CN1901934A - 促红细胞生成素在治疗慢性炎症性肠病中铁分布紊乱中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及促红细胞生成素用于治疗慢性炎症性肠病中铁分布紊乱的用途。

Description

促红细胞生成素在治疗慢性炎症性肠病中铁分布紊乱中的用途
发明领域
本发明涉及促红细胞生成素的新用途，尤其是涉及慢性炎症性肠病中铁分布紊乱的治疗。
技术背景
已知在多种疾病中铁代谢不正常。在贫血症中，由于体内总体缺铁，所以不能产生足够的血液。与铁有关的另一种代谢情况是血色素沉着病，其中体内铁的总浓度高于正常值，这导致多种情况，例如器官的破坏。
铁分布紊乱与上述贫血症和血色素沉着病不同，因为体内铁的总浓度是正常的。一方面，铁在各种不同器官中积累并可导致这些器官破坏，甚至损伤。另一方面，以正常量存在的铁在血液形成中的利用减少，从而产生继发反应(secondary effect)，这与贫血症相关的那些效应相当。
至今还不知道慢性炎症性肠病患者受到铁分布紊乱影响的可能性很大。铁分布紊乱可以通过在铁质状态诊断中常用的多个参数来诊断。基于对铁蛋白和可溶性运铁蛋白受体的测定，可以评测慢性炎症性肠病患者体内铁的总浓度是否正常。如果是这种情况，那么网织红细胞中较低浓度的血红蛋白是铁分布紊乱的一个标志。另一个标志是患有慢性炎症性肠病并且表现出正常的总铁浓度的患者的持续/长期增高的C反应蛋白(CRP)浓度。诊断铁分布紊乱的一种方法已经由P.Lehmann，M.Volkmann，J.Lotz，A.Baldauf，R.Roeddiger描述，海报出现于AACC/CSCC，2001年7月29日-8月2日的年会，Chicago，Illinois。
迄今为止，仍然没有提出针对患有铁分布紊乱的慢性炎症性肠病患者的治疗。因此，本发明首要的问题是提供慢性炎症性肠病中铁分布紊乱的治疗，以便最小化或降低上面所提及的不利情况。令人惊讶地是已经发现促红细胞生成素对慢性炎症性肠病中铁分布紊乱具有有益作用。因此，根据本发明，通过提供促红细胞生成素用于治疗慢性炎症性肠病中的铁分布紊乱解决了这个问题。
发明内容
除非另外指明，阐明以下定义来解释并定义用于描述本发明的各种术语的含义和范围。
本文中使用的术语“低级烷基”表示具有1至6个碳原子的直链或支链烷基基团。低级烷基基团的实例包括甲基、乙基和异丙基，优选地是甲基。
本文中使用的术语“低级烷氧基”表示R’-O-基团，其中R’是如上面所描述的低级烷基。
术语“慢性炎症性肠病中的铁分布紊乱”是指发生在慢性炎症性肠病患者身上的铁分布紊乱。铁分布紊乱可以表征如上。具体而言，铁分布紊乱的特征在于具有如下参数：可溶性运铁蛋白受体的浓度[mg/L]除以铁蛋白浓度[μg/L]的对数的结果小于3.5，同时C反应蛋白的浓度大于5mg/L。
术语“促红细胞生成素”或“促红细胞生成素蛋白”是指具有促使骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物活性的蛋白质，其选自人促红细胞生成素以及下面所定义的类似物。
术语“聚乙二醇化促红细胞生成素(Peg-EPO或PEG-EPO)”是指与一至三种下述聚乙烯衍生物共价连接的促红细胞生成素蛋白。
附图简述
图1：人EPO(165个氨基酸)的一级结构(SEQ ID NO：1)。
图2：人EPO(166个氨基酸)的一级结构(SEQ ID NO：2)。
更详细地来说，本发明涉及促红细胞生成素在制备用于治疗慢性炎症性肠病中铁分布紊乱的药物中的用途。慢性炎症性肠病的实例是，例如节段性肠炎(morbus crohn)，也被称作克隆病(crohn′s disease)，以及ulzerosa结肠炎(colitis ulzerosa)。在一个优选的实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中慢性炎症性肠病是节段性肠炎。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及上面所定义的用途，其中慢性炎症性肠病是ulzerosa结肠炎。
本发明尤其可用于制备含有促红细胞生成素作为药物活性成分的药物组合物。术语“促红细胞生成素”或“促红细胞生成素蛋白”或“EPO”如下所述：具体而言这些术语指一种糖蛋白，例如人促红细胞生成素，例如含有(SEQ ID NO：1)或(SEQ ID NO：2)中所示的氨基酸序列或者与其基本上同源的氨基酸序列，其生物学特性与红细胞产生的刺激及骨髓中定向红系祖细胞的分裂和分化的刺激相关。正如此处所用，这些术语包括精心修饰的此类蛋白质，例如，通过定点诱变或随机通过突变进行修饰。这些术语也包括具有1至6个用于糖基化的额外位点的类似物；在糖蛋白的羧基末端上含有至少一个额外氨基酸的类似物，其中该额外氨基酸包含至少一个糖基化位点；以及具有含至少一个用于糖基化的重排的氨基酸序列的类似物。这些术语包括天然和重组产生的人促红细胞生成素。在本发明的一个优选实施方案中，促红细胞生成素蛋白是人促红细胞生成素。
