CN101396347B - 一种重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法。该方法先将重组人血管内皮抑制素溶解于含有蛋白稳定剂的缓冲液中，得内水相；再将乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于混合有机溶剂中得内油相；高速分散内水相及内油相的混合溶液，得初乳；将所得初乳置于盛有含乳化剂的植物油或矿物油的搅拌容器中，搅拌形成油包油包水型复乳；持续搅拌挥发内油相中的混合有机溶剂，待微球固化后用微孔滤膜过滤分离，用溶剂洗涤微球表面残留的植物油或矿物油，真空干燥后得到微球成品。采用该方法制备的微球高载药量、高包封率，突释量合适且缓释周期较长。
Description
技术领域
本发明涉及重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法，尤其涉及一种具有高包封率的重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法。
背景技术
20世纪60年代，美国哈佛医学院的Folkman博士提出“肿瘤生长依赖血管生长”这一假设，并于1971年提出“饿死肿瘤疗法”理论。今天，在分子生物学技术的推动下，运用基因工程技术研发出了抗癌蛋白质-恩度。中国专利CN 1237072C罗永章等在天然Endostatin的N末端添加了9个氨基酸，不仅使Endostatin稳定性提高，半衰期延长，而且生物活性增加，蛋白的复性率也高于一般生产方法。该药物已正式上市，命名为恩度，其活性成份为一基因工程蛋白——重组人血管内皮抑制素Endostar，Endostar是以重组DNA技术生产，以大肠杆菌为表达系统，其表达出的Endostar与先前的Endostatin相比较，表达水平更高，疗效更强。它通过阻断肿瘤新生血管生成，从而阻断肿瘤的营养供给，逐步减小肿瘤体积，达到抗肿瘤作用。所生产的重组人内皮抑制素由192个氨基酸构成，其氨基酸序列为：
(M)GGSHHHHHHSHRDFQPVLHLVALNSPLSGGMRGIRGADFQCFQQARAVGLAGTFRAFLSSRLQDLYSIVRRADRAAVPIVNLKDELLFPSWEALFSGSEGPLKPGARIFSFDGKDVLRHPTWPQKSVWHGSDPNGRRLTESYCETWRTEAPSATGQASSLLGGRLLGQSAASCHHAYIVLCIENSFMTASK，其中当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除(其序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)。
蛋白与多肽在很多治疗方面都是理想的药物，然而这些有益的效用最终可能受限于传递蛋白的困难。在口服和透皮给药中，其生物利用度通常很低，并且半衰期短。将蛋白和多肽类药物制备成微球制剂可以减少注射频率，提高患者的顺应性。对蛋白和多肽类药物，微球是相当理想的载药系统。目前有多种蛋白、多肽类药物的缓控释微球处于研发阶段，包括促黄体生成素释放激素拮抗物(LXT-101)，重组人胰岛素样生长激素(rhIGF-I)以及干扰素α2-b(IFNα2-b)等。此外，一些微球制剂已获FDA批准应用于临床，如日本Takeda公司的亮丙瑞林微球Lupron Depot，瑞士Debiopharm公司的曲普瑞林微球Trelstar Depot和瑞士Novartis公司的奥曲肽微球Sandostatin Depot等。
微球是指药物溶解或分散在高分子材料基质中形成的微小球状实体，属于基质型骨架微粒。微球的粒径通常在1μm-300μm之间，药物被制成微球制剂后，有着靶向性、缓释性、安全性等特点。有多种材料可制备微球，近年来可生物降解高分子材料作为微球的基质受到了越来越多的重视，并广泛应用于医学领域的研究。乳酸-羟基乙酸共聚物(poly lactide-co-glycolide，PLGA)是一种生物相容性良好的可降解高分子材料，其主链含有不稳定的酯键，在体内降解后的终产物为水和二氧化碳。并获FDA批准作为医用材料。
目前大多数文献报道的制备蛋白质微球的方法为水包油包水复乳溶剂挥发法，该方法存在最大的缺陷是内水相中的药物在制备中极易通过微球中的孔隙渗漏至外水相，使包封率不高。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种重组人血管内皮抑制素载药量高、突释量合适且缓释周期较长的缓释微球制剂的制备方法。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的：
