KR20080074202A

KR20080074202A - 에스트로겐 암 요법

Info

Publication number: KR20080074202A
Application number: KR1020087015960A
Authority: KR
Inventors: 잭 싱어
Original assignee: 셀 쎄러퓨틱스 인코포레이티드
Priority date: 2005-12-06
Filing date: 2006-12-05
Publication date: 2008-08-12
Also published as: US20070167349A1; TW200803836A; CA2630553A1; PE20070701A1; RU2008127309A; WO2007067498A1; EP1957065A1; JP2009518406A; TWI322010B

Abstract

본 발명에는, 임의적으로 에스트로겐 요법과 병용하여, 폴리(아미노산) 폴리머에 컨쥬게이트된 항암 약물 전달을 포함하여, 남성 및 여성에서의 각종 암에 대한 치료를 선택하고, 이어서 상기 각종 암을 치료하는 방법이 개시된다.

에스트로겐 요법, 컨쥬게이트, 항암 약물

Description

에스트로겐 암 요법{ESTROGEN CANCER THERAPY}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 미국 가출원 제60/742,725호(출원일: 2005년 12월 6일) 및 미국 가출원 제60/814,221호(출원일: 2006년 6월 16일)를 기초로 우선권을 주장하는 것으로, 이들 가출원은 그 전체가 본 명세서에 참고로 원용되어 있다.

수용해성 파클리탁셀 컨쥬게이트(paclitaxel conjugate), 이의 제조 방법 및 그것을 이용하여 탁산(taxane)-반응성 질병을 치료하는 방법은 미국 특허 제5,977,163호 공보 및 미국 특허 제6,262,107호 공보에 기술되어 있다. 여기에 보고된 바와 같이, 상기 약물의 컨쥬게이트된 형태를 함유하는 조성물은 놀랍게도 예시적인 종양 모델에 대해서 항종양제로서 효과적인 것으로 판명되었고, 탁산류 또는 탁소이드류(taxoids)가 효과적인 것으로 공지되어 있는 질병 또는 질환 상태의 어느 것에 대해서도 적어도 파클리탁셀 또는 도세탁셀로서 효과적인 것으로 예상되었다. 그 조성물은 또한 (약물 자체의 불용성과 관련된 결점을 극복함으로써) 제제화의 용이성, 방출 제어성 및 보다 적은 부작용(적어도 부분적으로 종래의 파클리탁셀 조성물에서 관찰되는 부작용과 관련된 용매에 대한 필요성을 제거하는 것에 기인함)의 점에서 이점을 제공하였다.

발명의 개요

본 발명의 제1 양태는 암으로 진단되고 폐경전 에스트로겐 레벨을 가진 것으로 확인된 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 치료를 필요로 하는 여성에게 항암 약물에 컨쥬게이트된 폴리(아미노산) 폴리머를 포함하는 컨쥬게이트(이하, "컨쥬게이트된 약물" 또는 "약물 컨쥬게이트"라 칭함)를 전달하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 암은 에스트로겐 수용체 보유 암 세포 또는 암이 유래되는 기관 또는 조직의 에스트로겐 수용체 보유 정상 (질병에 걸리지 않은) 세포의 존재를 특징으로 한다.

본 발명의 제2 양태는 암으로 진단되고 폐경전 에스트로겐 레벨을 가진 것으로 확인된 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 암은 에스트로겐 수용체 보유 암 세포 또는 암이 유래되는 기관 또는 조직의 에스트로겐 수용체 보유 정상 (질병에 걸리지 않은) 세포의 존재를 특징으로 하며, 상기 치료는 상기 환자에게 상기 컨쥬게이트된 약물 및 에스트로겐 요법을 전달하는 단계를 포함한다.

본 발명의 각종 실시형태에 있어서, 상기 폴리(아미노산) 폴리머는 폴리(글루탐산) 또는 폴리(라이신)이고; 상기 항암 약물은 탁산이며; 다른 실시형태에 있어서, 상기 항암 약물은 파클리탁셀이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 항암 약물은 파클리탁셀이고, 상기 폴리머는 폴리(글루탐산)을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 에스트로겐 요법은 17-β-에스트라디올의 투여를 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 상기 암은 폐암이고, 추가의 실시형태에 있어서, 상기 암은 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer: NSCLC)이다.

본 발명의 또 다른 양태는 혈청 에스트로겐 레벨을 기초로 하여 암 치료 요법을 선택하는 방법에 관한 것이다.

임의의 특정 작용 이론에 의해 한정하고자 하는 것은 아니지만, 출원인은 에스트로겐(즉, 내인성 또는 외인성 공급된 에스트로겐 요법)의 존재가 암성 조직(예컨대, 종양)에 전달된 약물의 양을 증가시킴으로써 컨쥬게이트된 약물의 효능을 증강시키는 것으로 믿고 있다. 에스트로겐은 폴리머 담체의 백본(backbone)으로부터의 활성 약물의 분리와 관련된 효소인 카텝신 B의 상향조절을 일으킬 수도 있고, 결과적으로 암조직에서 컨쥬게이트되지 않은 (또는 유리된) 항암제의 양의 증가를 가져올 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 컨쥬게이트된 파클리탁셀 + 카보플라틴-(CT-2103 + 카보(즉, 카보플라틴); 백색 개방 원을 가진 실선) 또는 비컨쥬게이트된 파클리탁셀 + 카보플라틴(파클리탁셀 + 카보(즉, 카보플라틴); 백색 개방 사각형을 가진 대시선(dashed line))으로 처치된 폐경후 (즉, 낮은(저농도)) 혈장 에스트로겐 레벨을 가진 여성에 대한 생존(일수)을 표시한 선 그래프이다.

도 2는 컨쥬게이트된 파클리탁셀 + 카보플라틴(CT-2103 + 카보; 백색 개방 원을 가진 실선) 또는 비컨쥬게이트된 파클리탁셀 + 카보플라틴(파클리탁셀 + 카보; 백색 개방 사각형을 가진 대시선)으로 처치된 폐경전 (즉, 높은(고농도)) 혈장 에스트로겐 레벨을 가진 여성에 대한 생존(일수)을 나타낸 선 그래프이다.

도 3은 파클리탁셀 폴리글루멕스(PPX) 대 대조군으로 처치된 55세 미만의 여성에서의 전체 생존(OS)을 나타낸 선 그래프이다.

도 4는 PPX 대 대조군으로 처치된 55세 초과 여성에서의 OS를 나타낸 선 그래프이다.

도 5는 PPX 대 대조군으로 처치된 폐경전 여성에서의 OS를 나타낸 선 그래프이다.

도 6은 인간 종양 세포주와 HT-29 및 H460 종양 모델에서의 ERα 및 ERβ 발현을 나타낸 웨스턴 블롯을 표시한 도면이다.

도 7은 HT-29 종양 모델에서의 카텝신 B 활성 및 종양 중량에 대한 에스트로겐의 효과를 나타낸 선 그래프 세트이다.

도 8은 H460 종양 모델에서의 카텝신 B 활성 및 종양 중량에 대한 에스트로겐의 효과를 나타낸 선 그래프 세트이다.

도 9는 HT-29 종양 모델에서의 에스트로겐 수용체 β(ERβ) 발현에 대한 에스트라디올의 효과를 나타낸 웨스턴 블롯이다.

도 10은 H460 종양 모델에서의 ERβ 발현에 대한 에스트라디올의 효과를 나타낸 웨스턴 블롯이다.

도 11은 에스트로겐 수용체 시그널링(signaling) 경로의 E-카드헤린(E-Cadherin) 하류 유전자에 대한 RT-PCR 분석을 나타낸 차트이다.

도 12는 에스트로겐 수용체 시그널링 경로의 하류 유전자(Id-2)에 대한 RT-PCR 분석을 나타낸 차트이다.

도 13은 수컷(A), 암컷(B) 또는 난소적출된 암컷 래트(C)의 간, 폐 또는 골수에서의 비컨쥬게이트된 파클리탁셀 또는 총 파클리탁셀의 레벨(약물의 ng/조직의 g)을 나타낸 선 그래프 세트이다:

(A) (백색 개방 사각형을 가진 흑색 실선);

(B) (백색 개방 사각형을 가진 청색 실선); 및

(C) (백색 개방 사각형을 가진 적색 실선).

발명의 상세한 설명

본 발명은 암 치료에 관한 것이다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "에스트로겐 수용체 보유 암"이란 용어는 에스트로겐 수용체를 보유하는 암 세포의 존재를 특징으로 하는, 임의 암, 종양 형성 또는 기타(예컨대, 백혈병과 같은 조혈성 암)를 의미하거나, 또는 에스트로겐 수용체를 보유하는 정상 (질병에 걸리지 않은) 세포를 함유하는 기관 또는 조직에서 유래하는 암을 의미한다. 상기 에스트로겐 수용체는 일시적으로 발현될 수 있고/있거나, 에스트로겐 수용체 보유 세포는 세포(암 세포 또는 질병에 걸리지 않은 세포)의 총 모집단 중의 일부를 나타낼 수도 있다. 다소 다르게 말하면, 특정 암과 관련된 세포 또는 유래 조직내 세포가 모두 반드시 에스트로겐 수용체를 가질 필요는 없다. 또한, 암 세포는 항상 질병 진행 과정에 걸쳐 에스트로겐 수용체를 발현하는 것도 아니다. 또한, 유래 조직 내의 정상 세포가 반드시 그들 전체 수명에 걸쳐서 에스트로겐 수용체를 발현시킬 필요도 없다.

에스트로겐 수용체에는 2종류, 즉 α-수용체 및 β-수용체가 있다. 암 세포에 대한 어느 한쪽 수용체의 발병률은 특정 종류의 암 및/또는 특정 단계의 암의 진행과 관련될 수 있다. 따라서, 암 세포는 질병의 진행 동안 상이한 시간에 각 형태를 발현할 수 있다. 이에 대해서는, 문헌[Leav et al., Am. J. Path. 255:79-92(2001)]을 참조할 수 있다. 에스트로겐 수용체 β 보유 암으로는 비소세포 폐암(NSCLC), 유방암, 난소암, 상피성 자궁암 및 육종, 대장암, 신경아교종, 전립선암, 고환암, 및 흑색종을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 출원에 ㅇd어서, 에스트로겐 β 수용체는 폐 조직에에서 그리고 NSCLC에서 발현되는 유일한 기능성 수용체이므로 매우 중요하다. 이에 대해서는 문헌[Patrone et al. Mol . Cell. Bio. 23:8542-8552 (2003)]을 참조할 수 있다.

본 명세서에 설명되어 있는 바와 같이, 선택된 환자 모집단에 따라서는, 본 발명의 방법은 에스트로겐 요법의 투여도 포함할 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 선택된 환자 모집단은 내인성 에스트로겐의 폐경전(또는 높은(고농도)) 레벨을 가진 여성을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 어구로서의 "내인성 에스트로겐의 폐경전 레벨"을 가진 여성은 전형적으로 혈청 또는 혈장 중 약 30 내지 약 1,000 피코그램/밀리리터(pg/㎖), 예컨대, 약 30 내지 약 300 pg/㎖의 혈청 또는 혈장 에스트로겐 레벨(전형적으로 생활성 호르몬 에스트라디올(예를 들어, (RDI division of Fitzgerald Industries International)(매사추세츠주 콩코드시 소재)로부터 입수된 것과 같은 시판용 효소-결합된 면역 흡수 분석(ELISA) 키트를 이용한 에스트라디올-17β 또는 E2)로 환산하여 측정됨)을 가진다. 내인성 에스트로겐의 폐경전 레벨은 전형적으로 사춘기 후, 월경을 경험하지 않았지만, 에스트로겐 레벨을 현저하게 변화시키는 기타 건강 완화 인자(mitigating health factor)를 가지지 않은 여성에서 발견된다. 이 모집단은 전형적으로 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53세, 약 54세까지의 여성을 포함하며, 그리고 이들의 임의의 부분집합 범위도 포함한다. 또한, 드물지만, 경우에 따라 남성도 폐경전 여성과 마찬가지의 혈청 또는 혈장 에스트로겐 레벨을 갖는다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 "폐경전"이란 용어는 혈청 또는 혈장 에스트로겐 레벨과 관련해서 남성도 포괄한다.

