CN105229025A - 位点特异性胰岛素缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有改善的胰岛素受体结合亲和力和增强的活性的胰岛素缀合物、包含该胰岛素缀合物的长效制剂及其制备方法，其中非肽基聚合物和免疫球蛋白Fc区通过共价键与胰岛素β链(除其N-端外)的氨基酸残基位点特异性地连接。本发明的胰岛素缀合物用于提供显示出显著地增加肽的体内活性的胰岛素制剂。

Description

位点特异性胰岛素缀合物
【技术领域】
本发明涉及非肽基聚合物连接体和免疫球蛋白恒定区通过共价键与胰岛素β链(除其N-端外)的氨基酸残基特异性地连接的缀合物(conjugate)及其制备方法。
【背景技术】
胰岛素是由人胰腺β细胞分泌的肽，作为在控制机体的血糖水平中起着非常重要作用的物质。在机体中胰岛素分泌不正常或者所分泌的胰岛素不正常起作用的情况下，机体中的血糖不能被控制并且增加，从而引发称为糖尿病的状况。上面所述的情况被称为2型糖尿病，而胰腺不分泌胰岛素而使血糖增加的情况被称为1型糖尿病。用含化学物质作为主要成分的口服降血糖剂治疗2型糖尿病，而在某些患者中，也用胰岛素进行治疗。另一方面，1型糖尿病的治疗必然需要施用胰岛素。
目前广泛使用的胰岛素治疗是通过在餐前和餐后注射而施用胰岛素的方法。但是，这种胰岛素治疗需要每天3次连续施用，因而导致患者更加痛苦或不便。为了克服这一问题已进行了许多尝试。其中之一是尝试通过增加肽药物的生物膜渗透性，将肽药物通过经口或鼻腔吸入的方式递送到机体中。然而，与注射相比，这种方法显示出肽递送到机体中的效率非常低。因此，在保持所需条件的肽类药物体内活性方面仍存在很多困难。
另外，已经尝试在皮下注射大量药物后延迟吸收的方法。据此，已经提出通过每日仅施用一次来保持血药浓度的方法。一些药物已被批准作为医药产品(例如，Lantus，Sanofi-aventis)，并且当前对患者施用。已进行研究以用脂肪酸修饰胰岛素从而使胰岛素聚合物的结合更强并通过与存在于施用部位和血液中的白蛋白结合而延长持续时间，并且使用这种方法生产的药物已被批准作为医药产品(Levemir，NovoNordisk)。然而，这种方法具有引起施用部位处疼痛的副作用，另外，每日注射一次的施用间隔还会引起患者的极大不便。
同时，报道了胰岛素β链的N-端或C-端区域，即位置29处的氨基酸残基，没有显著影响胰岛素与胰岛素受体的结合(JensBrangeandAageVolund,Adv.DrugDeliv.Rev.,35(2-3):307-335(1999)；PeterKurtzhalsetal.,Diabetes,49(6):999-1005(2000))。
因此，本发明人已研究开发一种用非肽基聚合物和免疫球蛋白恒定区修饰胰岛素β链的C-端区域处的氨基酸残基的方法，并且他们发现，该方法用于制备比通过修饰胰岛素其它位点如N-端而制备的缀合物具有更高的对胰岛素受体的结合亲和力的缀合物，从而完成本发明。
【发明内容】
【技术问题】
本发明的目的是提供胰岛素缀合物及其制备方法，所述胰岛素缀合物通过非肽基聚合物将免疫球蛋白Fc区与胰岛素β链(除其N-端外)的氨基酸残基位点-选择性地(site-selectively)连接而制备。
【技术方案】
在实现上述目的方面中，本发明提供胰岛素缀合物，其特征在于胰岛素和免疫球蛋白Fc区通过非肽基聚合物连接体彼此连接，所述非肽基聚合物连接体选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯基醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合，并且非肽基聚合物的一端与胰岛素β链(除其N-端外)的氨基酸残基连接，而其另一端与免疫球蛋白Fc区连接。
优选地，非肽基聚合物可以与胰岛素β链的位置20至29处的氨基酸残基中的任一个连接。
更优选地，非肽基聚合物可以与胰岛素β链的位置25至29处的氨基酸残基中的任一个连接。
更加优选地，非肽基聚合物可以与胰岛素β链的位置29处的赖氨酸残基连接。
优选地，与非肽基聚合物连接的胰岛素β链的氨基酸残基可具有胺基或巯基。
优选地，胰岛素可以是天然胰岛素或其变体、胰岛素衍生物、胰岛素激动剂、或其片段，所述变体通过对天然胰岛素的一些氨基酸置换、添加、缺失和修饰中的任一种方法或通过其组合而制备。
优选地，非肽基聚合物的两端可以分别与免疫球蛋白Fc区和胰岛素β链的氨基酸残基的侧链的胺基或巯基连接。
优选地，氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸。
优选地，免疫球蛋白Fc区可以是非糖基化的。
优选地，免疫球蛋白Fc区由选自CH1、CH2、CH3和CH4结构域的一至四个结构域构成。
优选地，免疫球蛋白Fc区可以进一步包括铰链区。
优选地，免疫球蛋白Fc区可以是源自于IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc区。
优选地，免疫球蛋白Fc区的每个结构域可以是不同来源的结构域的杂合体，所述不同来源源自于选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白