正如下面详细列出地，EPO的制备和纯化在本领域是众所周知的。促红细胞生成素是指天然蛋白质或重组蛋白质，尤其是人的蛋白质，例如从任何常规来源(如组织、蛋白质合成、天然细胞或重组细胞的细胞培养物)获得的α型重组人红细胞生成素(epoetinα)或β型重组人红细胞生成素(epoetinβ)。具有促红细胞生成素活性的任何蛋白质都包括在其内，如突变蛋白或其他经修饰的蛋白质。在本发明的一个优选实施方案中，促红细胞生成素蛋白是α型重组人红细胞生成素或β型重组人红细胞生成素。重组的EPO可以通过重组DNA技术或通过内源基因活化，在CHO-、BHK-或HeLa细胞系中表达来制备。包括通过内源基因活化的蛋白质表达在本领域是熟知的，并且已经公开在，例如美国专利5,733,761号、5,641,670号和5,733,746号中，以及国际专利公开WO 93/09222、WO 94/12650、WO 95/31560、WO 90/11354、WO 91/06667和WO 91/09955中，上述每篇文件的内容均被引入作为参考。上面定义的用途中红细胞生成蛋白优选通过内源基因活化来表达。用于制备促红细胞生成素糖蛋白产物的优选EPO种类是人EPO种类。更优选地，EPO种类是含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的人EPO，更优选地是含有氨基酸序列SEQ ID NO：1的人EPO。因此，本发明的一个优选实施方案涉及上述用途，其中促红细胞生成素蛋白含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
另外，促红细胞生成素可以是含有1至6个用于糖基化的额外位点的糖蛋白类似物。因此，本发明也涉及前述用途，其中促红细胞生成素蛋白含有通过添加1至6个糖基化位点而修饰的人促红细胞生成素的序列。含有一个或多个寡糖基团的蛋白质的糖基化沿着多肽骨架在特定位点上发生，并大大影响蛋白质的物理特性，如蛋白质的稳定性、分泌作用、亚细胞定位和生物活性。糖基化通常有两种类型。O-连接寡糖连接到丝氨酸或苏氨酸残基上，N-连接寡糖连接到天冬酰胺残基上。在N-连接寡糖和O-连接寡糖上均发现的一类寡糖是N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，它是含有9个或更多个碳原子的氨基糖家族。唾液酸通常是N-连接和O-连接寡糖上的末端残基，这是由于其带有负电荷，赋予糖蛋白酸性特性。具有165个氨基酸的人促红细胞生成素含有三个N-连接寡糖链和一个O-连接寡糖链，其构成糖蛋白总分子量的大约40％。N-连接糖基化在第24、38和83位的天冬酰胺残基上发生，O-连接糖基化在第126位的丝氨酸残基上发生。寡糖链以末端唾液酸残基修饰。从糖基化的促红细胞生成素上酶促除去所有唾液酸残基导致体内活性的丧失，但体外活性没有丧失，这是由于促红细胞生成素的唾液酸化阻止了它与肝结合蛋白的结合以及随后的清除。
术语“促红细胞生成素”包括人促红细胞生成素的类似物，其在人促红细胞生成素的氨基酸序列上具有一个或多个改变，这导致用于唾液酸连接位点数量的增加。这些糖蛋白类似物可以通过含有氨基酸残基的添加、缺失或取代的定点诱变产生，这增加或改变了适于糖基化的位点。唾液酸水平比人促红细胞生成素中所发现的更高的糖蛋白类似物是通过添加糖基化位点产生的，这些位点不会干扰生物活性所需要的二级或三级构象。本发明的糖蛋白也包括在糖基化位点上糖类连接水平增加的类似物，其通常包括与N-连接或O-连接位点非常接近的位点上的一个或多个氨基酸的取代。本发明的糖蛋白也包括多种类似物，其含有从促红细胞生成素的羧基末端延伸出的、并且提供至少一个额外的糖类位点的一个或多个氨基酸。本发明的组合物的促红细胞生成素蛋白也包括含有一种氨基酸序列的类似物，所述氨基酸序列包括至少一个用于糖基化的重排。这种糖基化位点的重排包括人促红细胞生成素中的一个或多个糖基化位点的删除及一个或多个非天然发生的糖基化位点的添加。增加促红细胞生成素上糖链的数量，从而每个促红细胞生成素分子的唾液酸数量可以使其具有有利的特性，如增加的可溶性、对蛋白水解更大的抗性、降低的免疫原性、增加的血清半衰期和增加的生物活性。在Elliot的欧洲专利申请640 619中更详细地公开了含有额外糖基化位点的促红细胞生成素类似物，该申请公开于1995年3月1日。
在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含具有含至少一个用于糖基化的额外位点的氨基酸序列的促红细胞生成素蛋白，例如，但不限于，包含通过以下修饰而被修饰的人促红细胞生成素序列的促红细胞生成素，所述修饰选自：
Asn30Thr32；
Asn51Thr53；
Asn57Thr59；
Asn69；
Asn69Thr71；
Ser68Asn69Thr71；
Val87Asn88Thr90；
Ser87Asn88Thr90；
Ser87Asn88Gly89Thr90；
Ser87Asn88Thr90Thr92；
Ser87Asn88Thr90Ala162；
Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90；
Asn30Thr32Val87Asn88Thr90；
Asn89Ile90Thr91；
Ser87Asn89Ile90Thr91；
Asn136Thr138；
Asn138Thr140；
Thr125；及
Pro124Thr125。
此处用于氨基酸序列修饰的符号是指，用上标数字表示的相应未修饰蛋白质(例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的hEPO)的位置变成直接位于各自上标数字之前的氨基酸。
促红细胞生成素蛋白也可以是在糖蛋白的羧基末端含有至少一个额外的氨基酸的类似物，其中额外的氨基酸包含至少一个糖基化位点。额外的氨基酸可以包括来源于人绒毛膜促性腺激素羧基末端的肽片段。优选地，该糖蛋白是选自如下的类似物：(a)含有氨基酸序列Ser Ser Ser Ser Lys AlaPro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr ProIIe Leu Pro Gln的人促红细胞生成素，其从羧基末端延伸；(b)在(a)中进一步包含Ser87Asn88Thr90EPO的类似物；和(c)在(a)中进一步包含Asn30Thr32Val87Asn88Thr90EPO的类似物。