본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 선택된 환자 모집단은 낮은 레벨의 에스트로겐을 가진 환자, 일반적으로 남성 및 폐경후 여성으로 구성된다. 이러한 실시형태에 있어서, 환자는 약물 컨쥬게이트 및 에스트로겐 요법의 전달 또는 투여를 수반하는 병용 요법으로 치료된다. 이들 환자는 전형적으로 정량의 하한치 미만, 일반적으로 30 pg/㎖ 미만, 예를 들어, 약 20 내지 30 pg/㎖ 미만의 혈청 또는 혈장 에스트로겐 레벨을 가진다. 남성은 "월경"을 경험하지 않는 것으로 인식되어 있지만, 본 명세서에서 이용되는 바와 같이 혈청 또는 혈장 에스트로겐 레벨과 관련하여, "폐경후"란 용어는 남성도 포괄한다. 폐경후 여성의 나이는 전형적으로 55세보다 많다. 그러나, 몇몇 개별적인 경우에 있어서, 55세보다 나이가 적은 여성이 폐경후 에스트로겐 레벨을 가질 수도 있다. 이들 경우는 난소 적출 수술을 받았거나, 항암 화학요법제 또는 기타 난소 또는 뇌하수체 기능에 영향을 미치는 약물의 투여로 인해 난소 기능을 잃었거나, 또는 원발성 난소 기능이 상실된 여성을 포함한다. 이 군으로는 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 또는 54세의 나이가 적은 여성도 포함될 수 있다.

본 발명에 유용한 폴리머는 아미노산을 포함한다. 이러한 폴리머의 예는 미국 특허 제5,977,163호 및 미국 특허 제6,262,107호 공보에 기재되어 있다. 본 명세서에서 이용되는 "폴리(아미노산) 폴리머"란 용어는 천연 또는 합성 아미노산으로 이루어진 코폴리머 및 호모폴리머를 의미한다. 아미노산은 펩타이드 결합을 통해 중합되어 있을 필요는 없지만, 아미노산 모노머가 순차적으로 결합될 수 있는 소정의 방식으로 결합되어 있을 수 있다.

본 발명에 유용할 수 있는 폴리머로는 폴리(l-글루탐산), 폴리(d-글루탐산), 폴리(dl-글루탐산), 폴리(l-아스파르트산), 폴리(d-아스파르트산), 폴리(dl-아스파르트산), 폴리(l-라이신), 폴리(d-라이신), 폴리(dl-라이신), 폴리(l-세린), 폴리(d-세린), 폴리(dl-세린), 폴리(l-글리신), 폴리(d-글리신), 폴리(dl-글리신), 폴리(l-알라닌), 폴리(d-알라닌), 폴리(dl-알라닌), 폴리(l-티로신), 폴리(d-티로신), 폴리(dl-티로신), 폴리(l-트레오닌), 폴리(d-트레오닌), 폴리(dl-트레오닌), 폴리(d-시스테인), 폴리(l-시스테인) 및 폴리(dl-시스테인)을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 실시형태에 있어서, 폴리머는 코폴리머, 예컨대, 상기 열거된 폴리(아미노산)과 비아미노산 폴리머, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리카프로락톤, 폴리글리콜산 및 폴리락트산 뿐만 아니라 폴리(2-히드록시에틸 l-글루타민), 키토산, 카르복시메틸 덱스트란, 히알루론산, 인간 혈청 알부민 및 알긴산으로 된 블록, 그래프트 또는 랜덤 코폴리머이다. 폴리-글루탐산(류) 및 폴리-라이신(류)가 특히 바람직하다. 임의의 폴리(아미노산), 예를 들어, 폴리(글루탐산)에 대한 언급은 이성질화와 관련해서 제한되는 것은 아니므로, d, l 및 dl 형태를 비롯한 모든 이성질체 형태를 포함한다.

소정의 실시형태에 있어서, "수용성 폴리아미노산", "수용성 폴리아미노산들" 또는 "아미노산의 수용성 폴리머"가 이용된다. 이들 용어는 폴리머가 d 및/또는 l 이성질체 입체 형태의 글루탐산 및/또는 아스파르트산 및/또는 라이신의 조합으로 이루어진 아미노산 사슬을 포함하는 것을 의미한다. 소정의 실시형태에 있어서, 이러한 "수용성 폴리아미노산"은 1개 이상의 글루탐산, 아스파르트산 및/또는 라이신 잔기를 함유한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 폴리머는 폴리(음이온성 아미노산) 폴리머이다. 폴리(음이온성 아미노산) 폴리머의 예로는 폴리-글루탐산, 폴리-아스파르트산, 및 pH 7에서 순 음전하(net negative charge)을 가진 기타 호모- 혹은 헤테로-아미노산 폴리머를 들 수 있다.

다른 실시형태에 있어서, 폴리머는 글루탐산을 함유하는 블록, 그래프트 또는 랜덤 코폴리머 등의 코폴리머이다. 따라서, 글루탐산과 적어도 하나의 다른(바람직하게는 생분해성) 모노머, 올리고머 또는 폴리머와의 코폴리머가 포함된다. 이들은 예를 들어 적어도 하나의 다른 아미노산, 예컨대 아스파르트산, 세린, 티로신, 글리신, 에틸렌 글리콜, 에틸렌 옥사이드, (또는 이들 중의 임의의 올리고머 혹은 폴리머) 또는 폴리비닐 알코올을 함유하는 코폴리머를 포함한다. 글루탐산 잔기는 1개 이상의 치환기를 보유할 수 있고, 폴리머는 1개 이상의 치환기를 담지할 수 있고, 폴리머는 글루탐산 모노머의 일부 또는 전부가 치환되어 있는 것을 포함한다. 치환기는 예를 들어 통상 1개의 기당 18 개 이하의 탄소 원자를 갖는 알킬, 히드록시 알킬, 아릴 및 아릴알킬, 또는 에스테르 결합에 의해 부착된 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 본 명세서에서 "폴리(글루탐산)" 및 그와 유사한 표현은 본문에서 달리 요구되지 않는 한 상기 가능성 중 어느 것이든지 포함하는 것으로 해석할 필요가 있다.

천연, 비정상 또는 화학 변성 아미노산의 각종 대체물은 폴리(아미노산) 폴리머의 아미노산 조성을 포함할 수 있다.

아미노산 또는 폴리(아미노산)의 대체물로서 본 발명에 이용되는 천연 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시트룰린, 시스테인, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 오르니틴, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, 히드록시프롤린, ε-카르복시글루타메이트, 페닐글리신 또는 O-포스포세린이다.

본 발명에 이용되는 비천연 아미노산으로는 예컨대 β-알라닌, α-아미노 부티르산, γ-아미노 부티르산, γ-(아미노페닐) 부티르산, α-아미노 이소부티르산, 시트룰린, ε-아미노 카프로산, 7-아미노 헵탄산, β-아스파르트산, 아미노벤조산, 아미노페닐 아세트산, 아미노페닐 부티르산, γ-글루탐산, ε-라이신, 메티오닌 설폰, 노르류신, 노르발린, 오르니틴, d-오르니틴, p-니트로-페닐알라닌, 히드록시 프롤린, 1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린-3-카르복실산 및 티오프롤린을 들 수 있다.

아미노산 대체물은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적인 유사성, 예를 들어, 그것의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기준으로 한다. 아미노산 측쇄 치환기의 크기, 형상 및 종류의 분석 결과, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘은 모두 양 하전된 잔기이고; 알라닌, 글리신 및 세린은 모두 동일한 크기이며; 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 모두 일반적으로 동일한 형상을 가지는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 고려사항을 기준으로 해서, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘; 알라닌, 글리신 및 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 본 명세서에서 생물학적 기능성 등가물로서 정의된다.

슈도(pseudo)-폴리(아미노산)도 본 발명에 이용될 수 있다. 슈도-폴리(아미노산)은 다이펩타이드 모노머가 정상 펩타이드 결합 이외의 것을 통해 공유 결합되어 있다는 점에서 전술한 폴리(아미노산)과는 다르다. 본 발명에 따라 이용하기에 적합한 슈도-폴리(아미노산)은 예를 들어 문헌[Kohn et al. Amer . Chem . Soc., 109:911 (1987)] 및 [Pulapura et al. J. Polymer Preprints,. 31:23 (1990)]에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 참조로 본 명세서에 원용된다. 상기 슈도-폴리(아미노산)은 본 발명에 따라 단독으로 또는 고전적인 폴리(아미노산)과 슈도-폴리(아미노산)의 혼합물과의 조합으로 이용될 수 있다.

폴리(아미노산)은 본 명세서에 기재된 천연, 변성 또는 비정상 아미노산의 어느 것이든지에 의해 각각 치환된, 글루탐산, 아스파르트산, 세린, 티로신 또는 글리신 잔기를 아미노산 치환 범위의 하한치로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 이상 가질 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 있어서, 폴리(아미노산) 호모폴리머, 예컨대 폴리-글루탐산, 폴리-아스파르트산, 폴리-세린, 폴리-티로신, 폴리-글리신, 또는 이들 5가지 아미노산의 일부 또는 전부의 혼합물을 포함하는 폴리(아미노산) 코폴리머는 글루탐산, 아스파르트산, 세린, 티로신 또는 글리신 잔기를 하한치로 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25% 까지(잔기 또는 중량%) 가질 수 있고/있거나, 본 명세서에 기재된 천연, 변성 또는 비정상 아미노산 중 어느 것이든지에 의해 각각 치환될 수 있다.

폴리(아미노산) 호모폴리머, 예컨대 폴리-글루탐산, 폴리-아스파르트산, 폴리-세린, 폴리-티로신 또는 폴리-글리신은 본 명세서에 기재된 천연, 변성 또는 비정상 아미노산 중 어느 것이든지에 의해 각각 치환된, 글루탐산, 아스파르트산, 세린, 티로신 또는 글리신 잔기를 아미노산 치환 범위의 상한치로 25% 미만, 26% 미만, 27% 미만, 28% 미만, 29% 미만, 30% 미만, 31% 미만, 32% 미만, 33% 미만, 34% 미만, 35% 미만, 36% 미만, 37% 미만, 38% 미만, 39% 미만, 40% 미만, 41% 미만, 42% 미만, 43% 미만, 44% 미만, 45% 미만, 46% 미만, 47% 미만, 48% 미만, 50% 미만 등(잔기 또는 중량%)으로 가질 수 있다. 바람직하게는, 잔기의 대부분은 글루탐산 및/또는 아스파르트산 및/또는 세린 및/또는 티로신 및/또는 글리신을 포함한다.

본 발명의 폴리머의 분자량은 일반적으로 약 1,000 달톤(Da) 내지 10,000,000 달톤 미만이다. 소정의 실시형태에 있어서, 본 발명의 폴리머의 분자량은 약 10 달톤 내지 약 5,000 달톤으로, 이 범위 내의 모든 정수값을 비롯해서, 예를 들어 100, 200, 300, 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000 및 4,500 달톤을 포함하며, 소정의 다른 실시형태에 있어서, 분자량은 약 600 달톤, 약 32,000 달톤 또는 약 33,000 달톤이다.

