극 및 비-특이성 증식 단계 동안의 다음 사용을 위하여 저온보존하였다. CD8 세포-항체 1-항체 2-비드 복합체의 해리를 생산된 항체 1에 대한 펩티드, CD8 펩티드59 -70(AAEGLDTQRFSG)의 존재 하에 37℃에서 45분 동안 배양하여 달성하였다. 방출된 비드를 자력으로 제거하고 CD8+ 세포의 수를 세고 순도를 측정하기 위하여 유세포 분석을 수행하였다. CD8+ 세포의 회복은 전형적으로 80% 이상이었다. 열로 비활성화된 혈청을 초기의 세포 세정 단계에서 자가 조직의 혈장을 수집함으로써 제조하였다. 피브린을 CaCl2를 사용하여 응고시키고 피브린 응괴를 제거하였다. 혈청은 열로 비활성화되고, 여과되어, 분취되고 -80℃에서 냉동된다. 비-CD8+ 세포는 양성 선별 절차로부터 유지되고 피콜 기울기를 사용하여 정제되었다. 이들 세포를 DMSO, 펜타스판 및 열로 비활성화된 자가 조직의 혈청 중에 저온보존하고 액체 질소(LN2)에 저장하였다. 이들 세포를 재자극 시기에 부착 세포의 공급원으로서 사용하고 항원 제시 세포로서 사용하기 전에 펩티드로 펄스시켰다.
정제된 인간
CD8
+
T 세포의 시험관 내 면역
제 1의 자극. 형질전환된 초파리 S2 세포를 27℃에서 10% 우태아혈청 및 황산구리가 보충된 Schneider's 배지(106 세포/mL)에서 24 내지 72 시간 동안 배양하 였다. S2 세포(클론 1120-3-9)를 배양하고, 세정하고 인간 gp100154 -162, gp100209 -217, gp100280-288, MART-127-35, 티로시나아제-N369 -377 및 티로시나아제-D369 -377 펩티드를 포함하는 HYQ SFX-Insect 배지(Hyclone)에 재현탁시키고 5 μg/mL 인간 β2 마이크로글로불린 재조합형 단백질을 E. coli로부터 정제하였다. 4 시간 동안 상온(23-25℃)에서 배양한 다음, S2 세포를 5-10% 자가 조직의 혈청으로 보충된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute)배지(Gibco) 중에 1:10(초파리 세포:T 세포)의 비율로 CD8+ 세포와 혼합하였다. 세포 혼합물을 초파리 세포가 죽을 때까지(48 시간 까지) 37℃에서 배양하였다. 4일에, IL-2(20 U/mL) 및 IL-7(30 U/mL)을 선택적으로 증식시킨 흑색종-특이성 CTL 집단에 첨가하였다.
재자극. 자가 조직의, CD8가 격감된 PBMC를 림프구성분채집 시기에 수득하고 다음의 사용을 위하여 냉동하고, 해동, 세정하고, 10% 자가 조직의 혈청, 5 μg/mL 재조합 인간 β2 마이크로글로불린 및 5 μg/mL의 gp100154 -162, gp100209 -217, gp100280 -288, MART-127-35, 티로시나아제-N369 -377 및 티로시나아제-D369 -377 펩티드를 포함하는 RPMI 배지에 재현탁하였다. γ-방사(5,000 라드) 후, 세포를 37℃에서 재자극용 플라스크에서 2 시간 동안 배양하였다. 비부착 세포를 Dulbecco's PBS로 세정하여 제거하였다. 부착 단핵백혈구를 펩티드 에피토프로 적재하고 1% HSA 및 각각의 펩티드 5 μg/mL 중 5 μg/mL의 인간 β2 마이크로글로불린을 포함하는 Leibovitz 배지에 90분 동안 배양하였다. 상청액을 제거하고 초파리로 활성화된 CD8+ 세포 현탁액(10% 자가 조직의 혈청을 함유한 RPMI 배지 중 2.5 x 106 세포/mL)을 약 10 CD8+ 세포 대 하나의 부착 단핵백혈구의 비로 첨가하였다. 37℃에서 배양 3 내지 4일 후, IL-2(20 U/mL) 및 IL-7(30 U/mL)을 선택적으로 증식된 흑색종-특이성 CTL 집단에 배지 교환과 함께 첨가하였다.
비-특이성 증식. 두개의 재자극 라운드를 겪은 CD8+ 작동체 세포를 OKT3 항체로 자극시킨 후, 영양 세포(방사된 자가 조직의 비-CD8+ 선별 세포)와 함께 세포 배양 백에서 증식시켰다. 냉동된 비-CD8+ 선별 세포를 해동하고, 세정한 다음, 감마-방사(3,500 라드)하였다. 4:1(영양 세포:작동체)의 비를 OKT3 항체로 코팅된 T-225 플라스크에 두었다. OKT3 자극을 20 U/mL의 IL-2가 보충된 10% 자가 조직의 혈청을 포함하는 완전 RPMI 배지에서 수행하였다. 2일 후, 자극된 T 세포를 새로운 배지(X-vivo 10 배지)로 희석하고 증식을 위하여 세포 배양백에 옮겼다. 새로운 배지 및 IL-2를 빠르게 증식하는 T 세포를 배양하기 위하여 약 2 내지 3일 마다 보충하였다.
CTL
의 제조 및 방출
세포 수확 및 최종 산물 제제. 최종 세포 산물의 수확을 원심분리로 수행하여 배양 배지를 제거하고 세포를 농축하였다. 원심분리 후, 세포를 1% 인간 혈청 알부민(HSA)을 포함하는 식염수에 세정하고, 70-μm 필터를 통하여 여과한 다음, 융합 배지에 희석하였다. 융합을 위한 세포 산물은 30O mL Lactated Ringer's 주 입, USP(76% v/v), 0.9% 염화나트륨(4% v/v) 중 5% 덱스트로스 및 25% HSA(20% v/v) 중 자가 조직의 CTL을 포함한다. 최종 산물 세포를 온도 기록계가 장착된 냉각된 단열 컨테이너에서 1000 mL 이동 백에 팩킹하였다.