优选地，免疫球蛋白Fc区可以是由单链免疫球蛋白构成的二聚体或多聚体，所述单链免疫球蛋白由相同来源的结构域构成。
优选地，免疫球蛋白Fc区可以是IgG4Fc区。
优选地，免疫球蛋白Fc区可以是人非糖基化IgG4Fc区。
优选地，非肽基聚合物可以与胰岛素β链的氨基酸残基的侧链的胺基或巯基结合，以形成肽、硫代半缩醛、亚胺或硫代二氧吡咯烷基键。
优选地，非肽基聚合物的两端均可以独立地具有反应性基团，所述反应性基团选自醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。
优选地，琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚胺基羧甲基、琥珀酰亚胺基戊酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺基碳酸酯。
优选地，非肽基聚合物的两端可以分别具有丁醛反应性基团或琥珀酰亚胺基戊酸酯反应性基团。
在另一方面中，本发明提供具有改善的体内持续时间和稳定性的长效胰岛素制剂，其包括胰岛素缀合物。
优选地，该制剂可用于治疗糖尿病。
在又一个方面中，本发明提供胰岛素缀合物的制备方法，其包括以下步骤：(1)将非肽基聚合物与胰岛素β链(除其N-端外)的氨基酸残基共价连接；从(1)的反应混合物中分离非肽基聚合物与胰岛素β链(除其N-端外)的氨基酸残基共价连接的胰岛素络合物(complex)；和(3)将免疫球蛋白Fc区与所分离的络合物的非肽基聚合物的另一端共价连接，从而生成免疫球蛋白Fc区和胰岛素与非肽基聚合物的每一端连接的胰岛素缀合物。
优选地，非肽基聚合物可以与胰岛素β链的氨基酸残基的侧链的胺基或巯基结合，以形成肽、硫代半缩醛、亚胺或硫代二氧吡咯烷基键。
优选地，非肽基聚合物的两端均可以独立地具有醛衍生物、马来酰亚胺衍生物或琥珀酰亚胺衍生物作为反应性基团。
优选地，非肽基聚合物的两端可以分别与胰岛素β链(除其N-端外)和免疫球蛋白Fc区的氨基酸残基的胺基或巯基连接。
优选地，非肽基聚合物的两端均可以独立地具有醛衍生物或琥珀酰亚胺衍生物作为反应性基团。
优选地，步骤(1)可以在pH9.0±2的碱性环境下进行。
优选地，步骤(1)中的胰岛素和非肽基聚合物的摩尔比为1:1.5至1:10。
优选地，步骤(3)中的胰岛素络合物和免疫球蛋白Fc区的摩尔比为1:1至1:10。
【有利效果】
本发明的胰岛素缀合物显示出对胰岛素受体显著增加的结合亲和力，并因此极大地改善了胰岛素的体内活性，从而用于开发具有高效率的长效胰岛素制剂。
【附图说明】
图1A至1B显示了使用Source15S柱纯化的单聚乙二醇化胰岛素的概况和SDS-PAGE凝胶相片；
图2至3显示了由β链的第29氨基酸残基处的位点-特异性聚乙二醇化产生的胰岛素-PEG；
图3显示了最终纯化的缀合物的纯度的分析结果；和
图4显示了胰岛素缀合物与胰岛素受体结合的传感图，其中(A)表示N-端胰岛素缀合物，(B)表示B29胰岛素缀合物，以及从顶部到底部的每条曲线表示1000、500、250、125或62.5nM的物质浓度。
【最佳方式】
在实现上述目的的方面中，本发明提供胰岛素缀合物，其特征在于胰岛素和免疫球蛋白Fc区通过非肽基聚合物连接体彼此连接，所述非肽基聚合物连接体选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯基醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合，并且非肽基聚合物的一端与胰岛素β链(除其N-端外)的氨基酸残基连接，其另一端与免疫球蛋白Fc区连接。
在本发明中，胰岛素是一种血糖水平变高时由胰腺分泌的生理活性肽，其通过使肝、骨骼肌和脂肪组织从血液中吸收葡萄糖并将其存储为糖原，并通过抑制使用脂肪作为能量来源的新陈代谢而起到控制血糖水平的作用。如本文所使用的，术语‘胰岛素’包括胰岛素激动剂、前体、衍生物、片段或变体，以及天然胰岛素。优选地，胰岛素不受限制地包括天然胰岛素，速效胰岛素和长效胰岛素。
天然胰岛素是由胰腺分泌的激素，并且在通过促进葡萄糖的细胞摄取和抑制脂类分解来控制血糖水平中起着重要的作用。具有调节血糖水平作用的胰岛素是由无调节血糖水平作用的胰岛素前体通过一系列过程而产生的。天然胰岛素的氨基酸序列如下：
-α链：
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQIDNO：1)
-β链：
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQIDNO：2)
优选地，胰岛素可以是天然胰岛素，或变体、胰岛素衍生物、胰岛素激动剂、或其片段，所述变体是通过对天然胰岛素的一些氨基酸置换、添加、缺失和修饰中的任一种方法或通过其组合而制备。
胰岛素激动剂意思是与胰岛素受体结合以显示出与胰岛素相同的生物活性的物质，其与胰岛素的结构无关。
胰岛素衍生物意思是这样的肽：其与天然胰岛素相比在氨基酸序列中显示至少80％的序列同源性、具有通过化学替换(例如，α-甲基化，α-羟基化)、移除(例如，脱氨)或修饰(例如，N-甲基化、糖基化、脂肪酸)而改变的一些氨基酸残基基团，并且具有控制机体中血糖的作用。
