KR20220004042A - 나노캡슐로 제형화된 항-kras 항체의 세포내 전달 - Google Patents

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KR20220004042A
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페르난데스 마리아 호세 알론소
오소리오 데지레 테이헤이로
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유니버시다데 데 산티아고 데 콤포스텔라
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Abstract

외부 셸에 의해 둘러싸인 내부 코어를 포함하는 복수의 나노 엔티티를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공되되, 외부 셸은 중합체를 포함하고, 내부 코어는 적어도 하나의 소수성 화합물을 포함하며, 나노 엔티티는 약제학적 작용제를 포함하고, 약제학적 작용제는 항체 또는 이의 단편이며, 항체 또는 이의 단편은 활성화된 돌연변이된 KRAS 단백질의 에피토프에 결합한다. 특정 나노 엔티티로 제형화된 이들 항-KRAS 항체는 세포내 전달이 가능하고, 세포 내에서 생물학적 활성을 수행할 수도 있으므로, 암 및 다른 KRAS 유전자의 돌연변이와 관련된 질환의 치료에 유용하다.

Description

나노캡슐로 제형화된 항-KRAS 항체의 세포내 전달
본 발명은 항체가 내용물을 방출하는 세포 내부에 접근할 수 있도록 하기 위해 입자, 나노캡슐 또는 기타 나노엔티티(nanoentity)로 제형화된 돌연변이된 KRAS 종양 단백질에 대한 항체의 세포내 전달에 관한 것이다.
신체 내로의 약제학적 작용제의 표적화된 전달은 진행중인 어려운 문제이다. 예를 들어, 많은 약물이 표적 세포에 접근하기 어렵기 때문에 효과적으로 작용을 발휘할 수 없다. 지금까지 단일클론 항체-기반 암 요법은 세포외 단백질에만 집중되어 있는 반면, 암과 관련이 있는 수백 개의 세포내 종양 단백질은 약물 투여가 불가능한 상태(undruggable)로 남아 있다.
돌연변이적으로 활성화된 RAS 유전자(HRAS, KRAS 및 NRAS)는 암에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 유전자 패밀리를 포함한다. 3개의 RAS 유전자는 82% 내지 90%의 아미노산 서열 동일성을 공유하는 4개의 188번 내지 189번 아미노산 단백질을 암호화한다. KRAS는 세포 신호전달에서 온/오프 스위치로서 작동하는 유전자이다. 정상적으로 기능하는 경우, 이는 세포 증식을 조절한다. 돌연변이되는 경우, 음성 신호전달이 파괴되고, 세포는 지속적으로 증식하여 종종 암으로 발전할 수 있다. KRAS 단백질은 GTPase이며, 일반적으로 C-말단에 아이소프렌기가 존재하기 때문에 세포막에 연결된다. 정상적인 휴지 세포(quiescent cell)에서, RAS는 주로 GDP에 결합되어 있으며 비활성 상태이다. 세포외 자극, 수용체 타이로신 카이네이스(receptor tyrosine kinase: RTK) 및 다른 세포-표면 수용체의 활성화 시, RAS-GTP가 빠르고 일시적으로 형성되고 이어서 효과기 단백질이 관여하여 다양한 세포내 신호전달 네트워크를 조절하여 유사분열촉진 과정을 제어한다.
암-관련 RAS 유전자는 주로 글리신-12(G12), 글리신-13(G13) 또는 글루타민-61(Q61) 잔기에서 단일 아미노산 치환을 암호화하는 돌연변이를 특징으로 한다. 이러한 돌연변이는 RAS GTP에 결합되며, 세포외 자극과 무관하게 구성적으로 활성이 있어 암 성장으로 이어지는 신호전달 경로의 과자극을 초래한다.
돌연변이적으로 활성화된 RAS 유전자는 1982년에 인간 암세포에서 처음으로 확인되었다. 30여년 후, 암 게놈의 집중적인 시퀀싱은 500개를 초과하는 검증된 암 유전자의 확인에도 불구하고(COSMIC 데이터베이스, 암에서의 체세포 돌연변이의 카탈로그), 3개의 RAS 유전자(HRAS, NRAS 및 KRAS)는 여전히 인간 암에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 종양 유전자 패밀리를 구성하며(표 1), 모든 종양 샘플 시퀀싱의 25% 내지 30%에서 검출된다(문헌[Cox et al., 2014]).
Figure pct00001
모두 성인 조직 및 종양에서 광범위하게 발현되지만, KRAS 돌연변이는 NRAS 또는 HRAS보다 인간 암에서 훨씬 더 빈번하며, KRAS는 암에서 모든 RAS 돌연변이의 85%를 포함하고, NRAS(12%)가 그 뒤를 잇고, HRAS(3%)는 드물게 발생한다. NRAS 및 HRAS에 비해 KRAS 돌연변이의 빈도가 높은 것에 대한 한 가지 설명은 KRAS 단백질이 종양발생에 유리한 고유한 특성을 갖는다는 것이다.
따라서, 예를 들어, 췌장관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma: PDAC, 모든 췌장암의 90%) 및 폐 선암종(lung adenocarcinoma: LAC, 모든 폐암의 40%)에서, KRAS 돌연변이의 빈도는 각각 거의 100% 및 25% 내지 30%이다. 결장직장 암종(colorectal carcinoma: CRC)에서, KRAS는 또한 우세한 돌연변이된 동형(isoform)(45%)이다(문헌[Liu et al., 2019; Ferrer et al., 2018; Cox et al., 2014]).
G12, G13 또는 Q61 위치에서의 돌연변이의 상대적 빈도에도 암-유형의 차이가 있다. PDAC, LAC 및 CRC에서, KRAS 돌연변이는 주로 G12에서 발견된다. 주어진 잔기에서 보이는 치환에도 암-유형의 차이가 있다. 예를 들어, G12에서, PDAC 및 CRC에서 우세한 치환은 G12D이고, G12V가 뒤따른다. 대조적으로, LAC에서, 주요 치환은 G12C이며, 이는 PDAC에서 드물다. 유전자 실험은 췌장 및 폐 선암종의 종양원성 KRAS 발현에 대한 의존성을 보여주었으며(문헌[Fisher et al., 2001; Ying et al., 2012]), 분자 표적으로서의 가치를 강조하였다. 따라서, KRAS 단백질은 암에서 매우 중요한 역할을 하며, 매우 잘-검증된 약물 표적을 나타낸다.
종양원성 KRAS를 표적으로 하는 소분자를 개발하기 위한 노력이 수십 년에 걸쳐 이루어졌다. 그러나, KRAS 돌연변이체의 직접적인 저해는 주로 RAS의 표면에서 소분자 결합을 위한 약물 투여가 가능한 포켓(druggable pocket)을 식별하는 것이 어렵기 때문에 극도로 어려운 것으로 입증되었으며, 현재까지 임상적으로 승인된 작용제는 없다. 이는 단백질의 표면의 "매끄러움(smoothness)"에 기인하며, 기질에 너무 단단히 고정되어 변위되지 않는 GTP-결합 포켓은 예외이다.
KRAS 돌연변이가 있는 암의 치료를 위해, 예를 들어, 다음과 같은 다양한 전략이 제안되었다:
(1) 해머 헤드 리보자임(hammer head ribozyme) 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의한 RAS 단백질의 발현의 저해;
(2) 파르네실-트랜스퍼레이스(farnesyl-transferase) 저해제 또는 아실 단백질 티오에스터레이스 1(acyl protein thioesterase 1: APT1) 저해제에 의한 RAS의 막 국재화의 방지;
(3) RAS 신호 경로(안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 화학적 저해제를 통한 Raf 또는 MEK의 저해)의 하류 효과기의 차단; 및
(4) 야생형과 돌연변이체 KRAS 사이의 하나의 뉴클레오타이드 차이를 구별하는 RNA 간섭에 의한 돌연변이체 KRAS 전사체의 침묵.
그러나, 이러한 전략의 대부분은 비-선택성 또는 낮은 치료적 효능과 같은 한계가 있다. 따라서, 돌연변이체 KRAS-관련 암을 치료하기 위해서는 돌연변이체 KRAS 선택성을 활용한 더욱 효과적인 전략이 필요하다.
파라토프의 표면적이 넓은 항체는 고친화성을 갖는 단백질을 특이적으로 표적화하는데 우수하다. 그러나, 지금까지 항체-기반 암 요법은 주로 세포외 단백질에만 집중되어 있는 반면, 암과 관련이 있는 수백 개의 세포내 종양 단백질은 약물 투여가 불가능한 상태로 남아 있다. 다음의 두 가지 주요 접근법을 사용하여 세포막을 통과할 수 있는 능력을 부여하는 항체의 변형에 대한 시도가 이루어지고 있다: (i) 세포 투과 펩타이드(cell penetrating peptide: CPP)와의 화학적 접합; 및 (ii) 세포에 진입하는 고유한 능력을 담당하는 자가항체를 내재화(internalizing)하는 부분과의 융합.
그러나, 대부분의 경우, 시험관내에서 사용되는 항체 농도는 마이크로몰 범위에 있으며(문헌[Shin et al., 2017; Akishiba et al., 2017]), 생체내 데이터를 보고하는 연구에서, 투여 양생법은 임상적으로 전환 가능하지 않다(문헌[Shin et al., 2017]). CPP-기반 전략의 경우에, 주요 제한사항은 불량한 생체내 안정성, 조직/세포 특이성의 결여, 세포내 이입 소포(intracellular endocytic vesicle)로부터의 비-효율적인 방출 및 CPP의 존재로 인한 표적에 대한 결합의 지연과 같은 요인과 관련이 있다. CPP-기반 전략의 몇 가지 단점은 앞서 언급된 융합 단백질 접근법을 사용하여 우회될 수 있다. 그러나, 융합 단백질 생성은 상대적으로 시간이 오래 걸리며, 신속한 스크리닝에 적합하지 않다(문헌[Slastnikova et al., 2018; Singh et al., 2019]).
따라서, 생체내에서 임상적으로 관련된 항체 용량을 전달할 수 있고, 세포내 항체-기반 치료제 발굴 및 개발을 위한 다재 다능하고, 비용-효율적인 플랫폼으로 작동할 수 있는 신규한 세포내 전달 시스템이 필요하다.
우리가 아는 한, 항-KRAS 항체의 경우, 이들은 주로 진단적 용도와 관련하여 그리고 RAS 폴리펩타이드를 연구하기 위한 연구 도구로서 설명되어 왔다. 그러나, 문헌[Shin et al., 2017]은 살아있는 세포의 세포질에 내재화되고, 다양한 종양원성 Ras 돌연변이체의 활성화된 GTP-결합 형태에 선택적으로 결합하여 효과기 단백질과의 상호작용을 차단하여, 하류 신호전달을 억제하고 종양원성 Ras 돌연변이체가 있는 다양한 종양 세포에서 항-증식 효과를 발휘하는 인간 IgG1 형식 항체인 RT11의 개발을 보고하였다. RT11 항체는 Ras GTP-특이적 결합 VH 도메인을 세포질-투과 VL 단편과 통합하여 단일 IgG 형식 항체를 형성함으로써 생성되었다. 따라서, 이러한 메커니즘은 항-KRAS 항체의 본 명세서에 기재된 캡슐화와 상이하다.
여러 회사와 과학 논문이 표적 세포내 단백질을 표적으로 하는 단일클론 항체의 개발의 중요성을 주장하지만, 우리가 아는 한, 전신 IV 투여 후 치료적 항체의 세포내 전달을 위한 나노테크놀로지-기반 접근법의 효능을 보여주는 생체내 데이터에 대한 단일 개시는 없었다. 따라서, 약제학적 작용제의 전달의 개선이 필요하다.
본 발명이 해결하고자 하는 한 가지 문제는 항-KRAS 항체를 임상적으로 적절한 농도로 세포내 전달하여 치료적 효과를 유도하는 것이다.
이 해결책은 특정 나노 엔티티로 제형화된 항-KRAS 항체가 세포내로 전달될 수 있고, 나아가 세포 내에서 생물학적 활성을 수행할 수 있다는 본 발명자들의 발견에 기초한다.
본 명세서의 작업 실시예에서 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 항-KRAS 단일클론 항체를 상이한 중합체성 나노캡슐 조성물에 성공적으로 회합시켰다. 실시예 5에 나타낸 바와 같이, 이러한 나노캡슐은 세포막을 투과하고, 항체를 세포막 내부로 전달할 수 있다. 결장 선암종 세포에 효율적으로 내재화된 항-KRAS G12V mAb 및 내재화된 항체를 함유하는 나노캡슐은 표적 부위, 즉, 종양원성 KRAS가 국재화되어 있는 원형질 막의 내측에서 우선적인 국재화를 나타내었다. 유사하게는, 실시예 6에서, 항-KRAS G12V mAb-로딩된 중합체성 나노캡슐은 폐 선암종 세포에서 효율적으로 내재화되었다. 또한, 실시예 5에서, 이러한 나노캡슐은 25% 내지 50%의 백분율로 KRAS G12V 돌연변이체 종양 세포의 시험관내 성장을 저해할 수 있음이 입증되었다. 따라서, 나노캡슐로 제형화된 항-KRAS 항체는 세포내로 전달될 수 있으며, 또한 세포 내에서 생물학적 활성을 수행할 수 있음이 입증되었다.
놀랍게도, 실시예 7은 치료 독성의 징후를 나타내지 않는 췌장 이식편 및 결장 동소 종양 모델의 두 가지의 마우스 모델에서 종양 성장을 유의하게 감소시키는 항-KRAS G12V mAb를 함유하는 나노캡슐의 효능에 대한 최소의 생체내 증거를 제공한다.
논의된 바와 같이, 항-KRAS 항체는 그 자체로 세포막을 통과할 수 없고 KRAS 폴리펩타이드와 상호작용할 수 없어, 상응하는 세포내 표적 단백질의 기능을 차단하고 치료적 반응을 유도한다. 본 발명자들은 중합체성 나노캡슐에 항-KRAS 항체르 캡슐화하는 것이 이들 항체를 살아있는 세포의 세포질 내로 직접 전달하여, 시험관내 및 생체내 연구 둘 다에서 반응을 유도하는 효과적인 접근법임을 입증하였다.
이전에 언급한 바와 같이, 세포내 단백질을 표적으로 하는 단일클론 항체를 개발하려는 맣은 시도에도 불구하고, 우리가 아는 한, IV 투여 후 세포내 국재화를 위한 나노테크놀로지-기반 전달 시스템의 효능을 보여주는 생체내 데이터에 대한 단일 공개는 없다. 따라서, 생체내에서 성공적인 결과를 갖는 캡슐화된 항-KRAS 항체의 세포내 전달을 위한 첫 번째 접근법을 제공하는 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명은 당업자가 오랫동안 해결하고자 하는 기술적 과제를 해결함과 동시에 오랫동안 느껴온 요구를 충족시킨다.
본 명세서에서 논의된 바와 같이, 현재의 나노캡슐이 투과 세포막을 투과하고, 적절한 임상적 용량으로 항체를 세포막의 내부로 전달하며, 라이소솜 구획을 탈출할 수 있다는 사실은 일반적으로 상당한 이점이다.
예를 들어, 나노캡슐이 세포-투과 펩타이드 및/또는 종양/조직-투과 펩타이드를 또한 포함하는 본 명세서의 특정 실시형태와 관련하여, 종양 조직 및 암 세포 내로의 항체의 더 높은 용량 및 더 나은 국재화를 얻을 수도 있다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 양태는 외부 셸에 의해 둘러싸인 내부 코어를 포함하는 복수의 나노 엔티티를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 외부 셸은 중합체를 포함하고, 내부 코어는 적어도 하나의 소수성 화합물을 포함하되, 나노 엔티티는 약제학적 작용제를 포함하고, 약제학적 작용제는 항체 또는 이의 단편이며, 항체 또는 이의 단편은 활성화된 돌연변이된 KRAS 단백질의 에피토프에 결합한다.
본 발명의 두 번째 양태는 첫 번째 양태에 따른 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이며,
a) 중합체를 포함하는 수상을 제조하는 단계;
b) 소수성 화합물을 포함하는 소수성 상을 제조하는 단계;
c) 활성화된 돌연변이된 KRAS 단백질의 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 수상 또는 선택적으로 mAb 또는 단편이 고 농축된 경우 소수성 상에 첨가하는 단계,
d) 수상 및 소수성 상을 혼합하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 세 번째 양태는 약제로서 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 네 번째 양태는 KRAS 유전자의 돌연변이와 관련된 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
도 1: 이 도면은 동적 광 산란(Dynamic Light Scattering: DLS)에 의해 측정된 인간 혈장에서의 항-KRAS G12V mAb-로딩된 HA 나노캡슐(nanocapsule: NC)(HA 290kDa NC; 0.5 ㎎/㎖ mAb)의 안정성을 보여준다.
도 2: 이 도면은 나노입자 추적 분석(nanoparticle Tracking Analysis: NTA)에 의해 측정된 인간 혈장에서의 항-KRAS G12V mAb-로딩된 HA 나노캡슐(NC)(HA 290kDa NC; 0.5 ㎎/㎖ mAb)의 안정성을 보여준다.
도 3: 이 도면은 이미징 유세포 분석(imaging flow Cytometry)에 의해 KRAS G12V 돌연변이를 발현하는 SW480 결장직장 선암종 세포에서 HA 나노캡슐(NC)에 의해 유도된 항-KRAS G12V mAb(Alexa Fluor® 488로 표지됨)의 세포 내재화(internalization)를 보여준다. 효과적인 내재화는 살아있는 세포의 세포질 산성 소기관을 Lysotracker® 형광 마커로 표지함으로써 결정되었다.
도 4: 이 도면은 (A) 세포 증식의 저해 및 (B) C16-HA 나노캡슐(NC)(166nM mAb, 0.4ng mAb/세포 용량의 블랭크(blank) 및 항-KRAS G12V-로딩된 NC)과 함께 KRAS G12V 돌연변이를 발현하는 H441 선암종 폐암 세포의 인큐베이션 후 생산된 ERK 인산화의 감소를 보여준다. [C(-): 비처리 세포; BL: 블랭크 C16-HA NC; aG12V NC: 항-KRAS G12V mAb-로딩된 C16-HA NC].
도 5: 이 도면은 대조군과 비교하여 치료 기간 동안 항-KRAS G12V mAb-로딩된 PSA-tLyp-1 나노캡슐(NC)이 처리된 마우스에서 종양 성장의 감소를 보여준다. [C(-): 식염수; aG12V NC: 항-KRAS 로딩된 tLyp1-PSA NC; IP 투여; KRAS G12V 돌연변이를 발현하는 PA-TU-8902 세포로부터의 췌장 피하 이식편 종양 모델].
도 6: 이 도면은 대조군과 비교하여 3주 동안 항-KRAS G12V mAb-로딩된 HA NC로 처리된 마우스의 최종 종양 무게의 감소를 보여준다. [C(-): PBS; aG12V NC: 항-KRAS 로딩된 HA NC; IV 투여; KRAS G12V 돌연변이가 있는 SW480 세포주-유래 피하 종양 단편으로부터의 결장직장 동소 종양 모델].
도 7: 이 도면은 대조군과 비교하여 3주 동안 항-KRAS G12V mAb-로딩된 HA NC로 처리된 마우스의 종양에서의 현저한 조직학적 퇴행 변화를 보여준다. 종양 슬라이드는 스캐닝되어 NDP-View2 소프트웨어(하마마쓰(Hamamatsu))로 분석되었고, 각 슬라이드에 대해 괴사의 백분율이 계산되었다. [C(-): PBS; aG12V NC: 항-KRAS 로딩된 HA NC; IV 투여; KRAS G12V 돌연변이가 있는 SW480 세포주-유래 피하 종양 단편으로부터의 결장직장 동소 종양 모델].
도 8: 이 도면은 3주 치료 기간에 걸쳐 대조군과 비교하여 항-KRAS G12V mAb-로딩된 HA NC로 처리된 마우스의 체중 변화를 보여준다. [C(-): PBS; aG12V NC: 항-KRAS 로딩된 HA NC; KRAS G12V 돌연변이가 있는 SW480 세포주-유래 피하 종양 단편으로부터의 결장직장 동소 종양 모델].
본 발명은 외부 셸에 의해 둘러싸인 내부 코어를 포함하는 나노캡슐 또는 다른 나노 엔티티를 포함하는 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이되, 내부 코어는 오일과 같은 소수성 화합물을 포함하고, 외부 셸은 폴리시알산(polysialic acid: PSA), 하이알루론산, 폴리글루탐산, 폴리아스파르트산, 폴리말산 또는 폴리락트산과 같은 중합체를 포함한다. 나노 엔티티는 세포내에 위치한 표적에 대한 항체 또는 이의 단편인 약제학적 화합물을 더 포함하되, 항체 또는 이의 단편은 활성화된 돌연변이된 KRAS 단백질의 에피토프에 결합한다. 본 발명의 입자는 항체를 방출하는 세포의 내부에 접근할 수 있다. 더욱이, 유성 코어의 중합체 코팅은 응집, 관련 항체의 약물 방출 프로파일의 변화, 증가된 세포 내재화 및 소정의 세포 유형과의 특정 상호작용에 대한 더 큰 안정성 및 보호를 제공할 수 있다.
