MX2008011302A

MX2008011302A - Tratamiento de cancer que combina agente de linfodeplecion con linfocitos t citotoxicos y citocinas.

Info

Publication number: MX2008011302A
Application number: MX2008011302A
Authority: MX
Inventors: Zeling Cai; Ann Moriarty; Per A Peterson; Jon M Richards
Original assignee: Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date: 2006-03-01
Filing date: 2007-02-23
Publication date: 2008-11-04
Also published as: IL193710A; US7993638B2; KR20080098066A; EP1996232B1; US20090324539A1; WO2007103009A3; IL193710A0; EP1996232A4; RU2447900C2; CN101437542A; RU2008138880A; WO2007103009A2; AU2007222080A1; BRPI0708446A2; ZA200808334B; CA2643337C; EP1996232A2; CA2643337A1; ES2579762T3; AU2007222080B2

Abstract

En un tratamiento contra el cáncer que combina la terapia celular con quimioterapía, células T CD8+ antólogas se obtienen de un paciente activadas ex vivo al contactarlas con células que presentan antígeno xenogénico cargadas con antígeno peptídico seleccionado, generando de este modo linfocitos T citotóxicos activados específicos de antígeno; Dichos TLC activados se administran al paciente junto con un régimen de mantenimiento de linfodepleción y CTL que comprende un agente no mieloablativo pero de linfodepleción, tal como cladribina o denileucina diftitox, y citocinas estimuladoras interleucina-2 e interferón-a-2b.

Description

TRATAMIENTO DE CANCER QUE COMBINA AGENTE DE LINFODEPLECION CON LINFOCITOS T CITOTOXICOS Y CITOCINAS REFERENCIA RECIPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama prioridad a la solicitud provisional de los Estados Unidos No. 60/778,516, presentada en marzo 1 de 2006.

CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere a métodos para tratar cáncer en pacientes, que implican la administración de linfocitos T citotóxicos activados, citocinas tales como IL-2 e IFN-alfa-2b y cladribina o denileukin diftitox como un agente de linfodepleción.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Para facilitar una apreciación de la invención, esta sección puede discutir la base histórica y técnica que lleva al desarrollo de la invención, incluyendo observaciones, conclusiones y puntos de vista que pueden ser únicos para un inventor. Por consiguiente, no debe considerarse que las exposiciones de trasfondo en la presente son una admisión respecto al contenido de la técnica anterior.

Muchas terapias se han desarrollado para tratar una variedad de cánceres. Muchos de estos esfuerzos se han centrado alrededor de regímenes quimioterapéuticos. En un régimen de quimioterapia de combinación particular diseñado como un tratamiento para melanoma 5 metastásico, se reportaron índices de respuesta de 35 a 50% con el "régimen de Dartmouth" (una combinación de DTIC, cisplatino, BCNU y tamoxifeno), pero la duración de supervivencia ha perdurado a 6 a 10 meses. Se han reportado también altos índices de remisión para quimioterapia de intensidad de alta dosis agresiva y repleción de hematopoyesis con trasplantes autólogos ¦ , 10 de médula ósea. Sin embargo, la duración media de supervivencia fue breve, de aproximadamente cuatro meses. Mejoras significativas en supervivencia del orden de varios años se ha notado en un pequeño porcentaje de pacientes con melanoma que sufren ciertas inmunoterapias. Esto incluye inmunoterapia específica activa 15 con vacunas contra el cáncer, así como el uso de fomentadores no específicos del sistema inmune, tales como interleucina-2 (IL-2) e interferón- alfa (IFN-a). La identificación de antígenos tumorales definidos por células T en melanoma, ha llevado a pruebas clínicas que eligen como objetivo células 20 cancerosas, intentando aumentar la respuesta inmune celular específica del antígeno. Este procedimiento se ha buscado en numerosas estrategias de vacunación, en las cuales los antígenos son suministrados en un contexto inmunógeno en un intento por inducir respuestas potentes de células T in vivo.

