CN101463078A - 一种Exendin-4衍生物及其固相化学合成 - Google Patents
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Abstract
一种具有Exendin－4活性的Exendin－4衍生物及其制备和应用，属于生物工程技术领域。该衍生物的分子结构式为以下任何一种结构：Exendin－4(1－39)－Xaa40(Seq ID No.2)，Exendin－4(1－39)－Xaa40－Xaa41(Seq ID No.3)，Exendin－4(1－39)－Xaa40－Xaa41－Xaa42(Seq ID No.4)，Exendin－4(1－30)－Xaa31(SeqID No.6)，Exendin－4(1－30)－Xaa31－Xaa32(Seq ID No.7)，和/或Exendin－4(1－30)－Xaa31－Xaa32－Xaa33(Seq ID No.8)，其中Xaa40，Xaa41，Xaa42，Xaa31，Xaa32和Xaa33分别是Cys，Ala，Gly，His，Ser和Thr中的任何一个氨基酸。本发明Exendin－4衍生物具有长于Exendin－4体内药效时间的优点。本发明采用固相化学合成制备Exendin－4衍生物，生产步骤少，生产成本低。本发明Exendin－4衍生物特别适合于作为制备治疗糖尿病的药物中的活性成分。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有Exendin-4活性的Exendin-4衍生物及其固相化学合成，属于生物工程技术领域。
背景技术
糖尿病是威胁人类健康的三大疾病之一，发病率极高，且呈逐年上升趋势，其显著临床症状是血和尿中的葡萄糖含量超出正常范围，伴随“三多一少”即多食、多饮、多尿及消瘦。其中II型糖尿病患者占90％以上，长期以来人们主要通过磺酰脲类和双胍类等药物来治疗II型糖尿病，但这些药物副作用较大，长期使用会导致胰腺β细胞衰竭。人体内分泌的一种胰高血糖素样肽1(GLP-1)可以在血糖较高时刺激胰岛素分泌，从而降低血糖。但GLP-1在体内会迅速被二肽基肽酶IV(DPPIV)降解失活，其半衰期不足2分钟，所以限制了其临床应用。
近年来，对GLP-1类似物Exendin-4的研究进展较快，应用于治疗糖尿病效果较好。天然Exendin-4存在于美洲一种毒蜥的唾液中，是一种含有39个氨基酸的多肽，分子量约4.186kD。Exendin-4的生理功能主要包括：(1)促进胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的释放，从而达到降血糖效果；(2)通过减缓胃肠道的蠕动，使食物的吸收减慢，从而降低食物中的葡萄糖在血液中出现的高峰；(3)减缓胃肠道蠕动，增加饱足感，使人食欲下降，从而减轻体重；(4)刺激胰岛细胞增殖，抑制β细胞凋亡，从而增加胰岛β细胞数量；(5)增加外周组织对胰岛素的敏感性。Exendin-4的促胰岛素分泌作用依赖于葡萄糖浓度，用于糖尿病治疗时不会引起低血糖，因而在II型糖尿病治疗方面有较好的应用前景。
目前已上市的Exenatide(酰胺化的Exendin-4)可降低II型糖尿病患者的空腹和餐后血糖，对II型糖尿病有较好的疗效。然而由于其半衰期较短(2~4小时)，需每日皮下注射两次，给患者带来极大痛苦。
国内外对Exendin-4的研究方向之一是通过对其结构进行改变或修饰，以提高产量、增加稳定性。从Exendin-4的C端缩短肽链长度可得到一系列截短型的Exendin-4多肽片段，其中部分截短型Exendin-4可保持降血糖活性并有利于满足化学合成和基因工程方法生产的要求，提高产量、降低成本；通过改变肽链中某些氨基酸的种类可得到各种Exendin-4衍生物，在保留活性基础上更易于用基因工程方法制备，有利于降低生产成本；用一个或多个聚乙二醇修饰Exendin衍生物，修饰后的Exendin衍生物具有稳定性高、半衰期长、免疫原性低的特点。
研究表明，Exendin-4的C端9肽对其活性有重要作用，故上述截短型Exendin-4与原肽相比，活性都会出现不同程度的下降；改变肽链中氨基酸种类的方法虽利于生产，但提高稳定性、延长体内药效时间的作用并不显著，如：在第14位上把Met替换成Leu、在第25位上把Trp替换成Phe得到的Exendin-4类似物与Exendin-4相比体内药效时间并未延长；采用聚乙二醇修饰Exendin衍生物的制备工艺较复杂，产物分离纯化困难，而且得率很低，不利于工业化生产。可见上述Exendin-4及其衍生物在临床应用上还是存在较大的缺陷，因此迫切需要开发体内药效时间更长的、制备工艺快速简便且便于临床使用的新型Exendin-4衍生物。
发明内容
本发明涉及的“Exendin-4”包括Exendin-4(1-39)，其序列(Seq ID No.1)如下：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser。
本发明涉及的“Exendin-4”还包括Exendin-4的截短形式Exendin-4(1-30)，其序列(Seq ID No.5)如下：
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly。
