PT1537203E - Utilização de células dendríticas (dcs) expressando interleucina 12 (il-12) - Google Patents

Description

ΡΕ1537203 1 DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS (DCs) EXPRESSANDO INTERLEUCINA 12 (IL-12" O invento está relacionado com a utilização de células dendriticas (DCs) expressando interleucina 12 (IL-12) .

Embora haja progressos consideráveis no desenvolvimento de técnicas para identificar antigénios associados a tumores, os métodos tradicionais para a entrega destes antigénios são, em muitos casos, grosseiros e inadequados. A maioria dos adjuvantes que em principio estão disponíveis foi descoberta empiricamente e os seus mecanismos de acção de estimulação imune estão mal compreendidos. Ainda, os estudos pré-clínicos sugeriram que os adjuvantes mais convencionais suportam a geração de alguns tipos de resposta imune mas não induzem outros braços importantes do sistema imunitário, como seja actividade CTL. Em particular, a geração de imunidade citolítica antitumoral não foi conseguida por tais adjuvantes.

Isto conduz à aplicação de DCs como adjuvantes. Em tais experiências, DCs pulsadas in vitro com antigénio associado a tumores causou a rejeição de tumores em sistemas experimentais de tumores de murganho e aumentou a 2 ΡΕ1537203 imunidade antitumoral em doentes. As DCs capturam e processam antigénios na periferia, migram para órgãos lin-fóides, expressam moléculas co-estimuladoras de linfócitos e secretam citocinas para iniciar e guiar as respostas imunes. O antigénio é apresentado por DCs em moléculas de MHC classe I e classe II, as quais se ligam a péptidos durante a sua maturação biossintética, proporcionando assim continuamente uma apresentação actualizada da composição proteica intracelular e ambiental. Os receptores das células T nos linfócitos T citotóxicos (CTL) reconhecem os péptidos antigénicos ligados a moléculas MHC classe I, enquanto os complexos de MHC classe II-péptido são reconhecidos por linfócitos T auxiliares (HTL)

Alguns estímulos de maturação conduzem a polarização de HTL tipo 1 caracterizada pela produção de IL-12 [Cella, 1996] que, subsequentemente, suporta o desenvolvimento de imunidade citolítica. Outros são incapazes de o fazer e favorecem a polarização de HTL tipo 2 que suporta a imunidade humoral. 0 lipopolissacárido (LPS) é um estímulo de maturação clássico que resulta na secreção de IL-12 pelas DCs [Hilkens, 1997]. No entanto, foi demonstrado [Langenkamp, 2000] que após maturação com LPS as DCs produziram IL-12 apenas transitoriamente e tornam-se refractárias a estimulação posterior. A exaustão da produção de citocinas tem consequências no processo de polarização dos linfócitos T. Cedo, após a estimulação, as 3 ΡΕ1537203 DCs estimulam fortes respostas HTL tipo 1, enquanto mais tarde, as mesmas células estimulam preferencialmente HTLs tipo 2.

Em WO 01/39600 Al, foi descrita a utilização de Hsp27 como agente anti-inflamatório, o qual é usado para a maturação de DCs. Estas DCs, no entanto, não estão carregadas com um antigénio de tumor. Mas antes, o contacto com o antigénio ocorre apenas após a maturação ter ocorrido. Assim, neste documento não pode ocorrer carregamento com antigénio antes da maturação.

Em WO 01/09288 Al, DCs i.a. são preparadas pela adição de TNF-alfa ao meio de cultura. No entanto, é conhecido que TNF-alfa não estimula a molécula de IL-12 heterodimérica completa, mas apenas uma das duas subunidades. Ainda, de acordo com WO 01/09288 Al, o contacto com o antigénio torna-se efectivo apenas após as DCs terem sofrido maturação, pelo que as células ali descritas não estão em qualquer caso carregadas contra um agente patogénico especifico ou um tumor especifico.

Em WO 02/34887 A2, duas classes diferentes de ácidos nucleicos adjuvantes, i.e. CpGs por um lado, e Poli-I:Cs por outro, são usados para a estimulação de DCs. No entanto, foi demonstrado que Poli-I:C e CpG podem libertar IL-12 em DCs humanas apenas com uma eficiência muito baixa. Ainda, de acordo com este documento, um "carregamento" especifico de patogénico ou de tumor das DCs em combinação com a libertação de IL-12 não está descrita. 4 ΡΕ1537203

Em WO 01/51077 Al, são descritos métodos para a regulação da produção de IL-12 por agonistas e antagonistas de CCR5, ainda que ai seja também iniciado com DCs especificamente "carregadas".

Wang et al. (Zhonghua xue ye xue za zhi, 21(7), (2000), pp. 345-348) descrevem que a proliferação de células CD (4) ( + ) após cultura com DCs deverá ser um bom indicador como instrumento para testar o progresso de uma imunoterapia. DCs derivadas de PBMCs foram carregadas com um antigénio tumoral da linha celular XG-7, a qual tende a estimular mais células CD (4) ( + ) do que DCs. No entanto, este documento não descreve a administração de um estimulo de administração.

Felzmann et al., (Câncer Lett. 168 (2001), 145-154) descreve métodos para a maturação de DCs através da exposição a CD40L ou a LPS. Rieser et al., (Urol. Int. 63 (1999), 151-159) descrevem DCs maduras e a indução de respostas imunes em doentes com carcinoma de células renais metásticas. Felzmann et al. (Câncer Lett. 161 (2000) descreve o carregamento de linhas celulares linfoblastóides com toxóide do tétano. Banchereau et al. (Nature 392 (1998), 245-252) revê DCs e o controlo da imunidade. Gitlitz et al. (Curr. Urol. Rep. 2(2001), 46-52) descreve uma imunoterapia de carcinoma das células renais baseada em DCs. Hilkens et al. (Blood 90 (1997), 1920-1926) descreve que DCs requerem factores exógenos indutores de IL-12 para dirigir o fenótipo Thl. 5 ΡΕ1537203 É portanto um obj ectivo do presente invento proporcionar meios para o tratamento de infecções virais e tumores usando DCs. O presente invento proporciona assim células dendriticas activas (DCs) produtoras de interleucina 12 (IL-12) que são carregadas com um antigénio contra um tumor especifico para usar no tratamento de um doente tendo o referido tumor especifico, as referidas DCs são caracte-rizadas por as DCs estarem carregadas com o antigénio contra o tumor especifico e depois tratadas com lipopolis-sacárido (LPS) e interferão gama (IFN-γ) para obter DCs especificas de tumores produtoras de IL-12.