Aunque se han observado algunas respuestas clínicas en las pruebas de vacunas, la magnitud de la respuesta inducida en células T ha sido generalmente baja, o indetectable, y se ha correlacionado deficientemente con respuestas clínicas. La inmunización de pacientes con melanoma con 5 antígenos del cáncer puede incrementar el número de precursores de CTLs circulantes; sin embargo, no se ha correlacionado con la regresión clínica de tumores, sugiriendo un defecto en función o activación in vivo. Estudios de modelos de tumores en ratones han demostrado que la inmunoterapia adoptiva, que implica la inmunización in vitro de células T - . 10 específica de uno o más antígenos tumorales, puede ser eficaz con toxicidad mínima. Un obstáculo en la aplicación de esta estrategia al tratamiento de tumores humanos, ha sido la identificación de antígenos inmunógenos que hacen que las células tumorales sean susceptibles a la destrucción mediada por CTLs. El aislamiento de células T reactivas a tumores de pacientes con 15 melanoma, ha llevado a la identificación de algunos de los antígenos tumorales (epítopes) a los cuales los CTLs son dirigidos. Estos incluyen tirosinasa, MART-1/Melan A, gp100 y MAGE. De estos, la tirosinasa y MART- 1 son casi universalmente expresados en melanoma, y representan por lo tanto una elección objetivo deseada para inmunoterapia adoptiva. 20 La terapia adoptiva de células T implica la remoción de células T del ambiente del hospedero, en donde mecanismos tolerogénicos son activos in vivo en pacientes con cáncer, y contribuye a las respuestas ineficaces demostradas en esta población de pacientes. Células T CD8+ pueden ser estimuladas ex vivo para generar CTLs específicos del antígeno (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 6,225,042). Los primeros procedimientos de inmunoterapia adoptiva usaron linfocitos activados como un tratamiento para varios cánceres. Inicialmente, se usaron células asesinas activadas por 5 linfocinas (LAK), y después linfocitos infiltrantes en tumores (TlLs), activados ex vivo con IL-2, pero la demostración de eficacia fue equívoca. Estas primeras pruebas clínicas controladas no pudieron mostrar una ventaja del uso de las células activadas ex vivo sobre la administración directa de IL-2 a pacientes con melanoma. Estudios más recientes por Yee et al. (Fred • . 10 Hutchinson Cáncer Research Center) y Dudley et al. (NO), han demostrado el potencial para ciertos procedimientos terapéuticos adoptivos de células T. Estos estudios implicaron el uso de clones de células T específicos para MART-1 o gp100 e IL-2 a baja dosis, o TlLs expandidos ex vivo con células nodrizas alogénicas e IL-2 a alta dosis. Estos estudios confirmaron que la 15 inmunoterapia adoptiva continúa siendo una promesa como un tratamiento del cáncer, aunque su desarrollo completo ha sido impedido por la falta de métodos reproducibles para la generación ex vivo de números terapéuticos de CTLs CD8+ específicos del antígeno. Las células T CD8+ citolíticas son una línea principal de defensa 20 contra infecciones virales. Los linfocitos CD8+ reconocen y lisan específicamente células hospederas que son infectadas con un virus. Aunque sería deseable utilizar la actividad citotóxica de los CTLs, pocos procedimientos in vitro/ex vivo han estado disponibles para activar específicamente CTLs. La identificación de antígenos clave asociados con melanoma y un método para la activación específica in vitro de CTLs, permite una evaluación eficiente de la inmunoterapia adoptiva para melanoma metastásico. Mientras que es posible usar células que presentan antígenos (APCs) de ocurrencia natural para la activación de CD8+ in vitro (por ejemplo, células dendríticas, macrófagos, células tumorales autólogas), la eficiencia de activación es baja, puesto que las moléculas del MHC clase I de APCs nativas contienen muchos otros epítopes peptídicos, permitiendo de esta manera presentación mínima de epítopes de péptidos asociados con tumores. La mayoría de estos péptidos presentados representan proteínas endógenas inocuas normales. Una alternativa más directa para este problema sería activar células T CD8+ específicamente para aquellos epítopes relevantes para el combate de la enfermedad, en este caso particular, antígenos asociados con melanoma. Recientemente, se ha desarrollado una APC artificial usando una línea de células embrionaria de Drosophila melanogaster (la mosca de la fruta), que expresa las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I. Véase también las patentes de E.U.A. Nos. 6,225,042 y 6,355,479. Puesto que el insecto Drosophila carece de un sistema inmune avanzado, están ausentes los transportadores de péptidos TAP-1 ,2 que están implicados en la carga de epítopes peptídicos en las moléculas clase I humanas. Como resultado, las moléculas clase I transfectadas aparecen sobre la superficie de las células de Drosophila como vesículas vacías. Mediante la incubación de estas células de Drosophila transfectadas con péptidos sintéticos exógenos que se unen a las moléculas clase I específicas (es decir, epítopes peptídicos de células T de antígenos tumorales), todas las 5 moléculas clase I disponibles pueden ser ocupadas con epítopes peptídicos específicos restringidos en el MHC. La expresión de alta densidad de las moléculas clase I que presentan epítopes individuales o múltiples, y la adición de las moléculas co-estimuladoras clave B7-1 (CD80), CD70, LFA-3 (CD58) e ICAM-1 (CD54) en estas APCs de Drosophila, pueden permitir la generación - . 10 in vitro de células T CD8+ citotóxicas autólogas potentes, que son específicas para los péptidos antigénicos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION 15 Varios aspectos generales y modalidades preferidas de la invención están reflejados en las reivindicaciones anexas a esta especificación, que se incorporan en la presente como referencia. Otras modalidades, características y ventajas preferidas de varios aspectos de la invención llegarán a ser evidentes a partir de la descripción detallada 20 siguiente, tomada en conjunto con las figuras anexas.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra la actividad citolítica de CTLs generados ex vivo dirigidos contra células objetivo cargadas de péptidos. Células T CD8+ 5 aisladas de un paciente con melanoma fueron inmunizadas in vitro con APCs de Drosophila cargadas con cinco epítopes peptídicos diferentes asociados con melanoma. Las células T CD8+ activadas fueron cultivadas in vitro usando IL-2 e IL-7 que expanden selectivamente los CTLs específicos de melanoma. La actividad se evaluó como lisis específica de células objetivo T2 marcadas • . 10 con 51Cr cargadas individualmente con cada péptido (Tyr-1689> Tyr-2792, gp100- 1817, gp100-2853 o MART-1819 contra células T2 cargadas con un epítope control de HLA-A2). La figura 2 provee una ilustración esquemática de dos modalidades preferidas de regímenes de tratamiento de conformidad con la 15 invención, junto con un régimen control.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Y SUS MODALIDADES PREFERIDAS Los varios aspectos de la invención se ilustran a continuación a través de la descripción detallada de modalidades específicas y preferidas. Por razones de brevedad, las descripciones de todas las patentes y otras publicaciones citadas en la presente se incorporan en la presente como referencia. A menos que se defina de otra manera en la presente o sea evidente a partir del contexto, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se usa comúnmente en la técnica. 5 Los términos "que incluye", "que comprende" y "que contiene", se usan en la presente en su sentido abierto no limitativo. Los regímenes terapéuticos de la invención, que comprenden administrar CTLs que han sido activados poniendo en contacto xAPCs cargadas con péptidos seleccionados en conjunto con citocinas y por lo ¦ . 10 menos un agente de linfodepleción seleccionado de cladribina y DAB IL-2, pueden usarse para tratar cáncer en un sujeto que necesita de dicho tratamiento. De preferencia, el cáncer se selecciona de melanoma maligno, mieloma múltiple, cáncer de próstata, línfoma, linfoma no de Hodgkin, leucemia, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia 15 linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, linfoma de Burkitt, cáncer de tiroides, cáncer uterino, cáncer de riñon, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de piel, cáncer de estómago y cáncer cervical. De esta manera, en una modalidad preferida, la invención provee 20 un régimen de terapia adoptiva con CTLs, para tratar o mejorar un melanoma metastásico, que comprende: obtener células T CD8+ no afectadas de un sujeto; poner en contacto las células T CD8+ no afectadas con células xenogénicas que presentan antígenos (xAPCs) que han sido cargadas con antígenos peptídicos seleccionados, generando de esta manera CTLs activados que eligen como objetivo células que expresan el antígeno peptídico seleccionado; administrar los CTLs activados de nuevo al sujeto; administrar por lo menos un agente de linfodepleción seleccionado de cladribina y DAB IL- 5 2; y administrar por lo menos dos citocinas que efectúen persistencia de CTLs. El régimen de terapia adoptiva con CTLs usa de preferencia células T CD8+ autólogas que son activadas ex vivo, las cuales cuando son activadas y administradas a un sujeto de conformidad con la invención, son capaces de mostrar destrucción in vivo de células tumorales que posean epítopes • . 10 antigénicos asociados con cáncer. El término "sujeto" en este contexto se refiere a un paciente mamífero que necesita de tratamiento para un cáncer. Por ejemplo, un sujeto puede ser un humano diagnosticado con un melanoma, tal como un melanoma metastásico maligno avanzado, por ejemplo, un paciente que haya 15 sido diagnosticado como positivo para HLA-A2, y tenga enfermedad no extirpable de etapa lll/IV. El agente de CTLs se prepara de xAPCs. Ejemplos de células xenogénicas que presentan antígenos (xAPCs) que son adecuadas para su uso, pueden incluir los siguientes componentes: una molécula exógena del 20 MHC clase I; una o más moléculas auxiliares exógenas que asistan en la activación de células T no afectadas; y células hospederas capaces de expresar las moléculas exógenas sobre su superficie. De preferencia, las moléculas exógenas son codificadas por ácido nucleico xenogénico que ha sido introducido en células hospederas. Las xAPCs expresan también de preferencia moléculas de adhesión y co-estimuladoras exógenas, que potencien la capacidad de activación de células T de las xAPCs. De preferencia, las células hospederas son células de insecto, más 5 preferiblemente células de Drosophila, tales como células 2 de Schneider (S2). Ejemplos de xAPCs y métodos para su fabricación se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 6,225,042 y 6,355,479. Las xAPCs pueden ser cargadas con antígeno peptídico por una variedad de métodos conocidos o disponibles en la técnica. Se seleccionan • . 10 péptidos que sean capaces de mostrar unión a las moléculas del MHC clase I vacías. Péptidos seleccionados corresponden de preferencia a epítopes que comprenden secuencias de aminoácidos antigénicas o inmunógenas derivadas de proteínas expresadas sobre la superficie de las células, las cuales funcionarán como objetivos para las células T usadas en la terapia 15 adoptiva con CTLs. Para cargar moléculas del MHC clase I vacías con péptidos seleccionados, una o más especies de péptidos inmunógenos o antigénicos que se unen a dichas moléculas del MHC clase I vacías pueden ponerse en contacto con las xAPCs bajo condiciones adecuadas para que ocurra la unión. 20 Pueden seleccionarse una o más especies de péptidos inmunógenos o antigénicos. Si se selecciona más de una especie, puede ponerse en contacto con las xAPCs simultáneamente o en casos distintos, resultando en complejos de MHC-péptido multi-antigénicos o multi- ¡nmunógenos producidos en las xAPCs. La carga del péptido seleccionado sobre moléculas del MHC vacías, ocurre de preferencia bajo condiciones que se aproximan a condiciones de unión biológicas, que pueden ser aproximadas in vitro, ex vivo 5 o in vivo. En la selección de los péptidos, el experto en la técnica puede considerar uno o más factores tales como consideraciones termodinámicas, electrostáticas, energéticas y entrópicas, así como aminoácidos específicos dentro de péptidos seleccionados que se requieren para unión eficaz a moléculas del MHC. ¦ , 10 Péptidos preferidos incluyen, por ejemplo, los péptidos que corresponden a las secuencias de aminoácidos seleccionadas de una proteína tirosinasa, una proteína gp100 y una proteína MART-1 . Otros péptidos preferidos incluyen YMNGTMSQV (SEQ ID NO: 1 ), YMDGTMSQV (SEQ ID NO: 2), AAGIGILTV (SEQ ID NO: 3), ITDQVPFSV (SEQ ID NO: 4), 15 YLEPGPVTA (SEQ ID NO: 5) y KTWGQYWQV (SEQ ID NO: 6). Otros ejemplos de péptidos que pueden seleccionarse incluyen, por ejemplo, las siguientes secuencias de aminoácidos, en donde la proteína de la cual cada péptido se deriva se anota entre paréntesis: SILSLKEAST (C-lectina; SEQ ID NO: 70), KMASRSMRL (C-lectina; SEQ ID NO: 71 ), ALALAALLVV (Pee 60; 20 SEQ ID NO: 72), ALLVVDREV (Pee 60; SEQ ID NO: 73), YMNGTMSQV (tirosinasa; SEQ ID NO: 74), YMDGTMSQV (tirosinasa; SEQ ID NO: 75), ITDQVPFSV (gp100; SEQ ID NO: 7), YLEPGPVTA (gp100; SEQ ID NO: 8), AAGIGILTV (MART-1 ; SEQ ID NO: 9), ELAGIGILTV (MART-1 ; SEQ ID NO: 10), CLTSTVQLV (Her-2/neu; SEQ ID NO: 1 1 ), HLYQGCQVV (Her-2/neu; SEQ ID NO: 12), KIFGSLAFL (Her-2/neu; SEQ ID NO: 13), IISAVVGIL (Her- 2/neu; SEQ ID NO: 14), PLTSIISAV (Her-2/neu; SEQ ID NO: 15), VMAGVGSPYV (Her-2/neu; SEQ ID NO: 16), VLVKSPNHV (Her-2/neu; SEQ 5 ID NO: 17), ELVSEFSRM (Her-2/neu; SEQ ID NO: 18), YLSGANLNL (CEA; SEQ ID NO: 19), GPLTPLPV (AES; SEQ ID NO: 20), SLLMWITQC (NY-ESO- 1 ; SEQ ID NO: 21 ), KALFAGPPV (CA-125; SEQ ID NO: 22), YLETFREQV (CA-125; SEQ ID NO: 23), GLQSPKSPL (CA-125; SEQ ID NO: 24), VLLKLRRPV (CA-125; SEQ ID NO: 25), ELYIPSVDL (CA-125; SEQ ID NO: • . 