BR112015018828B1 - Conjugado de insulina sítio-específico - Google Patents

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Abstract

conjugado de insulina sítio- específico. são fornecidos um conjugado de insulina que tem uma afinidade de ligação ao receptor de insulina melhorada e uma atividade melhorada, em que um polímero não peptídico e uma região fc da imunoglobulina são ligados de forma sítio-específica a um resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina, excluindo o n-terminal dessa, por meio de uma ligação covalente, uma formulação de ação prolongada que inclui esse e um método de preparação desse. o conjugado de insulina da presente invenção é usado para fornecer uma formulação de insulina que exibe uma atividade in vivo significantemente melhorada do peptídeo.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção se refere a um conjugado em que um ligante (LINKER) de polímero não peptídico e uma região constante da imunoglobulina são ligados de forma sítio-específica a um resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina, excluindo o N-terminal dessa por meio de uma ligação covalente, e uma método de preparação do mesmo.
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA
[002] A insulina é um peptídeo secretado a partir das células beta do pâncreas humano como um material que tem uma função muito importante no controle do nível de glicose no sangue no corpo. Nos casos em que a insulina não é secretada de modo adequado ou a insulina, da forma como é secretada, não age adequadamente no corpo, a glicose no sangue no corpo não pode ser controlada e aumenta, induzindo, desse modo, o estado denominado diabetes. O caso, como mencionado acima, é denominado diabetes mellitus tipo 2 e o caso em que a insulina não é secretada pelo pâncreas para aumentar a glicose no sangue é denominado diabetes mellitus tipo 1. A diabetes mellitus tipo 2 é tratada com um agente hipoglicêmico oral que inclui um material químico como o componente principal e, em certos pacientes, também é tratada com insulina. Por outro lado, o tratamento da diabetes mellitus tipo 1 exige necessariamente a administração de insulina.
[003] A terapia com insulina, a qual é amplamente usada atualmente, é um método de administração de insulina por meio de injeção antes e depois das refeições. No entanto, tal terapia com insulina exige que essa seja constantemente administrada três vezes ao dia e, desse modo, causa muito sofrimento e é muito inconveniente para os pacientes. A fim de superar tais problemas, diversas tentativas foram realizadas. Uma dessas era a tentativa de liberar fármacos peptídicos no corpo por meio de inalação através de cavidades orais ou nasais aumentando a permeabilidade ao nível da membrana biológica de fármacos peptídicos. No entanto, tal método mostra uma eficiência significantemente baixa de liberação de peptídeo no corpo em comparação à injeção. Consequentemente, ainda há muitas dificuldades em manter a atividade IN VIVO de fármacos peptídicos nas condições exigidas.
[004] Além disso, tentou-se um método para atrasar a absorção após a administração subcutânea de fármacos em excesso. De acordo com isso, um método para manter a concentração de fármaco no sangue através de somente uma única administração diária foi apresentado. Alguns foram aprovados como produtos medicinais (por exemplo, Lantus, Sanofi-aventis) e são atualmente administrados a pacientes. O estudo para modificar a insulina com ácidos graxos para intensificar a ligação de um polímero de insulina e prolongar a duração através da ligação à albumina presente no local de administração e no sangue tem progredido, e os fármacos produzidos com o uso de tal método foram aprovados como produtos medicinais (Levemir, NovoNordisk). No entanto, tais métodos têm o efeito colateral de causar dor no local de administração e, além disso, o intervalo de administração de uma única injeção diária ainda é significantemente inconveniente para os pacientes.
[005] Entretanto, relatou-se que a região N ou C-terminal, isto é, o resíduo de aminoácido na posição 29 da cadeia beta da insulina, não influencia significantemente a ligação da insulina ao receptor de insulina (Jens Brange e Aage Volund, Adv. Drug Deliv. Rev., 35(2-3): 307 a 335 (1999); Peter Kurtzhals et al., Diabetes, 49(6): 999 a 1005 (2000)).
[006] Consequentemente, os presentes inventores estudaram para desenvolver um método de modificação de um resíduo de aminoácido na região C-terminal da cadeia beta da insulina com um polímero não peptídico e uma região constante da imunoglobulina, e constataram que esse método é usado para preparar um conjugado que tem uma maior afinidade de ligação em relação ao receptor de insulina do que os conjugados preparados modificando- se outros locais de insulina, como um N-terminal, completando, desse modo, a presente invenção.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] Um objetivo da presente invenção é fornecer um conjugado de insulina que é preparado ligando-se de uma forma sítio-específica a uma região Fc da imunoglobulina a um resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina, excluindo o N-terminal dessa por meio de um polímero não peptídico, e um método de preparação do mesmo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[008] As FIGS. 1A e 1B mostram um perfil e uma fotografia de um gel de SDS-PAGE de insulina monopeguilada purificada com o uso de uma coluna Source 15S;
[009] As FIGS. 2 e 3 mostram a insulina-PEG resultante da peguilação de local específico no 29° resíduo de aminoácido da cadeia beta;
[010] A FIG. 3 mostra o resultado da análise da pureza do conjugado purificado final; e
[011] A FIG. 4 mostra sensorgramas de ligação do conjugado de insulina ao receptor de insulina, em que (A) representa um conjugado de insulina do N- terminal, (B) representa um conjugado de insulina B29, e cada curva de cima para baixo representa a concentração de substância de 1000, 500, 250, 125 ou 62,5 nM.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS
[012] Em um aspecto para alcançar o objetivo acima, a presente invenção fornece um conjugado de insulina, caracterizado pelo fato de que a insulina e uma região Fc da imunoglobulina são ligadas entre si por meio de um ligante de polímero não peptídico selecionado a partir do grupo que consiste em polietilenoglicol, polipropilenoglicol, um copolímero de etilenoglicol- propilenoglicol, poliol polioxietilado, álcool polivinílico, polissacarídeo, dextrano, etil éter polivinílico, um polímero biodegradável, um polímero lipídico, quitina, ácido hialurônico e uma combinação desses, e uma extremidade do polímero não peptídico é ligada a um resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina, excluindo o N-terminal dessa, e a outra extremidade desse é ligada à região Fc da imunoglobulina.
[013] De preferência, o polímero não peptídico pode estar ligado a qualquer um dos resíduos de aminoácido nas posições 20 a 29 da cadeia beta da insulina.
[014] Mais preferencialmente, o polímero não peptídico pode estar ligado a qualquer um dos resíduos de aminoácido nas posições 25 a 29 da cadeia beta da insulina.
[015] Muito mais preferencialmente, o polímero não peptídico pode estar ligado ao resíduo de lisina na posição 29 da cadeia beta da insulina.
[016] De preferência, o resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina, ao qual o polímero não peptídico está ligado, pode ter um grupo amina ou um grupo tiol.
[017] De preferência, a insulina pode ser uma insulina nativa, ou uma variante que é preparada por qualquer método dentre substituição, adição, deleção e modificação de alguns aminoácidos de insulina nativa ou por uma combinação desses, um derivado de insulina, um agonista de insulina ou um fragmento dessa.