一种重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法，该方法包括下列步骤：
(1)将重组人血管内皮抑制素溶解于含有蛋白稳定剂的缓冲液中，得到内水相；
(2)再将乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于混合有机溶剂中得到内油相；
(3)以每分钟1000-30000转高速分散内水相及内油相的混合溶液，内水相∶内油相的体积比为1∶2～1∶20，得到初乳；
(4)将所得初乳置于盛有含乳化剂的植物油或矿物油的搅拌容器中，在0～60℃和每分钟100～2000转的速度搅拌形成油包油包水型复乳；
(5)持续搅拌挥发内油相中的混合有机溶剂，待微球固化后用微孔滤膜过滤分离，用溶剂洗涤微球表面残留的植物油或矿物油，真空干燥后得到微球成品。
所述的制备方法，其中所述重组人血管内皮抑制素为重组人血管内皮抑制素Endostar，其在缓冲液中的浓度为1～500mg/ml。
所述的制备方法，其中所述的蛋白质稳定剂包括明胶、硫酸软骨素、山梨醇、木糖醇、甘露醇、海藻糖、碳酸锌、白蛋白、泊洛沙姆中的一种或多种，优选硫酸软骨素；稳定剂在内水相中的浓度按重量体积百分比计为0.1％～20％。
所述的制备方法，其中所述的缓冲液为pH＝3～7的醋酸钠溶液或pH＝5～11的磷酸盐溶液，优选pH＝5.5的醋酸钠溶液或pH＝7.4的磷酸盐溶液。
所述的制备方法，其中所述共聚物为乳酸-羟基乙酸共聚物，乳酸-羟基乙酸分子量大小为5000～150000，其单体组成比例乳酸∶羟基乙酸为99∶1～50∶50，其在混合有机溶剂中的浓度为10～500mg/ml。
所述的制备方法，其中步骤(2)中所述混合有机溶剂为二氯甲烷和乙腈，或二氯甲烷和醋酸，或二氯甲烷和丙酮，或乙酸乙酯和丙酮，或乙酸乙酯和乙腈，二者比例为1∶9～9∶1；或者所述混合有机溶剂为二氯甲烷和乙腈和乙酸乙酯，或二氯甲烷和丙酮和乙酸乙酯，或乙酸乙酯和乙腈和丙酮，三者比例为3∶0.01∶0.01～0.01∶3∶0.01～0.01∶0.01∶3。
所述的制备方法，其中步骤(4)所述植物油为大豆油、玉米油、棉籽油、花生油、茶油的一种或多种；所述矿物油为液体石蜡或二甲基硅油。
所述的制备方法，其中步骤(4)所述植物油的乳化剂为卵磷脂、蔗糖酯的一种或多种，加入量按重量体积百分比计为植物油的0.1～10％，所述矿物油的乳化剂为司盘-80、司盘-60、蔗糖酯的一种或多种，加入量按重量体积百分比计为矿物油的0.1～10％。
所述的制备方法，其中步骤(5)所述的微孔滤膜过滤为过滤微球的技术手段，采用的膜为有机膜，孔径范围0.2μm～2μm。
所述的制备方法，其中步骤(5)所述洗涤微球的溶剂为正己烷、环己烷、正庚烷、石油醚的一种或多种。
本发明的有益效果：
第一，在有机相的溶剂系统中，按一定比例混合多种溶剂，使内油相既不与内水相相溶(保持药物活性)，也不与外油相相溶(使初乳的液滴圆整)，因此在制备中可以形成稳定的复乳，内水相中不稳定的蛋白质药物不与内油相接触，外油相又可以起到悬浮稳定的作用，使形成的微球形态圆整，粒径均一。新开发的多溶剂混合溶剂系统制备的微球粒子更圆整，粒径分布范围更窄，包封率更高。
第二，采用了新的稳定蛋白质手段：将蛋白稳定剂(优选硫酸软骨素)与Endostar结合(说明书给出的蛋白稳定剂不限于硫酸软骨素)，利用新型蛋白稳定剂-Endostar(特别是硫酸软骨素-Endostar)的复合物来制备微球，这一技术显著减少了微球中Endostar的活性损失。
第三，使用乳化剂，特别是蔗糖酯配合传统乳化剂卵磷脂、司盘用于复乳的乳化过程，提高了乳化效率，稳定了外油相中初乳的微小液滴，不仅使制备的微球表面光滑，并且粒径随加入乳化剂的量不同，可制备出平均粒径1μm～300μm的微球。
第四，W/O/O乳化溶剂挥发法避免了常见的W/O/W复乳溶剂挥发法对水溶性药物包封率不高的缺陷，其使用植物油或矿物油作为外油相，有效的阻止了蛋白质在制备中向外渗漏，提高了微球的包封率(达到90％以上)。
第五，该方法制备的微球含水量极低(干燥前约6％)。用传统的液中喷雾干燥法或W/O/W复乳溶剂挥发法制备的微球含水量很高(干燥前约24％)，在真空冷冻干燥的过程中，微球内部的水形成大的冰晶后升华，这一过程扩大了微球内部和表面的孔洞，损害微球内部结构，导致微球突释增大。而用油包油包水乳化溶剂挥发法制备的微球在冷冻干燥前和冷冻干燥后，突释量无显著改变。
第六，该方法得到的微球可调控微球内药物的释放时间，通过改变乳酸-羟基乙酸的分子量和单体比例，可方便调节微球的裂解速率，使微球在体内的释放时间在10天～180天内。