Apesar de ser conhecido que é possível induzir a produção de IL-12 em DCs, este conceito não foi considerado como adequado e necessário para o tratamento de doentes com tumores ou para o tratamento de doentes com infecções virais graves. Isto deve-se principalmente ao facto da IL-12 de DCs ser transitória e portanto adequada para a indução de uma resposta imune celular suficiente contra o tumor ou agente patogénico apenas durante uma janela de tempo limitada. Surpreendentemente, pôde ser demonstrado com o presente invento que a aplicação deste conceito para induzir a secreção de grandes quantidades de IL-12 por DCs, e.g. através da exposição a uma combinação de LPS e IFN-γ em condições de cultura na ausência de soro fetal de vitela, resultou numa estabilização da doença durante um 6 ΡΕ1537203 período prolongado de tempo sem quaisquer efeitos secundários tóxicos importantes. É, no entanto, importante to administrar as DCs de acordo com o presente invento num estado em que a produção de IL-12 ainda ocorre, i.e. imediatamente após a preparação das DCs produtoras de IL-12 específicas de tumor ou de agente patogénico ou pelo menos dentro de 1 a 10, especialmente dentro de 2 a 6 horas, idealmente cerca de 2 horas, após completada a preparação. Assim, o presente invento também está relacionado com um método para administração das DCs de acordo com o presente invento, numa quantidade eficaz, a um doente com tumor ou a um doente infectado com o agente patogénico específico.

De facto, o tratamento proporcionado pelo presente invento é bem tolerado. Poderá assim ser demonstrado pelo presente invento que tais DCs, ao contrário das DCs exaustas não produzem mais IL-12, foram capazes de induzir imunidade citolítica num modelo in vitro humano e de rejeição de tumores num modelo de tumor em murganho. Os primeiros resultados preliminares de uma fase I de ensaios clínicos do presente invento estão descritos na secção dos exemplos do presente pedido, os quais mostram a exe-quibilidade e ausência de toxicidade de uma imunoterapia com DC-ATIT secretora de IL-12 (imunoterapia antitumoral) para o tratamento de cancro.

Um outro método para induzir IL-12 a partir de DCs é a indução de um sinal mediado pela interacção das moléculas de CD4 na superfície de DCs com o seu ligando 7 ΡΕ1537203 CD40L. A combinação de LPS e IFN-γ mostrou a melhor estimulação de IL-12 nas presentes circunstâncias do ensaio terapêutico de fase I de acordo com o presente invento. A utilização ou método de acordo com o presente invento é igualmente preferida para doentes que tenham sido submetidos a transplante de medula óssea e que tenham sofrido uma infecção virai, causada por imunodeficiência, no decurso do transplante de medula óssea e antes do tratamento com as DCs de acordo com o presente invento. 0 presente invento pode ser usado para uma larga gama de tumores. De preferência, o tumor especifico a ser tratado com as DCs de acordo com o presente invento é o tumor maligno sólido numa fase avançada. Em principio, qualquer tumor, em qualquer fase, pode ser o alvo de uma resposta imune citolitica induzida por DCs de acordo com o presente invento. 0 presente invento é, de preferência, realizado usando DCs autólogas. Assim, prefere-se usar DCs ou células precursoras de DCs retiradas do doente com a infecção com o referido agente patogénico ou do doente com o referido tumor especifico ou de um dador no contexto de um transplante de medula óssea. Estas DCs autólogas estão associadas às reacções adversas mais baixas, devido a serem reconhecidas como "próprias" pelo sistema imune do doente. O carregamento das DCs pode ser realizado com 8 ΡΕ1537203 qualquer antigénio ou mistura de antigénios específicos do tumor, e.g. com polipéptidos isolados ou produzidos por síntese química ou por técnicas recombinantes. De preferência, no entanto, as DCs são carregadas com um antigénio derivado de um lisado de células tumorais do referido doente tendo o referido tumor específico. Tais preparações de tumor autólogas apresentam um sucesso importante em ensaios clínicos de acordo com o presente invento.

Para o seguimento e controlo adequados da administração das DCs e da resposta imunonológica do doente às mesmas, prefere-se carregar as DCs também com um antigénio marcador, especialmente com hemocianina de lapa (KLH) . Em princípio, cada neoantigénio, ou seja um antigénio a que o sistema imune humano nunca antes foi exposto, é adequado como um antigénio marcador.

De forma a estimular mais a resposta imune do presente invento pode ser preferido carregar também as DCs com um adjuvante, especialmente com toxóide do tétano. Em princípio, qualquer antigénio retornado, ou seja um antigénio contra o qual se pode esperar uma forte resposta imune devido a várias vacinações de rotina anteriores, é adequado como antigénio adjuvante. A fonte de DCs não é crítica, . Uma vez que a preparação de DCs a partir de células mononucleadas do sangue periférico (PBMCs) é uma técnica convencional, é igualmente preferida para gerar as DCs, a serem usadas de 9 ΡΕ1537203 acordo com o presente invento, a partir de células mononucleadas do sangue periférico (PBMCs) , especialmente PBMCs do doente para quem as DCs devem ser transferidas após carregamento.

As células activadas de acordo com o invento são DCs produtoras de interleucina 12 (IL-12) que são carreagadas com um antigénio contra um tumor especifico.

As DCs activadas de acordo com o presente invento podem, de preferência, ser carregadas com um antigénio derivado de uma célula tumoral. Aquele antigénio pode ser gerado por lise das células tumorais ou do tecido tumoral, o antigénio tumoral pode ser gerado em qualquer sistema de expressão recombinante ou pequenos péptido derivados do antigénio tumoral podem ser gerados por sintese quimica.

De acordo com uma realização preferida, as DCs activadas de acordo com o presente invento são ainda carregadas com um antigénio marcador. 0 invento é ainda descrito pelos exemplos que se seguem e pelas figuras apresentadas, ainda que não lhes estando restringido.

Figura 1: Fenótipo imune de DCs imaturas e maduras. Descreve-se um fenótipo imune típico de DCs antes (histograma aberto) e depois (histograma fechado) exposição a um estímulo de maturação com LPS/IFN-γ. 10 ΡΕ1537203

Figura 2: Reacção de leucócitos mistos. As DCs foram maturadas com LPS/IFN-γ e usadas para induzir a proliferação em linfócitos alogeneicos. Como controlo positivo, foram usados os superantigénios SEA e SEB. Está apresentada a média ± DMP de 18 experiências independentes.

Figura 3: Produção do heterodimero p70 de IL-12 pelas DCs. As culturas de DCs foram maturadas com LPS/IFN-γ e a secreção de IL-12 foi determinada após 24 horas. São apresentados dados individuais e média ± DMP (lado direito) de 23 experiências independentes.

Figura 4: Expansão especifica de antigénio de linfócitos T autólogos, DCs activas (círculos cheios, n = 10) e exaustas (círculos vazios, n = 10) carregadas com lisado autólogo solúvel de LCLs foram usadas para a expansão específica de antigénio de linfócitos T. Está apresentado o número absoluto de células como média ± DMP nos dias de re-estimulação numa escala logarítmica.

Figura 5: Distribuição de subséries de linfócitos T CD3-positivos durante a expansão específica de antigénio. DCs activas (painel superior, n = 10) e DCs exaustas (painel inferior, n = 10) carregadas com lisado derivado de LCLs autólogos foram usadas para estimular linfócitos T autólogos, semanalmente, durante quatro semanas. A distribuição das subséries de linfócitos T CD3-positivos foi determinada semanalmente por fenotipagem imune (HTLs 11 ΡΕ1537203 CD4-positivos, barras a cheio; CTLs CD8-positivos, barras vazias) . A percentagem das subpopulações é dada como média ± DMP nos dias de re-estimulação.