10 26), SLLMWITQV (NY-ESO-1 ; SEQ ID NO: 27), ILAKFLHWL (telomerasa; SEQ ID NO: 28), STAPPVHNV (MUC-1 ; SEQ ID NO: 29), FLWGPRALV (MAGE-3; SEQ ID NO: 30), FMWGNLTLA (CA-125; SEQ ID NO: 31 ), RLVDDFLLV (telomerasa; SEQ ID NO: 32), HLSTAFARV (G250; SEQ ID NO: 33), QLSLLMWIT (NY-ESO-1 ; SEQ ID NO: 34), ELWTHSYKV (FBP; SEQ ID 15 NO: 35), KVAELVHFL (MAGE-3; SEQ ID NO: 36), YIFATCLGL (MAGE-3; SEQ ID NO: 37), HLYIFATCL (MAGE-3; SEQ ID NO: 38), MLMAQEALAFL (CAMEL; SEQ ID NO: 39), STLEKINKT (SSX-4; SEQ ID NO: 40), KASEKIFYV (SSX-2; SEQ ID NO: 41 ), SLLMWITQCFL (NY-ESO-1 ; SEQ ID NO: 42), ELTLGEFLKL (survivina; SEQ ID NO: 43), LTLGEFLKL (survivina; SEQ ID 20 NO: 44), SLLEKREKT (SP17; SEQ ID NO: 45), TLGEDDPWL (SART-1 ; SEQ ID NO: 46), KLGLKPLEV (SART-1 ; SEQ ID NO: 47), YLWTSAKNT (SCP-1 ; SEQ ID NO: 48), STAPPAHGV (MUC-1 ; SEQ ID NO: 49), GMGSEELRL (LIVIN; SEQ ID NO: 50), SLGSPVLGL (LIVIN; SEQ ID NO: 51 ), YLFFYRKSV (hTRT; SEQ ID NO: 52), CQQEETFLL (CA-125; SEQ ID NO: 53), TLAKFSPYL (PRAME; SEQ ID NO: 54), NLTHVLYPV (PRAME; SEQ ID NO: 55), STFKNWPFL (survivina; SEQ ID NO: 56), SLLQHLIGL (PRAME; SEQ ID NO: 57), FLDQRVFFV (gp100; SEQ ID NO: 58), FLDQRVFVV (gp100; SEQ 5 ID NO: 59), FLDQVAFVV (gp100; SEQ ID NO: 60), GLDREQLYL (MUC-16; SEQ ID NO: 61 ), VMQHLLSPL (MUC-16; SEQ ID NO: 62), QQTHGITRL (MUC-16; SEQ ID NO: 63), LQPLSGPGL (MUC-16; SEQ ID NO: 64), TLDRDSLYV (MUC-16; SEQ ID NO: 65), QLYLELSQL (MUC-16; SEQ ID NO: 66), KVLEYVIKV (MAGE-1 ; SEQ ID NO: 67), KVADLVGFL (MAGE-1 ; SEQ ID • m 10 NO: 68) y KTWGQYWQV (SEQ ID NO: 69). Péptidos seleccionados pueden ser presentados a las células por medio de una variedad de medios y métodos conocidos en la técnica. Péptidos seleccionados pueden ser presentados en una manera que les permita entrar a un grupo ¡ntracelular de péptidos. Por ejemplo, los péptidos 15 pueden ser presentados por medio de carga osmótica. De preferencia, los péptidos se añaden al medio de cultivo del sistema de xAPCs. Los péptidos pueden añadirse al medio de cultivo en la forma de una proteína o polipéptido intacto que sea degradado subsiguientemente por medio de procesos celulares tales como, por ejemplo, degradación enzimática. En forma 20 alternativa, la proteína o polipéptido intacto puede ser degradado por medio de algunos otros medios tales como digestión química (por ejemplo, con bromuro de cianógeno) o proteasas (por ejemplo, tripsina y quimotripsina) antes de la adición al medio de cultivo del sistema de xAPCs. En forma alternativa, una secuencia entera de polipéptidos o proteínas puede ser clonada en un vector adecuado, e insertada en una célula procariótica, por lo cual la célula genera cantidades significativas del polipéptido antigénico que son entonces cosechadas, purificadas y digeridas en péptidos que se añaden entonces al medio de cultivo del sistema de xAPCs. Una cantidad suficiente de cada péptido seleccionado puede añadirse al cultivo de células para permitir que las moléculas del MHC clase I se unan y presenten subsiguientemente una gran densidad del péptido sobre la superficie de células humanas que expresan el MHC clase I. Las xAPCs pueden ponerse a prueba para función mejorada de APCs en comparación con la función de APCs de células que presentan antígenos no xenogénicas o endógenas. La función mejorada de las APCs puede determinarse midiendo cualquiera de una variedad de parámetros de activación de células T CD8+ tales como, por ejemplo, un grado de expresión de una o más proteínas de la superficie de la célula, lo cual es indicativo de la activación de células T CD8+, tal como expresión de CD69 en la superficie de las células, un grado de diferenciación, un grado de capacidad de destrucción citotóxica, un grado de lisis específica de células y un grado de producción de citocinas. La purificación de proteínas y péptidos puede lograrse a través de varias técnicas que se conocen en la materia, tales como cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía de afinidad, precipitación de proteínas, intercambios de regulador de pH, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica y cromatografía de exclusión por tamaño. Los CTLs estimulados por el antígeno pueden detectarse o aislarse mediante tinción de tetrámeros pMHC de péptidos-MHC, en donde los CTLs detectados son específicos de un péptido seleccionado presentado por las xAPCs. Se obtienen leucocitos de sangre periférica (PBLs) de un sujeto, y de preferencia se purifican sustancialmente. Métodos para la purificación de PBLs incluyen métodos que usan gradientes de Ficoll, y pueden usarse para este propósito. Los PBLs purificados se mezclan entonces con xAPCs preincubadas con los péptidos antigénicos adecuados. De preferencia, los PBLs se purifican mediante sistemas de purificación con perlas magnéticas que se conocen en la técnica, tales como perlas de Myltenyi (Myltenyi Biotec) y sistemas Dynabead (Dynal Biotech). Los PBLs pueden purificarse también por medio de procedimientos de distribución de células, tales como métodos basados en el distribuidor de células asistido por fluorescencia (FACS), u otros dispositivos y metodología adecuados de distribución de células. Dichos métodos de distribución de células o distribución de eritrocitos usan proteína fluorescente verde (GFP) como un marcador para varias proteínas específicas de la célula. Células T no afectadas se incuban en cultivo con las xAPCs adecuadas, y se cargan con péptidos seleccionados por un tiempo suficiente para activar y enriquecer además una población de células CD8+. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,690,915 describe un método para obtener grandes números de linfocitos por medio de linfocitoféresis. De preferencia, las células CD8+ son activadas en una manera específica del antígeno. La relación de células CD8+ en reposo o precursoras (efectoras) a células que presentan antígenos puede variar de individuo a individuo, y puede depender además de variables tales como la receptibilidad de los linfocitos de un individuo a las condiciones de cultivo y la naturaleza y severidad del cáncer. Sin embargo, de preferencia, la relación de linfocitos: células que presentan antígenos (por ejemplo, células de Drosophilá) está de preferencia en la escala de aproximadamente 30:1 a 300:1 . Por ejemplo, en una modalidad, se mezclan 3x107 PBLs humanos y 1 x106 células de Drosophilá vivas, y se mantienen en 20 mi de medio de cultivo 1640 del RPMI. El cultivo de células que presentan antígenos/células efectoras puede mantenerse por un largo tiempo, según sea necesario, para activar y enriquecer una población de un número terapéuticamente utilizable o efectivo de células CD8+. Con un nivel de activación máximo específico de células CD8+ siendo generalmente observado después de 1 a 10 días de cultivo, por ejemplo, después de 5 días de cultivo, un tiempo preferido es de aproximadamente 3 a 7 días. En una modalidad de la presente invención, la activación in vitro de células T CD8+ puede detectarse dentro de un breve período después de la transfección de una línea de células. En una modalidad, la expresión transitoria en una línea de células transfectada capaz de activar a células T CD8+, es detectable dentro de 48 horas de transfección. De esta manera, cultivos estables o transitorios de células transformadas que expresan moléculas del MHC clase I humanas, son efectivos para activar células T CD8+. Linfocitos T citotóxicos activados pueden separarse efectivamente de las xAPCs (por ejemplo, células de Drosophila), usando un 5 método adecuado conocido o disponible en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos monoclonales específicos de las APCs artificiales, para los péptidos cargados sobre las APCs artificiales, o para los CTLs (o un segmento de los mismos), para unir su ligando complementario adecuado. Células marcadas con anticuerpos pueden extraerse entonces de la mezcla de células • . 10 efectoras-estimulador, por cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, métodos de inmunoprecipitación e inmunoensayo. En forma alternativa, puede omitirse por completo un paso de separación, y las xAPCs ¡nactivadas pueden dejarse en cultivo con los CTLs activados. 15 Pueden seleccionarse cantidades citotóxicas terapéuticamente efectivas de los CTLs activados como adecuadas para el uso in vitro e in vivo descritos, por ejemplo, en vista de la cantidad y el tipo de células que son el objetivo último de estos CTLs. La cantidad se seleccionará también en vista de la condición del paciente, y puede determinarse considerando todos los 20 factores adecuados por el médico general. De preferencia, se usan aproximadamente 1 x106 a aproximadamente 1 x1012, más preferiblemente aproximadamente 1 x108 a aproximadamente 1 x1011, y aún más preferiblemente aproximadamente 1x109 a aproximadamente 1 x1011, células CD8+ activadas para humanos adultos, en comparación con aproximadamente 5x106 - 5x107 células usadas en ratones. De preferencia, las células CD8+ activadas, que son CTLs, se cosechan como se describió anteriormente del cultivo de xAPCs, antes de la administración de los CTLs al individuo que está siendo tratado. El sistema de cultivo de células es de preferencia no tumorígeno. Por lo tanto, si no se logra la separación completa de las células de Drosophila y las células CD8+ activadas, no debe haber riesgo inherente asociado con la administración de un pequeño número de células de Drosophila. Células T CD4+ o células T CD8+, o células T CD4+ y células T CD8+ no afectadas, pueden extraerse de preferencia de un sujeto antes de la incubación con los cultivos de xAPCs. Los sujetos pueden sufrir cualquiera de una variedad de procedimientos de separación de células sanguíneas conocidos o disponibles (por ejemplo, leucoféresis), para colectar leucocitos. Pueden cosecharse células T no afectadas de un sujeto antes del inicio de otro tratamiento o terapia que pueda interferir con, atenuar, o de algún modo limitar, la activación específica de células T no afectadas, y métodos de uso se proveen en la presente invención. Por ejemplo, en el tratamiento de un individuo con una neoplasia o tumor, puede obtenerse una muestra de células T no afectadas antes del inicio del tratamiento de quimioterapia o radiación, y pueden mantenerse en cultivo. Después de que las células T no afectadas son activadas con xAPCs cargadas con péptidos, las células T no afectadas pueden ser expandidas y activadas, y los CTLs activados pueden ser introducidos de nuevo en el sujeto. En forma alternativa, células T no afectadas pueden ser activadas, y los CTLs activados pueden ser introducidos de nuevo en el sujeto de quien las células T no afectadas se obtuvieron anteriormente, después, o en conjunto con otras formas de 5 tratamiento opcionales, tales como quimioterapia o radiación. Los CTLs activados pueden ser suspendidos también en un vehículo adecuado para suministro e infusión en un sujeto. Técnicas para reintroducir componentes celulares se conocen en la materia, e incluyen procedimientos tales como los ejemplificados en las patentes de E.U.A. Nos. • . 10 4,844,893 y 4,690,915. Por ejemplo, puede usarse administración de CTLs activados por medio de infusión intravenosa. Pueden requerirse infusiones múltiples, y estas infusiones pueden ocurrir durante un período de va as semanas o más tiempo. En los regímenes de tratamiento de la invención, se administran 15 también citocinas para lograr persistencia de CTLs, e intensificar de esta manera las propiedades de vida media, actividad, potencia y/o selectividad de los CTLs que se administran a un sujeto. Dicha persistencia puede resultar de un efecto directo sobre los CTLs, o de un efecto indirecto que implique sobrerregulación de la expresión del antígeno en células objetivo de los CTLs. 20 Citocinas preferidas son IFN-a-2b e IL-2. Se administran también los agentes de linfodepleción cladribina (2-CdA, Leustatin®) y/o DAB IL-2 (ONTAK®) en los regímenes de tratamiento inventivos. Estos agentes son no mieloablativos, e inducen una inmunosupresión transitoria en sujetos que reciben la terapia con CTLs. La oportunidad y duración de la administración de cada uno de los CTLs, citocinas y agentes de linfodepleción pueden ser seleccionadas por los expertos en la técnica con base en experimentación de rutina y la guía 5 dada en la presente, incluyendo los siguientes ejemplos. Para ilustrar varios aspectos y características de la invención, se proveen los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS ¦ % 10 Preparación ex vivo de CTLs Se generan líneas de APCs xenogénicas (xAPCs) a partir de células S2 de Schneider (células S2), que se establecieron en 1969 de varios cientos de embriones Oregon-R de 20 a 24 horas (tipo silvestre) de Drosophila 15 melanogaster (Oregon-R) (ATCC CRL-1963), de acuerdo con procedimientos publicados (Schneider, J. Embryol. Morph. 27: 353-365, 1972). La línea de células S2 ha sido depositado con la American Type Culture Collection (CRL10974). El suministro original de células S2 usadas para derivar las líneas de células de las cuales las xAPCs se derivan, se obtiene de esta 20 fuente. Para generar xAPCs, células S2 son transfectadas con vectores derivados del vector de plásmido pRMHa-3 (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 6,225,042). Una línea de xAPCs, designada como clon A, es transíectada con vectores que codifican para HLA-A2.1 clase I, B7.1 e ICAM- 1 . Una segunda línea de xAPCs, designada como clon B, es transfectada con vectores que codifican para HLA-A2.1 clase I, B7.1 , B7.2, ICAM-1 y LFA-3. Una tercera línea de xAPCs, designada como clon C, es transfectada con vectores que codifican para HLA-A2.1 clase I, B7.1 , ICAM- , LFA-3 y CD70. De esta manera, el clon A expresa HLA-A2, B7.1 e ICAM- , el clon B expresa HLA-A2.1 clase I, B7.1 , B7.2, ICAM-1 y LFA-3, y el clon C expresa HLA-A2.1 clase I, B7.1 , ICAM-1 , LFA-3 y CD70.B7.2 y LFA-3. Cultivos continuos independientes de células que descienden del clon A y el clon B se mantienen en medio de Schneider complementado con suero de ternera fetal a 10% y 500 pg/ml de geneticina (G418), y se dividen dos veces por semana con medio fresco añadido durante cada división, para ajustar la densidad de células a aproximadamente 1 x106 células/mL. Aproximadamente un día antes de la inducción (día -2 a -4; día 0 definido como el día en que las células se ponen a prueba para la expresión de moléculas endógenas y son cargadas con péptidos), se inoculan 3 matraces T75 con un volumen de suspensión de células mantenido en cultivos existentes equivalente a 1 .5 x 107 células/matraz. Se añade medio SFM completo para Drosophila sin G418 para llevar el volumen hasta 15 ml/matraz. Los matraces se incuban entonces en una cámara a aproximadamente 27°C. En aproximadamente el día -1 a -3, las células son inducidas entonces por la adición de sulfato de cobre (CuSO4) a una concentración final de 1 .0 mM (dilución de 1 :200 de existencias de CuS04 200 mM; 75 µ? de CuSO4 por cada matraz T75 conteniendo 15 mi de suspensión de células), y se regresan a la cámara a 27°C. El tiempo de inducción dura aproximadamente 24 a 72 horas. En el día 0, los matraces que contienen cultivos de células inducidas se verifican visualmente y microscópicamente para detectar evidencia de contaminación. Los matraces no contaminados se agrupan y se hace el conteo de células viables. Muestras de cultivos de células agrupadas de aproximadamente 6x106 células se evalúan por citometría de flujo, usando análisis por distribuidor de células asistido por fluorescencia (FACS), para determinar el nivel de expresión de moléculas exógenas. Entonces, se ponen a prueba los cultivos de células (aproximadamente 1x107 células/mL) para verificar la expresión de HLA-A2.1 , B7.1 e ICAM-1 exógenas (para las células del clon A) o HLA-A2.1 , B7.1 , B7.2, ICAM-1 y LFA-3 (para las células del clon B), antes de la carga de péptidos. Una vez que se verifica la expresión de las moléculas exógenas, cada cultivo de células se lava dividiendo cada cultivo en dos tubos cónicos estériles de 50 mi. Cada tubo es llenado entonces con medio para insectos SFX HYQ (Hyclone) y centrifugado a 1 ,700 rpm (600 x g) por aproximadamente siete minutos, para convertir las células a pellas. Se desechan los sobrenadantes, y los tubos que contienen a la pella de células se centrifugan de nuevo a 1 ,700 rpm (600 x g) por aproximadamente 1 minuto. Se remueven los sobrenadantes con una pipeta de punta fina. Pellas de cada cultivo de células dividido se recombinan entonces y se resuspenden en 8 mL de medio para insectos SFX a una densidad de células de aproximadamente 1x107 células/mL. Aproximadamente 40 pL de una solución existente de ß2 microglobulina a 1.0 mg/mL y 24 pL de una dilución de 1 :50 de una solución combo de péptidos existentes a 1 .67 mg/mL para cada péptido, se añaden a cada cultivo suspendido. De esta manera, cada suspensión de cultivo de células contiene ß2 microglobulina a una concentración final de aproximadamente 5 pg/mL, y cada péptido seleccionado que se va a cargar sobre las xAPCs contiene ß2 microglobulina a una concentración final de aproximadamente 0.1 pg/ml por péptido. Los cultivos de células se incuban en la suspensión que contiene ß2 microglobulina y péptidos por cuando menos cuatro horas, y no más de ocho horas, con acción de remolino cada 30 minutos a temperatura ambiente. Después del período de incubación de los péptidos, se distribuyen alícuotas de aproximadamente 1 mL de cada cultivo de células por separado en ocho tubos de polipropileno (Falcon 2006). Cualquier suspensión de cultivo de células residual, se desecha. Células CD8+ aisladas de muestras de leucofóresis por selección positiva con un anticuerpo anti-CD8+, son estimuladas contra péptidos asociados con melanoma humano (tirosinasa-68936g-377, tirosinasa-792369-377, MART-1 -81927-35, gp100-8172o9-2i7, gp100-818280-288 y gp100-853i54-i 62) presentados por células de Drosophila que expresan las moléculas de adhesión/co-estimulación y clase I humanas HLA-A2.1 , B7.1 , CD70, LFA-3 e ICAM-1. Células CD8+ son reestimuladas por dos rondas con monocitos autólogos (pulsados con los epítopes descritos) en presencia de IL-2 e IL-7. El número de células efectoras es incrementado entonces por estimulación no específica con anticuerpos monoclonales anti-CD3 en presencia de células nodrizas autólogas tratadas con radiación gamma e IL-2. La actividad de los linfocitos T citotóxicos se mide contra células T2 cargadas de péptidos y un panel de células de melanoma, mientras que la pureza de las células T CD8+ estimuladas in vitro, se evalúa mediante citometría de flujo.