促红细胞生成素蛋白也可以是具有含至少一个用于糖基化的重排的氨基酸序列的类似物。该重排可以包括人促红细胞生成素中任何一个N-连接糖类的位点的删除及人促红细胞生成素氨基酸序列第88位上的N-连接糖类的位点的添加。优选地，该糖蛋白是选自Gln24Ser87Asn88Thr90EPO；Gln38Ser87Asn88Thr90EPO和Gln83Ser87Asn88Thr90EPO的类似物。其他的类似物是α达贝泊汀(darbepoetinα)。前述用途中优选的促红细胞生成素是α达贝泊汀。
更特别地，如上所述的本发明的药物组合物的促红细胞生成素蛋白也包括其聚乙二醇化衍生物。促红细胞生成素的聚乙二醇化衍生物及其制备在本领域是已知的且描述于，例如WO 01/02017、EP-A-1064951、EP-A-539,167、EP-A-605,963、WO 93/25212、WO 94/20069、WO 95/11924、美国专利5,56、EP-A-584、876、WO 92/16555、WO 94/28024、WO 97/04796、美国专利5,359,030号和5,681,811号、美国专利4,179,337号、日本专利、WO 98/32466、美国专利5,324,650号中。优选地，上述用途中促红细胞生成素是聚乙二醇化的。聚乙二醇化促红细胞生成素种类的一个优选的实施方案是指下面描述的衍生物。
因此，本发明也涉及上述用途，其中促红细胞生成素蛋白是缀合物，所述缀合物包括如上所述的促红细胞生成素蛋白，其含有至少一个自由氨基，并具有促使骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物活性，所述缀合物选自人促红细胞生成素及其类似物，其含有通过增加1至6个糖基化位点或至少一个糖基化位点重排而修饰的人促红细胞生成素序列；所述促红细胞生成素以每一个聚(乙二醇)基团的-CO(即羰基)与所述氨基之一形成酰胺键而共价连接到式-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的n个聚(乙二醇)基团上；其中R是低级烷基；x是2或3；m是大约450至大约900；n是1至3；并且n和m的选择使得缀合物的分子量减去促红细胞生成素蛋白的分子量在20千道尔顿至100千道尔顿之间。本发明进一步提供了含有此处描述的缀合物的药物组合物，其中n为1的缀合物的百分比为组合物的所有缀合物的至少90％，优选地是至少92％，更优选地是96％。
更特别地，上述缀合物可以由式(I)表示
P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR]n                     (I)
其中P是此处描述的促红细胞生成素蛋白的残基(即没有与式I中所示的羰基形成酰胺键的一个或多个氨基)，具有促使骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物活性；其中R是低级烷基；X是2或3；m是大约450至大约900；n是1至3；对n和m的选择使得缀合物的分子量减去促红细胞生成素糖蛋白的分子量在20千道尔顿至100千道尔顿之间。根据本发明，R是任何低级烷基。其中R是甲基的缀合物是优选的。
符号“m”表示聚(环氧乙烷)基团中的环氧乙烷残基(OCH2CH2)的数目。环氧乙烷的单个PEG(聚乙二醇)亚单元的分子量为大约44道尔顿。因此，缀合物的分子量(除去EPO的分子量)依赖于数值“m”。在本发明的缀合物中，“m”是大约450至大约900(相当于分子量为大约20kDa至大约40kDa)，优选地是大约650至大约750(相当于分子量为大约30kDa)。对数值m的选择使得本发明的所得到的缀合物具有与未修饰的EPO相当的生理活性，其活性可以是与未修饰EPO的相应活性相同、更大或其一部分的活性。“大约”某个数量的分子量表示该分子量在通过常规分析技术确定的数量的合理范围之内。对数值“m”如此选择，是为了与促红细胞生成素糖蛋白共价连接的每一个聚(乙二醇)基团的分子量在大约20kDa至大约40kDa之间，优选是大约30kDa。
在本发明的缀合物中，数值“n”是与促红细胞生成素蛋白的自由氨基(包括氨基酸赖氨酸的ε-氨基和/或N端氨基)通过酰胺键共价结合的聚(乙二醇)基团的数目。本发明的缀合物中，每个EPO分子可以具有1个、2个或3个PEG基团。“n”是1至3之间的整数，优选地“n”是1或2，更优选地“n”是1。上面描述的缀合物中的优选的缀合物包括其中x是2，m是650至750，n是1并且R是甲基的化合物。
通过式II的化合物与促红细胞生成素糖蛋白的缩合，式(I)的化合物可以从已知的聚合材料制备：
Figure A20048003980900121
其中R和m如上所述。其中x是3的式II化合物是聚(乙二醇)的α-低级烷氧基，丁酸琥珀酰亚胺酯(低级烷氧基-PEG-SBA)。其中x是2的式II化合物是聚(乙二醇)的α-低级烷氧基，丙酸琥珀酰亚胺酯(低级烷氧基-PEG-SPA)。可以使用胺与活化酯反应形成酰胺的任何常规方法。在上述反应中例证性的琥珀酰亚胺酯是导致酰胺形成的离去基团。使用诸如式II化合物的琥珀酰亚胺酯与蛋白质产生缀合物公开于美国专利5,672,662中，出版于1997年9月30(Harris等人)。
人EPO含有9个自由氨基，即N端氨基加上8个赖氨酸残基的ε-氨基。当聚乙二醇化试剂与式II的SBA化合物化合时，已经发现在pH 7.5下，蛋白质∶PEG比率为1∶3以及反应温度为20-25℃时，产生了单聚乙二醇化种类、双聚乙二醇化种类和痕量的三聚乙二醇化种类的混合物。当聚乙二醇化试剂是式II的SPA化合物时，在除了蛋白质∶PEB比率为1∶2之外的相似条件下，主要产生单聚乙二醇化种类。聚乙二醇化EPO可以以混合物使用，或者以阳离子交换层析分离的不同聚乙二醇化种类使用。通过控制反应条件(例如反应物的比例、pH、温度、蛋白质浓度、反应时间等等)，可以改变不同聚乙二醇化物质种类的相对量。
