CN1863551A - 用于提高在体内的效力的PLP和PEG－rMETase的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及5’磷酸吡哆醛依赖性酶的修饰方法，以延长该酶的血清半衰期，延长宿主体内甲硫氨酸的清除时间，并且降低该酶的免疫原性。优选的被修饰的PLP－依赖性酶是甲硫氨酸酶，优选重组的甲硫氨酸酶(rMETase)。本发明还进一步涉及包括经修饰的PLP－依赖性酶的组合物及使用其的方法。

Description

用于提高在体内的效力的PLP和PEG-rMETase的用途
于联邦赞助研究下做出的发明权利声明
本研究部分由国立癌症研究所资助，项目编号1 R43 CA86166-01。
技术领域
本发明涉及5’磷酸吡哆醛(PLP)依赖性酶的修饰方法，以延长酶的血清半衰期，延长宿主体内甲硫氨酸的清除时间，并且降低酶的免疫原性。优选的被修饰的PLP-依赖性酶是甲硫氨酸酶，优选重组的甲硫氨酸酶(rMETase)。本发明还进一步涉及包括经修饰的PLP-依赖性酶的组合物及使用其的方法。
背景技术
前面的研究已经大量的证明多种人类肿瘤在体外对rMETase敏感。与非肿瘤细胞相比，rMETase对多种癌细胞系的IC50要低好几倍。rMETase诱发的敏感性尤其对乳腺、肾、结肠、肺和前列腺细胞系具有明显的优势。(Tan，Y.等，Protein Expr.Purif.(1997)9：233-245，Tan，Y等，Clin.Cancer Res.(1999)5：2157-2163)。在小鼠的xenograph模型中用不同的肿瘤细胞系的后续评价显示了对rMETase的类似的敏感性。另外，rMETase介导的血浆甲硫氨酸清除导致对几种不同的化疗剂的肿瘤敏感性增强。不幸的是，rMETase的免疫原性和短的血清半衰期限制了该重要的治疗剂的发展。
发明内容
以下说明涉及PLP-依赖性酶如rMETase的修饰方法，以延长该酶的血清半衰期，延长宿主体内甲硫氨酸的清除时间，并降低酶的免疫原性。本发明还进一步涉及包括经修饰的PLP-依赖性酶的组合物及使用其的方法。
甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基戊二酸酯PEG(methoxypolyethyleneglycol succinimidyl glutarate PEG)(MEGC-PEG)用来对rMETase传递新的分子和功能优势。有效的酶血清半衰期和甲硫氨酸的清除时间的显著延长是通过rMETase的PEG化实现的。酶的免疫原性也因PEG化而有利地降低。并且也观察到rMETase的PEG化降低了酶对5’磷酸吡哆醛(PLP)的依赖性，PLP是rMETase功能需要的辅助因子。
图例的简单说明
图1：显示了MEGC-50HS-PEG(甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基戊二酸酯-PEG)的化学结构。
图2：显示了原型(naked)和PEG化的rUETase的SDS-PAGE结果。
图3：显示了原型和PEG化的rUETase的几个MALDI谱图。
图4：是描述小鼠经静脉注射原型和PEG化rMETase后的血浆酶活性的图。
图5：是描述小鼠经静脉注射原型和PEG化的rMETase后的血浆甲硫氨酸清除的图。
图6：是描述小鼠在没有植入和植入PLP泵时的血浆PLP浓度图。
图7：是描述小鼠植入PLP泵并经静脉注射原型和PEG化的rMETase后的血浆甲硫氨酸清除的图。
图8：是描述被标明的PEG化的rMETase在有和没有PLP补充的情况下清除的血浆甲硫氨酸水平的比值。原始数据参照图5和图7。
本发明的其它特点和优势随着以下的详细叙述以及权利要求将会得到明显显示。
本发明的实施方式
蛋白与聚乙二醇(PEG)的偶联已显示可以增加不同治疗性蛋白的血清半衰期并降低免疫原性(Kozlowski，A.和Harris，J.M.，J.Control Release(2001)72：217-224)。PEG-偶联的蛋白显示增加可溶性、降低抗原性、降低对蛋白水解的敏感性、降低肾清除速率。PEG偶联物还显示增加选择性的肿瘤靶向性。
FDA已经批准的PEG化的蛋白治疗剂有腺苷脱氨酶、天冬酰胺酶、α-干扰素(IFN)和生长激素拮抗剂(Olson，K.等，(1997) Poly(ethyleneglycol)： Chemistry and Biological Applications(J.M.Harris，S.Zalipsky，eds.)，ACSBooks，Washington，DC，pp.170-181)。治疗丙型肝炎的PEG-α-IFN(Park，C.W.G.和Chuo，M.，(1999)美国专利5,951,974)最近有两种形式获得批准。具有顽固性或复发性的成淋巴细胞白血病(ALL)的病人通过PEG-天冬酰胺酶和甲氨喋呤、长春新碱和泼尼松联合用药进行治疗(Aguayo，A等，Cancer(1999)86：1203-1209)。腺苷脱氨酶(ADA)的遗传缺乏产生抑制免疫系统发育的缺陷，使得病人对几乎任何类型的感染都敏感。PEG-ADA显著地加强了这些病人的免疫系统(Pool，R.，Science(1990)248：305；和Hershfield，M.S.，Clin.Immunol.Immunopathol.(1995)76：S228-S232)。
除聚乙二醇外，任何的聚亚烷基二醇(polyalkylene glycol)也可以通过本发明进行应用。术语聚(亚烷基二醇)是指分子式为HO--[(烷基)O]y--OH的聚合物，其中烷基指C1到C4的直链或者支链烷基，包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基以及异丁基。Y是大于4的整数，典型地在8到500之间，更优选40-500之间。
任何PLP-依赖性酶都可以按照描述的方法使用，可以使用的酶的例子包括：胱硫醚γ-裂解酶；胱硫醚γ-合酶；O-乙酰基高丝氨酸O-乙酰基丝氨酸硫化氢解酶；天冬氨酸氨基转移酶；嗜热丙氨酸消旋酶；嗜冷丙氨酸消旋酶；L-甲硫氨酸γ-裂解酶(MGL)；L-胱硫醚β-裂解酶；L-胱硫醚γ-合酶；D-氨基酸转氨酶；D-氨基酸氨基转移酶(D-AAT)；亮氨酸脱氢酶；氨基酸消旋酶；ω氨基酸转氨酶；色氨酸合酶β亚单位样PLP依赖性酶；镍铁氢化酶；O-乙酰基丝氨酸硫化氢解酶；胱硫醚-β合酶；多巴脱羧酶；1-氨基环丙烷-1-羧化酶(carboxylate)(ACC)；L-苏氨酸脱水酶；L-丝氨酸脱水酶和甲硫氨酸酶。