本发明的第一个目的是提出一种Exendin-4衍生物，其特征在于，该衍生物的分子结构式为以下之任何一种结构：Exendin-4(1-39)-Xaa40(Seq ID No.2)，Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41(Seq ID No.3)，Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42(Seq ID No.4)；Exendin-4(1-30)-Xaa31(Seq ID No.6)，Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32(Seq ID No.7)和Exendin-4(1-30)Xaa31-Xaa32-Xaa33(Seq ID No.8)，其中Xaa40，Xaa41，Xaa42，Xaa31，Xaa32和Xaa33分别是Cys，Ala，Gly，His，Ser和Thr中的任何一个氨基酸。
所述Exendin-4衍生物的进一步特征在于，该衍生物为以下六种结构之任何一种：Exendin-4(1-39)-Xaa40(Seq ID No.2)，Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41(Seq ID No.3)，Exendin-4(1-39)-Xaa40Xaa41-Xaa42(Seq ID No.4)；Exendin-4(1-30)-Xaa31(Seq ID No.6)，Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32(Seq ID No.7)和Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32-Xaa33(Seq ID No.8)，其中Xaa40和Xaa31＝Cys，Xaa41，Xaa42，Xaa32和Xaa33分别＝Cys，Ala，Gly，His，Ser和Thr中的任何一个氨基酸。
所述Exendin-4衍生物的进一步特征在于，该衍生物为以下四种结构之任何一种：Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41(Seq ID No.3)，Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42(Seq ID No.4)；Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32(Seq IDNo.7)和Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32-Xaa33(Seq ID No.8)，其中Xaa41和Xaa32＝Cys，Xaa40，Xaa42，Xaa31和Xaa33分别＝Cys，Ala，Gly，His，Ser和Thr中的任何一个氨基酸。
所述Exendin-4衍生物的进一步特征在于，该衍生物为以下两种结构之任何一种：Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42(Seq ID No.4)；Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32-Xaa33(Seq ID No.8)，其中Xaa42和Xaa33＝Cys，Xaa40，Xaa41，Xaa31和Xaa32分别＝Cys，Ala，Gly，His，Ser和Thr中的任何一个氨基酸。
本发明通过对Exendin-4构效关系的长期研究发现：Exendin-4的天然形式Exendin-4(1-39)以及截短形式如Exen din-4(1-30)等的体内药效时间较短，而目前通过氨基酸定点突变得到的一些Exendin-4类似物并未显著延长体内药效时间。本发明采用全新的思路对Exendin-4(1-39)及Exendin-4(1-30)的氨基酸序列进行设计和改造，通过固相化学合成方法得到上述Exendin-4衍生物。经过多次动物体内药效学实验表明，上述Exendin-4衍生物不仅保持了天然Exendin-4在体内的降血糖活性，而且其在体内的药效持续时间显著地得到延长(约为改造前的2-3倍)，具有良好的临床应用价值，适于作治疗糖尿病药物的活性成分。
本发明的第二个目的是提供采用固相化学合成技术制备上述Exendin-4衍生物的方法。
所述Exendin-4衍生物的固相化学合成方法，具体操作步骤如下：
(1)需用的带保护基的氨基酸单体共有19个，它们是：Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，其中缩写表示：
Fmoc：9-芴基甲氧羰基
Boc：叔丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl)
Trt：三苯甲基(trityl)
OtBu：叔丁基酯
tBu：叔丁基(tert-butyl)
Pbf：2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-苯磺酰基；
(2)需用的仪器设备及试剂
仪器：SYMPHONY型12通道多肽合成仪，型号：SYMPHONY，美国产品
试剂：N-甲基吡咯烷酮，二氯甲烷，六氢吡啶，甲醇，二甲氨基吡啶(Dimethylaminopyridine)/DMFN，N-二异丙基乙胺(N，N-diisopropylethylamine)/NMP，HBTU 100mmol/0.5M HOBT in DMF N，N-二环己基碳二亚胺(N，N-Dicyclohexylcarbodiimide)/NMP，
其中DMF为N，N-二甲基甲酰胺
NMP为N-甲基吡咯烷酮
HOBT为1-羟基苯并三唑