산물 테스트. CTL 산물 방출 전에 수행한 테스트를 하기에 열거하였다. 개별의 펩티드에 대한 직접적인 특정 활성을 자극에 사용되는 각각의 펩티드로 적재된 크롬-표지 T2 세포에 대한 작동체 세포의 세포독성 활성을 측정하여 평가하였다. 세포독성 활성을 또한 대조로서 티로시나아제, gp 100 및 MART-1에 대한 흑색종 세포주(01-KN) 음성 또는 정상 섬유아세포(Malme 3)를 사용하여, 크롬-표지 흑색종 표적(Malme 3M, M14)에 대하여 측정하였다.
표현형: 세포 수확의 일부를 적재하기 전에 CD8 산물의 표현형을 테스트하였다. 최종 산물 명세서는 CD3, CD8 및 TCR 발현이다. 기억, 활성 등과 일치하는 마커에 대한 추가의 표현형 평가를 측정하고 기록하였다.
확인: 샘플의 HLA-A2, HLA-C 및 HLA-DR의 상태를 수확된 세포 산물로부터 선택된, 초기의 림프구성분채집 시기에 제조된 PBMC 샘플 및 배양의 끝에 수집된 CD8+ T 세포로부터 분리된 DNA 정제의 분석에 의해 결정하였다. DNA 샘플의 PCR 분석을 Genovision으로부터 제공받은 HLA-특이성 프라이머 올리고로 수행하였다. 최종 산물 명세는 0일 샘플로 확인하였다.
세포 수: 주입을 위하여 원하는 세포 양은 1010 CD8+ T 세포이다. 최종 산물 주입 한계는 1010 세포이다. 생성된 세포의 총 수는 환자에 달려 있다. 세포 양은 앞선 연구(여기에서 세포는 동일한 생체 외 프로토콜 하에 생산됨)에서 평균 9 X 109이었다. 최종 세포 수는 살아있는 세포 수로 결정하였다.
생존능력: 최종 세포 양의 생존능력은 >70%이다. 살아있는 세포 수는 트리판 블루 염색을 제외한 세포를 현미경으로 셈하여 확립하였다.
마이코플라즈마 테스트: 마이코플라즈마에 대한 세포의 테스트는 세포를 환자에게 투여하기 전에 수행하여 음성 마이코플라즈마 검출을 확인하였다. ELISA 분석도 포함하는 Roche PCR 키트를 사용하였다. 또한, T 세포 배양의 샘플을 처음의 사이토카인 공급(6일)에서 회수하고 28-일 배양 절차를 만족시키기 위하여 BioReliance로 보냈다. 배양의 결과물을 T 세포 주입 후에 받았다.
내독소 테스트: 최종 세포 산물 상 내독소 테스트를 Limulus Amebocyte Lysate 분석(BioWhittaker, Walkersville, MD)을 사용하여 수행하였다. 내독소 수준 한계는 환자로 융합되는 것이 5 EU/kg 미만이다. 최종 세포 산물 사항은 <1 EU/mL이다.
프로세스에서 산물 살균성 테스트: 프로세스에서 살균성을 위한 테스트를 BacT/ Alert 시스템을 사용하여 수행하였다. 샘플을 배지 교환을 하는 동안에 선택하였다. 최종 농도로부터의 샘플을 또한 BacT/Alert 시스템으로 테스트하였고, 최종 산물 사항에는 증식이 없었다.
초파리 DNA 및 곤충 바이러스 RNA 검출: DNA를 최종 CD8+ T 세포 산물로부터 분리하고, 초파리 DNA PCR 분석을 위한 주형(재조합형 초파리 APC를 제조하기 위하 여 사용되는 곤충 벡터를 위한 특이성 프라이머를 사용)으로서 사용하였다. 이 샘플을 음성 대조로서 작용하는 나이브 CD8+ 샘플 및 양성 대조로서 사용되는 초파리 세포 DNA와 비교하였다. 또한 총 RNA를 동일한 CD8+ T 세포 샘플로부터 분리하고 공지된 3개의 상이한 곤충 바이러스의 RNA 바이러스의 cDNA의 20 카피/μg을 검출할 수 있는, 정량 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 두개의 분석에 대한 산물 사항은 곤충 게놈 및 바이러스의 핵산의 음성 검출이다.
용해 활성: 항-펩티드 활성을 측정하기 위하여 두개의 펩티드-적재 T2 세포 표적에서 크롬-방출 분석으로 최종 CD8+ T 세포 산물에 대한 용해 활성을 평가하고, 흑색종의 특이적 치사를 평가하기 위하여 자가 조직의 흑색종 세포 HLA-A2 표적 및 기증자와 매치된 종양 및 비종양주(Malme 3 및 Malme 3M)를 확립하였다. 산물 사항은 표적 세포의 특이성 치사이다.
또한, 하기 테스트의 모니터링을 용이하게 하기 위하여 상술한 방출 테스트를 부가로 수행할 수 있다.
테트라머 염색: 나이브 림프구성분채집-유래의 샘플에 대한 CD8+ T 세포를 생체 외에서 CTL을 생산하기 위하여 사용되는 펩티드 에피토프에 대하여 특이성을 갖는 T 세포를 계산하기 위하여 디자인된 테트라머 분자를 갖는 항원-특이성 T 세포 존재에 대하여 평가하였다. 이는 처리 후 항원-특이성 T 세포의 모니터링을 허락한다.
말초 혈액 샘플의 흑색종 종양 세포: 약물의 치료 전, 동안 및 후에 민감한, 정량 실시간 PCR 분석을 환자 혈액 샘플에서 흑색종 세포를 계산하기 위하여 모니 터링하였다. 모든 III/IV기 흑색종 환자의 종양 세포를 계산한 것은 아니지만, 이들 세포의 검출은 요법의 반응에 대한 대리 표지자로서 사용될 수 있다.
상술한 바와 같이 제조된 CTL 산물은 하기 실시예에 기재되는 바람직한 구체예로 설명되는 바와 같이 본 발명의 배합 요법 치료 요법에 사용될 수 있다.