Figura 6: Actividade citolitica dos linfócitos T após expansão específica de antigénio. DCs activas (círculos a cheio, n=3) e DCs exaustas (círculos abertos, n = 5) carregadas com lisado derivado de LCLs autólogos foram usadas para estimular linfócitos T autólogos semanalmente durante guatro semanas. No dia 28, foi analisada a actividade citolitica da população de linfócitos T expandida. Está apresentada a percentagem de lise específica como média ± DMP nas proporções indicadas de efector/alvo.

Figura 7: Fenótipo imune de DCs de murganho imaturas e maduras. Um fenótipo imune típico de DCs antes (histograma vazio) e após (histograma cheio) exposição a um estímulo de maturação com LPS/IFN-γ. São descritos os resultados de uma experiência representativa.

Figura 8: Concentração do hetrodímero p70 de IL-12 nos sobrenadantes de cultura após diferentes períodos de estimulação com LPS/IFN-γ. As DCs foram lavadas 2 horas após a estimulação com LPS/IFN-γ e novamente cultivadas durante 24 horas em meio de cultura de DCs ou deixadas durante 24 horas em meio sem remoção de LPS e IFN-γ. Os 12 ΡΕ1537203 dados destas experiências estão apresentados como média ± DMP.

Figura 9: Protecção de murganhos de um tumor expressando NPT como antigénio modelo. Grupos de 5 murganhos foram imunizados como indicado com DCs activas ou exaustas ou reagentes controlo. As DCs foram carregadas com lisado K-Balb-NPT (barras a cheio), proteína NPT recombinante (barras a tracejado) ou péptidos sintéticos derivados de NPT (barras abertas) . Para a exposição a tumor, foram usadas células tumorais selvagens K-Balb e células tumorais K-Balb-NPT. Os controlos foram expostos a células tumorais K-Balb-NPT. Está descrita uma experiência representativa.

EXEMPLO

MÉTODOS

Geração de células dendriticas humanas Células mononucleadas do sangue periférico (PBMCs) foram colhidas por leucaferese (Amicus, Baxter, Vienna, Áustria). 0 produto da leucaferese foi diluído com PBS 1:5 e a solução de Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) foi colocada por debaixo. O gradiente foi centrifugado 30 min a 2200 rpm, 18° a 20°C, sem travão. A camada de PBMCs foi transferida para um outro tubo de centrífuga e as células lavadas com PBS em excesso. 13 ΡΕ1537203

Os PBMCs foram contados num aparelho Sysmex F820, Japan) e congelados em alíquotas adequadas. Para a geração de DCs uma alíquota dos PBMCs foi descongelada e contada. Um milhão de DCs/ml foram cultivados em meio AIM-V (Invitrogen Corporation, Bethesda, MD) com 1% de plasma humano AB reunido (Octaplas, Octapharm, Vienna, Áustria) durante duas horas, a 37°C, numa incubadora humidificada. As células não aderentes foram removidas lavando cuidadosamente a placa. As células aderentes foram cultivadas durante 5 dias em meio AIMV-V suplementado com 25 de plasma humano, 400 U/ml de IL-4 (Pan Biotech GmbH, Aidenbach, Germany) e 1000 U/ml de GM-CSF (Roche, Basel, Switzerland). No dia 5 as células foram recuperadas, lavadas com PBS e ressuspensas em AIM-V sem plasma. Um milhão de DCs/ml foi exposto a 1-10 pg de antigénio durante 2 h a 37°C. Sem lavagem a cultura de DCs foi suplementada para uma concentração final de 200 U/ml de LPS (US Pharmacopeia, Rockville, MD) , 50 ng/ml de IFN-γ (Boehringer Ingelheim, Vienna, Áustria), 400 U/ml de IL-4, 1000 U/ml de GM-CSF e plasma humano para uma concentração final de 2%. As células foram incubadas durante 2 horas a 37°C para aplicação como DCs activadas produtoras de IL-12 e durante 48 horas para aplicação como DCs exaustas. Após completado o passo de maturação as DCs foram lavadas duas vezes com PBS.

Geração de células dendriticas de murganho

Ao contrário das DCs humanas, as DCs murinas foram geradas a partir de células estaminais da medula 14 ΡΕ1537203 óssea. Em tudo o resto o procedimento é semelhante ao do sistema imune humano. As células estaminais da medula óssea de murganhos Balb/c foram colhidas dos ossos longos cortando as extremidades dos ossos e injectando a cavidade medular com uma seringa pequena. As células da medula óssea foram cultivadas em meio RPMI (Invitrogen Corporation, Bethesda, MD) com 10% de soro fetal de vitela (PAA Laboratories, Linz, Áustria) durante 6 dias na presença de 5 ng/ml de IL-4 murina e 3 ng/ml de GM-CSF (ambos adquiridos à Invitrogen Corporation, Bethesda, MD) numa placa de 24 alvéolos a uma densidade de 106 DCs/alvéolo. O carregamento com o antigénio é feito da mesma forma que para as DCs humanas (ver atrás) . Para a maturação é usado LPS numa concentração de 100 ng/ml e IFN-γ (Invitrogen Corporation, Bethesda, MD) foi usado numa concentração de 10 ng/ml. A comissão para a segurança animal da University of Vienna Medicai School aprovou todas as experiências com animais.

Fenotipagem imune

O fenótipo imune foi analisado antes e após a maturação de acordo com procedimentos convencionais. Os receptores Fc de IgG são bloqueados pela adição de 50 μΐ de solução de IgG a 4% a cada tubo a testar. Para a análise de DCs humanas foram usados os seguintes pares de MABs: IgG FITC-CD14 PE; MHC II FITC-MHCI PE; CDla FITC-CD83 PE; CD86 FITC-CD80 PE. Para a análise de DCs de murganho, foram usados os MABs CDllb PE, CDllc FITC, MHC II PE, CD80 PE, 15 ΡΕ1537203 CD40 FITC, CD86 PE. Os MABs foram comprados à DAKO, Glostrup, Denmark, Immunotech, Marseille, France ou Invitrogen Corporation, Bethesda, MD. Fez-se citometria de fluxo usando um aparelho FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Reacção de leucócitos mistos