용어 "내부 코어"는 본 명세서에서 대안적으로 "내부 부분"으로 지칭될 수 있고, 이러한 용어는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
돌연변이된 KRAS 폴리펩타이드에 대한 항체
돌연변이된 KRAS 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 첫 번째 항체 중 일부는 KRAS 폴리펩타이드의 12번 위치에 아미노산 돌연변이를 포함하는 활성화된 KRAS 폴리펩타이드와 반응하며 12번 위치에 정상적인 아미노산 글리신을 포함하는 단백질과는 반응하지 않는 단일클론 항체를 개시하고 있는 US5084380(참조에 의해 본 명세서에 원용됨)에 기술되어 있다. US5084380의 발명자들은 글리신(G12E) 대신에 12번 위치에 글루탐산을 포함하는 KRAS 폴리펩타이드와 반응한 항체 E184 및 글리신(G12R) 대신에 12번 위치에 아르기닌을 포함하는 KRAS 폴리펩타이드와 반응한 E170, R256 및 글리신(G12V) 대신에 12번 위치에 발린을 포함하는 KRAS 폴리펩타이드와 반응한 DWP를 확인하였다.
단일클론 항체 E170 및 E184는 12번 위치에서 글리신 대신에 글루탐산을 암호화하는 돌연변이된 ras 유전자의 5번 내지 16번 아미노산에 상응하는 합성 펩타이드에 대해 생성되었다. 이들 항체는 12번 위치에 글루탐산을 포함하는 도데카펩타이드에 대한 특이성을 나타내지만, 12번 위치에 Gly, Asp, Ser, Arg, Cys, Ala 또는 Val을 포함하는 도데카펩타이드에 대해서는 특이성을 나타내지 않는다.
단일클론 항체 R256은 12번 위치에서 글리신 대신에 아르기닌을 암호화하는 돌연변이된 ras 유전자의 5번 내지 16번 아미노산에 상응하는 합성 펩타이드에 대해 생성되었다. 단일클론 항체 R256은 12번 위치 Arg를 포함하는 도데카펩타이드와 특이적으로 반응하였지만, 12번 위치에 Gly, Glu, Asp, Ser, Cys, Val 또는 Ala를 포함하는 도데카펩타이드와는 반응하지 않았다.
DWP는 12번 위치에서 글리신 대신에 발린을 암호화하는 돌연변이된 ras 유전자의 5번 내지 16번 아미노산에 상응하는 합성 펩타이드에 대해 생성되었다. DWP는 12번 위치에 Val 또는 Cys를 포함하는 펩타이드와 경쟁 검정에서 반응하였지만, 12번 위치에 Gly, Arg, Ser, Ala, Asp 또는 Glu를 포함하는 펩타이드와는 반응하지 않았다(문헌[Carney et al., 1986 및 EP0190033]).
단일클론 항체를 분비하는 것으로 밝혀진 하이브리도마 세포주는 부다페스트 조약(Budapest Treaty)에 따라 아메리칸 타입 티슈 컬처 컬렉션(American Type Tissue Culture Collection: ATCC)에 기탁되었고, E184에는 등록 번호 HB9194, E170에는 등록 번호 HB9195, R256에는 등록 번호 HB9196 및 DWP에는 등록 번호 HB8698이 부여되었다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 항체는 US5084380에 개시된 위에 기재된 항체 중 하나 또는 이의 단편이다.
US5443956(참조에 의해 본 명세서에 원용됨)에는 12번 위치에 아스파르트산을 갖는 돌연변이된 ras p21 단백질과 반응하는 단일클론 항체(G12D)가 하이브리도마 세포주 D113, D205 및 D210에 의해 생산되었다는 것이 추가로 기술되어 있다. 이들 세포주는 부다페스트 조약에 따라 ATCC에 기탁되었다. 하이브리도마 세포주 D113에는 ATCC 지정 번호 HB10086이 부여되었다. 하이브리도마 세포주 D205에는 TCC 지정 번호 HB10061이 부여되었다. 하이브리도마 세포주 D210에는 ATCC 지정 번호 HB10083이 부여되었다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 항체는 US5443956에 개시된 위에 기재된 항체 중 하나 또는 이의 단편이다.
예를 들어, 압캠(Abcam)에 의해 개발되었으며 ab221163, ab264094 및 ab264095를 포함하고; 뉴이스트 바이오사이언스(NewEast Bioscience)에 의해 개발되었으며 카탈로그 번호: 26036(G12D), 26038(G12D), 26193(Q61L), 26474(G13R), 26192(Q61R), 26477(G13V), 26195(Q61H), 26191(G13A) 및 26186(G12S)을 포함하고; 셀 시그널링(Cell Signalling)에 의해 개발되었으며 Ras(G12D 돌연변이체 특이적)(D8H7) 토끼 mAb #14429 및 Ras(G12V 돌연변이체 특이적)(D2H12) 토끼 mAb #14412를 포함하고; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에 의해 개발되었으며 G12V Ref. OP38 항-Pan-Ras(Ab-1) 마우스 mAb를 포함하는 돌연변이된 KRAS 폴리펩타이드에 결합하는 다른 단일클론 항체가 개발되었다.
일 실시형태에서, 활성화된 돌연변이된 KRAS 단백질의 에피토프는 UNIPROT 참조 P01116-2(RASK_HUMAN)를 갖는 GTPase KRas의 인간 동형 2B(인간 종양에서 발현되는 주요 동형)의 폴리펩타이드 서열에 상응하는 서열번호 39의 아미노산 서열의 12번 위치의 글리신 잔기, 13번 위치의 글리신 잔기 또는 61번 위치의 글루타민 잔기의 돌연변이를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 서열번호 39의 아미노산 서열의 12번 위치의 돌연변이는 아르기닌, G12R, 아스파르트산, G12D, 발린 G12V 및 시스테인 G12C로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 39의 아미노산 서열의 13번 위치의 돌연변이는 아르기닌, G13R, 아스파르트산, G13D 및 발린 G13V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 서열번호 39의 아미노산 서열의 61번 위치의 돌연변이는 글루타민 Q61R, 류신 Q61L 및 히스티딘 Q61H로 이루어진 군으로부터 선택된다.
당업자는 이러한 기술된 에피토프에 결합하는 항체를 선택하는 방법을 알고 있지만, 일 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 KLVVVGAVGVGK 서열번호 40, KLVVVGADGVGK 서열번호 41 및 KLVVVGACGVGK 서열번호 42로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열의 에피토프에 결합한다.
추가의 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 ATCC-HB-10086 D113, ATCC-HB-10083 D210 및 ATCC-HB-8698 DWP로 이루어진 군으로부터 선택되는 기탁 번호를 갖는 하이브리도마 세포주로부터 얻을 수 있는 항체와 동일한 인간 활성화된 돌연변이된 KRAS 단백질의 에피토프에 결합한다.
또 다른 추가의 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 ATCC-HB-10086 D113, ATCC-HB-10083 D210 및 ATCC-HB-8698 DWP로 이루어진 군으로부터 선택되는 기탁 번호를 갖는 하이브리도마 세포주로부터 얻을 수 있다.
위에 언급된 하이브리도마는 ATCC로부터 얻었으며, 활성화시켜 상응하는 항체를 얻었다.
추가의 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 DSM ACC3358, ATCC-HB-10083 D210, ATCC-HB-8698 DWP, ATCC-HB-10086-D113 및 DSM ACC3359로 이루어진 군으로부터 선택되는 기탁 번호를 갖는 하이브리도마 세포주로부터 얻을 수 있는 항체와 동일한 인간 활성화된 돌연변이된 KRAS 단백질의 에피토프에 결합한다.
또 다른 추가의 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 DSM ACC3358, ATCC-HB-10083 D210, ATCC-HB-8698 DWP, ATCC-HB-10086-D113 및 DSM ACC3359로 이루어진 군으로부터 선택되는 기탁 번호를 갖는 하이브리도마 세포주로부터 얻을 수 있다.
하이브리도마 세포주 DSM ACC3358 및 DSM ACC3359는 2019년 10월 16일의 기탁일에 독일 라이프니츠 연구소 DSMZ-독일 미생물 및 세포배양 콜렉션 게엠베하(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms Cell Cultures GmbH)(독일, 브라운슈바이크, 인호펜슈트라쎄 7B. 38124 소재)에 기탁되었다. 기탁된 세포는 생존 가능하며, 기탁과 관련된 특징을 모두 유지한다. 마우스 하이브리도마 세포주 G12D D113-2-1은 등록 번호 DSM ACC3358로, 마우스 하이브리도마 세포주 G12V DWP-1-1-3은 등록 번호 DSM ACC3359로 기탁되었다. 기탁자는 산티아고 데 콤포스텔라 대학교(Universidade de Santiago de Compostela)(스페인 소재)이다.
DSM ACC3359로 기탁된 하이브리도마 세포주로부터 항-KRAS 항체의 DNA 서열을 얻었다. 상응하는 항체는 G12V 항-KRAS 단일클론 항체이다. 일 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 중쇄 가변 영역 CDR1: (서열번호 33) SGYYWN, 중쇄 가변 영역 CDR2: (서열번호 34) YIGYDGTNNYNPSLKN, 중쇄 가변 영역 CDR3: (서열번호 35) LWDY, 경쇄 가변 영역 CDR1: (서열번호 36) RSSQTIVHGNGNTYLE, 경쇄 가변 영역 CDR2: (서열번호 37) TVSNRFS 및 경쇄 가변 영역 CDR3: (서열번호 38) FQGSHAPYT를 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 서열번호 43을 갖는 중쇄 영역 및 서열번호 44를 갖는 경쇄 영역을 포함한다.
DSM ACC3358로 기탁된 하이브리도마 세포주로부터 항-KRAS 항체의 DNA 서열을 얻었다. 상응하는 항체는 G12D 항-KRAS 단일클론 항체이다. 일 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 중쇄 가변 영역 CDR1: (서열번호 45) SYYMY, 중쇄 가변 영역 CDR2: (서열번호 46) EINPSNGGTNFNEKFKS, 중쇄 가변 영역 CDR3: (서열번호 47) GGYGY, 경쇄 가변 영역 CDR1: (서열번호 29) RSSKSLLYKDGKTYLN, 경쇄 가변 영역 CDR2: (서열번호 30) LMSTRAS 및 경쇄 가변 영역 CDR3: (서열번호 31) QQVVEYPRT를 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 서열번호 10을 갖는 중쇄 영역 및 서열번호 17을 갖는 경쇄 영역을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체는 단일클론 항체이다. 보다 구체적으로, 단일클론 항체는 인간 투여를 위한 인간화된 단일클론 항체 또는 키메라 유도체이다.
항체 또는 이의 단편
본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 (a) 특정 항원에 면역-특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는, 면역글로불린 폴리펩타이드 및 면역글로불린 폴리펩타이드의 면역학적 활성 부분, 즉, 면역글로불린 패밀리의 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 (b) 항원에 면역-특이적으로 결합하는 이러한 면역글로불린 폴리펩타이드 또는 단편의 보존적으로 치환된 유도체를 지칭한다. 따라서, 항체 및 이의 단편은 모두 항원-결합 부위를 갖는 것, 즉 돌연변이된 KRAS 에피토프에 결합할 수 있는 것이다.
용어 항체는 또한 "항체 유도체"를 포함하며, 이는, 예를 들어, 이종성 폴리펩타이드의 부착과 같은 이종성 분자의 공유 부착에 의해 또는 항체와 일반적으로 연관되지 않는 글리코실화, 아세틸화 또는 인산화 등에 의해 변형되는 위에 정의된 바와 같은 항체를 의미한다.
특정 실시형태에서, 항체는 임의의 진핵생물 또는 원핵생물 세포 클론 또는 파지 클론을 포함하는 단일 세포 클론으로부터 유래되는 항체를 지칭하는 단일클론 항체이며, 그것이 생산되는 방법이 아니다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "단일클론 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산되는 항체로 제한되지 않는다.
항체 구조의 기본 단위는 4개의 폴리펩타이드 - 비-공유 회합 및 이황화 결합 모두에 의해 함께 연결된 2개의 동일한 저분자량("가벼운") 사슬 및 2개의 동일한 고분자량("무거운") 사슬의 복합체이다. 상이한 항체에는 이러한 기본 단위가 1개 내지 5개가 있을 것이다. 항체는 "Y"로 개략적으로 나타낼 수 있다. "Y"의 각 분지는 중쇄 및 관련된 경쇄의 아미노 말단 부분에 의해 형성된다. "Y"의 염기는 두 중쇄의 카복시 말단 부분에 의해 형성된다. "Y"의 노드(node)는 힌지 영역으로 지칭된다.
5개의 인간 항체 클래스(IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE) 및 이러한 클래스 내의 다양한 하위클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 면역글로불린 분자의 하위클래스는 단일 항체 분자에서 면역글로불린 단위의 수, 개별 단위의 이황화 브리지 구조 및 사슬 길이와 서열의 차이와 같은 구조적 차이에 기초하여 인식된다. 항체의 클래스 및 하위클래스는 이의 아이소타입이다.
항체는 온전한 항체 또는, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fd 사슬, 단일쇄 Fv(scFv), 단일쇄 항체, 이황화-연결된 Fv(sdFv), VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편 또는 Fab 발현 라이브러리로부터 생성된 단편과 같은 항원-결합 항체 단편일 수 있다. 단일쇄 항체를 포함하는 항원-결합 항체 단편은 가변 영역(들)을 단독으로, 또는 힌지 영역, CH1, CH2, CH3, CH4 및 CL 도메인의 전체 또는 일부와 조합하여 포함할 수 있다. 또한, 항원-결합 단편은 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2, CH3, CH4 및 CL 도메인의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 단편은 사슬간 이황화 결합을 포함하는 적어도 하나의 도메인 또는 도메인의 일부를 포함한다.
항체는 온전한 면역글로불린으로 존재하거나, 또는 다양한 펩티데이스로 분해하여 생성된 잘-특성화된 다수의 단편으로 존재한다. 따라서, 예를 들어, 펩신은 힌지 영역에서 이황화 연결 아래에서(즉, Fc 도메인 쪽으로) 항체를 분해하여 그 자체가 이황화 결합에 의해 VH-CH1에 연결되는 경쇄인 Fab의 이량체인 F(ab)'2를 생성한다. F(ab)'2는 힌지 영역에서 이황화 연결을 파괴하기 위해 온화한 조건하에서 환원되어 (Fab')2 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킨다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab이다. 다양한 항체 단편이 온전한 항체의 분해의 관점에서 정의되었지만, 이들 및 다른 단편은 또한, 예를 들어, 재조합 DNA 방법론을 이용함으로써 "파지 디스플레이" 방법 등에 의해 화학적으로 새로(de novo) 합성된다. 항체의 예는 단일쇄 항체, 예를 들어, 가변 중쇄 및 가변 경쇄가 함께 연결되어(직접적으로 또는 펩타이드 링커를 통해) 연속 폴리펩타이드를 형성하는 단일쇄 Fv(scFv) 항체를 포함한다. 항체의 추가적인 비제한적인 예는 나노바디, 항체 단편, 단일클론 항체, 키메라 항체, 역 키메라 항체 등을 포함한다. 항원 결합 단편은 Fab, Fab' F(ab)2, dsFv, sFv, 유니바디, 미니바디, 다이어바디, 트라이바디, 테트라바디, 나노바디, 프로바디, 도메인 바디, 유니바디, 이중-특이성 단일쇄 가변 단편(bi-scFv) 등을 포함한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단한, 비-공유 회합에서 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 이러한 구성에서, 각 가변 도메인의 3개의 초가변 영역이 상호작용하여 VH-VL이량체의 표면의 항원-결합 부위를 정의한다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위보다 낮은 친화도이지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
항체 친화도는 하기 본 명세서의 실시예에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 특정 항체는 약 1×10-7 M 이하; 특히 약 1×10-8 M 이하; 특히 1nM 내지 10nM, 보다 구체적으로 3nM 내지 5nM의 범위 내의 Kd 값, 보다 구체적으로 3.9nM 내지 5nM의 Kd 값으로 펩타이드 KLVVVGA V GVGK(서열번호 40) 또는 KLVVVGA D GVGK(서열번호 41)에 결합하는 것들이다.
전형적으로, 항체는 인간, 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트), 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "인간" 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하고, 인간 면역글로불린 라이브러리, 인간 B 세포 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 형질변환된 동물로부터 단리된 항체를 포함한다. 항체는 단일특이성, 이중특이성, 삼중특이성 또는 더 큰 다중특이성일 수 있다.
입자/나노캡슐/나노 엔티티
본 명세서에서 사용되는 "나노 엔티티"는 전형적으로 1,000㎚ 미만, 예를 들어, 750㎚ 미만, 500㎚ 미만, 300㎚ 미만, 250㎚ 미만, 200㎚ 미만, 150㎚ 미만 또는 100㎚ 미만의 평균 직경을 갖는 나노 엔티티이다. 일부 경우에, 나노 엔티티는 적어도 1㎚, 5㎚, 10㎚, 50㎚, 100㎚, 500㎚ 또는 1,000㎚의 평균 직경을 갖는다. 이들 직경의 임의의 조합이 또한 가능하며, 예를 들어, 나노 엔티티는 100㎚ 내지 300㎚, 1,000㎚ 내지 1㎚, 1,000㎚ 내지 10㎚, 750㎚ 내지 1㎚, 500㎚ 내지 10㎚, 300㎚ 내지 10㎚, 250㎚ 내지 10㎚, 200㎚ 내지 10㎚, 150㎚ 내지 10㎚, 100㎚ 내지 10㎚ 등의 평균 직경 범위를 갖는다. 하나 이상의 나노 엔티티가 또한 일부 실시형태에 존재하며, 이러한 경우에, 복수의 나노 엔티티의 평균(산술) 직경은 본 명세서에 기재된 치수를 갖는다. 일부 경우에, 다양한 직경을 갖는 나노 엔티티가 존재한다. 이러한 나노 엔티티는 동적 또는 레이저 광 산란 기법과 같은 다양한 방법에 의해 결정된다. 나노 엔티티의 예는 나노입자, 나노캡슐, 마이셀 또는 본 명세서에 기재된 것들과 같은 다른 나노 엔티티를 포함한다.
일부 경우에, 나노 엔티티는, 예를 들어, 나노 엔티티를 둘러싸는 환경에 노출된 외부 셸에 의해 둘러싸인 내부 코어를 포함한다. 내부 코어는 나노 엔티티 내에 대칭적으로 또는 비대칭적으로 위치된다. 내부 코어는, 예를 들어, 액체(예를 들어, 비수성 또는 수성임), 고체 및/또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 내부 코어는 하나 이상의 약제학적 작용제 또는 약물을 포함한다. 예를 들어, 내부 코어는 단일클론 항체 및 도세탁셀(docetaxel)과 같은 소분자를 포함한다.
일부 경우에, 나노 엔티티는 캡슐(예를 들어, 나노캡슐)이다. 캡슐은 실질적으로 고체이거나, 또는 고무 또는 겔과 같은 셸을 갖는다. 또한, 일부 경우에, 나노 엔티티는 나노입자와 같은 입자이다. 입자는 고체이며, 잘-정의된 모양을 갖는다. 일부 경우에, 입자는 외부 셸에 의해 둘러싸인 내부 코어를 갖는 나노 엔티티이며, 예를 들어, 입자는 캡슐이다. 나노캡슐은 나노미터 범위의 크기를 갖는다. 나노입자가 일반적으로 구형인 경우, 이는 나노스피어로도 지칭된다. 나노캡슐은 본 명세서에 기재된 것들을 포함하여 표적화 모이어티, 침투 강화제, 항체 등과 같은 추가적인 표면 특징을 갖지만 실질적으로 균일하다.
일부 경우에, 입자는 외부 셸에 의해 둘러싸인 내부 코어를 갖는 나노 엔티티이며, 예를 들어, 입자는 캡슐 또는 나노캡슐이다. 일부 경우에, 나노캡슐은 내부 코어 및 내부 코어와 구별되는 조성물을 갖는 외부 셸을 포함하는 나노미터 범위의 크기를 갖는다. 내부 코어는, 예를 들어, 액체 또는 고체 재료일 수 있다. 항상 그런 것은 아니지만 종종, 내부 코어는 오일이다. 외부 셸은 연속 재료로 형성되며, 전형적으로 내부 코어에 공유적으로 결합되지 않는다. 일부 경우에, 외부 셸은 적어도 1㎚, 적어도 2㎚, 적어도 3㎚, 적어도 5㎚, 적어도 10㎚, 적어도 20㎚, 적어도 30㎚, 적어도 50㎚, 적어도 100㎚ 또는 적어도 200㎚의 평균 두께를 갖는다.
특정 실시형태에서, 복수의 나노 엔티티 중 적어도 일부는 1 마이크로미터 미만의 평균 직경을 갖는 나노캡슐이다.