胰岛素片段意思是这样的片段：其具有在胰岛素的氨基或羧基端添加或缺失的一个或多个氨基酸，其中添加的氨基酸可以是非天然存在的氨基酸(例如，D-型氨基酸)，并且该胰岛素片段具有控制机体中血糖水平的作用。
胰岛素变体意思是这样的肽：其在一个或多个氨基酸序中与胰岛素不同并且保留控制机体中血糖水平的作用。
此外，可以单独或组合使用胰岛素激动剂、衍生物、片段和变体的各自制备方法。例如，本发明的胰岛素肽还包括这样的肽：其具有与天然胰岛素不同的一个或多个氨基酸和N-端氨基酸残基的脱氨基作用，并且具有控制机体中血糖水平的作用。
在具体的实施方式中，本发明中所使用的胰岛素可以通过重组技术产生，并且还可以通过固相法合成胰岛素。
本发明的胰岛素缀合物特征在于其通过将胰岛素β链和免疫球蛋白Fc区共价地与作为连接体的非肽基聚合物的每一端连接而制备，其中非肽基聚合物在两端具有反应性基团。优选地，非肽基聚合物的两端可以分别与免疫球蛋白Fc区和胰岛素β链的氨基酸残基的侧链的胺基或巯基连接。
在这方面，氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸，但没有限制，只要氨基酸包含胺基或巯基以与非肽基聚合物一起形成共价键。
在本发明中，发现在制备聚乙二醇(PEG)和免疫球蛋白恒定区(以下简称免疫球蛋白Fc或Fc)的缀合物中通过改变胰岛素β链上的PEG-Fc-结合位点胰岛素受体结合亲和力而不同，从而改善胰岛素的血液稳定性。此外，本发明人证明了增加胰岛素的结合亲和力以改善其活性的结合位点。例如，它们确定了通过与PEG-Fc结合而改善血液稳定性并且在不抑制与胰岛素受体结合的情况下没有降低活性的结合位点。在胰岛素α链用于形成缀合物的情况下，其活性显著降低。因此，意图探索胰岛素β链上的最佳结合位点。结果，确认非肽基聚合物的结合位点可以是除胰岛素β链的N-端以外的具有胺基或巯基的任意氨基酸残基。
优选地，非肽基聚合物可以与胰岛素β链的位置20至29处的氨基酸残基中的任一个连接。更优选地，非肽基聚合物可以与胰岛素β链的位置25至29处的氨基酸残基中的任一个连接。更加优选地，非肽基聚合物可以与胰岛素β链的位置29处的赖氨酸残基连接。
优选地，与非肽基聚合物连接的胰岛素β链的氨基酸残基可以具有胺基或巯基。例如，氨基酸残基可以是赖氨酸、半胱氨酸或其衍生物，但不限于此。
在本发明的具体实施方式中，缀合物是通过将PEG-Fc分别与胰岛素β链的N-端或第29个赖氨酸残基连接而制备，并检查各自胰岛素缀合物与胰岛素受体的结合亲和力。结果，通过将PEG-Fc与胰岛素β链的第29个赖氨酸残基连接而制备的胰岛素缀合物比通过将PEG-Fc与胰岛素β链的N-端连接而制备的胰岛素缀合物显示出更高的结合亲和力(约3.6倍)(实施例4，表1)。这种胰岛素受体结合亲和力的增加表明相应胰岛素缀合物的增加的活性。
然而，用于制备保持胰岛素活性并具有改善稳定性的缀合物的非肽基聚合物的结合位点并不限于胰岛素β链的第29个残基。通过将非肽基聚合物与胰岛素β链——优选C-端区域、更优选位置20至29处的氨基酸残基中的任一个并且更加优选位置25至29处的氨基酸残基中的任一个——连接而制备的缀合物也包括在本发明的范围内。例如，天然胰岛素可以在β链的位置29处通过单一赖氨酸残基的ε-胺基与非肽基聚合物共价地连接。含有在其它位点具有胺基或巯基的氨基酸残基的胰岛素变体或衍生物也可以在相应的氨基酸位置与非肽基聚合物连接，并且这些缀合物也包括在本发明的范围内。
当制备保持胰岛素活性的缀合物时，为了制备方便可以用赖氨酸或半胱氨酸残基置换胰岛素β链的氨基酸残基。例如，通过用赖氨酸或半胱氨酸残基置换胰岛素β链C-端处的氨基酸残基而形成的胰岛素衍生物被容易地用于制备胰岛素缀合物，并且使用该胰岛素衍生物制备的胰岛素缀合物也包括在本发明的范围内。
如本文所使用的，“非肽基聚合物”意思是通过连接重复单元中的两个或多个而形成的生物相容性聚合物，并且重复单元通过任何共价键而非肽键彼此连接。用于本发明中的非肽基聚合物可以选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯基醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物，如PLA(聚乳酸)和PLGA(聚乳酸-乙醇酸)、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合，并优选聚乙二醇(PEG)。本领域熟知且在本领域技术范围内容易制备的其衍生物也包括在本发明的范围内。
用于通过常规的框内融合方法获得的融合蛋白中的肽连接体具有以下缺点：其在体内容易被蛋白水解酶切割，并因此不能如预期的获得通过载体增加活性药物的血液半衰期的充分效果。然而，在本发明中，可以使用对蛋白水解酶具有抗性的聚合物将肽的血液半衰期保持与载体相似。因此，可以无限制地使用任意非肽基聚合物，只要其是具有上述作用的聚合物，即对体内蛋白水解酶具有抗性的聚合物。非肽基聚合物具有1至100kDa范围的分子量，并优选1至20kDa范围。此外，本发明的与生理活性多肽连接的非肽基聚合物可以是一种聚合物或不同类型聚合物的组合。
本发明中使用的非肽基聚合物具有能够与免疫球蛋白Fc区和蛋白质药物结合的反应性基团。