[018] De preferência, ambas as extremidades do polímero não peptídico podem ser ligadas a um grupo amina ou um grupo tiol da cadeia lateral do resíduo de aminoácido de uma região Fc da imunoglobulina e da cadeia beta da insulina, respectivamente.
[019] De preferência, o aminoácido pode ser um aminoácido de ocorrência natural ou de ocorrência não natural.
[020] De preferência, a região Fc da imunoglobulina pode ser aglicosilada.
[021] De preferência, a região Fc da imunoglobulina é composta por um a quatro domínios selecionados a partir do grupo que consiste em domínios CH1, CH2, CH3 e CH4.
[022] De preferência, a região Fc da imunoglobulina pode incluir adicionalmente uma região de dobradiça.
[023] De preferência, a região Fc da imunoglobulina pode ser uma região Fc derivada de IgG, IgA, IgD, IgE ou IgM.
[024] De preferência, cada domínio da região Fc da imunoglobulina pode ser um híbrido de domínios de uma diferente origem derivada de uma imunoglobulina selecionada a partir do grupo que consiste em IgG, IgA, IgD, IgE e IgM.
[025] De preferência, a região Fc da imunoglobulina pode ser um dímero ou um multímero composto por imunoglobulinas de cadeia única compostas por domínios da mesma origem.
[026] De preferência, a região Fc da imunoglobulina pode ser uma região Fc da IgG4.
[027] De preferência, a região Fc da imunoglobulina pode se4r uma região Fc da IgG4 aglicosilada humana.
[028] De preferência, o polímero não peptídico pode se ligar ao grupo amina ou ao grupo tiol da cadeia lateral do resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina para formar uma ligação de peptídeo, hemitioacetal, imina ou tiodioxopirrolidinila.
[029] De preferência, ambas as extremidades do polímero não peptídico podem ter, cada uma, independentemente, um grupo reativo selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo aldeído, a grupo propionaldeído, um grupo butiraldeído, um grupo maleimida e um derivado de succinimida.
[030] De preferência, o derivado de succinimida pode ser carboximetila de succinimidila, valerato de succinimidila, metil butanoato de succinimidila, metil propionato de succinimidila, butanoato de succinimidila, propionato de succinimidila, N-hidroxisuccinimida ou carbonato de succinimidila.
[031] De preferência, ambas as extremidades do polímero não peptídico podem ter um grupo butiraldeído reativo ou um grupo valerato de succinimidila reativo, respectivamente.
[032] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma formulação de insulina de ação prolongada que tem uma duração IN VIVO e uma estabilidade melhoradas, incluindo o conjugado de insulina.
[033] De preferência, a formulação pode ser usada para o tratamento de diabetes.
[034] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de preparação do conjugado de insulina, incluindo as etapas de: (1) ligar covalentemente um polímero não peptídico a um resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina, excluindo o N-terminal dessa; (2) isolar um complexo de insulina, em que o polímero não peptídico é covalentemente ligado ao resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina, excluindo o N-terminal dessa, da mistura de reação de (1); e (3) ligar covalentemente uma região Fc da imunoglobulina à outra extremidade do polímero não peptídico do complexo isolado de modo a produzir um conjugado de insulina, em que a região Fc da imunoglobulina e a insulina são ligadas a cada extremidade do polímero não peptídico.
[035] De preferência, o polímero não peptídico pode se ligar ao grupo amina ou grupo tiol da cadeia lateral do resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina para formar uma ligação de peptídeo, hemitioacetal, imina ou tiodioxopirrolidinila.
[036] De preferência, ambas as extremidades do polímero não peptídico podem ter, cada uma, independentemente, um derivado de aldeído, um derivado de maleimida ou um derivado de succinimida como um grupo reativo.
[037] De preferência, ambas as extremidades do polímero não peptídico podem ser ligadas a um grupo amina ou a grupo tiol do resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina excluindo o N-terminal dessa, e uma região Fc da imunoglobulina, respectivamente.
[038] De preferência, ambas as extremidades do polímero não peptídico podem ter, cada uma, independentemente, um derivado de aldeído ou um derivado de succinimida como um grupo reativo.
[039] De preferência, a Etapa (1) pode ser realizada sob um ambiente alcalino de pH 9,0±2.
[040] De preferência, uma razão molar entre a insulina e o polímero não peptídico na Etapa (1) pode ser de 1:1,5 a 1:10.
[041] De preferência, uma razão molar entre o complexo de insulina e a região Fc da imunoglobulina na Etapa (3) pode ser de 1:1 a 1:10.
[042] Em um aspecto para alcançar o objetivo acima, a presente invenção fornece um conjugado de insulina, caracterizado por a insulina e uma região Fc da imunoglobulina serem ligadas entre si por meio de um ligante de polímero não peptídico selecionado a partir do grupo que consiste em polietilenoglicol, polipropilenoglicol, um copolímero de etilenoglicol-propilenoglicol, poliol polioxietilado, álcool polivinílico, polissacarídeo, dextrano, etil éter polivinílico, um polímero biodegradável, um polímero lipídico, quitina, ácido hialurônico e uma combinação desses, e uma extremidade do polímero não peptídico é ligada a um resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina, excluindo o N- terminal dessa, e a outra extremidade desse é ligado à região Fc da imunoglobulina.
[043] Na presente invenção, a insulina é um tipo de peptídeo fisiologicamente ativo secretado do pâncreas quando o nível de glicose no sangue se torna alto, o qual funciona de modo a controlar os níveis de glicose no sangue, fazendo com que o fígado, os músculos esqueléticos e o tecido adiposo absorvam a glicose do sangue e a armazenem como glicogênio, e suprimindo-se o metabolismo para usar gordura como fonte de energia. Como usado no presente documento, o termo “insulina” inclui agonistas de insulina, precursores, derivados, fragmentos ou variantes, bem como insulina nativa. De preferência, a insulina inclui insulina nativa, insulina de ação rápida e insulina de ação prolongada sem limitação.
[044] A insulina nativa é um hormônio secretado do pâncreas e tem uma função crítica no controle dos níveis de glicose no sangue promovendo a absorção celular de glicose e inibindo a lipólise. A insulina que tem uma função de regular os níveis de glicose no sangue é produzida a partir de um precursor de pró-insulina sem uma função de regular os níveis de glicose no sangue, através de uma série de processos. As sequências de aminoácidos da insulina nativa são como a seguir.
[045] -Cadeia alfa:
[046] Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu- Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn (SEQ ID NO: 1)
[047] -Cadeia beta:
[048] Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr- Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr (SEQ ID NO: 2)
[049] De preferência, a insulina pode ser uma insulina nativa, ou uma variante que é preparada por qualquer método dentre substituição, adição, deleção e modificação de alguns aminoácidos de insulina nativa ou por uma combinação desses, um derivado de insulina, um agonista de insulina ou um fragmento dessa.
[050] O agonista de insulina representa uma substância que se liga ao receptor de insulina para mostrar atividade biológica igual àquela da insulina, o que é irrelevante para a estrutura da insulina.