Foram isolados PBMCs por centrifugação em gradiente do sangue periférico como descrito atrás e ressuspensos em AIM-V/2% de plasma humano. AS DCs (10000, 2000 ou 400) foram colocadas em triplicados (100 μΐ por alvéolo) numa placa de 96 alvéolos de fundo redondo e 105 MNCs alogeneicos em 100 μΐ de meio foram adicionados a cada um dos alvéolos. Para uma referência positiva 105 MNCs foram estimulados em 100 μΐ de meio com enterotoxina de estafilococos A/B (SEA/SEB, Toxin Technologies Inc. Sarasota, FL) para 100 ng/ml de concentração final. A mistura de células foi incubada durante 4 dias. No dia 4, 25 μΐ de solução de timidina triciada (NEN Life Science Products, Boston, MA) foram adicionados a cada alvéolo e as células foram incubadas durante mais 18 horas. Finalmente, as células foram colhidas com um sistema de colheita Skatron (Skatron, Lier, Norway) e a timidina triciada incorporada foi contada num contador beta Trilux (Wallac Oy, Turku, Finland). ELISA para IL-12 O número adequado de alvéolos foi revestido com 16 ΡΕ1537203 anticorpo anti-IL-12 (Invitrogen Corporation, Bethesda, MD) em PBS e a placa foi incubada durante a noite a 4°C. No dia seguinte, a placa foi lavada, 250 μΐ de solução de bloqueio (2% albumina sérica bovina em PBS) foram adicionados e a placa foi incubada à temperatura ambiente durante 3 horas. A placa foi lavada novamente e as amostras e os padrões de IL-12 (Invitrogen Corporation, Bethesda, MD) foram adicionados na diluição adequada. As concentrações padrão foram 2500, 500, 100, 20 e 4 pg/ml. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante a noite. Após um outro passo de lavagem, 75 μΐ da solução de anticorpo biotinilado anti-IL-12 (Invitrogen Corporation Bethesda, MD) foram adicionados, a placa foi incubada à temperatura ambiente durante 4 horas, lavada novamente e 75 μΐ de solução de estrepta-vidina-fosfatase alcalina (Chemicon, Temecula, CA) foram adicionados. Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, foi adicionado 100 μΐ de PNPP (Sigma, St. Louis, MO) em tampão de dietanolamina (48 ml de dietanolamina 10M, 0,25 ml de MgCl2 1M, 20 ml de HC1 3M, ajustado a 500 ml com água e pH = 9,8) e a placa foi incubada 50 minutos, no escuro, à temperatura ambiente. Finalmente, 50 μΐ de NaOH 3M foi adicionado para parar a reacção e a placa foi medida com um leitor de placas de ELISA (Anthos, Salzburg, Áustria) a 405 nm usando 690 nm como comprimento de onda de referência.

Indução in vitro de uma resposta imune citolitica

Linhas de células B linfoblastóides (LCL) transformadas com EBV foram geradas por infecção de linfócitos B 17 ΡΕ1537203 com EBV produzido por células B95.8. Os LCLs foram crescidos em meio RPMI (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro fetal de vitela (PAA Laboratories, Linz, Áustria) e L-glutamina. As culturas em crescimento continuo foram transferidas para meio RPMI suplementado com 4% de plasma humano. Prepararam-se lisados de LCLs com cinco ciclos de congelação e descongelação em água estéril. Os componentes particulares foram removidos da solução proteica por centrifugação. A concentração proteica foi determinada usando um ensaio de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Munich, Germany) de acordo com as especificações do fabricante. Os linfócitos autólogos foram expostos a uma proporção previamente optimizada de 5:1 de DCs carregadas com proteina solúvel derivada de LCL. Como controlo negativo foram usados LCLs não carregados. As culturas foram mantidas em meio X-VIVO 15 (Bio-Whittaker, Watersville, MD) suplementado com 1% de plasma humano e 10 ng/ml de IL-2 ("Proleukin", Chiron, Emeryville, USA) a uma concentração de partida de 1 x 106 linfócitos/ml. Os linfócitos foram re-estimulados semanalmente durante quatro semanas. O número de células foi determinado usando um aparelho Coulter Z2 (Coulter, Hialeah, FL). A distribuição de subséries foi analisada por citometria de fluxo usando anticorpos monoclonais contra CD3, CD4 e CD8 (todos adquiridos à Invitrogen Corporation, Bethesda, MD) de acordo com procedimentos convencionais. A actividade citolitica gerada nas culturas de linfócitos T foi determinada contra células alvo autólogas 18 ΡΕ1537203 e alogeneicas. As LCLs foram lavadas em meio e ressuspensas em 1 ml de tampão contendo EUCI3 80 μΜ (Fluka, Buchs, Switzerland) , DTPA-Na2 400 μΜ, 250 pg/ml de dextransulfato (PM 500000), Hepes 50 mM (pH 7,4), NaCl 93 mM, MgCl2 2 mM e KC1 5 mm (todos da Merck, Darmstadt, Germany) e incubados durante não mais de 15 min, a 4°C, com agitação numa roda giratória. Subsequentemente, adicionou-se 20 μΐ de CaCl2 e continuou-se a incubação durante mais 5 min e lavou-se 3 vezes num tampão contendo Hepes 50 mM (pH 7,4), NaCl 93 mM, MgCl2 2 mM, KC1 5 mM, CaCl2 2 mM e glucose 10 mM. O sedimento foi ressuspenso em 20 ml de meio e pré-incubado numa plataforma de agitação em frascos de cultura de tecidos de 75 cm2, durante 40 min, a 37°C. Finalmente, as células foram novamente lavadas, ressuspensas em meio e ajustadas a 5 x 104/ml. 100 μΐ desta suspensão celular foram transferidos para o número adequado de alvéolos numa placa de 96 alvéolos de fundo redondo. Foram acrescentados outros alvéolos para determinação da libertação espontânea e máxima (esta última pela lise das células em 1% Triton X-100) de Eu pelas LCLs. Os linfócitos T pré-estimulados foram colhidos, lavados uma vez e ajustados a uma proporção de efector/alvo de 25/1, 12,5/1 e 6,25/1 (volume final de 200 μΐ) . A placa foi centrifugada a 500 rpm durante 5 min sem travão. Após 4 horas de incubação a 37°C, a placa foi centrifugada novamente e 25 μΐ do sobrenadante foram transferidos para uma placa de 96 alvéolos de fundo plano e guardados a 4°C. Antes da medição, foram adicionados 200 μΐ de solução de estimulação, a placa foi cuidadosamente agitada e a fluorescência foi analisada por fluorimetria 19 ΡΕ1537203 resolvida no tempo num contador de múltiplas marcas Wallac 1420 VICTOR (Wallac, Turku, Finland). Os resultados foram calculados como percentagem de lise especifica pela fórmula: % Lise = (Contagens experimentais - libertação espontânea) x 100 / (Libertação máxima - libertação espontânea).

Modelo tumoral em murganho

Usou-se a linha celular de tumor de murganho K-Balb que é singeneica relativamente aos murganhos Balb/c. Esta linha celular foi manipulada para expressar fosfo-transferase da neomicina (NPT) através de transferência de genes com retrovirus. Esta proteína xenogeneica serviu como um antigénio artificial de tumor em experiências de imunização. Foram usadas três fontes de antigénio. Primeiro, a proteína recombinante NPT foi gerada num sistema de expressão bacteriano comercial (Qiagen, Hilden, Germany) que possui uma cauda de histidinas para a purificação de proteína de acordo com a recomendação dos fabricantes. Segundo, a sequência de NPT foi analisada relativamente a péptidos nonaméricos que possuem uma elevada probabilidade de se ligarem a moléculas de H2b e serem apresentadas pelas DCs de murganhos Balb/c. Para esta análise, foi usada a base de dados "SYFPEITHI" de ligandos de MHC e motivos peptídicos (http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com). Encontrou-se que os dois péptidos GYDWAQQTI e PVLFVKTDL possuem a maior probabilidade de ligação. A fonte do terceiro antigénio foi lisado total de células tumorais, obtido 20 ΡΕ1537203 através de cinco ciclos de congelação e descongelação com um passo subsequente de centrifugação para remover componentes particulares do lisado. A concentração proteica destes lisados foi determinada na mesma forma que a concentração proteica de lisados derivados de LCL (ver atrás).