폴리(아미노산) 폴리머는 화학적 공정 및 재조합 공정을 비롯해서 수종의 표준 기법에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, 글루탐산의 호모폴리머는 2단계 공정, 즉, (i) 글루탐산을 포스겐 또는 등가의 시약, 예컨대 다이포스겐으로 15℃ 내지 70℃에서 처리하여 N-카르복시언히드라이드(NCA)를 형성시키는 단계; 및 (ii) N-카르복시언히드라이드의 개환 중합을 염기로 수행하여 폴리-(글루탐산)을 수득하는 단계를 포함하는 공정으로 제조될 수 있다. 적절한 염기로는 알콕사이드류, 예를 들어, 알칼리 금속 알콕사이드류, 예컨대 나트륨 메톡사이드, 유기금속 화합물, 1급, 2급 또는 3급 아민류, 예를 들어 부틸아민 또는 트라이에틸아민을 들 수 있다. 이에 대해서는 미국 특허 제5,470,510호 공보를 참조할 수 있다. 폴리(아미노산)을 화학적으로 합성하는 기타 방법은 다수가 있다.

본 발명의 아미노산 폴리머는 형질변형된 대장균(E. coli)을 이용해서 재조합적으로 생산될 수 있다. 폴리(글루탐산)의 제한된 세균 생산은 예를 들어 유럽특허 공개 공보 제EP-A-410,638호에 기재되어 있다. 세균이 d-형태를 제공하는 것은 공지되어 있다고 하더라도, 세균을 이용해서 수행되는 재조합 공정은 통상 폴리(l-글루탐산)을 수득할 것이다.

몇몇 실시형태에 있어서, 폴리머에 컨쥬게이트된 항암 약물은 탁산이다. 탁산으로는 파클리탁셀, 도세탁셀 및 탁산 골격을 가진 기타 화학 약물을 들 수 있다. 이것에 대해서는, 문헌[Cortes et al. J. Clin . Oncol. 13:2643-2655 (1995)]을 참조할 수 있다. 탁산 화합물 및 이의 제조 방법의 예는 미국 특허 제4,942,184호 공보에 기재되어 있다.

바람직한 실시형태에 있어서, 파클리탁셀은 폴리-(l-글루탐산)에 컨쥬게이트되어 있다. 본 발명의 컨쥬게이트된 약물은 다수의 탁산 골격분자인 반면, 비컨쥬게이트된(즉, 컨쥬게이트되지 않은) 약물(예컨대, 전통적인 파클리탁셀)은 단일의 탁산 골격 분자이다. 컨쥬게이트된 약물과 비컨쥬게이트된 약물 간에 적어도 하나의 의미 있는 비교를 제공하기 위해, 컨쥬게이트된 약물에 있어서의 각 탁산 골격 분자는 하나의 파클리탁셀(즉, 비컨쥬게이트된 파클리탁셀) 당량으로서 계산된다. 일 실시형태에 있어서, 약물 컨쥬게이트, 즉, 폴리글루타메이트 파클리탁셀 컨쥬게이트는 화학명 α-폴리-l-글루탐산의 (2R, 3S)-N-벤조일-3-페닐-이소세린) 2', 감마 카르복실레이트 에스테르와 함께 5-베타, 20-에폭시-1,2-알파, 4,7-베타, 10-베타, 13-알파-헥사히드록시-탁스-11-엔-9-온 4,10-디아세테이트 2-벤조에이트 13-에스테르를 가진 다수의 탁산 골격 분자이다.

유용한 폴리글루타메이트 파클리탁셀 컨쥬게이트의 예로는 파클리탁셀 폴리글루멕스(PPX; USAN(United States Approved Name) 협회(Council)에서 채용된 비독점적 명칭(상품명 Xyotax™))를 들 수 있다. PPX는 약 35% 내지 약 37% 중량 대 중량 (w/w) 파클리탁셀 적재량을 가지는 약 35,000 내지 약 40,000 Da 범위의 평균 분자량(MW)을 가지지만, 75,000 Da을 초과하지 않는다.

다른 실시형태에 있어서, 항암 약물 또는 항암제는 캄프토테신 또는 그의 유사체, 유도체 또는 프로드러그이다. 캄프토테신(CPT) 화합물로는 각종 20 (S)-캄프토테신, 20 (S)-캄프토테신의 유사체 및 20 (S)-캄프토테신의 유도체를 들 수 있다. 캄프토테신은, 본 발명의 본문에서 이용되는 경우, 식물 알칼로이드 20 (S)-캄프토테신, 양자의 치환 및 비치환 캄프토테신 및 그 유사체를 포함한다. 캄프토테신 유도체의 예로는 9-니트로-20 (S)-캄프토테신, 9-아미노-20 (S)-캄프토테신, 9-메틸-캄프토테신, 9-클로로캄프토테신, 9-플루오로-캄프토테신, 7-에틸 캄프토테신, 10-메틸캄프토테신, 10-클로로-캄프토테신, 10-브로모-캄프토테신, 10-플루오로-캄프토테신, 9-메톡시-캄프토테신, 11-플루오로-캄프토테신, 7-에틸-10-히드록시 캄프토테신, 10,11-메틸렌디옥시 캄프토테신 및 10,11-에틸렌디옥시 캄프토테신, 및 7-(4-메틸피페라지노메틸렌)-10,11-메틸렌디옥시 캄프토테신을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 캄프토테신의 프로드러그로는 미국 특허 제5,731,316호에 기재된 바와 같은 에스테르화된 캄프토테신 유도체, 예컨대, 캄프토테신 20-O-프로피오네이트, 캄프토테신 20-O-뷰티레이트, 캄프토테신 20-O-발레레이트, 캄프토테신 20-O-헵타노에이트, 캄프토테신 20-O-노나노에이트, 캄프토테신 20-0-크로토네이트, 캄프토테신 20-O-2',3'-에폭시-뷰티레이트, 니트로캄프토테신 20-O-아세테이트, 니트로캄프토테신 20-O-프로피오네이트 및 니트로캄프토테신 20-O-뷰티레이트를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 20 (S)-캄프토테신의 특정 예로는 9-니트로캄프토테신, 9-아미노캄프토테신, 10,11-메틸렌디옥시-20 (S)-캄프토테신, 포토테칸, 이리노테칸, 7-에틸-10-히드록시 캄프토테신, 또는 7, 9, 10, 11 또는 12번 위치 중 적어도 하나가 치환되어 있는 기타 치환된 캄프토테신을 들 수 있다. 이들 캄프토테신은 임의적으로 치환되어 있을 수도 있다.

활성을 여전히 유지하면서 캄프토테신 골격(scaffold)에 치환이 이루어질 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 캄프토테신 골격은 7, 9, 10, 11 및/또는 12번 위치에 치환된다. 이러한 치환은 비치환 캄프토테신 화합물과는 상이한 활성을 제공할 수 있다. 치환된 캄프토테신의 예로는 9-니트로캄프토테신, 9-아미노캄프토테신, 10,11-메틸렌디옥시-20 (S)-캄프토테신, 토포테칸, 이리노테칸, 7-에틸-10-히드록시 캄프토테신, 또는 7, 9, 10, 11 또는 12번 위치 중 적어도 하나가 치환되어 있는 기타 치환된 캄프토테신을 들 수 있다.

천연의 비치환된 캄프토테신은 천연 추출물의 정제에 의해 얻어질 수 있거나, 또는 스텔린 화운데이션 포 캔서 리서치(Stehlin Foundation for Cancer Research)(텍사스주 휴스턴시 소재)로부터 얻어질 수 있다.

치환된 캄프토테신은 문헌에 공지된 방법을 이용해서 얻을 수 있거나, 또는 상업적인 공급처로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 9-니트로캄프토테신은 슈퍼젠 인크.(SuperGen, Inc.)(캘리포니아주 산 라몬시 소재)로부터 얻을 수 있고, 9-아미노캄프토테신은 이덱 파마슈티컬즈(Idec Pharmaceuticals)(캘리포니아주 샌 디에고시 소재)로부터 얻을 수 있다. 캄프토테신 및 각종 유사체는 시그마 케미컬즈(미조리주 세인트 루이스시 소재) 등의 표준 정제 화학 약품 공급업체로부터 얻을 수도 있다.

탁산 및 캄프토테신 이외에, 본 발명의 조성물 및 방법에 유용할 수 있는 기타 항암 약물로는 에토포사이드, 테니포사이드, 플루다라빈, 독소루비신, 다우노마이신, 에모딘, 5-플루오로우라실, FUDR, 에스트라디올, 캄프토테신, 레티노산, 베라파밀, 에포틸론 및 사이클로스포린을 들 수 있다. 더욱 일반적으로, 컨쥬게이트 부위를 제공할 수 있는 유리 히드록실기를 가진 항암 약물이 사용될 수 있다.

본 발명에서는 단일의 폴리머뿐만 아니라 2종 이상의 다른 폴리머의 이용도 고려된다. 다른 폴리머로는 예를 들어 상이한 길이의 유사한 폴리머뿐만 아니라 실질적으로 상이한 폴리머를 들 수 있다. 본 발명은 단일 폴리머에 컨쥬게이트된 약물 및 다수의 다른 폴리머에 컨쥬게이트된 약물의 이용을 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 각각 동일 유형의 폴리머에 컨쥬게이트된 2종 이상의 약물뿐만 아니라, 각각 상이한 폴리머에 컨쥬게이트된 2종 이상의 약물의 혼합물을 포함한다. 소정의 실시형태에 있어서, 2종 이상의 상이한 약물 부분은 단일 폴리머에 컨쥬게이트되어 있을 수 있다. 또한, 본 발명에서는 컨쥬게이트 및/또는 에스트로겐 요법 이외에 기타 암 약물(예를 들어, 카보플라틴)의 투여도 고려된다.

약물과 폴리머 간의 결합 또는 회합의 성질은 중요하지 않다. 예를 들어, 컨쥬게이트된 약물-폴리머 상호작용은 공유 결합을 통한 것인 반면, 회합(association)은 전하-전하 상호작용, 반 데르 발스 힘 등을 통한 것일 수 있다. 공유 결합은 합성적으로 또는 유전자 융합에 의해 발생되어 재조합 폴리머-약물 융합 단백질을 생산할 수 있다. 폴리머를 약물에 컨쥬게이트하는 예시적인 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,977,163호, 제6,262,107호 및 6,441,025호 공보, 그리고 국제 특허 공보 WO 99/49901, WO 97/33552, WO 01/26693 및 WO 01/70275에 기재되어 있다.

폴리머 및 약물은 직접 컨쥬게이트 또는 회합될 수 있거나, 또는 링커(linker) 또는 스페이서 등의 2차적인 분자를 통해 컨쥬게이트 또는 회합될 수 있다(예를 들어, WO 01/70275를 참조할 수 있다. 여기에 에 개시된 기술은 소정의 약물 컨쥬게이트, 특히 폴리아미노산 컨쥬게이트에 적용될 수 있다). 바람직한 링커는 순환시 가수분해에 대해서 비교적 안정한 것들을 포함한다. 링커의 예로는 아미노산, 히드록시산, 다이올, 아미노티올, 히드록시티올, 아미노알코올, 베타 알라닌, 글리콜 및 이들의 조합 등을 들 수 있다. 또한, 약물은 새로운 작용기의 도입, 기존의 작용기의 변성 또는 스페이서 분자의 부착 등과 같이 컨쥬게이션 전의 변성을 필요로 할 수 있다.