PLP依赖性酶的重组形式也可以用此公开的方法。采用本领域技术人员已知的技术，PLP依赖性酶的活性能够通过突变酶的氨基酸序列，或者通过替换，或者通过失活酶的一部分而改变。PLP依赖性酶在以下有介绍：Yoshimura，T.等，Biosci.Biotechnol.Biochem.(1996)2：181-187；Motoshima，H.等，J.Biochem.(Tokyo)(2000)3：349-354；Grabowski，R.等，Trends BiochemSci.(1993)8：297-300；和van Ophem，P.W.等，Biochemistry(1999)4：1323-1331。
在优选的实施方案中，重组的甲硫氨酸酶以文中描述的方法使用。跟其它很多细菌多肽和蛋白一样，rMETase可在高等动物中具有免疫原性，这可以限制rMETase的应用，尤其是考虑多剂量应用的时候。抗METase的抗体可以加速rMETase的清除，从而降低其治疗效力。这些抗体还可以通过在酶的活性位点或者其附近结合而降低酶的效能。还可以发生对rMETase的过敏性副反应。目前的数据明显的证实PEG化形式酶的降低的免疫原性，这可能与聚合物修饰掩盖了蛋白的抗原位点相关。不管机理如何，酶的修饰显著增强了临床应用中治疗效力的潜能。
要往蛋白上偶联PEG，首先需要活化该聚合物。这是通过将聚合物的羟基末端转化为能典型地与赖氨酸和N端的氨基基团反应的官能团(Kozlowski，A.，supra(2001))。
PEG分子的每个乙烯化氧(ethylene oxide)单元与两到三个水分子结合(associate)，与水的相互作用导致PEG修饰的蛋白的行为如同它是相当分子量的蛋白的五到十倍大(Kozlowski，A.，supra(2001))。PEG化蛋白的清除速率与分子量成反比(Id.)。在体内，典型地分子量大约为20,000或更小的分子在尿中相对快速的被清除。然而，较高分子量的PEG化的蛋白在尿和粪便中被清除的较慢(Yamaoka，T.等，J.Pharm.Sci.(1994)83：601-606)。
rMETase的PEG化是通过活化PEG衍生物并且使这些衍生物与目标rMETase反应而进行的。该酶能够商品化购买，并且应该是药品级的。优选的酶是L-甲硫氨酸α-脱氨基-γ-甲硫醇(mercaptomethane)裂解酶(甲硫氨酸酶，METase)[EC 4.4.1.11]，其在假单胞菌属、气单胞菌属、梭菌属、毛滴虫属(Trichomonas)、钩虫属(Nippostrongylus)、鞘毛滴虫属(Trichomonasvaginalis)、钩虫属brasiliensis和梭杆菌属sp.中都有发现，但是在酵母、植物或哺乳类动物中没有发现。重组和非重组的METase都可以用本公开的方法使用。
活化的PEG衍生物与METase结合产生修饰酶。虽然PEG衍生物与酶的摩尔比可以小于1∶1，但是PEG衍生物优选以相对于METase摩尔过量来使用。然而，优选地PEG衍生物与酶氨基酸序列中的游离赖氨酸的摩尔比为1∶1到1000∶1。具体摩尔比的具体例子包括：1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、50∶1、75∶1、100∶1、110∶1、120∶1、130∶1、140∶1、150∶1、200∶1、500∶1、750∶1、和1000∶1。也包括PEG衍生物与酶的更高的摩尔比。
修饰具体的METase制剂的反应条件可以根据酶的来源和具体的修饰酶的PEG衍生物而不同。在优选实施方案中，将给定量的活化的PEG逐步加到METase溶液中，典型地以30分钟间隔。PEG化反应是在促进酶的修饰而不损坏蛋白的温度下进行的。在优选实施方案中，修饰反应在20-25℃在轻柔的搅拌下进行90分钟。
没有反应的活化的PEG衍生物典型地是通过柱色谱法从溶液中去除。例如，在优选实施方案中，修饰的蛋白通过凝胶过滤柱色谱法从没有反应的衍生物中分离。其它的色谱法，如亲和色谱法和离子交换色谱法也可以应用。在修饰之后，PEG化的酶制剂纯化至药品标准并以适合治疗给药的方式制备。
药物制剂和给药方法
纯化的PEG化的METase适合掺入到治疗需要其的有机体的药品中。纯化的PEG化的METase按照格林制剂学(galenic pharmacy)的常规方法进行加工生产用于哺乳动物包括人类的药物制剂。纯化的PEG化的METase在有或者没有进一步修饰的情况下可以掺入到药品中。制备以多种途径递送本发明的药理活性化合物的药物或治疗剂，是本发明的几个方面。例如，但不仅限于，具有编码感兴趣的METase序列的DNA、RNA、或者病毒载体可以采用本发明的方法用来制备METase(即rMETase)。包括PEG化的METase的药物组合物可以单独或者与其它活性成分如已知在治疗不同肿瘤疾病中有效的化疗剂组合给药。
本发明的化合物可以与常规赋形剂混合使用，如优选不有害地与本发明药理活性成分反应的适合于胃肠道外、肠(如口服)或者局部应用的药学上可接受的有机或者无机载体物质。合适的药学上可接受的载体包括但不限于：水、盐溶液、醇、阿拉伯胶、植物油、苄基醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或者淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、香料油、脂肪酸甘油一酯和甘油二酯、季戊四醇脂肪酸酯、羟基甲基纤维素、聚乙烯吡咯酮等。更多的合适的载体在 Remington’s Pharmaceutical Sciences，第15版，Mack Publishing Co.，Easton，PA，页码1405-1412和1461-1487(1975)以及在 The National Formulary XIV，第14版，Washington，AmericanPharmaceutical Association(1975)中描述。本发明公开的药物制剂可以灭菌，如果需要的话也可以与辅助剂混合，如优选不有害地与本发明药理活性成分反应的润滑剂、防腐剂、稳定剂、保湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等。