As DCs foram carregadas com 1 yg/ml de péptidos sintéticos derivados de NPT, proteína NPT recombinante ou 10 yg/ml de lisado de K-Balb-NPT através de incubação das DCs durante 2 horas em meio sem soro. Subsequentemente, sem lavagem prévia, adicionou-se soro às culturas e as DCs receberam o estímulo de maturação LPS/IFN-γ durante 2 ou 24 horas. Após maturação, as DCs foram lavadas duas vezes em PBS e recuperadas em NaCl numa concentração de 107 DCs/ml. Um milhão de DCs carregadas com antigénio e maduras foram injectadas subcutaneamente no dorso de murganhos Balb/c rapados, em grupos de cinco murganhos. A imunização foi repetida após 1 semana e após mais 2 semanas os murganhos foram expostos a 106 células K-Balb ou K-Bal-NPT que foram crescidas em meio sem soro fetal de vitela durante pelo menos uma semana antes da injecção. As células tumorais foram injectadas subcutaneamente no flanco oposto dos murganhos e o crescimento de tumores foi controlado.

Desenho de ensaios clínicos

Foram recrutados doentes pediátricos com tumores sólidos da infância que esgotaram todas a opções de tratamento convencionais. O tecido tumoral foi obtido por 21 ΡΕ1537203 cirurgia e destruído mecanicamente para gerar uma suspensão de células isoladas. A proporção de células de tumor e de estroma foi avaliada num laboratório de diagnóstico por hibridação in situ de fluorescência (FISH) , de acordo com procedimentos convencionais usando marcadores informativos para anomalias citogenéticas das células tumorais. As suspensões de células isoladas continham 50-90% de células tumorais. A comissão de ética do St. Anna Children's Hospital, Vienna, Áustria aprovou este ensaio clínico. Células mononucleadas de sangue periférico foram colhidas de doentes por leucaferese e as DCs geradas como aqui descrito. As DCs foram carregadas com 10 yg/106 DCs/ml de lisados de células tumorais autólogas geradas através de cinco ciclos de congelação e descongelação e remoção de partículas por centrifugação. A concentração da proteína solúvel foi determinada como descrito para os lisados derivados de LCL. Ainda, as DCs foram carregadas com hemocianina de lapa (KHL) que foi usada como antigénio marcador em ensaios de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) e com toxóide do tétano (TT) como adjuvante (ambas as substâncias foram compradas à Calbiochem, San Diego, CA) . Subsequentemente as DCs receberam um estímulo de maturação com LPS/IFN-γ durante 2 horas. As DCs carregadas com antigénio foram lavadas três vezes e misturadas numa proporção de 1:1 com células de tumor autólogas irradiadas. As DCs (1-10 x 106/m2) foram injectadas perto dos nódulos linfáticos sem tumor em intervalos semanais, durante três semanas, com um período de repouso de três semanas após 22 ΡΕ1537203 três injecções. Este procedimento foi repetido três vezes. Os doentes receberam ainda tratamento com IFN-γ para estimular a expressão de moléculas de MHC classe I contribuindo assim para evitar o escape à imunidade citolitica. IFN-γ foi administrado durante três semanas de aplicação da vacina contra o tumor através de três injecções subcutâneas por semana em dosagens convencionais.

Uma avaliação básica dos parâmetros clínicos e laboratoriais assim como monitorização da doença foram realizadas, antes e após tratamento, pelos métodos adequados. Outro diagnóstico foi realizado quando clinicamente necessário. Os efeitos secundários do tratamento foram avaliados de acordo com os padrões da WHO. Os testes de DTH contra KLH e contra células de tumor irradiadas foram usados para avaliar a eficiência do procedimento de imunização. 0 lisado de células tumorais (1 yg em 100 μΐ de NaCl), KLH (1 yg em 100 yl de NaCl), 100 yl de meio de cultura de DCs ou 100 yl de NaCl foram injectados intradermicamente. O inchaço e a vermelhidão no local de injecção foram usados como medida da indução de uma resposta imune.

RESULTADOS 1. Análise de células dendríticas humanas 1.1. Fenótipo imune DCs imaturas foram geradas e sujeitas a um 23 ΡΕ1537203 estímulo de maturação com LPS/IFN-γ. 0 fenótipo imune foi analisado, antes e após maturação, relativamente à regulação positiva do marcador de DCs CD83, regulação positiva das moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86, regulação positiva de moléculas MHC classe I e MHC classe II e regulação negativa do marcador de monócitos CD14. Foi igualmente incluída uma análise da molécula CDla que é suposta ser regulada positivamente nas DCs imaturas, é o marcador comum de leucócitos CD45 e nos controlos de isotipo. Todos os marcadores mostraram a modulação tipicamente esperada excepto CDla, o qual parece ser uma característica das DCs cultivadas em meio suplementado com plasma humano em vez de soro fetal de vitela (figura 1). 1.2 Reacção de leucócitos mistos DCs maduras foram cocultivadas com PBMCs alogeneicos de forma a analisar a capacidade estimuladora de DCs. Foi consistentemente demonstrado que as DCs expostas a um estímulo de maturação com LPS/IFN-γ podiam induzir proliferação de linfócitos alogeneicos que foi comparável quando da utilização dos superantigénios SEA e SEB como estímulo de proliferação (figura 2). 1.3 Secreção de IL-12 0 sobrenadante de culturas de DCs 24 horas após exposição ao estímulo de maturação com LPS/IFN-γ foi colhido e a concentração das moléculas heterodiméricas p70 - 24 - ΡΕ1537203 de IL-12 foi determinada. A concentração média de IL-12 foi de 2,4 ± 0,4 ng/106 DCs/ml (Figura 3) . As DCs que foram maturadas durante 2 horas e novamente cultivadas durante 24 horas produziram quantidades quase iguais do heterodimero de IL-12 p70 às DCs que foram maturadas durante 24 horas. 2. Geração in vitro de imunidade citolitica

As DCs foram carregadas com proteína solúvel derivada do lisado de células LCL e usadas para estimular linfócitos T autólogos. A estimulação foi repetida quatro vezes em intervalos semanais. No dia da estimulação o número de células foi registado e a percentagem de HTLs e CTLs foi determinada. A actividade citolitica das culturas foi analisada num ensaio de CTL no dia 28. A capacidade estimuladora de DCs "activas" secretoras IL-12 foi comparada com a capacidade estimuladora de DCs "exaustas" que não produzem mais IL-12.