기타 나노 엔티티
일부 경우에, 나노 엔티티는 마이셀이다. 전형적으로, 마이셀은 내부 부분 및 외부를 정의하는 복수의 계면활성제 또는 양친매성 분자로부터 형성된다. 예를 들어, 계면활성제 분자는, 예를 들어, 단일 층의 계면활성제 또는 양친매성 분자로부터 형성되는 상대적으로 친수성인 외부와 상대적으로 소수성인 내부 부분을 갖도록 배열된다. 일부 경우에, 마이셀은 나노미터 범위의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 마이셀은 마이셀이 외부 상에 분산될 때 임계 마이셀 농도(critical micellar concentration: CMC) 이상의 농도에서 양친매성 분자로 구성된다. 외부 액체상이 수성인 경우, 양친매성 분자의 친수성 부분은 외부 상으로 배향된다. 양친매성 분자의 농도에 따라, 마이셀은 스스로 조직화되어 마이셀의 클러스터인 더 큰 구조를 형성할 수 있다. 마이셀은 예를 들어, 표면에 친수성 부분이 있으며 내부를 가리키는(pointing inwardly) 소수성 부분이 있는 계면활성제 분자로 형성된다(또는 일부 경우, 그 반대).
일부 경우에, 나노 엔티티는 리포솜이다. 리포솜은 유사한 구조를 가질 수 있지만, 일반적으로 계면활성제 또는 양친매성 분자의 이중층(예를 들어, 지질 이중층)으로부터 형성되어, 내부 부분, 중간 부분 및 외부 셸을 정의할 수 있고; 예를 들어, 내부 부분은 상대적으로 친수성이고, 중간 부분(예를 들어, 계면활성제 또는 양친매성 분자의 이중층 구조에 의해 형성된 리포솜의 외부 셸)은 상대적으로 소수성이며, 리포솜의 외부는 수성 또는 친수성 환경이다.
나노 엔티티의 내부 부분이 수성인 경우, 내부 부분을 형성하는 수성 액체는 소정의 실시형태에서, 적어도 하나의 염을 함유하는 물로 구성될 수 있다. 추가적으로, 일부 실시형태에서, 내부 부분을 형성하는 수성 액체는 하나 이상의 수용성 안정화제, 방부제, 계면활성제, 글리콜, 폴리올, 당, 증점제, 겔화제 및 이들 및/또는 다른 적합한 부형제의 혼합물을 함유할 수 있다. 이들 부형제는, 예를 들어, 제형의 안정성을 개선하고, 최종 조성물의 점도를 조정하며, 내부 수상 등으로부터의 방출 속도를 제어하는데 사용된다.
일부 실시형태에서, 나노 엔티티는 나노에멀션이다. 나노에멀션은 적어도 하나의 적절한 양친매성 계면활성제에 의해 안정화된 유중수(W/O) 또는 수중유(O/W) 액적의 두 가지 비혼화성 액체의 2상 분산액으로, 나노미터 크기의 액적을 형성한다.
내부 코어; 소수성 화합물
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "친수성"의 특성은 수상으로 침투하거나 또는 그 안에 잔류하는 분자 또는 작용기의 구성적 특성으로 이해된다. 따라서, "소수성"의 특성은 물에 대한 외친성(exophilic) 거동을 나타내는 분자 또는 작용기의 구성적 특성으로 이해되며; 즉, 물에 침투하지 않거나 또는 수상을 이탈하는 경향을 나타내기 위한 것이다. 더 자세한 내용에 대해서는 문헌[R
Figure pct00002
mpp Lexikon Lacke und Druckfarben, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, N.Y., 1998, "Hydrophilicity", "Hydrophobicity", pages 294 and 295] 참조. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "소수성"인 특성은 "친유성"인 특성과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 소수성 물질은 일반적으로 친유성이지만, 실리콘 및 플루오로카본의 경우와 같이 예외가 있는 것으로 알려져 있다.
일부 실시형태에서, 내부 코어는, 예를 들어, 오일, 친유성 계면활성제, 지방산, 알케인, 사이클로알케인, 담즙염, 담즙염 유도체, 테르페노이드, 테르펜, 테르펜-유래 모이어티 및 친유성 바이타민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 소수성 화합물을 포함한다.
소수성 화합물은 특히 오일이다. 오일은 휘발성 또는 비-휘발성일 수 있고, 특정 실시형태에서, 천연 오일, 반합성 및 합성 약제학적 또는 이들의 조합물, 예컨대, 동물성 오일, 식물성 오일, 탄화수소 또는 실리콘 오일로부터 선택된다. 이들 오일은 식물 또는 동물 기원으로부터의 오일, 탄화수소 오일 또는 실리콘 오일과 같은 약제학적 용도를 위한 천연, 반합성 및 합성 오일로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 소정의 실시형태를 수행하는데 적합한 오일은 카프릴릭/카프릭 트라이글리세라이드, 미네랄 오일, 스쿠알렌 오일, 향유, 실리콘 오일, 에센셜 오일, 수불용성 바이타민, 아이소프로필 스테아레이트, 뷰틸 스테아레이트, 옥틸 팔미테이트, 세틸 팔미테이트, 트라이데실 베헤네이트, 다이아이소프로필 아디페이트, 다이옥틸 세바케이트, 멘틸 안트라닐레이트, 세틸 옥타노에이트, 옥틸 살리실레이트, 아이소프로필 미리스테이트, 네오펜틸 글리콜 다이카프레이트 케톨, 데실 올레이트, C12-C15 알킬 락테이트, 세틸 락테이트, 라우릴 락테이트, 아이소스테아릴 네오펜타노에이트, 미리스틸 락테이트, 아이소세틸 스테아로일 스테아레이트, 옥틸도데실 스테아로일 스테아레이트, 탄화수소 오일, 아이소파라핀, 유동 파라핀, 아이소도데케인, 바셀린, 아르간 오일, 유채씨유, 칠리유, 코코넛유, 옥수수유, 면실유, 아마인유, 포도씨유, 겨자유, 올리브유, 팜유, 분획 팜유, 땅콩유, 피마자유, 잣유, 양귀비 종자유, 호박 종자유, 쌀겨유, 홍화유, 티트리유, 트러플유, 식물유, 살구씨유, 호호바유, 마카다미아넛유, 밀배아유, 아몬드유, 대두유, 참깨유, 헤이즐넛유, 해바라기유, 햄프씨드유, 로즈우드유, 쿠쿠이넛유, 아보카도유, 호두유, 어유, 베리유, 올스파이스유, 주니퍼유, 종자유, 아몬드씨유, 아니스씨유, 셀러리씨유, 커민씨유, 육두구씨유, 바질잎유, 베이잎유, 계피잎유, 커먼세이지잎유, 유칼립투스잎유, 레몬잎유, 멜라루카잎유, 오레가노유, 패출리잎유, 페퍼민트잎유, 솔잎유, 로즈마리잎유, 스피어민트유, 티트리잎유, 타임유, 꽃유, 카모마일유, 클라리 세이지유, 클로브유, 제라늄꽃유, 히솝꽃유, 자스민유, 라벤더유, 마우카꽃유, 마조람꽃유, 오렌지꽃유, 장미꽃유, 일랑일랑꽃유, 나무껍질유, 카시아나무껍질유, 계피나무껍질유, 사사프라스나무껍질유, 나무 오일, 녹나무 오일, 삼나무 오일, 자단 오일, 샌달우드 오일, 생강나무 오일, 톨유, 피마자유, 미르유, 과피유, 베르가못 과피유, 포도 과피유, 레몬 과피유, 라임 과피유, 오렌지 과피유, 탠저린 과피유, 근유, 발레리안유, 올레산, 리놀레산, 올레일 알코올, 아이소스테아릴 알코올, 에틸 올레이트, 중쇄 트라이글리세라이드, 예컨대, 데카노일- 및 옥타노일 글리세라이드의 혼합물(Miglyol® 810N, Miglyol® 812N, Kollisolv® MCT, Captex® 300, Captex® 355, Labrafac® Lipophile WL1349), Labrafil® M 2125 CS(리놀레오일 마크로골-6 글리세라이드), Labrafil® M2130 CS(라우로일 마크로골-6 글리세라이드), Labrafil® M 1944 CS(올레오일 폴리옥실-6 글리세라이드), Labrafac® PG(프로필렌 글리콜 다이카프릴로카프레이트), Rylo®(지방산의 혼합물), Peceol®(글리세롤 모노올레이트) 및 Maisine®(글리세롤 모노리놀레이트), 이들의 합성 또는 반합성 유도체 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 경우에, 오일은 땅콩유, 면실유, 올리브유, 피마자유, 대두유, 홍화유, 참깨유, 옥수수유, 팜유, 알파-토코페롤(바이타민 E), 아이소프로필 미리스테이트, 스쿠알렌, Miglyol®, Labrafil®, Labrafac®, Peceol®, Captex®, Kollisolv® MCT 및 Maisine® 또는 이들의 혼합물 중 하나 이상이다. 다른 적합한 오일은 아이소프렌 단위(2-메틸뷰타-1,3-다이엔)에 의해 형성되고, 탄소 원자: 헤미테르펜(C5), 모노테르펜(C10), 세스퀴테르펜(C15), 다이테르펜(C20), 세스터테르펜(C25), 트라이테르펜(C30), 테트라테르펜(C40, 카로테노이드) 및 폴리테르펜, 바이타민 A, 스쿠알렌 등에 따라 세분화된 테르펜 계열의 오일을 포함한다. 일부 실시형태에서, 내부 부분을 형성하는 비수성 액체는 제형의 최대 안정성을 제공하기 위해 수불용성 안정화제, 방부제, 계면활성제, 유기 용매 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 하나 이상의 이들 및/또는 다른 오일의 조합이 또한 가능하다.
일 실시형태에서, 내부 코어는 오일, 특히 카프릴릭/카프릭 트라이글리세라이드(예컨대, Miglyol® 812N)를 포함한다.
외부 셸; 중합체
에멀션 시스템과 관련하여 나노캡슐 시스템의 이점은 더 큰 안정성 및 응집에 대한 보호, 관련 약물의 약물 방출 프로파일의 변화, 증가된 세포 내재화 및 소정의 세포 유형과의 특정 상호작용을 부여할 수 있는 유성 코어를 코팅하는 중합체의 존재이다. 다양한 중합체가 본 발명의 소정의 실시형태에 따라 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 중합체는 폴리시알산(PSA), 하이알루론산(HA), 폴리글루탐산(PGA) 및/또는 페길화된-폴리글루탐산(PGA-PEG), 폴리락트산(PLA) 및/또는 페길화된 폴리락트산(PLA-PEG), 폴리(아스파르트산)(PASP) 및/또는 페길화된- 폴리(아스파르트산)(PASP-PEG), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA) 및/또는 페길화된 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLA-PEG), 알긴산(ALG) 및/또는 페길화된 알긴산(ALG-PEG), 폴리말산(PLMA) 및/또는 페길화된 폴리말산(PLMA-PEG) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 및/또는 다른 중합체의 조합이 또한 소정의 실시형태에서 사용된다.
특정 실시형태에서, 중합체는 폴리시알산, 하이알루론산, 폴리글루탐산, 폴리아스파르트산, 폴리말산, 알긴산, 폴리락트산, 폴리락트산-코-글리콜산, 이들의 페길화된 형태 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 중합체는 PSA 또는 HA이다.
중합체는 엔티티 전체에 고르게 분포되거나 또는 엔티티의 소정의 영역, 예를 들어, 캡슐의 외부 셸 또는 엔티티의 다른 외부 표면 내에 농축된다. 일부 경우에, 셸과 같은 엔티티의 부분의 적어도 50 wt%가 중합체를 포함하고, 소정의 경우에, 엔티티의 부분의 적어도 60 wt%, 적어도 70 wt%, 적어도 75 wt%, 적어도 80 wt%, 적어도 85 wt%, 적어도 90 wt%, 적어도 95 wt% 또는 적어도 99 wt%가 중합체를 포함할 수 있다.
중합체 - PSA
특정 실시형태에서, 중합체는 PSA이다. PSA는 일반적으로 복수의 시알산 단위로 구성되며, 종종 함께 결합되어 2→8 및/또는 2→9 결합을 통해 중합체를 형성하지만, 다른 결합 배열도 또한 가능하다. 전형적으로, PSA를 형성하기 위해 함께 결합된 적어도 2개, 적어도 4개, 적어도 6개, 적어도 8개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 75개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개의 시알산 단위가 있다. 일부 경우에, PSA는 PSA를 형성하기 위해 함께 결합된 1000개 이하, 500개 이하, 200개 이하, 100개 이하, 50개 이하, 30개 이하 또는 10개 이하의 시알산 단위를 갖는다. 이들의 임의의 조합도 또한 가능하며, 예를 들어, PSA는 함께 결합된 2개 내지 100개의 시알산 단위를 갖는다. 시알산 단위는 동일할 필요는 없으며, 동일한 PSA 분자 내에서도 독립적으로 동일하거나 상이할 수 있다는 점에 유의하여야 한다. PSA는 직쇄(선형)일 필요는 없으며, 다양한 분기 배열도 또한 가능하다는 점에 유의하여야 한다. 예를 들어, 시알산 단위는 3개 이상의 상이한 시알산 단위에 결합하여 PSA 분자 내에 분기점을 생성한다.
비제한적인 예로서, PSA는 상이한 분자량, 예를 들어, 4kDa, 30kDa, 95kDa 등을 갖는다. 일부 경우에, PSA는 300개 초과의 시알산 단위를 함유한다. 추가적인 비제한적인 예로서, PSA는 적어도 1kDa, 적어도 3kDa, 적어도 5kDa, 적어도 10kDa, 적어도 20kDa, 적어도 25kDa, 적어도 30kDa, 적어도 40kDa, 적어도 50kDa, 적어도 60kDa, 적어도 70kDa, 적어도 75kDa, 적어도 80kDa, 적어도 90kDa, 적어도 100kDa 등의 분자량을 갖는다. 일부 경우에, PSA는 100kDa 이하, 90kDa 이하, 80kDa 이하, 75kDa 이하, 70kDa 이하, 60kDa 이하, 50kDa 이하, 40kDa 이하, 30kDa 이하, 25kDa 이하, 20kDa 이하, 10kDa 이하, 5kDa 이하, 3kDa 이하 또는 1kDa 이하의 분자량을 갖는다. 임의의 이들의 조합도 가능하며, 예를 들어, PSA는 분자량 약 1kDa 내지 약 100kDa, 약 5kDa 내지 약 80kDa 또는 약 10kDa 내지 약 50kDa 등의 분자량을 갖는다. (반대로 표시되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 분자량은 수 평균 분자량임).
폴리시알산은 항상 동일할 필요는 없다는 점에 유의하여야 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, PSA는 상이한 수의 시알산 단위를 가지고/가지거나 존재하는 상이한 PSA 분자에 상이한 시알산 단위가 있다. 일부 경우에, 하나 또는 몇 가지 유형의 PSA 분자가 존재할 수 있으며, 예를 들어, 하나 이상의 형태는 즉, 몰 기준으로 존재하는 PSA 분자의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 그 이상을 포함한다.
PSA 내에 존재하는 시알산 단위의 비제한적인 예는 N-아세틸뉴라민산(Neu), 2-케토-3-데옥시논산(Kdn), 락타민산, N-시알산 및/또는 O-시알산을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 예는 N-글리콜릴뉴라민산(Neu5Gc), 9-O-아세틸-8-O-메틸-N-아세틸뉴라민산(Neu5,9Ac28Me) 및 7,8,9-트라이-O-아세틸-N-글리콜릴뉴라민산(Neu5Gc7,8,9Ac3)을 포함한다. "Sia"는 일반적으로 불특정한 시알산 단위를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 시알산 단위는 자연에서 전형적으로 발견되는 43개의 유도체를 포함하는, 뉴라민산(9-탄소 당)의 임의의 유도체를 포함한다. 이들은 Neu; Neu5Ac; Neu4,5Ac2; Neu5,7Ac2; Neu5,8Ac2; Neu5,9Ac2; Neu4,5,9Ac3; Neu5,7,9Ac3; Neu5,8,9Ac3; Neu5,7,8,9Ac4; Neu5Ac9Lt; Neu4,5Ac29Lt; Neu5Ac8Me; Neu5,9Ac28Me; Neu5Ac8S; Neu5Ac9P; Neu2en5Ac; Neu2en5,9Ac2; Neu2en5Ac9Lt; Neu2,7an5Ac; Neu5Gc; Neu4Ac5Gc; Neu7Ac5Gc; Neu8Ac5Gc; Neu9Ac5Gc; Neu7,9Ac25Gc; Neu8,9Ac25Gc; Neu7,8,9Ac35Gc; Neu5Gc9Lt; Neu5Gc8Me; Neu9Ac5Gc8Me; Neu7,9Ac25Gc8Me; Neu5Gc8S; Neu5GcAc; Neu5GcMe; Neu2en5Gc; Neu2en9Ac5Gc; Neu2en5Gc9Lt; Neu2en5Gc8Me; Neu2,7an5Gc; Neu2,7an5Gc8Me; Kdn; 및 Knd9Ac를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 한 세트의 실시형태에서, 각각의 시알산 단위(PSA를 형성하기 위한 중합 전)는 독립적으로 하기 구조를 가질 수 있다:
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R1은 H; Gal(3/4/6), GalNAc(6)(N-아세틸갈락토사민), GlcNAc(4/6), Sia(8/9) 또는 5-O-Neu5Gc에 대한 알파 연결; 2,7-무수물 분자에서 C-7에 연결된 산소; 또는 Neu2en5Ac에서 제거된 아노머 하이드록실(C-3에 대한 이중 결합)이다. R2는 H; Gal(3/4/6), GalNAc(6), GlcNAc(4/6), Sia(8/9) 또는 5-O-Neu5Gc에 대한 알파 연결; 2,7-무수물 분자에서 C-7에 연결된 산소; 또는 Neu2en5Ac에서 제거된 아노머 하이드록실(C-3에 대한 이중 결합)이다. R4는 H; -아세틸; C-8에 대한 무수물; Fuc(프룩토스); 또는 Gal(갈락토스)이다. R5는 아미노; N-아세틸; N-글리콜릴; 하이드록실; N-아세트이미돌일; N-글리콜릴-O-아세틸; N-글리콜릴-O-메틸; 또는 N-글리콜릴-O-2-Neu5Gc이다. R7은 H; -아세틸; C-2에 대한 무수물이거나; 또는 Leg(레지오나민산)에서 아미노 및 N-아세틸에 의해 치환된다. R8은 H; -아세틸; C-4에 대한 무수물; -메틸; -설페이트; Sia(시알산); 또는 Glc(글루코스)이다. R9는 H; -아세틸; -락틸; -포스페이트; -설페이트; Sia이거나; 또는 Leg에서 H에 의해 치환된 OH이다. 일부 경우에, PSA는 콜로민산이다(2→8 결합만이 존재하는 경우).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 시알산은 시알산의 수용성 염 및 수용성 유도체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 시알산 염은 소듐염, 포타슘염, 마그네슘염, 칼슘염 또는 아연염이다. 일 실시형태에서, 시알산의 적어도 일부는 소듐염으로 존재한다. 여러 유형의 시알산의 조합이 또한 예를 들어, PSA의 서브유닛 및/또는 PSA의 상이한 분자로서 사용된다. 한 세트의 실시형태에서, PSA 내의 시알산의 적어도 일부는 변형된다(그러나, 다른 실시형태에서, PSA가 반드시 변형되는 것은 아님을 이해하여야 함). 예를 들어, 일부 경우에, 하나 이상의 시알산 단위는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 알킬 또는 다른 소수성 모이어티 등에 대한 부착에 의해 변형된다. 소수성 모이어티는 소수성 분자 또는 이의 일부, 예를 들어, 본 명세서에서 논의된 것과 같은 알킬기를 포함한다.
중합체 - 하이알루론산, HA
한 세트의 실시형태에서, 중합체는 하이알루론산을 포함한다. 하이알루론산은 하기 화학식에 나타낸 바와 같이 베타-1,4 및 베타-1,3 글리코시드 결합을 교대로 결합시킴으로써 결합된 D-글루쿠론산 및 D-N-아세틸글루코사민이 교대로 첨가되어 형성되는 이당류 구조의 반복을 포함하는 선형 중합체이다:
Figure pct00004
상기 식에서, 정수 n은 중합의 정도, 즉, 하이알루론산 사슬에서 이당류 단위의 수를 나타낸다. 예를 들어, n은 적어도 2, 적어도 4, 적어도 6, 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400 또는 적어도 500이다. 일부 경우에, n은 1000 이하, 500 이하, 200 이하, 100 이하, 50 이하, 30 이하 또는 10 이하이다. 이들의 임의의 조합도 또한 가능하며, 예를 들어, n은 2 내지 100이다. 하이알루론산 단위는 동일할 필요는 없으며, 동일한 하이알루론산 사슬 내에서도 독립적으로 동일하거나 상이할 수 있다는 점에 유의하여야 한다. 또한, 하이알루론산은 직쇄(선형)일 필요는 없으며, 다양한 분기 배열도 가능하다는 점에 유의하여야 한다.