本发明的另一个优选实施方案涉及上面定义的用途，其中促红细胞生成素蛋白是缀合物，所述缀合物包括如上面所定义的促红细胞生成素蛋白，其含有至少一个自由氨基且具有促使骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物活性，所述缀合物选自人促红细胞生成素蛋白及其类似物，其含有通过添加1至6个糖基化位点修饰的人促红细胞生成素蛋白的一级结构；所述促红细胞生成素蛋白与一至三个低级烷氧基聚(乙二醇)基团共价连接，每一个聚(乙二醇)基团通过式-C(O)-X-S-Y-的链接剂，以链接剂的C(O)与所述氨基之一形成酰胺键而共价连接到促红细胞生成素蛋白上，X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1至10，Y是
Figure A20048003980900141
每一个聚(乙二醇)部分的平均分子量在大约20千道尔顿至大约40千道尔顿之间，缀合物的分子量是大约51千道尔顿至大约175千道尔顿之间。
该促红细胞生成素种类也可以通过式(III)表示
P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n          (III)
其中R可以是任何低级烷基。优选的低级烷基是甲基。X可以是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k是1至大约10。优选地，k是1至大约4，更优选地，k是1或2。最优选地，X是-(CH2)。
在式1中，Y是
优选地
Figure A20048003980900143
更优选地
Figure A20048003980900151
在式(III)中，数值m的选择使得所得到的式(III)缀合物具有与未修饰的EPO相当的生理活性，该活性可以是与未修饰EPO的相应活性相同、更大或其一部分的活性。m表示PEG单元中的环氧乙烷残基的数目。单个PEG亚单位的-(OCH2CH2)-分子量为大约44道尔顿。因此，该缀合物的分子量(除去EPO的分子量)取决于m的数值。“大约”某个数量的分子量指该分子量在通过常规分析技术确定的数量的合理范围之内。m是大约450至大约900(相当于20至40kDa之间的分子量)之间的整数，m优选在大约550至大约800(大约24至35kDa)之间，m最优选在大约650至大约700(大约29至大约31kDa)之间。
在式(III)中，数值n是通过酰胺键与PEG单元共价连接的促红细胞生成素中的氨基酸赖氨酸的ε-氨基的数目。本发明的缀合物中每个EPO分子可以具有1个、2个或3个PEG单元。n是1至3范围内的整数，n优选是1或2，n最优选是1。
式(III)的优选促红细胞生成素蛋白由下式表示：
Figure A20048003980900161
在本发明的最优选的实施方案中，促红细胞生成素缀合物通过下式表示：
其中，在上式中n是1至3的整数；m是450至900的整数；R是低级烷基；X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，P是促红细胞生成素蛋白残基，其没有与X形成酰胺键的一个或多个氨基。
其他优选的促红细胞生成素糖蛋白产物通过下式表示：
Figure A20048003980900163
更优选的促红细胞生成素糖蛋白产物通过下式表示：
Figure A20048003980900171
这些促红细胞生成素蛋白可以制备如下：
(a)将式P-[NH2]n表示的促红细胞生成素蛋白的氨基酸赖氨酸的ε-氨基与式Z-CO-X-S-Q表示的双功能试剂共价反应，形成下式表示的具有酰胺键的中间产物：
                    P-[NH-CO-X-S-Q]n
其中P是少了形成酰胺键的氨基的促红细胞生成素蛋白；n是1至3的整数；Z是反应基，例如羧基-NHS酯；X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k是1至大约10；Q是保护基团，像烷酰基，例如乙酰基。
(b)将来自步骤(a)的具有酰胺键的中间产物与式W-[OCH2CH2]m-OR代表的活化聚(乙二醇)衍生物共价反应，形成下式代表的促红细胞生成素糖蛋白产物：
其中W是Y的巯基反应形式；m是大约450至大约900的整数；R是低级烷基；并且Y如上面所定义。
在该实施方案中，双功能试剂优选地是N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代丙酸酯或N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯，Z优选地是N-羟基-琥珀酰亚胺，活化聚(乙二醇)衍生物W-[OCH2CH2]m-OR优选选自碘代-乙酰基-甲氧基-PEG，甲氧基-PEG-乙烯砜以及甲氧基-PEG-马来酰亚胺。
更详细地，将式(III)的促红细胞生成素蛋白通过硫羟基团与EPO的共价连接(“活化”)及将所得到的活化EPO与聚(乙二醇)(PEG)衍生物的缀合来制备。根据本发明，聚乙二醇化EPO制备的第一个步骤包括硫羟基团的共价连接(通过EPO的NH2-基团)。EPO的活化用带有受保护的硫羟基团及额外的反应基团的双功能试剂进行，例如分别是活化酯(例如琥珀酰亚胺酯)、酐、磺酸的酯、羧酸和磺酸的卤化物。该硫羟基团通过本领域已知的基团保护，例如乙酰基基团。这些双功能试剂能通过形成酰胺键而与氨基酸赖氨酸的ξ-氨基反应。该反应的第一个步骤如下所示：
Figure A20048003980900181
EPO、n和X如上面所定义，Z是本领域已知的反应基，例如下式的N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)取代基：