优选地，非肽基聚合物可以与胰岛素β链的氨基酸残基的侧链的胺基或巯基结合，以形成肽、硫代半缩醛、亚胺或硫代二氧吡咯烷基键。
在非肽基聚合物两端处的反应性基团的非限制性例子可以包括醛基，如丙醛基或丁醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚胺基羧甲基、琥珀酰亚胺基戊酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺基碳酸酯，但不限于此。可以无限制地使用选择性地能够与免疫球蛋白Fc区和胰岛素β链的氨基酸残基的胺基或巯基一起形成共价键的任何反应性基团。
在非肽基聚合物两端处的反应性基团可以彼此相同或不同。例如，非肽聚合物可以在一端具有琥珀酰亚胺基团，而在另一端具有醛基，如丙醛基或丁醛基。当在其两端具有反应性羟基的聚乙二醇用作非肽基聚合物时，羟基可以通过已知的化学反应活化成各种反应性基团，或可以使用具有商业上可获得的经修饰的反应性基团的聚乙二醇，从而制备本发明的蛋白缀合物。
优选地，非肽基聚合物可以分别在两端具有丁醛基和琥珀酰亚胺基戊酸酯反应性基团。
如本文所使用的，“免疫球蛋白Fc区”指的是这样的蛋白质：其包含免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)，而不含免疫球蛋白的重链和轻链的可变区、重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区1(CL1)。它还可以包含重链恒定区处的铰链区。此外，本发明的免疫球蛋白Fc区可以含有包含除免疫球蛋白的重链和轻链的可变区之外的重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)的Fc区的部分或全部，只要它具有与天然形式基本相似或比其更好的效果。此外，它可以是在CH2和/或CH3的氨基酸序列的相对长的部分中具有缺失的区域。即，本发明的免疫球蛋白Fc区可以包含1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域，2)CH1结构域和CH2结构域，3)CH1结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，5)一个或多个结构域和免疫球蛋白铰链区(或部分铰链区)的组合，以及6)重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域的二聚体。
免疫球蛋白Fc区用作药物载体是安全的，因为它是体内代谢的生物可降解多肽。此外，与整个免疫球蛋白分子相比，免疫球蛋白Fc区具有相对低的分子量，因此，在缀合物的制备、纯化和收率方面是有利的。免疫球蛋白Fc区不包含Fab片段(其由于根据抗体亚类的不同氨基酸序列而是高度不同质的)，因此，可以预期免疫球蛋白Fc区可以极大地增加物质的同质性并且在血液中为低抗原性。
免疫球蛋白Fc区可以是源自于人或包括牛、羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠的其它动物，并且优选人。此外，免疫球蛋白Fc区可以是源自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的Fc区或通过其组合或其杂合体制成的Fc区。优选地，其源自IgG或IgM(它们是人血液中最丰富的蛋白质之一)，并且最优选源自已知提升蛋白质配体结合的半衰期的IgG。
同时，本文所使用的“组合”意思是编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽与不同来源的单链多肽连接而形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可以由选自以下的两种或多种片段形成：IgGFc片段、IgAFc片段、IgMFc片段、IgDFc片段和IgEFc片段。
如本文所使用的，“杂合体”意思是编码两种或多种不同来源的免疫球蛋白Fc区的序列存在于单链免疫球蛋白Fc区中。在本发明中，多种类型的杂合体是可能的。即，由选自IgGFc、IgMFc、IgAFc、IgEFc和IgDFc的CH1、CH2、CH3和CH4中的一至四个结构域构成的结构域杂合体是可能的，并且可以包含铰链区。
另一方面，IgG分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类，并且本发明包括其组合和杂合体。优选的是IgG2和IgG4亚类，最优选的是IgG4的Fc区，其很少具有效应子作用，如CDC(补体依赖性细胞毒性)。
即，作为本发明的药物载体，最优选的免疫球蛋白Fc区是源自人IgG4的非糖基化Fc区。人源性Fc区比非人源性Fc区更优选，非人源性Fc区可以在人体内用作抗原并且引起不期望的免疫反应，如产生抗抗原的新抗体。