包含PEG化METase的具体药物制剂的有效剂量和给药方法可以根据病人个体需要和采用的治疗或预防措施而改变。这些化合物的治疗效力和毒性可以按照标准的药物规程(pharmaceutical procedure)在细胞培养或试验动物中进行测定，如ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。例如，文中公开的PEG化METase制剂可以在小鼠的xenographic模型上测定。修饰的酶在血浆甲硫氨酸水平、肿瘤大小、以及肿瘤对其它化疗剂的敏感性的效果可以在这样的模型系统上测定。由这些测试得到的数据然后用来形成(formulate)用于其它的有机体包括人类的剂量范围。这些化合物的剂量优选在包括没有毒性的ED50的循环(circulating)浓度的范围之内。该剂量根据一些可变的因素而在这个范围内变化，如用的METase的类型、治疗的肿瘤类型、和给药途径。
PEG化METase的通常剂量能在大约1到100,000单位间变化。在一些实施方案中，PEG化METase的剂量优选产生血清甲硫氨酸水平的降低，从大约40μM至小于10μM。期望的剂量产生甲硫氨酸的血液浓度是大约1到10μM。
正确的剂量是每个医生根据治疗的病人而选择的。调节剂量和给药途径以提供足够水平的PEG修饰的METase酶来维持减少肿瘤甲硫氨酸可用性的期望效果。可以考虑的其他因素包括疾病的严重性、受治疗者的年龄和体重；饮食、给药的时间和频率、药物组合、反应敏感性和对治疗的耐受和反应。短效的药物组合物是每天给药，而长效的药物组合物是每2、3到4天、每周、或每两周1次给药的。根据具体制剂的半衰期和清除速率，本发明的药物组合物每天给药1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或者更多次。
本发明的药物的给药途径包括但不限于：局部、透皮、胃肠道外、胃肠道、经支气管、经肺泡。透皮给药是通过施用能够允许药理活性化合物穿透皮肤的乳膏、洗液(rinse)、凝胶等而实现的。胃肠道外给药途径包括但不限于：电的(electrical)或直接的注射，如直接注射到中枢静脉管(central venousline)中、静脉内、肌肉内、腹膜内、真皮内、或者皮下注射。胃肠道给药途径包括但不限于：摄入和直肠。经支气管和经肺泡给药途径包括但不限于：吸入，或者经口或者鼻内。
包含文中描述的PEG化METase的药物组合物，适合于作为药学上可接受的混悬液、油、乳膏和软膏透皮或局部给药，直接施用到皮肤或者掺入到保护性载体中如透皮装置(“透皮贴剂”)。合适的乳膏、软膏等的例子可以在例如 Physician′s Desk Reference中找到。合适的透皮装置的例子在例如1989年4月4日出版的Chinen等的美国专利号4,818,540中有所描述。
文中描述的包含PEG化的METase的适合于胃肠道外给药的药物组合物包括但不限于药学上可接受的无菌等渗溶液。这些溶液包括但不限于：用于注射到中枢静脉管、静脉内、肌肉内、腹膜内、真皮内或皮下注射的盐水和磷酸盐缓冲的盐水。
文中描述的包含PEG化的METase的适合于经支气管和经肺泡给药的药物组合物包括但不限于吸入用的不同类型的气溶胶。适合于这些的经支气管和经肺泡给药的装置也是实施方案。这些装置包括但不限于喷雾器和蒸发器。现在应用的很多类型的喷雾器和蒸发器能够被容易地改造用来递送具有本发明药理活性化合物的组合物。
文中描述的包含PEG化的METase的适合胃肠道给药的药物组合物包括但不限于药学上可接受的粉末、丸剂或者用于吸入的液体和直肠给药的栓剂。因为使用简单，胃肠道给药尤其是口服是尤其优选的实施方案。一旦获得了文中叙述的包括PEG化METase的药物，就可以给药于需要其的受治疗者。
文中描述的药物组合物包含PEG化的酶于药学上可接受的载体中。任选地，该药物组合物可以包含其它的化合物。例如，文中描述的药物组合物中可以包含不同种类的化疗剂。合适的化疗剂的实例包括卡铂、顺铂、环磷酰胺、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素C、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、甲氨喋呤、喜树碱、依立替康、托泊替康、博来霉素、多西他赛、依托泊苷、紫杉醇、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、染料木黄酮、曲妥单抗、ZD1839；细胞毒性剂；凋亡诱导剂、细胞周期控制抑制剂、维拉帕米和环孢素A。
以下的实施例是用来向本领域的普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整的公开和说明，不用作限制本发明人认为其发明的范围，也不代表以下实验是进行的全部或仅有的实验。
实施例
PEG化rMETase的制备和纯化
重组的METase(rMETase)是由Shionogi Co.，Ltd.(大阪，日本，批号8Y003)提供的。rMETase的生产方案以前描述过(Tan，Y.，supra(1997)，Yoshioka，T.，等，Cancer Research(1998)58：2583-2587)。rMETase配制在50mM的磷酸钠缓冲液中，pH 7.2，含有10μM的PLP，蛋白浓度是31mg/ml，比活性是50.7U/mg。HPLC检测rMETase的纯度大于95％，四聚物/低聚物比值是96.7/3.3，内毒素是0.06EU/mg。
甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基戊二酸酯-5000(MEGC-50HS-PEG或者MEGC-PEG)(NOF Corporation，Kawasaki-shi，Kanagawa，日本，批号M21514)的多分散性是1.02，取代94.2％，二聚物含量0.84％，用1H-NMR测定纯度98.4％。平均分子量是5461Da。MEGC-PEG的化学结构显示于图1。
DEAE琼脂糖凝胶FF购自AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH(Piscataway，New Jersey，USA)。预制的10％ tris-甘氨酸凝胶购自NOVEX(SanDiego，CA，USA)。蓄水池(reservoir)体积200μl、泵速度1.0μl/hr以及维持时间(duration)7天(模式2001)的微型渗透泵，购自DURECT CORPORATION(Cupertino，CA，USA)。PLP和其他试剂购自SIGMA(St.Louis，MO，USA)。