Figure A20048003980900182
在优选实施方案中，赖氨酸ε-氨基的活化通过与具有琥珀酰亚胺部分的双功能试剂的反应进行。该双功能试剂可以带有不同的间隔基种类，例如(CH2)k-或-CH2-(O-CH2-CH2-)k-部分，其中k是1至大约10，优选地是1至大约4，更优选地是1或2，最优选地是1。这些试剂的实例是N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代丙酸酯(SATP)和N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)
Figure A20048003980900191
乙酰硫代烷基-羧基-NHS-酯，如同
Figure A20048003980900192
2-(乙酰基硫代)-(乙氧基)k-乙酸-NHS-酯
k如上面所定义。
该双功能试剂的制备在本领域是已知的。2-(乙酰基硫代)-(乙氧基)k-乙酸-NHS-酯(2-(acetylthio)-ethoxy)K-acetic-acid-NHS-esters)的前体描述于DE-3924705中，而衍生为乙酰基硫代化合物描述于March，J.，AdvancedOrganic Chemistry，McGraw-Hill，1977，375-376中。SATA可以商购(Molecular Probes，Eugene，OR，美国和Pierce，Rockford，IL)。
被添加到EPO分子上的硫羟基团的数量可以通过调节反应参数来选择，即蛋白质(EPO)浓度和蛋白质/双功能试剂的比率。优选地，EPO通过每个EPO分子共价连接1至5个硫羟基团来活化，更优选地是每个EPO分子1.5至3个硫羟基团。这些范围是指硫羟基团在EPO蛋白总体中的统计学分布。
该反应在，例如在pH 6.5-8.0的含水的缓冲溶液中进行，例如在10mM磷酸钾、50mM NaCl、pH 7.3中进行。双功能试剂可以加入到DMSO中。在反应完成后，优选在30分钟后，通过加入赖氨酸终止反应。过量的双功能试剂通过本领域已知的方法分离，例如通过透析或柱过滤。添加到EPO中的硫羟基团的平均数量可以通过光度测定方法确定，该方法描述于，例如Grasetti，D.R.和Murray，J.F.在J.Appl.Biochem.Biotechnol.119，41-49(1967)中。
上述反应之后是已活化的聚(乙二醇)(PEG)衍生物的共价缀合。合适的PEG衍生物是平均分子量为大约20至大约40kDa的活化PEG分子，更优选地是大约24至大约35kDa的活化PEG分子，最优选地是大约30kDa的活化PEG分子。
活化的PEG衍生物在本领域是已知的且描述于，例如Morpurgo，M.等人针对PEG-乙烯砜的J.Bioconj.Chem.(1996) 7，第363 ff页中。直链和支链PEG种类适合于制备式1的化合物。反应性PEG试剂的实例是碘代-乙酰基-甲氧基-PEG和甲氧基-PEG-乙烯砜：
这些碘代-活化物质的应用在本领域是已知的且描述于，例如Hermanson，G.T.在Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego(1996)第147-148页中进行的描述。
更优选地，该PEG种类通过马来酰亚胺活化，使用(低级烷氧基-PEG-马来酰亚胺)，如甲氧基-PEG-马来酰亚胺(MW 30000；ShearwaterPolymers，Inc.)。低级烷氧基-PEG-马来酰亚胺的结构如下：
Figure A20048003980900202
R和m如上所定义的，优选地
Figure A20048003980900211
硫羟保护基团原位裂解之后，与低级烷氧基-PEG-马来酰亚胺的缀合反应在含水缓冲溶液中进行，所述含水缓冲溶液是例如10mM磷酸钾、50mM NaCl、2mM EDTA、pH 6.2。保护基团的裂解可以如此进行，例如，在25℃、pH 6.2下与DMSO中的羟胺进行大约90分钟。对于PEG修饰，活化EPO/低级-烷氧基-PEG-马来酰亚胺的摩尔比应该是大约1∶3至大约1∶6，优选是1∶4。反应通过加入半胱氨酸以及剩余的硫羟(-SH)基团与N-甲基马来酰亚胺或其他能形成二硫键的适当化合物的反应来终止。由于任何剩余的活性硫羟基团与诸如N-甲基马来酰亚胺的保护基团或其他合适的保护基团反应，本发明的缀合物中的EPO糖蛋白可能含有这类保护基团。通常，此处描述的过程将产生具有由不同数目的保护基团保护的可变数目的硫羟的分子混合物，这依赖于糖蛋白上不与PEG-马来酰亚胺发生缀合的活化硫羟基团的数目。
尽管当N-甲基马来酰亚胺被用于封闭聚乙二醇化蛋白质上的剩余硫羟基团时，其形成相同类型的共价键，但二硫化物化合物将以分子内硫化物/二硫化物交换反应导致封闭试剂的二硫桥连偶合(bridged coupling)。用于该类型封闭反应的优选封闭试剂是氧化型谷胱甘肽(GSSG)、半胱氨酸和胱胺。尽管被引入聚乙二醇化蛋白质中的半胱氨酸没有额外的净电荷，但是使用封闭试剂GSSG或胱肽导致额外的负电荷或正电荷。
包括单-、二-和三-聚乙二醇化EPO种类分离的式(III)化合物的进一步纯化可以通过本领域已知的方法进行，例如柱层析。
聚乙二醇化的促红细胞生成素衍生物优选含有至少90％的单-PEG缀合物。通常，期望是促红细胞生成素糖蛋白的单-PEG缀合物，这是由于它们易于具有比-二-PEG缀合物更高的活性。单-PEG缀合物的百分比以及单-和二-PEG种类的比率可以通过在洗脱峰值附近集中更宽的级分从而降低单-PEG的百分比，或通过在洗脱峰值附近集中更窄级分从而增加组合物中单-PEG的百分比来控制。大约90％的单-PEG缀合物是产率和活性的良好平衡。有时，期望的组合物是其中例如至少92％或至少96％的缀合物是单-PEG(n＝1)的组合物。在本发明的一个实施方案中，其中n为1的缀合物的百分比是90％至96％。