흑색종과 관련된 펩티드(MART-1,
gp100
및 티로시나아제)가 적재된 초파리 세포로 생체 외 자극되는 자가 조직의
CD8
+
림프구 및 2-
CdA
또는 DAB IL-2의 투여와 함께 및 투여 없이
IFNa
-2b 및 IL-2의 연속 투여를 사용하는 전이성 흑색종 환자의 치료
이들 예시는 클라드리빈 및 DAB IL2뿐만 아니라 사이토카인 IL-2 및 IFN-α- 2b로부터 선택된 림프구 고갈제와, 대조 치료와의 배합에서 흑색종과 관련된 항원으로부터 유래된 펩티드 에피토프에 대하여 특이성인 자가 조직의 세포독성 T 림프구(CTL)의 투여를 포함하는 치료를 설명한다. MART-1-, gp100- 및 티로시나아제 유래의 항원성 펩티드를 적재한 초파리 xAPC와 접촉에 의해 MART-1, gp100 및 티로시나아제를 발현하는 흑색종 세포를 특이적으로 표적으로 하도록 활성화된 자가 조직의 CTL을 포함하는 세포 요법제는 MART-1, gp100 및 티로시나아제를 발현하는 흑색종 세포를 표적으로 하는 환자의 면역을 증진하고 유지하도록 디자인된다. 면역조절제 IFN-α-2b 및 IL-2의 첨가는 CTL의 반응을 증가시키기 위하여 포함된다. 골수비파괴성이나 림프구를 고갈시키는 제제, 예비 요법(클라드리빈) 또는 특이성 T 세포 서브세트 고갈제 데닐루킨 디프티톡스(DAB IL-2)를 CTL의 착상을 증진시키 기 위하여 CTL 주입 전에 투여하였다. 치료는 종양 퇴화 및 흑색종-특이성 CTL의 유지를 통하여 임상적 이익을 일으키도록 디자인하였다.
더욱 구체적으로, HLA-A2 양성인 악성 흑색종으로 진행된 임상의 환자는 골수비파괴성이나 림프구를 고갈시키는 제제, 클라드리빈(0.12 mg/kg/일 x 5일) 또는 DAB IL-2(18 μg/kg의 1회 주사)로 구성된 예비 요법을 투여하였다. 또한, 인터페론-α-2b (IFN-α-2b; 10 MIU/m2)의 동시 요법을 CTL 주입 전에 피하 주사로 연속 5일 동안 매일 투여하였다. 결과적으로, 환자는 생체 외에서 생산되고, 초파리 xAPC로 자극되는, CTL 표현형을 나타내는, 자가 조직의 CD8+ T 세포의 1회 투여를 제공받았다. 세포 주입을 저농도(예: 3 MIU)의 IL-2를 28일 동안 매일 피하 투여한 다음 즉시, 종양 측정을 수행하였다. 매일 저농도(예: 3 MIU)의 IL-2의 피하 투여를 질병 진행의 증거가 없는 환자에서 계속하였다.
정제된 나이브 CD8+ T 세포를 인간 MHC 클래스 I 제한 조건에서 6개의 다른 흑색종과 관련된 T 세포 펩티드 에피토프를 나타내는 초파리 xAPC로 자극시키는 방법으로, 배양 약 34일 후, MART-1, gp100 및 티로시나아제에 대한 다중 특이성을 나타내는 CTL을 생산하였다.
연구를 위하여 환자를 제한하기 위한 스크리닝에서 혈액을 수집하고 예비의 림프구성분채집 절차를 0 또는 1일에 수행하였다. 세포 요법제를 제조에 요구되는 충분한 백혈구를 수득하기 위하여 환자에서 기준의 2.0-3.0 X 혈액 부피의 림프구성분채집을 수행하였다. 분석을 위한 말초 혈액 세포를 수득하기 위하여 지시된 시간에, 추가의 림프구성분채집 절차(초기의 CD8 샘플을 수득하기 위하여 사용되는 양의 3배 이상)를 수행하였다. 이들 샘플을 항원-특이성 T 세포의 존재 및 순환가능한 흑색종 종양 세포를 모니터하는데 사용하였다. 또한 혈장 및 혈액 세포를 치료-전 및 -후 샘플을 보관하기 위한 이종이식 요구를 만족시키기 위하여 수집하였다. 림프구성분채집 산물을 CD8+ T 세포가 분리, 자극되고 약 34일 동안 배양된 곳으로 이동하였다.
계측가능한 병변의 평가를 CTL 주입 4 및 8주 후에 수행하였다. 연구의 대상을 T-세포 주입 및 확립된 면역-증가 사이토카인 요법 전에, 전체 골수비파괴성 림프구-고갈제(클라드리빈)를 투여할지 선택적 T 세포 서브세트 고갈제(DAB IL-2)를 투여할지를 결정하였고, 이는 목적의 종양 퇴보를 동반하는 항원-특이성 T 세포 유지의 결과를 가져올 것이다.
세포독성 림프구의 제조
항-CD8 항체의 양성 선별에 의한 림프구성분채집 샘플로부터 분리된 CD8+ 세포를 인간 클래스 I 및 공동 자극 분자(HLA-A2.1, β2 마이크로글로불린, B7.1, CD7O, ICAM-1 및 LFA-3)를 발현하는 초파리 xAPC에 의해 나타내어지는 인간 흑색종과 관련된 항원성 펩티드[티로시나아제369 -377(원래의), 티로시나아제369 -377(수정된 D371), MART-127-35, gp100154 - l63, gp100209 -217 및 gp100280 -288]로 자극시켰다. 이러한 동일한 CD8+ 세포를 IL-2 및 IL-7 존재 하에 자가 조직의 두개의 라운드, 펩티드가 펄스된 단핵 세포로 재자극시켰다. 또한, 항-CD3 mAb(OKT3)를 갖는 비-특이성 증식 단계가 총 세포 수를 증가시키기 위하여 포함된다: 일반적으로 제 2의 재자극 단계의 끝에서 수득된 것보다 25배 더 많다. 세포독성 T 세포 활성을 펩티드가 적재된 T2 세포 및 A2+ 흑색종 세포의 패널에 대하여 측정하고, 시험관 내에서 자극된 CD8+ T 세포의 순도를 유세포 분석으로 평가하였다. 또한, 항원-특이성 자극 및 펩티드-특이성 테트라머 분석에 대한 반응에서, 인터페론-감마 산물을 작동체 기능 및 생성된 CTL의 특이성에 대하여 각각 확인하였다.