活化的PEG衍生物以PEG比rMETase中游离的赖氨酸(每rMETase分子32个)摩尔过量(1-5倍)来使用，这相当于PEG与rMETase的摩尔比是30-120/1。对于每个反应，使用120mg/ml rMETase的100mM硼酸盐缓冲液(pH 8.8)。基于活化的PEG与rMETase的30-120/1的摩尔比(相当于活化的PEG与rMETase的重量比是0.87-3.5/1)，给定量的活化的PEG以30分钟间隔分三步加到rMETase溶液中。PEG化反应在20-25℃于轻轻搅拌下进行90分钟。
为了清除过量的没有反应的活化的PEG，PEG化反应之后，立即将产生的PEG-rMETase偶联物施用到Sephacryl S-300 HR凝胶过滤柱(HIPREP26/60，AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH，Piscataway，NJ，USA)上。PEG-rMETase以pH 7.4含10μM PLP、80mM氯化钠的10mM磷酸钠洗脱，流速120ml/h。
含有PEG-rMETase偶联物的级分进一步用DEAE琼脂糖凝胶FF柱(XK16/15，AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH，Piscataway，NJ，USA)来除去痕量的未PEG化的rMETase。柱子用pH 7.2含10μM PLP、80mM氯化钠的10mM磷酸钠以流速180ml/h平衡和洗脱。含有PEG-rMETase偶联物的级分流经柱子并被收集。最终纯化的PEG-rMETase溶液用AMICONCENTFJPREP YM-30(MILLIPORE CORP.，Bedford，MA，USA)浓缩，并用0.22μm的膜过滤器(FISHER SCIENTIFIC，Tustin，CA，USA)过滤除菌，并在-80℃保存。
蛋白含量的确定
根据指导手册并经轻微改动(Watanabe，N.等，Clin.Chem.(1986)32：1551-1555)，用Wako蛋白分析试剂盒(Wako Pure Chemical，大阪，日本)测定蛋白。将50μl的每个样品或者标准蛋白(BSA)加到3ml的产色溶液(焦没食子酚红钼酸盐复合物)中并良好涡旋。混合物在室温不要摇晃培养20分钟，然后测定600nm处的吸光度。样品的蛋白含量由BSA标准校正曲线测定。
rMETase活性分析
rMETase活性用由L-甲硫氨酸根据Tanaka，H.等，Biochemishy(1977)16：100-106的方法作轻微改动产生的α-酮基丁酸根(α-ketobutyrate)进行测定。将稀释于包含0.01％ DTT、1mM EDTA Na2、10μM PLP和0.05％吐温80的100mM pH 8.0磷酸钾缓冲液中的样品0.5ml，与含有25mM L-甲硫氨酸和10μM PLP的100mM pH 8.0磷酸钾缓冲液的0.5ml底物溶液在玻璃试管中混合。立即涡旋反应混合物并在37℃不要摇晃精确培养10分钟。加入0.5ml 50％的TCA终止反应。将混悬液于13,000rpm离心2分钟。将上清液(0.5ml)收集到包含有1ml 1M pH 5.0的醋酸盐缓冲液的玻璃试管中。然后将包含0.1％的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙二氢氯化物单水合物(Wako PureChemical，大阪，日本)的MBTH溶液0.4ml加入到试管中，充分混合，并于50℃培养30分钟。反应混和物的吸光度在320nm测定。分析以三次重复进行。ΔE通过从反应混和物的平均吸光度中减去空白的平均吸光度而计算。酶活性通过下面的公式计算：活性(U/ml)＝0.548(1.07+2.2ΔE)ΔE。酶的一个单位定义为：在过量(infinite)L-甲硫氨酸浓度下，每分钟产生1μM的α-酮基丁酸根的酶的量。
SDS-电泳分析
PEG-rMETase的SDS-PAGE分析是根据指导手册，用10％的NOVEX聚丙烯酰胺预制的tris-甘氨酸凝胶，在包含SDS的NOVEX tris-甘氨酸缓冲液中进行的。凝胶用考马斯亮蓝进行染色。
rMETase的PEG化程度的测定
PEG化rMETase的修饰程度是通过荧光胺分析(Karr，L.J.等，MethodsEnzymol.(1994)228：377-390)和MALDI测定的。对于荧光胺分析，将在2ml的0.1M的磷酸钠pH 8.0的缓冲液中的不同量的rMETase和PEG化rMETase与1ml的荧光胺溶液(0.3mg/ml在丙酮中)混合，并在室温培养5分钟。然后用荧光分光光度计分析样品，激发光390nm，发射光475nm。结果以荧光单位对浓度进行绘图，线的斜率通过线性回归测定。PEG化的伯胺的百分比按照下列的公式计算：
1-(PEG化rMETase的斜率/原型rMETase的斜率)×100。
原型和PEG化rMETase的MALDI分析使用PerSeptive BiosystemsVOYAGER-ELITE质谱在Scripps研究所测定。
血浆甲硫氨酸测定
血浆中的甲硫氨酸水平是根据柱前衍生化然后用HPLC分离(Jones，B.N.和Gilligan，J.P.，J.Chromatogr.(1983)266：471-482)来测量的。简单来说，将10μl的血浆样品或者甲硫氨酸标准品用30μl的乙腈沉淀，然后于10,000rpm离心5分钟。将10μl的上清液与5μl的氟化醛(fluoraldehyde)衍生剂邻-苯二醛于室温混合1分钟，然后加入pH 7.0的150μl 0.1M乙酸钠。将20μl的反应混和物加载到反相SupelcosilTM LC-18DB柱(25cm×4.8cm，粒径5μm(Supelco，Bellefonte，PA，USA.)上。氨基酸衍生物通过在溶液A(四氢呋喃/甲醇/0.1M乙酸钠，pH7.2；5/95/900)中40-60％溶液B(甲醇)的梯度洗脱分离，流速1.5ml/min。用荧光分光光度计检测，激发光350nm，发射光450nm。血浆甲硫氨酸通过甲硫氨酸标准品溶液的保留时间来确定，并根据甲硫氨酸标准曲线来定量。
血浆5′-磷酸吡哆醛的测定
血浆中的PLP是用在流动相中加入硫酸氢钠进行衍生化的HPLC测定的(Deitrick，C.L.等，J.Chromatogr B Biomed Sci Appl.(2001)751：383-387)。简单来讲，血浆样品和PLP标准品溶液与等体积的去蛋白剂0.8M的HCIO4混合，用力涡旋。于4℃以15000rpm离心5分钟后，取出上清液并放入到新的瓶中。将50μl的上清液加载到反相CosmosilTM5C18-AR-II柱(4.6×150，Nacalai Tesque，日本)上。柱子用在流动相A(0.1M磷酸二氢钾缓冲液，含0.1M高氯酸钠和0.5g/L硫酸氢钠，pH 3.0)中20-80％流动相B(30％乙腈/水v/v)进行梯度洗脱，流速1.0ml/分钟。荧光分光光度计用来检测，激发光300nm，发射光400nm。PLP峰根据PLP标准品的保留时间确定。血浆PLP的浓度使用校正曲线计算。