화학적 커플링은 예를 들어 문헌[Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, Inc., 1995] 및 문헌[Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, 1991]에 기재된 것과 같이 당업계에 공지된 이용가능한 방법에 따라 시판의 호모- 또는 헤테로-이작용성 가교 화합물을 이용해서 달성할 수도 있다.

약물 또는 다른 분자에 폴리머를 결합시키기 위한 방법의 추가의 예는 문헌[Hoffman et al., Biol . Chem. 370:575-582 (1989); Wiesmuller et al., Vaccine 7:29-33 (1989); Wiesmuller et al., Int . J. Peptide Protein Res. 40:255-260 (1992); Defourt et al., Proc Natl . Acad . Sci. 83:3879-3883 (1992); Tohokuni et al., J. Am. Chem . Soc. 116:395-396 (1994); Rachel, Chem . Common. 2087-2088 (1997); Kamitakahara, Angew . Chem . Int . Ed. 37:1524-1528 (1998); 및 Dullenkopf et al., Chem . Etc. J. 5:2432-2438 (1999)]에 기재되어 있다.

소정의 실시형태에 있어서, 폴리머는 미국 특허 제5,977,163호에 기재된 바와 같이 화학적 컨쥬게이션에 의해 약물에 컨쥬게이트된다. 이 방법에서는, 폴리글루탐산 컨쥬게이트를 나트륨염으로서 제조하고, 투석하여 저분자량의 오염물 및 과잉의 염을 제거한 후, 동결건조시킨다. 기타 화학적 컨쥬게이션 방법은 국제 특허 공개 공보 WO 01/26693 A2에 기재되어 있다. 이 방법에 따르면, 폴리글루탐산 폴리머는 폴리글루탐산의 카르복실산 잔기와 약물의 작용기 간의 직접 결합에 의해 또는 1개 이상의 이작용성 기를 통한 간접 결합에 의해 약물에 공유결합된다. 다른 방법은 문헌[March, Advanced Organic Chemistry, Wiley Interscience, 4th ed., 1992]에 개시되어 있다.

일 실시형태에 있어서, 폴리글루타메이트 담체는 다음과 같은 방법:

(a) 폴리글루탐산 폴리머의 양성자화된 형태(protonated form) 및 그에 대한 컨쥬게이션을 위한 약물을 제공하는 단계;

(b) 불활성 유기 용매 중에서 상기 약물을 상기 폴리글루탐산 폴리머에 공유 결합시켜 폴리글루탐산-약물 컨쥬게이트를 형성하는 단계;

(c) 과량 부피의 수용성 염 용액의 첨가에 의해 용액으로부터 상기 폴리글루탐산-약물 컨쥬게이트를 석출시키는 단계; 및

(d) 상기 컨쥬게이트를 양성자화된 고체로서 회수하는 단계.

를 포함하는 방법에 따라 약물에 결합된다.

단계 (a)에서의 폴리글루탐산 폴리머의 양성자화된 형태는 출발 물질로서 사용될 폴리글루탐산의 염을 함유하는 용액을 산성화시키고, 해당 염을 그 산 형태로 전환시킴으로써 얻어진다. 얻어진 고형물을 원심분리에 의해 분리한 후, 해당 고형물을 수세한 후, 폴리글루탐산을 건조시키는데, 바람직하게는 동결건조에 의해 그리고 바람작하게는 원하는 약물 (b)에 컨쥬게이트되기 전에, 물 약 2% 내지 약 21%, 물 약 7% 내지 약 21% 또는 물 7% 내지 21%를 포함하는 일정 중량으로 건조시킨다.

컨쥬게이트는 재결합 DNA 기법을 이용해서 전체로든 부분으로든 생산될 수 있다. 예를 들어, 폴리머 또는 약물, 또는 이들 양자는 재결합 수단에 의해 생산된 후, 회합되거나 컨쥬게이트될 수 있다. 대안적으로는, 예를 들어 폴리머 및 약물 양자를 포함하는 단일의 폴리펩타이드는 융합 단백질로서 생산될 수도 있다. 재결합 발현 벡터를 구성하는 방법은, 세균 및 효모 등의 각종 미생물에 있어서 재결합 폴리펩타이드를 발현시키는 방법과 같이, 당업계에 공지되어 있다.

폴리머에 컨쥬게이트된 약물의 양은 다양하다. 약물 폴리머 컨쥬게이트는, 하한치로서, 해당 컨쥬게이트의 질량에 대해서 약물을 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%(w/w)까지 포함할 수 있다. 또한, 약물-폴리머 컨쥬게이트는, 상한치로서, 해당 컨쥬게이트의 질량에 대해서 약물을 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 50% 이상(w/w)까지 포함할 수 있다.

마찬가지로, 폴리머 분자당 컨쥬게이트된 약물의 분자수는 다양할 수 있다. 약물-폴리머 컨쥬게이트는, 하한치로서, 폴리머 분자당 약물의 분자수를 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20 이상까지 포함할 수 있다. 약물-폴리머 컨쥬게이트는, 상한치로서, 폴리머 분자당 약물의 분자수를 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39, 약 40, 약 41, 약 42, 약 43, 약 44, 약 45, 약 46, 약 47, 약 48, 약 49, 약 50, 약 51, 약 52, 약 53, 약 54, 약 55, 약 56, 약 57, 약 58, 약 59, 약 60, 약 61, 약 62, 약 63, 약 64, 약 65, 약 66, 약 67, 약 68, 약 69, 약 70, 약 71, 약 72, 약 73, 약 74, 약 75 이상까지 포함할 수 있다.

폴리머는 약물 분자 상에서 하나 이상의 별개의 부위 또는 중첩 부위와 회합될 수 있다. 이와 반대로, 소정의 실시형태에 있어서, 약물 분자는 폴리머 상에서 하나 이상의 별개의 부위와 회합될 수 있다. 따라서, 소정의 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물은 폴리머 상에서 상이한 부위를 통해 폴리머와 회합된 약물뿐만 아니라 약물 상에서 상이한 부위를 통해 약물과 회합된 폴리머를 포함한다. 상이한 링커가 상이한 부위를 통한 회합을 유도하는 데 이용될 수 있거나, 또는 단일 링커가 각 부위에 존재하는 특정 작용기에 따라 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에 있어서, 본 발명은 각 약물 또는 폴리머 상에서 하나의 이상의 상이하거나 중첩되는 부위를 통해 하나 이상의 약물과 회합된 하나 이상의 폴리머의 혼합물을 포함하는 조성물을 포함한다.

본 발명의 약물 컨쥬게이트는 소정의 치료상 적합한 수단에 의해 전달되거나 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여는 비경구 또는 경구 방식일 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 투여는 정맥내(i.v.) 방식으로 수행된다.

조성물은 컨쥬게이트와 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 약제학적으로 허용가능한 담체로는 용제(예를 들어, 완충된 수용성 매질), 분산 매체, 코팅, 항균제, 항진균제, 등장성 제제(예를 들어, 글루코스) 등을 들 수 있다. 정맥내 용도에 적합한 컨쥬게이트를 함유하는 약제학적 조성물은 수용액 중에서 나중에 재구성될 수 있는 멸균 분말뿐만 아니라, 멸균 수용액 또는 분산액을 포함한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올, 이들의 적절한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용제 또는 분산 매체일 수 있다. 적절한 주사 용액은, 임의적으로 상기 열거된 바와 같은 각종 기타 성분과 함께, 적정량의 컨쥬게이트를 적당한 용제 내로 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 용액은 여과에 의해 멸균될 수도 있다. 분산액은 상기 열거된 것들로부터 유래한 임의의 소정 기타 성분 및 분산 매질을 함유하는 멸균 부형제(vehicle)에 컨쥬게이트를 혼입시킴으로써 제조될 수도 있다. 멸균 분말은, 컨쥬게이트와 임의의 추가 소정 성분의 분말을, 이의 이미 멸균-여과된 용액으로부터 수득하는, 진공 건조 및 동결 건조 기법에 의해 제조될 수도 있다.

약제학적 조성물은 적절한 기간 및 빈도로 적절한 용량으로 전달 또는 투여될 수 있다. 투여 용량 및 기간은 전형적으로 환자의 상태, 환자의 질병의 종류와 중증도, 활성 성분의 특정 형태 및 투여 방법과 같은 인자에 의해 결정된다. 적절한 용량 및 치료 섭생은 치료상 이득(예를 들어, 더욱 빈번하게 완전 또는 부분 완화, 보다 긴 무병(disease-free) 상태 및/또는 전체 생존(overall survival: OS) 등과 같은 개선된 임상적 결과)을 얻도록 설계된다. 상이한 범위의 투여 용량 및 치료 스케줄의 예가 미국 특허 제5,670,537호(탁솔에 대한 투여 용량 및 투여 스케줄을 개시하고 있음)에서 제공된다.

본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 이러한 치료를 필요로 하는 환자에게는 PPX 등의 약물 컨쥬게이트를, 내포된 특정 컨쥬게이트에 전형적으로 사용되는 용량 레벨로 2주마다 또는 기타 임상적으로 유용한 스케줄로 투여한다. 다수의 탁산 골격 분자 요법과 기타 단일의 탁산 골격 분자 요법 간의 유의한 비교를 제공하기 위해, 탁산 컨쥬게이트의 투여량은 "파클리탁셀 당량"으로서 표현될 수 있다. 예를 들어, 투여 목적을 위해서, 탁산 컨쥬게이트 분자 내의 각 탁산 골격은 1 파클리탁셀 당량으로서 계산된다. 용량 레벨은 일반적으로 약 175 내지 약 250 밀리그램/제곱 미터(㎎/㎡) 파클리탁셀 당량의 범위이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 환자에게는 PPX를 약 200 내지 약 250 ㎎/㎡ 파클리탁셀 당량의 양으로 21일마다 또는 약 3주마다 1회 처치한다. 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 환자에게는 PPX를 약 175 ㎎/㎡ 파클리탁셀 당량의 양으로 21일마다 또는 약 3주마다 1회 처치한다. 다른 실시형태에 있어서, 환자에게는 탁산 컨쥬게이트, 예컨대 PPX를 약 250 ㎎/㎡ 파클리탁셀 당량의 양으로 21일마다, 또는 심지어 약 275 ㎎/㎡ 파클리탁셀 당량을 초과하는 양으로 21일마다 처치한다.

정맥내 주입은 소정의 적절한 시기 동안일 수 있고, 이것은 당업자에 의해 용이하게 결정가능하다. 예를 들어, 주입은 약 1시간 내지 약 24 시간 지속될 수 있지만, 보다 짧거나 보다 긴 주입 시간도 본 발명의 범위 내에 속한다.

본 발명의 몇몇 실시형태에서는 약물 컨쥬게이트와 병용한 에스트로겐 요법의 사용이 고려된다. 본 명세서에서 이용되는 에스트로겐 요법이란, 환자에 있어서의 에스트로겐의 레벨을 증가시키거나, 또는 비암성 조직(폐암의 경우 뼈 및 간을 포함함)에 비해서 암성 조직, 예를 들어 폐에 있어서의 항암 약물의 고도의 축적을 초래하는 에스트로겐성 물질의 투여를 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 이용되는 바와 같이 "에스트로겐"으로는 천연 포유류 에스트로겐 및 그의 동류물(congener), 예를 들어 에스트라디올 및 그의 유기 에스테르(예컨대, 에스트라디올 벤조에이트, 에스트라디올 사이피오네이트 및 에스트라디올 발레레이트), 에스트론, 다이에틸스틸베스트롤, 피페라진 에스트론 설페이트, 에티닐 에스트라디올, 메스트라놀, 폴리에스트라디올 포스페이트, 에스트리올, 에스트리올 헤미숙시네이트, 퀸에스트롤, 에스트로피페이트(estropipate), 핀에스트롤(pinestrol), 에스트론 칼륨 설페이트 및 티볼론, 에스트로겐 대사 산물, 예를 들어, 17-β-에스트라디올, 에스트로겐 유사체, 에스트로겐성 활성을 가진 천연 화합물, 예를 들어, 피토에스트로겐, 예컨대 게네스테인 또는 이소플라본, 에스트로겐 작용제, 예를 들어, 소정의 작용 활성을 가진 선택적인 에스트로겐 수용체 조절물질(modulator)(예컨대, 타목시펜), 및 세포 표면 에스트로겐 수용체와의 상호작용을 할 수 있는 기타 물질 중 어느 것이든 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이들 에스트로겐 및 에스트로겐성 물질은 천연 또는 합성일 수 있다.