따라서, 다양한 분자량을 갖는 하이알루론산이 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 하이알루론산은 상이한 분자량, 예를 들어, 4kDa, 30kDa, 95kDa 등을 갖는다. 예를 들어, 하이알루론산은 적어도 1kDa, 적어도 3kDa, 적어도 5kDa, 적어도 10kDa, 적어도 20kDa, 적어도 25kDa, 적어도 30kDa, 적어도 40kDa, 적어도 50kDa, 적어도 60kDa, 적어도 70kDa, 적어도 75kDa, 적어도 80kDa, 적어도 90kDa, 적어도 100kDa 등의 분자량을 갖는다. 일부 경우에, 하이알루론산은 100kDa 이하, 90kDa 이하, 80kDa 이하, 75kDa 이하, 70kDa 이하, 60kDa 이하, 50kDa 이하, 40kDa 이하, 30kDa 이하, 25kDa 이하, 20kDa 이하, 10kDa 이하, 5kDa 이하, 3kDa 이하 또는 1kDa 이하의 분자량을 갖는다. 임의의 이들의 조합도 또한 가능하며, 예를 들어, 하이알루론산은 약 1kDa 내지 약 100kDa, 약 5kDa 내지 약 80kDa 또는 약 10kDa 내지 약 50kDa 등의 분자량을 갖는다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 하이알루론산은 이의 짝염기(conjugated base)(하이알루로네이트)를 포함한다. 이 짝염기는, 예를 들어, 소듐염, 포타슘염, 칼슘염, 암모늄염, 마그네슘염, 알루미늄염 및 리튬염과 같은 무기염, 중성 pH에서 염기성 아미노산염과 같은 유기염을 포함하는 하이알루론산의 알칼리염일 수 있다. 일부 경우에, 염은 약제학적으로 허용 가능하다. 일 실시형태에서, 알칼리염은 하이알루론산의 소듐염이다. 여러 유형의 하이알루론산의 조합이 또한, 예를 들어, 하이알루론산 사슬의 서브유닛 및/또는 하이알루론산의 상이한 분자로서 사용된다.
따라서, 하이알루론산이 항상 동일할 필요는 없다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 하이알루론산은 상이한 수의 하이알루론산 단위(예컨대, 위에 기재된 것들)를 가지고/가지거나 존재하는 상이한 하이알루론산 사슬에 상이한 하이알루론산 단위가 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 유형의 하이알루론산 분자가 존재하며, 예를 들어, 하나 이상의 형태는 즉, 몰 기준으로 존재하는 하이알루론산 분자의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 이상을 포함한다.
일부 실시형태에서, 하이알루론산 단위의 적어도 일부가 변형된다(그러나, 다른 실시형태에서, 하이알루론산이 반드시 변형되는 것은 아님을 이해하여야 함). 예를 들어, 일부 경우에, 하나 이상의 하이알루론산 단위는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 알킬 또는 다른 소수성 모이어티 등에 대한 부착에 의해 변형된다. 소수성 모이어티는 소수성 분자 또는 이의 일부, 예를 들어, 본 명세서에서 논의된 것과 같은 알킬기를 포함한다.
중합체 - 폴리글루탐산, PGA
한 세트의 실시형태에서, 중합체는 폴리글루탐산(PGA)을 포함한다. PGA는 아미노산 글루탐산(GA)의 중합체이다. 분자량(Mw) 외에도, D-글루탐산 단량체 대 L-글루탐산 단량체의 비 및 분자 구조는 PGA의 중요한 화학적 특성이다. PGA는 아래와 같이 두 가지 상이한 구조로 존재한다:
Figure pct00005
상기 식에서, 정수 n은 중합의 정도, 즉, PGA 사슬에서 글루탐산 단량체의 수를 나타낸다. 예를 들어, n은 적어도 2, 적어도 4, 적어도 6, 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400 또는 적어도 500이다. 일부 경우에, n은 1000 이하, 500 이하, 200 이하, 100 이하, 50 이하, 30 이하 또는 10 이하이다. 따라서, 다양한 분자량을 갖는 폴리글루탐산이 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 폴리글루탐산은 상이한 분자량을 가지며, 예를 들어, 폴리글루탐산은 적어도 1kDa, 적어도 3kDa, 적어도 5kDa, 적어도 10kDa, 적어도 20kDa, 적어도 25kDa, 적어도 50kDa, 적어도 60kDa, 적어도 70kDa, 적어도 80kDa, 적어도 90kDa, 적어도 100kDa 등의 분자량을 갖는다. 이들의 임의의 조합도 또한 가능하다. 또한, 글루탐산 단위는 반드시 직쇄(선형)일 필요는 없으며, 다양한 분기 배열도 또한 가능하다는 점에 유의하여야 한다.
폴리-α-글루탐산(α-PGA)은 화학적으로 합성될 수 있는 반면, γ-PGA는 미생물 생산을 통해서만 얻어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 폴리글루탐산은 폴리글루탐산의 수용성 염 및 수용성 유도체(예를 들어, 소듐염, 포타슘염, 마그네슘염, 칼슘염)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 한 세트의 실시형태에서, PGA 내의 글루탐산의 적어도 일부가 변형된다(그러나, 다른 실시형태에서, PGA가 반드시 변형되는 것은 아님을 이해하여야 함). 예를 들어, 일부 경우에, 하나 이상의 글루탐산 단위는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 알킬 또는 다른 소수성 모이어티 등에 대한 부착에 의해 변형된다.
중합체 - 폴리아스파르트산, PASP
한 세트의 실시형태에서, 중합체는 폴리아스파르트산(PASP)을 포함한다. PASP는 백본에 단백질-유사 아마이드 결합과 각 반복 단위에 펜던트기로서 카복실산이 있는 폴리(아미노산)이다. 자연에서, PASP는 길이가 최대 50개의 아미노산인 더 큰 단백질의 단편으로 발견되었다. PASP는 상이한 방법에 의해 합성될 수 있다. 중합체는 α, β 및 L, D 이성질체와 같은 다양한 형태로 존재한다.
Figure pct00006
상기 식에서, 정수 n은 중합의 정도, 즉, PASP 사슬에서 아스파르트산 단량체의 수를 나타낸다. 임의의 수의 아스파르트산 단위가 중합체 내에 존재한다. 예를 들어, n은 적어도 2, 적어도 4, 적어도 6, 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400 또는 적어도 500이다. 일부 경우에, n은 1000 이하, 500 이하, 200 이하, 100 이하, 50 이하, 30 이하 또는 10 이하이다. 비제한적인 예로서, 폴리글루탐산은 상이한 분자량을 가지며, 예를 들어, 폴리글루탐산은 적어도 1kDa, 적어도 3kDa, 적어도 5kDa, 적어도 10kDa, 적어도 20kDa, 적어도 25kDa, 적어도 50kDa, 적어도 60kDa, 적어도 70kDa, 적어도 80kDa, 적어도 90kDa, 적어도 100kDa 등의 분자량을 갖는다. 이들의 임의의 조합도 또한 가능하다. 또한, 다른 아미노산이 PASP 사슬 내에 존재할 수 있으며, 중합체는 직선형 또는 분지형이라는 점에 유의하여야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 폴리아스파르트산은 폴리아스파르트산의 수용성 염 및 수용성 유도체(예를 들어, 소듐염, 포타슘염, 마그네슘염, 칼슘염)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 한 세트의 실시형태에서, PASP 내의 아스파르트산의 적어도 일부는 변형된다(그러나, 다른 실시형태에서, PASP가 반드시 변형되는 것은 아님을 이해하여야 함). 예를 들어, 일부 경우에, 하나 이상의 아스파르트산 단위는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 알킬 또는 다른 소수성 모이어티 등에 대한 부착에 의해 변형된다.
중합체 - 폴리말산, PMLA
한 세트의 실시형태에서, 중합체는 폴리말산(PMLA)을 포함한다. PLMA 화학적 합성 또는 점균류(slime mold) 피나룸 폴리세팔룸(Physarum polycephalum)에서 생물학적 발효에 의해 생산될 수 있는 카복실-작용화된 폴리에스터이다. PMLA는 시트르산 회로에서 물과 이산화탄소로 대사되는 완전히 생분해성인 중합체이다. 라세미 또는 광학적으로 순수한 α- 및 β-구조는 모두 화학적 방법에 의해 얻어질 수 있는 반면, 미생물은 극히 높은 광학적 순도의 PMLA를 독점적으로 생성한다. 펜던트 카복실산기는 관심 분자를 도입하기 위해 화학적으로 변형될 수 있다. 다양한 형태의 PLMA의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00007
상기 식에서, 정수 n은 중합의 정도, 즉, PLMA 사슬에서 말산 단위의 수를 나타낸다. 예를 들어, n은 적어도 2, 적어도 4, 적어도 6, 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400 또는 적어도 500이다. 일부 경우에, n은 1000 이하, 500 이하, 200 이하, 100 이하, 50 이하, 30 이하 또는 10 이하이다. 따라서, 다양한 분자량을 갖는 폴리말산이 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 폴리말산은 상이한 분자량을 가지며, 예를 들어, 폴리말산은 적어도 1kDa, 적어도 3kDa, 적어도 5kDa, 적어도 10kDa, 적어도 20kDa, 적어도 25kDa, 적어도 50kDa, 적어도 60kDa, 적어도 70kDa, 적어도 80kDa, 적어도 90kDa, 적어도 100kDa 등의 분자량을 갖는다. 이들의 임의의 조합도 또한 가능하다. 또한, 말산 단위는 반드시 직쇄(선형)일 필요는 없으며, 다양한 분기 배열도 또한 가능함에 유의하여야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 폴리말산은 폴리말산의 수용성 염 및 수용성 유도체(예를 들어, 소듐염, 포타슘염, 마그네슘염, 칼슘염)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 한 세트의 실시형태에서, PLMA 내의 말산의 적어도 일부는 변형된다(그러나, 다른 실시형태에서, PLMA가 반드시 변형되는 것은 아님을 이해하여야 함). 예를 들어, 일부 경우에, 하나 이상의 말산 단위는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 알킬 또는 다른 소수성 모이어티 등에 대한 부착에 의해 변형된다.
중합체 - 알긴산, ALG
한 세트의 실시형태에서, 중합체는 알긴산(ALG)을 포함한다. ALG는 갈조류(brown algae)의 세포벽에 널리 분포하는 친수성 다당류이다. 이의 염은 알기네이트로 알려져 있다. 알기네이트는 실제로 블록 공중합체이며, 굴루로네이트 대 만누로네이트의 비는 천연 공급원에 따라 다르다. 알기네이트는 (1,4)-연결된 β-D-만누로네이트(M) 및 α-L-굴루로네이트(G) 잔기의 블록을 함유하는 선형 공중합체의 전체 패밀리로 알려져 있다. 블록은 아래 나타낸 바와 같이 연속 G 잔기(GGGGGG), 연속 M 잔기(MMMMMM) 및 교호(alternating) M 및 G 잔기(GMGMGM)로 구성된다(문헌[Lee and Mooney, 2012]).
Figure pct00008
비제한적인 예로서, 알긴산은 상이한 분자량을 가지며, 예를 들어, 알기네이트는 적어도 1kDa, 적어도 3kDa, 적어도 5kDa, 적어도 10kDa, 적어도 20kDa, 적어도 25kDa, 적어도 50kDa, 적어도 60kDa, 적어도 70kDa, 적어도 80kDa, 적어도 90kDa, 적어도 100kDa 등의 분자량을 갖는다. 이들의 임의의 조합도 또한 가능하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 알긴산은 알긴산의 수용성 염 및 수용성 유도체(예를 들어, 소듐염, 포타슘염, 마그네슘염, 칼슘염)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 한 세트의 실시형태에서, ALG 내의 굴루로네이트 및/또는 만누로네이트 잔기의 적어도 일부는 변형된다(그러나, 다른 실시형태에서, ALG가 반드시 변형되는 것은 아님을 이해하여야 함). 예를 들어, 일부 경우에, 하나 이상의 굴루로네이트 및/또는 만누로네이트 잔기는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 알킬 또는 다른 소수성 모이어티 등에 대한 부착에 의해 변형된다.
중합체 - 폴리락트산, PLA
한 세트의 실시형태에서, 중합체는 폴리락트산(PLA) 폴리에스터를 포함한다. PLA의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00009
상기 식에서, 정수 n은 중합의 정도, 즉, PLA 사슬에서 락트산/락타이드산 단위의 수를 나타낸다. 예를 들어, n은 적어도 2, 적어도 4, 적어도 6, 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400 또는 적어도 500이다. 일부 경우에, n은 1000 이하, 500 이하, 200 이하, 100 이하, 50 이하, 30 이하 또는 10 이하이다. 따라서, 다양한 분자량을 갖는 PLA가 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, PLA는 상이한 분자량을 가지며, 예를 들어, PLA는 적어도 1kDa, 적어도 3kDa, 적어도 5kDa, 적어도 10kDa, 적어도 20kDa, 적어도 25kDa, 적어도 50kDa, 적어도 60kDa, 적어도 70kDa, 적어도 80kDa, 적어도 90kDa, 적어도 100kDa 등의 분자량을 갖는다. 이들의 임의의 조합도 또한 가능하다. 또한, 락트산/락타이드산 단위가 반드시 직쇄(선형)일 필요는 없으며, 다양한 분기 배열도 또한 가능함에 유의하여야 한다.
중합체 - 폴리락트산-코-글리콜산, PLGA
한 세트의 실시형태에서, 중합체는 폴리락트산-코-글리콜산(PLGA) 폴리에스터를 포함한다. PLGA의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00010
상기 식에서, 정수 x는 락트산 단위의 수를 나타내고, 정수 y는 글리콜산 단위의 수를 나타낸다. 중합에 사용되는 락트산 대 글리콜산의 비에 따라, 다양한 형태의 PLGA가 얻어질 수 있으며, 이들은 일반적으로 사용된 단량체의 몰비와 관련하여 확인된다. 비제한적인 예로서, PLGA는 75:25(조성이 75% 락트산 및 25% 글리콜산인 공중합체), 50:50(조성이 50% 락트산 및 50% 글리콜산인 공중합체) 및 25:75(조성이 25% 락트산 및 75% 글리콜산인 공중합체)이다.
일부 경우에, PLA 또는 PLGA에서 하나 이상의 락트산 및/또는 글리콜산 단량체는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 알킬 또는 다른 소수성 모이어티 등에 대한 부착에 의해 변형된다.
페길화된 중합체, 중합체-PEG
한 세트의 실시형태에서, 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)을 포함한다. 따라서, 일부 경우에, PEG는, 예를 들어, HA-PEG, PGA-PEG, PASP-PEG, PLMA-PEG, ALG-PEG, PLA-PEG 또는 PLGA-PEG를 형성하기 위해, 예를 들어, HA, PGA, PASP, PLMA, ALG, PLA 또는 PLGA에 접합된다. 그러나, 다른 경우에, PEG는 존재하며, 즉, 중합체에 접합되지 않는다.
가장 일반적인 형태의 PEG는 하기 화학식을 갖는 중합체이다:
H-(O-CH2-CH2)n-OH
상기 식에서, n은 PEG 중합 정도를 나타내는 정수이다. 접합체 중합체-PEG의 형성을 위해, 2개의 말단 하이드록실기 중 1개 또는 2개가 변형된다. 변형된 PEG는, 예를 들어, 다음과 같다:
X1-(O-CH2-CH2)n-X2
상기 식에서, X1은 수소 또는 후속 반응을 위한 OH 라디칼 기능을 차단하는 하이드록실 보호기이다. 예를 들어, n은 적어도 2, 적어도 4, 적어도 6, 적어도 8, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 75, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400 또는 적어도 500이다. 일부 경우에, n은 1000 이하, 500 이하, 200 이하, 100 이하, 50 이하, 30 이하 또는 10 이하이다. 이들의 임의의 조합도 또한 가능하며, 예를 들어, n은 2 내지 100이다. 하이드록실 라디칼의 보호기는 당업계에 널리 알려져 있다.
중합체의 페길화는 당업계에서 이용 가능한 임의의 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 중합체는 다양한 분자량으로 이용 가능하다. 예를 들어, PEG 또는 중합체-PEG에 적합한 분자량은 약 1kDa 내지 약 100kDa, 약 5kDa 내지 약 80kDa, 약 10kDa 내지 약 50kDa이다. 추가적인 비제한적인 예로서, PEG 또는 중합체-PEG는 적어도 1kDa, 적어도 5kDa, 적어도 10kDa, 적어도 20kDa, 적어도 30kDa, 적어도 40kDa, 적어도 50kDa, 적어도 60kDa, 적어도 70kDa, 적어도 80kDa, 적어도 90kDa, 적어도 100kDa 등의 분자량을 갖는다. 이들의 임의의 조합도 또한 가능하다.
일부 실시형태에서, 중합체(예를 들어, HA, PGA, PASP, PLMA, ALG, PLA, PLGA 등) 중 PEG의 비율은 중합체의 총 중량에 대해 약 10% 내지 90%(w/w), 약 15% 내지 80%, 약 20% 내지 70% 또는 약 20%, 약 22%, 약 24%, 약 26%, 약 28%, 약 30%, 약 32%, 약 34%, 약 36%, 약 38%, 약 40%, 약 42%, 약 44%, 약 46%, 약 48%, 약 50%, 약 52%, 약 54%, 약 56%, 약 58% 또는 약 60%일 수 있다.
표적화 모이어티
일 양태에서, 엔티티는 또한 표적화 모이어티를 포함하지만, 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티가 존재하지 않음에 유의하여야 한다. 표적화 모이어티(존재하는 경우)는, 예를 들어, 대상체 내의 소정의 세포 집단에 대한 엔티티의 전달을 표적화하는데 사용된다. 예를 들어, 표적화 모이어티는 하나 이상의 유형의 세포, 예를 들어, 암 세포, 내피 세포 및/또는 면역 세포에 대한 나노 엔티티의 접근을 용이하게 한다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 대상체 내의 특정 위치, 예를 들어, 특정 장기 또는 특정 세포 유형(예를 들어, 종양 또는 암 세포)에 대한 엔티티의 표적화를 가능하게 한다. 일부 경우에, 엔티티는 표적화 모이어티가 필요 없이 세포에 의해 내재화되며, 일부 다른 경우에, 내재화는 표적화 모이어티에 의해 촉진된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 유형의 표적화 모이어티가 존재한다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 세포- 및/또는 종양/조직-투과 펩타이드를 포함한다. 그러나, 소정의 실시형태에서, 표적화 모이어티는 내재화를 반드시 촉진하지 않을 수도 있음을 이해하여야 한다.
매우 다양한 표적화 모이어티가 다양한 실시형태에 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적화 모이어티는 펩타이드, 단백질, 압타머, 항체(단일클론 항체, 나노바디 및 항체 단편을 포함), 핵산, 유기 분자, 리간드 등을 포함한다. 일부 표적화 모이어티는, 예를 들어, 문헌[Bertrand, et al., 2014, et al., 2016 및 Zhou et al., 2016]에서 찾을 수 있다.
한 세트의 실시형태에서, 예를 들어, 표적화 모이어티는, 예를 들어, 50개 이하의 아미노산, 40개 이하의 아미노산, 30개 이하의 아미노산, 20개 이하의 아미노산 또는 10개 이하의 아미노산 길이를 갖는 펩타이드이다.
한 세트의 실시형태에서, 표적화 모이어티는 세포-투과 및/또는 종양/조직-투과 펩타이드이다. 세포-투과 펩타이드는 세포막을 투과하는 능력을 갖는다. 종양-투과 펩타이드는 약물 페이로드가 종양으로 깊숙이 침투하도록 하는 능력을 갖는다. 일부 경우에, 세포-투과 및/또는 종양/조직-투과 펩타이드는 또한 세포에 대한 나노 엔티티의 표적화를 촉진한다.
본 명세서에서 사용되는 "천연 아미노산"은 전형적으로 L-이성질체, 즉, 알라닌("Ala" 또는 "A"), 아르기닌("Arg" 또는 "R"), 아스파라긴("Asn" 또는 "N"), 아스파르트산("Asp" 또는 "D"), 시스테인("Cys" 또는 "C"), 글루타민("Gln" 또는 "Q"), 글루탐산("Glu" 또는 "E"), 글리신("Gly" 또는 "G"), 히스티딘("His" 또는 "H"), 아이소류신("Ile" 또는 "I"), 류신("Leu" 또는 "L"), 라이신("Lys" 또는 "K"), 메티오닌("Met" 또는 "M"), 페닐알라닌("Phe" 또는 "F"), 프롤린("Pro" 또는 "P"), 세린("Ser" 또는 "S"), 트레오닌("Thr" 또는 "T"), 트립토판("Trp" 또는 "W"), 타이로신("Tyr" 또는 "Y") 및 발린("Val" 또는 "V")으로 자연에서 일반적으로 발견되는 20개의 아미노산이다.
일부 종양/조직-투과 펩타이드는, 예를 들어, 문헌[Ruoslahti 2017]에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는, 예를 들어, 뉴로필린-1(neuropilin-1: NRP-1)과 같은 수용체에 대한 결합을 통해 종양 혈관 및 종양 조직의 투과성을 향상시키는 능력과 관련된 C-말단 "C-말단 규칙"(C-end Rule: CendR) 서열 모티프(R/K)XX(R/K)를 포함할 수 있다. 이 서열에서 각각의 X는 독립적으로 아미노산이거나 또는 아미노산이 없다.