2.1 Expansão especifica de antigénio dos linfócitos T

Uma expansão específica de antigénio aproximada-mente igual dos linfócitos T obtendo 5311198 milhões de linfócitos T foi observada quando as DCs foram usadas para estimulação e 3181228 milhões de linfócitos T quando se usa DCs exaustas para a estimulação (Figura 4) . Igualmente em pontos mais precoces não se observaram diferenças impor- 25 ΡΕ1537203 tantes na cinética de crescimento de linfócitos T específicos de antigénio, mesmo apesar dos linfócitos T expostos a DCs activas tenderem a proliferar melhor comparativamente com a exposição a DCs exaustas. 2.2 Distribuição de subpopulações de linfócitos T durante a expansão especifica de antigénio

Em cada nova estimulação foi determinada a distribuição de subséries de linfócitos T CD3-positivos por fenotipagem imune (Figura 5) . Quando se usou DCs activas secretoras de IL-12 (n = 10) foi observado um declínio gradual na percentagem de HTLs CD4-positivas (de 77 ± 4% para 4 4 ± 7%) acompanhado de um aumento relativo dos CTLs CD8-positivos (de 23±6% para 56±7%). Pelo contrário, quando DCs exaustas (n=10) foram usadas na estimulação de linfócitos T, tanto a percentagem de HTLs (79±4% no dia 7 e 73±3% no dia 28) como a percentagem de CTLs (21 ±4 no dia 7 e 27±3% no dia 28) permaneceu estável. Isto resultou numa percentagem significativamente superior de HTLs quando comparando culturas que foram estimuladas com DCs exaustas com culturas que foram estimuladas com DCs activas (p = 0,0016 no dia 28). O efeito oposto foi encontrado por comparação da percentagem de CTLs que foi significativamente superior após estimulação com DCs activas comparativamente com a estimulação com DCs exaustas = 0,0016 no dia 28). 26 ΡΕ1537203 2.3 Actividade citolítica de linfócitos T após expansão especifica de antigénio

Os linfócitos T foram expostos a DCs activas carregadas com lisado de LCL secretoras de IL-12 (n = 3) ou com DCs exaustas (n = 5) que não produzem IL-12. As culturas foram novamente estimuladas semanalmente durante quatro semanas e sujeitas a análise da actividade citolítica no dia 28. A lise específica atingiu 5519% após estimulação com DCs activas comparativamente com 1215% após estimulação com DCs exaustas (p = 0,0034) na proporção efector/alvo mais elevada de 25/1. A mesma tendência foi evidente numa proporção efector/alvo de 12,5/1 (2717% vs 712%, p = 0,0125) e 6,25/1 (3018% vs 411%, p = 0,0047). 3. Análise de células dendriticas murinas 3.1 Fenótipo imune DCs murinas foram maturadas com LPS/IFN-γ e o fenótipo imune de DCs imaturas e maduras foi analisado. MABs dirigidos contra CDllb, CDllc, MHC II, CD80, CD40, CD86 foram usados para caracterizar o estado de maturação de DCs. O fenótipo típico CDllb/CDllc de DCs maduras foi consistentemente detectado. Foi igualmente observada a regulação positiva das moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86, assim como das moléculas CD40 e MHC II. 27 ΡΕ1537203 3.2 Secreção de IL-12 0 teor do sobrenadante de cultura de DCs foi analisado relativamente à presença de IL-12 um dia após a exposição ao estimulo de maturação LPS/IFN-γ. DCs foram lavadas 2 horas após a estimulação com LPS/IFN-γ e novamente cultivadas durante 24 horas em meio de cultura de DCs (DCs activas) ou deixadas durante 24 horas em meio sem remoção de LPS e de IFN-γ (DCs exaustas) . Em geral, cerca de 2 ng/106 DCs/ml foram detectadas (Figura 8). As DCs que foram maturadas durante 2 horas produziram quantidades quase iguais do heterodimero de IL-12 p7 0 que as DCs que foram maturadas durante 24 horas. 4. Indução de imunidade anti-tumoral num modelo de tumor de murganho.

Tendo obtido evidência sugestiva para o papel importante de IL-12 na indução de uma resposta imune citolitica in vitro, tentou-se confirmar estes dados in vivo. Para este fim, desenhou-se um modelo de tumor murino que permitiu imunizar contra um antigénio modelo especifico. A linha de células tumorais K-Balb foi manipulada para expressar a proteína bacteriana NPT, a qual confere resistência ao análogo da neomicina G418. Foi igualmente produzida proteína recombinante num sistema de expressão bacteriano e purificada por afinidade. Finalmente, usou-se um programa informático para previsão de epítopos para identificar péptidos nonaméricos derivados de NPT com uma 28 ΡΕ1537203 elevada probabilidade de ligação às moléculas apresentadoras de antigénio H-2b de DCs de murganhos Balb/c. DCs imaturas foram carregadas com os péptidos nonaméricos sintéticos derivados de NPT, proteina NPT recombinante ou proteina solúvel obtida a partir de células K-Balb-NPT por procedimentos repetidos de congelação e descongelação. As DCs carregadas foram expostas a LPS/IFN-γ durante 2 horas e injectadas nos animais em grupos de 5 murganhos como DCs activas secretoras de IL-12 ou maturadas durante 24 horas com LPS/IFN-γ, lavadas e injectadas como DCs exaustas que perderam a sua capacidade para produzir IL-12. Nos grupos controlos os murganhos foram injectados com células tumorais K-Balb-NPT, proteina recombinante NPT, péptidos sintéticos derivados de NPT ou DCs não carregadas. Os murganhos imunizados foram expostos a células K-Balb-NPT transgénicas para NPT ou com células K-Balb selvagens e o crescimento de tumores foi monitorizado (figura 9).

Independentemente do regime de imunização, os murganhos expostos a células tumorais K-Balb selvagens desenvolveram tumores que cresceram progressivamente. O mesmo aconteceu nos grupos controlo, com excepção de 1 murganho, após imunização com DCs carregadas. Mais importante, nos grupos de murganhos que foram imunizados com DCs activas secretoras de IL-12 e expostas a células tumorais K-Balb-NPT, a maioria dos murganhos foram capazes de rejeitar o tumor (3/5 imunizados com DCs carregadas com lisado K-Balb-NPT, 5/5 imunizados com DCs carregadas com proteina NPT recombinante, 4/5 imunizadas com DCs carre- 29 ΡΕ1537203 gadas com péptido sintético). Pelo contrário, quase todos os murganhos imunizados com DCs exaustas foram incapazes de rejeitar tumores K-Balb-NPT (1/5 imunizado com DCs carregadas com lisado de K-Balb-NPT, 0/5 imunizadas com DCs carregadas com proteína NPT recombinante, 1/5 imunizados com DCs carregadas com péptidos sintéticos). Todos os murganhos expostos a células de tumor selvagem K-Balb desenvolveram tumores que cresceram progressivamente, demonstrando evidência de uma reposta específica de antigénio dirigida contra a proteína NPT expressa pelas células tumorais K-Balb-NPT.