Materiales Reactivos rhlL- 7. La interleucina-7 (IL-7) humana recombinante, es una linfocina producida en E. coli y purificada por el proveedor (PeproTech) usando cromatografía de líquidos de alto rendimiento (CLAR) pero no anticuerpos. La IL-7, recibida como un polvo, es diluida en DPBS estéril conteniendo albúmina de suero humano a 1 %. La solución global es filtrada entonces a través de un filtro de 0.2 pm, distribuida en alícuotas (30,000 U/mL, concentración de 1000 X) en viales estériles, y almacenada a -80°C antes de su uso. rhlL-2. La interleucina-2 (IL-2) humana recombinante es producida por medio de tecnología de ADN recombinante y provista por Chiron Corporation (Proleukin®). La IL-2, recibida como un polvo, es diluida en diluyente de IL-2 (albúmina de suero humano a 0.5% en ácido acético 50 mM), filtrada a través de un filtro de 0.2 pm, distribuida en alícuotas en viales estériles (20,000 U/mL, concentración de 1000 X), y almacenada entonces a -80°C antes de su uso.

Péptido de tirosinasa YMNGTMSQV (SEQ ID NO: 1). Un péptido de tirosinasa (tyr 369-377), que corresponde a los aminoácidos 369 a 377 de tirosinasa humana, es fabricado y purificado usando estándares de acatamiento de GLP (Synpep Corporation). El péptido en polvo recibido del fabricante (Synpep Corporation), es disuelto en sulfoxido de dimetilo (DMSO) hasta obtener una solución de péptido existente a una concentración de 10 mg/mL, y es almacenado a -72°C a -88°C antes de su uso. Esta solución de péptido existente se mezcla en partes iguales con otras soluciones existentes de péptidos (también a una concentración de 10 mg/ml), para generar soluciones de péptido de combinación para su uso en la carga de xAPCs. Las soluciones de péptido de combinación se distribuyen en alícuotas en viales estériles en un sitio limpio clase 10,000 bajo condiciones asépticas en un gabinete de bioseguridad clase II.

Péptido de tirosinasa YMDGTMSQ (SEQ ID NO: 2)V. Una forma desamidada del péptido tyr 369-377 descrito anteriormente, que contiene un residuo de ácido aspártico en lugar de un residuo de asparagina en la posición 3 del péptido, es fabricada y purificada usando estándares de acatamiento de GLP (Synpep Corporation). Esta forma de desamidación se denomina tyr 369-377d. El péptido en polvo recibido del fabricante es disuelto en sulfóxido de dimetilo (DMSO) hasta obtener una solución de péptido existente a una concentración de 10 mg/mL, y se almacena a -72°C a -88°C antes de su uso.

Péptido de qp100 ITDQVPFSV (SEQ ID NO: 4). Un péptido de gp100 (gp100209-2i 7), que corresponde a los aminoácidos 209 a 217 de gp-100 humana, es fabricado y purificado usando estándares de acatamiento de GLP (Synpep Corporation). El péptido en polvo es disuelto en sulfóxido de dimetilo (DMSO) hasta obtener una solución de péptido existente a una concentración de 10 mg/mL, y se almacena a -72°C a -88°C antes de su uso.

Péptido de qp100 KTWGQYWQV (SEQ ID NO: 6). Un péptido de gp100 (gp100i54-i62), que corresponde a los aminoácidos 154 a 162 de gp100 humana, es fabricado y purificado usando estándares de acatamiento de GLP. El péptido en polvo recibido de Synpep Corporation es disuelto en sulfóxido de dimetilo (DMSO) hasta obtener una solución de péptido existente a una concentración de 10 mg/mL, y se almacena a -72°C a -88°C antes de su uso.

Péptido de qp100 YLEPGPVTA (SEQ ID NO: 5). Un péptido de gp100 (gp1 ??280-288), que corresponde a los aminoácidos 280-288 de gp100 humana, es fabricado y purificado usando estándares de acatamiento de GLP por Synpep Corporation. El péptido en polvo es disuelto en sulfóxido de 'dimetilo (DMSO) hasta obtener una solución de péptido existente a una concentración de 10 mg/mL, y se almacena a -72°C a -88°C antes de su uso.

Péptido de MART-1 AAGIGILTV (SEQ ID NO: 3). Un péptido de MART-1 (MART-127-35), que corresponde a los aminoácidos 27 a 35 de MART- 1 humana, es fabricado y purificado usando estándares de acatamiento de GLP (Synpep Corporation). El péptido en polvo es disuelto en sulfóxido de dimetilo (DMSO) hasta obtener una solución de péptido existente a una concentración de 10 mg/mL, y se almacena a -72°C a 88°C antes de su uso.

DYNABEADS® M-450. DYNABEADS®, IgG M-450 (SAM), son perlas paramagnéticas estériles recubiertas con IgG anti-ratón de cabra policlonal que une la IgG primaria de ratón. DYNABEADS, disponibles de Baxter Oncology Inc., se almacenan a 4°C antes de su uso en aislamiento de células T usando el selector de células magnético Isolex 300i.

Albúmina de suero humano. HSA a 25%, USP (Baxter Fenwal Laboratories; la fuente de plasma para cada lote puesto a prueba que va a ser negativo para VIH-1 VIH-2, HCV y HBV), se almacena a temperatura ambiente antes de su uso como una fuente de proteína regulada en su pH durante los siguientes pasos de activación y preparación de células T: purificación de células T CD8+ y células T CD8", carga de péptidos de células adherentes; y formulación final de células T activadas.

Anticuerpo anti-CD8. El anticuerpo monoclonal anti-CD8 (37B1A) es un anticuerpo monoclonal de murino dirigido contra el antígeno CD8 de células T, el cual se usa para seleccionar células T CD8+ con el sistema de selector de células magnético Isolex 300i. La solución de concentrado se diluye en DPBS estéril para su uso en procedimientos de activación o aislamiento de células T CD8+. La solución global se filtra a través de un filtro de 0.2 pm, y se distribuye entonces en alícuotas en viales de un sólo uso en un sitio limpio clase 10,000 bajo condiciones asépticas en un gabinete de bioseguridad clase II. Se almacenan alícuotas (10.0 mg/mL) a -80°C antes de su uso.

Péptido de la cadena alfa de CD8 - AAEGLDTQRFSG (SEQ ID NO: 76). El péptido de la cadena ligera alfa de CD8 (AAEGLDTQRFSG (SEQ ID NO: 76)) es purificado y fabricado bajo estándares de acatamiento de GLP. El péptido de la cadena alfa de CD8 se usa en procedimientos de aislamiento de células T CD8+ para liberar células T CD8+ capturadas usando anticuerpo CD8 (37B A) y el selector de células magnético Isolex 300?. Cada lote de péptido es fabricado por Synpep Corporation para cumplir con estándares de grado farmacéutico, y se pone a prueba para secuencia, pureza, peso molecular y apariencia de péptidos. El péptido de la cadena alfa de CD8, recibido como un polvo, es procesado además para crear una solución existente de 10 mg/ml. Esta solución existente es diluida en DPBS, filtrada a través de un filtro de 0.2 pm, distribuida en alícuotas en viales estériles, y almacenada a -72°C a -88°C antes de su uso. La distribución del reactivo del péptido en viales se realiza en un sitio limpio clase 10,000 bajo condiciones asépticas en un gabinete de bioseguridad clase II. 32 microglobulina humana. Un concentrado de beta-2 microglobulina (ß2?) humana producido por medio de tecnología de ADN recombinante, es diluido en DPBS estéril hasta alcanzar una concentración de 1.0 mg/mL. La solución global es filtrada entonces a través de un filtro de 0.2 µ?t?, distribuida en alícuotas en viales estériles, y almacenada a -80°C antes de su uso durante la preparación y carga de péptidos de xAPCs, y carga de péptidos de células adherentes.

Solución de citrato de sodio. Una solución de citrato de sodio anticoagulante no pirógena estéril, USP (Baxter Fenwal), es almacenada a temperatura ambiente antes de su uso como un aditivo de regulador de pH para introducir el selector de células magnético Isolex 300i para la selección de células T CD8+ y células T CD8".

Medio de Schneider. El medio para Drosophila de Schneider es un medio de cultivo usado para el cultivo de células de Drosophila. Cada lote de medio es puesto a prueba por el proveedor (Invitrogen Corporation) para osmolaridad, pH, esterilidad y la capacidad para sustentar el crecimiento de células de Drosophila. El medio para Drosophila de Schneider (concentración de 1X) se almacena a 2°C a 6°C antes de su uso.

Suero de bovino fetal. El suero de bovino fetal (FBS), el cual se usa como una fuente de proteínas para el crecimiento de células hospederas o células xAPCs, se almacena a -80°C. El FBS, disponible de Gemini Bioproducts, es procesado de sangre fetal de bovino de animales originados de Estados Unidos. Los animales maternos de los cuales la sangre se deriva, están libres de enfermedades infecciosas y contagiosas y parásitos nocivos.

Medio para insectos SFX HYQ. El medio para insectos SFX de Hyclone (Hyclone Corporation), es un medio de cultivo libre de suero (concentración de 1 X) usado durante la carga de péptidos de las xAPCs, y se almacena a 2°C a 6°C antes de su uso. Este medio no contiene productos de origen bovino.

Sulfato de cobre. El pentahidrato de sulfato de cobre (II) (Aldrich), se usa para la inducción de células hospederas modificadas que expresan moléculas de HLA co-estimuladoras y de adhesión humanas. La solución existente se formula disolviendo el CuSO4 cristalino en agua estéril libre de endotoxinas hasta alcanzar una concentración de 200 mM, y filtrando asépticamente la solución a través de un filtro de 0.2 µ? en un contenedor estéril en un gabinete de bioseguridad clase II. La solución existente filtrada se almacena a 2°C a 6°C antes de su uso.

RPMI. El medio de cultivo del RPMI (disponible de Invitrogen Corporation o Gibco), que está libre de suero y antibióticos (concentración de 1 ), se usa para el desarrollo de células T. El medio de cultivo del RPMI se almacena a 2°C a 6°C antes de su uso.

Solución salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco (DPBS). Se almacena solución salina regulada en su pH con fosfato de Dulbecco (DPBS) no pirógena estéril (disponible de Invitrogen Corporation o Gibco, concentración de 1X), a temperatura ambiente antes de su uso. Se usa DPBS para los siguientes procedimientos: introducción del instrumento selector de células magnético Isolex 300i durante la selección de células T CD8+ y células T CD8"; lavado de células no adherentes durante los pasos de reestimulación y lavado de anticuerpo monoclonal OKT3 no unido durante la expansión no específica; y dilución de ß2 microglobulina, IL-7, péptido CD8 y OKT3 de humano.

Medio de Leibovitz. Se almacena medio L-15 de Leibovitz (sin L-glutamina; concentración de 1 X), disponible de Sigma-Aldrich, a 2°C a 6°C antes de su uso durante la carga de péptidos del procedimiento de activación de células T.

Anticuerpo ???^3. OKT®3 de Orthoclone (1.0 mg/mL), un anticuerpo monoclonal de murino específico para el antígeno CD3 de células T provisto en ampolletas como una solución estéril aprobada para uso clínico (disponible de Ortho), se distribuye en alícuotas en viales de un sólo uso bajo condiciones estériles, y se almacena congelado a -80°C antes de su uso en la activación de células T.

Geneticina (G418). La geneticina (Invitrogen Corporation) es un antibiótico selectivo usado en cultivo de células de Drosophila para mantener la expresión de moléculas exógenas codificadas por ácido nucleico xenogénico. La geneticina es provista como una solución existente estéril (50 mg/mL) y se almacena a 2°C a 6°C antes de su uso.

Cloruro de calcio. Se usa hidrato de cloruro de calcio para coagular plasma autólogo obtenido del producto de linfoféresis para generar suero autólogo usado en procedimientos de aislamiento o activación de células T CD8+. El hidrato de cloruro de calcio se recibe como un polvo cristalino, se combina en una solución existente (1 M) y se almacena a 2°C a 6°C antes de su uso. La solución existente se formula disolviendo cloruro de calcio en agua estéril libre de endotoxinas, y se filtra asépticamente a través de un filtro de 0.2 pm en un contenedor estéril en un gabinete de bioseguridad clase II.

Acido acético. El ácido acético (17.4M) usado para la preparación de soluciones existentes de IL-2 se obtiene de Sigma Corporation, y se almacena a temperatura ambiente antes de su uso.