体内药物动力学和甲硫氨酸清除效力
无胸腺裸小鼠(nu/nu)，4周龄(20-25g)，用来进行研究，每组四只。皮下植入装有250μl的PLP(0.5g/ml)的渗透微型泵。泵植入24小时后，将在0.5mlpH 7.4的PBS中的80单位的原型rMETase或者PEG-rMETase通过尾静脉注射到带有或者不带有PLP泵的小鼠中。用肝素化毛细管从每只动物的眶后血管从取血400μl。在注射前以及注射后1、2、4、8、24、48、72、96和120小时收集血样。分离血浆并以小等分存储在-80℃。根据上面描述的方法测定不同时间点收集的血浆中的血浆酶活性、甲硫氨酸浓度和PLP水平。
血浆抗rMETase抗体的测定
BALB/c雄性小鼠每组5只随机分组。每只小鼠以一周的间隔，接受三次腹腔注射在0.2ml(200μg)弗氏完全佐剂(FCA)中乳化的原型或者PEG-rMETase。最后一次注射后的两周后，每只小鼠接受rMETase或者PEG-rMETase的加强注射。加强注射两周后收集血样，分离血浆并冻存在-80℃。
血浆抗rMETase的抗体采用夹心ELISA技术测定。将200μg/ml的rMETase的0.1M pH 9.5的碳酸盐包被缓冲液100μl加入到96孔板的每个孔中，于4℃培养过夜。用pH 7.4含0.05％吐温-20的PBS洗涤缓冲液将板洗涤三次，用pH 7.4含10％FBS的PBS测定溶液200μl在室温阻断2小时。洗涤三次后，将血浆样品的PBS测定溶液10倍系列稀释液100μl加入到合适的孔中，室温培养2小时，然后洗涤。将最佳稀释的用辣根过氧化物酶(SIGMA，St.Louis，MO，USA)偶联的羊抗鼠IgG和IgM亚型100μl加入到每个孔中。板在室温培养1小时并洗涤三次。将含有邻-苯二胺二氯氢化物(OPD)的100μl底物溶液和过氧化氢(SIGMA，St.Louis，MO，USA)加入到每个孔中，然后在室温培养30分钟。向每孔中加入2N硫酸50μl来终止显色反应。于492nm测定每个孔的吸光度。抗体滴度定义为最高血浆稀释度，其为在492nm处免疫血浆的孔中产生的消光(extinction)超过阴性对照血浆的孔中产生的消光的两倍时的最高血浆稀释度。
PEG化rMETase的SDS-PAGE分析
用摩尔比30/1、60/1和120/1的PEG/rMETase制备了三种rMETase偶联物。PEG偶联到rMETase的程度和PEG化rMETase偶联物的纯度用SDS-PAGE测定(图2)。当用上面的摩尔比时，经室温90分钟的反应所有的rMETase亚单位都被PEG化了，因为用SDS-PAGE没有检测到未PEG化的rMETase(图2)。纯化了的PEG化rMETase在10％的SDS-PAGE凝胶上跑胶。当提高PEG与rMETase的摩尔比时，有更多的PEG链偶联到rMETase上，如用SDS-PAGE所见的(图2)。凝胶用考马斯亮蓝染色，右边的数字代表分子量。带1：分子量标记。带2：原型的rMETase。带3：PEG/rMETase 30。带4：PEG/rMETase 60。带5：PEG/rMETase 120。在胶上看到的宽带代表在低PEG/rMETase摩尔比时的PEG化rMETase偶联物的异质性。当在反应中采用更高的PEG/rMETase摩尔比时，观察到PEG化rMETase偶联物的较低的异质性。
用荧光胺分析和MALDI对PEG化程度的测定
三种PEG化rMETase偶联物的PEG化程度在表1中显示。
表1.PEG化rMETase偶联物的PEG化程度的测定
荧光胺分析(100％)     MALDI
 分子量   每个rMETase单体的PEG
 原型rMETasePEG/rMETase 30PEG/rMETase 60PEG/rMETase 120   0336181  42.3kD48.3-75.3kD59.8-81.0kD82.0-91.9kD   01-63-77-9
原型和PEG化rMETase的PEG化程度根据上面描述的方法用荧光胺分析和MALDI测定。荧光胺分析的结果表示为rMETase中PEG化赖氨酸基团的百分比。MALDI结果表示为PEG化rMETase单体的总分子量和计算的每个rMETase单体上偶联的PEG聚合物的数量。连接到rMETase上的每个PEG聚合物对PEG化rMETase单体的总分子量贡献大约5kD。
荧光胺分析显示在比值是PEG/rMETase 30、PEG/rMETase 60和PEG/rMETase 120时，分别大约有33％、61％和81％的rMETase中的游离赖氨酸与PEG链偶联。数据显示，用上面的偶联比例，相应的每个rMETase亚单位中分别有平均3、5和7个PEG化赖氨酸。
MALDI分析也表明，对于使用的这三种偶联比，在平均分子量分别为64582、70591和87011Da的地方可以观察到一系列的信号峰(图3)。MALDI分析是用PerSeptive Biosystems Voyager-Elite质谱仪进行的。在48276-75271、59757-81027和82043-91895Da处的最后系列峰分别代表原型rMETase、PEG-rMETase(30/1)、PEG-rMETase(60/1)和PEG-rMETase(120/1)时的离子信号。在原型rMETase和PEG-rMETase峰前面的系列峰是衍生于上面母体离子的两电荷物质。这些数据与在使用的三种摩尔比时分别共价结合到rMETase每个亚单位上的平均4、6和8个PEG单位一致。在MALDI谱中的PEG化rMETase的系列峰反映了由rMETase的PEG化所产生的分布异质性。发现在越高的PEG化程度下，在MALDI中观察到的信号峰越少，显示更少的异质性。例如，PEG/rMETase120偶联物具有最少的异质性(图3)。MALDI和荧光胺分析都说明，提高PEG化反应中的PEG/rMETase的摩尔比导致rMETase亚单位PEG化的提高。
PEG化rMETase的血浆循环半衰期
对每只小鼠注射80单位的原型rMETase后，原型rMETase的血浆酶活性迅速下降并且在24小时之后就不能被检测到了。然而，PEG化rMETase显示药物动力学有显著改善。当评价PEG/rMETase 60和PEG/rMETase 120时，血浆酶活性直到72小时还可以检测到。原型rMETase的半衰期是2小时，相对比的是PEG/rMETase 30、PEG/rMETase 60和PEG/rMETase 120的半衰期分别是12小时、18小时和38小时(图4，表2)。