同时，免疫球蛋白Fc区可以是具有天然糖链、与天然形式相比糖链增加或与天然形式相比糖链减少的形式，或者可以是去糖基化形式。免疫球蛋白Fc糖链的增加、减少或去除可以通过本领域中常用的法实现，如化学法、酶促法和利用微生物的基因工程法。此处，从Fc区去除糖链导致与补体(c1q)的结合亲和力明显降低和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性降低或丧失，从而不会诱导不必要的体内免疫反应。在这方面，去糖基化或非糖基化形式的免疫球蛋白Fc区作为药物载体可以更适合于本发明的目的。
如本文所使用的，“去糖基化”意思是从Fc区酶促地去除糖部分，而“无糖基化”意思是由原核生物(优选大肠杆菌)以非糖基化形式产生Fc区。
此外，本发明的免疫球蛋白Fc区包括其序列衍生物(突变体)以及天然氨基酸序列。由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守或保守置换或其组合，氨基酸序列衍生物具有与天然氨基酸序列不同的序列。例如，在IgGFc中，在214至238、297至299、318至322或327至331位处的已知对于结合重要的氨基酸残基可以用作修饰的适合靶点。此外，其它多种衍生物是可能的，包括具有缺失能够形成二硫键的区域、缺失天然Fc形式的N-端处的数个氨基酸残基或向天然Fc形式的N-端添加甲硫氨酸残基的衍生物。此外，为了去除效应子作用，缺失可发生于补体-结合位点，如C1q-结合位点和ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)位点。制备这种免疫球蛋白Fc区的序列衍生物的技术公开在WO97/34631和WO96/32478中。
蛋白质和肽中一般不改变分子活性的氨基酸交换是本领域已知的(H.Neurath,R.L.Hill,TheProteins,AcademicPress,NewYork,1979)。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly，双向皆可。
如需要，Fc区可以通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸酯化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等进行修饰。
上述Fc衍生物是具有与本发明的免疫球蛋白Fc区相同的生物活性或对热、pH等具有改善的结构稳定性的衍生物。此外，这些免疫球蛋白恒定区可以得自从人和包括牛、羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠的其它动物中分离的天然形式，或者可以是得自转化的动物细胞或微生物的重组体或其衍生物。此处，它们可以通过从人或动物有机体分离整个免疫球蛋白并用蛋白水解酶对它们进行处理而从天然免疫球蛋白获得。木瓜蛋白酶将天然免疫球蛋白消化成Fab区和Fc区，而胃蛋白酶处理导致产生pF’c和F(ab)2。这些片段可以进行尺寸排阻色谱以分离Fc或pF’c。
优选地，人源性免疫球蛋白Fc区可以是获得自微生物的重组免疫球蛋白恒定区。
在本发明中，免疫球蛋白Fc区和非肽基聚合物的结合是通过非肽基聚合物的不与胰岛素结合的其它末端反应性基团和免疫球蛋白Fc区的氨基酸残基的胺基或巯基之间的共价键而形成，如胰岛素β链和非肽基聚合物的结合那样。因此，非肽基聚合物与免疫球蛋白Fc区的N-端或免疫球蛋白Fc区内的赖氨酸残基的胺基或半胱氨酸残基的巯基结合。就这一点而言，对与非肽基聚合物结合的免疫球蛋白Fc区上的氨基酸残基的位置没有限制。
在又一个方面中，本发明提供具有改善的体内活性的长效胰岛素制剂，其包含胰岛素缀合物。长效制剂可以是用于治疗糖尿病的组合物。
此外，本发明提供通过向有需要的对象施用长效胰岛素制剂来治疗糖尿病的方法。
如本文所使用的，“施用”意思是通过特定的合适方法将预定的物质导入患者中。本发明的缀合物可以通过任意常规途径施用，只要它能够到达期望的组织。可以进行腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、经口、局部、鼻内、肺内和直肠内施用，但本发明并不局限于此。然而，由于经口施用后肽被消化，所以用于经口施用的组合物的活性成分应当被包被或者配制用于保护在胃中免于降解。此外，可以使用能将活性成分转运到靶细胞中的某些设备来施用长效制剂。
包含本发明缀合物的长效制剂可以包括药学上可接受的载体。对于经口施用而言，药学上可接受的载体可以包括粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、芳香剂等。对于可注射的制剂而言，药学上可接受的载体可以包括缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂和稳定剂。对于局部施用的制剂而言，药学上可接受的载体可以包括基底、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。可以将本发明的长效制剂与上述药学上可接受的载体组合配制成多种剂型。例如，对于经口施用而言，可以将制剂制成片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂或膜片(wafers)。对于可注射的制剂而言，可以将制剂制成单剂量安瓿或多剂量容器。还可以将制剂配制成溶液、悬浮剂、片剂、丸剂、胶囊和缓释制剂。