HBTU为2-(1氢苯并三唑基)-四甲基脲六氟磷酸盐(2-1H-benzotriazole-yl-1，3，3-tetramethyl-Uroniumhexafluorophosphate)；
(3)操作：
第一步多肽树脂的合成
当多肽C端以羧基结尾时，采用王氏树脂；当多肽C端以酰氨结尾时，采用Rink Amide MBHA树脂。以0.25mmol规模为例，称取王氏树脂0.25g，置入SYMPHONY型12通道多肽合成仪上的反应器中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列从C-端向N-端排列在所述的合成仪中，25℃下，由计算机程序控制自动进行脱Fmoc保护、活化、连接，然后再进行下一轮循环，如此完成合成，得到带侧链保护基的多肽树脂，在所述的合成仪上吹干、称重；
第二步脱保护基及切断树脂
将第一步得到的带侧链保护基的多肽树脂置于具塞三角烧瓶，加入0.25mL水、0.25mL EDT、1ml TIS、9.45mL三氟乙酸作为裂解试剂，然后在30℃下，电磁搅拌反应2小时，过滤，收集滤液，树脂用三氟乙酸洗涤，合并收集液与洗涤液，加入乙醚产生沉淀，过滤，沉淀用乙醚洗涤，干燥，得粗品；
第三步HPLC分离纯化、冷冻干燥
将第二步得到的粗品用制备型HPLC进行分离纯化，再经冷冻干燥，得产品Exendin-4衍生物。
若采用基因工程法制备该衍生物，则至少包括以下步骤：第一步，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列通过PCR或人工合成获得基因片段；第二步，以适合于表达单独的蛋白质或融合蛋白的方式将编码序列放入表达载体；第三步，用含有Exendin-4衍生物或融合的Exendin-4衍生物基因序列的表达载体转化适当的原核生物的宿主细胞，获得基因工程菌株；第四步，将基因工程菌株经液体发酵，经离心获得含有Exendin-4衍生物融合蛋白或单独含有Exendin-4衍生物蛋白的湿菌体；第五步，将湿菌体破壁，经分离获得含Exendin-4衍生物融合蛋白或单独含有Exendin-4衍生物蛋白的粗品；第六步，经HPLC纯化、冷冻干燥制得产品Exendin-4衍生物。
与基因工程法相比，本发明提供的制备Exendin-4衍生物的固相化学合成方法，生产步骤少，生产周期短，工艺快速简便。本发明固相化学合成方法制备的Exendin4衍生物具有显著地长于Exendin-4的体内药效持续时间，适合于作治疗糖尿病药物的活性成分。
本发明的第三个目的是提供Exendin-4衍生物在制备预防或治疗糖尿病的药物中作药物活性成分的应用。
本发明的第四个目的是提供含有有效量Exendin-4衍生物以及药学可接受的成分的组合物。
本发明的Exendin-4衍生物优选以无菌冻干物形式储存，在给药前与合适的等渗溶液混合，其中含有药学上可接受的成分如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠等，然后可通过静脉注射、腹腔注射或皮下注射等方式给药。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步详述本发明的技术方案，说明书及以下实施例中所用带保护基的氨基酸单体以及其它化学试剂等，均可以从相关公司购买获得，未注明具体条件的实验方法，可按常规条件进行，或按商品所建议的条件进行。所有的实施例均使用发明内容中的合成方法规定的仪器设备及试剂和按照发明内容中的合成方法规定的步骤进行操作，这里就不重复，所有的实施例仅罗列与各自产品有关的关键步骤。
实施例1本发明提供的Exendin-4衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No.2，其中Xaa40＝Cys。
实施例2本发明提供的Exendin-4衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No.3，其中Xaa40＝Cys，Xaa41＝Gly。
实施例3本发明提供的Exendin-4衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No.3，其中Xaa40＝Gly，Xaa41＝Cys。
实施例4本发明提供的Exendin-4衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No.4，其中Xaa40＝Cys，Xaa41＝Ala，Xaa42＝Gly。
实施例5本发明提供的Exendin-4衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No.4，其中Xaa40＝Ala，Xaa41＝Cys，Xaa42＝Gly。
实施例6本发明提供的Exendin-4衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No.4，其中Xaa40＝Ala，Xaa41＝Gly，Xaa42＝Cys。
实施例7本发明提供的Exendin-4衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No.6，其中Xaa31＝Cys。
实施例8本发明提供的Exendin-4衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No.7，其中Xaa31＝Cys，Xaa32＝Gly。