일부 경우에, 표적화 모이어티는 서열 Z1X1X2Z2를 포함하되, Z1은 R 또는 K이고, Z2는 R 또는 K이며, X1 및 X2는 각각 독립적으로 아미노산 잔기이거나 또는 아미노산 잔기가 없다. 일부 경우에, 펩타이드의 한쪽 또는 양쪽 말단은 예를 들어, J1Z1X1X2Z2, Z1X1X2Z2J2 또는 J1Z1X1X2Z2J2 구조에서와 같이 다른 아미노산을 포함하되, J1 및 J2는 각각 독립적으로 아미노산 서열(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 아미노산 잔기를 포함함) 또는 지방족 탄소 사슬이다. 지방족 탄소 사슬은 탄소 및 수소 원자를 임의의 적합한 순서, 예를 들어, 직쇄형 또는 분지형으로 함유하며, 포화 또는 불포화된다. 예를 들어, 한 세트의 실시형태에서, 지방족 탄소 사슬은 화학식, 예를 들어, -(CH2)n-을 갖는 직쇄 알킬 사슬이되, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 또 다른 양의 정수이다. 또한, 일부 경우에, 서열은 예를 들어, CJ1Z1X1X2Z2, CZ1X1X2Z2J2 또는 CJ1Z1X1X2Z2J2에서와 같이 시스테인 잔기로 끝난다.
CendR 펩타이드의 비제한적인 예는 Lyp-1, cLyp1, tLyp-1, iNGR, iRGD, RPARPAR, TT1, 선형 TT1, F3 또는 CRGRRST를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 선택적으로, 다른 아미노산도 펩타이드에 존재한다. Lyp-1은 서열 CGNKRTRGC(서열번호 1)를 갖는다. 일부 실시형태에서, 2개의 Cys 잔기는 이황화 브리지를 통해 서로 결합되어 원형 구조를 형성하므로, 따라서 cLyp-1이라고도 한다. 일부 경우에, 예를 들어, 절단된 Lyp-1 또는 tLyp-1(CGNKRTR)(서열번호 2)의 경우와 같이, Lyp-1 서열의 일부만이 존재한다. iNGR은 2개의 시스테인이 함께 연결된 서열 CRNGRGPDC(서열번호 4)를 갖는다. iRGD는 2개의 시스테인이 함께 연결된 서열(CRGDKGPDC)(서열번호 5)을 갖고, iRGD2는 서열 CRGDRGPDC(서열번호 6)를 갖는다. RPARPAR은 서열 RPARPAR(서열번호 7)을 갖는다. TT1은 2개의 시스테인이 함께 연결된 서열 CKRGARSTC(서열번호 8)를 갖는다. 선형 TT1은 서열 AKRGARSTA(서열번호 9)를 갖는다. F3은 서열 KDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKPKKAPAKK(서열번호 32)를 갖는다. CRGRRST는 서열 CRGRRST(서열번호 3)를 갖는다.
일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는 종양 내피 세포에서 발현되는 인테그린에 결합하는 인테그린-결합 RGD 서열 모티프를 포함한다. 선택적으로, 다른 아미노산도 펩타이드에 존재할 수 있다. 선형 및 고리형 RGD 펩타이드가 모두 표적화 모이어티로서 사용될 수 있다. RGD 펩타이드의 고리화는, 예를 들어, S-S 이황화, 티오에터 및 강성 방향족 고리와 같은 링커를 통해 수행될 수 있다. 일부 RGD 펩타이드 및 유도체는, 예를 들어, 문헌[Kapp, et al., 2017]에서 찾을 수 있다. RGD 펩타이드의 비제한적인 예는 RGD, RGDS(서열번호 14), GRGD(서열번호 15), GRGDS(서열번호 16), GRGDSP(서열번호 13), GRGDSPK(서열번호 26), GRGDNP(서열번호 27, GRGDTP(서열번호 28), RGD-4C(CDCRGDCFC, 서열번호 11), RGD-10(GARYCRGDCFDGR, 서열번호 12), 고리형 RGD 펜타펩타이드, 고리형 헥사펩타이드, 실렌지타이드(Cilengitide)(c(RGDf(NMe)V)) 또는 앞서 언급된 CendR 펩타이드 iRGD를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 고리형 RGD 펜타펩타이드는 화학식 c(RGDxX)를 특징으로 할 수 있되, x 잔기는, 예를 들어, 서열 c(RGDfV), c(RGDfK), c(RGDyK) 또는 c(RGDfC)와 같은 D-배열(αvβ3-인테그린 결합 친화도에 필수적임)의 방향족 아미노산이다.
임의의 위에 개시된 서열을 포함하는 펩타이드는 일부 실시형태에서, 특히 종양 조직에서, 세포- 또는 조직-투과 활성을 나타낸다. 한 세트의 실시형태는 일반적으로 예를 들어, 대상체에 비-전신적으로 투여될 때(예를 들어, 종양내, 비강, 국부, 복강내, 질, 직장, 경구, 폐, 안구 등), 또는 시험관내 또는 생체외, 예를 들어, 살아있는 세포 또는 조직에 투여될 때 세포- 또는 조직-투과 활성이 있는 나노 엔티티의 적어도 일부를 제공하기 위한 표적화 특성이 없는 세포-투과 펩타이드의 회합에 관한 것이다. 일부 경우에, 일부 나노캡슐 중합체(예를 들어, PSA, HA, PGA)는, 예를 들어, 공유 또는 비-공유 회합에 의해 세포-투과 펩타이드에 연결된다.
일부 세포-투과 펩타이드는, 예를 들어, 문헌[Zhang et al., 2016 및 Regberg et al., 2012]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 소정의 실시형태에 유용한 세포-투과 펩타이드는 TAT, mTAT(C-5H-TAT-5H-C), G3R6TAT, TAT(49-57), TAT(48-60), MPS, VP22, Antp, gH625, 아르기닌-풍부 CPP(예를 들어, 옥타아르기닌, 폴리아르기닌, 스테아릴-폴리아르기닌, HIV-1 Rev34-50, FHV coat35-49) 페네트라틴, 페네트라틴-Arg, 페네트라틴-Lys, SR9, HR9, PR9, H(7)K(R(2)), Pep-1, Pep-3, 트랜스포탄, 트랜스포탄10, pepFect, pVEC, JB577, TD-1, MPG8, CADY, YTA2, YTA4, SynB1, SynB3, PTD-4, GALA, SPACE 등으로부터 선택되지만, 이들로 제한되지 않는다.
세포-투과 펩타이드는 또한 표적화 모이어티와 커플링될 수 있다. 일부 비제한적인 예는 PEGA(CPGPEGAGC)(서열번호 18), CREKA(서열번호 19), RVG(YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG)(서열번호 20), DV3(LGASWHRPDKG)(서열번호 21), DEVDG(서열번호 22), ACPP-MMP-2/9(PLGLAG)(서열번호 23), ACPP-MMP-2(IAGEDGDEFG)(서열번호 24), R8-GRGD(서열번호 25), 페네트라틴-RGD 등이다.
본 발명의 소정의 실시형태에 유용한 표적화 모이어티는 펩타이드, 예를 들어, CendR 펩타이드(예를 들어, Lyp1, cLyp1, tLyp1, iRGD, iNGR, TT1, 선형 TT1, RPARPAR, F3 등), RGD 펩타이드, NGR 펩타이드; 단백질(예를 들어, 트랜스페린, 안키린 반복 단백질, 인슐린); 소분자(예를 들어, 폴산, 트라이페닐포스포늄, ACUPA, PSMA); 탄수화물 모이어티(예를 들어, 만노스, 글루코스, 갈락토스 및 이들의 유도체); 항체(나노바디, 항체 단편, 단일클론 항체, 어피바디 또는 다른 항체 포함) 및 압타머로부터 선택되지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 조성물은 표적화 모이어티를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 표적화 모이어티는 세포-투과 펩타이드 및/또는 종양/조직-투과 펩타이드를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 표적화 모이어티는 Lyp-1, tLyp-1 또는 cLyp-1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 중합체는 PSA 또는 HA이고, 표적화 모이어티는 tLyp-1이다.
중합체와 표적화 모이어티 사이의 결합
소정의 실시형태에서, 중합체(예를 들어, PSA, HA, PGA)의 일부는, 예를 들어, 공유적으로 표적화 모이어티에 결합된다. 중합체는, 예를 들어, 아미노알킬(C1-C4) 석신이미드 링커(C1, C2, C3 및 C4 포함) 또는 아미노알킬(C1-C4) 아미도-아이소프로필 링커(C1, C2, C3 및 C4 포함)와 같은 링커를 통해 직접적 또는 간접적으로 표적화 모이어티에 결합된다. 일부 경우에, 다른 아미노알킬석신이미드 또는 아미노알킬아미도-아이소-프로필 링커가 사용된다. 일부 실시형태에서, 표적화 모이어티는, 예를 들어, 결합을 위한 C 말단을 포함한다. 일부 경우에, 아미노알킬(C1-C4) 석신이미드 링커는 아미노에틸석신이미드 링커, 아미노프로필석신이미드, 아미노뷰틸석신이미드 등이다. 아미노알킬(C1-C4) 석신이미드 링커는, 예를 들어, EDC/NHS(1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 하이드로클로라이드/N-하이드록시석신이미드) 커플링 반응을 사용하여 말레이미드 모이어티를 단량체 단위(예를 들어, 시알산 단위) 상의 카복실산 모이어티에 부착하여 생성될 수 있다. 일부 경우에, N-아미노에틸 말레이미드 모이어티와 같은 N-아미노알킬(C1-C4) 말레이미드 모이어티는 단량체 단위 상의 카복실산 모이어티와 반응하여 아마이드 결합을 생성함으로써 말레이미드 모이어티를 중합체(예를 들어, PSA)에 연결한다. 아미노알킬(C1-C4) 아미도-아이소-프로필 링커는, 예를 들어, BOP/TBA(벤조트라이아졸-1-일옥시-트리스(다이메틸-아미노) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트/테트라-n-뷰틸암모늄 하이드록사이드)의 존재하에 아미노에틸메타크릴아마이드 또는 N-(3-아미노프로필)메타크릴아마이드를 사용하여 생성될 수 있다. 그런 다음, 말레이미드 모이어티 또는 메타크릴로일 모이어티는, 예를 들어, 마이클-타입 첨가를 통해, 펩타이드 내의 시스테인, 티올기 또는 기타 황-함유 모이어티와 반응하여 아미노에틸석신이미드 링커와 같은 아미노알킬(C1-C4) 석신이미드 또는 아미노알킬(C1-C4) 아미도-아이소-프로필 링커를 통해 중합체(예를 들어, PSA, HA, PGA)에 펩타이드를 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 중합체(예를 들어, PSA, HA, PGA) 아마이드기를 통해 직접적으로 표적화 모이어티에 결합된다. 아마이드기는, 예를 들어, 단량체 단위(예를 들어, 시알산 단위) 상의 카복실산 모이어티와 펩타이드 내의 라이신, 아르기닌 또는 기타 1차 아민-함유 모이어티를 반응시킴으로써 생성될 수 있으며, 특히 1차 아민기는 표적화 모이어티 상의 라이신 또는 아르기닌 아미노산에 있다. 일부 실시형태에서, 활성제는, 예를 들어, 카보다이이미드, N-하이드록시석신이미드 또는 DMTMM(4-(4,6-다이메톡시-1,3,5-트라이아진-2-일)-4-메틸모폴리늄 클로라이드)과 같은 중간체를 형성하기 위해 반응에 존재한다.
따라서, 한 세트의 실시형태는 일반적으로 중합체(예를 들어, PSA, HA, PGA) 상의 카복실레이트 모이어티를 아미노알킬(C1-C4) 말레이미드 및/또는 아미노알킬(C1-C4) 메타크릴아마이드와 반응시키고, 생성된 아미노알킬(C1-C4) 말레이미드 및/또는 아미노알킬(C1-C4) 메타크릴아마이드를 펩타이드 상의 시스테인기에 반응시켜 중합체-아미노알킬(C1-C4) 석신이미드-펩타이드 및/또는 중합체-아미노알킬(C1-C4) 아미도아이소프로필-펩타이드 조성물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 세트의 실시형태는 중합체(예를 들어, PSA, HA, PGA) 상의 카복실레이트 모이어티를 N-하이드록시석신이미드 또는 카보다이이미드와 반응시키고, 펩타이드 상의 라이신 또는 아르기닌기로 형성된 중간체와 반응시켜 중합체-아마이드-펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 표적화 모이어티는 정전기적으로 중합체에 결합된다. 또 다른 실시형태에서, 표적화 모이어티는 링커를 통해 중합체에 결합된다. 특정 실시형태에서, 중합체는 PSA 또는 HA이고, 표적화 모이어티는 tLyp-1이다.
소수성 모이어티에 연결된 중합체
예를 들어, PSA 또는 HA를 포함하는 외부 셸은 공유적으로, 정전기적으로 또는 다른 수단에 의해 소수성 모이어티에 연결될 수 있다. 소수성 모이어티는 알킬기, 예를 들어, 직쇄 알킬기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 소수성 모이어티는 적어도 2개의 탄소 원자를 포함한다. 다른 경우에, 소수성 모이어티는 적어도 3개의 탄소 원자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 소수성 모이어티는 C2-C24 직쇄 알킬기(예를 들어, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23 및/또는 C24)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 소수성 모이어티는 직쇄 C12 알킬기를 포함한다. 일부 경우에, 본 발명의 조성물은 중합체(예를 들어, PSA)에 공유적으로 결합된 지방족 탄소 사슬을 더 포함한다. 다른 경우에, 지방족 탄소 사슬은 C2-C24 지방족 탄소 사슬(예를 들어, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23 및/또는 C24)을 포함한다.
소수성 모이어티의 다른 예는 C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24 또는 다른 알킬기(예를 들어, 직쇄 또는 분지형 알킬기, 예를 들어, 아이소알킬기)를 포함한다. 일부 경우에, 소수성 모이어티는 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개 또는 적어도 24개의 탄소 원자를 포함한다. 소수성 모이어티는 포화 또는 불포화, 예를 들어, 하나 이상의 탄소-탄소 이중 또는 삼중 결합을 함유한다. 소수성 모이어티를 부착하기 위한 일부 기법은 WO2019086627A1에 기재되어 있다. 일부 경우에, 소수성 모이어티는 소수성 모이어티(예를 들어, 알킬 아민, 예컨대, C12에 대한 도데실아민)와 반응하기 전, 4차 암모늄염(예를 들어, 테트라뷰틸암모늄 하이드록사이드) 및 테트라플루오로보레이트(예를 들어, 2-브로모-1-에틸 피리디늄 테트라플루오로보레이트)에 의한 활성화를 사용하여 부착된다.
일 실시형태에서, 중합체의 적어도 일부는 소수성 모이어티에 연결된다. 또 다른 실시형태에서, 소수성 모이어티는 알킬기, 사이클로알케인, 담즙염 및 유도체, 테르페노이드, 테르펜, 테르펜-유래 모이어티 및 친유성 바이타민으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 실시형태에서, 소수성 모이어티는 C2-C24 직쇄 알킬기를 포함한다. 또 다른 추가의 실시형태에서, 소수성 모이어티는 C16 직쇄 알킬기를 포함한다.
또 다른 추가의 실시형태에서, 중합체는 HA이고, 소수성 모이어티에 연결된다. 특히, 소수성 모이어티는 C16 직쇄 알킬기를 포함한다. 나노 엔티티는 선택적으로 tLyp-1 표적화 모이어티를 포함할 수 있다.
계면활성제
나노 엔티티는 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다. 계면활성제의 예는 다음을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(폴리소르베이트 80; Tween 80®; HLB 15), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(Tween® 60, HLB 14.9 및 Tween 61®; HLB 9.6), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Tween 81®; HLB 10), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트라이스테아레이트(Tween 65®; HLB 10.5), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트라이올레이트(Tween 85®; HLB 11), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Tween® 20, HLB 16.7 및 Tween 21®; HLB 13.3), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트(Tween® 40, HLB 15.6); 페길화된 지방산 에스터 및 PEG와의 혼합물, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트(HLB 11.6), 폴리에틸렌 글리콜 스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜 스테아레이트 40(HLB 17), 폴리에틸렌 글리콜 스테아레이트 100(HLB 18.8), 폴리에틸렌 글리콜 다이라우레이트 400(HLB 9.7), 폴리에틸렌 글리콜 다이라우레이트 200(HLB 5.9), 폴리에틸렌 글리콜 모노팔미테이트(HLB 11.6), 마크로골 15 하이드록시스테아레이트(Kolliphor HS15®, 바스프), 폴리에틸렌 글리콜-15-하이드록시스테아레이트(HLB 14-16), D-알파-토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 석시네이트(TPGS; HLB 13.2), 트라이에탄올암모늄 올레이트(HLB 12), 소듐 올레이트(HLB 18), 소듐 콜레이트(HLB 18), 소듐 데옥시콜레이트(HLB 16), 소듐 라우릴 설페이트(HLB 40), 소듐 글리코레이트(HLB 16-18), 트라이에탄올아민 올레이트(HLB 12), 트래거캔스검(HLB 11.9) 및 소듐 도데실 설페이트(HLB 40); 폴록사머 124(HLB 16), 폴록사머 188(HLB 29), 폴록사머 237(HLB 29), 폴록사머 238(HLB 28), 폴록사머 278(HLB 28), 폴록사머 338(HLB 27) 및 폴록사머 407(HLB 22), 소르비탄 모노올레이트(Span® 80, HLB 4.3), 소르비탄 모노라우레이트(Span® 20, HLB 8.6), 소르비탄 모노스테아레이트(Span® 60, HLB 4.7), 소르비탄 트라이올레이트(Span® 85, HLB 1.8), 소르비탄 세스퀴올레이트(Span® 83, HLB 3.7), 소르비탄 모노팔미테이트(Span® 40, HLB 6.7), 소르비탄은 아이소스테아레이트(Span® 120, HLB 4.7), 라우로일 마크로골글리세라이드(예를 들어, Gelucire® 44/14, HLB 14 및 Labrafil® M2130CS, HLB 4), 스테아로일 마크로골글리세라이드(예를 들어, Gelucire® 50/13, HLB 13), 리놀레오일 마크로골글리세라이드(예를 들어, Labrafil® M2125CS, HLB 4), 올레오일 마크로골글리세라이드(Labrafil® M1944CS, HLB 4), 카프릴로카프로일 마크로골글리세라이드(Labrasol®, HLB 14), 레시틴(예를 들어, 달걀 레시틴, 대두 레시틴, 비-GMO 레시틴, 유채씨 레시틴, 해바라기 레시틴, 라이소레시틴 등), 인지질(예를 들어, 달걀 인지질, 대두 인지질, 합성 인지질, 수소화된 인지질, 페길화된 인지질, 스핑고지질, 포스파티딜콜린, 라이소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린 등), Phosal®, Phospholipon® 또는 임의의 이들 및/또는 다른 계면활성제의 임의의 조합. 일부 경우에, 계면활성제는 양이온성, 예를 들어, 벤제토늄 클로라이드, 벤잘코늄 클로라이드, CTAB(헥사데실트라이메틸암모늄 브로마이드), 세트리마이드, 테트라데실트라이메틸암모늄 브로마이드, 도데실트라이메틸암모늄 브로마이드 등이다. 일부 경우에, 양이온성 계면활성제는, 예를 들어, 헤드기로서 암모늄염을 함유한다. 예를 들어, 헤드기는 1차, 2차, 3차 또는 4차 암모늄염을 포함한다. 또한, 이러한 계면활성제가 모든 실시형태에서 필요한 것은 아님을 이해하여야 한다.
일부 실시형태에서, 계면활성제는 주로 내부 코어 및 외부 셸의 내부상에 위치된다.
특정 실시형태에서, 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(예를 들어, Tween 80®)이다. 특정 실시형태에서, 나노 엔티티는 계면활성제로서 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(예를 들어, Tween 80®) 및 마크로골 15 하이드록시스테아레이트(Kolliphor HS15®)를 함유한다.
나노캡슐의 조성물을 생성하는 방법
본 발명의 다양한 양태는 또한 일반적으로 본 명세서에 기재된 것과 같은 조성물, 예를 들어, 나노캡슐 또는 다른 나노 엔티티를 생성하는 시스템 및 방법에 관한 것이다.
예를 들어, PSA-기반 나노캡슐, HA-기반 나노캡슐, PGA-기반 나노캡슐과 같은 중합체성 나노캡슐이 다양한 기법에 의해 생성될 수 있다. 그 중 하나는 계면에서 극성 용매의 혼합을 포함하는 용매 치환 기법이다. 또 다른 기법은 유기 용매를 사용할 필요가 없는 자기유화 기법이다. 일부 경우에, 이는 중합체(예를 들어, PSA, HA, PGA, PGA-PEG, PASP, PASP-PEG, PLMA, PLA-PEG 등) 및 선택적으로 하나 이상의 수용성 계면활성제를 포함하는 수성 용액을 제조하고, 유성 용액(예를 들어, 오일 및 하나 이상의 계면활성제 및 유기 용매 등을 포함함)을 제조하고, 용액을 함께 혼합하는 것을 포함한다. 나노캡슐은 중합체, 예를 들어, PSA, HA, PGA, PASP와 수중유 에멀션의 계면에서 양전하를 띤 계면활성제의 상호작용으로 인해 형성되는 것으로 여겨진다. 그러나, 양이온성 계면활성제의 존재는 알킬 사슬/소수성 성분의 존재가 유성 나노액적에서 삽입에 의해 중합체 부착을 촉진하기 때문에 소수성으로 변형된 중합체를 사용할 때 필요하지 않을 수 있다.