表2.小鼠中原型和PEG化rMETase的血浆半衰期
 在小鼠血浆中的半衰期
原型rMETase  2小时
PEG/rMETase 30  12小时
PEG/rMETase 60  18小时
PEG/rMETase 120  38小时
图4显示了对小鼠静脉注射原型或者PEG化rMETase后的血浆酶活性。对小鼠静脉注射80U的原型或者标明PEG化的rMETase。在不同的时间点收集血样并按照上面的描述测定血浆酶活性。
PEG化rMETase的血浆甲硫氨酸清除效力
用80U的原型或者三种PEG化的偶联物在1个小时内，血浆甲硫氨酸清除从基线的40μM降低到小于5μM(图5)。然而，PEG/rMETase 30、PEG/rMETase 60和PEG/rMETase 120清除血浆甲硫氨酸到5uM以下分别持续8小时、24小时和48小时，分别是原型rMETase的2、6和12倍长(表3)。
表3.在有和没有PLP补充时通过原型或者PEG化rMETase清除血浆甲硫氨酸到5μM以下的最大时间
 MET清除到5uM以下的最大时间(小时)
 PLP-  PLP+
 原型rMETase  4  4
 PEG/rMETase 30  8  48
 PEG/rMETase 60  24  48
 PEG/rMETase 120  48  72
80U的原型或者PEG化rMETase在有或者没有PLP补充的情况下，通过静脉注射到每只小鼠体内。在不同的时间点取样，按照在材料和方法中的描述测定酶活性和甲硫氨酸浓度。血浆半衰期通过血浆酶浓度-时间曲线来计算(图4)。由图5和图7中的血浆甲硫氨酸水平计算甲硫氨酸清除低于5μM的最大时间。
图5显示了小鼠静脉注射原型或者PEG化rMETase后血浆甲硫氨酸的清除。小鼠静脉注射80U的原型或者标明PEG化的rMETase。在不同的时间点收集血样，并按照上面的描述测定血浆甲硫氨酸浓度。
PEG化对体内rMETase的PLP依赖性的效果
PLP微型渗透泵的植入显著的增加了血浆PLP的浓度(图6)。在产生图6数据的实验中，装有250μl的0.5g/ml PLP的微型渗透泵在静脉注射原型或者PEG化rMETase之前皮下植入到小鼠中。在不同的时间点收集血样，并按照材料和方法的中描述测定血浆PLP浓度。PLP-表示没有PLP泵的动物。PLP+表示有PLP泵的动物。
图7显示植入PLP泵并且静脉注射原型或者PEG化rMETase后的血浆甲硫氨酸清除。在这些实验中，在有以及没有从植入的微型渗透泵中的PLP补充的情况下，将80U的原型或者PEG化rMETase静脉注射到动物中。在不同的时间点收集血样并测定血浆甲硫氨酸浓度。与没有PLP补充时的血浆甲硫氨酸清除相比(图5)，在有PLP补充的情况下，血浆甲硫氨酸清除被显著的延长(图7)，表明了PEG-rMETase体内甲硫氨酸清除效力的PLP依赖性。通过三种PEG化rMETase偶联物清除的血浆甲硫氨酸水平，当PEG/rMETase120并有PLP补充时维持在小于2μM 48小时，小于4μM 72小时(表3)。在注射PEG/rMETase后的120小时，通过PEG/rMETase 30、PEG/rMETase 60和PEG/rMETase 120清除的血浆甲硫氨酸水平依然分别维持在正常基线的40％、57％和22％(表3)。
要定量PEG化对rMETase的PLP依赖性的效果，计算了没有PLP补充时PEG化rMETase清除的血浆甲硫氨酸浓度(PLP-)(图5)与有PLP补充时PEG化rMETase清除的血浆甲硫氨酸浓度(PLP+)(图7)在不同时间点的比值(图8)。图8显示在有和没有PLP补充的情况下标明PEG化的rMETase清除的血浆甲硫氨酸水平的比值。(原始数据参见图5和7)。低的比值表明在PLP-和PLP+的情况下相似的甲硫氨酸清除，表明PEG化可以降低rMETase的PLP依赖性。这些比值显示PEG/rMETase 60和PEG/rMETase 120比PEG/rMETase 30有更小的PLP依赖性(图5、7和8)，显示PEG化对PLP被rMETase保留的保护效果。
PEG化rMETase对血浆抗-rMETase特异抗体的效果
在有弗氏完全佐剂(FCA)的存在下通过测量免疫了原型和PEG化rMETase的小鼠中血浆抗-rMETase特异IgG和IgM抗体来评价原型和PEG化rMETase的抗原性。如表4所示，与原型rMETase产生的10-8滴度相比，由用PEG/rMETase 30、PEG/rMETase 60和PEG/rMETase 120免疫的小鼠而获得的血浆产生的IgG抗体滴度分别是10-7、10-6和10-4。对于IgM抗体，在用三种PEG化rMETase偶联物免疫的小鼠中检测到10-3的抗体滴度，低于原型rMETase产生的10-4的抗体滴度。
表4.小鼠中由原型或PEG化rMETase诱发的血浆抗-rMETase特异抗体滴度
 IgG IgM
原型rMETase  10-8(5) 10-4(4)，10-5(1)
PEG/rMETase 30  10-7(4)，10-6(1) 10-3(5)
PEG/rMETase 60  10-6(5) 10-3(5)
PEG/rMETase 120  10-4(4)，10-5(1) 10-3(5)
在弗氏完全佐剂存在下，用原型或者标明PEG化的rMETase免疫的小鼠的血浆的IgG和IgM抗-rMETase抗体滴度，按照材料和方法中的描述，用ELISA法检测。括号中的数字代表小鼠的数目。
发现在PEG化反应中rMETase浓度越高，rMETase的修饰就越大。因此，rMETase浓度调到120mg/ml rMETase。
PEG化rMETase的异质性通过SDS-PAGE和MALDI都可以观察到。PEG作为合成聚合物是多分散的，这也对PEG化偶联物的异质性有所贡献。理想的是，从对于低分子量低聚物(3-5kD)的大约1.01到对于高分子量(20kD)的1.2范围的多分散值(Mw/Mn)，可以期待对蛋白和肽进行PEG化(Veronese，F.M.，Biomaterials(2001)22：405-417)。除了PEG的多分散性，也发现PEG/rMETase的摩尔比影响形成的偶联物的异质性(图2、图3和表1)，高的PEG/rMETase摩尔比导致小的PEG化rMETase异质性。