实施例9本发明提供的Exendin-4衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No.7，其中Xaa31＝Gly，Xaa32＝Cys。
实施例10本发明提供的Exendin-4衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No.8，其中Xaa31＝Cys，Xaa32＝Ala，Xaa33＝Gly。
实施例11本发明提供的Exendin-4衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No.8，其中Xaa31＝Ala，Xaa32＝Cys，Xaa33＝Gly。
实施例12本发明提供的Exendin-4衍生物的氨基酸序列，如Seq ID No.8，其中Xaa31＝Ala，Xaa32＝Gly，Xaa33＝Cys。
实施例13固相化学合成法合成本发明的Exendin-4衍生物，该衍生物具有以下结构：Exendin-4(1-39)-Xaa40(Seq ID No.2)，其中Xaa40＝Cys，操作步骤：
(1)需用的带保护基的氨基酸单体共有19个，它们是：Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH，其中缩写表示：
Fmoc：9-芴基甲氧羰基
Boc：叔丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl)
Trt：三苯甲基(trityl)
OtBu：叔丁基酯
tBu：叔丁基(tert-butyl)
Pbf：2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-苯磺酰基；
(2)需用的仪器设备及试剂
仪器：SYMPHONY型12通道多肽合成仪，型号：SYMPHONY，美国产品
试剂：N-甲基吡咯烷酮，二氯甲烷，六氢吡啶，甲醇，二甲氨基吡啶(Dimethylaminopyridine)/DMFN，N-二异丙基乙胺(N，N-diisopropylethylamine)/NMP，HBTU 100mmol/0.5M HOBT in DMF N，N-二环己基碳二亚胺(N，N-Dicyclohexylcarbodiimide)/NMP，
其中DMF为N，N-二甲基甲酰胺
NMP为N-甲基吡咯烷酮
HOBT为1-羟基苯并三唑
HRTU为2-(1氢苯并三唑基)-四甲基脲六氟磷酸盐(2-1H-benzotriazole-yl-1，3，3-tetramethyl-Uroniumhexafluorophosphate)；
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.2)从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品Exendin-4衍生物，该产品具有本发明提出的Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.2)，在该序列中，Xaa40＝Cys。
实施例14固相化学合成法合成本发明的Exendin-4衍生物，该衍生物具有以下结构：Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41(Seq ID No.3)，其中Xaa40＝Cys，Xaa41＝Gly，操作步骤：
(1)(2)同实施例13。
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.3)从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品Exendin-4衍生物，该产品具有本发明提出的Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.3)，在该序列中，Xaa40＝Cys，Xaa41＝Gly。
实施例15固相化学合成法合成本发明的Exendin-4衍生物，该衍生物具有以下结构：Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41(Seq ID No.3)，其中Xaa40＝Gly，Xaa41＝Cys，操作步骤：
(1)(2)同实施例13。
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.3)从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品Exendin-4衍生物，该产品具有本发明提出的Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.3)，在该序列中，Xaa40＝Gly，Xaa41＝Cys。
实施例16固相化学合成法合成本发明的Exendin-4衍生物，该衍生物具有以下结构：Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42(Seq ID No.4)，其中Xaa40＝Cys，Xaa41＝Ala，Xaa42＝Gly，操作步骤：
(1)(2)同实施例13。
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取lmmol装瓶，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.4)从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品Exendin-4衍生物，该产品具有本发明提出的Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.4)，在该序列中，Xaa40＝Cys，Xaa41＝Ala，Xaa42＝Gly。