흑색종 암 환자로부터 분리된
나이브
CD8
+
T 세포로부터 생성된
CTL
의 효능
흑색종 환자에서 말초 혈액 샘플로부터 분리된 항원-특이성 CTL은 직접적인 TCR에 대한 특이성 펩티드/MHC 복합체에 대하여 저결합능에서 고결합능의 범위에 있는 이종 세포 집단의 부분이라는 것은 증명되어 있다. 그러나, 이들 CTL의 대부분은 저결합능이고, 고결합능인 CTL에서만 중요한 종양 세포 용해가 증명되었다.21 또한, 종양-침윤성 림프구(TIL)를, 흑색종 환자의 종양 덩어리로부터 분리하였다. 고농도의 IL-2의 존재 하에 이들 TIL의 생체 외 증식이 흑색종 환자에서의 목적의 반응에서 일어났다; 그러나, 이들 반응은 짧은 기간 동안이었고 TIL 기원의 고-반응성 클론 T 세포는 임의의 완전한 반응을 생성하는데 실패하였다.16
반면, 초파리-xAPC를 갖는 생체 외에서 생성된 CTL은 효능있는 고결합능의 펩티드-특이성 용해가 가능한 항원-특이성 T 세포(예를 들어, 도 1 참조)이고 강력 한 흑색종 종양 세포 치사능을 가진다. 종양 세포에 대한 강력한 세포독성 활성을 갖는 CTL의 재생가능한 세대는 몇몇의 기여 인자에 기인하는 것으로 고려된다. 첫째, 항체를 특이성 펩티드 존재 하에 방출하는 동안에, 펩티드- 특이성, 고밀도의 CD8를 갖는 세포에 대하여 선택된 항-CD8 단일클론 항체를 갖는 CD8+ 정제는 T 세포의 비특이성 자극을 막았다. 둘째, 고도로 정제된 CD8+ T 세포(표 I)를 MHC 분자 환경에서 특이성 T-세포 에피토프를 나타내는 xAPC로 자극시켰고, 여기에서 고밀도의 항원 표시는 효능 있는 주요 T-세포 면역 반응을 나타낸다. APC 상 다중 공동자극 분자의 포함은 T 세포 자극을 최대화한다. 셋째, 재자극 단계는 제 1의 자극에 사용되는 동일한 흑색종과 관련된 T 세포 에피토프로 적재되고 T 세포를 번식시키는데 부스트를 제공하는 자가 조직의 단핵 세포를 포함한다. 최종적으로, OKT3, 자가 조직의 영양 세포 및 저용량 IL-2를 갖는 단일 비-특이성 증식 단계는 제 2의 재자극 단계의 끝에서 기록된 항원-특이성 T 세포의 동일한 퍼센트를 유지하는 반면, ~25배의 총 세포 수를 증가시킨다.
표 I: 양성 선별 및
유세포
분석으로 분석된
CD8
+
세포의 정제(데이터는 총 28명의 환자의 요약을 나타낸다)
| 세포 타입 | PBMC | 선별 후 | ||
| (%) | (범위) | (%) | (범위) | |
| CD3+ T 세포 | 45 | (29-64) | 83 | (59-98) |
| CD4+ T 세포 | 27 | (16-46) | 2 | (0.5-4) |
| CD8+ T 세포 | 17 | (8-31) | 84 | (60-96) |
| CD14+ 단핵백혈구 | 27 | (11-43) | 5 | (0.5-17) |
| CD15+/CD16+호중성 백혈구 | 2 | (0.5-9) | 0.5 | (0.5-1) |
| CD16+/CD15- NK 세포 | 15 | (8-47) | 8 | (2-20) |
| CD19 B 세포 | 1 | (0.5-2) | 1 | (0.5-3) |
이러한 생체 외 xAPC CD8+ T 세포 자극 프로토콜은 효능 있는 종양 세포 용해, 펩티드/MHC 복합체에 대한 고결합능 및 펩티드-특이성 테트라머 분자의 계산에 의해 평가되는 항원-특이성을 갖는 CTL을 유도하고, 특이성 항원 자극 및 특이성 종양 용해에 대한 반응에서 인터페론-감마를 방출한다.
앞선 연구로부터 악성의 전이성 흑색종에서
CTL
요법의 평가
III기 또는 IV기 흑색종을 갖는 총 55명의 대상과 관련된, 두개의 I기 시도 및 하나의 II기 시도를 수행하였다. 연구 1, "초파리 항원 제시 세포, 인터루킨-2, 인터루킨-7, 부착 단핵백혈구 및 티로시나아제 펩티드로 연속적으로 생체 외 배양된 자가 조직의 세포독성 T 림프구(CD8+)"는 10명의 IV기 흑색종 환자에서의 공개 라벨 연구였다. 임상 종말점은 1) 시험관 내 면역 후 재주입된 자가 조직의 CTL의 안정성 및 내성; 2) 제한 희석 분석에 의한 체순환에서 주입된 CTL의 동역학의 결정; 3) 방사신티그램 촬영에 의해 111인듐-표지 CTL의 총 신체 분포; 4) 면역조직화 학 분석(CTL, TH, NK, B 세포)에 의한 생검 결절의 세포 성분 및 5) 계측가능한 병변의 퇴보 및 2개월에 걸친 반응의 지속22 이었다.