包含聚乙二醇化促红细胞生成素的药物组合物在本领域中是已知的且已描述于，例如国际专利申请WO 01/87329中。如上面所定义，每毫升这些组合物可以包含10-10000μg促红细胞生成素蛋白。优选地，每毫升组合物包含10-1000μg，例如10、50、100、400、800或2500μg。进一步，每毫升这些组合物可以包含10μg-10000μg促红细胞生成素蛋白、10-200mmol/l硫酸盐、10-50mmol/l磷酸盐、pH 6.0至6.5。该组合物也可以包含高达20mM的甲硫氨酸、1-5％的多元醇(w/v)、高达0.1％的普流尼克(pluronic)F68(普流尼克F68)(w/v)以及任选地高达1mM的CaCl2。该组合物的一个实例是每毫升包含10μg至10000μg促红细胞生成素蛋白、40mmol/l硫酸盐、10mmol/l磷酸盐、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％普流尼克F68(w/v)、pH 6.2。在另一个方案中，每毫升该组合物可以包含10μg至10000μg促红细胞生成素蛋白、10至100mmol/lNaCl、10至50mmol/l磷酸盐、pH 6.0-7.0、任选地1-5％(w/v)的多元醇。进一步，该组合物可以包含高达20mM的甲硫氨酸、高达0.1％普流尼克F68(w/v)以及任选地7.5μmol/l CaCl2。特别地，每毫升该组合物可以包含10μg至10000μg促红细胞生成素蛋白、100mmol/l NaCl、10mM甲硫氨酸、0.01％普流尼克F68(w/v)和10mmol/l磷酸盐、pH 7.0。
本发明也涉及上述组合物，其每毫升包含10μg至10000μg促红细胞生成素蛋白、10至50mmol/l精氨酸、pH 6-pH 6.5、10至100mmol/l硫酸钠。此外，该组合物可以包含高达20mM的甲硫氨酸、高达0.1％的普流尼克F68(w/v)、任选地高达1mmol/l的CaCl2及任选地1-5％(w/v)的多元醇。特别地，每毫升该组合物可以包含10μg至10000μg促红细胞生成素蛋白、40mmol/l精氨酸、pH 6.2、30mmol/l硫酸钠、3％甘露醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％普流尼克F68(w/v)以及任选地1mmol/lCaCl2。
本发明的一个优选实施方案指包含如下成分的组合物：10至10000μg/ml促红细胞生成素，优选为25至2500μg/ml促红细胞生成素，及
a)10mM磷酸钠/磷酸钾、100mM NaCl、pH 7.0，或
b)10mM磷酸钠、120mM硫酸钠、pH 6.2，或
c)10mM磷酸钠、40mM硫酸钠、3％甘露糖醇(w/v)、pH 6.2，或
d)10mM磷酸钠、40mM硫酸钠、3％甘露糖醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％普流尼克F68(w/v)、pH 6.2，或
e)40mM精氨酸、30mM硫酸钠、3％甘露糖醇(w/v)、pH 6.2，或
f)40mM精氨酸、30mM硫酸钠、3％甘露糖醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％普流尼克F68(w/v)、pH 6.2。
在最优选的实施方案中，这些组合物包含的促红细胞生成素蛋白的数量为50、100、400、800或2500μg/ml。该最优选的组合物包含10mM磷酸钠、40mM硫酸钠、3％甘露糖醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％普流尼克F68(w/v)、pH 6.2；或者包含40mM精氨酸、30mM硫酸钠、3％甘露糖醇(w/v)、10mM甲硫氨酸、0.01％普流尼克F68(w/v)、pH 6.2。这些组合物进一步的细节可以从WO 01/87329获知。
本发明也涉及用于治疗慢性炎症性肠病中铁分布紊乱的方法，该方法包括施用有效量的如上面所定义的促红细胞生成素蛋白。进一步，本发明涉及用于治疗慢性炎症性肠病中铁分布紊乱的药物，其特征在于含有有效量的促红细胞生成素蛋白。慢性炎症性肠病的实例是，例如节段性肠炎，也被称作克隆病，以及ulzerosa结肠炎。在上面所提及的方法和药物的内容中，节段性肠炎是慢性炎症性肠病的优选形式。Ulzerosa结肠炎是慢性炎症性肠病的另一种优选形式。如上所述的优选方法和药物是其中促红细胞生成素蛋白是如上所定义的那些。
根据本发明，EPO或EPO缀合物的比活性可以通过本领域已知的多种测定方法确定。本发明的纯化EPO蛋白的生物活性是通过注射将EPO蛋白施用给人类病人，导致与未注射的或对照组的实验对象相比，骨髓细胞中网织红细胞和红细胞的产生增加的生物活性。根据本发明获得和纯化的EPO蛋白或其片段的生物活性，可以通过根据Annable等人，Bull.Wld.Hlth.Org.(1972)47：99-112和Pharm.Europa Spec Issue ErythropoietinBRP Bio 1997(2)的方法测试。用于测定EPO蛋白活性的另一种生物学测定法，即正常细胞毒性血性小鼠测定法(normocythaemic mouse assay)在本领域有所描述(例如Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRPBio 1997(2)和Ph.Eur.BRP.中的促红细胞生成素专论)。
参考下面的实施例，本发明将更加易于理解，这些实施例例证性地说明了本发明，但没有将本发明限制于此。
实施例
实施例1