[051] O derivado de insulina representa um peptídeo que mostra uma homologia de sequência de pelo menos 80 % em uma sequência de aminoácidos em comparação à insulina nativa, tem alguns grupos de resíduos de aminoácido que são alterados por substituição química (por exemplo, alfa- metilação, alfa-hidroxilação), remoção (por exemplo, desaminação) ou modificação (por exemplo, N-metilação, glicosilação, ácidos graxos) e tem uma função de controlar a glicose no sangue no corpo.
[052] O fragmento de insulina representa um fragmento que tem um ou mais aminoácidos adicionados ou deletados no terminal carboxila ou amino da insulina, em que os aminoácidos adicionados podem ser aminoácidos de ocorrência não natural (por exemplo, aminoácido tipo D), e esse fragmento de insulina tem uma função de controlar o nível de glicose no sangue no corpo.
[053] A variante de insulina representa um peptídeo que difere da insulina em uma ou mais sequências de aminoácidos e retém a função de controlar a glicose no sangue no corpo.
[054] Além disso, os respectivos métodos de preparação dos agonistas, derivados, fragmentos e variantes de insulina podem ser usados individualmente ou em combinação. Por exemplo, o peptídeo da insulina da presente invenção também inclui um peptídeo que tem um ou mais aminoácidos diferentes daqueles da insulina nativa e da desaminação do resíduo de aminoácido na N-terminal, e tem uma função de controlar o nível de glicose no sangue no corpo.
[055] Em uma modalidade específica, a insulina usada na presente invenção pode ser produzida por uma tecnologia de recombinação, e também é possível sintetizar a insulina através de um método de fase sólida.
[056] O conjugado de insulina da presente invenção é caracterizado por ser preparado por ligar covalentemente à cadeia beta da insulina e uma região Fc da imunoglobulina a cada extremidade do polímero não peptídico como um ligante, em que o polímero não peptídico tem grupos reativos em ambas as extremidades. De preferência, ambas as extremidades do polímero não peptídico podem ser ligadas a um grupo amina ou a um grupo tiol da cadeia lateral do resíduo de aminoácido da região Fc da imunoglobulina e à cadeia beta da insulina, respectivamente.
[057] Nesse sentido, o aminoácido pode ser um aminoácido de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, porém, não há limitação, desde que o aminoácido contenha um grupo amina ou um grupo tiol para formar uma ligação covalente, juntamente ao polímero não peptídico.
[058] Na presente invenção, constatou-se que a afinidade de ligação do receptor de insulina difere variando-se o local de ligação PEG-Fc na cadeia beta da insulina na preparação de um conjugado de polietilenoglicol (PEG) e uma região constante da imunoglobulina (doravante, denominada Fc ou Fc da imunoglobulina) para melhorar a estabilidade da insulina no sangue. Além disso, os presentes inventores demonstraram um local de ligação que aumenta a afinidade de ligação da insulina para melhorar sua atividade. Por exemplo, identificaram um local de ligação que melhora a estabilidade no sangue por ligação com PEG-Fc e não reduz a atividade sem inibir a ligação com receptores de insulina. No caso em que a cadeia alfa da insulina é usada para formar um conjugado, sua atividade é reduzida de modo notável. Portanto, pretendeu-se explorar um local de ligação ideal na cadeia beta da insulina. Como resultado, confirmou-se que o local de ligação do polímero não peptídico pode ser qualquer resíduo de aminoácido que tem um grupo amina ou um grupo tiol, excluindo o N-terminal da cadeia beta da insulina.
[059] De preferência, o polímero não peptídico pode estar ligado a qualquer um dos resíduos de aminoácido nas posições 20 a 29 da cadeia beta da insulina. Mais preferencialmente, o polímero não peptídico pode estar ligado a qualquer um dos resíduos de aminoácido nas posições 25 a 29 da cadeia beta da insulina. Muito mais preferencialmente, o polímero não peptídico pode estar ligado ao resíduo de lisina na posição 29 da cadeia beta da insulina.
[060] De preferência, o resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina, ao qual o polímero não peptídico está ligado, pode ter um grupo amina ou um grupo tiol. Por exemplo, o resíduo de aminoácido pode ser lisina, cisteína ou um derivado do mesmo, porém, sem limitação.
[061] Em uma modalidade específica da presente invenção, conjugados foram preparados ligando-se PEG-Fc ao N-terminal ou ao 29° resíduo de lisina da cadeia beta da insulina, respectivamente, e as afinidades de ligação dos respectivos conjugados de insulina em relação aos receptores de insulina foram examinadas. Como resultado, o conjugado de insulina preparado ligando-se PEG-Fc ao 29° resíduo de lisina da cadeia beta da insulina mostrou uma maior afinidade de ligação (cerca de 3,6 vezes) do que o conjugado de insulina preparado ligando-se PEG-Fc ao N-terminal da cadeia beta da insulina (Exemplo 4, Tabela 1). Tal aumento na afinidade de ligação do receptor de insulina indica uma atividade aumentada do conjugado de insulina correspondente.
[062] No entanto, o local de ligação do polímero não peptídico para a preparação de um conjugado que mantém a atividade de insulina e tem uma estabilidade melhorada não é limitado ao 29° resíduo da cadeia beta da insulina. Os conjugados preparados ligando-se o polímero não peptídico à cadeia beta da insulina, de preferência, região C-terminal, mais preferencialmente, a qualquer um dos resíduos de aminoácido nas posições 20 a 29 e, muito mais preferencialmente, a qualquer um dos resíduos de aminoácido nas posições 25 a 29, também estão incluídos no escopo da presente invenção. Por exemplo, a insulina nativa pode ter se ligada covalentemente ao polímero não peptídico por meio do grupo amina do único resíduo de lisina na posição 29 da cadeia beta. Uma variante ou um derivado de insulina que contém um resíduo de aminoácido que tem um grupo amina ou um grupo tiol em outros locais também pode ser ligado ao polímero não peptídico na posição do aminoácido correspondente, e esses conjugados também estão incluídos no escopo da presente invenção.
[063] Quando o conjugado que mantém a atividade da insulina é preparado, o resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina pode ser substituído por um resíduo de lisina ou cisteína para preparação conveniente. Por exemplo, um derivado de insulina formado substituindo-se o resíduo de aminoácido no C-terminal da cadeia beta da insulina com um resíduo de lisina ou cisteína é usado para preparar um conjugado de insulina com facilidade, e um conjugado de insulina preparado com o uso desse derivado de insulina também é incluído no escopo da presente invenção.
[064] Como usado no presente documento, “polímero não peptídico” significa um polímero biocompatível formado ligando-se duas ou mais das unidades de repetição, e as unidades de repetição são ligadas entre si por meio não de uma ligação peptídica, mas por qualquer ligação covalente. O polímero não peptídico útil na presente invenção pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em polietilenoglicol, polipropilenoglicol, um copolímero de etilenoglicol-propilenoglicol, poliol polioxietilado, álcool polivinílico, polissacarídeo, dextrano, etil éter polivinílico, um polímero biodegradável, como PLA (ácido poliláctico) e PLGA (ácido glicólico-poliláctico), um polímero lipídico, quitina, ácido hialurônico e combinações desses, e, de preferência, polietilenoglicol (PEG). Os derivados desse que são bem conhecidos na técnica e são facilmente preparados por pessoas versadas na técnica também são incluídos no escopo da presente invenção.