약제학적 작용제는 나노 엔티티를 제조하거나 또는 미리 형성된 나노 엔티티와 함께 인큐베이션되기 전에 수상 또는 유상에 용해될 수 있다. 약제학적 작용제가 단일클론 항체와 같은 항체인 경우, 항체는 특히 나노캡슐을 제조하기 전에 수상 또는 유상(고농축인 경우)에 용해시켜 캡슐화된다.
예로서, 일 실시형태에서, 이는 중합체(예를 들어, PSA 또는 HA)를 포함하는 수상을 제조하는 단계; 소수성 화합물(예를 들어, 오일 및 하나 이상의 계면활성제 및 선택적으로 유기 용매 등을 포함함)을 포함하는 소수성 상을 제조하는 단계; 활성화된 돌연변이된 KRAS 단백질의 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 수상 또는 선택적으로 mAb 또는 단편이 고농축된 경우 소수성 상에 첨가하는 단계; 및 교반하에 수상 및 소수성 상을 혼합하는 단계를 포함한다. 이 방법은 본 명세서에서 "원-스텝 방법"으로 불릴 수 있다. 특정 실시형태에서, 소수성 화합물은 오일이고, 소수성 상은 또한 계면활성제를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 수상은 계면활성제를 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 중합체는 소수성 모이어티에 연결된다.
또 다른 실시형태에서, 방법은 유성 용액(예를 들어, 오일 및 하나 이상의 계면활성제 및 선택적으로 유기 용매 등을 포함함)을 제조하는 단계 및 이를 수상에 첨가하는 단계(또는 유상에 수상을 첨가하는 단계)를 포함한다. 수상은 중합체(예를 들어, PSA 또는 HA)를 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 수용성 계면활성제를 함유한다. 용액은 나노캡슐을 형성하기 위해 교반하면서 혼합된다. 일단 나노캡슐이 형성되면, 항체 또는 이의 단편을 포함하는 추가적인 수상이 인큐베이션에 의해 항체-로딩된 나노캡슐을 생성하기 위해 교반하에 첨가된다. 이 방법은 본 명세서에서 "2-단계 방법"으로 불릴 수 있다.
유기 용매가 첨가되면, 일부 경우에, 이는 완전히 또는 부분적으로 증발된다.
중합체는 또한 세포-투과 펩타이드 및/또는 종양/조직-투과 펩타이드와 같은 표적화 모이어티 또는 직쇄 알킬기와 같은 소수성 모이어티로 기능화될 수 있다.
예로서, PSA는 펩타이드 tLyp-1의 티올기와 PSA의 카복실레이트기간의 공유 결합에 의해 tLyp-1에 연결될 수 있다. 이 합성 접근법에는 첫째, 링커의 아민기를 통해 PSA의 카복실레이트기에 통합(카보다이이미드 화학을 사용)시키고, 둘째, 링커의 말레이미드기에 펩타이드의 티올기(시스테인 잔기)의 첨가를 통해(마이클 타입 첨가) 펩타이드 결합을 하는 2-단계 과정을 거치는 이종이작용성 링커 아미노에틸 말레이미드가 사용된다. 이 전략은 tLyp-1 펩타이드의 생물학적으로 활성인 기의 보존을 가능하게 하였다. 또한, 치환도는 쉽게 제어될 수 있다.
전형적으로, 항체와 같은 정제된 폴리펩타이드는 수성 상태에서 아주 미미하게만 안정하며, 화학적 및 물리적 분해를 거쳐 가공 및 보관 중에 생물학적 활성의 손실을 초래한다. 추가적으로, 수상에서 펩타이드 조성물은 탈아미드화 및 펩타이드 결합 절단과 같은 가수분해를 겪는다. 이러한 효과는 생물학적 활성에 기초하여 정의된 투여 범위 내에서 인간에게 투여되도록 의도된 치료적 활성 항체에 대한 심각한 문제를 나타낸다. 이러한 이유로, 생성된 나노 엔티티가 동결건조 후에도 기능을 유지할 수 있는지 여부를 테스트하였다.
따라서, 본 발명의 한 실시형태는 보관 동안 보존할 수 있는 동결건조의 추가적인 단계를 포함하는 나노 엔티티를 생산하는 방법에 관한 것이다. 일부 경우에, 동결건조 중에 동결방지제를 사용할 필요는 없다. 일부 실시형태에서, 나노 엔티티가 동결건조물의 재구성 동안 응집체를 형성하지 않기 때문에, 동결건조 전에 콜로이드 시스템을 희석할 필요가 없다. 일부 경우에, 하나 이상의 당, 예를 들어, 동결방지제 효과를 나타내는 당을 첨가하는 것이 가능하다. 동결방지제의 예는 다음을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다: 트레할로스, 글루코스, 수크로스, 만니톨, 말토스, 폴리바이닐 피롤리돈(PVP), 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 프로필렌 글리콜, 2-메틸-2,4-펜테인다이올(MPD), 라피노스, 덱스트란, 프럭토스, 스타키오스 등. 일부 경우에, 동결방지제 또는 기타 첨가제는, 예를 들어, pH를 제어하기 위한 완충액으로서 다른 효과가 있다. 동결건조된 형태에서, 나노 엔티티는 장기관 보관되며, 예를 들어, 물을 첨가하여 재생될 수 있다.
항체 또는 이의 단편과 다른 약제학적 작용제/약물의 조합
특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 단편은 다른 약제학적 작용제/약물과 조합된다. 이들은 실시형태에 따라 나노 엔티티의 내부 및/또는 표면에 위치될 수 있다.
약제학적 작용제는 약리학적 활성을 가지고/가지거나 항체 또는 이의 단편의 효과를 향상시킬 수 있고/있거나, 질환의 진단, 치료, 완화, 치료 또는 예방에 다른 직접적인 효과를 가질 수 있다.
종양 세포의 증가된 대사 요구사항을 고려할 때, 소정의 종양 유형이 세포외 및 세포내 공급원 모두에서 영양소를 제거하는 메커니즘을 발달시킨 것은 놀라운 일이 아니다. 특히, RAS-유발 암은 다양한 대사산물을 재활용할 수 있는 여러 가지 다양한 대사 적응(metabolic adaptation)을 갖는다. 이는 두 가지 주요 목적을 제공한다; 1) 대사 유연성 및 효율성을 제공하고; 2) 생합성 전구체의 적절한 이용 가능성을 보장한다. 중요하게는, 이들 제거 경로는 이들 암의 대사에 중요하며, 치료 기회를 제공할 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 항-KRAS 항체는, 예를 들어, 클로로퀸, 글루코스 수송체(glucose transporter: GLUT) 저해제, 락테이트 데하이드로게네이스 저해제 및 당분해 저해제와 같은 거대자가포식 저해제(macroautophagy inhibitor)와 조합된다.
KRAS는 암이 증식하고 생존할 수 있도록 하는 피드백 루프에 대한 많은 기회를 제공하는 복잡한 네트워크의 중심 절(central node)이다. 따라서, 특정 실시형태에서, 항-KRAS 항체는 잠재적으로 종양 퇴행의 측면에서 상승 효과를 발휘하고, 항-종양 면역을 생성하거나 또는 각 약물 단독과 비교하여 저항성을 극복하는데 기여하기 위해, IGFR, mTOR, RAF, MEK, PIK3, EFGR/ERBB2, SHP2 또는 면역 관문 저해제에 대한 것과 같은 다른 표적화된 요법과 조합된다.
특정 실시형태에서, 추가의 약제학적 작용제는, 예를 들어, 파클리탁셀 또는 도세탁셀과 같은 함암 약물이다.
약제학적 작용제는 시스템 성분의 총 건조 중량에 대해 대략 50 wt%까지 존재한다. 그러나, 적절한 비율은 혼입되는 약제학적 작용제, 사용되는 지시, 투여의 효율성 등과 같은 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 일부 경우에, 약제학적 작용제는 예컨대, 대략 10 wt%까지 또는, 예컨대, 대략 5 wt%까지 또는, 예컨대, 대략 2 wt%까지 또는, 예컨대, 대략 1 wt%까지 또는, 예컨대, 대략 0,5 wt%까지 또는, 예컨대, 대략 0,1 wt%까지 존재한다. 소정의 실시형태에서, 하나 이상의 약제학적 작용제가 존재하며, 이는 혼입되는 활성 약제학적 성분의 특성에 따라 동일한 용액에 용해되거나 또는 별도로 용해될 수 있다.
약제학적 조성물 및 투여 형태
또 다른 양태는 본 명세서에 논의된 나노 엔티티 및 특히 나노캡슐을 포함하는 조성물을 살아있는 유기체에 투여하는 방법을 제공한다. 투여될 때, 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 제형으로서 치료적 유효량으로 적용된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 제형이 유해한 효과를 일으키지 않으면서 살아있는 유기체에 투여하는데 필요한 형태와 양립할 수 있는 작용제 또는 부형제를 함유함을 의미한다. 본 발명의 임의의 조성물은 치료적으로 유효한 용량으로 살아있는 유기체에 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 "치료적으로 유효한" 또는 "유효한"은 치료 중인 특정 병태의 발병을 지연, 이의 진행을 저해, 이의 발병 또는 진행을 완전히 정지, 이를 진단하거나 또는 그렇지 않으면 의학적으로 바람직한 결과를 달성하는데 필요한 양을 의미한다. 살아있는 유기체에 투여될 때, 유효량은 치료 중인 특정 병태 및 목적하는 결과에 따라 달라질 것이다. 치료적으로 유효한 용량은 당업자에 의해 결정된다. 본 발명의 일부 실시형태는 일반적으로 약제의 제조를 위한 본 명세서에 개시된 바와 같은 조성물의 용도에 관한 것이다.
임의의 의학적으로 허용 가능한 방법이 살아있는 유기체에 조성물을 투여하기 위해 사용된다. 투여는 치료될 병태에 따라 국소적(즉, 특정 영역, 생리학적 시스템, 조직, 장기 또는 세포 유형에 대해) 또는 전신적이다. 예를 들어, 조성물은 경구로 또는 질, 직장, 협측, 폐, 국부, 비강, 경피, 종양내, 복강내와 같은 다른 기법을 통해, 비경구 주사 또는 이식을 통해, 외과적 투여 또는 본 발명의 조성물에 의해 목표가 달성되는 임의의 다른 투여 방법을 통해 투여된다. 경구 투여에 적합한 조성물은 각각 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유하는 경질 또는 연질 캡슐, 알약, 사쉐, 정제, 트로키 또는 로젠지와 같은 별개의 단위로 제공된다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 다른 경구 조성물은 시럽, 엘릭서 또는 에멀션과 같은 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액을 포함한다. 또 다른 세트의 실시형태에서, 조성물은 식품 또는 음료를 보강하기 위해 사용된다. 직장 투여는 일부 실시형태에서, 예를 들어, 관장제, 좌약 또는 폼의 형태로 사용될 수 있다.
한 세트의 실시형태에서, 조성물의 투여는 비경구, 종양내 또는 경구이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 주사 또는 주입에 의해 투여된다. 일 실시형태에서, 주사는 종양내, 복강내, 피하, 근육내 또는 정맥내 주사로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 경막내 주사 또는 주입을 통해 투여된다.
본 발명의 소정의 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 투여는 소정의 기간, 예를 들어, 수 시간, 수 일, 수 주, 수개월 또는 수 년에 걸쳐 조성물에 순차적으로 노출되도록 설계된다. 이는 위에 기재된 방법 중 하나에 의해 본 발명의 조성물을 반복 투여함으로써 달성된다. 조성물의 투여는 단독으로 또는 다른 치료적 작용제 및/또는 조성물과 조합하여 투여될 수 있다.
특정 실시형태에서, 조성물의 투여는 정맥내, 종양내, 복강내, 피하 또는 흡입에 의한 것이다. 특히, 투여는 정맥내이다.
본 발명의 소정의 실시형태에서, 조성물은 예를 들어, 중합체 방출 시스템에 혼입되거나 또는, 예를 들어, 용해된 형태 또는 콜로이드 형태로 액체에 현탁된 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 사용하기에 적합한 약제학적으로 허용 가능한 담체는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 투여될 활성 화합물(들)의 생물학적 활성의 유효성을 현저하게 방해하지 않지만, 예를 들어, 사용하기 전 조성물 내의 활성 화합물(들)을 안정화 또는 보호하기 위해 제형 성분으로서 사용되는 무독성 물질을 지칭한다. 용어 "담체"는 천연 또는 합성인 유기 또는 무기 성분을 나타내며, 본 발명의 하나 이상의 활성 화합물이 본 명세서에 논의된 바와 같은 조성물의 적용을 용이하게 하기 위해 조합된다. 담체는 목적하는 약제학적 효능을 실질적으로 손상시키는 상호작용이 없도록 하는 방식으로 본 발명의 하나 이상의 조성물과 함께 혼합되거나 또는 그렇지 않으면 서로 혼합된다. 담체는 용도에 따라 가용성 또는 불용성이다. 잘 알려진 담체의 예는 유리, 폴리스타이렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀레이스, 천연 및 변성 셀룰로스, 폴리아크릴아마이드, 아가로스 및 마그네타이트를 포함한다. 담체의 성질은 가용성 또는 불용성일 수 있다. 당업자는 다른 적합한 담체를 알고 있거나 또는 일상적인 실험만을 사용하여 이를 확인할 수 있을 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 활성 화합물과 함께 사용되는 염, 담체, 완충제, 유화제, 희석제, 부형제, 킬레이트제, 충전제, 건조제, 항산화제, 항균제, 방부제, 결합제, 증량제, 실리카, 가용화제 또는 안정화제와 같은 제형 성분과 함께 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제형이 액체인 경우, 담체는 용매, 부분 용매 또는 비-용매일 수 있고, 수성 또는 유기계일 수 있다. 적합한 제형 성분의 예는 희석제, 예컨대, 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 락토스, 카올린, 칼슘 포스페이트 또는 소듐 포스페이트; 과립제 및 붕해제, 예컨대, 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예컨대, 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석; 시간-지연 물질, 예컨대, 글리세롤 모노스테아레이트 또는 글리세롤 다이스테아레이트; 현탁제, 예컨대, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 소듐 알기네이트, 폴리바이닐피롤리돈; 분산제 또는 습윤제, 예컨대, 레시틴 또는 다른 자연 발생적 포스파타이드; 증점제, 예컨대, 세틸 알코올 또는 밀랍; 완충제, 예컨대, 아세트산 및 이의 염, 시트르산 및 이의 염, 붕산 및 이의 염 또는 인산 및 이의 염; 또는 방부제, 예컨대, 벤잘코늄 클로라이드, 클로로뷰탄올, 파라벤 또는 티메로살을 포함한다. 적합한 담체 농도는 단지 일상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에 논의된 바와 같은 조성물은 정제, 캡슐, 엘릭서, 분말, 과립, 연고, 용액, 증착제, 흡입제 또는 주사제와 같은 고체, 반-고체, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제형화될 수 있다. 당업자는 다른 적합한 제형 성분을 알고 있거나 또는 단지 일상적인 실험을 사용하여 이를 확인할 수 있을 것이다.
제제는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액 및 에멀션을 포함하며, 이는 소정의 실시형태에서 살아있는 유기체의 혈액과 등장성일 수 있다. 비-수성 용매의 예는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대, 올리브유, 참깨유, 코코넛유, 땅콩유, 미네랄 오일, 주사용 유기 에스터, 예컨대, 에틸 올레이트, 또는 합성 모노 또는 다이-글리세라이드를 포함하는 고정유이다. 수성 담체는 식염수 및 완충 매질을 포함하여 물, 알코올/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 소듐 클로라이드 용액, 1,3-뷰탄다이올, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 젖산 링거 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 체액 및 영양 보충제, 전해질 보충제(예컨대, 링거 덱스트로스에 기반한 것들) 등을 포함한다. 예를 들어, 항균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체 등과 같은 방부제 및 다른 첨가제도 또한 존재한다. 당업자는 과도한 실험에 의지하지 않고 본 명세서에 논의된 바와 같은 조성물을 제조하고 제형화하기 위한 다양한 매개변수를 쉽게 결정할 수 있다.
본 발명은 또한 선택적으로, 예를 들어, 암의 치료를 위한 조성물의 사용에 대한 설명서를 포함하는 키트에 임의의 위에 언급된 조성물을 제공한다. 이전에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 기법, 예를 들어, 경구 또는 정맥내로 조성물을 투여하기 위한 설명서가 또한 제공될 수 있다. 키트는 전형적으로 본 발명의 조성물 중 임의의 하나 또는 이와 이전에 기재된 바와 같은 다른 성분의 조합을 포함하는 패키지를 정의한다. 키트는 또한 조성물을 혼합, 희석하거나 또는 살아있는 유기체에 투여하기 위한 용기뿐만 아니라 하나 이상의 용매, 계면활성제, 방부제 및/또는 희석제(예를 들어, 정상적인 식염수(0.9% NaCl) 또는 5% 덱스트로스)가 담긴 다른 용기를 포함할 수 있다. 키트의 조성물은 액체 용액 또는 건조 분말로 제공될 수 있다. 조성물이 건조 분말로 제공될 때, 조성물은 적합한 용매의 첨가에 의해 재구성될 수 있다. 액체 형태의 조성물이 사용되는 실시형태에서, 액체 형태는 농축되거나 또는 바로 사용할 수 있다. 용매는 조성 및 사용 또는 투여 방식에 따라 달라질 것이다.
의학적 적용
본 발명의 양태는 의학에 사용하기 위한(즉, 약제로서) 나노 엔티티의 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일 양태는 KRAS 유전자의 돌연변이와 관련된 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 나노 엔티티를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 대안적으로, 본 발명은 KRAS 유전자의 돌연변이와 관련된 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다. 대안적으로, 본 발명은 본 발명의 조성물을 KRAS 유전자의 돌연변이와 관련된 질환의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, KRAS 유전자의 돌연변이와 관련된 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료" 또는 "의 치료"는 소정의 질환 또는 장애에 대한 가능성을 감소시키거나, 소정의 질환 또는 장애의 발생을 감소시키고/시키거나 소정의 질환 또는 장애의 중증도를, 특히, 대상체가 더 이상 불편함 및/또는 이로 인한 변경된 기능을 겪지 않는 정도로 감소시키는 것을 지칭한다. 예를 들어, "치료하는"은 대상체에 투여될 때 소정의 질환 또는 장애가 발생하는 것을 예방하고/하거나 소정의 질환 증상, 징후 또는 원인을 치료 또는 완화시키기 위한 요법의 능력을 지칭할 수 있다. "치료하는"은 또한 적어도 하나의 임상적 증상을 완화 또는 감소시키고/시키거나 병태의 진행을 저해 또는 지연시키고/시키거나 질환 또는 질병의 발병의 예방 또는 지연시키는 것을 지칭한다. 따라서, 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "의 치료"(또는 문법적으로 동등한 용어)는 예방적 및 치료적 치료 양생법 모두를 지칭한다. 특히, 본 명세서에서 사용되는 "치료"는 질환의 초기 또는 조기 단계에서의 투여를 포함하는 KRAS 유전자의 돌연변이와 관련된 질환을 앓고 있는 대상체에 본 발명에 따른 조성물을 투여하는 것에 관한 것이며, 여기서 목적은 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 장애를 예방하거나 늦추는(경감) 것이다. 본 개시내용은 일반적으로 치료적 이점 또는 목적하는 임상적 결과를 제공하는 방법 및 조성물을 제공한다. 치료적 이점은 반드시 특정 질환 또는 장애에 대한 치료가 아니라, 오히려 가장 전형적으로 질환 또는 장애의 완화 또는 증가된 생존, 질환 또는 장애의 제거, 질환 또는 장애와 관련된 증상의 감소 또는 완화, 1차 질환 또는 장애의 발생으로 인한 2차 질환, 장애 또는 병태의 예방 또는 완화, 질환의 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 일시적 완화(palliation) 및 검출 가능하거나 또는 검출 가능하지 않은 것에 관계없이 관해(부분적이거나 전체적이거나) 및/또는 질환 또는 장애의 예방을 포함하는 결과를 포함한다. 치료는 또한 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방", "예방하는" 또는 "예방하다"는 본 발명에 따른 조합 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 투여 시점에 KRAS 유전자의 돌연변이와 관련된 질환을 가질 가능성이 있는 것으로 진단되지 않았지만, 일반적으로 상기 질환이 발생할 것으로 예상되거나 또는 상기 질환의 위험이 증가된 것으로 예상되는 대상체에 투여하는 것에 관한 것이다. 예방은 상기 질환의 출현을 피하기 위한 것이다. 예방은 완전할 수 있다(예를 들어, 질환의 완전한 부재). 예방은 또한 부분적일 수 있어, 예를 들어, 대상체에서 질환의 발생이 본 발명의 조성물의 투여 없이 발생했을 것보다 적다. 예방은 또한 임상적 병태에 대한 감수성의 감소를 지칭한다.
용어 "대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자"는 진단, 예후예측 또는 요법이 필요한 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 포함한다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 농장 동물 및 동물원 또는 반려 동물, 예컨대, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 젖소 등을 포함한다. 본 발명의 특정한 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 본 발명의 보다 특정한 실시형태에서, 대상체는 인간, 특히 임의의 인종 및 성별의 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 미경험(naive) 대상체이다. 미경험 대상체는 요법을 투여받지 않은 대상체이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 KRAS 유전자의 돌연변이와 관련된 질환을 치료하기 위한 요법 및/또는 1회 이상의 용량의 치료제를 투여 받았다.