PEG化rMETase偶联物的药物动力学数据显示血浆循环时间取决于PEG化程度(图4)。与用M-SPA-PEG进行PEG化的rMETase的40分钟的血浆半衰期相比(Motoshima，H.等，J.Biochem.(2000)128：349-354)，用MEGC-PEG进行PEG化的rMETase显示在血液中有更长的循环时间。PEG/rMETase 30、PEG/rMETase 60和PEG/rMETase 120的半衰期分别延长到12小时、18小时和38小时(表2)。该改善的药物动力学特征可以反映MEC-PEG比M-SPA-PEG对rMETase有更高的PEG化效率。
5μM的血浆甲硫氨酸浓度被用作清除水平的目标，因为有报道说，当用人癌症小鼠模型时，当血清甲硫氨酸清除到小于5μM时是rMETase效力的有效治疗水平(Kokkinakis，D.M.，Cancer Research(2001)61：4017-4023)。没有PLP补充的情况下甲硫氨酸清除的该水平可以通过用PEG/rMETase 30实现8小时，用PEG/rMETase 60实现24小时和用PEG/rMETase 120实现48小时。有补充时，清除到小于5μM可以通过用PEG/rMETase实现30小时，用PEG/rMETase 60实现48小时和PEG/rMETase 120实现72小时。
PEG化对于体内PLP被rMETase表观保留的保护效果是预料之外的结果，因为用原型的rMETase和低度PEG化的rMETase时，PLP在体内迅速消失。在体外PLP相对紧密地结合到rMETase上(Han，Q.等，ClinicalChemistry(2002)48：1560-1564)，但是在体内PLP表现出容易与rMETase解离。承认PLP的效果具有导致体内酶的稳定性和保留以及在降低血浆甲硫氨酸水平方面延长效力的证据，是潜在的重要治疗课题。PLP与rMETase的解离机理和PEG化对解离的表观抑制将在将来的研究中考察。
血浆抗-rMETase特异抗体测定显示PEG化rMETase能够降低小鼠中rMETase的免疫原性。血浆IgG抗体是重要的抗体亚型，与体内超敏反应和外源蛋白抗体的中和相关。PEG/rMETase显示抗原性的显著降低。例如，与原型rMETase的10-8相比，PEG/rMETase 120血浆抗-rMETase IgG抗体滴度降低到10-4。血浆IgG抗体的降低取决于PEG-衍生化的氨基基团的数目，表明PEG化rMETase的降低的抗原性是由于聚合物修饰掩盖了蛋白的抗原性位点而导致的结果。本数据证实了酶的PEG化形式的降低的抗原性，这可能与聚合物修饰掩盖了蛋白抗原性位点相关。修饰应该很大提高临床应用中的治疗效力的潜能。
已经有报道说很多类型肿瘤细胞的最小甲硫氨酸依赖性相对于正常细胞提高。(Tan，Y，等，supra(1997)；Hoffman，R.M.和Erbe，R.W.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1976)73：1523-1527；Hoffman，R.M.，Biochem.Biophys.Acta(1984)738：49-87；Mecham，J.O.，等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1983)117：429-434；Guo，H.Y.等，Cancer Res.(1993)53：2479-2483；Kreis，W.，和Goodenow，M.，Cancer Res.(1978)38：2259-2262′Guo，H.等，Cancer Res.(1993)53：5676-5679；Goseki，N.等，Jpn.J.Cancer Res.(1995)86：484-489；Goseki，N.等，Cancer(1992)69：1865-1872；Lishko，V.K.等，ProteinExpression and Purifcation(1993)4：529-533；Tan，Y.等，Anticancer Res.(1996)16：3931-3936；和Tan，Y.等，Anticancer Res.(1996)16：3937-3942)。来自假单胞putida菌的L-甲硫氨酸α-脱氨基-γ-甲硫醇裂解酶(甲硫氨酸酶，METase)[EC 4.4.1.11]以前已经被克隆并在大肠杆菌中生产(Tay，Y.等，supra(1997)；Inoue，H.等，J.Biochem.(1995)117：1120-1125；和Hori，H.等，CancerRes.(1996)56：2116-2122)以靶向肿瘤细胞的甲硫氨酸依赖性。rMETase在假单胞菌属(Pp)、气单胞菌属和羧菌属中有发现，但是在酵母、植物或哺乳动物中没有发现(Motoshima，H.等，supra(2000))。rMETase是均四聚物(homotetrameric)的5’-磷酸吡哆醛酶，分子量是172kDa。rMETase催化的生化反应如下：
Figure A20048002865300221
rMETase每个亚单位有398个氨基酸残基。rMETase的氨基酸序列与催化α、γ-消除和γ-置换反应的PLP酶的γ-族同源，如rUETase中的胱硫醚γ-裂解酶、胱硫醚γ-合酶和O-乙酰基高丝氨酸O-乙酰基丝氨酸硫化氢解酶(Inoue，H.等，Biosci.Biotechnol.Biochem.(2000)64：2336-2343)。在底物的γ-消除中显示酪氨酸114非常重要(Inoue，H.等，supra(2000))。
rMETase已经被结晶了(Motoshima，H.等，supra(2000)，以及Sridhar，V.等，Acta Cryst.(2000)D56：1665-1667)。使用同步辐射衍射数据以1.7埃的分辨率，测定rMETase的结构，并且发现是222对称的均四聚物。两个单体组合构建活性二聚物。亚单位的空间折叠，有三种功能不同的结构域。它们的四级排列与来自大肠杆菌的L-胱硫醚β-裂解酶和L-胱硫醚-γ-合酶的类似(Motoshima，H，等，supra(2000))。
上述出版物或者文献的引用不作为承认任何前述的内容是有关的现有技术，也不构成承认这些出版物或者文献的内容或者数据(date)。

Claims (50)

1.有效量的聚亚烷基二醇修饰的甲硫氨酸酶在制备用于降低需要其的受治疗者的血清甲硫氨酸水平的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中受治疗者患有肿瘤疾病。
3.权利要求2的用途，其中该肿瘤疾病选自乳腺癌、肾癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌。