[065] O ligante do peptídeo que é usado na proteína de fusão obtido por um método de fusão inframe convencional tem desvantagens no sentido de que é facilmente clivado IN VIVO por uma enzima proteolítica e, desse modo, um efeito suficiente de aumentar a meia-vida sanguínea do fármaco ativo através de um veículo não pode ser obtido como esperado. Na presente invenção, no entanto, o polímero que tem resistência à enzima proteolítica pode ser usado para manter a meia-vida sanguínea do peptídeo similar àquela do veículo. Portanto, qualquer polímero não peptídico pode ser usado sem limitação, desde que seja um polímero que tenha a função mencionada acima, ou seja, um polímero que tenha resistência à enzima proteolítica IN VIVO. O polímero não peptídico tem um peso molecular na faixa de 1 a 100 kDa e, de preferência, na faixa de 1 a 20 kDa. Além disso, o polímero não peptídico da presente invenção, ligado ao polipeptídeo fisiologicamente ativo, pode ser um polímero ou uma combinação de diferentes tipos de polímeros.
[066] O polímero não peptídico usado na presente invenção tem um grupo reativo com capacidade de ligação à região Fc da imunoglobulina e à droga proteica.
[067] De preferência, o polímero não peptídico pode se ligar ao grupo amina ou ao grupo tiol da cadeia lateral do resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina para formar uma ligação de peptídeo, hemitioacetal, imina ou tiodioxopirrolidinila.
[068] Exemplos não limitantes dos grupos reativos em ambas as extremidades do polímero não peptídico podem incluir um grupo aldeído como um grupo propionaldeído ou um grupo butiraldeído, um grupo maleimida e um derivado de succinimida. O derivado de succinimida pode ser carboximetila de succinimidila, valerato de succinimidila, metil butanoato de succinimidila, metil propionato de succinimidila, butanoato de succinimidila, propionato de succinimidila, N-hidroxisuccinimida ou carbonato de succinimidila, porém, sem limitação. Qualquer grupo reativo que é seletivamente capaz de formar uma ligação covalente, juntamente a um grupo amina ou um grupo tiol do resíduo de aminoácido da região Fc da imunoglobulina e à cadeia beta da insulina, pode ser usado sem limitação.
[069] Os grupos reativos em ambas as extremidades do polímero não peptídico podem ser iguais ou diferentes entre si. Por exemplo, o polímero não peptídico pode possuir um grupo succinimida em uma extremidade e um grupo aldeído, como um grupo propionaldeído ou um grupo butiraldeído na outra extremidade. Quando o polietilenoglicol que tem grupos hidróxi reativos em ambas as extremidades desse é usado como o polímero não peptídico, o grupo hidróxi pode ser ativado em relação a vários grupos reativos através de reações químicas conhecidas, ou o polietilenoglicol que tem um grupo reativo modificado comercialmente disponível pode ser usado de modo a preparar o conjugado de proteína da presente invenção.
[070] De preferência, o polímero não peptídico pode ter um grupo butiraldeído e um grupo valerato de succinimidila reativo em ambas as extremidades, respectivamente.
[071] Como usado no presente documento, “região Fc da imunoglobulina” se refere a uma proteína que contém a região constante de cadeia pesada 2 (CH2) e a região constante de cadeia pesada 3 (CH3) de uma imunoglobulina, excluindo as regiões variáveis das cadeias leve e pesada, a região constante de cadeia pesada 1 (CH1) e a região constante de cadeia leve 1 (CL1) como imunoglobulina. Pode incluir, ainda, uma região de dobradiça na região constante de cadeia pesada. Ademais, a região Fc da imunoglobulina da presente invenção pode conter uma parte ou toda a região Fc, incluindo a região constante de cadeia pesada 1 (CH1) e/ou a região constante de cadeia leve 1 (CL1), exceto as regiões variáveis das cadeias leve e pesada da imunoglobulina, desde que tenha um efeito substancialmente similar ou melhor do que a forma nativa. Além disso, pode ser uma região que tenha uma deleção em uma porção relativamente longa da sequência de aminoácidos de CH2 e/ou CH3. Ou seja, a região Fc da imunoglobulina da presente invenção pode incluir 1) um domínio CH1, um domínio CH2, um domínio CH3 e um domínio CH4, 2) um domínio CH1 e um domínio CH2, 3) um domínio CH1 e um domínio CH3, 4) um domínio CH2 e um domínio CH3, 5) uma combinação de um ou mais domínios e uma região de dobradiça da imunoglobulina (ou uma porção da região de dobradiça) e 6) um dímero de cada domínio das regiões constantes de cadeia pesada e a região constante de cadeia leve.
[072] A região Fc da imunoglobulina é segura para uso como um veículo de fármacos devido ao fato de que é um polipeptídeo biodegradável que é metabolizado IN VIVO. Além disso, a região Fc da imunoglobulina tem um peso molecular relativamente baixo, em comparação às moléculas integrais de imunoglobulina e, desse modo, é vantajosa em termos de preparação, purificação e rendimento do conjugado. A região Fc da imunoglobulina não contém um fragmento Fab, o qual é altamente não homogêneo devido às diferentes sequências de aminoácidos de acordo com as subclasses do anticorpo e, então, pode-se esperar que a região Fc da imunoglobulina aumente muito a homogeneidade de substâncias e seja menos antigênica no sangue.
[073] A região Fc da imunoglobulina pode ser derivada de seres humanos ou outros animais, incluindo vacas, cabras, porcos, camundongos, coelhos, hamsters, ratos e porquinhos-da-Índia e, de preferência, seres humanos. Além disso, a região Fc da imunoglobulina pode ser uma região Fc que é derivada de IgG, IgA, IgD, IgE, e IgM, ou feita por combinações dessas ou híbridos dessas. De preferência, é derivada de IgG ou IgM, as quais estão entre as proteínas mais abundantes no sangue humano, e, com máxima preferência, de IgG que é conhecida por melhorar as meias-vidas de proteínas de ligação com ligante.
[074] Entretanto, “combinação”, como usado no presente documento, significa que polipeptídeos que codificam as regiões Fc da imunoglobulina de cadeia única da mesma origem são ligados a um polipeptídeo de cadeia única de uma origem diferente para formar um dímero ou multímero. Ou seja, um dímero ou multímero pode ser formado a partir de dois ou mais fragmentos selecionados a partir do grupo que consiste em fragmentos Fc de IgG, Fc de IgA, Fc de IgM, Fc de IgD e Fc de IgE.
[075] Como usado no presente documento, “híbrido” significa sequências que codificam duas ou mais regiões Fc da imunoglobulina de origem diferente estão presentes em uma região Fc da imunoglobulina de cadeia única. Na presente invenção, diversos tipos de híbridos são possíveis. Ou seja, híbridos de domínio compostos por um a quatro domínios selecionados a partir do grupo que consiste em CH1, CH2, CH3 e CH4 de Fc de IgG, Fc de IgM, Fc de IgA, Fc de IgE e Fc de IgD são possíveis e podem incluir a região de dobradiça.