종양원성 RAS 돌연변이는 췌관 선암종(PDAC), 결장직장 선암종(CRC), 폐 선암종 및 위 선암종을 포함하는 다양한 암의 유도에 기여한다. 가장 빈번하게 돌연변이되는 종양 유전자 패밀리를 대표하는 돌연변이된 RAS 유전자는 인간 종양의 대략 25%에 존재한다. KRAS 내의 돌연변이는 모든 RAS 패밀리 종양원성 돌연변이의 85%를 차지한다.
특정 실시형태에서, KRAS 유전자의 돌연변이와 관련된 질환은 암이다. 보다 특정한 실시형태에서, 암은 혈액학적 악성종양, 예컨대, 백혈병이다. 용어 "혈액학적 악성종양"은 혈액, 골수 및 림프절에 영향을 미치며, 림프종(lymphoma), 골수종(myeloma) 및 백혈병을 포함하는 암의 유형을 지칭한다. KRAS 유전자가 돌연변이된 혈액학적 악성종양의 예는 급성 골수성 백혈병(myelogenous leukemia: AML), 핵심 결합 인자 급성 골수성 백혈병(core binding factor acute myeloid leukemia), 연소성 골수단구성 백혈병(juvenile myelomonocytic leukemia: JMML), 다발성 골수종(multiple myeloma), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome) 및 자가면역 림프증식성 증후군(autoimmune lymphoproliferative syndrome)이다.
다른 특정 실시형태에서, 암은 고형 종양이다. "고형 종양" 또는 고형 암은 혈액, 골수 또는 림프 세포 이외의 신체 조직 세포의 비정상적인 성장에 의해 형성된 신생물(세포의 새로운 성장) 또는 병변(해부적 구조의 손상 또는 생리학적 기능의 장애)이다. 고형 종양은 간, 결장, 유방 또는 폐와 같은 다양한 조직 유형으로부터 유래할 수 있는 비정상적인 세포 덩어리로 구성되며, 처음에는 세포 기원의 기관에서 성장한다. 그러나, 이러한 암은 질환의 진행 단계에서 전이성 종양 성장을 통해 다른 장기로 퍼질 수 있다. 고형 종양의 예는 암종, 육종(sarcoma), 생식세포종(germinoma) 및 모세포종(blastoma)이다.
특정 실시형태에서, 암은 선암종이다. 일부 실시형태에서, 암은 위 암(특히 위 선암종), 담관암종, 폐암(특히, 폐 선암종), 결장직장 암(특히, 결장직장 선암종(CRC)), 췌장암(특히, 도관 선암종(PDAC)), 피부 흑색종(skin cutaneous melanoma), 자궁체부 자궁내막 암종(uterine corpus endomietriod carcinoma), 자궁 암육종(uterine carcinosarcoma), 갑상선 암종, 위 선암종, 방광 요로상피 암종(bladder urothelial carcinoma), 자궁경부 선암종, 두경부 편평세포 암종, 식도 선암종이다.
G12V 및 G12D KRAS 치환은 췌장 선암종(각각 30% 및 51%) 및 결장직장 선암종(각각 27% 및 45%)에서 가장 흔히 관찰되는 돌연변이 중 하나이며, 불량한 예후예측과 관련이 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 암은 췌장 선암종 및 결장직장 선암종이다.
특정 실시형태에서, 질환은 KRAS 유전자의 G12의 치환과 관련이 있다. 보다 구체적으로, 질환은 비-소세포 폐암종, 결장직장 암종, 악성 고형 종양, 급성 골수성 백혈병, 편평세포 폐 암종, 결장직장 선암종, 췌관 선암종, 직장 선암종, 소세포 폐암종, 신경교종, 갑성선 선암종, 다발성 골수종 및 골수이형성 증후군이다.
특정 실시형태에서, 치환은 G12V이고, 질환은 결장직장 선암종, 비-소세포 폐암종, 췌관 선암종, 자궁체 신생물 및 난소 신생물이며, 이들은 가장 유병률이 높다.
특정 실시형태에서, 치환은 G12C이고, 질환은 비-소세포 폐암종, 결장직장 선암종, 미지의 원발성 선암종, 자궁체 신생물 및 미지의 원발성 암이며, 위에 언급된 것들은 가장 유병률이 높다.
특정 실시형태에서, 치환은 G12D이고, 질환은 결장직장 선암종, 췌관 선암종, 비-소세포 폐암종, 자궁체 신생물 및 난소 신생물이 가장 유병률이 높다.
다른 실시형태에서, KRAS 돌연변이와 관련된 질환은 누난 증후군(Noonan syndrome: NS), 심장-얼굴-피부 증후군(Cardiofaciocutaneous syndrome: CFC) 및 표피 모반(epidermal nevus)이다. KRAS 유전자의 생식세포계열 돌연변이는 또한 주요 특징이 심장-얼굴-피부 증후군, 및 누난 증후군과 코스텔로 증후군(Costello syndrome)이라는 두 가지 관련 장애와 겹치는 장애를 유발한다. 이러한 병태는 KRAS 돌연변이-관련 표현형으로 기재되었다.
일 양태에서, 본 발명은 약물 전달 응용을 위한 나노 엔티티에 관한 것이다. 예를 들어, 이러한 나노 엔티티는 대상체가 앓고 있는 종양에 도달하도록 대상체에 전달된다. 나노 엔티티는 종양 세포 내로 전달되며, 선택적으로 Lyp-1 또는 tLyp-1과 같은 세포- 또는 종양/조직-투과 펩타이드 또는 본 명세서에서 논의된 다른 펩타이드로서의 능력도 갖는 표적화 모이어티에 의해 촉진된다. 일단 전달되면, 나노 엔티티는 표적 세포, 예를 들어, 암 세포 및 전이성 암 세포에 접근하고, 거기에 포함된 약물(즉, 항-KRAS 항체)을 방출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 양태는 본 발명에 따른 나노 엔티티를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 항-KRAS 항체 또는 이의 단편을 표적 세포에 전달하는 방법에 관한 것이되, 나노 엔티티는 표적 세포의 세포막을 가로지른다. 특히, 표적 세포는 암 세포이다. 본 명세서에 제공된 실시예에 따르면, 나노 엔티티는 항-KRAS 항체 또는 이의 단편의 세포내 전달을 유발하는 세포에 침투할 수 있다. 따라서, 본 발명의 양태는 세포내 전달, 특히, 생체내 세포내 전달을 위한 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다. 또한, 항체 또는 이의 단편이 있는 나노 엔티티는 세포 내에서 생물학적 기능, 예를 들어, 세포 증식의 감소를 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 나노 엔티티를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포에서 세포 증식을 감소시키는 방법을 제공한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 설명 및 청구범위 전체에 걸쳐 단어 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 이의 변형은 다른 기술적 특징, 첨가제, 성분 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다. 본 발명의 추가적인 목적, 이점 및 특징은 설명의 검토시 당업자에게 명백해지거나 또는 본 발명의 실시에 의해 학습될 수 있다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 특정한 및 바람직한 실시형태의 모든 가능한 조합을 포함한다. 하기 실시예 및 도면은 본 발명을 제한하려는 의도 없이 예시의 목적으로 본 명세서에 제공된다.
실시예
실시예 1: 표적 단백질과 특이적으로 상호작용하는 항-KRAS mAb의 능력
이 실시예는 표적 단백질과 특이적으로 상호작용하는 항-KRAS 단일클론 항체의 능력을 보여준다. 이러한 능력을 조사하기 위해 2개의 상이한 연구를 수행하였다:
(i) 하이브리도마 기술에 의해 이전 세대에 사용된 합성 항원 펩타이드와 항-KRAS 단일클론 항체의 상호작용. 이들 펩타이드는 KRAS 단백질의 아미노산 서열(5번 위치 내지 16번 위치)에 해당한다. 펩타이드를 표 2(캐러베이 바이오켐(Karebay Biochem), 미국 소재); CoA에 따라 95% 초과의 순도)에 도시된 서열에 따라 합성하였고, 실용적인 이유로 운반 단백질인 소 혈청 알부민(bovin serum albumin: BSA)(바이오진스(Biogenes), 독일 소재)에 추가로 접합하였다. 일단 BSA에 접합된 펩타이드에 부여된 내부 코드는 또한 하기 표 2에 나타나 있다.
(ii) 항-KRAS 단일클론 항체와 상이한 재조합 인간 돌연변이된 KRAS 단백질의 상호작용.
(i) 항-KRAS 단일클론 항체와 합성 항원 펩타이드의 상호작용
ELISA 테스트를 위한 펩타이드-BSA 접합체의 제조: 말단 시스테인 잔기를 합성 동안 펩타이드에 첨가하였고, 설피드릴기를 사용하여 다음 2-단계 방법에 의해 펩타이드를 BSA에 접합시켰다:
1. BSA의 말레일화: 1㎎의 가교제 SMCC(50　㎎/㎖, N-메틸-2-피롤리돈, NMP 중)를 1㎖의 BSA 용액(10　㎎/㎖, 0.1mM NaHCO3 중, pH 8.3)에 첨가하였다. 실온(RT)에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, PBS로 미리 평형화된 Sephadex G-50 - 칼럼(1.5×14㎝)을 사용하여 용액을 탈염하였다.
2. 말레일화된 BSA의 접합: 50㎕의 펩타이드 용액(10　㎎/㎖, 이중 증류수 중)을 1㎖의 말레일화된 BSA(1.0　㎎/㎖, PBS 중)에 첨가하고, 실온에서 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 실온에서 추가로 4시간 동안 인큐베이션하였다. 미반응 말레이미드기에 2-머캅토에탄올을 10mM의 최종 농도로 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 차단하였다. 마지막으로, 접합체를 4℃(MW-컷오프 10,000)에서 3×500 부피의 PBS에 대해 투석하였다.
Figure pct00011
ELISA 플레이트를 항원 펩타이드 820940-BSA(G12V), 항원 펩타이드 820941-BSA(G12D) 및 항원 펩타이드 820942-BSA(G12C)를 4 ㎍/㎖(50㎕/웰)로 코팅하고, 2차 항체로서 염소 항-마우스 IgG Fc-특이성을 사용하는 알칼리 포스파테이스-매개성 간접 ELISA를 사용하여 처리하였다. 결과는 기질 인큐베이션 15분 후의 OD405nm를 나타낸다.
모든 항-KRAS 항체(클론 DWP, 클론 D113 및 클론 D210)는 상응하는 항원 펩타이드와 상호작용하였다. 상응하는 항원 펩타이드 820941-BSA(G12D)로 적정된 클론 D113 및 D210에 대해 얻어진 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Figure pct00012
(ii) 항-KRAS 단일클론 항체와 상이한 재조합 인간 돌연변이된 KRAS 단백질의 상호작용
다음으로 ELISA 플레이트를 재조합 KRAS(G12V) 돌연변이된 단백질(시그널켐(SignalChem), 캐나다 소재, 카탈로그 번호 R06-32CH)을 2 ㎍/㎖(50㎕/웰)로 코팅하고, 2차 항체로서 염소 항-마우스 IgG Fc-특이성을 사용하는 알칼리 포스파테이스-매개성 간접 ELISA를 사용하여 처리하였다. 결과를 기질 인큐베이션 15분 후의 OD405nm을 나타낸다.
ELISA 플레이트를 또한 재조합 KRAS(G12D) 돌연변이된 단백질(시노 바이올로지컬(Sino Biological), 카탈로그 번호 12259-H07E1)을 5 ㎍/㎖(50㎕/웰)로 코팅하고, 2차 항체로서 염소 항-마우스 IgG(H+L), HRP 접합체를 사용하여 서양고추냉이 퍼옥시데이스-매개성 간접 ELISA를 사용하여 처리하였다. 결과는 기질 인큐베이션 25분 후 OD405nm를 나타낸다.
모든 항-KRAS 항체(클론 DWP, 클론 D113 및 클론 D210)는 상응하는 돌연변이된 표적 단백질과 상호작용하였다.
추가적으로, 항-KRAS 항체(서브클론 DWP, D113 및 D210)의 특이성은 G12V, G12D 및 G12C KRAS 돌연변이(4 ug/mL)에 상응하는 상이한 항원 펩타이드 및 재조합 G12V KRAS 단백질(5 ㎍/㎖)도 사용하여 테스트하였다.
하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 각 클론은 상응하는 표적 펩타이드 및/또는 단백질과만 상호작용할 수 있었다.
Figure pct00013
결론:
항-KRAS 항체(클론 DWP, D113 및 D210)는 상응하는 항원 펩타이드(하이브리도마 기술에 의한 생성을 위해 사용됨) 및 상응하는 재조합 인간 KRAS 표적 단백질과도 선택적으로 상호작용할 수 있다. 따라서, DWP는 820940-BS 펩타이드(G12V) 및 재조합 KRAS G12V 단백질과만 상호작용하는 반면; D113 및 D210은 820941-BS 펩타이드(G12D) 및 재조합 KRAS G12D 단백질과만 상호작용하였다.
실시예 2: 가용성 항원(KRAS G12D 단백질)에 대한 2개의 항-KRAS mAb(D210 및 D113)의 KD 값의 결정
이 실시예는 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance: SPR) 기술(지이 비아코어(GE Biacore) 8K)을 통해 가용성 항원(KRAS G12D 단백질)에 대한 2개의 항-KRAS 단일클론 항체(D210 및 D113)의 KD 값의 결정을 보여준다.
KD는 친화도에 반비례하는 평형 해리 상수이고: KD 값이 낮을수록 항체의 친화도가 높아진다. 항체 친화도는 에피토프가 항체 상의 개별 파라토프(항원-결합 부위)에 결합하는 강도를 지칭한다. 고친화성 항체는 항원에 빠르게 결합하고, 상이한 조건하에서 이러한 결합을 더욱 쉽게 유지한다. 대부분의 항체는 낮은 마이크로몰(10-6)에서 나노몰(10-7 내지 10-9) 범위의 KD　값을 갖는다. 고친화성 항체는 일반적으로 낮은　나노몰 범위(10-9)로 간주된다.
간략하게는, 정의된 농도의 KRAS G12D 단백질을 항-KRAS 항체-코팅된 센서 칩(단백질 A 센서 칩)에 흘리고, 시간 경과에 따른 반응을 포착하였으며, 이는 상호작용 및 회합/해리 주기의 진행을 보여주었다. 반응은 굴절률(refractive index)의 변화를 측정하고, 이는 센서 표면에 가까운 질량의 변화와 관련이 있다. 따라서, 반응은 항체와 상호작용하는 항원 분자의 수에 비례한다. 다양한 농도의 KRAS G12D 단백질을 연속적으로 테스트한 후(재생은 한 농도에서 다른 농도로 칩으로부터 남아있는 모든 결합 단백질을 제거하기 위해 수행됨), 동역학 매개변수 및 친화도를 BIA-평가 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. 항-KRAS 항체 D113 및 D210의 KD(M)는 각각 4.98×10-9 및 3.75×10-9이었다.
결론:
항-KRAS G12D 항체인 D210 및 D113은 모두 낮은 나노물 범위에서 유사한 KD 값을 나타내어, 표적(KRAS G12D 단백질)에 대한 높은 친화도를 나타낸다.
실시예 3: 항-KRAS mAb의 효율적인 회합 및 전달을 위한 다양한 중합체성 나노캡슐의 제형
이 실시예는 항-KRAS 단일클론 항체(mAb)의 효율적인 회합 및 전달을 위한 다양한 중합체성 나노캡슐의 제형을 보여준다. 중합체-형성 셸은 예를 들어, tLyp-1과 같은 표적화 및/또는 종양/조직-투과 리간드로 공유적으로 또는 정전기적으로 추가로 기능화될 수 있는 생분해성 폴리산으로 제조될 수 있다. 아래에서, 표적화 리간드 tLyp-1의 공유 부착 또는 단순 이온 상호작용에 의한 작용화된 중합체의 제조가 설명된다. 둘째로, 항-KRAS mAb가 로딩되고 다양한 중합체로 만들어진 나노캡슐의 제제 및 특성화가 자세히 설명된다.
공유적으로 작용화된 PSA 중합체(PSA-tLyp-1)의 제조
폴리시알산(PSA, 28kDa, 인도 혈청 연구소)을 다음 N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC)/N-하이드록시석신이미드(NHS)/N-(2-아미노에틸) 말레이미드 트라이플루오로아세테이트염(AEM)/tLyp-1: 11.6/2/0.40/0.0283의 몰비를 사용하여 N-(2-아미노에틸) 말레이미드 트라이플루오로아세테이트염으로 변형시켰다. 이를 위해, PSA를 0.1M MES 완충액(pH 6)에 2 ㎎/㎖의 최종 농도로 용해시키고, EDC, NHS 및 AEM의 상응하는 양을 또한 0.1M MES 완충액에 용해시키고, PSA 용액을 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 자기 교반하에 유지하였다. 말레이미드 작용화된 PSA(PSA-Mal)를 먼저 NaCl 50mM에 대해 투석(재생된 셀룰로스, SnakeSkin 7kDa MWCO, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific))으로 정제한 다음 물에 대해 정제하였다. 두 번째 반응의 경우, PSA-Mal을 0.1M MES 완충액과 NaCl 50mM의 용액에 최종 PSA 농도 1 ㎎/㎖로 용해시켰다. 펩타이드를 이 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 자기 교반하에 4시간 동안 유지시키고, 최종 PSA-tLyp-1 생성물을 앞서 기재된 바와 같이 투석에 의해 정제하고, 동결-건조시키고, 4℃에서 보관하였다.
정전기적으로 작용화된 PSA 및 C16-HA 중합체(PSA+tLyp-1; C16-HA+tLyp-1)의 제조
폴리시알산(PSA, 28kDa, 인도 혈청 연구소(Serum Institute of India)) 및 C16-HA(216kDa의 분자량 및 5%의 알킬 치환도, 콘티프로(Contipro))를 표적화 리간드 tLyp-1로 정전기적으로 변형시켰다. 먼저, PSA 또는 C16-HA를 0.1M MES 완충액(pH 6)에 1 ㎎/㎖의 최종 농도로 용해시키고, 상응하는 양의 펩타이드 tLyp-1을 이 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 자기 교반하에 4시간 동안 유지하고, 최종 생성물을 앞서 기재된 바와 같이 투석으로 정제하고, 동결-건조시키고, 4℃에서 보관하였다.
중합체성 나노캡슐의 제조
PSA(28kDa, 인도 혈청 연구소) 또는 PSA-tLyp-1 또는 HA(290kDa, 레보스 이베리카(Lehvoss Iberica)) 또는 C16-HA(216kDa의 분자량 및 5%의 알킬 치환도, 콘티프로) 또는 C16-HA+tLyp-1의 중합체 코팅을 갖는 나노캡슐을 자가-유화 기법에 의해 제조하였다. 먼저, 59㎎의 폴리소르베이트 80(Tween 80®, 머크(Merck)) 및 58㎎의 카프릴릭/카프릭 트라이글리세라이드(Mygliol® 812N, 아이오아이 올레오케미칼 게엠베하(IOI Oleochemical GmbH))를 2㎖ 용량의 유리 바이알에 칭량하였다(유상). 그런 다음, 비-소수성으로 변형된 또는 비-양친매성 중합체를 셸로서 함유하는 제형의 경우, 양이온성 계면활성제를 유상(이전에 에탄올에 용해시킨 벤제토늄 클로라이드 4 마이크로리터, 50 ㎎/㎖)에 첨가하였으며, 그렇지 않으면 알킬 사슬/소수성 성분의 존재가 유성 나노액적에 삽입되어 중합체 부착을 촉진하기 때문에 필수적이지 않다. 유상의 모든 성분을 자기 교반(500rpm)하에 유지하였다. 동시에, 수상은 각 중합체를 가변 농도(예를 들어, 3 ㎎/㎖의 PSA-기반 제형의 경우, 0.25 ㎎/㎖ 내지 0.5 ㎎/㎖의 HA-기반 제형의 경우)로 그리고 PBS(pH 7.3) 25mM 중 마크로골 15 하이드록시스테아레이트(Kolliphor HS15®, 바스프(BASF))를 20 ㎎/㎖의 농도로 개별적으로 용해시킴으로써 제조하였다. 그 후, 0.75㎖의 중합체 용액을 125 마이크로리터의 Kolliphor 용액과 편리하게 혼합하고, 이 수상을 자기 교반(1100rpm)하에 유상에 첨가하였다.
항-KRAS mAb 항-G12V(DWP) 및 항-G12D(D113 및 D210)을 회합시키는데 사용되는 mAb 회합 프로세스
목적하는 최종 mAb 농도(예를 들어, 1 ㎎/㎖, 2 ㎎/㎖ 또는 3 ㎎/㎖)를 얻기 위해 필요한 부피의 항-KRAS mAb를 유상과 혼합하기 전에 수상에 첨가하였다.