FICOLL-PAQUE ® Plus. Después del aislamiento de células T CD8+ y células T CD8" con el sistema selector de células Isolex 300i, células mononucleares de la fracción no de CD8+ se fraccionan adicionalmente usando FICOLL-PAQUE ® Plus (concentración de 1X), un reactivo de gradiente de Ficoll sin componente animal alguno disponible de Amersham Pharmacia Biotech usado para remover células muertas, neutrófilos y eritrocitos. El reactivo se almacena a temperatura ambiente antes de su uso.

PENTASPAN®. PENTASPAN (B. Braun Medical Inc.) es una solución estéril de pentaalmidon a 10% en cloruro de sodio a 0.9% para uso clínico (NDC 0264-1972-10), y se almacena a temperatura ambiente antes de su uso. Se usa (concentración de 1X) como un crioprotector en la criopreservación de células T CD8+ y células T CD8" aisladas.

Sulfóxido de dimetilo (DMSO). Se usa DMSO como un crioprotector en la criopreservación de células T CD8+ y células CD8" aisladas. La solución de DMSO (concentración de 1X), disponible de Sigma-Aldrich, se almacena a temperatura ambiente antes de su uso.

L-glutamina. L-glutamina (USP), 200 mM (concentración de 100X), disponible de Invitrogen Corporation, se usa como un complemento del medio de cultivo del RPMI, y se almacena a -80°C antes de su uso.

Solución de piruvato de sodio de MEM. Se usa solución de piruvato de sodio de MEM (concentración de 100 mM, 100X), disponible de Invitrogen Corporation, para complementar medio del RPMI, y se almacena a 2°C a 6°C antes de su uso.

Aminoácidos no esenciales. Aminoácidos no esenciales (10 mM; concentración de 100X) de Invitrogen Corporation, usados para complementar medio del RPMI, se almacenan a 2°C a 6°C antes de su uso.

Solución de HEPES. Solución de regulador de pH de HEPES 1 M (concentración de 200X) (Invitrogen Corporation), usada para complementar medio del RPMI, se almacena a 2°C a 6°C antes de su uso.

Medio X-Vivo 10-Cell. Medio de cultivo X-vivo 10-Cell, provisto por BioWhittaker, se almacena a 2°C a 6°C antes de su uso. Este medio (concentración de 1X), que está libre de suero, rojo de fenol y antibióticos, se usa durante la fase de expansión no específica de células T activadas por exposición a xAPCs cargadas de péptidos.

Invección de cloruro de sodio. Una solución de cloruro de sodio a 0.9%, USP, disponible de Baxter Fenwal Laboratories, se usa para procedimientos de lavado de células durante la cosecha de células T. La solución, que es estéril, no pirógena y está libre de componentes animales, se almacena a temperatura ambiente antes de su uso.

Solución de dextrosa + cloruro de sodio. Una solución inyectable de dextrosa a 5% y cloruro de sodio a 0.9%, USP (Baxter Fenwal Laboratories), se obtiene como una solución estéril no pirógena libre de componentes animales. La solución, que se usa como un regulador de pH de almacenamiento para células T activadas, se almacena a temperatura ambiente antes de su uso.

Solución lactada de Rinqer. Una solución lactada de Ringer a 0.9%, USP (Baxter Healthcare Laboratories), que es una solución estéril de bajo contenido de endotoxinas de cloruro de calcio, cloruro de potasio, cloruro de sodio y lactato de sodio, en agua para inyección libre de componentes animales, se almacena a temperatura ambiente antes de su uso en la cosecha y suspensión de células T.

Agua destilada. Agua destilada grado cultivo de células, que se obtiene por filtración en membrana e identificación de endotoxinas (Invitrogen Corporation), se usa como un solvente para la preparación de soluciones existentes de sulfato de cobre, cloruro de calcio e interleucina-2 (IL-2), y se almacena a temperatura ambiente antes de su uso.

Otros materiales Se colectan productos de linfoféresis de sujetos humanos diagnosticados con melanoma, y se almacenan a temperatura ambiente antes de su uso para la generación de un producto de células autólogo específico del paciente. Se usa suero humano autólogo como una fuente de proteínas para el cultivo de células T aisladas. Se prepara plasma humano autólogo del producto de linfoféresis, añadiendo cloruro de calcio hasta lograr la coagulación de la fibrina, y colectando entonces la fase de suero líquida. La fase de suero líquida colectada se almacena a 4°C para almacenamiento a corto plazo, y a -80°C para almacenamiento a largo plazo. Una línea de xAPCs de Drosophila, derivada del clon B de Drosophila xenogénico, que se usa como materia prima seminal para crear un cultivo continuo de xAPCs de Drosophila, se obtiene como se describe más adelante.

Procedimientos Aislamiento de células CD8+ humanas Se aislan células CD8+ de muestras de leucoíéresis usando una máquina Isolex 300i (Baxter) por selección positiva con un anticuerpo monoclonal anti-CD8 (anticuerpo 1 ), seguida de un procedimiento de aislamiento de Dynabeads™ (Dynal) usando IgG anti-ratón de oveja (anticuerpo 2) recubierta sobre perlas magnéticas (perlas de SAM). El anticuerpo monoclonal de ratón CD8 anti-humano se añade a células lavadas resuspendidas en PBS de Dulbecco complementado con HSA a 1 % (Baxter-Hyland) y citrato de sodio a 0.2%. Se añaden perlas magnéticas Dynal (Dynabeads™) a una relación de perla a célula de 1 :1 a 1 :2, dependiendo del número de PB Cs. Las células CD8+ aisladas se remueven por separación magnética. La fracción restante no de CD8+ se colecta y es criopreservada para uso futuro durante los pasos de reestimulación y expansión no específica. La disociación del complejo de célula CD8-ant¡cuerpo 1 -anticuerpo 2-perla se logra por incubación a 37°C por 45 minutos en presencia de péptido59-7o (AAEGLDTQRFSG (SEQ ID NO: 76)) de CD8, el péptido al cual se generó el anticuerpo 1. Las perlas liberadas se remueven magnéticamente, y se hace el conteo de células CD8+, las cuales se analizan por citometría de flujo para evaluar su pureza. La recuperación de células CD8+ es típicamente mayor de 80%. Se prepara suero inactivado con calor colectando el plasma autólogo al momento del paso inicial de lavado de las células. Se coagula la fibrina usando CaCI2) y se remueve el coágulo de fibrina. El suero es inactivado con calor, filtrado, distribuido en alícuotas y congelado a -80°C. Las células no CD8+ son retenidas del procedimiento de selección positiva y purificadas usando un gradiente de Ficoll. Estas células son criopreservadas en DMSO, Pentaspan y suero autólogo inactivado con calor, y almacenadas en nitrógeno líquido (LN2). Estas células se usan como la fuente de células adherentes al momento de las reestimulaciones, y son pulsadas con péptidos antes de su uso como células que presentan antígenos.

Inmunización in vitro de células T CD8+ humanas purificadas Estimulación primaria. Se incuban células S2 de Drosophila transfectadas en medio de Schneider ( 06 células/mL) complementado con suero de ternera fetal a 10% y sulfato de cobre, a 27°C por 24 a 72 horas. Células S2 (clon 1 120-3-9) se cosechan, se lavan y se resuspenden en medio para insectos SFX HYQ (Hyclone) conteniendo 0.1 pg/mL de cada uno de péptidos gp100i54-i62, gp100209-2i 7, gp10028o-288, MART-127-35, t¡rosinasa-N369. 37 y tirosinasa-D369-377 de humano y 5 µg/mL de proteína recombinante de ß2 microglobulina humana purificada de E. coli. Después de incubación a temperatura ambiente (23-25°C) por 4 horas, las células S2 se mezclan con células CD8+ a una relación de 1 :10 (células de Drosophila: células T) en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Gibco) complementado con suero autólogo a 5 a 10%. La mezcla de células se incuba a 37°C, tiempo durante el cual las células de Drosophila mueren (en 48 horas). En el día cuatro, se añaden IL-2 (20 U/mL) e IL-7 (30 U/mL) para expandir selectivamente la población de CTLs específicos de melanoma.

Reestimulaciones. PBMCs autólogas agotadas en CD8, obtenidas al momento de la linfaféresis y congeladas para uso futuro, se descongelan, se lavan y se resuspenden a 107 células/mL en medio del RPMI conteniendo suero autólogo a 10%, 5 pg/mL de ß2 microglobulina humana recombinante y 5 pg/mL de péptidos gp100i54-i 62, gp100209-2i7, gp10028o-288, MART-127-35, tirosinasa-N369-377 y t¡rosinasa-D369-377- Después de irradiación gamma (5,000 rads), las células se incuban a 37°C por dos horas en los matraces usados para la reestimulación. Las células no adherentes se remueven mediante lavado con PBS de Dulbecco. Los monocitos adherentes se cargan con los epítopes peptídicos y se incuban por 90 minutos en medio de Leibovitz conteniendo 5 pg/mL de ß2 microglobulina humana en HSA a 1 % y 5 pg/mL de cada péptido. El sobrenadante se remueve, y la suspensión de células CD8+ activada por Drosophila (2.5 x 106 células/mL en medio del RPMI con suero autólogo a 10%) se añade a una relación de aproximadamente 10 células CD8+ a un monocito adherente. Después de 3 a 4 días de cultivo a 37°C, se añaden IL-2 (20 U/mL) e IL-7 (30 U/mL) con un cambio de medio para expandir selectivamente la población de CTLs específica de melanoma.

Expansión no específica. Las células efectoras CD8+ que han sufrido dos rondas de reestimulación son expandidas en bolsas de cultivo de células junto con células nodrizas (células seleccionadas no CD8+ autólogas irradiadas) después de haber sido estimuladas con anticuerpo OKT3. Las células seleccionadas no CD8+ congeladas se descongelan, se lavan y se tratan entonces con irradiación gamma (3,500 rads). Una relación de 4:1 (células nodrizas: células efectoras) se pone en los matraces T-225 que han sido recubiertos con anticuerpo OKT3. La estimulación con OKT3 se realiza en medio del RPMI completo conteniendo suero autólogo a 10% complementado con 20 U/mL de IL-2. Dos días después, las células T estimuladas se diluyen con medio fresco (medio X-vivo 10), y se transfieren a bolsas de cultivo de células para expansión. El medio fresco e IL-2 son complementados aproximadamente cada dos a tres días para alimentar a las células T en rápida expansión.

Preparación y liberación de CTLs Cosecha de células y formulación del producto final. La cosecha del producto final de células se realiza por centrifugación para remover el medio de cultivo y para concentrar las células. Después de centrifugación, las células se lavan en solución salina conteniendo albúmina de suero humano (HSA) a 1%, se filtran a través de un filtro de 70 µ?t?, y se diluyen entonces en medio de infusión. El producto de células para infusión contiene CTLs autólogos en 300 mL de inyección lactada de Ringer, USP (76% en v/v), dextrosa a 5% y cloruro de sodio a 0.9% (4% en v/v) y HSA a 25% (20% en v/v). Las células del producto final se empacan en una bolsa de transferencia de 1000 ml_ en un contenedor para envío aislado enfriado con un registrador de datos de temperatura.

Prueba del producto. Pruebas realizadas antes de la liberación del producto de CTLs, se enlistan a continuación. La actividad específica dirigida contra cada uno de los péptidos se evalúa midiendo la actividad citotoxica de las células efectoras contra células T2 marcadas con cromo cargadas con cada péptido individual usado para la estimulación. Se mide también la actividad citotoxica contra objetivos de melanoma marcados con cromo (Malme 3M, M14), usando fibroblastos normales (Malme 3) o una línea de células de melanoma (01 -KN) negativa para tirosinasa, gp100 y MART-1 como controles.

Fenotipo: Una porción de la cosecha de células se usa para poner a prueba el fenotipo del producto CD8+ antes del envío. La especificación del producto final es expresión de CD3, CD8 y TCR. Evaluación fenotípica adicional para marcadores consistente con memoria, activación, etc., se mide y se registra.

Identidad: El estado de HLA-A2, HLA-C y HLA-DR de la muestra se determina por análisis de una preparación de ADN aislada de una muestra de PBMCs preparada al momento de la recepción de la leucoféresis inicial y de las células T CD8+ colectadas al final del cultivo, tomadas del producto de células cosechado. El análisis por PCR de muestras de ADN se realiza con oligómeros de iniciadores específicos de HLA provistos por Genovision. La especificación del producto final es identidad con la muestra del día 0.

Conteos de células: La dosis de células deseada para la infusión es 1010 células CD8+. El límite de infusión del producto final es 1010 células. El número total de células generadas depende del paciente. Las dosis de células promediaron 9 X 109 en un estudio previo, en donde las células se generaron bajo el mismo protocolo ex vivo. El conteo final de células se hace determinando el número de células viables.