[076] Por outro lado, a IgG é dividida em subclasses IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, e a presente invenção inclui combinações e híbridos dessas. São preferenciais as subclasses IgG2 e IgG4 e é mais preferencial a região Fc de IgG4 que raramente tem funções efetoras, como CDC (citotoxicidade dependente do complemento).
[077] Ou seja, como o veículo de fármaco da presente invenção, a região Fc da imunoglobulina mais preferencial é uma região Fc humana não glicosilada derivada de IgG4. A região Fc derivada de ser humano é mais preferencial do que uma região Fc não derivada de ser humano que pode agir como um antígeno no corpo humano e causar respostas imunológicas indesejáveis, como a produção de um novo anticorpo contra o antígeno.
[078] Entretanto, a região Fc da imunoglobulina pode estar na forma de cadeias de açúcar nativas, cadeias de açúcar aumentadas em comparação a uma forma nativa ou cadeias de açúcar diminuídas em comparação à forma nativa, ou pode estar em uma forma deglicosilada. O aumento, a diminuição ou a remoção das cadeias de açúcar de Fc da imunoglobulina podem ser alcançados por métodos comuns na técnica, como um método químico, um método enzimático e um método de engenharia genética com o uso de um micro-organismo. No presente documento, a remoção de cadeias de açúcar de uma região Fc resulta em uma diminuição significativa da afinidade de ligação ao complemento (c1q) e uma diminuição ou perda em citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo ou citotoxicidade dependente do complemento, não induzindo, desse modo, respostas imunológicas desnecessárias IN VIVO. Nesse sentido, uma região Fc da imunoglobulina em uma forma deglicosilada ou aglicosilada pode ser mais adequada ao objetivo da presente invenção como um veículo de fármaco.
[079] Como usado no presente documento, “deglicosilação” significa remover enzimaticamente porções químicas de açúcar a partir de uma região Fc, e “aglicosilação” significa que uma região Fc é produzida em uma forma deglicosilada por um procarionte, de preferência, E. COLI.
[080] Além disso, a região Fc da imunoglobulina da presente invenção inclui um derivado de sequência (mutante) dessa, bem como uma sequência de aminoácidos nativa. Um derivado de sequência de aminoácidos tem uma sequência que é diferente da sequência de aminoácidos nativa devido à deleção, inserção, substituição conservativa ou não conservativa de um ou mais resíduos de aminoácido ou combinações dessas. Por exemplo, em Fc de IgG, os resíduos de aminoácido conhecidos como importantes na ligação, nas posições 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322 ou 327 a 331, podem ser usados como um alvo adequado para modificação. Além disso, outros vários derivados são possíveis, incluindo derivados que tem uma deleção de uma região capaz de formar uma ligação de dissulfito, uma deleção de diversos resíduos de aminoácido no N-terminal de uma forma de Fc nativa ou uma adição de um resíduo de metionina ao N-terminal de uma forma de Fc nativa. Ademais, para remover funções efetoras, uma deleção pode ocorrer um local de ligação de complemento, como um local de ligação de C1q e um local de ADCC (citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo). Técnicas de preparo de tais derivados de sequência da região Fc da imunoglobulina são apresentados nos documentos WO 97/34631 e WO 96/32478.
[081] Trocas de aminoácido em proteínas e peptídeos, as quais geralmente não alteram a atividade de moléculas, são conhecidas na técnica (H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). As trocas que ocorrem mais comumente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly, em ambas as direções.
[082] A região Fc, se desejado, pode ser modificada por fosforilação, sulfatação, acrilação, glicosilação, metilação, farnesilação, acetilação, amidação ou similares.
[083] Os derivados de Fc mencionados anteriormente são derivados que têm uma atividade biológica idêntica àquela da região Fc da imunoglobulina da presente invenção ou uma estabilidade estrutural melhorada contra calor, pH ou similares. Além disso, essas regiões constantes da imunoglobulina podem ser obtidas a partir de formas nativas isoladas a partir de seres humanos e outros animais, incluindo vacas, cabras, porcos, camundongos, coelhos, hamsters, ratos e porquinhos-da-Índia, ou podem ser recombinantes ou derivados dessas, obtidas a partir micro-organismos ou células animais transformadas. No presente documento, podem ser obtidas a partir de uma imunoglobulina nativa isolando-se imunoglobulinas integrais de organismos humanos ou animais e tratando-os com uma enzima proteolítica. A papaína digere a imunoglobulina nativa em regiões Fab e Fc, e o tratamento com pepsina resulta na produção de pF’c e F(ab)2. Esses fragmentos podem ser submetidos à cromatografia por exclusão de tamanho para isolar Fc ou pF’c.
[084] De preferência, uma região Fc da imunoglobulina derivada de ser humano pode ser uma região constante da imunoglobulina recombinante que é obtida a partir de um micro-organismo.
[085] Na presente invenção, a ligação da região Fc da imunoglobulina e do polímero não peptídico é formada por uma ligação covalente entre o outro grupo terminal reativo do polímero não peptídico que não se liga à insulina e ao grupo amina ou tiol do resíduo de aminoácido da região Fc da imunoglobulina, como a ligação da cadeia beta da insulina e do polímero não peptídico. Portanto, o polímero não peptídico se liga ao N-terminal da região Fc da imunoglobulina ou ao grupo amina do resíduo de lisina ou ao grupo tiol do resíduo de cisteína na região Fc da imunoglobulina. Nesse sentido, não há limitação na posição do resíduo de aminoácido na região Fc da imunoglobulina, ao qual o polímero não peptídico se liga.
[086] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece uma formulação de insulina de ação prolongada com uma atividade IN VIVO melhorada, incluindo o conjugado de insulina. A formulação de ação prolongada pode ser uma composição para o tratamento de diabetes.
[087] Além disso, a presente invenção fornece um método para tratar diabetes administrando-se a formulação de insulina de ação prolongada a um indivíduo que necessita dessa.
[088] Como usado no presente documento, “administração” significa a introdução de uma substância predeterminada em um paciente através de um determinado método adequado. O conjugado da presente invenção pode ser administrada por meio de qualquer uma das vias comuns, desde que seja capaz de alcançar um tecido desejado. Administrações intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, oral, tópica, intranasal, intrapulmonar e intraretal podem ser realizadas, porém, a presente invenção não é limitada a isso. No entanto, já que os peptídeos são digeridos mediante administração oral, os ingredientes ativos de uma composição para administração oral devem ser revestido ou formulado para proteção contra degradação no estômago. De preferência, a presente composição pode ser administrada em uma forma injetável. Além disso, a formulação de ação prolongada pode ser administrada com o uso de um aparelho determinado capaz de transportar os ingredientes ativos em uma célula-alvo.