实施例17固相化学合成法合成本发明的Exendin-4衍生物，该衍生物具有以下结构：Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42(Seq ID No.4)，其中Xaa40＝Ala，Xaa41＝Cys，Xaa42＝Gly，操作步骤：
(1)(2)同实施例13。
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.4)从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品Exendin-4衍生物，该产品具有本发明提出的Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.4)，在该序列中，Xaa40＝Ala，Xaa41＝Cys，Xaa42＝Gly。
实施例18固相化学合成法合成本发明的Exendin-4衍生物，该衍生物具有以下结构：Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42(Seq ID No.4)，其中Xaa40＝Ala，Xaa41＝Gly，Xaa42＝Cys，操作步骤：
(1)(2)同实施例13。
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.4)从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品Exendin-4衍生物，该产品具有本发明提出的Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.4)，在该序列中，Xaa40＝Ala，Xaa41＝Gly，Xaa42＝Cys。
实施例19固相化学合成法合成本发明的Exendin-4衍生物，该衍生物具有以下结构：Exendin-4(1-30)-Xaa31(Seq ID No.6)，其中Xaa31＝Cys，操作步骤：
(1)(2)同实施例13。
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.6)从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品Exendin-4衍生物，该产品具有本发明提出的Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.6)，在该序列中，Xaa31＝Cys。
实施例20固相化学合成法合成本发明的Exendin-4衍生物，该衍生物具有以下结构：Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32(Seq ID No.7)，其中Xaa31＝Cys，Xaa32＝Gly，操作步骤：
(1)(2)同实施例13。
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.7)从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品Exendin-4衍生物，该产品具有本发明提出的Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.7)，在该序列中，Xaa31＝Cys，Xaa32＝Gly。
实施例21固相化学合成法合成本发明的Exendin-4衍生物，该衍生物具有以下结构：Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32(Seq ID No.7)，其中Xaa31＝Gly，Xaa32＝Cys，操作步骤：
(1)(2)同实施例13。
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.7)从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品Exendin-4衍生物，该产品具有本发明提出的Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.7)，在该序列中，Xaa31＝Gly，Xaa32＝Cys。
实施例22固相化学合成法合成本发明的Exendin-4衍生物，该衍生物具有以下结构：Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32-Xaa33(Seq ID No.8)，其中Xaa31＝Cys，Xaa32＝Ala，Xaa33＝Gly，操作步骤：
(1)(2)同实施例13。
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.8)从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品Exendin-4衍生物，该产品具有本发明提出的Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.8)，在该序列中，Xaa31＝Cys，Xaa32＝Ala，Xaa33＝Gly。