연구 2, "진행된 흑색종의 치료에 있어서 초파리 세포로 자극된 자가 조직의 CD8+ 림프구와 함께 피하의 인터페론-알파의 준비 조사"에서, 총 15명의 III/IV기 흑색종 환자에게 IFNα-2b의 지속 요법은 공표하지 않고 유지하면서 자가 조직의 CD8+ T 세포를 주입하였다. CTL 요법은 1) 재주입된 CTL의 안정성 및 내성의 모니터링; 2) 생검 결절의 세포 성분; 3) 계측가능한 병변의 퇴보 및 4) 3개월에 걸친 반응의 지속으로 평가하였다. 안정 병변을 가지거나 추후 평가(처음의 주입 4주 후)에서 임상적 반응을 나타내는 대상에 치료의 두번째 사이클을 제공하였다. 15명의 대상 중 8명이 CTL 요법의 두번째 사이클을 받았고 4명의 대상이 세번째의 사이클에 들어갔으며 1명의 대상이 T 세포 요법의 4 사이클로 처리되었다.23
연구 3, "진행된 흑색종의 치료에 있어서 초파리 세포로 자극된 자가 조직의 CD8 림프구의 주입과 함께 또는 없는 피하의 인터페론-α-2b(IFN) 및 인터루킨-2(IL-2)의 랜덤한 II기 시도"에서, 총 30명의 III/IV기 흑색종 환자에게 사이토카인 단독(IFNα 및 IL-2) 또는 사이토카인 + T 세포를 처리하였다. 이는 환자가 사이토카인-단독의 팔(팔 A) 또는 사이토카인 + T 세포 팔(팔 B)로 들어가는 랜덤한 연구였다. 팔 A로 들어가거나 진행하는 환자에게 사이토카인 + T-세포 팔(팔 C)를 교차할 기회를 제공하였다. 이 연구의 주요 종말점은 두개의 그룹(팔 A 대 팔 B) 사이에서 질병이 진행되기까지의 시간(TTP)을 비교하는 것이었다. 팔 B로 들어간 환자의 TTP 대 팔 A로 들어간 환자의 TTP에서 통계적 유의성을 달성하였다(도 11). 팔 A에서 팔 C로 교차된 환자에서, TTP의 통계적 유의성은 또한, T 세포를 제공받은 환자에서 검출되었다. 또한, 용량 및 요법된 스케줄 상에서 IFNα 및 IL-2의 안정성 및 내성을 모니터링하였다.24
인터페론-a-2b(
IFN
-a-2b)의 사용에 대한 이론적 해석
인터페론-알파(IFN-a)는 다양한 악성종양에서 면역조절 및 항증식성 효과의 광범위한 스펙트럼을 갖는다. IFN-α 작용의 하나의 메커니즘은 흑색종 세포 상에서 종양 항원 발현을 상향조절하는 것으로 여겨졌다. 이는 종양의 표면상에서 면역학적으로 중요한 분자의 발현을 증진시키는 능력을 갖는다. 이들은 MHC 항원, 보조 분자뿐만 아니라 종양-관련 항원을 포함한다.25-27 이들 면역조절 효과는 항체 및 림프구 모두를 포함하는, 면역 시스템의 활성을 개선시켜 생체 내 종양 세포를 인식하고 공격할 수 있다. 활성의 특이성 면역요법은 파종성 흑색종의 치료에서 중요한 임상적 반응을 나타낸다. 상기 토론한 면역 기능 연구의 결과는 흑색종 백신 치료가 항-흑색종 CTL의 빈도를 증가시킴을 증명하였다. 이들 두개의 면역요법의 양상은 시너지적으로 작용할 것으로 여겨진다. IFN-α(1O MU/m2; 피하주사)의 5일 코스는 연구 2에 포함되고, 조직의 IHC 염색의 결과는 시간과 용량이 특정한 시간 프레임에서 한 명의 환자로부터 수득된 일련의 생검 샘플에서 발현된 클래스 I 및 흑색종과 관련된 항원 모두의 상향조절에 충분함을 증명하였다. 임상 연구에서 동일한 5일 코스는 연구 3에 포함된다.
인터루킨-2의 사용에 대한 이론적 해석
인간 재조합형 인터루킨-2(IL-2)는 다양한 생물학적 활성을 보이는 것으로 나타난 재조합 DNA 기술로 생산된 림포카인이다. IL-2는 면역 시스템을 자극시키고 그의 생물학적 효과는 표적 세포의 표면 상에서 특정 수용체와 결합하는 데에서 발휘된다. 시험관 내에서, 이는 T 세포 증식 및 림프구 세포독성을 증진시키고, 림포카인으로 활성화된 세포 및 자연 살해 세포 둘 모두의 살해 활성을 유도하며, 인터페론-감마 생산을 유도하는 것으로 나타났다. 283명의 환자에게 고용량의 IL-2의 투여는 9개의 완전한 반응과 함께 7%의 경감율을 나타내었고, 환자는 9 내지 91개월 이상 질병이 없었다.28 고용량의 IL-2가 저용량의 연속 주입보다 더욱 효과적이긴 하지만, 고용량의 IL-2는 더욱 유독하다. 가장 일반적인 부작용은 감기와 같은 증상이었다. 가장 심각한 부작용은 저혈압, 모세혈관 유출 증후군 및 감소된 장기 관류이었다. 저용량 IL-2의 피하 투여(3 MIU/일 X 28일)를 양자 전달된 자가 조직의 T 세포의 수준을 증진시키고 유지하기 위하여, 연구 3의 부분에 사용하였다. 이는 IFN-α의 단기 코스 후에 첨가된 다음 즉시 생체 내 항원-특이성 T 세포를 유지하기 위한 노력으로 CTL을 주입하여 림프구 유사분열생식, 림프구 세포독성 및 인터페론-감마 생산을 증진시켰다.
림프구의 양자 전달 후 골수비파괴성
면역억제성
화학요법 요법
마우스 연구는, T 세포 투여 전 화학요법의 면역억제의 유도가 최대의 종양 퇴보를 중재하기 위한 림프구의 양자 전달을 가능하게 하는데 필수적임을 증명하였다2 9 ,30. 이들 연구를 기초로 하여, 임상 프로토콜을 림프구의 양자 전달 후 골수비파괴성 화학요법 요법의 적용으로 환자를 치료하기 위하여 시작하였다16 ,31. 골수비파괴성의 예비 요법을 동종 골수 이식을 받은 환자를 치료하기 위하여 사용하였고, 이들 요법은 양자 전달된 T 림프구의 효과를 증진시킬 수 있는 한시적인 면역억제를 유도하는데 이상적으로 적절하였다. HLA-매치된 동종이식편32을 제공받은 신세포암 환자에서 일반적으로 사용되는 시클로포스파미드 및 플루다라빈의 요법은 최근 전이성 흑색종 환자에서 사용되었다16 ,31. T 세포의 양자 전달에 앞서 림프구고갈제 요법의 결합에 대한 이론적인 해석은 조절 세포를 파괴, 항상성 T 세포 조절을 붕괴하거나("making space"), 전달된 T 세포의 착상을 잠재적으로 증진시킬 수 있는 다른 정상적인 관용 기작을 폐기하는 것을 가능하게 한다. 치료와 관련된 사망은 관찰되지 않았으므로, 항종양 림프구 + 고용량의 IL-2로 배합된 골수비파괴성 화학요법은 안전하다. 비골수제거를 플루다라빈(25 mg/m2) 및 시클로포스파미드 (60 mg/kg)로 유도한 다음 림프구 주입 및 고용량의 IL-2(720,000 IU/kg)로 유도하였다.