[089] A formulação de ação prolongada que inclui o conjugado da presente invenção pode incluir veículos farmaceuticamente aceitáveis. Para administração oral, o veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir um aglutinante, um lubrificante, um desintegrador, um excipiente, um solubilizador, um agente dispersante, um estabilizador, um agente de suspensão, um agente de coloração, um perfume ou similares. Para preparações injetáveis, o veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir um agente tampão, um agente conservante, um analgésico, um solubilizador, um agente isotônico e um estabilizador. Para preparações de administração tópica, o veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir uma base, um excipiente, um lubrificante, um agente conservante ou similares. A formulação de ação prolongada da presente invenção pode ser formulada em uma variedade de formas de dosagem em combinação com os veículos farmaceuticamente aceitáveis mencionados anteriormente. Por exemplo, para administração oral, a formulação pode ser preparada em tabletes, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes ou pastilhas. Para preparações injetáveis, a formulação pode ser preparada em uma ampola de dose única ou em um recipiente de múltiplas doses. A formulação também pode ser formulada em soluções, suspensões, tabletes, pílulas, cápsulas e preparações de liberação controlada.
[090] Por outro lado, exemplos de veículos, excipientes e diluentes adequados para formulação incluem lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metilcelulose, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, água, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, estearato de magnésio, óleos minerais ou similares. Além disso, a formulação pode incluir, ainda, cargas, agentes anticoagulantes, lubrificantes, umectantes, perfumes, antissépticos ou similares.
[091] Ademais, a formulação de ação prolongada da presente invenção pode ser determinada por diversos fatores relacionados, incluindo os tipos de doenças a serem tratadas, vias de administração, a idade, o sexo e o peso do paciente e a severidade da doença, bem como os tipos de fármaco como um componente ativo. Já que a composição farmacêutica da presente invenção tem duração IN VIVO e titulação excelentes, reduz significantemente a frequência de administração da formulação farmacêutica da presente invenção.
[092] A formulação de ação prolongada da presente invenção melhora a estabilidade IN VIVO da insulina, enquanto mantém sua atividade e, desse modo, é eficaz no tratamento de diabetes.
[093] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de preparação do conjugado de insulina, incluindo as etapas de: (1) ligar covalentemente um polímero não peptídico a um resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina, excluindo o N-terminal dessa; (2) isolar um complexo de insulina, em que o polímero não peptídico é covalentemente ligado ao resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina, excluindo o N-terminal dessa, da mistura de reação de (1); e (3) ligar covalentemente uma região Fc da imunoglobulina à outra extremidade do polímero não peptídico da ligação isolada de modo a produzir um conjugado de insulina, em que a região Fc da imunoglobulina e a insulina são ligadas a cada extremidade do polímero não peptídico.
[094] Como descrito acima, o polímero não peptídico pode se ligar, de preferência, ao grupo amina ou ao grupo tiol da cadeia lateral do resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina para formar uma ligação de peptídeo, hemitioacetal, imina ou tiodioxopirrolidinila. Nesse sentido, ambas as extremidades do polímero não peptídico são, cada uma, independentemente, um derivado de aldeído, um derivado de maleimida ou um derivado de succinimida como um grupo reativo, porém, sem limitação.
[095] Como descrito acima, ambas as extremidades do polímero não peptídico podem se ligar, de preferência, ao grupo amina ou ao grupo tiol da cadeia lateral do resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina, excluindo o N-terminal dessa, e à região Fc da imunoglobulina, respectivamente.
[096] De preferência, o polímero não peptídico pode ter um derivado de aldeído e um derivado de succinimida como um grupo reativo em ambas as extremidades, respectivamente. Nesse sentido, a Etapa (1) pode ser realizada sob um ambiente alcalino de pH 9,0±2. Se a reação pode ser permitida sob um ambiente ácido de menos de pH 7, o polímero não peptídico pode se ligar ao grupo amina no N-terminal. A faixa de pH acima pode ser controlada, dependendo do tipo do grupo reativo do polímero não peptídico e do tipo do grupo reativo do resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina, o qual reage com esse, por exemplo, um grupo amina ou um grupo tiol. Por exemplo, se um PEG que tem um derivado de succinimida como um grupo reativo é usado como o polímero não peptídico e é destinado a ser ligado ao grupo amina da lisina na insulina, o pH é controlado a 9,0, resultando na formação de um complexo de insulina, em que o polímero não peptídico se liga de modo seletivo ao grupo amina da lisina e não ao grupo amina no N-terminal.
[097] Na Etapa (1) de ligação do polímero não peptídico à cadeia beta da insulina, uma razão molar de reação entre a insulina e o polímero pode ser, de preferência, 1:1,5 a 1:10 e, mais preferencialmente, 1:2. Além disso, na Etapa (3) da ligação covalente da região Fc da imunoglobulina à outra extremidade do polímero não peptídico do complexo de insulina, uma razão molar entre o complexo de insulina e a região Fc da imunoglobulina pode ser, de preferência, 1:1 a 1:10 e, mais preferencialmente, 1:1.2.
[098] Em uma modalidade específica da presente invenção, a insulina é seletivamente peguilada em um alto rendimento com o uso de um ligante de PEG que contém independentemente cada um dos grupos succinimida e aldeído reativos em ambas as extremidades, e a peguilação do 29° resíduo da cadeia beta da insulina foi identificado através de um método de mapeamento (FIGS. 2 a 3). Além disso, os presentes inventores ligaram uma região constante da imunoglobulina à insulina monopeguilada então preparada de modo a preparar um conjugado de insulina-polímero não peptídico-região constante da imunoglobulina.
[099] A afinidade de ligação do conjugado de insulina preparado em relação ao receptor de insulina foi examinada. Como resultado, o conjugado de insulina mostrou uma afinidade de ligação cerca de 3,6 vezes maior do que o conjugado preparado ligando-se PEG-Fc ao N-terminal da insulina, indicando uma eficiência superior do conjugado da presente invenção.
[100] Doravante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, esses Exemplos têm propósitos ilustrativos somente e não se pretende que a invenção seja limitada por esses Exemplos.
Exemplo 1: Reação de peguilação do 29° aminoácido da cadeia beta da insulina e Purificação de insulina monopeguilada
[101] Pó de insulina foi dissolvido em HCl 10 mM e, então, foi reagido com 3,4K de butiraldeído-PEG-valerato de succinimidila (sendo que o PEG tem um grupo butil aldeído e um grupo valerato de succinimidila como grupos funcionais em cada extremidade, Laysan Bio, Inc., USA) à temperatura ambiente por cerca de 1 hora a uma razão molar de insulina:PEG de 1:2 e uma concentração de insulina de 1,5 mg/ml para peguilar o 29° resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina. Essa reação foi conduzida em borato de sódio 60,8 mM e 45% de isopropanol a pH 9,0. A solução de reação foi purificada com a coluna Source S (GE Healthcare) com o uso de um tampão que contém citrato de sódio (pH 3,0) e 45% de etanol, e um gradiente de concentração de KCl para produzir insulina monopeguilada (FIGS. 1a a 1b).
Exemplo 2: Identificação de local de peguilação da insulina monopeguilada
[102] A fim de identificar o local de ligação de 3,4K de PEG na insulina peguilhada, de acordo com o Exemplo 1, um método de mapeamento de Glu-C foi usado. 10 g de endoproteinase Glu-C com uma concentração de 1 mg/ml foram adicionados a 50 g de insulina monopeguilada com uma concentração de 1 mg/ml. A solução de reação era HEPES 50 mM a pH 7,5, e a reação foi permitida a 25 °C por 8 horas. Então, 50 l de HCl 1 N foram adicionados para terminar a reação. A cromatografia reversa de CLAE foi usada para mapeamento. O resultado é dado na FIG. 2.