第七，该方法稳定了微球中包裹的重组人血管内皮抑制素，特别是Endostar这一蛋白质生物大分子，通过在内水相添加不同浓度的明胶、山梨醇、木糖醇、甘露醇、海藻糖、碳酸锌、白蛋白，使微球中Endostar的活性保持在80％以上。其中，山梨醇、木糖醇、甘露醇、海藻糖可以减少Endostar与聚合物相互结合；明胶不仅可以保持Endostar在冷冻干燥过程中的活性，作为一种蛋白质，明胶也发挥了其表面活性性质，在制备初乳时迅速增大的油水界面会极大的破坏Endostar的三级结构，明胶比Endostar更易于分布在油水界上。在内水相添加入明胶后，明胶会优先于Endostar分散于油水界面上，减少Endostar与有机相接触的面积，保护了Endostar的三级结构不被破坏。
第八，该方法得到的微球能缓慢的释放药物，稳定的血药浓度更有利于Endostar持续发挥其抗癌药效。
本发明使用油包油包水乳化溶剂挥发法，当药物被聚合物包裹后，能稳定的存在于初乳中，不会向外渗漏，从而获得高载药量，高包封率的微球。
附图说明
图1 PLGA(Mw＝20000，75∶25)Endostar微球的体外释放曲线。
图2 PLGA(Mw＝20000，50∶50)Endostar微球的体外释放曲线。
图3显示的是常规释放液中Endostar的非还原性SDS-PAGE鉴定。图中1～8分别对应：1、分子量分别为14400，20100，31000，43000，66200，97400的标准蛋白(marker)；2、Endostar原液；3、释放4h；4、释放第1d；5、释放第5d；6、释放第10d；7、释放第20d；8、释放第30d。
图4 Endostar制成微球前后抗内皮细胞增殖活性。
图5 Endostar微球体内释放行为曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但不是对本发明保护范围的限制。
实施例1：
精密称取400mg Endostar溶于1ml PH7.4的PBS缓冲液中(内含3％明胶)，形成内水相。将PLGA(Mw＝20000，75∶25)400mg溶于8ml二氯甲烷和乙腈(1∶1)的混合溶剂中，成为内油相。将上述内水相加至内油相中，4000rpm高速分散乳化，形成W/O初乳，然后将此初乳倾倒至含有0.3％卵磷脂与0.1％蔗糖酯的大豆油中，机械搅拌挥发溶剂(500rpm)4小时，使用0.8μm的有机微孔滤膜过滤得到微球，并用石油醚洗涤三次，最后冷冻干燥得到微球成品。将微球成品用二氯甲烷溶解，以PH＝7.4的PBS溶液萃取药物，将萃取后的溶液用HPLC的方法测定其中的蛋白浓度，得到微球的包封率。包封率为91.5％，平均粒径30μm。
称取100mg微球，置于至截留分子量为30000，直径为1厘米的透析袋中。再将透析袋置于含有10ml磷酸缓冲液(0.1M pH 7.0)的烧杯中，并用磁力搅拌器不断搅拌。每日取烧杯中缓冲液1ml，同时补充同体积新鲜的磷酸缓冲液。样品中Endostar的含量用HPLC法测定。用药物的累计释放百分率与释药时间作图。第1天释放20.0％，第10天释放53.19％，第20天释放92.81％。(图1)
实施例2：
精密称取2000mg Endostar与200mg硫酸软骨素溶于10ml Tris(10Mm PH7.4)，调整该溶液的pH值至6.5～8.3，测量其zeta电位位于0～-48mv时，形成硫酸软骨素-Endostar复合物。取0.5ml复合物溶液作为内水相。将PLGA(Mw＝20000，50∶50)400mg溶于8ml二氯甲烷和乙腈和乙酸乙酯(0.5∶1∶0.5)的混合溶剂中，成为内油相。将上述内水相加至内油相中，4000rpm高速分散乳化，形成W/O初乳，然后将此初乳倾倒至含有0.8％司盘-80和0.35％蔗糖酯的液体石蜡中，机械搅拌挥发溶剂(500rpm)4小时，使用0.8μm的有机微孔滤膜过滤得到微球，并用石油醚洗涤三次，最后冷冻干燥得到微球成品。将微球成品用二氯甲烷溶解，以PH＝7.4的PBS溶液萃取药物，将萃取后的溶液用HPLC的方法测定其中的蛋白浓度，得到微球的包封率。包封率为96.3％，平均粒径24μm。
称取100mg微球，置于至截留分子量为30000，直径为1厘米的透析袋中。再将透析袋置于含有10ml磷酸缓冲液(0.1M pH 7.0)的烧杯中，并用磁力搅拌器不断搅拌。每日取烧杯中缓冲液1ml，同时补充同体积新鲜的磷酸缓冲液。样品中Endostar的含量用HPLC法测定。用药物的累计释放百分率与释药时间作图。第1天释放10.0％，第10天释放64.2％，第20天释放92.55％。(图2)
实施例3：