4.权利要求1的用途，其中该药物进一步包含有效量的5’-磷酸吡哆醛(PLP)。
5.权利要求4的用途，其中PLP与甲硫氨酸酶制剂分开给药。
6.权利要求1的用途，其中血清甲硫氨酸水平低于5μM。
7.权利要求1的用途，其中该药物配制成给药于受治疗者至少一次。
8.权利要求1的用途，其中该药物配制成用来静脉内给药。
9.权利要求1的用途，其中该聚亚烷基二醇是聚乙二醇。
10.权利要求9的用途，其中该聚乙二醇是甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基戊二酸酯-5000(MEGC-PEG-5000)。
11.权利要求9的用途，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是30∶1。
12.权利要求9的用途，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是60∶1。
13.权利要求9的用途，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是120∶1。
14.权利要求1的用途，其中甲硫氨酸酶是重组产生的。
15.权利要求1的用途，其中甲硫氨酸酶是L-甲硫氨酸α-脱氨基-γ-甲硫醇裂解酶。
16.权利要求1的用途，其中聚亚烷基二醇修饰的甲硫氨酸酶的特征为比未经修饰的甲硫氨酸酶有提高的血清半衰期。
17.权利要求16的用途，其中重组甲硫氨酸酶的半衰期通过改变偶联到甲硫氨酸酶上的聚亚烷基二醇的量而调节。
18.权利要求17的用途，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是30∶1。
19.权利要求17的用途，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是60∶1。
20.权利要求17的用途，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是120∶1。
21.权利要求1的用途，其中血清甲硫氨酸水平的降低敏化受治疗者的肿瘤细胞。
22.权利要求21的用途，其中该药物进一步包含化疗剂。
23.权利要求22的用途，其中化疗剂选自以下药物：卡铂、顺铂、环磷酰胺、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素C、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、甲氨喋呤、喜树碱、依立替康、托泊替康、博来霉素、多西他赛、多柔比星、依托泊苷、紫杉醇、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、染料木黄酮、曲妥单抗、ZD1839；细胞毒性剂；凋亡诱导剂、细胞周期控制抑制剂、维拉帕米和环孢素A。
24.长期降低血清甲硫氨酸水平的方法，包括给药于需要其的受治疗者包括偶联有聚亚烷基二醇的甲硫氨酸酶的制剂。
25.权利要求24的方法，其中受治疗者患有肿瘤疾病。
26.权利要求25的方法，其中该肿瘤疾病选自乳腺癌、肾癌、结肠癌、肺癌和前列腺癌。
27.权利要求24的方法，进一步包括给药于受治疗者5’磷酸吡哆醛(PLP)。
28.权利要求27的方法，其中PLP与甲硫氨酸酶制剂一起给药。
29.权利要求27的方法，其中PLP与甲硫氨酸酶制剂分开给药。
30.权利要求24的方法，其中血清甲硫氨酸水平低于5μM。
31.权利要求24的方法，其中该制剂给药于受治疗者至少一次。
32.权利要求24的方法，其中该制剂是静脉内给药。
33.权利要求24的方法，其中该聚亚烷基二醇是聚乙二醇。
34.权利要求33的方法，其中聚乙二醇是甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基戊二酸酯-5000(MEGC-PEG-5000)。
35.权利要求33的方法，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是30∶1。
36.权利要求33的方法，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是60∶1。
37.权利要求33的方法，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是120∶1。
38.权利要求24的方法，其中甲硫氨酸酶是重组产生的。
39.权利要求24的方法，其中甲硫氨酸酶是L-甲硫氨酸α-脱氨基-γ-甲硫醇裂解酶。
40.通过将甲硫氨酸酶偶联到聚亚烷基二醇上来提高甲硫氨酸酶血清半衰期的方法。
41.权利要求40的方法，其中通过改变偶联到甲硫氨酸酶上的聚亚烷基二醇的量来调节重组甲硫氨酸酶血清半衰期。
42.权利要求41的方法，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是30∶1。
43.权利要求41的方法，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是60∶1。
44.权利要求41的方法，其中聚亚烷基二醇与甲硫氨酸酶的摩尔比大约是120∶1。
45.权利要求40的方法，其中甲硫氨酸酶是重组产生的。
46.权利要求40的方法，其中甲硫氨酸酶是L-甲硫氨酸α-脱氨基-γ-甲硫醇裂解酶。
47.敏化肿瘤细胞的方法，包括给药于受治疗者偶联到聚亚烷基二醇上的甲硫氨酸酶。
48.权利要求47的方法，进一步包括给药5’-磷酸吡哆醛(PLP)。
49.权利要求48的方法，进一步包括给药化疗剂。
50.权利要求49的方法，其中化疗剂选自以下药物：卡铂、顺铂、环磷酰胺、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素C、米托蒽醌、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、甲氨喋呤、喜树碱、依立替康、托泊替康、博来霉素、多西他赛、多柔比星、依托泊苷、紫杉醇、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、染料木黄酮、曲妥单抗、ZD1839；细胞毒性剂；凋亡诱导剂、细胞周期控制抑制剂、维拉帕米和环孢素A。
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