Viabilidad: La viabilidad de la dosis de células final es mayor de 70%. El número de células viables se establece contando microscópicamente células que excluyen el colorante azul trípano.

Prueba para micoplasmas: La prueba de las células para micoplasmas se realiza antes de que las células se administren al paciente para confirmar la detección negativa de micoplasmas. Se usa el equipo de PCR de Roche, que incluye también una prueba de ELISA. Además, se colectan muestras de los cultivos de células T en la primera provisión de citocinas (día 6), y se envían a BioReliance para satisfacer el procedimiento de cultivo de 28 días. Los resultados del cultivo se reciben post infusión de células T.

Prueba de endotoxinas: La prueba de endotoxinas en el producto celular final se realiza usando una prueba de lisado de amibocitos de límulo (BioWhittaker, Walkersville, MD). El límite del nivel de endotoxinas es menor de 5 EU/kg infundidos en los pacientes. La especificación del producto de células final es <IEU/mL.

Pruebas de esterilidad del producto en el procedimiento: La prueba de esterilidad del procedimiento se realiza usando el sistema BacT/Alert. Se toman muestras durante tiempos de cambios de medio. Una muestra de la dosis final se pone a prueba también mediante el sistema BacT/Alert, y la especificación del producto final es ausencia de crecimiento.

Detección de ADN de Drosophila y ARN viral de insectos: Se aisla ADN del producto final de células T CD8+, y se usa como un molde para una prueba de PCR de ADN de Drosophila, que usa iniciadores específicos para el vector de insecto usado para preparar las APCs de Drosophila recombinantes. Esta muestra se compara con la muestra de células CD8+ no afectadas que actúa como el control negativo, y se usa ADN de células de Drosophila como el control positivo. Se aisla también ARN total de las mismas muestras de células T CD8+, y se realiza una RT-PCR en tiempo real cuantitativa, que puede detectar 20 copias/pg de ADNc de tres virus de ARN viral de insecto conocidos diferentes. La especificación del producto para ambas pruebas es detección negativa de ácido nucleico viral y genómico de insecto.

Actividad lítica: Se evalúa la actividad lítica para el producto final de células T CD8+ mediante una prueba de liberación de cromo en objetivos de células T2 cargadas con péptidos, que mide actividad anti-péptidos, y objetivos de HLA-A2 de células de melanoma establecidos o autólogos y líneas tumorales y no tumorales en coincidencia con el donador (Malme 3 y Malme 3M) que evalúa destrucción específica de melanoma. La especificación del producto es destrucción específica de células objetivo. Asimismo, para facilitar el monitoreo, pueden realizarse también las siguientes pruebas además de las pruebas de liberación descritas anteriormente: Tinción tetramérica: Se evalúan células T CD8+ para la muestra derivada de leucoféresis no afectada para la presencia de células T específicas del antígeno, con moléculas tetraméricas que han sido diseñadas para enumerar células T con especificidad por los epítopes peptídicos usados para generar los CTLs ex vivo. Esto permite el monitoreo de células T específicas del antígeno después del tratamiento.

Células tumorales de melanoma en muestras de sangre periférica: Pruebas de PCR en tiempo real cuantitativas sensibles permiten el monitoreo de células tumorales de melanoma circulantes en muestras de sangre de pacientes antes, durante y después del tratamiento con fármacos. Mientras que no todos los pacientes con melanoma de etapa lll/IV demuestran células tumorales circulantes, la detección de estas células puede usarse como un marcador sustituto de respuesta a la terapia. Productos de CTLs preparados como se describió anteriormente, pueden usarse en los regímenes de tratamiento de la terapia de combinación de la invención, según se ilustra mediante las modalidades preferidas descritas en los siguientes ejemplos.

Tratamiento de pacientes con melanoma metastásico usando linfocitos CD8+ autólogos estimulados ex vivo con células de Drosophila cargadas con péptidos asociados con melanoma (MART-1 , gp100 y tirosinasa), y administración subcutánea de IFNa-2b e IL-2, con y sin administración de 2-CdA o DAB IL-2 Estos ejemplos ilustran tratamientos que comprenden la administración de linfocitos T citotóxicos (CTLs) autólogos que son específicos para epítopes peptídicos derivados de antígenos asociados con melanoma en combinación con un agente de linfodeplecion seleccionado de cladribina y DAB IL-2, así como citocinas IL-2 e IFN-a-2b, así como un tratamiento control.

El agente de terapia celular, que comprende CTLs autólogos que han sido activados de modo que eligen como objetivo específicamente células tumorales de melanoma que expresan MART-1 , gp100 y tirosinasa poniendo en contacto xAPCs de Drosophila cargadas con péptidos antigénicos derivados de MART-1 , gp100 y tirosinasa, se ha diseñado para mejorar y mantener la determinación del blanco inmune de un paciente de células tumorales de melanoma que expresan MART-1 , gp100 y tirosinasa. La adición de los inmunomoduladores IFN-a-2b e IL-2 se incluye para aumentar la respuesta de los CTLs. Un régimen preparativo no mieloablativo pero de depleción de linfocitos (cladribina), o una depleción del subgrupo de células T específico denileukin diftitox (DAB IL-2), se administra antes de la infusión de CTLs para mejorar el injerto de los CTLs. El tratamiento está diseñado para causar regresión de tumores y beneficio clínico a través de la persistencia de CTLs específicos de melanoma. Más particularmente, a pacientes clínicos con melanoma maligno avanzado que son positivos para HLA-A2, se les administra un régimen preparativo no mieloablativo pero de depleción de linfocitos, que consiste de cladribina (0.12 mg/kg/día x 5 días) o DAB IL-2 (una sola inyección de 18 pg/kg). Además, un régimen concomitante de interferón-a-2b (IFN-a-2b; 10M Ul/m2) se administra diariamente, por 5 días consecutivos, por inyección subcutánea antes de la infusión de los CTLs. Después, los pacientes reciben una sola dosis de células T CD8+ autólogas estimuladas con xAPCs de Drosophila generadas ex vivo, que exhiben el fenotipo de CTLs. La infusión de células va seguida de inmediato por la administración subcutánea diaria de IL- 2 a baja dosis (por ejemplo, 3 MUI), por 28 días, seguida de evaluación del tumor. La administración diaria subcutánea de IL-2 a baja dosis (por ejemplo, 3 MUI) se continúa en los pacientes sin evidencia de progresión de la enfermedad. Los CTLs se generan por un método en el cual células T CD8+ no afectadas purificadas son estimuladas con xAPCs de Drosophila que presentan seis diferentes epítopes peptídicos de células T asociados con melanoma en el contexto de restricción del MHC clase I humano, que resulta en CTLs que exhiben especificidades múltiples para MART-1 , gp100 y tirosinasa, después de aproximadamente 34 días en cultivo. Se colecta sangre en la identificación para calificar a pacientes para el estudio, y el procedimiento de leucoféresis preparativo ocurre en el día 0 o el día 1. Los pacientes sufren una leucoféresis estándar de 2.0-3.0X el volumen sangre, para obtener suficientes leucocitos requeridos para preparar el agente de terapia celular. En tiempos indicados, se realizan procedimientos de leucoféresis adicionales (< la tercera parte de la cantidad usada para obtener la muestra de CD8 inicial), para obtener células de sangre periférica para análisis. Estas muestras se usan para monitorear la presencia de células T específicas del antígeno y células tumorales de melanoma circulantes posibles. Se colectan también plasma y células sanguíneas para satisfacer el requerimiento de xenotrasplante para obtener muestras de pretratamiento y post-tratamiento. Los productos de leucoféresis son transportados a una instalación en donde células T CD8+ son aisladas, estimuladas y cultivadas por aproximadamente 34 días. Una evaluación de lesiones mensurables se realiza a 4 y 8 semanas después de la infusión de CTLs. Un objetivo del estudio es determinar si la administración de una depleción completa del subgrupo de células T no mieloablativas, de depleción de linfocitos (cladribina) o selectiva (DAB IL-1 ), antes de la infusión de células T y en conjunto con un régimen de citocinas establecido que mejora la respuesta inmune, resultará en persistencia de células T específicas del antígeno con regresión acompañante de tumores objetivo.

Preparación de linfocitos citotóxicos Células CD8+ aisladas de muestras de leucoféresis por selección positiva con un anticuerpo anti-CD8, son estimuladas con péptidos antigénicos asociados con melanoma humano (tirosinasa369-377(nat¡va). tirosinasa369-377(D37imod¡f¡cada), MART-127-35, gp100i54-i 63, gp100209-2i7 y gp10028o-28ß) presentados por xAPCs de Drosophila que expresan moléculas co-estimuladoras y clase I humanas (HLA-A2.1 , ß2 microglobulina, B7.1 , CD70, ICAM-1 y LFA-3). Estas mismas células CD8+ son reestimuladas por dos rondas de células mononucleares autólogas pulsadas con péptidos, en presencia de IL-2 e IL-7. Un paso de expansión no específico con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 (OKT3) se incluye también para incrementar el número total de células: en general 25 veces más que el obtenido al final del segundo paso de reestimulación. Se mide la actividad de células T citolíticas contra células T2 cargadas con péptidos y un panel de células tumorales de melanoma A2+, mientras que se evalúa la pureza de las células T CD8+ estimuladas in vitro por citometría de flujo. Además, la producción de interferón-gamma, en respuesta a la estimulación específica del antígeno y el análisis tetramérico específico de péptidos confirma, respectivamente, la función efectora y especificidad de los CTLs generados.

Potencia de CTLs generados de células T CD8+ no afectadas aisladas de pacientes con cáncer de melanoma Se ha demostrado en pacientes con melanoma que CTLs específicos del antígeno, aislados de muestras de sangre periférica, son parte de una población heterogénea de células con avidez de baja a alta por el complejo de péptido/MHC específico al cual la TCR es dirigida. Sin embargo, la vasta mayoría de estos CTLs son de baja avidez, y sólo los CTLs con alta avidez demuestran lisis significativa de células tumorales. Además, se han aislado linfocitos infiltrantes en tumores (TlLs) de masas tumorales en pacientes con melanoma. La expansión ex vivo de estos TlLs en presencia de IL-2 a alta dosis, ha resultado en respuestas objetivo en pacientes con melanoma; sin embargo, estas respuestas fueron de corta duración, y las células T clonadas altamente reactivas que se originan de los TlLs no pudieron generar respuesta completa alguna. En contraste, los CTLs generados ex vivo con Drosophila-xAPCs son células T potentes específicas del antígeno de alta avidez capaces de exhibir lisis específica de péptidos (véase, por ejemplo, la figura 1 ) y fuerte destrucción de células tumorales de melanoma. Se cree que la generación reproducible de los CTLs, con fuerte actividad citolítica por células tumorales, es atribuible a varios factores contribuidores. Primero, la purificación de CD8+ con un anticuerpo monoclonal anti-CD8 específico de péptidos seleccionó para células con una alta densidad de CD8, mientras que la liberación de anticuerpos en presencia de péptidos específicos, evitó la estimulación no específica de las células T. Segundo, las células T CD8+ altamente purificadas (cuadro I) son estimuladas con xAPCs que presentan epítopes de células T específicos en el contexto de moléculas del MHC, en donde una alta densidad de presentación del antígeno resulta en una respuesta inmune primaria potente de células T. La inclusión de moléculas de co-estimulación múltiples en los APCs, optimiza la estimulación de células T. Tercero, los pasos de reestimulación incorporan células mononucleares autólogas que han sido cargadas con los mismos epítopes de células T asociados con melanoma usados en la estimulación primaria, y proveen un refuerzo para las células T proliferantes. Por último, un paso de expansión no específico individual con OKT3, células nodrizas autólogas e IL-2 a baja dosis, mantiene el mismo porcentaje de células T específicas del antígeno registradas al final del segundo paso de reestimulación, mientras que el incremento del número total de células T es de aproximadamente 25 veces.

CUADRO I Purificación de células CD8* por selección positiva y analizadas por citometría de flujo (los datos representan el resumen del total de 28 pacientes) PBMC Post-selección Tipo de célula (%) (Escala) (%) (Escala) Células T CD3+ 45 (29-64) 83 (59-98) Células T CD4+ 27 (16-46) 2 (0.5-4) Células T CD8+ 17 (8-31 ) 84 (60-96) Monocitos CD14+ 27 (1 1 -43) 5 (0.5-17) Neutrófilos 2 (0.5-9) 0.5 (0.5-1 ) CD157CD16+ Células asesinas naturales 15 (8-47) 8 (2-20) CD167CD15+ Células B CD19 1 (0.5-2) 1 (0.5-3) Este protocolo de estimulación de células T CD8+ de xAPCs ex vivo, resultó en CTLs con lisis potente de células tumorales, alta avidez por el complejo de péptido/MHC y especificidad por el antígeno, según se evaluó por enumeración con moléculas tetraméricas específicas de péptidos, liberación de interferón-gamma en respuesta a estímulo antigénico específico, y lisis específica de tumores.