通过测定下述参数，检查一位患有ulzerosa结肠炎的中年妇女的铁分布紊乱，这些参数为CRP(C反应蛋白)、铁蛋白和可溶性运铁蛋白受体-正如P.Lehmann，M.Volkmann，J.Lotz，A.Baldauf，R.Roeddiger所描述的，海报出现在AACC/CSCC，2001年7月29日-8月2目的年会，Chicago，Illinois。这些结果表明了铁分布紊乱。该病人皮下使用150/U kgRecormonTM(市售的促红细胞生成素蛋白)进行治疗，每周两次，最多12周。然后，上述参数的测定表明铁质缺乏病症的改善。
实施例2
通过测定下述参数，检查一位患有节段性肠炎的中年妇女的铁分布紊乱，这些参数为CRP(C反应蛋白)、铁蛋白和可溶性运铁蛋白受体-正如P.Lehmann，M.Volkmann，J.Lotz，A.Baldauf，R.Roeddiger所描述的，海报出现在AACC/CSCC，2001年7月29日-8月2日的年会，Chicago，Illinois。这些结果表明了铁分布紊乱。该病人皮下使用150/U kgRecormonTM(市售的促红细胞生成素蛋白)进行治疗，每周两次，最多12周。然后，上述参数的测定表明铁质缺乏病症的改善。
                           序列表
(1)基本信息：
    (i)申请人：
        (A)姓名：弗·哈夫曼-拉罗切有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)
        (B)街道：格兰扎克尔街124号(124 Grenzacherstrasse)
        (C)城市：巴赛尔(Basle)
        (E)国家：瑞士
        (F)邮政编码(ZIP)：CH-4070
        (G)电话：(61)688 11 11
        (H)电传：(61)688 13 95
        (I)电报：962 292 hlr ch
    (ii)发明名称：新药物组合物
    (iii)序列数：2
    (iv)计算机可读形式：
        (A)介质类型：软盘
        (B)计算机：IBM PC兼容
        (C)操作系统：WORD
        (D)软件：PatentIn版本2.0
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>165
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu
 1                5                  10                  15
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His
             20                  25                  30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
         35                  40                  45
Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
     50                  55                  60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
 65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp
                 85                  90                  95
Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
            100                 105                 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
        115                 120                 125
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
    130                 135                 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp
                165
<210>2
<211>166
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu
  1               5                  10                  15
Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His
             20                  25                  30
Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
         35                  40                  45
Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp
     50                  55                  60
Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
 65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp
                 85                  90                  95
Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu
            100                 105                 110
Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala
        115                 120                 125
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
    130                 135                 140
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165

Claims (17)

1.促红细胞生成素蛋白在制备用于治疗慢性炎症性肠病中铁分布紊乱的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述慢性炎症性肠病是节段性肠炎。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述慢性炎症性肠病是ulzerosa结肠炎。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述促红细胞生成素蛋白是人促红细胞生成素。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述促红细胞生成素蛋白是α型重组人红细胞生成素或β型重组人红细胞生成素。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述促红细胞生成素蛋白通过内源性基因活化来表达。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述促红细胞生成素蛋白含有氨基酸序列SEQ ID NO：1或氨基酸序列SEQ ID NO：2。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述促红细胞生成素蛋白含有通过加入1至6个糖基化位点而修饰的人促红细胞生成素的序列。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述促红细胞生成素蛋白是α达贝泊汀。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中如权利要求4至8中任一项所定义的促红细胞生成素蛋白是聚乙二醇化的。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述促红细胞生成素蛋白是缀合物，所述缀合物包含促红细胞生成素蛋白，其含有至少一个自由氨基，并且具有促使骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物活性，所述缀合物选自人促红细胞生成素及其类似物，其含有通过加入1至6个糖基化位点或至少一个糖基化位点的重排而修饰的人促红细胞生成素的序列；所述促红细胞生成素蛋白以每一个聚(乙二醇)基团的-CO与所述氨基之一形成酰胺键而共价连接到式-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR的n个聚(乙二醇)基团上；其中R是低级烷基；x是2或3；m是大约450至大约900；n是1至3；并且n和m的选择使得缀合物的分子量减去促红细胞生成素蛋白的分子量在20千道尔顿至100千道尔顿之间。
12.根据权利要求11所述的用途，其中x是2，m是650至750，n是1且R是甲基。
13.根据权利要求10所述的用途，其中所述促红细胞生成素蛋白是缀合物，所述缀合物包含促红细胞生成素蛋白，其含有至少一个自由氨基，并且具有促使骨髓细胞增加网织红细胞和红细胞产生的体内生物活性，所述缀合物选自人促红细胞生成素蛋白及其类似物，其含有通过加入1至6个糖基化位点而修饰的人促红细胞生成素蛋白的一级结构；所述促红细胞生成素蛋白与一个至三个低级氧烷基聚(乙二醇)基团共价连接，每一个聚(乙二醇)基团通过式C(O)-X-S-Y-的链接剂，以链接剂的C(O)与所述氨基之一形成酰胺键而共价连接到促红细胞生成素蛋白上，X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1至10，Y是
每一个聚(乙二醇)部分的平均分子量在大约20千道尔顿至大约40千道尔顿之间且所述缀合物的分子量在大约51千道尔顿至大约175千道尔顿之间。
14.根据权利要求13所述的用途，具有下式的促红细胞生成素缀合物：
其中n是1至3的整数；m是450-900的整数；R是低级烷基；X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1至10，P是促红细胞生成素蛋白的残基，其没有与X形成酰胺键的n个氨基。
15.一种用于治疗慢性炎症性肠病中铁分布紊乱的方法，其包括施用有效量的促红细胞生成素蛋白。
16.一种用于治疗慢性炎症性肠病中铁分布紊乱的药物，其特征在于含有有效量的促红细胞生成素蛋白。
17.上面所定义的本发明。
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