Fase I de ensaio clinico para demonstrar a exequibilidade e ausência de toxicidade de uma imunoterapia imune com DCs secretoras de IL-12

Foram incluídos neste ensaio doentes que sofrem de tumores malignos sólidos pediátricos que não tinham mais opções de tratamento convencional. Os principais objectivos foram avaliar a exequibilidade e a toxicidade de DC-ATIT. 20 doentes foram recrutados para o estudo e 12 completaram o tratamento. As terapêuticas imunes individuais com DC-ATIT preencheram todos os critérios de qualidade incluindo um fenótipo imune típico de DCs imaturas e maduras, respectivamente, secreção de 1 a 5 ng IL-12/106 DCs/ml e uma boa capacidade estimuladora numa reacção de leucócitos mistos. A terapêutica imune com DC-ATIT pode ser gerada em quantidade suficiente para completar o esquema de tratamento. ΡΕ1537203 30

Tabela 1:

Doentes incluídos no ensaio clínico de fase I DC-ATIT

Doente Diagnóstico Idade Sexo Ciclos SH001 Carcinoma hepatocelular 15 M 3 TM002 Osteossarcoma 21 M 3 JS003 Carcinoma hepatocelular 10 F 1 BG004 Osteossarcoma 17 F 1 AE005 Osteossarcoma 8 M 3 MR00 6 Carcinoma das células renais 7 M 3 SÍH007 Sarcoma de Ewing 22 F 3 SA008 Carcinoma hepatocelular 13 M 2 LS009 Linfoma não Hodgkin 14 M 0 BT010 Neuroblastoma 20 F 0 AROU Tumor de Wilms 11 F 3 JS012 Carcinoma das células renais 16 F 3 SH(2) 013 Carcinoma hepatocelular 15 M 3 RC014 Tumor de Wolms 12 F 3 JS (2)015 Carcinoma das células renais 16 F 3 NH016 Sarcoma de Ewing 13 F 0 TP017 Sarcoma de Ewing 22 M 0 GK018 Osteossarcoma 15 M 0 MK019 Osteossarcoma 10 F 3 LS020 Osteossarcoma 13 F 3 0 tratamento foi bem tolerado e pode ser dado em ambulatório. Não foram observados ; efeitos secundários tóxicos importantes do tratamento. Febre ligeira , mu i t o 31 ΡΕ1537203 provavelmente devido ao tratamento simultâneo com IFN-γ que foi aplicado com a intenção de regular positivamente in situ a expressão de moléculas MHC classe I em células tumorais, pôde ser controlada com antipiréticos. 0 inchaço no local da injecção das DCs foi tratado localmente com anti-histaminicos.

Como ensaio in vivo para a resposta a DC-ATIT, foram realizados ensaios de hipersensibilidade do tipo retardado. Os doentes foram injectados intradermicamente com células tumorais autólogas irradiadas ou com o antigénio marcador KLH, assim como com um controlo de meio e um controlo negativo. Todos os doentes que completaram o tratamento mostraram uma resposta positiva a KLH. Isto oferece evidência convincente que DC-ATIT tem capacidade para induzir imunidade. No entanto, nestes ensaios não se conseguiu detectar imunidade antitumoral. As injecções dos controlos não resultaram em qualquer resposta.

Todos os doentes tinham idade avançada e tinham uma história de quimioterapia e radioterapia extensiva assim como cirurgias repetidas. Assim, neste ensaio não foi observado regressão objectiva de tumor. No entanto, vários destes doentes tiveram a doença estabilizada durante um periodo de tempo prolongado.

DISCUSSÃO A indução bem sucedida da secreção de IL-12 por 32 ΡΕ1537203 DCs pareceu desempenhar um papel chave na geração de uma resposta HTL tipo 1, a qual suporta a actividade CTL antitumoral [Cells, 1996]. Como resposta a LPS, as DCs produziram IL-12 apenas transitoriamente até cerca de 18 a 20 horas após maturação [Langenkamp, 2000]. Assim, as DCs colhidas em tempos precoces após indução da maturação induziram forte polarização de HTL tipo 1, enquanto as mesmas células colhidas mais tarde induziram células polarizadas HTL tipo 2. Estes resultados indicam uma regulação dinâmica da geração da função de células efectoras.

Observou-se que DCs activas secretoras de IL-12 foram capazes de induzir igualmente a expansão de CTLs e HTLs. Pelo contrário, as DCs exaustas que perderam a capacidade para libertar IL-12 causaramm a expansão predominante de HTLs. Consequentemente, os linfócitos T estimulados pela exposição a DCs activas mas não a DCs exaustas adquiriram a capacidade para a lise específica de células alvo. Foram usados dois sistemas modelo para demonstrar isto. Um foi um modelo humano in vitro que usa DCs carregadas com proteína solúvel de LCLs transformadas com EBV para estimulação de linfócitos T autólogos. A lise específica de antigénio dos LCLs pôde ser demonstrada neste sistema. O segundo modelo foi um modelo de tumor murino. Encontrou-se que os murganhos ficavam protegidos de exposição a tumores após imunização com DCs activas carregadas com antigénio mas não com as DCs exaustas. Ainda, um ensaio clínico piloto de fase I foi iniciado para obter evidência 33 ΡΕ1537203 da exequibilidade e da ausência de toxicidade de DCs secretoras de IL-12.

Respostas imunes citoliticas mediadas por CTLs estão dependentes da apresentação de antigénio via moléculas MHC classe I, as quais derivam os seus péptidos anti-génicos de proteínas do citoplasma, de proteínas próprias sintetizadas endogenamente ou de proteínas não próprias no decurso de uma infecção intracelular. Os actuais paradigmas defendem que apenas as DCs apresentadoras profissionais de antigénios podem induzir uma resposta imune primária. Assim, as DCs teriam de internalizar antigénio não seus de células do corpo infectadas de forma a apresentá-las a CTLs, se elas próprias não forem infectadas e forçadas ou capacitadas para sintetizarem estes antigénios endogenamente. Muitos dados, no entanto, suportam o conceito que nas DCs os antigénios derivados exogenamente e escolhidos são direccionados principalmente para a via de apresentação de antigénios MHC classe II. Para resolver esta aparente contradição, foi colocado o conceito de apresentação cruzada. Suportado por evidência in vitro e in vivo, implica a apresentação de antigénio de origem exógena na via de apresentação de antigénio MHC classe I pelas DCs. No entanto, ultimamente a importância da apresentação cruzada tem sido discutida de forma controversa.

Recentemente, as DCs carregadas ex vivo com antigénios associados a tumores ou derivados de vírus foram usadas para fins terapêuticos em imunoterapia antitumoral ou em imunoterapia adoptiva para infecções virais em 34 ΡΕ1537203 doentes imunocomprometidos. Neste contexto, a apresentação cruzada é de importância central uma vez que, frequentemente, os antigénios são aplicados como proteínas solúveis. As DCs exposta a estes antigénios interiorizam-nos por fagocitose e sem apresentação cruzada seriam processados exclusivamente na via MHC classe II e assim não causariam imunidade citolitica. As condições que favorecem a apresentação cruzada, no entanto, estão mal definidas e a maior parte da evidência da apresentação cruzada de antigénios exógenos a CTLs que resultam em imunidade citolitica antitumoral ou antiviral é indirecta.