精密称取400mg Endostar溶于1ml PH＝5.5的醋酸钠溶液中(内含5％牛血清白蛋白)，形成内水相。分别将PLGA(A：Mw＝12000，50∶50)、(B：Mw＝20000，50∶50)、(C：Mw＝40000，50∶50)、(D：Mw＝80000，100∶0)、(E：Mw＝20000，75∶25)、(F：Mw＝130000，75∶25)400mg溶于8ml二氯甲烷和乙腈和乙酸乙酯(0.5∶1∶0.5)的混合溶剂中，成为内油相。将上述内水相分别加至上述内油相中，4000rpm高速分散乳化，形成W/O初乳，然后将此初乳倾倒至含有0.5％卵磷脂和0.2％蔗糖酯的大豆油中，机械搅拌挥发溶剂(500rpm)4小时，使用0.8μm的有机微孔滤膜过滤得到微球，并用石油醚洗涤三次，最后冷冻干燥得到微球成品。将微球成品用二氯甲烷溶解，以PH＝7.4的PBS溶液萃取药物，将萃取后的溶液用HPLC的方法测定其中的蛋白浓度，得到微球的包封率。具体包封率见表1。
表1不同分子量与单体比例的PLGA所得微球的包封率
| PLGA | 包封率％ |
| ABCDEF | 93.295.797.091.993.694.8 |
实施例4：
精密称取400mg Endostar溶于1ml PH＝5.5的醋酸钠溶液中(内含5％甘露醇)，形成内水相。将PLGA(Mw＝30000，50∶50)400mg溶于8ml二氯甲烷和乙腈和乙酸乙酯(0.5∶1∶0.5)的混合溶剂中，成为内油相。将上述内水相加至内油相中，4000rpm高速分散乳化，形成W/O初乳，然后将此初乳倾倒至含有0.8％司盘-80和0.15％蔗糖酯的液体石蜡中，机械搅拌挥发溶剂(500rpm)4小时，使用0.8μm的有机微孔滤膜过滤得到微球，并用石油醚洗涤三次，最后冷冻干燥得到微球成品。将微球成品用二氯甲烷溶解，以PH＝7.4的PBS溶液萃取药物，将萃取后的溶液用HPLC的方法测定其中的蛋白浓度，得到微球的包封率。包封率为93.2％，平均粒径22μm。
将上述制备的微球精密称取100mg置于5ml PH7.4的磷酸盐缓冲液中，25℃振摇，于4h、1d、5d、10d、20d、30d离心取200μl上清液，并向其中补充200μl新鲜磷酸盐缓冲液。取上清液进行非还原性SDS-PAGE鉴定，考察药物从微球中释放后的活性保留情况。(图3)
实施例5：
取实施例2制备的微球进行Endostar微球的生物活性测定
1、HUVEC细胞用添加FBS、ECGS、P/O Solution的ECM培养基于37℃，5％CO2的培养箱中培养，待细胞状态良好并进入对数生长期后进行接种。
2、细胞用0.25％胰酶消化，1000rpm离心5min，弃上清，用培养基重新混悬，显微镜下用血细胞计数板计数活细胞。调细胞密度为5000个/ml，每孔加入160μl细胞悬液，置37℃5％CO2培养箱中培养。
3、将Endostar原液和Endostar微球第30d释放液用pH7.4的磷酸盐缓冲液预稀释至2.5mg/ml，按孔中终浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.625μg/ml，每孔加入40μl药物体积，每个梯度设3个平行，37℃ 5％CO2培养箱中培养96h。
4、加入5mg/ml MTT工作液，每孔20μl，置37℃5％CO2培养箱中培养4h，弃去细胞上清，每孔加入DMSO 200μl。放置10min，使用酶标仪490nm波长下测定OD值。
5、根据OD值求出细胞抑制率，计算公式为抑制率(IR)＝(对照组OD值均数-实验组OD值均数)/(对照组OD值均数-空白OD值均数)。(图4)
实施例6：
精密称取800mg Endostar溶于1ml PH＝5.5的醋酸钠溶液中(内含5％甘露醇)，形成内水相。将PLGA(Mw＝70000，75∶25)400mg分别溶于4ml混合溶剂(混合溶剂和比例见表2)中，成为内油相。将上述内水相加至内油相中，4000rpm高速分散乳化，形成W/O初乳，然后将此初乳倾倒至含有0.8％司盘-80和0.35％蔗糖酯的液体石蜡中，机械搅拌挥发溶剂(500rpm)4小时，使用0.8μm的有机微孔滤膜过滤得到微球，并用石油醚洗涤三次，最后冷冻干燥得到微球成品。将微球成品用二氯甲烷溶解，以PH＝7.4的PBS溶液萃取药物，将萃取后的溶液用HPLC的方法测定其中的蛋白浓度，得到微球的包封率。包封率均达到90％以上。具体包封率见表2。
表2不同混合溶剂系统对包封率的影响
| 混合溶剂 | 体积比 | 包封率％ |
| 二氯甲烷和乙腈二氯甲烷和醋酸二氯甲烷和丙酮乙酸乙酯和丙酮乙酸乙酯和乙腈二氯甲烷和乙腈和乙酸乙酯二氯甲烷和丙酮和乙酸乙酯乙酸乙酯和乙腈和丙酮 | 1∶10.6∶1.40.75∶1.251.2∶0.81∶10.5∶1∶0.50.3∶1.2∶0.51∶0.5∶0.5 | 91.197.691.296.792.694.598.995.4 |