물리화학적 특성화
나노캡슐을 광자 상관 분광법(photon correlation spectroscopy: PCS)에 의해 평균 입자 크기 및 다분산 지수(polydispersity index: PI)의 측면에서 특성화하였다. 샘플을 MilliQ 물에 희석하고, 173℃의 각도 검출로 25℃에서 분석을 수행하였다. 제타 전위 측정을 레이저 도플러 풍속계(laser Doppler anemometry: LDA)에 의해 수행하고, 샘플을 초순수에 희석하였다. PCS 및 LDA 분석을 NanoZS®(말번 인스트루먼츠(Malvern Instruments), 영국 말번 소재)를 사용하여 3회 수행하였다. 달리 언급하지 않는 한, 3회 반복에 상응하는 결과는 표 5 및 표 6에 나타나 있다.
회합 효율. 나노캡슐에 대한 항-KRAS mAb의 회합을 결정하기 위해, 각각의 상이한 제형의 분취량을 먼저 PBS에 희석한 다음, 1 바(bar)의 질소 압력하에 4℃에서 Amicon Stirred Cells®(폴리에터설폰 Biomax® 500kDa 한외여과 디스크, 머크)에서 여과(1㎖)하였다. 회합 효율은 다음과 같이 간접적으로 계산하였다: [(총 mAb - 유리 mAb)/총 mAb]*100. 항-KRAS G12V 및 항-KRAS G12D에 대해 얻어진 결과는 각각 하기 표 5 및 표 6에 나타나 있다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
동결-건조 연구
항-KRAS mAb-함유 나노캡슐 현탁액을 장기 보관을 위한 분말로 처리할 가능성을 평가하기 위해 예비 동결-건조 연구를 수행하였다. PSA 항-KRAS mAb-로딩된 나노캡슐을 위에 설명된 방법(10㎖-배취(batch))에 의해 제조하고, 동결-건조 전에 나노캡슐 현탁액(10% w/v의 트레할로스의 최종 농도)에 트레할로스의 농축된 용액을 첨가하였다. 입자 크기, PI, pH, 제타 전위, 회합 효율 및 총 mAb 함량(ELISA에 의해)을 측정하여 4℃에서 보관 동안 다양한 재구성 시점에서 동결-건조(FD) 전후의 동결-건조 나노캡슐의 특성을 분석하였다. 측정은 위에 설명된 것과 동일한 방식으로 수행하였다. 3회 반복에 상응하는 결과는 아래 표 7에 나타나 있되, 나노캡슐과 관련되거나 또는 단지 제형에 존재하는 물리-화학적 특성 및 mAb%의 측면에서 유의미한 변화가 생성되지 않았음을 보여준다.
Figure pct00017
결론: 항-KRAS 단일클론 항체는 상이한 중합체성 나노캡슐 조성물과 효율적으로 회합되어 있다(55% 내지 80%). 나노캡슐은 적절한 물리화학적 특성을 나타내었다. 동결-건조에 의해 장기 보관을 위한 분말로 가공될 가능성도 또한 입증되었다.
실시예 4: 다양한 항-KRAS mAb-로딩된 중합체성 나노캡슐의 혈장에서의 안정성
종종, 나노담체의 효능의 부족은 복합 매질에서의 응집의 결과이다. 이는 높은 이온 강도 및/또는 생물학적 매질에서의 단백질의 존재로 인해 발생할 수 있다. 따라서, 다양한 항-KRAS mAb-로딩된 중합체성 나노캡슐의 혈장에서의 안정성을 연구하였다. 이들의 안정성은 mAb의 비경구 투여에 대한 가능성의 지표로서 간주되었다.
혈장에서의 안정성. 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조된 항-KRAS G12V 로딩된 나노캡슐을 수평 진탕(300rpm, 하이돌프 인스트루먼츠 게엠베하 앤 컴퍼니(Heidolph Instruments GmbH & Co.))하에 인간 혈장(37℃에서 1:10 희석)에서 인큐베이션하였다. 미리 결정된 시간에, Malvern Zeta-Sizer에 의한 입자 크기의 분석 및 나노입자 추적 분석(NTA)에 의한 크기별 분석을 위해 인큐베이션 환경의 샘플을 회수하였다. 샘플을 적절한 추가의 희석(NTA의 경우 PBS(pH 7.4) 10mM 중 1:10.000; 동적 광 산란(DLS)의 경우 물 중 1:1000) 후 분석하였다.
DLS 및 NTA에 의해 측정된 하나의 대표적인 제형(항-KRAS mAb-로딩된 HA 나노캡슐, 0.5 ㎎/㎖ mAb 농도)의 안정성이 각각 도 1 및 도 2에 나타나 있다.
결론: mAb-로딩된 나노캡슐은 적어도 24시간 동안 인간 혈장에서 적절한 안정성을 보여주었으며, 이는 대상체에 비경구 투여되는 중요한 이점을 나타낸다.
실시예 5: KRAS G12V 돌연변이를 발현하는 결장 선암종 세포에서 항-KRAS G12V mAb-로딩된 나노캡슐의 시험관내 세포 내재화
이 실시예는 KRAS G12V 돌연변이를 발현하는 SW480 결장 선암종 세포주에서 항-KRAS G12V mAb의 세포 내재화를 보여준다. 항체를 먼저 형광 마커(Alexa Fluor® 488)로 표지한 다음, 나노캡슐에 회합시켰다. 형광 항체의 로딩 후 나노캡슐 특성의 유지를 평가하였다.
Alexa Fluor ® 488을 사용한 항-KRAS mAb의 표지
간략하게는, mAb를 1× PBS(pH 7.2 내지 pH 8.0)에 2 ㎎/㎖의 농도로 희석하였다. 그런 다음, 50㎕의 1M 소듐 바이카보네이트 완충액을 0.5㎖의 mAb 용액(2 ㎎/㎖)에 첨가하였다(최종 pH는 7.5 내지 8.0이어야 함). 이어서, 용액을 Alexa Fluor® 488 단백질 표지 키트(써모-피셔)와 함께 제공되는 특정 반응성 염료의 바이알에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 그 후, 용액을 2℃ 내지 8℃ 하에 밤새 유지하였다. 정제 칼럼/수지를 키트와 함께 제공되는 플라스틱 칼럼 내부에 수지 상부로부터 최대 약 3㎝까지 첨가하여 제조하고, 표지된 단백질을 로딩하기 전에 과량의 완충액을 배수시켰다(실온에서 1회). 모든 용액이 수지에 침투될 때, 1× PBS를 첨가하여 단백질을 용리하였다. 그런 다음, 표지된 단백질을 함유하는 분획(바닥에 위치함)을 수집하고, 단백질 농도(M) 및 표지의 정도를 각각 방정식 1 및 방정식 2에 따라 계산하였다:
Figure pct00018
여기에서, 203,000 ㎝-1M-1은 전형적 IgG의 몰 흡광 계수(molar extinction coefficient)이고, 0.11은 280㎚에서 염료의 흡수를 설명하기 위한 보정 계수(correction factor)이다.
Figure pct00019
여기에서, 71,000 cm-1M-1은 494㎚에서 Alexa Fluor® 488 염료의 대략적인 몰 흡광 계수이다.
표지 정도는 mAb 1몰당 Alexa Fluor® 488 염료 5몰로 나타났으며, 이는 키트 사양에 따른 최적 범위 내에 있다(mAb 1몰당 Alexa Fluor® 488 염료 4몰 내지 9몰).
형광-표지된 항-KRAS G12V mAb를 함유하는 나노캡슐의 제조
이들 연구를 위해, 중합체성 나노캡슐 제형을 이전에 Alexa Fluor® 488(최종 mAb 농도: 1 ㎎/㎖)로 표지된 항-KRAS G12V mAb를 사용하여 위(실시예 3)에 기재된 바와 같이 제조하였다. 크기, 다분산성 및 제타 전위의 측면에서 특성화 결과를 표 8에 나타내었다.
Figure pct00020
시험관내 세포 내재화 연구
이미징 유세포 분석기(Imaging Flow Cytometer, ImageStream®)를 사용하여 관련 항-KRAS 항체의 세포 내로의 효과적인 내재화를 유도하는 나노캡슐의 능력을 조사하였다. 간략하게는, Alexa Fluor® 488-로딩된 나노캡슐을 연구할 각 시점(예를 들어, 0시간, 4시간 및 8시간)마다 별도의 웰을 사용하여 SW480 세포가 있는 24-웰 플레이트에서 인큐베이션하였다. 미리 결정된 각 시점에서, 세포를 트립신처리하고, ImageStream® 장치에서 이미지를 획득하였다. 효과적인 내재화는 세포질 산성 소기관을 살아 있는 세포에 대한 Lysotracker® 형광 마커로 표지하여 결정하고, 공초점 현미경으로 추가로 확인하였다(데이터 미도시). 대표적인 이미지는 도 3에 나타나 있다.
결론 : 중합체(HA) NC는 KRAS G12V 돌연변이를 발현하는 SW480 세포에서 형광 표지된 항-KRAS G12V mAb의 효율적인 내재화를 가능하게 하였다. 내재화된 항체는 종양원성 KRAS가 국재화되어 있는 원형질 막의 내부에서 우선적인 국재화를 나타내었다.
실시예 6. KRAS G12V 돌연변이를 발현하는 폐 선암종 세포에서 항-KRAS G12V mAb-로딩된 나노캡슐의 시험관내 세포 내재화의 효과
이 실시예는 KRAS G12V 돌연변이를 발현하는 세포주(H441 선암종 폐암 세포)에서 세포 증식 및 RAS-신호전달의 저해에 대한 항-KRAS G12V mAb-로딩된 중합체성 나노캡슐의 효과를 보여준다.
세포 증식 검정
H441 선암종 폐암 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 8000개의 세포 또는 24-웰 플레이트에 웰당 75000개의 세포 밀도로 시딩하고 밤새 배양한 다음, 표 9에 표시된 용량의 항체로 3일 동안 처리하였다. 3 일의 인큐베이션 후, 세포를 수집하고, MTT(96-웰 플레이트 연구) 또는 트립판 블루 염색(24-웰 플레이트 연구)에 의해 생존 세포를 결정하였다. 결과는 각각의 블랭크 나노캡슐-대조군에 대한 생존 세포의 백분율로 표시하였다.
Figure pct00021
웨스턴 블로팅. 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하고 밤새 배양한 다음, 20시간 동안 C16-HA NC(166nM mAb, 0.4ng mAb/세포 용량의 블랭크(blank) 및 항-KRAS G12V mAb-로딩된 NC)로 처리하였다. 표준 절차에 따라 특정 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅을 수행하였다. 웨스턴 블로팅 데이터의 정량화를 위해, 밴드 강도를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화하고, 로딩 대조군의 값으로 정규화하였다. 단백질의 인산화 수준을 SDS-PAGE 겔에 동등하게 로딩된 각 단백질의 총 수준으로 정규화하였다. 상대적 밴드 강도를 상응하는 대조군(블랭크 나노캡슐-처리 대조군)의 값과 비교하여 감소 퍼센트로 나타내었다. 웨스턴 블롯의 스캔은 동시에 수행된 실험에서 얻어진 상응하는 세포 증식의 저해(도 4a)와 함께 도 4b에 도시되어 있다.
도 4. (A) 세포 증식의 저해 및 (B) KRAS G12V 돌연변이를 발현하는 H441 선암종 폐암 세포에서 C16-HA NC(166nM mAb, 0.4ng mAb/세포 용량의 블랭크 및 항-KRAS G12V mAb-로딩된 나노캡슐)와의 인큐베이션 후 생성된 ERK 인산화의 감소[C(-): 비처리 세포; BL: 블랭크 C16-HA NC; aG12V NC: 항-KRAS G12V-로딩된 C16-HA NC].
결론: 항-KRAS G12V mAb-로딩된 중합체성 나노캡슐은 실험 조건에 따라 25% 내지 50% 초과 범위의 백분율로 KRAS G12V 돌연변이체 종양 세포의 시험관내 성장을 저해하였다. RAS 신호전달 경로의 간섭은 웨스턴 블로팅에 의해 결정된 ERK 인산화의 30% 내지 40%의 감소에 의해 입증되었다.
실시예 7: 생체내 검정: KRAS G12V 돌연변이를 갖는 2마리의 마우스 모델(피하 췌장 이식편 및 결장 동소 종양 모델)에서 종양 성장을 감소시키는데 있어서 항-KRAS G12V mAb를 함유하는 나노캡슐의 효능
이 실시예는 2마리의 상이한 종양 마우스 모델(췌장 피하 이식편 종양 모델 및 결장 동소 종양 모델)에서 종양 성장을 감소시키는 데 있어서 중합체성 항-KRAS G12V mAb-로딩된 PSA-tLyp-1 나노캡슐의 능력을 보여준다.
췌장 피하 이식편 종양 모델
KRAS G12V 돌연변이를 발현하는 PA-TU-8902 세포를 Rag2-/- 마우스(6-주령)의 오른쪽 및 왼쪽 허벅지에 피하로 접종하여 췌장 이식편 종양 모델을 만들었다. 종양 부피가 대략 150㎣ 내지 170㎣에 도달했을 때, 마우스를 치료 코호트에 무작위로 할당하고, PSA-tLyp-1 NC 또는 식염수 비히클 대조군을 3일마다 복강내 투여하였다(5 ㎎/㎏의 항-KRAS G12V mAb 용량×4회 투여; 120㎖/용량의 PSA-tLyp-1 NC). 종양 부피 및 체중을 일정한 간격으로 기록하였다. 희생시, 항-KRAS G12V mAb-로딩된 PSA-tLyp-1 NC로 처리된 마우스는 식염수 대조군보다 약 2-배 더 낮은 종양 성장 퍼센트를 나타내었다(도 5). 체중 감소 및 동물 거동의 측면에서 어떠한 독성의 징후도 기록되지 않았다(데이터 미도시).
결장 동소 종양 모델
SW480 세포주-유래 피하 종양 단편을 무흉선 누드-Foxn1nu(5-주령) 마우스의 결장에 이식하여 SW480 세포주-유래 동소 이식편 모델을 만들었다. 이식 3주 후, 마우스를 무작위화하고, 상이한 치료를 받게 하기 위해 다른 그룹에 할당하였다. 10 ㎎/㎏의 mAb 용량의 항-KRAS G12V mAb-로딩된 HA NC를 3-주의 치료 기간(1주차: 2회 용량, 즉, 3일마다 1회 용량; 2주차: 2회 투여, 즉, 3일마다 1회 투여, 3주차: 4회 투여, 즉, 2일마다 1회 투여, 150㎕/용량) 동안 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여하였다. PBS(대조군)을 같은 날 비-처리 동물의 대조군으로 투여하였다. 희생 후 최종 종양 무게는 도 6에 나타나 있다. 조직학적 퇴행 변화의 정도를 정량화하기 위해, 종양 슬라이드를 스캔하고 NDP로 분석하였다. View2 viewing 소프트웨어(하마마쓰)를 사용하여 모든 경우의 괴사의 백분율을 계산하였다. 치료 그룹당 2개의 상이한 종양으로부터의 결과가 도 7에 나타나 있다. 마우스 거동 및 체중을 치료 동안 모니터링하여 임의의 치료 독성의 징후를 검출하였다(도 8).
결론: 항-KRAS G12V mAb-로딩된 중합체성 나노캡슐은 두 가지 상이한 KRAS G12V 발현 세포주 모델: 췌장 피하 이식편 종양 모델(PA-TU-8902 세포) 및 결장직장 동소 종양 모델(SW480 세포)에서 생체내 종양 성장을 유의하게 저해하였으며, 여기서 종양 괴사(70% 초과)의 측면에서 매우 현저한 조직학적 퇴행 변화가 희생시 발견되었다. 3-주의 연구 동안 체중 감소는 기록되지 않았으므로, 치료 독성의 징후는 나타나지 않았다.
참조 목록
비-특허 문헌
Figure pct00022
Figure pct00023
비특허 문헌
Figure pct00024
Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH DSMACC3358 20191016 Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH DSMACC3359 20191016
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSIDADE DE SANTIAGO DE COMPOSTELA <120> Intracellular delivery of anti-KRAS antibodies formulated into nanocapsules <130> WO 2020/221849 <140> PCT/EP2020/062002 <141> 2020-04-30 <150> EP 19172120.8 <151> 2019-05-01 <150> EP 20382206.9 <151> 2020-03-19 <160> 50 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 1 Cys Gly Asn Lys Arg Thr Arg Gly Cys 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 2 Cys Gly Asn Lys Arg Thr Arg 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 3 Cys Gly Asn Lys Arg Thr Arg Gly Cys 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 4 Cys Arg Asn Gly Arg Gly Pro Asp Cys 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 5 Cys Arg Gly Asp Lys Gly Pro Asp Cys 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> 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His Lys Thr 210 215 220 Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody polypeptide from hybridoma DSM ACC3358 <400> 45 Ser Tyr Tyr Met Tyr 1 5 <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody polypeptide from hybridoma DSM ACC3358 <400> 46 Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hybridoma DSM ACC3358Antibody polypeptide from hybridoma DSM ACC3358 <400> 47 Gly Gly Tyr Gly Tyr 1 5 <210> 48 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody polypeptide from hybridoma DSM ACC3358 <400> 48 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody polypeptide from hybridoma DSM ACC3358 <400> 49 Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody polypeptide from hybridoma DSM ACC3358 <400> 50 Gln Gln Val Val Glu Tyr Pro Arg Thr 1 5

Claims (20)

  1. 조성물로서,
    외부 셸에 의해 둘러싸인 내부 코어를 포함하는 복수의 나노 엔티티(nanoentity)를 포함하되, 상기 외부 셸은 중합체를 포함하고, 상기 내부 코어는 적어도 하나의 소수성 화합물을 포함하며, 상기 나노 엔티티는 약제학적 작용제를 포함하고, 상기 약제학적 작용제는 항체 또는 이의 단편이며, 상기 항체 또는 이의 단편은 활성화된 돌연변이된 KRAS 단백질의 에피토프에 결합하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 내부 코어의 소수성 화합물은 오일, 친유성 계면활성제, 지방산, 알케인, 사이클로알케인, 담즙염, 담즙염 유도체, 테르페노이드, 테르펜, 테르펜-유래 모이어티 또는 친유성 바이타민을 포함하는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 소수성 화합물은 오일인, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 항체인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성화된 돌연변이된 KRAS 단백질의 에피토프는 서열번호 39의 아미노산 서열의 12번 위치의 글리신 잔기, 13번 위치의 글리신 잔기 또는 61번 위치의 글루타민 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는, 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 서열번호 39의 아미노산 서열의 12번 위치의 돌연변이는 아르기닌 G12R, 아스파르트산 G12D, 발린 G12V 및 시스테인 G12C로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 KLVVVGAVGVGK 서열번호 40, KLVVVGADGVGK 서열번호 41 및 KLVVVGACGVGK 서열번호 42로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 에피토프에 결합하는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 DSM ACC3358, ATCC-HB-10083 D210, ATCC-HB-8698 DWP, ATCC-HB-10086-D113 및 DSM ACC3359로 이루어진 군으로부터 선택되는 기탁 번호를 갖는 하이브리도마 세포주로부터 수득 가능한, 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 중쇄 가변 영역 CDR1: (서열번호 33) SGYYWN, 중쇄 가변 영역 CDR2: (서열번호 34) YIGYDGTNNYNPSLKN, 중쇄 가변 영역 CDR3: (서열번호 35) LWDY, 경쇄 가변 영역 CDR1: (서열번호 36) RSSQTIVHGNGNTYLE, 경쇄 가변 영역 CDR2: (서열번호 37) TVSNRFS 및 경쇄 가변 영역 CDR3: (서열번호 38) FQGSHAPYT를 포함하는, 조성물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 중쇄 가변 영역 CDR1: (서열번호 45) SYYMY, 중쇄 가변 영역 CDR2: (서열번호 46) EINPSNGGTNFNEKFKS, 중쇄 가변 영역 CDR3: (서열번호 47) GGYGY, 경쇄 가변 영역 CDR1: (서열번호 29) RSSKSLLYKDGKTYLN, 경쇄 가변 영역 CDR2: (서열번호 30) LMSTRAS 및 경쇄 가변 영역 CDR3: (서열번호 31) QQVVEYPRT를 포함하는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체는 폴리시알산(PSA), 하이알루론산(HA), 폴리글루탐산(PGA) 및/또는 페길화된-폴리글루탐산(PGA-PEG), 폴리락트산(PLA) 및/또는 페길화된 폴리락트산(PLA-PEG), 폴리(아스파르트산)(PASP) 및/또는 페길화된-폴리(아스파르트산)(PASP-PEG), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA) 및/또는 페길화된 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLA-PEG), 알긴산(ALG) 및/또는 페길화된 알긴산(ALG-PEG), 폴리말산(PLMA) 및/또는 페길화된 폴리말산(PLMA-PEG) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 중합체는 PSA, HA 또는 PGA-PEG인, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 표적화 모이어티 및/또는 세포-투과 펩타이드를 포함하는, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 조성물은 CendR 펩타이드가 Lyp-1, tLyp-1, cLyp-1 및 iRGD로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적화 모이어티를 포함하는, 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체의 적어도 일부는 소수성 모이어티에 연결되는, 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한, 조성물.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, KRAS 유전자의 돌연변이와 관련된 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 질환은 암인, 조성물.
  19. 약제학적 조성물로서, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, 약제학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 단편은 적어도 하나의 다른 약제학적 작용제/약물과 조합하여 존재하는, 조성물 또는 약제학적 조성물.
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