实施例23固相化学合成法合成本发明的Exendin-4衍生物，该衍生物具有以下结构：Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32-Xaa33(Seq ID No.8)，其中Xaa31＝Ala，Xaa32＝Cys，Xaa33＝Gly，操作步骤：
(1)(2)同实施例13。
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.8)从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品Exendin-4衍生物，该产品具有本发明提出的Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.8)，在该序列中，Xaa31＝Ala，Xaa32＝Cys，Xaa33＝Gly。
实施例24固相化学合成法合成本发明的Exendin-4衍生物，该衍生物具有以下结构：Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32-Xaa33(Seq ID No.8)，其中Xaa31＝Ala，Xaa32＝Gly，Xaa33＝Cys，操作步骤：
(1)(2)同实施例13。
(3)操作
在第一步中，将带保护基的氨基酸单体称取1mmol装瓶，按Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.8)从C-端向N-端排列在SYMPHONY型12通道多肽合成仪中：Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH；
在第三步中，得产品Exendin-4衍生物，该产品具有本发明提出的Exendin-4衍生物的氨基酸序列(Seq ID No.8)，在该序列中，Xaa31＝Ala，Xaa32＝Gly，Xaa33＝Cys。
实施例25Exendin-4衍生物的降血糖作用。
实验材料与方法：
雌性健康昆明小鼠(清洁级，上海复旦大学医学院动物中心提供)；
60％葡萄糖溶液；
0.9％NaCl溶液；
Exendin-4(1-39)；
Exendin-4(1-30)；
m39Exendin-4，具有实施例1所述Exendin-4衍生物的结构；
m30Exendin-4，具有实施例7所述Exendin-4衍生物的结构；
血糖测试仪(上海新立医疗器械有限公司出品)。
雌性健康昆明小鼠禁食过夜，分为5组(n＝10)。1，生理盐水对照组；2，Exendin-4(1-39)给药对照组；3，Exendin-4(1-30)给药对照组；4，m39Exendin-4给药组，具体的序列结构是实施例1中所述的结构；5，m30Exendin-4给药组，具体的序列结构是实施例7中所述的结构。生理盐水对照组1腹腔注射100uL的0.9％NaCl溶液；Exendin-4(1-39)给药对照组2腹腔注射0.5ug的Exendin-4(1-39)；Exendin-4(1-30)给药对照组3腹腔注射0.4ug的Exendin-4(1-30)；m39Exendin-4给药组4，每组分别腹腔注射0.5ug的m39Exendin-4；m30Exendin-4给药组5，每组分别腹腔注射0.4ug的m30Exendin-4；记此时为零时刻。1～3组于3.5、5.5、7.5、9.5、11.5、13.5小时给予100uL60％葡萄糖溶液，分别于4、6、8、10、12、14小时进行小鼠尾静脉取血10ul，用血测试糖仪测定血糖浓度；4组于3.5、7.5、11.5、13.5小时给予100uL 60％葡萄糖溶液，分别于4、8、12、14小时进行小鼠尾静脉取血10ul，用血测试糖仪测定血糖浓度；5组于3.5、5.5、7.5、9.5小时给予100uL 60％葡萄糖溶液，分别于4、6、8、10小时进行小鼠尾静脉取血10ul，用血测试糖仪测定血糖浓度。
结果如下表所示，所示数值均为n＝10的均值，所示降糖率按如下方法计算：降糖率(％)＝(生理盐水对照组血糖值给药组血糖值)/生理盐水对照组血糖值。与生理盐水对照组小鼠相比，在给药后4小时之内，Exendin-4(1-39)给药对照组和Exendin-4(1-30)给药对照组均能显著降低血糖，Exendin-4(1-39)的降血糖活性稍高于Exendin-4(1-30)。而m39Exendin-4给药组可在12小时内显著降低小鼠血糖，m30Exendin-4给药组可在8小时内显著降低小鼠血糖，药效持续时间均比Exendin-4(1-39)或Exendin-4(1-30)显著延长。
表 m39Exendin-4、m30Exendin-4的降血糖作用
实施例26包含Exendin-4衍生物的组合物
取1mg固相化学合成法制备的m30Exendin-4，溶解于0.5mL去离子水中；另取50mg甘露醇，溶解于0.5mL去离子水中；将二者混匀即为m30Exendin-4与甘露醇的组合物，其中含1mg/mL的m30Fxendin-4以及50mg/mL的甘露醇。
上述具体实施方式旨在阐述本发明的最佳实施方式而不是以任何形式限制本发明。本领域技术人员根据本发明的启示，结合本领域的常识所做的各种变更，均落在本发明专利申请权利要求的范围内。
序列表
<110>华东师范大学
<120>一种Exendin-4衍生物及其固相化学合成
<160>8
<210>1
<211>39
<212>PRT
<213>希拉毒蜥(Heloderma suspectum)
<400>1
<210>2
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(40)