实施例7：
精密称取200mg Endostar溶于1ml PH7.4的PBS缓冲液中(内含3％明胶)，形成内水相。将PLGA(Mw＝6000，50∶50)400mg溶于8ml二氯甲烷和丙酮和乙酸乙酯(0.3∶1.2∶0.5)的混合溶剂中，成为内油相。将上述内水相加至内油相中，4000rpm高速分散乳化，形成W/O初乳，然后将此初乳倾倒至含有0.8％司盘-80和0.35％蔗糖酯的液体石蜡中，机械搅拌挥发溶剂(500rpm)4小时，使用0.8μm的有机微孔滤膜过滤得到微球，并用石油醚洗涤三次，最后冷冻干燥得到微球成品。将微球成品用二氯甲烷溶解，以PH＝7.4的PBS溶液萃取药物，将萃取后的溶液用HPLC的方法测定其中的蛋白浓度，得到微球的包封率。包封率为94.3％，平均粒径27μm。
将上述微球用适宜的混悬介质混悬均匀后，设定剂量给予大鼠皮下注射，取其血清，用ELISA测试剂盒检测一个月内Endostar微球的体内释放行为。(图5)
序列表
<110>江苏先声药物研究有限公司
<120>一种重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法
<160>2
<210>1
<211>192
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>大肠杆菌表达的重组人内皮抑制素
<400>1
Met Gly Gly Ser His His His His His His Ser His Arg Asp Phe
1 5 10 15
Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly
20 25 30
Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln
35 40 45
Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser
50 55 60
Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg
65 70 75
Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe Pro
80 85 90
Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro
95 100 105
Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His
110 115 120
Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn
125 130 135
Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu
140 145 150
Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg
155 160 165
Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val
170 175 180
Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys
185 190
<210>2
<211>191
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>大肠杆菌表达的重组人内皮抑制素
<400>2
Gly Gly Ser His His His His His His Ser His Arg Asp Phe Gln
1 5 10 15
Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly
20 25 30
Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala
35 40 45
Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser
50 55 60
Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala
65 70 75
Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser
80 85 90
Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro Gly
95 100 105
Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro
110 115 120
Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly
125 130 135
Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala
140 145 150
Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu
155 160 165
Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu
170 175 180
Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys
185 190
Claims (9)
1.一种重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)将重组人血管内皮抑制素溶解于含有蛋白稳定剂的缓冲液中，得到内水相，所述的蛋白稳定剂包括明胶、硫酸软骨素、山梨醇、木糖醇、甘露醇、海藻糖、碳酸锌、白蛋白、泊洛沙姆中的一种或多种，所述的缓冲液为pH＝3～7的醋酸钠溶液或pH＝5～11的磷酸盐溶液；
(2)再将乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于混合有机溶剂中得到内油相，所述的混合有机溶剂为二氯甲烷和乙腈，或二氯甲烷和醋酸，或二氯甲烷和丙酮，或乙酸乙酯和丙酮，或乙酸乙酯和乙腈，二者比例为1∶9～9∶1；或者所述的混合有机溶剂为二氯甲烷和乙腈和乙酸乙酯，或二氯甲烷和丙酮和乙酸乙酯，或乙酸乙酯和乙腈和丙酮，三者比例为3∶0.01∶0.01～0.01∶3∶0.01～0.01∶0.01∶3；
(3)以每分钟1000-30000转高速分散内水相及内油相的混合溶液，内水相∶内油相的体积比为1∶2～1∶20，得到初乳；
(4)将所得初乳置于盛有含乳化剂的植物油或矿物油的搅拌容器中，在0～60℃和每分钟100～2000转的速度搅拌形成油包油包水型复乳，所述的植物油的乳化剂为卵磷脂、蔗糖酯的一种或多种，矿物油的乳化剂为司盘-80、司盘-60、蔗糖酯的一种或多种；
(5)持续搅拌挥发内油相中的混合有机溶剂，待微球固化后用微孔滤膜过滤分离，用溶剂洗涤微球表面残留的植物油或矿物油，真空干燥后得到微球成品，所述的洗涤微球的溶剂为正己烷、环己烷、正庚烷、石油醚的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述重组人血管内皮抑制素为重组人血管内皮抑制素Endostar，其在缓冲液中的浓度为1～500mg/ml。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的蛋白质稳定剂是硫酸软骨素。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述蛋白质稳定剂在内水相中的浓度按重量体积百分比计为0.1％～20％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的缓冲液为pH＝5.5的醋酸钠溶液或pH＝7.4的磷酸盐溶液。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述共聚物为乳酸-羟基乙酸共聚物，乳酸-羟基乙酸分子量大小为5000～150000，其单体组成比例乳酸∶羟基乙酸为99∶1～50∶50，其在混合有机溶剂中的浓度为10～500mg/ml。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(4)所述植物油为大豆油、玉米油、棉籽油、花生油、茶油的一种或多种；所述矿物油为液体石蜡。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于步骤(4)所述植物油的乳化剂加入量按重量体积百分比计为植物油的0.1～10％，所述矿物油的乳化剂加入量按重量体积百分比计为矿物油的0.1～10％。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(5)所述的微孔滤膜过滤为过滤微球的技术手段，采用的膜为有机膜，孔径范围0.2μm～2μm。
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