완전히 골수형성되지 않은 화학요법제 시클로포스파미드 및 플루다라빈의 배합은 골수억제, 호중성 백혈구, 림프구, 혈소판 및 적혈구에 영향을 미칠 수 있다 고 증명되었다. 화화요법 시작 10일 후 최저로 떨어지는 호중구 수준을 6/mm3에서 기록하고 필그라스팀(G-CSF)의 보조로 14일에 500/mm3 이상으로 기록되었다. 림프구 수준은 최저 6/mm3를 가졌고 동일한 기간 동안 200/mm3 이상으로 회복되었다. 환자는 화화요법 시작 2-3주 후 일반적으로 500/mm3 이상의 호중구 수 및 20,000/mm3 이상의 혈소판 수를 나타내었다. 골수 작용을 돕기 위하여 줄기 세포 주입을 요하는 환자는 없었으므로, 전반적으로 치료는 안전한 것으로 나타났다. 그러나, CD4 수는 지속적으로 낮았고(평균 CD4 수는 약 200일에 46/mm3 내지 320/mm3의 범위에서 156/mm3이었다), 이는 플루다라빈으로 유도되는 면역억제의 부작용으로 공지되어 있다. 기회 감염의 발생이 있었고(예: 한시적인 대상포진 발발), 이는 치료의 종료 후 해결되었다.
플루다라빈과 유사한 퓨린 유사체, 클라드리빈(2-CdA, 류스타틴®)은 유모세포 백혈병의 치료에 사용에 대하여 승인받았고 자가반응 T 림프구를 감소시키기 위한 노력으로 다발성 경화증(MS) 환자에서 평가받고 있다. MS 환자에서 T 세포 서브세트의 특이적 감소는 클라브리빈의 상이한 용량과 서로 관련 있다.33-35 이는 다른 림프세포독성 약물에 비하여 매우 적합한 독성 프로필을 갖고 있으나, 장기간의 림프구 감소를 유도한다. 림프구 수준은 클라드리빈을 처음으로 주입한 후 즉시 떨어지고, 5개월에 최저에 이르고 4개월의 코스 동안 투여할 경우 6개월에 회복을 시작한다3 3 ,34. 림프구 감소를 모든 환자에서 관찰하였고, 감염 합병증은 심각한 문제가 아니였다. 약물은 국소 자극성 발생 없이 약동학을 갖는 편리한 피하 경로로 제공될 수 있고 치료 결과는 전반적으로 경로 IV와 동등함을 나타내었다36 ,37.
최근 인간의 연구에서 백신 설정에서 면역억제성으로서 T 조절 세포(Treg)의 확인은 CD28, CTLA-4 및 GITR과 함께 CD4+/CD25+hi 표현형을 나타내는 Treg 서브세트의 고갈에 따르는 증진된 항종양 면역 반응을 나타내었다.38 이 T 세포 서브세트는 데닐루킨 디프티톡스(DAB389IL-2, ONTAK®)의 단독 투여에 따라 선택적으로 고갈(약 3주)될 수 있다. 단독 투여 4일 후, Treg 세포의 37-77% 고갈이 8명의 신세포암 환자에서 기록되었다. T 세포 고갈 후, RNA-DC 백신을 투여하고 백신 항원에 대한 면역 반응에서 10배의 증가가 DAB IL-2 및 백신 대 단독의 백신을 제공받은 환자에서 기록되었다. 따라서, 항원-특이성 CTL의 양자 전달 6일 전의 동일한 용량(18 ㎍/kg)이 본 발명에 따른 요법에서 사용하기에 바람직한 용량이다.
환자 선택
연구를 위한 대상은 HLA-A2 양성인 전이성 흑색종으로 진단받은 인간 환자이다. 단일클론 항체(BB7.2)를 FACS 분석에 의한 PBMC 샘플을 분석하는데 사용하고 다음의 분석은 HLA-A*0201 서브타입을 결정하기 위하여 Olerup SSP™ PCR 테스트(Geno Vision)를 사용하여 수행하였다.
치료 도식
도 2는 하기에 더욱 상세히 설명되는 치료 요법을 나타낸다. 환자를 각 코호트에 10명으로 대상을 3개의 코호트로 나누었다. 코호트 A 요법에서, 림프고갈제 요법에 대한 대조, CTL + 사이토카인을 투여하였다. 본 발명의 바람직한 구체예인 코호트 B 요법에서, 환자는 클라드리빈(0-4일) + CTL(36일) + 사이토카인을 제공받는다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예인 코호트 B 요법에서, 환자는 DAB IL-2(30일) + CTL(36일) + 사이토카인을 제공받는다. 실험적 요법은 하기에 더욱 상세히 설명한다.
흑색종과 관련된 항원에 대한
CTL
특이성
악성 흑색종에 대한 세포독성 T 림프구 요법은 흑색종과 관련된 항원성 에피토프를 함유하는 흑색종 세포를 파괴하기 위하여 시험관 내에서 활성화된 자가 조직의 CD8+ T 세포를 사용하였다. CTL을 임상적 자리에서 생산되고 사용하기 위하여 전달된 림프구성분채집 샘플로부터 제조하였고 여기에서 CTL은 GMP 가이드라인 하에서 생산되고 주입을 위하여 회복된다.