另一方面，适于制剂的载体、赋形剂和稀释剂的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸盐、丙基羟基苯甲酸盐、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。此外，制剂可以进一步包括填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、芳香剂、防腐剂等。
此外，本发明的长效制剂可以由若干相关因素确定，包括待治疗疾病的类型、施用途径、患者年龄、性别、体重和疾病的严重程度，以及由作为活性成分的药物类型确定。由于本发明的药物组合物具有优异的体内持续时间和效价，所以其极大地降低本发明药物制剂的施用频率。
本发明的长效制剂改进了胰岛素的体内稳定性，同时保持其活性，并因此其有效用于治疗糖尿病。
在又一个方面中，本发明提供胰岛素缀合物的制备方法，其包括以下步骤：(1)将非肽基聚合物与胰岛素β链(除其N-端外)的氨基酸残基共价连接；(2)从(1)的反应混合物中分离非肽基聚合物与胰岛素β链(除其N-端外)的氨基酸残基共价连接的胰岛素络合物；和(3)将免疫球蛋白Fc区与所分离的连接物(linkage)的非肽基聚合物的另一端共价连接，从而生成免疫球蛋白Fc区和胰岛素与非肽基聚合物的每一端连接的胰岛素缀合物。
如上所述，非肽基聚合物可以优选地与胰岛素β链的氨基酸残基的侧链的胺基或巯基结合以形成肽、硫代半缩醛、亚胺或硫代二氧吡咯烷基键。就这一点而言，非肽基聚合物的两端均独立地为作为反应性基团的醛衍生物、马来酰亚胺衍生物或琥珀酰亚胺衍生物，但不限于此。
如上所述，非肽基聚合物的两端可以分别优选地与胰岛素β链(除其N-端外)和免疫球蛋白Fc区的氨基酸残基的侧链的胺基或巯基结合。
优选地，非肽基聚合物可以分别在两端具有醛衍生物和琥珀酰亚胺衍生物作为反应性基团。就这一点而言，步骤(1)可以在pH9.0±2的碱性环境下进行。如果可以使在低于pH7的酸性环境下反应，则非肽基聚合物可以与N-端胺基结合。取决于非肽基聚合物反应性基团的类型以及与其反应的胰岛素β链的氨基酸残基的反应性基团的类型，例如胺基或巯基，可以控制上述pH范围。例如，如果具有琥珀酰亚胺衍生物作为反应性基团的PEG被用作非肽基聚合物并且将要与胰岛素中的赖氨酸的胺基连接，则pH被控制为9.0，导致形成非肽基聚合物选择性地与赖氨酸的胺基结合，而不与N-端胺基结合的胰岛素络合物。
在将非肽基聚合物与胰岛素β链连接的步骤(1)中，胰岛素和聚合物的反应摩尔比可以优选地为1:1.5至1:10，且更优选1:2。此外，在将免疫球蛋白Fc区与胰岛素络合物的非肽基聚合物的另一端共价连接的步骤(3)中，胰岛素络合物和免疫球蛋白Fc区的摩尔比可以优选地为1:1至1:10，且更优选1:1.2。
在本发明的具体实施方式中，使用在两端都独立地含有琥珀酰亚胺和醛反应性基团中的每一个的PEG连接体以高收率对胰岛素进行选择性聚乙二醇化，并且通过作图法(mappingmethod)鉴定胰岛素β链的第29位残基的聚乙二醇化(图2至3)。此外，本发明人将免疫球蛋白恒定区与由此制备的单聚乙二醇化胰岛素连接，从而制备胰岛素-非肽基聚合物-免疫球蛋白恒定区缀合物。
检查所制备的胰岛素缀合物与胰岛素受体的结合亲和力。结果，胰岛素缀合物显示出比通过将PEG-Fc与胰岛素的N-端连接而制备的缀合物高约3.6倍的结合亲和力，这表明本发明缀合物的优良功效。
【用于发明的方式】
下文中，将通过参照实施例更加详细地说明本发明。然而，这些实施例仅用于说明性目的，并且本发明不意图受这些实施例所限制。
实施例1：胰岛素β链的第29位氨基酸的聚乙二醇化反应和单聚 乙二醇化胰岛素的纯化
将胰岛素粉末溶于10mMHCl中，然后以胰岛素:PEG为1:2的摩尔比和1.5mg/mL的胰岛素浓度在室温下与3.4K丁醛-PEG-琥珀酰亚胺基戊酸酯(在各端具有丁基醛基和琥珀酰亚胺基戊酸酯基团作为官能团的PEG，美国LaysanBio公司)反应约1小时，以将胰岛素β链的第29位氨基酸残基聚乙二醇化。该反应是在6.8mM硼酸钠和45％异丙醇在pH9.0下进行的。使用含有柠檬酸钠(pH3.0)和45％乙醇的缓冲液以及KCl浓度梯度，用SourceS(GEHealthcare)柱纯化反应溶液，以得到单聚乙二醇化胰岛素(图1a至1b)。
实施例2：单聚乙二醇化胰岛素的聚乙二醇化位点的鉴定
为了鉴定在根据实施例1聚乙二醇化的胰岛素中的3.4KPEG结合位点，使用Glu-C作图方法。将浓度为1mg/mL的10μg胞内蛋白酶Glu-C添加至浓度为1mg/mL的50μg单聚乙二醇化胰岛素。反应溶液为pH7.5的50mMHEPES，并使在25℃下反应8小时。然后，添加50μl的1NHCL终止反应。使用HPLC反相色谱进行作图。在图2中给出结果。
如图2所示，观察到含有胰岛素β链第29位氨基酸的峰的位移，这表明胰岛素β链的第29位氨基酸用3.4KPEG的聚乙二醇化。
实施例3：制备单聚乙二醇化胰岛素和免疫球蛋白Fc的缀合物