Evaluación de la terapia con CTLs en melanoma metastásico maligno de estudios previos Se han realizado dos pruebas de fase I y una prueba de fase II, que incluyeron un total de 55 sujetos con melanoma de etapa III o etapa IV. El estudio 1 , "linfocitos T citotóxicos autólogos (CD8+) cultivados gradualmente ex vivo con células que presentan antígenos de Drosophila, interleucina-2, interleucina-7, entonces monocitos adherentes y péptido de tirosinasa", fue un estudio de clasificación pendiente en 10 pacientes con melanoma de etapa IV. Los extremos clínicos fueron: 1 ) seguridad y tolerabilidad de CTLs autólogos reinfundidos después de inmunización in vitro; 2) determinación de la cinética de los CTLs infundidos en la circulación sistémica por análisis de dilución limitativa; 3) disposición en el cuerpo entero de CTLs marcados con 111 In por radioescintigrafía; 4) composición de células de nodulos obtenidos por biopsia por análisis inmunohistoquímico (CTLs, TH, células NK, células B), y 5) regresión de lesiones mensurables y duración de la respuesta durante dos meses. En el estudio 2, "estudio piloto de interferón-alfa subcutáneo con infusión de linfocitos CD8+ autólogos estimulados con células de Drosophila para el tratamiento de melanoma avanzado", un total de 15 pacientes con melanoma de etapa lll/IV fueron infundidos con células T CD8+ autólogas en la terapia de mantenimiento de fondo con IFNa-2b. La terapia con CTLs se evaluó monitoreando: 1 ) la seguridad y tolerancia de los CTLs reinfundidos; 2) la composición de células de los nodulos obtenidos por biopsia; 3) la regresión de lesiones mensurables, y 4) la duración de respuesta durante tres meses. A los sujetos que tuvieron enfermedad estable o demostraron una respuesta clínica a la evaluación de seguimiento (cuatro semanas después de la primera infusión), se les ofreció un segundo ciclo de tratamiento. Ocho de los 15 sujetos sufrieron un segundo ciclo de terapia con CTLs, 4 sujetos entraron a un tercer ciclo, y 1 sujeto fue tratado con cuatro ciclos de terapia con células T. En el estudio 3, "prueba aleatorizada de fase II de interferón-a-2b (IFN) e interleucina-2 (IL-2) subcutáneos con o sin infusión de linfocitos CD8 autólogos estimulados con células de Drosophila para el tratamiento de melanoma avanzado", se trató a un total de 30 pacientes con melanoma de etapa lll/IV con citocinas solas (IFNa e IL-2) o citocinas más células T. Fue un estudio aleatorizado en el cual los pacientes entraron al brazo de sólo citocinas (brazo A) o al brazo de citocinas más células T (brazo B). A los pacientes que entraron y progresaron al brazo A, se les ofreció una oportunidad de cruzar hacia el brazo de citocinas más células T (brazo C). El extremo primario de este estudio fue comparar el tiempo a la progresión (TTP) de enfermedad entre los dos grupos (brazo A contra brazo B). Se logró significancia estadística en TTP en pacientes que entraron al brazo B, contra aquellos que entraron al brazo A (figura 1 ). En pacientes que cruzaron del brazo A al brazo C, se detectó también significancia estadística en TTP en los pacientes que recibieron células T. Se monitorearon también la seguridad y tolerabilidad de IFNa e IL-2 a las dosis y en el plan prescrito.

Razón fundamental para el uso de interferón-a-2b (IFN-a-2b) El interferón-alfa (IFN-a) tiene un amplio espectro de efectos inmunomoduladores y antiproliferativos en una variedad de malignidades. Se cree que un mecanismo de acción del IFN-a, es la sobrerregulación de la expresión de antígenos tumorales en células de melanoma. Tiene la capacidad de mejorar la expresión de moléculas inmunológicamente importantes sobre la superficie del tumor. Estas incluyen los antígenos del MHC, moléculas accesorias, así como antígenos asociados con tumores. Estos efectos inmunomoduladores pueden mejorar la actividad del sistema inmune, incluyendo anticuerpos y linfocitos, que reconocen y atacan a células tumorales in vivo. La ¡nmunoterapia específica activa ha demostrado respuestas clínicas significativas en el tratamiento de melanoma diseminado. Los resultados de los estudios de la función inmune discutidos anteriormente han demostrado que el tratamiento con vacunas de melanoma incrementa la frecuencia de CTLs anti-melanoma. Se cree que estas dos modalidades de inmunoterapia pueden actuar sinérgicamente. Un curso de 5 días de IFN-a (10 MU/m2; subcutáneamente) se incluyó en el estudio 2, y los resultados de tinciones de tejido con IHC demostraron que la oportunidad y la dosis fueron suficientes para sobrerregular la expresión de antígenos asociados con melanoma y clase I en muestras obtenidas por biopsia conseguidas de un sólo paciente en los marcos de tiempo especificados. El mismo curso de 5 días en el estudio clínico se incluyó en el estudio 3.

Razón fundamental para el uso de interleucina-2 La interleucina-2 (IL-2) recombinante humana es una linfocina producida por medio de tecnología de ADN recombinante, que se ha mostrado exhibe una variedad de actividades biológicas. La IL-2 estimula el sistema inmune, y ejerce sus efectos biológicos después de la unión a receptores específicos sobre la superficie de células objetivo. In vitro, se ha mostrado que intensifica la proliferación de células T y la citotoxicidad de linfocitos, induce la actividad asesina de células asesinas naturales y células activadas por linfocinas, e induce la producción de interferón-gamma. La administración de IL-2 a alta dosis a 283 pacientes produjo un índice de remisión de 7% con 9 respuestas completas, y los pacientes se mantuvieron libres de enfermedad de 9 a más de 91 meses. Aunque la IL-2 a alta dosis pareció ser más efectiva que las infusiones continuas a baja dosis, las altas dosis de IL-2 son también más tóxicas. Los efectos secundarios más comunes fueron síntomas tipo influenza. Los efectos secundarios más severos fueron hipotensión, síndrome de fuga capilar y perfusión reducida de órganos. La administración subcutánea de IL-2 a baja dosis (a 3 MUI/día X 28 días), se usó en parte del estudio 3, para mejorar y mantener el nivel de células T autólogas transferidas adoptivamente. Se añadió después de un curso breve de IFN-a, e inmediatamente después de la infusión de CTLs para mejorar la mitogénesis de linfocitos, la citotoxicidad de linfocitos y la producción de interferón-gamma en un esfuerzo por mantener las células T específicas del antígeno in vivo.

Transferencia adoptiva de linfocitos después de un régimen de quimioterapia inmunosupresora no mieloablativa Estudios en ratones demostraron que la inducción de inmunosupresión con quimioterapia antes de la administración de células T, fue esencial para permitir la transferencia adoptiva de linfocitos que median la regresión máxima de tumores. Con base en estos estudios, se iniciaron protocolos clínicos para tratar a pacientes con la transferencia adoptiva de linfocitos después de la aplicación de un régimen quimioterapéutico no mieloablativo. Se han usado regímenes preparativos no mieloablativos para tratar a pacientes que reciben trasplantes alogénicos de médula ósea, y estos regímenes parecen ser idealmente adecuados para inducir la inmunosupresión transitoria que puede mejorar el efecto de linfocitos T transferidos adoptivamente. Un régimen de ciclofosfamida y fludarabina usado originalmente en pacientes con cáncer de células renales que reciben alotrasplantes en coincidencia con HLA, se ha usado recientemente en pacientes con melanoma metastásico. La razón fundamental para la incorporación de un régimen de linfodepleción antes de la transferencia adoptiva de células T, fue destruir posiblemente células reguladoras, interrumpir la regulación homeostática de células T ("creación de espacio"), o suprimir otros mecanismos tolerogénicos normales que podrían mejorar potencialmente el injerto de las células T transferidas. No se observó mortalidad alguna relacionada con el tratamiento, y por lo tanto la quimioterapia no mieloablativa en combinación con linfocitos antitumorales más IL-2 a alta dosis, debe ser segura. La no mieloablación fue inducida con fludarabina (25 mg/m2) y ciclofosfamida (60 mg/kg), y fue seguida de una infusión de linfocitos e IL-2 a alta dosis (720,000 Ul/kg).

Se ha demostrado que la combinación de los agentes quimioterapéuticos ciclofosfamida y fludarabina, mientras que no es completamente mieloablativa, es mielosupresora, afectando a neutrófilos, linfocitos, plaquetas y eritrocitos. Los niveles de neutrófilos, que disminuyeron hasta un punto más bajo en el día 10 después del inicio de la quimioterapia, se registraron a 6/mm3, y se recuperaron a arriba de 500/mm3 en el día 14 con soporte de filgrastim (G-CSF). Los niveles de linfocitos tuvieron un punto más bajo de 6/mm3, y se recuperaron a arriba de 200/mm3 durante el mismo período. Los pacientes exhibieron usualmente conteos de neutrófilos arriba de 500/mm3 y conteos de plaquetas arriba de 20,000/mm3, 2 a 3 semanas después del inicio de la quimioterapia. Ningún paciente necesita una transfusión de células madre para rescatar la función de la médula, y por lo tanto el tratamiento general parece ser seguro. Sin embargo, los conteos de CD4 continuaron siendo persistentemente bajos (el conteo medio de CD4 a aproximadamente el día 200 fue de 156/mm3, con una escala entre 46/mm3 y 320/mm3), que es un efecto secundario conocido de la inmunosupresión inducida con fludarabina. Ocurrió el desarrollo de infecciones oportunistas (es decir, brotes transitorios de herpes zoster), las cuales se resolvieron después de la terminación del tratamiento. Cladribina (2-CdA, Leustatin®), un análogo de purina similar a la fludarabina, está aprobada para su uso en el tratamiento de leucemia de células pilosas, y se ha evaluado también en pacientes con esclerosis múltiple (MS) en un esfuerzo por reducir los linfocitos T autorreactivos. En pacientes con MS, una disminución específica en subgrupos de células T se correlacionó con diferentes dosis de cladribina. Tiene un perfil de toxicidad muy favorable respecto a otros fármacos linfocitolíticos, mientras que induce una linfopenia de larga duración. Los niveles de linfocitos se precipitan inmediatamente después de la primera infusión de cladribina, alcanzan un punto más bajo a 5 meses, y comienzan a recuperarse alrededor de 6 meses cuando se administra por 4 cursos mensualmente. Se observó linfopenia en todos los pacientes, y las complicaciones infecciosas no fueron un problema serio. El fármaco puede administrarse por la vía subcutánea conveniente sin que cause irritación local y con resultados farmacocinéticos y terapéuticos que parecen ser enteramente equivalentes a la vía IV. Un estudio reciente en humanos que identifica a células T reguladoras (Treg) como ¡nmunosupresoras en un ambiente de vacunas, demostró una respuesta inmune antitumoral mejorada después de la depleción del subgrupo Treg que exhibe un fenotipo CD4+/CD25+hl junto con CD28, CTLA-4 y GITR. Este subgrupo de células T puede ser agotado selectivamente (aproximadamente 3 semanas) después de una sola dosis de denileukin diftitox (DAB389 IL-2, ONTAK®). Cuatro días después de la dosis individual, se observó de 37 a 77% de depleción de células Treg en 8 pacientes con carcinoma de células renales. Después de la depleción de células T, se administró una vacuna de ARN-DC y se observó una mejora de 10 veces en la respuesta inmune a los antígenos de la vacuna en los pacientes que recibieron DAB IL-2 y vacuna contra vacuna sola. De esta manera, la misma dosis (18 pg/kg) seis días antes de una transferencia adoptiva de los CTLs específicos del antígeno, es una dosis preferida para su uso en regímenes de conformidad con la invención.

Selección de pacientes Los sujetos para el estudio son pacientes humanos diagnosticados con melanoma metastásico, quienes son positivos para HLA-A2. Se usa un anticuerpo monoclonal (BB7.2) para analizar muestras de PBMCs por análisis por FACS, y se realiza otro análisis usando la prueba de PCR Olerup SSP™ (GenoVision) para determinar el subtipo HLA-A*0201.