에스트로겐 또는 에스트로겐성 물질은 포유류 생리학에 상용성을 갖는 임의의 수단 및 선택된 전달 경로에 의해 제제화될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 충분히 공지되어 있다. 이에 대해서는, 문헌[U.S. Pharmacopeia National Formulary, United States Pharmacopeal Convention, Inc., pp. 530-541 (1990)]을 참조할 수 있다.

에스트로겐 요법은 국소, 경구, 전신, 정맥내, 근육내, 점막내 또는 경피(예를 들어, 패취) 등의 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 에스트로겐 요법은 규칙적(예를 들어, 날마다/주마다) 기준으로 투여될 수 있고, 약물-컨쥬게이트 요법에 대해서 간헐적일 수 있거나 또는 실질적으로 연속적일 수 있다.

전형적인 용량 범위는 화합물 및 환자의 특성에 의존한다. 에스트로겐의 1일 용량은 전형적으로 에스트로겐 또는 그의 대사 산물이 사용되는 경우 혈청 또는 혈장 에스트로겐 레벨을 30 pg/㎖와 동일 또는 그 이상으로 유지하는 데 필요한 주어진 제제의 양에 의거한다.

치료 섭생으로는 매일 0.3 ㎎/1.5㎎, 0.45 ㎎/1.5㎎, 0.625 ㎎/2.5 ㎎ 또는 0.625 ㎎/5.0 ㎎의 에스트로겐/프로게스테론 요법과 같은 호르몬 대체 요법을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또 다른 실시형태에 있어서, 요법은 1일 1회 또는 2회 0.15 ㎎, 0.3 ㎎, 0.625 ㎎ 또는 1.25 ㎎의 에스트로겐 요법을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 요법은 1일 3회 10 ㎎의 에스트로겐을 포함한다. 에스트로겐의 예는 프레마린(등록상표: Premarin®)(펜실베니아주 소재, Wyeth Pharmaceuticals, Inc. 제품)이 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 에스트로겐/프로게스테론 조합물은 프레프로(상품명: Prempro®)(Wyeth Pharmaceuticals, Inc. 제품)의 투여에 의해 달성된다. 대안적인 요법은 단일 용량으로 매일 20 mg으로 또는 1일 10 mg씩 수회로 1일 20 내지 40 mg으로 투여된 타목시펜을 포함한다.

본 발명의 방법은 병용 요법의 각 성분이 동일 경로로 전달되거나 심지어 동시에 전달될 필요는 없다. 그러나, 본 발명의 몇몇 실시형태에 있어서, 약물 컨쥬게이트 및 에스트로겐 요법은 동일한 투여 경로에 의해 동시에 부여된다. 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 에스트로겐 요법은 약물 컨쥬게이트 처치 과정 기간에 걸쳐 실질적으로 연속적이 되도록 경피(예를 들어, 패취에 의해) 또는 경구(예를 들어, 1일 정제, 캡슐 또는 환제) 투여된다.

본 발명은 또한 혈청 또는 혈장 에스트로겐 레벨을 기초로 하여 암 치료를 선택하거나 선정하는 방법에 관한 것이다. 폐경전 에스트로겐 레벨을 가진 환자는 항암 약물의 컨쥬게이트된 형태, 예를 들어, PPX의 처치에 대해서 바람직하게 반응하기 더욱 쉬운 반면, 낮은(예를 들어 폐경후) 에스트로겐 레벨을 가진 환자는 PPX 또는 비컨쥬게이트된 파클리탁셀 등의 다른 암 요법으로 처치될 수 있다(예를 들어, 실시예 1 및 2, 특히 도 3 및 4 참조할 수 있다).

암 치료를 선택 또는 선정하는 방법은 암 환자로부터 얻어진 혈액 샘플의 혈청 또는 혈장 중의 에스트로겐 레벨을 측정하는 단계 및 에스트로겐 레벨을 치료 옵션과 상관시키는 단계를 수반한다. 폐경전 에스트로겐 레벨은 PPX의 투여를 포함하는 암치료와 상관관계가 있다. 폐경후 에스트로겐 레벨은 PPX 또는 파클리탁셀을 포함할 수 있는 암 치료와 상관관계가 있다. 이 방법은 에스트로겐 수용체 보유 암과 관련해서 특히 유용하며, 이것은, 이미 설명한 바와 같이, 에스트로겐 수용체 보유 암 세포의 존재를 특징으로 하는 임의의 암 또는 에스트로겐 수용체를 보유하는 정상 (질병에 걸리지 않은) 세포를 함유하는 기관 또는 조직에서 유래되는 암을 포함하며, 여기서 에스트로겐 수용체는 일시적으로 발현될 수 있고/있거나, 에스트로겐 수용체 담지 세포가 세포의 전체 모집단의 일부를 대표할 수도 있다.

본 발명 및 그의 장점을 충분히 예시하기 위하여, 하기 구체적인 실시예를 제공하는 데, 이들 실시예는 단지 예시를 의도한 것일뿐 어떠한 방식으로도 제한을 의도한 것이 아님을 이해해야 한다.

실시예 1

실시예 1에서 제시되는 실험 및 결과는, 전체 생존(OS)에 의해 측정된 바와 같이, CT-2103 대 파클리탁셀에 의한 처치 및 에스트로겐 레벨 간의 상관관계를 기술한다. 도 1 및 2에 표시된 데이터는 다국적 위상 III, 개방-표지 연구(open-label study)로부터 유래하였다. 또한, NSCLC을 가진 400명의 환자는 2 처치 아암(treatment arm) 중 하나에 대해 동등하게 랜덤화하였다: 아암 1(CT-2103, 즉, PPX)의 199명의 환자에게는 카보플라틴(AUC 6)과 병용하여 210 ㎎/㎡의 용량으로 투여하였고; 아암 2(비컨쥬게이트된 파클리탁셀)의 201명의 환자에게는 카보플라틴(AUC 6)과 병용해서 225 ㎎/㎡의 용량으로 투여하였다. 랜덤화는 2 처치 아암 사이의 잠재적인 불균형을 최소화하기 위해 계층화하였다. 이들이 연구를 위해 선택된 후, 환자들은 질병 단계(IV 대 기타), 성별, 지리적 위치(미국 대 서유럽 및 캐나다 대 나머지 세계) 및 뇌전이의 병력(예 대 아니오)에 의해 계층화하였다.

초기 샘플 세트로부터, 고농도 또는 저농도 에스트로겐 여성으로 이루어진 서브세트를 분석하였다. 아암 1로부터, 29명의 고농도 에스트로겐 여성과 15명의 저농도 에스트로겐 여성을 연구하였고, 아암 2로부터, 25명의 고농도 에스트로겐 여성과 17명의 저농도 에스트로겐 여성을 연구하였다. 여성에 있어서의 에스트로겐 레벨은 경쟁적 면역측정(예를 들어, DPC IMMULITE 2000 Analyzer, NY; DPC IMMULITE Analyzer, 아일랜드 소재)에 의해 결정하였다. 비교는 저농도 에스트로겐 군(도 1)에 대해서 아암 1과 2 사이에 수행하였고, 고농도 에스트로겐 군(도 2)에 대해서 아암 1과 2 사이에 수행하였다.

함유 기준(inclusion criteria)은 이하의 것으로 구성하였다:

1. NSCLC의 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인된 진단;

2. 질병 상태에 대해 하기 기준 중 하나를 충족시키는 것:

a. 방사선 요법 및/또는 수술로 이미 처치된 국소적으로 진행되거나 재발된 질병,

b. 병용 양식 요법에 대해서 후보가 아닌 IIIB 단계 환자 또는

c. IV 단계 질병을 가진 환자;

3. ECOG 성능 점수 2 ; 및

4. 적절한 골수, 신장 및 간장 기능. 또한, 공지된 뇌 전이를 가진 환자가 표준 항종양 치료(방사선 요법과 병용된 전신 화학요법이 아님)를 받았던 것임에 틀림없고; 환자가 랜덤화 2주 전에 요법으로부터 적절하게 회복되어 안정적인 신경 기능을 나타내는 것임에 틀림없다.

환자에게는 각 21일 주기로 총 6 사이클 동안 각 주기의 1일에 정맥내 주입에 의해 CT-2103/카보플라틴 또는 파클리탁셀/카보플라틴을 투여하였다. 독성은 각 환자 내방시 평가하였다. 혈액학, 임상 화학 및 응고 파라미터는 연구 기간 전 및 연구 동안 평가하였다. 종양 부하량(tumor burden)은 RECIST(Response Criteria in Solid Tumors)에 따라 평가하였고; 질병 관련 증후군은 FACT-LCS(functional assessment cancer therapy-lung cancer score)에 의해 측정하였고, 전산화 단층촬영(CT: computerized tomography) 스캔은 정해진 간격으로 평가하였다. 환자는 질병 진행, 과도한 독성, 환자의 동의 퇴원, 또는 환자 퇴원에 대한 연구자 결정의 경우에 퇴원시켰다. 처치 평가의 종료는 최종 연구 처치의 완료 후 22 내지 26일에 수행하였고; 환자는 추가의 생존 및 질병 상태 정보를 얻기 위해 치료 내방 종료 이후 8주 간격으로 접촉하였다. 이 연구의 효능과 안전성은 독립적인 DMC(Data Monitoring Committee)에 의해 모니터링하였다.

치료 효능은 RECIST에 따라 종양 부하량의 평가에 의해 결정하였다. 또한, CT 스캔은 베이스라인에서 매 홀수 사이클 중 3번째 주(週)에 수행하였다. 질병 관련 증후군은 각 연구 치료 전에 3일 이내에 FACT-LCS에 의해 평가하였다.

로그 랭크(log rank) 통계 분석은 고농도 에스트로겐 여성에 있어서의 아암 1 및 아암 2와 저농도 에스트로겐 여성에 있어서 아암 1 및 아암 2를 비교하기 위해 수행하였다.

상기 연구로부터의 결과는, NSCLC로 진단되어 CT-2103 + 카보플라틴 또는 파클리탁셀 + 카보플라틴으로 처치된 폐경후(즉, 저농도 에스트로겐) 여성의 OS에 있어서 통계학적으로 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(도 1). 이와 아주 반대로, CT- 2103 + 카보플라틴이 NSCLC(즉, 고농도 에스트로겐)를 가진 사춘기 후 폐경전 여성에 대해서 투여된 경우 대 파클리탁셀 + 카보플라틴이 투여된 경우 생존률에 있어 통계학적으로 유의한 증가가 있었다(도 2). 도 2에 도시된 연구의 결과에 대해서 통계학적으로 유의한 차이는 저농도 샘플 크기를 부여한 경우 훨씬 더 경이로웠다.