为了制备胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc片段缀合物，由实施例1所述方法制备的单聚乙二醇化胰岛素和免疫球蛋白Fc片段以总蛋白质水平为20mg/ml在1:1.2的摩尔比下于25℃反应13小时。在这方面，反应溶液包含pH8.2的100mMHEPES和2M氯化钠(NaCl)，并且进一步包含20mM氰基硼氢化钠作为还原剂。
在反应完成后，反应溶液通过SourceQ(GEHealthcare)柱分离并纯化未反应的胰岛素、未反应的免疫球蛋白Fc片段、胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc片段缀合物和使用Tris-HCl(pH7.5)缓冲液和NaCl浓度梯度与两种或多种单聚乙二醇化胰岛素(胰岛素-PEG)偶联的免疫球蛋白Fc片段缀合物。
随后，使用SourceISO(GEHealthcare)去除任何剩余的免疫球蛋白Fc和多重偶合的胰岛素缀合物，从而得到胰岛素-PEG-免疫球蛋白Fc缀合物。在此情况下，使用含有Tris-HCl(pH7.5)的硫酸铵的浓度梯度进行洗脱。利用反相色谱、离子交换色谱和排阻色谱通过HPLC对由此制备的缀合物的纯度进行分析(图3)。
实施例4：根据胰岛素β链中的PEG-Fc结合位点对胰岛素缀合物 的胰岛素受体结合亲和力测定
为了测定通过将PEG-Fc与胰岛素的N-端连接而制备的胰岛素缀合物和通过将PEG-Fc与B29连接而制备的胰岛素缀合物的胰岛素受体结合亲和力，使用SPR(表面等离子共振，BIACORE3000)。作为胰岛素受体，将ECD(胞外结构域)在HEK293F细胞中表达，然后进行纯化。将由此表达的胰岛素受体通过氨基偶联固定在CM5芯片上，并且施加1μM至6.25nM的N-端或B29胰岛素缀合物并测定它们的结合亲和力。使用结合缓冲液(HBS-EP)将这些胰岛素缀合物稀释，并与固定有胰岛素缀合物的芯片结合4分钟、解离6分钟。然后，为了在不同的浓度下结合胰岛素缀合物，将50mMNaCl/5mMNaOH施加至与胰岛素受体偶联的胰岛素缀合物约30秒。利用BIA评估软件程序的1:1Langmuir结合模型来分析结合亲和力。在图4中给出结果。
如图4所示，N-端和B29胰岛素缀合物都被发现以浓度依赖性方式与胰岛素受体结合。这些胰岛素缀合物与胰岛素受体的结合亲和力显示在表1中。详细地，B29胰岛素缀合物具有比N端胰岛素缀合物高约1.8倍的缔合(association)速率常数，这表明B29胰岛素缀合物与胰岛素受体的结合比N-端胰岛素缀合物与胰岛素受体的结合更快。B29胰岛素缀合物具有比N-端胰岛素缀合物低约1.8倍的解离速率常数，这表明在结合后，B29胰岛素缀合物与胰岛素受体的结合更稳定地保持。N-端和B29胰岛素缀合物之间结合亲和力的比较结果显示出，B29胰岛素缀合物的结合亲和力比N-端胰岛素缀合物的结合亲和力高约3.6倍。
[表1]
N-端胰岛素缀合物和B29胰岛素缀合物之间胰岛素受体结合亲和力的比较
胰岛素缀合物 ka(1/ms，×105) kd(1/s，×103) KD(nM)
N-端 0.06±0.01 3.86±0.15 692.5±50.2
B29 0.11±0.02 2.15±0.22 191.5±50.2
ka：缔合速率常数
kd：解离速率常数
KD：亲和力常数
基于以上描述，在不背离本发明的范围和精神的情况下可以进行的各种修改和改变将对本领域技术人员是明显的。因此，应理解，在所有方面上述实施方式并不是限制性的而是说明性的。本发明的范围是由所附的权利要求所限定而不是由权利要求之后的上述描述所限定，因此，落入权利要求边界和界限或者这些边界和界限的等同物内的所有改变和修改都意图被权利要求所囊括。

Claims (30)

1.胰岛素缀合物，其中胰岛素和免疫球蛋白Fc区通过非肽基聚合物连接体彼此连接，所述非肽基聚合物连接体选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯基醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合，并且所述非肽基聚合物的一端与胰岛素β链除其N-端外的氨基酸残基连接，而其另一端与所述免疫球蛋白Fc区连接。
2.权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述非肽基聚合物与所述胰岛素β链的位置20至29处的氨基酸残基中的任一个连接。
3.权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述非肽基聚合物与所述胰岛素β链的位置25至29处的氨基酸残基中的任一个连接。
4.权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述非肽基聚合物与所述胰岛素β链的位置29处的赖氨酸残基连接。
5.权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中与所述非肽基聚合物连接的所述胰岛素β链的所述氨基酸残基具有胺基或巯基。
6.权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述胰岛素是天然胰岛素或变体、胰岛素衍生物、胰岛素激动剂、或其片段，所述变体是通过对天然胰岛素的一些氨基酸的置换、添加、缺失和修饰中的任意一种方法或通过其组合而制备。