Esquema de tratamiento La figura 2 describe los regímenes de tratamiento descritos en más detalle a continuación. Se divide a los pacientes en tres grupos de sujetos, con 10 en cada grupo. En el régimen del grupo A, un control para el régimen de linfodepleción, se administran CTLs más citocinas. En el régimen del grupo B, que es una modalidad preferida de la invención, los pacientes reciben cladribina (días 0-4) más CTLs (día 36) más citocinas. En el régimen del grupo B, que es otra modalidad preferida de la invención, los pacientes reciben DAB IL-2 (día 30) más CTLs (día 36) más citocinas. Los regímenes experimentales se describen en más detalle a continuación.

CTLs específicos para antíqenos asociados con melanoma La terapia con linfocitos T citotóxicos para melanoma maligno usa células T CD8+ autólogas activadas in vitro, que destruyen células tumorales de melanoma que poseen epítopes antigénicos asociados con melanoma. Se preparan CTLs de muestras de leucoféresis generadas en el sitio clínico, y se transfieren a una instalación, en donde se generan CTLs bajo normas generales de GMP y se regresan para infusión. En el día 0, los pacientes con melanoma metastásico sufren leucoféresis (prueba de aproximadamente 10 a 15 litros, dependiendo del peso y la condición del paciente). Las células obtenidas se envían durante la noche a temperatura ambiente para procesamiento en una instalación de fabricación GMP. En tiempos apropiados, se realiza leucoféresis para obtener linfocitos de sangre periférica para análisis. Estas muestras se usan para monitorear la presencia de células T específicas del antígeno y la presencia de células tumorales de melanoma circulantes. El monitoreo del procedimiento de leucoféresis procesa aproximadamente 5 litros de sangre periférica (o una tercera parte del volumen colectado en la leucoféresis inicial para obtener células CD8 para infusión subsiguiente) en el sitio clínico, y es enviado a la instalación de fabricación GMP. Se usa una prueba de PCR para determinar una disminución en el nivel de células tumorales de melanoma circulantes después de la terapia. La detección de células tumorales de melanoma circulantes puede medirse por medio de una prueba de PCR en tiempo real cuantitativa sensible. La presencia de células T específicas del antígeno se evalúa con tetrámeros de HLA-A2/específicos de péptidos. La preparación de CTLs final para infusión contiene 1 x 1010 CTLs autólogos en 300 mL, contenidos en 76% (en v/v) de solución lactada de Ringer, 4% (en v/v) de D5NS y 20% (en v/v) de albúmina de suero humano (HSA) a 25%. El producto de CTLs se prepara en una bolsa estéril, adecuada para infusión, mantenida en hielo e infundida durante 30 minutos, dentro de 42 horas de preparación. Antes de la infusión, los CTLs se monitorean para actividad lítica (células objetivo cargadas de péptidos y lisis de células tumorales de melanoma), viabilidad y pureza por análisis por FACS. La ausencia de ADN de células de Drosophila y ARN viral de insecto se verifica con pruebas de PCR en tiempo real cuantitativas sensibles. La esterilidad se determina por análisis BacT/Alert®, prueba para micoplasmas y análisis por tinción de Gram. Los pacientes reciben una infusión de CTLs de aproximadamente 1010 células T autólogas, que han sido estimuladas y expandidas ex vivo hasta llegar a ser linfocitos T citotóxicos capaces de determinar como blanco células que expresan in vivo los antígenos a los cuales los CTLs son dirigidos. Las células son infundidas después del final del tratamiento con IFN-alfa, y preceden inmediatamente al inicio del régimen de IL-2.

Citocinas Se obtiene interleucina-2 (IL-2) de Chiron Corporation (Emeryville, CA). Se provee como viales de un sólo uso que contienen 22 millones de Ul (-1.3 mg) de IL-2 como una torta liofilizada estéril blanca a blanquecina más 50 mg de manitol y 0.18 mg de dodecil sulfato de sodio, regulada en su pH con aproximadamente 0.17 mg de fosfato de sodio monobásico y 0.89 mg de fosfato de sodio dibásico a un pH de 7.5 (escala de 7.2 a 7.8). El polvo es reconstituido con 1.2 ml_ de agua estéril para inyección, USP, y la concentración resultante es de 18 millones de Ul/ml o 1.1 mg/mL. Se almacenan viales intactos en el refrigerador (2°C - 8°C) y se protegen de la luz. La IL-2 reconstituida es diluida además con 2.4 ml_ de agua desionizada a 5%. La concentración final (6 MU/mL), una vez extraída en jeringas de plástico, es adecuada para 14 días después de la reconstitución, si se mantiene refrigerada a 2 a 8°C. La dilución final de IL-2 es auto-administrada subcutáneamente sobre una base de pacientes externos a una dosis de 3 millones de unidades (3 MUI), iniciando inmediatamente después de la infusión de CTLs, y diariamente hasta la progresión de la enfermedad. Se obtiene INTRON-A® de Schering-Plough Corporation (Keniiworth, NJ). Este producto de IFN-alfa-2b se provee como un polvo liofilizado o una solución para inyección en viales estériles de 5 mi. Un vial contiene aproximadamente 3 x 106 U o 18 x 106 U de IFN. El polvo liofilizado es reconstituido de preferencia poco antes de su uso, ya que no existe agente bacteriostático incluido; el polvo liofilizado no usado se almacena en un refrigerador o congelador (-4°C a -20°C). Cuando el agente se provee como una solución inyectable, se almacena en el refrigerador (2°-8°C). La dilución final de IFN-a es auto-administrada sobre una base de pacientes externos a 10 MU/m2 en los días 31 a 35 como una inyección subcutánea.

DABggg IL-2 DAB389 IL-2 (denileukin diftitox, ONTAK®) es una proteína citotóxica derivada de ADN recombinante compuesta de las secuencias de aminoácidos para los fragmentos A y B de la toxina de la difteria, seguidas de las secuencias para interleucina-2 que es expresada en E. coli. Es un fármaco elegido como objetivo, que se une a células que expresan CD25 (IL-2R) sobre su superficie. Interactúa con el receptor de IL-2 de alta afinidad sobre la superficie de células T reguladoras (Treg) normales o malignas que inhiben la síntesis de proteínas intracelulares, llevando rápidamente a muerte de las células. DAB389 IL-2 se provee en viales de un sólo uso como una solución congelada estéril destinada para administración intravenosa (IV). Cada vial de 2 mL de ONTAK contiene 300 mcg de DAB IL-2 recombinante en una solución estéril de ácido cítrico (20 nM), EDTA (0.05 mM) y polisorbato 20 (<1%) en agua para inyección, USP. La solución tiene un pH de 6.9 a 7.2. Se almacenan congelados viales intactos o a -10°C, pero no se vuelven a congelar. El material se lleva a temperatura ambiente (25°C) antes de que se prepare la dosis por descongelación en un refrigerador por no más de 24 horas o a temperatura ambiente por 1 a 2 horas, y se diluye con NS a una concentración > 15 mcg/mL. DAB389 IL-2 se administra por inyección intravenosa, de preferencia por infusión durante por lo menos 15 minutos. Los pacientes asignados al grupo C reciben una inyección subcutánea individual de DAB IL-2 en el día 30, que es un día antes del inicio de IFN-a y seis días antes de la inyección de los CTLs. La dosis es de 18 pg/kg.

Cladribina Leustatin® (2-cloro-2'desoxi^-D-adenosina) es un agente antineoplásico sintético. Es un análogo de nucleósido de purina resistente a la acción de la adenosina desaminasa, que resulta en linfocitotoxicidad preferencial. En células con una alta relación de desoxicitidina cinasa a desoxinucleotidasa (por ejemplo, linfocitos y monocitos), la cladribina es fosforilada en el desoxinucleótido de trifosfato activo, 2-CdATP, que se acumula, causando una interrupción del metabolismo celular, daño del ADN y muerte subsiguiente de las células. El fármaco es una solución isotónica clara, incolora, estéril y libre de conservadores, provista en viales de un sólo uso que contienen 10 mg (1 mg/mL) de cladribina. Cada mL de cladribina contiene 1 mg del ingrediente activo y 9 mg (0.15 mEq) de cloruro de sodio como un ingrediente inactivo. La solución tiene una escala de pH de 5.5 a 8.0. Pueden añadirse ácido fosfórico y/o fosfato de sodio dibásico para ajustar el pH a 6.3 ± 0.3. Los viales intactos se almacenan refrigerados (2 a 8°C). La dosis de cladribina para el grupo B es de 0.12 mg/kg/día para un total de 5 días, fraccionada en 3 a 4 sitios, en donde se administra un máximo de 3.0 cm3 en un sólo sitio. La dosis total de cladribina es de 0.6 mg/kg. Se ha reportado que cladribina, administrada subcutáneamente en este mismo plan (5 días consecutivos) y a una dosis de 0.14 mg/kg/día (dosis total = 0.7 mg/kg), es segura en pacientes con leucemia de células pilosas. Además, la cladribina administrada con este plan y dosis a sesenta pacientes produjo aproximadamente 70% de linfodepleción después de un sólo ciclo con mielosupresión clínicamente segura. Como resultado de un cambio en estandarización, se ha encontrado que Leustatin es 12% mayor que lo que se reporta en estudios clínicos previos comparados con una existencia de cladribina sintetizada en un laboratorio. Se estima ahora que la dosis que se reportó como 0.1 mg/kg, ha sido realmente de sólo 0.087 mg/kg. Respecto a la seguridad de la administración subcutánea con la formulación de Leustatin® fraccionada en 2 a 3 sitios, en un estudio en pacientes con esclerosis múltiple recurrente-remitente se usaron 0.07 mg/kg/día x 5 días, mensualmente por 6 meses, para una dosis acumulativa total de 2.1 mg/kg. Un total de 27 pacientes se distribuyó al azar hacia el brazo de fármaco de tratamiento. Las infecciones fueron limitadas a un episodio de herpes zoster parcial leve que ocurrió en dos pacientes tratados con cladribina y en un paciente que recibió placebo. No hubo casos individuales de trombocitopenia significativa, anemia, granulocitopenia o supresión generalizada de médula.

Cuidado sustentador opcional Los pacientes pueden recibir cualquiera de los siguientes, para suprimir la toxicidad del IFN-alfa y la IL-2 durante el tratamiento y después: acetaminofén (650 mg por la boca cada 4 horas, p.m.), difenhidramina (50 mg IM o por la boca cada 4 horas, por razón necesaria), indometacina (25 mg por la boca tres veces al día, o 75 mg de liberación sostenida cada día), proclorperazina (10 mg IV o por la boca cada 4 horas, por razón necesaria, para la náusea), Zantac® (150 mg dos veces al día, para la gastritis). Otros agentes antiinflamatorios y antieméticos no prescritos específicamente pueden sustituir a cualquiera de los fármacos sustentadores anteriores. Aunque la invención se ha descrito en detalle con relación a ejemplos ilustrativos y modalidades preferidas, el experto en la técnica entenderá que el alcance de la invención no es definido por la descripción anterior, sino por las reivindicaciones anexas según se construyen adecuadamente bajo los principios de la ley de patentes.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- El uso de los CTLs activados, para la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de cáncer en un sujeto, en donde dichos CTLs activados son generados al poner en contacto células T CD8+ no afectadas previamente obtenidas del sujeto con células xenogénicas que presentan antígenos cargadas con uno o más antígenos peptídicos, y en donde dicho medicamento se adapta para ser administrable con por lo menos dos citocinas que efectúen persistencia de CTLS; y un agente de linfodepleción seleccionado del grupo que consiste de cladribina y denileukin diftitox. 2. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde citocinas (por lo menos dos) comprenden interferón-a-2b e interleucina-

2.

3. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde dichos uno o más antígenos peptídicos comprenden una secuencia de aminoácidos derivada de una proteína seleccionada de gp100, tirosinasa y MART-1.

4. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dichos uno o más antígenos peptídicos consisten de antígenos peptídicos derivados de proteínas gp100, tirosinasa y MART-1 humanas.

5. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde cada uno de dichos uno o más antígenos peptídicos se selecciona del grupo que consiste de YMNGTMSQV (SEQ ID NO: 1 ), YMDGTMSQV (SEQ ID NO: 2), AAGIGILTV (SEQ ID NO: 3), ITDQVPFSV (SEQ ID NO: 4), YLEPGPVTA (SEQ ID NO: 5) y KTWGQYWQV (SEQ ID NO: 6).

6. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 5, en donde dicho cáncer es un melanoma.

7. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la administración del agente de linfodepleción comienza antes de la administración del medicamento.