<223>Xaa＝Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr
<400>2
<210>3
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(40，41)
<223>Xaa＝Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr
<400>3
<210>4
<211>42
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(40，41，42)
<223>Xaa＝Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr
<400>4
<210>5
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
<210>6
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(31)
<223>Xaa＝Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr
<400>6
<210>7
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(31，32)
<223>Xaa＝Cys，Ala，Gly，His，Ser或或Thr
<400>7
<210>8
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>合成构建体
<222>(31，32，33)
<223>Xaa＝Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr
<400>8
Claims (7)
1.一种Exendin-4衍生物，其特征在于，所述衍生物可以是以下任何一种结构：Seq ID No.2，Seq ID No.3，Seq ID No.4，Seq ID No.6，Seq ID No.7或Seq ID No.8，其中Xaa40，Xaa41，Xaa42，Xaa31，Xaa32或Xaa33分别是Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr中的任何一个氨基酸。
2.如权利要求1所述的Exendin-4衍生物，其特征在于，其中Xaa40，Xaa41，Xaa42，Xaa31，Xaa32和Xaa33分别是Cys，Ala和Gly中的任何一个氨基酸。
3.权利要求1所述Exendin-4衍生物的固相化学合成制备方法，先将树脂置入多肽合成仪，再将带保护基的氨基酸单体按照权利要求1所述Exendin-4衍生物的氨基酸序列，从C端向N端排列在所述多肽合成仪中，合成带侧链保护基的多肽树脂，再经脱保护基、切断树脂、HPLC纯化、冷冻干燥，得到所述Exendin-4衍生物；
其中，所述带保护基的氨基酸单体包括：Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Cys(Trt)-OH；
其中，当权利要求1所述Exendin-4衍生物C末端为羧基时，选择王氏树脂；当权利要求1所述Exendin-4衍生物C末端为酰胺时，选择Rink Amide MBHA树脂。
4.如权利要求3所述的制备方法，其中，所述带保护基的氨基酸单体依次为：Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Pro-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH和Fmoc-L-His(Trt)-OH时，所得产物为具有Seq ID No.2的Exendin-4衍生物，在该序列中，Xaa40＝Cys。
5.如权利要求3所述的制备方法，其中，所述带保护基的氨基酸单体依次为：Fmoc-L-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Asn(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Trp-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ile-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Ala-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Met-OH、Fmoc-L-Gln(Trt)-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-L-Ser(tBu)-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-L-Gly-OH和Fmoc-L-His(Trt)-OH时，所得产物具有Seq ID No.6的Exendin-4衍生物，在该序列中，Xaa31＝Cys。
6.权利要求1所述的Exendin-4衍生物在制备治疗糖尿病的药物中的用途。
7.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有有效量的权利要求1所述的Exendin-4衍生物，以及药学可接受的成分。
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