[103] Como mostrado na FIG. 2, um deslocamento do pico que contém o 29° aminoácido da cadeia beta da insulina foi observado, indicando peguilação do 29° aminoácido da cadeia beta da insulina com 3,4K de PEG.
Exemplo 3: Preparação de conjugado de insulina monopeguilada e imunoglobulina Fc
[104] Para preparar um conjugado insulina-PEG-fragmento Fc da imunoglobulina, a insulina monopeguilada preparada pelo método do Exemplo 1 e um fragmento Fc da imunoglobulina foram reagidos a uma razão molar de 1:1,2 com um nível de proteína total de 20 mg/ml a 25 °C por 13 horas. Nesse sentido, a solução de reação continha HEPES 100 mM e cloreto de sódio 2 M (NaCl) a pH 8,2, e continha, ainda, cianoborohidrato de sódio 20 mM como um agente redutor.
[105] Após a finalização da reação, a solução de reação foi passada através da coluna Source Q (GE Healthcare) para separar e purificar a insulina não reagida, o fragmento Fc da imunoglobulina não reagido, o conjugado insulina-PEG-fragmento Fc da imunoglobulina e o conjugado de fragmento Fc da imunoglobulina acoplado a duas ou mais insulinas monopeguiladas (insulina-PEG) com o uso de tampão Tris-HCl (pH 7,5) e um gradiente de concentração de NaCl.
[106] Então, a coluna Source ISO (GE Healthcare) foi usada para remover qualquer Fc da imunoglobulina residual e conjugado de insulina acoplado de modo múltiplo, obtendo, desse modo, o conjugado insulina-PEG-Fc da imunoglobulina. Nesse caso, a eluição foi conduzida com o uso de um gradiente de concentração de sulfato de amônio que contém Tris-HCl (pH 7,5). A pureza do conjugado então preparado foi analisada por CLAE com o uso de cromatografia reversa, cromatografia de troca iônica e cromatografia por exclusão de tamanho (FIG. 3).
Exemplo 4: Medição de afinidade de ligação do receptor de insulina do conjugado de insulina de acordo com o local de ligação PEG-Fc na cadeia beta da insulina
[107] A fim de medir afinidades de ligação do receptor de insulina de um conjugado de insulina preparado ligando-se PEG-Fc ao N-terminal da insulina e um conjugado de insulina ligando-se PEG-Fc a B29, a RPS (ressonância de plasma de superfície, BIACORE 3000) foi usada. Como os receptores de insulina, o ECD (domínio extracelular) foi expresso em célula HEK293F e, então, foi purificado. Os receptores de insulina então expressos foram imobilizados em um chip CM5 por acoplamento de amina, e 1 M a 6,25 nM do conjugado de insulina em N-terminal ou B29 foram aplicados e suas afinidades de ligação foram medidas. Esses conjugados de insulina foram diluídos com o uso de um tampão de ligação (HBS-EP) e ligados ao chip imobilizado do conjugado de insulina por 4 minutos, e dissociados por 6 minutos. Então, para ligar os conjugados de insulina a diferentes concentrações, NaCl 50 mM/NaOH 5 mM foi aplicado aos conjugados de insulina acoplados aos receptores de insulina por cerca de 30 segundos. A afinidade de ligação foi analisada com o uso do modelo de ligação de Langmuir 1:1 do programa de software BIAevaluation. Os resultados são mostrados na FIG. 4.
[108] Como mostrado na FIG. 4, encontrou-se que ambos os conjugados de insulina do N-terminal e de B29 se ligam a receptores de insulina de uma maneira dependente de concentração. As afinidades de ligação desses conjugados de insulina em relação a receptores de insulina são mostradas na Tabela 1. Em detalhes, o conjugado de insulina de B29 tem uma constante de taxa de associação que é cerca de 1,8 vezes maior do que aquela do conjugado de insulina do N-terminal, indicando que a ligação do conjugado de insulina do B29 ao receptor de insulina é mais rápida do que o conjugado de insulina do N-terminal. O conjugado de insulina de B29 tem uma constante de taxa de dissociação que é cerca de 1,8 vezes menor do que aquela do conjugado de insulina do N-terminal, indicando que, após a ligação, a ligação do conjugado de insulina de B29 ao receptor de insulina é mantida de modo mais estável. Os resultados da comparação da afinidade de ligação entre o conjugados de insulina do N-terminal e de B29 mostraram que a afinidade de ligação do conjugado de insulina de B29 é cerca de 3,6 vezes maior do que aquela do conjugado de insulina do N-terminal.
[109] [Tabela 1]
[110] Comparação da afinidade de ligação do receptor de insulina entre o conjugado de insulina do N-terminal e o conjugado de insulina de B29
[111] ka: constante de taxa de associação
[112] kd: constante de taxa de dissociação
[113] KD: constante de afinidade
[114] Com base na descrição acima, ficará evidente para aqueles que são versados na técnica que diversas modificações e alterações podem ser realizadas sem que haja desvio do escopo e do espírito da invenção. Portanto, deve-se compreender que a modalidade acima não é limitante, porém, é ilustrativa em todos os aspectos. O escopo da invenção é definido pelas reivindicações anexas em vez de o ser pela descrição as precede e, portanto, todas as alterações e modificações que estejam dentro dos limites das reivindicações ou equivalentes de tais limites são destinadas, portanto, a serem abrangidas pelas reivindicações.
Efeito da invenção
[115] O conjugado de insulina da presente invenção exibe uma afinidade de ligação significantemente aumentada em relação a receptores de insulina e, desse modo, a atividade IN VIVO da insulina se torna muito melhorada, sendo usada, assim, no desenvolvimento de uma formulação de insulina de ação prolongada com alta eficiência.

Claims (28)

1. Conjugado de insulina caracterizado por a insulina e uma região Fc da imunoglobulina serem ligadas uma à outra por meio de um ligante (linker) de polímero não peptídico selecionado a partir do grupo que consiste em polietilenoglicol, polipropilenoglicol, um copolímero de etilenoglicol- propilenoglicol, poliol polioxietilado, álcool polivinílico, polissacarídeo, dextrano, etil éter polivinílico, um polímero biodegradável, um polímero lipídico, quitina, ácido hialurônico e uma combinação desses, e uma extremidade do polímero não peptídico é ligada a qualquer um dos resíduos de aminoácido nas posições 20 a 29 de uma cadeia beta da insulina, e a outra extremidade desse é ligada à região Fc da imunoglobulina, em que a insulina é selecionada do grupo que consiste no seguinte (i) e (ii): (i) uma insulina nativa compreendendo um primeiro peptídeo de SEQ ID No: 1 e um segundo peptídeo de SEQ ID No: 2; e (ii) um fragmento da insulina definida no item (i) em que o fragmento tem a função de controlar o nível de glicose no sangue em um corpo de sujeito ao qual o referido fragmento de insulina é administrado.
2. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polímero não peptídico ser ligado a qualquer um dos resíduos de aminoácido nas posições 25 a 29 da cadeia beta da insulina.
3. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polímero não peptídico ser ligado ao resíduo de lisina na posição 29 da cadeia beta da insulina.
4. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina, ao qual o polímero não peptídico é ligado, ter um grupo amina ou um grupo tiol.
5. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ambas as extremidades do polímero não peptídico serem ligadas a um grupo amina ou um grupo tiol da cadeia lateral do resíduo de aminoácido de uma região Fc da imunoglobulina e da cadeia beta da insulina, respectivamente.
6. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o aminoácido ser um aminoácido de ocorrência natural ou de ocorrência não natural.
7. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a região Fc da imunoglobulina ser aglicosilada.
8. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a região Fc da imunoglobulina ser composta por um a quatro domínios selecionados a partir do grupo que consiste em domínios CH1, CH2, CH3 e CH4.
9. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a região Fc da imunoglobulina incluir, ainda, uma região de dobradiça.
10. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a região Fc da imunoglobulina ser uma região Fc derivada de IgG, IgA, IgD, IgE ou IgM.
11. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por cada domínio da região Fc da imunoglobulina ser um híbrido de domínios de uma origem diferente derivada de uma imunoglobulina selecionada a partir do grupo que consiste em IgG, IgA, IgD, IgE e IgM.
12. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a região Fc da imunoglobulina ser um dímero ou um multímero composto por imunoglobulinas de cadeia única compostas por domínios da mesma origem.
13. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a região Fc da imunoglobulina ser uma região Fc da IgG4.
14. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a região Fc da imunoglobulina ser uma região Fc da IgG4 aglicosilada humana.
15. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polímero não peptídico se ligar ao grupo amina ou ao grupo tiol da cadeia lateral do resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina para formar uma ligação peptídica, hemitioacetal, imina ou tiodioxopirrolidinila.
16. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ambas as extremidades do polímero não peptídico se ligarem independentemente por meio de um grupo reativo selecionado a partir do grupo que consiste em um grupo aldeído, um grupo propionaldeído, um grupo butiraldeído, um grupo maleimida e um derivado de succinimida.
17. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o derivado de succinimida ser carboximetila de succinimidila, valerato de succinimidila, metil butanoato de succinimidila, metil propionato de succinimidila, butanoato de succinimidila, propionato de succinimidila, N- hidroxisuccinimida ou carbonato de succinimidila.
18. Conjugado de insulina, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por ambas as extremidades do polímero não peptídico se ligarem por meio de um grupo butiraldeído reativo ou um grupo valerato de succinimidila reativo, respectivamente.
19. Formulação de insulina de ação prolongada caracterizada por ter uma duração in vivo e uma estabilidade melhoradas, a qual compreende o conjugado de insulina, tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.
20. Formulação de insulina de ação prolongada, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada por a formulação ser usada para o tratamento de diabetes.
21. Método de preparação do conjugado de insulina, tal como definido na reivindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: (1) ligar covalentemente um polímero não peptídico a qualquer um dos resíduos de aminoácido nas posições 20 a 29 da cadeia beta da insulina, excluindo o N-terminal dessa; (2) isolar um complexo de insulina, em que o polímero não peptídico é covalentemente ligado ao resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina, excluindo o N-terminal dessa, da mistura de reação de (1); e (3) ligar covalentemente uma região Fc da imunoglobulina à outra extremidade do polímero não peptídico do complexo isolado de modo a produzir um conjugado de insulina, em que a região Fc da imunoglobulina e a insulina são ligadas a cada extremidade do polímero não peptídico.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o polímero não peptídico se ligar ao grupo amina ou ao grupo tiol da cadeia lateral do resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina para formar uma ligação peptídica, hemitioacetal, imina ou tiodioxopirrolidinila.
23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por ambas as extremidades do polímero não peptídico terem, cada uma, independentemente, um derivado de aldeído, um derivado de maleimida ou um derivado de succinimida como um grupo reativo.
24. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por ambas as extremidades do polímero não peptídico serem ligadas a um grupo amina ou um grupo tiol da cadeia lateral do resíduo de aminoácido da cadeia beta da insulina e a uma região Fc da imunoglobulina, respectivamente.
25. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por ambas as extremidades do polímero não peptídico terem, cada uma, independentemente, um grupo butiraldeído ou um grupo valerato de succinimidila reativo.
26. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a Etapa (1) ser realizada sob um ambiente alcalino de pH 9,0±2.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, caracterizado por uma razão molar entre a insulina e o polímero não peptídico na Etapa (1) ser de 1:1,5 a 1:10.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, caracterizado por uma razão molar entre o complexo de insulina e a região Fc da imunoglobulina na Etapa (3) ser de 1:1 a 1:10.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
KR20160101702A (ko) * 2015-02-17 2016-08-25 한미약품 주식회사 지속형 인슐린 또는 이의 아날로그 결합체
AR105616A1 (es) 2015-05-07 2017-10-25 Lilly Co Eli Proteínas de fusión
UY36870A (es) * 2015-08-28 2017-03-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogos de insulina novedosos
RU2764197C1 (ru) 2016-09-23 2022-01-14 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Аналоги инсулина с пониженной аффинностью к рецептору инсулина и их применение
CA3054899A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Insulin analog complex with reduced affinity for insulin receptor and use thereof
JP2020535199A (ja) * 2017-09-29 2020-12-03 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 効力が向上した持続性タンパク質結合体

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
DE69731289D1 (de) 1996-03-18 2004-11-25 Univ Texas Immunglobulinähnliche domäne mit erhöhten halbwertszeiten
KR101135244B1 (ko) * 2007-11-29 2012-04-24 한미사이언스 주식회사 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물
WO2007140282A1 (en) 2006-05-24 2007-12-06 Peg Biosciences Peg linker compounds and biologically active conjugates thereof
HUE030373T2 (en) * 2009-03-20 2017-05-29 Hanmi Science Co Ltd A method for producing a site-specific conjugate of a physiologically active polypeptide
AR081066A1 (es) 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
KR101330868B1 (ko) * 2010-06-08 2013-11-18 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 단편을 이용한 인슐린 유도체 약물 결합체
AU2011268327B2 (en) * 2010-06-16 2016-02-25 Indiana University Research And Technology Corporation Single chain insulin agonists exhibiting high activity at the insulin receptor
CN103533952B (zh) 2011-03-15 2017-02-15 诺沃—诺迪斯克有限公司 包含半胱氨酸置换的人胰岛素类似物和衍生物
CN102675452B (zh) * 2011-03-17 2015-09-16 重庆富进生物医药有限公司 具持续降血糖和受体高结合的人胰岛素及类似物的偶联物
UA113626C2 (xx) * 2011-06-02 2017-02-27 Композиція для лікування діабету, що містить кон'югат інсуліну тривалої дії та кон'югат інсулінотропного пептиду тривалої дії
SG195192A1 (en) * 2011-06-02 2013-12-30 Hanmi Science Co Ltd Non-peptidyl polymer-insulin multimer and method for producing the same

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