이들 결과는, NSCLC로 진단되고 폐경전 에스트로겐 레벨을 가진 여성이 CT-2103(즉, PPX)이 포함된 암 치료로부터 혜택을 받지만, 폐경후 에스트로겐 레벨을 가진 여성은 CT-2103 또는 파클리탁셀로 치료될 수 있는 것을 시사한다.

실시예 2

실시예 2에서 제시되는 실험 및 결과는, 전체 생존(OS)에 의해 측정된 바와 같이, 에스트로겐 레벨간 상관관계, 성별(즉, 성) 및 PPX 대 파클리탁셀에 의한 처치를 기술한다. 열등한 성능 상태(PS2) 및 NSCLC를 가진 총 781명의 환자를 입회시킨 2개의 III상 연구를 수행하였다. 하나의 연구(스텔라(STELLAR) 3)에 있어서, 환자는 2개의 처치군, 즉, PPX(210 ㎎/㎡ + 카보플라틴 AUC 6, 3주마다)를 투여한 실 험군과 파클리탁셀(225 ㎎/㎡ + 카보플라틴 AUC 6, 3주마다)을 투여한 대조군으로 나뉘었다. 다른 연구(스텔라 4)에 있어서, 실험군에는 PPX(175 ㎎/㎡, 3주마다)를 투여하였고, 대조군에는 겜시타빈(1, 8 및 15일째에 1000 ㎎/㎡, 4주마다) 또는 비노렐빈(vinorelbine)(1, 8 및 15일째에 30 ㎎/㎡, 3주마다)을 투여하였다. 각종 처치군 중에서 생존에 대한 에스트로겐 및 성별 효과를 연구하기 위해서, 양쪽 III상 임상 실험으로부터의 결과를 조합해서 복합 분석을 수행하였다.

생존 결과에 대한 성별 효과의 결과는 이하의 표 1에 제공된다. 이들 결과는 PPX로 처치된 통계학적으로 보다 많은 수의 여성이 대조군의 여성보다 1년 생존점에 도달하는 것으로 나타났다. 한편, PPX군의 남성 대 대조군의 남성에 대해서 이러한 1년 생존 차이는 없었다.

	여성			남성
	PPX		대조군	PPX		대조군
^aN	97		101	283		290
OS(일수)	285		233	220		207
1년	40%		25%	26%		30%
시간		0.70			1.05
p값		.03			.585
^aN: 주어진 군 내에서의 환자 수

PPX로 처치된 여성에 있어서의 생존에 대한 에스트로겐 효과를 평가하기 위해서, 폐경 상태에 의해 소급하여 데이터를 분석하였다. 기능성 폐경 상태는 이용가능한 경우, 연령 및 치료전 에스트라디올 레벨에 의거해서 지정하였다. 이 연구는 양쪽 임상 연구로부터의 결과의 복합이었다. 55세 미만의 여성에 있어서, OS는 대조군 아암의 것에 비해서 PPX를 투여한 환자에 대해서 연장하였다(도 3). 55세를 넘은 여성에 있어서, OS는 처치군 간에 유사하였다(도 4).

스텔라 3에 있어서, 에스트로겐 레벨은 몇몇 여성에 대해서 유효하였다. 폐경전 에스트로겐 레벨을 가진 여성은 대조군에 비해서 PPX로 처치된 경우 향상된 결과를 가졌다(도 5). 이에 대해서, 처치군은 폐경후 에스트로겐 레벨을 가진 환자에 있어서의 생존 효과는 명확하지 않았다(데이터는 표시 생략).

실시예 3

실시예 3에서 제시되는 실험 및 결과는 PPX가 세포 속으로 들어가는 기전을 설명한다. PPX의 세포내 흡수(cellular uptake)는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 얻어진 2개의 세포주인 NCI-H460 인간 폐 암종(H460; ATCC HTB-177) 및 RAW 264.7 마우스 단핵 세포/대식 세포(RAW; ATCC TIB-71)에 있어서 시험관내에서 연구하였고, 이들 세포주는 독립적으로 배양하여 PPX로 처치하였다.

1세트의 실험에 있어서, PPX 흡수는 방사능 표지된 PPX를 이용해서 측정하였고, 상기 방사능 표지된 PPX는 다음과 같이 제작하였다: 방사능 표지된 PPX는 폴리-L 글루탐산의 표준 제제를 2-벤조일 고리 중 ¹⁴C에 균일하게 표지된 파클리탁셀(¹⁴C-PPX; 시그마-알드리치 제품, 1.762 마이크로큐리(μCi)/㎎ 비활성(specific activity))과 컨쥬게이션함으로써 제조하였다. 세포들은 2분 또는 3 내지 4시간 동안 0.01 내지 10 μM ¹⁴C-PPX로 처치하였다. 방사능 활성은 이어서 섬광 계수에 의해 매질 중에서 정량화하였다. 수확된 세포는 에틸 아세테이트 중에 추출하였고, 상부 유기상(비컨쥬게이트된 파클리탁셀 및 저분자량 대사 산물[즉, 모노-및 디-글루타밀 파클리탁셀]을 함유함)과 하부 수상(글루타밀-파클리탁셀 대사 산물과 미처리(intact) PPX를 함유함)을 계수하였다.

PPX의 분포를 연구하기 위해서, RAW 세포는 방사능 표지된 PPX(¹⁴C-PPX) 1 μM 또는 10 μM로 처치하였다. 2분, 그리고 3 또는 4시간째에, 샘플을 채취하였다. 방사능 활성은 이미 설명한 바와 같이 정량화하였다. 3개의 샘플로부터의 결과는 DPM(disintegrations per minute) ± 표준 편차로서 표시하였다.

이하의 표 2에 제시된 결과는 ¹⁴C-PPX 10 μM로 3시간 처치된 세포에 있어서 미처리 PPX의 통계학적으로 유의한 증가 (p < 0.001)를 나타내었다.

[¹⁴C-PPX]	1μM		10μM
배양시간	2분	4시간	2분	3시간
샘플	DPMs ± 표준편차, N=3(대조군 %)
출발 매질	252989±4366	252989±4366	2490999±16716	2490999±16716
수성 세포층 추출물	196±11 (0.077%)	1980±197 (0.783%)	454±66 (0.018%)	2554±90 (0.103)
유기 세포층 추출물	323±360 (0.128%)	693±410 (0.273)	207±29 (0.008%)	275±50 (0.011%)

다른 실험에 있어서, RAW 세포 또는 H460 세포의 두 코호트(cohort)는 2분 또는 3시간 동안 ¹⁴C-PPX로 처치하였다. 코호트 중 하나는 에너지 의존 세포내이입의 저해제(20 μM의 사이토칼라신 D{사이토 D, EMD 바이오사이언시스 제품} 또는 1 μM의 페닐 아르신 옥사이드{POA, 시그마 제품})로 추가적으로 처치하였다. 방사능활성은 전술한 바와 같이 정량화하였다. DPM은 에틸 아세테이트 추출된 세포층 구획의 수상에서 3시간 배양시의 DPM으로부터 2분 배양시의 DPM을 감산함으로써 산출하였다.

이하의 표 3에 제시된 결과는, 세포내이입의 저해제에 의한 세포의 전처리가 수상(미처리 PPX)에서 측정된 바와 같이 ¹⁴C-PPX에 있어서 통계학적으로 유의한 감소를 가져오는 것으로 나타났다.

[¹⁴C-PPX]	1μM		10μM
+/- 저해제	-	+	-	+
저해제/세포 종류	DPMs ± 표준편차, N=3
사이토 D/RAW 세포	1784±197	808±106	2100±112	1318±57
PAO/H460 세포	73±15	54±6	217±6	128±11
DPM은 에틸 아세테이트 추출된 세포층 구획의 수상에서 3시간 배양시의 DPM으로부터 2분 배양시의 DPM을 감산함으로써 산출되었다.

¹⁴C-PPX 흡수 연구로부터의 결과는 미처리 PPX가 용량- 및 시간-의존적 방식으로 에너지-의존 세포내이입에 의해 RAW 배양된 대식 세포 및 H460 종양 세포의 세포 구획 내로 흡수된 것으로 나타났다.

다른 세트의 실험에 있어서, PPX 흡수는 간접적인 면역형광법에 의해 연구되었다. 항-PPX 단클론성 항체(MAb)는 다음과 같이 제조하였다: 열대열원충(Plasmodium falciparum: P. falciparum) 펩타이드(GGG GGA GLL GNV STV LLG GV; Genemed Synthesis, Inc. 제품)는 PPX 분자 면역원성을 부여하기 위해 디이소프로필 카르보디이미드 반응을 통해 PPX(CTI; 로트 번호 1116-91)에 컨쥬게이트화하였다. 열대열원충 펩타이드-PPX 항원은 독점적인 래피트 프라임(등록상표: Rapid Prime®) 면역화 절차(ImmunoPrecise Antibodies Ltd.)를 통해 MAb를 제조하는 데 사용하였다. 양성 하이브리도마 클론은 면역화된 열대열원충 펩타이드-PPX 항원에 의한 고상 ELISA를 이용해서 선택하였다. 하나의 하이브리도마 클론인 CT-2D5는 BALB/c 마우스들에 있어서 복강내(i.p.) 주사를 통해 확장하였다. CT-2D5는 단백질 G 크로마토그래피에 의해 복수(ascites fluid)로부터 정제하였다. 결합 친화도는 고상 ELISA 방법에 의해 분석평가하였다. MAb 동형(isotype)은 인스턴트 ChekTM-ISOTYPE 키트(EY 래보라토리즈 리미티드 제품)에 의해 IgG-2b로 되도록 결정하였다. CT-2D5의 결합 에피토프는 경합적인 ELISA 방법을 이용해서 맵핑하였다.

컨플루언트(confluent) 세포층이 10 nM 내지 10 μM의 PPX로 4시간 배양된 후, 세포들이 고정되어 이하의 방법에 의해 면역형광분석을 위해 처리하였다: 고정된 세포들을 CT-2D5, 1°항체(Ab), 및 AlexaFluor488 표지화된 염소 항-마우스 F(ab')₂ 2° Ab(몰리큘러 프로브스(Molecular Probes)사 제품)의 1:5000 희석액으로 염색하였다. 화상들은 니콘 다이아프핫 형광 현미경(Nikon Diaphot fluorescent microscope) 및 쿨스냇 에이치큐 카메라(CoolSnap HQ camera)를 이용해서 얻었다. 메타모프(Metamorph) 화상 처리 소프트웨어(Metamorph v.6.2 r6)를 이용해서 화상을 처리하여 저장하였다.

RAW 세포층은 설명된 바와 같이 처리하고 나서, 항-조기 엔도솜 항원-1 Ab(anti-early endosomal antigen-1)(EEA-1, 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)사 제품)를 이용해서 공염색하였다. H460 세포층은 설명된 바와 같이 처리되었다. H460 세포층의 추가의 코호트는 훽스트 핵 염료 및 항-α-튜불린 Ab를 이용해서 공염색하였다.

간접적인 면역형광 연구로부터의 결과는 PPX 면역 염색이 엔도솜 표지자에 의해 공국부화(co-localized)된 것으로 나타났다(데이터는 표시 생략). 엔도솜은 라이소솜과 함께 융합되어, 약물, 주로 카텝신 B를 대사시키는 라이소솜 효소에 PPX를 노출시켰다.