0일에, 전이성 흑색종 환자에서 림프구성분채집(환자의 체중 및 상태에 따라 약 10-15 리터 수행)을 하였다. 수득한 세포를 상온에서 프로세스를 위하여 하룻밤 동안 GMP 제조 시설에 두었다. 적절한 시간에, 분석을 위한 말초 혈액 림프구 를 수득하기 위하여 림프구성분채집을 수행하였다. 이들 샘플을 항원-특이성 T 세포 및 순환하는 흑색종 종양 세포의 존재를 모니터하기 위하여 사용하였다. 림프구성분채집 절차 모니터링은 임상 자리에서 약 5 리터의 말초 혈액(또는 연속적인 주입을 위한 CD8 세포를 수득하기 위하여 처음의 림프구성분채집에서 1/3 부피를 수집함)으로 수행하고 GMP 제조 시설에 두었다. PCR 분석을 요법에 따른 순환하는 흑색종 세포의 수준에서의 감소를 결정하는데 사용하였다. 순환하는 흑색종 세포의 검출은 민감한, 정량 실시간 PCR 분석으로 측정될 수 있다39 -41. 항원-특이성 T 세포의 존재는 펩티드-특이성/HLA-A2 테트라머로 평가된다.
주입을 위한 최종 CTL 제제는 76%(v/v) Lactated Ringer's 용액, 4%(v/v)의 D5NS 및 20%(v/v)의 25% 인간 혈청 알부민(HSA)이 포함된, 30O mL 중 1 x 1010 자가 조직의 CTL을 포함한다. 제조의 42 시간 내에, CTL 산물을 아이스 상에서 고정하고 30분에 걸쳐, 주입을 위한 적절한 살균 백에 주입하여 제조하였다.
주입 전에, CTL을 용해 활성(펩티드가 적재된 표적 세포 및 흑색종 종양 세포 용해), 생존능력 및 FACS 분석에 의한 순도에 대하여 모니터하였다. 초파리 세포 DNA 및 곤충 바이러스 RNA의 부재를 민감한 정량 실시간 PCR 분석으로 체크하였다. 살균성은 BacT/Alert® 분석, 마이코플라즈마 테스트 및 그램 염색 분석으로 결정하였다.
환자는, 세포독성 T 림프구가 CTL에 직접적인 생체 내에서 항원을 발현하는 세포를 표적으로 하는 것이 가능하도록 생체 외에서 자극되고 증식된, 약 1010 자가 조직의 T 세포의 CTL 주입을 제공받는다. 세포는 IFN-알파 처리의 완결 후 및 IL-2 요법 시작에 바로 앞서 주입된다.
사이토카인
인터루킨-2(IL-2)를 Chiron Corporation(Emeryville, CA)으로부터 입수하였다. 이는 살균된 22 백만 IU(~1.3 mg)의 IL-2, 백색 내지 회백색의 동결건조된 케이크 + 50 mg 만니톨 및 0.18 mg 도데실 황산 나트륨을 포함하는 1회 사용 바이얼로서 제공되었고, 약 0.17 mg의 1염기 및 0.89 mg의 인산 2나트륨으로 완충하여 pH 7.5(7.2 내지 7.8의 범위)가 되도록 하였다. 분말을 주입, USP를 위하여 1.2 mL의 증류수로 재구성 하였고 결과의 농도는 18 백만 IU/㎖ 또는 1.1 mg/mL이었다. 손상되지 않은 바이얼을 냉장고(2°- 8℃)에 저장하고 빛으로부터 보호하였다. 원상태로 된 IL-2을 추가로 2.4 mL의 D5% 물로 희석하였다. 2-8℃에서 냉장보관되었을 경우, 플라스틱 주사기로 당겨지면, 최종 농도(6 MU/mL)는 원상태로 된 14일 후에 유효하다. IL-2의 최종 희석액은 외래환자를 기초로 하여 3백만 유닛(3 MIU)의 용량으로 피하로 자가투여되고, CTL 주입 후 즉시 시작되며 질병이 진행될 때까지 매일 투여된다.
INTRON-A®를 Schering-Plough Corporation(Kenilworth, NJ)으로부터 입수하였다. 이 IFN-알파-2b 산물을 동결건조된 분말 또는 살균된 5 ㎖ 바이얼 중의 주사용으로서 공급하였다. 바이얼은 약 3 x 106 U 또는 18 x lO U6 IFN을 포함한다. 동결건조된 분말은 정균 시약을 포함하고 있지 않으므로 사용 직전에 재구성 하는 것이 바람직하다; 사용하지 않은 동결건조 분말은 냉장고 또는 냉동고(-4℃ 내지 -20℃)에 보관한다. 시약이 주사 용액으로서 제공될 경우, 이는 냉동고(2°-8℃ 또는 36°-46°F)에 보관한다. IFN-α의 최종 희석액은 외래환자를 기초로 하여 31-35일에 10 MU/m2로 피하 주사로서 자가투여된다.
DAB
389
IL
-2
DAB389IL-2(데닐루킨 디프티톡스, ONTAK®)은 E coli에서 발현되는 인터루킨 2를 위한 서열 다음의 디프테리아 독소 단편 A 및 B를 위한 아미노산 서열로 구성된 재조합 DNA-유래의 세포독성 단백질이다. 이는 표적 약물이고, 그들의 표면 상에서 CD25(IL-2R)를 발현하는 세포에 결합한다. 이는 악성 또는 정상의 T 조절 (Treg) 세포의 표면 상에서 고친화 IL-2 수용체와 상호작용하여 세포내 단백질 합성을 억제하고, 세포 자살을 빠르게 유도한다. DAB389IL-2를 정맥(IV) 투여용으로 살균, 냉동 용액으로서 바이얼로 단독으로 제공하였다. ONTAK의 각 2 mL 바이얼은 주입, USP를 위하여 물 중 폴리솔베이트20(<1%), 시트르산(2O nM) 및 EDTA (0.05 mM)의 살균 용액 중의 300 mcg의 재조합형 DAB-IL2를 포함한다. 용액의 pH는 6.9-7.2이다. 손상되지 않은 바이얼은 냉동 또는 -10℃에 보관하지만 재냉동은 하지 않는다. 물질을 24 시간 미만 동안 냉장고에서 또는 1-2 시간 동안 상온에서 해동하여 용량을 제조하기 전에 상온(25℃ 또는 77°F)으로 가져오고, NS로 희석하여 15 mcg/mL 이상의 농도가 되도록하였다. DAB389IL-2를 정맥 주사로, 바람직하게는 적어도 15분에 걸친 주입으로 투여하였다. 코호트 C로 할당된 환자는 CTL의 주사 6일 전 및 IFN-α 시작 전인 30일에 DAB IL-2의 단독 피하 주사를 제공받는다. 용량은 18 μg/kg이다.