7.权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述非肽基聚合物的两端分别与免疫球蛋白Fc区和所述胰岛素β链的所述氨基酸残基的所述侧链的胺基或巯基连接。
8.权利要求7所述的胰岛素缀合物，其中所述氨基酸是天然存在的或非天然存在的氨基酸。
9.权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是非糖基化的。
10.权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区由选自CH1、CH2、CH3和CH4结构域的一至四个结构域构成。
11.权利要求10所述的胰岛素缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区进一步包括铰链区。
12.权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是源自于IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc区。
13.权利要求12所述的胰岛素缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区的每个结构域是不同来源的结构域杂合体，所述不同来源源自于选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白。
14.权利要求12所述的胰岛素缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是由单链免疫球蛋白构成的二聚体或多聚体，所述单链免疫球蛋白由相同来源的结构域构成。
15.权利要求12所述的胰岛素缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG4Fc区。
16.权利要求12所述的胰岛素缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是人非糖基化IgG4Fc区。
17.权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述非肽基聚合物与所述胰岛素β链的所述氨基酸残基的所述侧链的所述胺基或巯基结合，以形成肽、硫代半缩醛、亚胺或硫代二氧吡咯烷基键。
18.权利要求1所述的胰岛素缀合物，其中所述非肽基聚合物的两端均独立地具有反应性基团，所述反应性基团选自醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。
19.权利要求18所述的胰岛素缀合物，其中所述琥珀酰亚胺衍生物是琥珀酰亚胺基羧甲基、琥珀酰亚胺基戊酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丁酸酯、琥珀酰亚胺基甲基丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺或琥珀酰亚胺基碳酸酯。
20.权利要求18所述的胰岛素缀合物，其中所述非肽基聚合物的两端分别具有丁醛反应性基团或琥珀酰亚胺基戊酸酯反应性基团。
21.具有改善的体内持续时间和稳定性的长效胰岛素制剂，其包括权利要求1至20中任一项所述的胰岛素缀合物。
22.权利要求21所述的长效胰岛素制剂，其中所述制剂用于治疗糖尿病。
23.权利要求1所述的胰岛素缀合物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将非肽基聚合物与所述胰岛素β链除其N-端外的氨基酸残基共价连接；
(2)从(1)的所述反应混合物中分离所述非肽基聚合物与所述胰岛素β链除其N-端外的所述氨基酸残基共价连接的胰岛素络合物；以及
(3)将免疫球蛋白Fc区与所述分离的络合物的所述非肽基聚合物的另一端共价连接，从而生成所述免疫球蛋白Fc区和胰岛素与所述非肽基聚合物的每一端连接的胰岛素缀合物。
24.权利要求23所述的方法，其中所述非肽基聚合物与所述胰岛素β链的所述氨基酸残基的所述侧链的所述胺基或巯基结合，以形成肽、硫代半缩醛、亚胺或硫代二氧吡咯烷基键。
25.权利要求23所述的方法，其中所述非肽基聚合物的两端均独立地具有醛衍生物、马来酰亚胺衍生物或琥珀酰亚胺衍生物作为反应性基团。
26.权利要求23所述的方法，其中所述非肽基聚合物的两端分别与所述胰岛素β链除其N-端外的和免疫球蛋白Fc区的所述氨基酸残基的所述侧链的胺基或巯基连接。
27.权利要求23所述的方法，其中所述非肽基聚合物的两端均独立地具有丁醛基或琥珀酰亚胺基戊酸酯反应性基团。
28.权利要求23所述的方法，其中步骤(1)是在pH9.0±2的碱性环境下进行。
29.权利要求23至28中任一项所述的方法，其中步骤(1)中的所述胰岛素和所述非肽基聚合物的摩尔比为1:1.5至1:10。
30.权利要求23至28中任一项所述的方法，其中步骤(3)中的所述胰岛素络合物和所述免疫球蛋白Fc区的摩尔比为1:1至1:10。
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