실시예 4

실시예 4에서 제시되는 실험 및 결과는 PPX의 생체내 트래피킹(trafficking)을 기술한다. 따라서, PPX의 분포는 종양을 보유하는, PPX 처치된 암컷 누드 마우스들에 있어서 연구되었다. 암컷 누드 마우스들에게는 왼쪽 옆구리에 H460 인간 종양 단편을 피하(s.c.) 이식하였다. 종양이 100 내지 150 ㎣의 크기에 도달한 경우, 마우스들은 PPX의 단일 i.v. 용량(PTX 당량으로서 90 ㎎/㎏)으로 처치하였다. 마우스들은 처치후 24시간째에 안락사시켰다. 폐, 간, 비장 및 종양 샘플을 회수하고, 10% 완충 포르말린으로 고정시키고 파라핀을 함침시켰다. 조직 절편(4 마이크로미터(㎛))은 수개의 항체, 즉, CT-2D5(이미 실시예 3에 설명되어 있음), CD45 래트 항-마우스(BD Pharmingen 제품, Cat No: 55039, 클론: 30-F11), F4/80 래트 항-마우스(Novus Biologicals 제품, Cat NB 600-404 클론 CI:A3-), MHCII(HLA) 마우스 항-인간 단클론성 Ab HLA-DR α-체인(Dako Cytomation 제품, 클론 TAL.1B5, REF: M 0746, LOT: 00006515), 리소자임 다클론성 토끼 항-인간(다코 사이토메이션 제품, EC 3.2.1.17, 코드 A 0099) 및 골수세포형 과산화효소(myeloperoxidase: MPO) 다클론성 토끼 항-인간(다코 사이토메이션 제품, 코드 NP082)로 염색하였다.

CT-2D5 염색은 Dako-ARK 마우스-온-마우스 키트를 이용하여 수행하였다. CD45 및 F4/80 염색은 벡테스타인 ABC-알칼린-포스파타제 키트(Vectestain ABC-Alkaline-Phosphatase kit)를 이용하여 수행하였다. MHCII, 리소자임 및 MPO 염색은 벡테스타인 ABC-퍼옥시다제 키트를 이용하여 수행하였다. 비특이적 염색을 검출하기 위해서, 음성 대조군 절편은 다음과 같이 제조하였다. CT-2D5, CD45, F4/80 및 MHCII를 이용한 면역염색 동안에는, 음성 대조군 절편을 1차 Ab로서 정상 블로킹 혈청과 함께 배양하였다. 리소자임 및 MPO를 이용한 면역염색 동안에는, 음성 대조군 절편을 관계가 없는 토끼 다클론성 1차 Ab와 함께 배양하였다.

조직학적 검사는 부착된 디지틀 카메라를 갖춘 광 현미경을 이용하여 수행하였다. 현미경 조사는 블라인드 방식으로 수행하였다. 양성 면역 반응의 강도는 임의의 척도(최소치부터 마킹된 부분까지)에 따라 점수 매겼다. IHC 양성률(positivity rate)의 반정량적 평가는 랜덤하게 선택된 10개의 필드(field)에 있어서 높은 배율(400×)에서 양성 세포를 계수함으로써 수행하였다. 100배에서의 대표적인 필드는 조직 내에서의 양성 분포를 나타내도록 포착되었다.

강력한 세포질 내 염색은 PX에 의한 처치 후 24시간째에 세망내피계의 기관에서 발견되었고; 간에서는, 쿠퍼 세포(Kupffer cell)와 견줄만한 형태를 가진 대략 20 cpf(cells per field)가 강력하게 양성이었으며; 간세포는 음성으로 발현되었고; 비장에서는, 대식 세포 형태를 가진 세포가 양성(

10-15 cpf)인 반면, 림프소절은 음성이었으며; 폐에서는, 양성 세포(< 1 cpf)는 II형 폐포세포와 형태학적으로 견줄만하였다.

종양 조직에 있어서, 강력한 세포질내 염색은 종양 캡슐(

2 cpf)에서 발견되었고; 양성 세포의 형태는 대식 세포에 침투하는 것과 일치하였다. 생육성 세포와 괴사 간의 테두리(rim)는 중간 정도 내지 강한 정도의 과립, 세포외 및 경우에 따라서는 세포내(세포질내 및 핵내) 염색을 특징으로 하였다. 이 영역 내의 조직 구조는 엄격하게는 괴사 과정에 의해 심하게 손상되었고, 따라서 CT-2D5 양성 세포의 형태 분석에 의한 신뢰성 있는 식별은 불가능하였다.

비장에서는, 적색 속질(pulp) 내에서의 거의 모든 세포가 CD45에 대해 강한 세포질내 양성을 보였고, 또한 백색 속질에서도 약간 내지 보통의 양성이 확인되었으며; F4/80에 대한 보통의 세포질내 염색은 적은 수의 세포(

10-15 cpf) 내의 적색 속질에서 보였다. 간에서는, 약간 내지 보통의 세포질내 염색이 CD45 및 F4/80 의 양쪽 모두(

20 cpf)에서 보였다. 폐에서는, 보통 내지 강한 세포질내 염색은 CD45(

2-5 cpf)에 대해서 보였고; F4/80에 대한 약간의 세포질내 염색은 근소한 수의 세포(<1 cpf)에서 보였다. 간, 비장 및 폐에서의 F4/80 양성 세포의 형태 및 분포 패턴은 동일한 조직 내의 CT-2D5 양성 세포의 것과 일치하였다.

종양에 있어서, 강한 세포질내 염색은 종양 캡슐 내의 CD45 및 F4/80(각각,

6 및 4 cpf)의 양쪽 모두에 대해서 보였다. 드문 CD45 및 F4/80 양성 세포가 살아있는 종양 조직 내에 국지화되었다. 살아있는 종양 세포와 괴사 간의 테두리(rim)는 CD45에 대해서 보통 내지 강한 세포외 과립 염색 및 경우에 따라서는 내포내 염색을 특징으로 하였다. 이들 세포의 형태는 캐리오라이틱-캐리오렉틱(karyolitic-karyorrhectic) 과립구의 것과 일치하였다. 괴사 영역은 CD45에 대해서 현저한 양성인 것을 특징으로 하였다. 주변-괴사 및 괴사 영역은 F4/80에 대해서 음성이었다.

MHCII에 대한 구체적인 면역반응성(

10 cpf)은 종양의 외부 캡슐에 있어서 국지화되어 있었다. 드문(≤ 1 cpf) 및 산재된 양성 세포는 종양의 살아 있는 부분에서 발견되었다. 면역반응 세포의 형태 분석은 조직구 기원이었던 것을 나타낸다. 양성 염색은 괴사 영역에서 발견되지 않았다.

리소자임에 대한 양성 면역반응성은 종양의 외부 캡슐(

10 cpf)에 국지화되어 있었다. 강력한 양성 염색(미세한 과립 부스러기)이 종양의 괴사 영역에서 발견되었다.

캐리오라이틱-캐리오렉틱 과립구와 형태상 일치하는 수많은 MPO 면역반응 세포는 종양의 괴사 영역에서 보였다.

이 연구의 결과는 주사 후 24시간째에 PPX의 흡수 및 축적이 상이한 기관 및 종양 조직에서 검출될 수 있는 것을 뒷받침한다.

CD45(통상의 백혈구 항원) 및 F4/80(특정 쥐과 동물의 대식 세포 항원) 신호의 공동국지화(colocalization)에 의해 뒷받침되는 형태 평가는, CT-2D5 양성 세포가 간, 비장, 폐 및 종양 캡슐 내의 골수-조직구 기원의 전부였던 것을 입증하였다. 이들은 간세포, 폐의 폐포 라이닝 세포 또는 비장의 백색 속질에 대한 유의한 분포 없이 세망내피계 내의 조직-관련 대식 세포에 의해 크게 흡수된 것임을 뒷받침한다.

주변괴사 및 괴사 영역 내의 CT-2D5 양성의 평가는 제한된 수의 생세포에 의해 복잡화되었다. 그럼에도 불구하고, CD45, MPO 및 리소자임 양성 및 형태학적 조사는, 종양의 이들 영역 내에서의 PPX 축적이 다형핵(polymorphonuclear: PMN) 백혈구 침투와 관련되어 있고, 세포내 PPX는 그 영역에서 그들의 식세포성 활성에 연유하는 것을 시사한다.

이 종양 모델의 중앙부에서의 대식 세포의 축적의 결여는 종양 관련 대식세포(TAM: Tumor Associate Macrophage) 기능에 대해서 세포내 유리 파클리탁셀 PPX의 높고 지속된 농도의 잠재적인 효과 및 종양내 PPX 대사의 잠재적으로 중요한 공급원으로서 TAM과 PPX의 잠재적인 상호작용의 평가를 방지한다.

H460 종양 이종이식(xenograft) 종양 조직의 주변괴사 영역에서 검출된 PPX의 축적은 종양 맥관의 EPR(enhanced permeability and retention) 효과를 통해 PPX의 증강된 분포와 양립가능하다.

H460 이종 이식의 종양 캡슐 내에서의 높은 레벨의 PPX의 존재는 이전의 생분포 연구와 일치하고, PPX의 우선적인 종양 축적을 뒷받침한다.

PPX의 세포내 국지화는 주로 식세포질(phagocytotic) 세포, 즉, 조직-관련 세포(간, 비장) 또는 종양-침투 대식 세포에서 관찰된다.

종양 조직에 있어서, 세포내 및 세포외 PPX는 라이소좀 활성에 대한 표지자와 함께 공동국지화된다.

종합하면, 이들 관찰은 PPX가 우선적으로 종양 조직에 축적되고 나서 라이소솜 효소의 단백질 분해 활성을 통한 파클리탁셀의 분해를 행하는 모델과 일치한다.

실시예 5

인간 종양 이종 이식에서의 카텝신 B 및 PPX 활성에 대한 에스트로겐의 효과를 조사하기 위해 연구를 행하였다. 이 효과를 연구하기 위해, HT-29 인간 CRC(colorectal cancer) 및 H460 인간 비소세포 폐암(NSLCL)(양쪽 모두 ATCC로부터 입수) 세포를 암컷 CD nu/nu 마우스들에 피하(s.c.) 이식하였다. 플라시보(placebo) 또는 0.18, 0.36, 0.72 ㎎/60일의 17β 에스트라디올(E2) 방출 제어된 펠렛(IRA)을 0일째에 피하 이식하고, 5일 후, 인간 종양 단편을 이식하였다. 펠렛 이식 후 5, 21, 28 및 35일째에, 혈액 및 종양을 회수하였다(5 마우스/시점).

PPX에 대한 에스트로겐 처치 효과 및 HT-29-인간 CRC 이종이식 종양 모델에 대한 파클리탁셀 항종양 활성을 이하의 방법에 의해 분석하였다: 종양이 120-150 ㎎(즉, 진행 종양)인 경우, PPX(i.v./qdl 90 ㎎/㎏ PTX 당량) 및 PTX(i.v./qdl 90 ㎎/㎏, 시그마 알드리치 제품)를 종양 및 플라시보(placebo)(P) 또는 E2 펠렛 보유 마우스에 투여하였다. 약물 처치 후 1일(24시간) 및 7일(168시간) 째에, 종양을 회수하고, 절개 직후 액체 질소 중에서 신속하게 동결시켰다.

항종양 활성 파라미터는 다음과 같이 결정되었다:

1. 종양 중량 저해율 %(TWI%)는 100 - (처치 TW/대조군 TW) × 100이며, 이것은 펠렛 이식 후 60일째에 평가하였다.

2. 종양 성장 지연(TGD): TGD는 처치 TG - 대조군 TG이며, 여기서 TG는 1 그램(g)의 중량에 도달하는 종양에 대한 평균 시간(일수)이다.