Na imunidade antitumoral e antiviral o papel das CTLs recebeu maior atenção devido à maioria dos tumores ou células infectadas com virus expressarem moléculas MHC classe I mas não moléculas MHC classe II. Ainda, as CTLs são capazes de lisar células directamente quando do reconhecimento de complexos péptido-MHC classe I e foi demonstrada a sua capacidade para erradicar grandes massas in vivo. Esta preferência foi apoiada por estudos de transferência adoptiva em que linhas e clones de CTLs, específicos de antigénios restringidos por MHC classe I, que foram estimulados in vitro puderam mediar imunidade antitumoral ou antiviral quando transferidos novamente para os hospedeiros portadores dos tumores. Ainda, descrições recentes sugerem que a imunização usando DCs carregadas com péptidos tumorais pode resultar em imunidade produtiva antitumoral [Nestle, 2001] assim como antiviral [De-Brujin, 1998]. 35 ΡΕ1537203

Uma conclusão implicada pelo presente invento é que as DCs activas precocemente, após maturação com LPS/IFNy, preenchem as condições de apresentação cruzada de antigénios exógenos pelas CTLs. Pelo contrário, DCs exaustas parecem ter perdido a sua capacidade. De acordo com o presente invento, a libertação de IL-12 é usada como marcador para DCs activas [Langenkamp, 2000]. No entanto, é concebível que o efeito de IL-12 nas CTLs seja mediado por HTLs polarizadas do tipo 1 que, por sua vez, suportam apresentação cruzada, expansão de CTLs e actividade citolitica. Uma resposta de linfócitos T com êxito contra antigénios celulares, tais como antigénios derivados de virus ou antigénios associados a tumores, baseia-se em CTLs e em HTLs. No entanto, os HTLs receberam menos atenção, o que é notável considerando o papel pivô destas células na regulação da maioria das respostas imunes especificas de antigénio. Ainda que durante muito tempo se tenha imaginado que a ajuda dos HTLs ao desenvolvimento de CTLs ocorra através da elaboração de linfocinas, evidência mais recente indicou que uma via critica para a entrega de ajuda a CTLs, que estão dependentes de THLs, usa as DCs como um intermediário. Em particular, as interacções entre CD40L e CD40 nos HTLs e as DCs parecem ser criticas na activação das DCs para apresentarem antigénios a precursores de CTLs e co-estimulação da sua sensibilização. Neste cenário, as DCs representam as cadeias de transmissão entre HTLs e CTLs que são especificas de epitopos restringidos por MHC classe II e MHC classe I, respectivamente. Neste contexto, o 36 ΡΕ1537203 resultado de amplificação aproximadamente equivalente de HTLs e CTLs após estimulação com DCs activas mas não com DCs exaustas parece ser de particular importância.

Devido a evidência convincente em ambos os sistemas modelo usados de acordo com o presente invento, foi iniciado um ensaio clinico piloto de fase I. Doentes que sofriam de tumores malignos sólidos avançados da infância foram tratados com DCs activas autólogas produtoras de IL-12 que foram carregadas com proteina solúvel derivada do tumor do doente. Os ensaios clinicos usando DCs carregadas com antigénio tumoral foram realizados para diferentes doenças neoplásicas. No entanto, as DCs usadas nestes ensaios estavam imaturas ou tinham sofrido maturação com TNFoí. Tais DCs não possuem a capacidade de produzir IL-12. Assim, face às presentes experiências pré-clinicas, estas DCs foram consideradas inferiores às DCs secretoras de IL-12 usadas no presente ensaio. Todos os doentes no presente estudo tinham doença avançada e tinham uma história de extensa quimioterapia e radioterapia. Assim, não foi observada regressão objectiva dos tumores nestes doentes. No entanto, alguns dos doentes estabilizaram a doença durante um período de tempo prolongado. A toxicidade do tratamento com a nossa imunoterapia com DCs foi mínima.

Resumindo, encontrou-se num modelo in vitro de ser humano, assim como num modelo in vivo de tumor murino que DCs activas secretoras de IL-12 no início da maturação, 37 ΡΕ1537203 em contraste com DCs exaustas que perderam posteriormente a sua capacidade para secretarem IL-12, suportam a geração de respostas imunes citoliticas in vitro. DCs activas possuem a capacidade de apresentação cruzada de antigénios exógenos em moléculas MHC classe I a CTLs, enquanto DCs exaustas não possuem essa capacidade. A expansão e actividade citolítica de CTLs está criticamente dependente da presença de IL-12. Os resultados descritos no presente invento são importantes para o tratamento adoptivo de infecções virais em doentes imunocomprometidos com linfócitos T específicos de antigénio expandidos ex vivo. Um ensaio clínico piloto de fase I indicou a exequibilidade e a ausência de toxicidade do tratamento de doenças neoplásicas com esta imunoterapia com DCs.

Lisboa, 7 de Maio de 2012

Claims (11)

1 ΡΕ1537203 REIVINDICAÇÕES 1. Células dendríticas (DCs) activas secretoras de interleucina 12 (IL-12), que estão carregadas com um antigénio contra um tumor específico, para serem usadas no tratamento de um doente com o referido tumor específico, caracterizadas por as DCs serem carregadas com o antigénio contra o tumor específico e depois tratadas com lipopolis-sacário (LPS) e interferão gama (IFN-γ) para se obter DCs secretoras de IL-12 específicas de tumor.

2. DCs activas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por o referido tratamento ser realizado após transplante de medula óssea.

3. DCs activas de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadas por o referido tumor específico estar num estado avançado de malignidade.

4. DCs activas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadas por as referidas DCs serem DCs que foram retiradas do doente tendo o referido tumor específico ou da medula óssea do dador.

5. DCs activas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadas por as DCs terem sido carregadas com um antigénio de uma célula tumoral do referido doente tendo o referido tumor específico. 2 ΡΕ1537203

6. DCs activas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadas por as DCs estarem ainda carregadas com um antigénio marcador.

7. DCs activas de acordo com a reivindicação 6, caracterizadas por o referido antigénio marcador ser hemocianina de lapa (KLH).

8. DCs activas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizadas por as DCs estarem ainda carregadas com um adjuvante, especialmente com toxóide do tétano.

9. DCs activas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por as DCs terem sido geradas in vitro a partir de células mononucleadas do sangue periférico (PBMCs).

10. Um kit compreendendo - LPS, - IFN-γ e - um antigénio contra um tumor especifico para proporcionar DCs especificas de tumor secretoras de IL-12, para usar no tratamento de um doente tendo o referido tumor especifico. 3 ΡΕ1537203 reivindicação 10, antigénio de uma o referido tumor

11. Um kit de acordo com a caracterizado por o antigénio ser um célula tumoral de um doente tendo específico. Lisboa, 7 de Maio de 2012