클라드리빈
류스타틴®(2-클로로-2'데옥시-β-D-아데노신)은 합성 항종양제이다. 이는 아데노신 데아미나아제의 작용에 내성이 있는 퓨린 뉴클레오시드 유사체이고, 선택적 림프구독성을 나타낸다. 데옥시사이티딘 키나아제 대 데옥시뉴클레오티다아제(예: 림프구 및 단핵백혈구)의 높은 비율을 갖는 세포에서, 클라드리빈은 활성 3인산염 데옥시뉴클레오티드, 2-CdATP로 인산화되고, 축적되며, 세포 대사의 파괴, DNA 손상 및 다음의 세포 사멸을 일으킨다. 약물은 선명하고, 무색이며, 살균성이고, 방부제가 없으며, 1O mg(1 mg/mL)의 클라드리빈을 포함하는 1회 사용 바이얼로 제공되는 등장성 용액이다. 클라드리빈의 각 mL은 1 mg의 활성 성분 및 활성 성분으로서 9 mg(0.15 mEq)의 염화나트륨을 포함한다. 용액의 pH 범위는 5.5 내지 8.0이다. 인산 및/또는 인산 2나트륨을 6.3 ± 0.3으로 pH를 조절하기 위하여 첨가할 수 있다. 손상되지 않은 바이얼을 냉장보관(2-8℃)하였다. 코호트 B에 대한 클라드리빈의 용량은 총 5일 동안 0.12 mg/kg/일이고, 단독 자리에서 최대 3.0 cc가 투여되는 곳에서 3-4 자리로 분류되었다. 총 클라드리빈 용량은 0.6 mg/kg이다. [이와 동일한 스케쥴(연속적인 5일) 및 0.14 mg/kg/일의 용량(총 용량=0.7 mg/kg)에서 피하로 투여되는 클라드리빈은 유모세포 백혈병 환자에서 안전한 것으로 보고되었다37. 또한, 이 스케쥴 상 및 60명의 환자에게 투여된 클라드리빈은 임상적으로 안전한 골수억제를 갖는 단독 사이클 후 약 70% 림프구 고갈을 초래하였다. 표준화에서 변화의 결과로서, 류스타틴은 실험실에서 합성된 클라드리빈 스톡과 비교한 앞선 임상적 연구에서 보고된 것보다 12% 더 높은 것으로 발견되었다. 0.1 mg/kg으로 보고된 용량은 본 발명에 이르러 실질적으로 단지 0.087 mg/kg인 것으로 평가되었다33. 2-3 자리로 분류된 류스타틴® 제제의 피하 투여의 안전성에 관하여, 다발성 경화증 연구에서 다발성 경화증 환자는 총 축적 용량 2.1 mg/kg에 대하여 6개월 동안 매달 0.07 mg/kg/일 X 5일을 사용하였다36. 총 27명의 환자를 치료 약물 팔에 무작위화하였다. 감염은 클라드리빈으로 처리한 두명의 환자 및 플라시보를 제공받은 한명의 환자에서 발생한 미약하고 부분적인 대상포진의 에피소드로 한정되었다. 중요한 혈소판 감소, 빈혈 과립구감소 또는 전반적 골수 억제의 개별적 경우는 없었다.]
임의의 지지 보호
환자는 치료 중 및 그 후에 IFN-알파 및 IL-2 독성을 폐기하기 위하여 하기의 임의의 것을 제공받을 수 있다: 아세트아미노펜(650 mg PO q4h pm), 디펜히드라민(50 mg IM 또는 PO q4h pm), 인도메타신(25 mg PO TID 또는 75 mg SR qd), 프로클로르페라진(10 mg IV 또는 PO q4h pm 구토), 잔탁®(150 mg BID 위염). 특별히 규정되지 않은 다른 항-염증제 및 구토방지제는 상기의 임의의 지지 약물로 대체될 수 있다.
본 발명은 예시적인 실시예 및 바람직한 구체예와 관련하여 상기에 상세히 설명되었지만, 당업자는 본 발명의 범위가 앞의 기술로 한정되는 것이 아니라, 특허 법의 조항 하에 적절히 해석되는 첨부된 청구항으로 한정된 것임을 이해할 것이다.
참조
Claims (7)
- (a) 대상으로부터 나이브() CD8+ T 세포를 수득하는 단계;
(b) 나이브 CD8+ T 세포를 하나 이상의 펩티드 항원으로 적재된 이종 항원 제시 세포와 접촉시켜, 상기 하나 이상의 펩티드 항원을 발현하는 세포를 표적으로 하는 활성화된 CTL을 생성하는 단계;(c) 대상에 상기 활성화된 CTL을 투여하는 단계;(d) 대상에 CTL 유지에 유효한 적어도 두개의 사이토카인을 투여하는 단계; 및(e) 대상에 클라드리빈 및 데닐루킨 디프티톡스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 림프구 제거제를 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료를 요하는 대상의 치료 방법. - 제 1항에 있어서, 적어도 두개의 사이토카인은 인터페론-α-2b 및 인터루킨-2를 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 2항에 있어서, 하나 이상의 펩티드 항원은 gp100, 티로시나아제 및 MART-1로부터 선택되는 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 하나 이상의 펩티드 항원은 인간 gp100, 티로시나아제 및 MART-1 단백질로부터 유래된 펩티드 항원으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 하나 이상의 펩티드 항원은 각각 YMNGTMSQV (서열번호 1), YMDGTMSQV (서열번호 2), AAGIGILTV (서열번호 3), ITDQVPFSV (서열번호 4), YLEPGPVTA (서열번호 5) 및 KTWGQYWQV (서열번호 6)로 구성된 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 암은 흑색종임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 림프구 제거제의 투여는 활성화된 CTL의 투여 전에 개시됨을 특징으로 하는 방법.
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