3. 로그 세포 사멸(Log cell kill: LCK)은 다음 식으로 산출되었다: LCK는 ((TGD 1 g)/3.32) × DT이며, 여기서 DT는 대조군 및 실험군에 있어서 체적의 2배로 되도록 종양에 필요한 시간(일수)이다.

통계학적 분석은 원-웨이 아노바 본페로니 포스트 테스트(one-way ANOVA Bonferroni post test)를 이용하여 수행하였다.

에스트로겐 혈장 레벨은 방사면역측정 키트(RadioImmunoAssay KIT)(DiaSorin 제품)에 의해 결정하였다.

종양 조직에서의 비컨쥬게이트된 파클리탁셀 및 총 파클리탁셀의 분석은 다음과 같은 방법에 의해 결정하였다: 조직의 적절한 균질화 후, 비컨쥬게이트된 파클리탁셀 농도는 메틸-tert-뷰틸에터(MTBE)에 의한 액체/액체 추출을 통해 결정하였다. 총 파클리탁셀은 PPX의 메탄 분해 반응에 이어 유리된 파클리탁셀의 MTBE 추출 후 측정하였다. 처리된 샘플에서의 파클리탁셀 함량은 선택된 반응 모니터링에 있어서 최적화된 조건 하에 LC/MS/MS에 의해 분석하였다.

ERa, ERβ, E-카드헤린 및 Id-2 유전자 발현은 GAPDH 유전자의 RT-PCR에 대한 그들의 RNA 발현에 관한 RT-PCR에 의해 결정하였다. 종양으로부터 추출된 총 RNA는 써모스크립트(Thermoscript) RT-PCR 시스템(INVITROGEN 제품)에 의해 역전사시켰다. 생성된 cDNA는 ERa, ERβ, E-카드헤린 및 Id-2에 특이적인 프라이머와 함께 PCR용 템플릿으로서 사용하였다.

웨스턴 블롯 분석은 다음과 같이 수행하였다: 단백질은 RIPA 완충액 중의 균질화에 의해 추출하였고, 그들의 함량은 바이오-라드 단백질 분석(Bio-Rad Protein Assay)에 의해 결정하였다. 단백질 분획들을 10% SDS-PAGE 상에 크기별로 분리하여, 니트로셀룰로스 멤브레인으로 옮겼다. 면역검출은 항-ERα 다클론성 Ab(HC-20, 산타 크루즈 바이오테크놀로지즈 제품), 항-ER-β 다클론성 Ab(06-629, Upstate Biotechnologies 제품) 항-α-액틴(시그마 제품) 및 항-α-튜불린(산타 크루즈 바이오테크놀로지즈 제품)을 이용하여 수행하였다.

카텝신 B 활성 분석은 다음과 같이 수행하였다: 단백질은 조직 100 ㎎ 당 완충액 1㎖의 비율로 카텝신 B 완충액 중의 균질화에 의해 추출하였다. 시험은 합성 기질 Z-Arg-Arg-AMC를 소화시키는 카텝신 B의 능력을 이용하였다. 유리된 AMC는 여기파장 390 ㎚ 및 발광 파장 460 ㎚에서 형광법으로 결정하였다. 카텝신 B의 활성은 AMC 표준 곡선에 대하여 정량화하였다.

인간 종양 세포주와 HT-29 및 H460 인간 이종이식 종양 모델에서의 ERa 및 ERβ 발현은 웨스턴 블롯 분석(도 6)을 통해 입증하였다.

종양 성장 및 카텝신 B 활성에 대한 순환 에스트로겐 레벨의 효과는 HT-29 인간 CRC 이종이식 종양 모델에서 입증되었다. 이 결과는 증가된 레벨의 에스트로겐(17β 에스트라디올)으로 인해 종양 중량 및 카텝신 B 활성의 양쪽 모두가 증가하는 것으로 나타났다(도 7). 유사한 효과가 H460 인간 NSCLC 이종이식 종양 모델에서 관찰하였다(도 8).

HT-29 인간 CRC 및 H460 인간 NSCLC에 있어서의 ERβ 발현에 대한 에스트라디올의 효과는 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다(각각 도 9 및 도 10).

HT-29 인간 CRC 세포 및 H460 인간 NSCLC 세포에 있어서의 ERβ 활성화에 대한 에스트라디올의 효과는 RT-PCR에 의해 분석하였고, 이때 E-카드헤린 유전자(HT-29 세포)의 증가된 발현 및 Id-2 유전자(H460 세포)의 증가된 발현은 ERβ 활성화를 나타내었다(각각 도 11 및 도 12).

PPX 대사에 대한 에스트로겐 처치의 효과는 HT-29 CRC 이종이식 종양 모델을 이용해서 입증하였다. 이 결과는 이하의 표 4에 제공한다. (+(E2): 0.72 ㎎ 17β 에스트라디올이 보충된 종양 보유 마우스; -(P): 보충되지 않은 종양 보유 마우스들. 3개의 종양의 풀(pool)로부터의 데이터). 보다 높은 농도의 비컨쥬게이트된 파클리탁셀은, 이와 같이 비컨쥬게이트된 파클리탁셀이 투여된 경우 활성화된 것과 비교해서 PPX의 투여 후의 종양에서 관찰하였다.

		PPX iv 90㎎/㎏ PTX 당량		파클리탁셀 iv 90㎎/㎏
에스트라디올 치료	시간(h)	총 PTX	유리 PTX	PTX
+(E2) -(P)	24 24	93300 114700	11200 17900	6810 7310
+(E2) -(P)	168 168	29230 94300	8480 28100	421 nd

종합적으로, 실시예 5에 제시된 결과는, 에스트로겐-매개 시그널링이 주로 ERβ에 따라 좌우되고, E2 보충물이 ERβ 활성화 및/또는 발현을 유도하며, 증가된 카텝신 B 활성이 HT-29 세포 내에서 증강된 PPX 항종양 활성과 관련된다는 것으로 나타내었다.

실시예 6

실시예 6에서 제시되는 실험 및 결과는 래트 모델을 이용해서 에스트로겐의 존재 유무에 있어서 각종 조직에서의 유리 및 총 파클리탁셀을 기술한다. 이들 연구를 위해서, 래트는 3개의 군: 1) 수컷, 2) 겉보기 수술된(즉, 미처리된) 암컷 및 3) 난소 적출된 암컷으로 나뉘었다. 래트에는 25 ㎎/㎏의 단일 정맥내 주사로서 ¹⁴C-CT2103(¹⁴C 표지화된 컨쥬게이트된 파클리탁셀, 즉, ¹⁴C 표지된 PPX)을 투여하였다.

주사후 각종 시점에서, 군당의 3마리의 래트를 안락사시키고, 각종 조직(즉, 폐, 간 및 골수) 내에서의 비컨쥬게이트된 파클리탁셀 및 총 파클리탁셀에 대해 분석하였다.

이 연구로부터의 결과는 비컨쥬게이트된 파클리탁셀과 총 파클리탁셀이 겉보기 수술된 암컷 래트의 폐 조직 내에서의 통계학적으로 높은 레벨 대 수컷 또는 난소적출된 암컷 래트에서의 레벨로 축적된 것을 나타났다. 이에 대해서, 간 또는 골수 중에서의 수컷, 겉보기 수술된 암컷 또는 난소 적출된 암컷 래트 중 약물 축적에 있어서 통계학적 차이는 없었다 (도 13). 총체적으로, 이들 데이터는 파클리탁셀이 에스트로겐의 존재 시 폐 조직 중에서 통계학적으로 보다 높은 레벨로 축적되는 것을 확립하고 있다.

본 명세서에 인용된 특허 공보 및 비특허 공보를 비롯한 모든 공보는 본 발명에 속하는 당해 기술분야의 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 이들 모든 공보는 각 개별 공보가 참고 인용되어 있는 바와 같이 구체적 및 개별적인 바와 같은 동일한 정도로 본 명세서에 참고 인용되어 있다.

비록 본 발명이 본원에서 특정 실시형태를 참조로 하여 예시되어 있긴 하지만, 이들 실시형태는 본 발명의 원리 및 용도를 단지 예시하기 위한 것임을 이해할 필요가 있다. 그러므로, 수많은 변형이 예시적인 실시형태에 대하여 이루어질 수 있으며, 다른 구성도 첨부되는 청구범위에 의해 규정되는 바와 같은 본 발명의 사상 및 영역을 벗어남이 없이 발명될 수 있음을 이해할 필요가 있다.

Claims

암 치료 방법으로서,

폐경전 에스트로겐 레벨을 가진 암 환자 또는 폐경후 에스트로겐 레벨을 가진 환자를 확인하는 단계; 및 상기 환자에게 항암 약물에 컨쥬게이트된 폴리(아미노산) 폴리머를 포함하는 컨쥬게이트를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 암은 에스트로겐 수용체 보유 암 세포의 존재를 특징으로 하거나, 또는 암은 에스트로겐 수용체 보유 세포를 함유하는 기관 또는 조직에서 유래되며, 폐경후 에스트로겐 레벨을 가진 환자는 임의적으로 에스트로겐 요법도 투여되는 것인 암 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 환자는 폐경전 에스트로겐 레벨을 가진 것으로 확인된 것인 암 치료 방법.
제2항에 있어서, 상기 환자가 여성인 암 치료 방법.
제2항에 있어서, 상기 여성이 55세 미만인 암 치료 방법.
제2항에 있어서, 상기 환자가 호르몬 대체 요법 중인 폐경후 여성인 암 치료 방법.
제2항에 있어서, 상기 환자가 호르몬 대체 요법 중인 남성인 암 치료 방법.
제2항에 있어서, 상기 환자가 항안드로겐 요법 중인 남성인 암 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 환자는 폐경후 에스트로겐 레벨을 가진 것으로 확인되고, 상기 치료는 상기 환자에게 항암 약물에 컨쥬게이트된 폴리(아미노산) 폴리머를 포함하는 항암제, 및 에스트로겐 요법을 투여하는 단계를 포함하는 것인 암 치료 방법.
제8항에 있어서, 상기 환자가 남성인 암 치료 방법.
제8항에 있어서, 상기 환자가 여성인 암 치료 방법.
제10항에 있어서, 상기 여성이 55세 이상인 암 치료 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리(아미노산) 폴리머가 폴리(글루탐산)인 암 치료 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항암 약물이 탁산인 암 치료 방법.
제13항에 있어서, 상기 항암 약물이 파클리탁셀인 암 치료 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항암 약물은 파클리탁셀이고, 상기 폴리머는 폴리(글루탐산)을 포함하는 것인 암 치료 방법.
제15항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 PPX를 포함하는 것인 암 치료 방법.
제16항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 약 175 내지 약 250 ㎎/㎡ 파클리탁셀 당량의 양으로 투여하는 것인 암 치료 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 정맥내 전달되는 것인 암 치료 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 폐암인 암 치료 방법.
제19항에 있어서, 상기 폐암이 비소세포 폐암인 암 치료 방법.
에스트라디올 레벨에 기초하여 암 치료 요법을 선택하는 방법으로서,

암 환자의 에스트로겐의 혈청 또는 혈장 레벨이 폐경전인지 또는 폐경후인지를 결정하는 단계로서, 폐경전 에스트로겐 레벨은 폴리글루타메이트에 컨쥬게이트된 파클리탁셀에 의한 치료가 비컨쥬게이트된 파클리탁셀보다 더 효과적이다는 점을 나타나며, 그리고 혈청 또는 혈장 중의 낮은 폐경후 에스트로겐 레벨은 폴리글루타메이트에 컨쥬게이트된 파클리탁셀에 의한 치료가 비컨쥬게이트된 파클리탁셀보다 더 효과적이지 않다는 것을 나타내는 것인 단계

를 포함하는 방법.