CN1120457A - 结合稳定的多肽组合物、其治疗、诊断制剂及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及稳定轭合的肽复合物，其中肽偶联于含亲脂性和亲水性基团的聚合物上，具体地涉及口服或非胃肠道给药的胰岛素组合物，其中胰岛素与含线性聚二醇基团和亲脂性基团的聚合物共价结合，胰岛素、线性聚二醇基团和亲脂性基团在构象上的相互排列使胰岛素对体内酶解的耐受性增强。本发明的轭合物可用于治疗性和非治疗性(如诊断)用途。肽和聚合物可共价结合，也可通过氢键等互相缔合。

Description

结合稳定的多肽组合物、 其治疗、诊断制剂及制备和使用方法

本发明涉及结合稳定的多肽和蛋白质组合物及制剂，还涉及其制备和使用方法。

多肽和蛋白质用于某些疾病的全身治疗现已在医疗实践中被为广为接受。多肽在替代治疗中所起的作用如此重要，以致很多研究活动投入在用重组DNA技术大量合成。这些多肽中很多是内源性分子，它们在产生生理作用上是很强的，并且是特异性的。

限制这些物质在所期望的应用上的有用性的主要因素是当非胃肠道给药时它们易被血浆蛋白酶代谢。这些物质的口服给药途径更成问题，因为在它们到达所期望的靶组织前除了在胃中的蛋白分解外，胃的高酸度也会将其破坏。由胃和胰酶作用产生的多肽和蛋白质片断被肠的刷状缘膜上的外源性和内源性肽酶裂解，得到二肽和三肽，即使避免了胰酶的蛋白分解，多肽也受到刷状缘肽酶的降解。通过胃后保存下来的任何一点服用的肽在具有渗透屏障阻止其进入细胞的肠粘膜被进一步代谢。

尽管有这些障碍，文献中有实质性证据提示营养性和药用蛋白通过肠粘膜被吸收。另一方面，营养性和药物(多)肽类被肠粘膜细胞上的特异转运系统吸收。这些发现表明，配制恰当的(多)肽类和蛋白质可经口给予，保持对预期用途足够的生物活性。然而，如果可以修饰这些肽类，以便完全或至少程度显著地保持它们的生理活性，同时稳定它们，不受蛋白分解酶的作用，并增强它们通过肠粘膜的渗透能力，那么就能恰当地利用它们达到预期的目的。这样得到的产物将会提供如下优点：产生更有效的吸收，相应地可用较低剂量产生最适治疗效果。

蛋白质的口服或非胃肠道给予所伴随的问题在制药工业上是熟知的，正采用各种策略力图解决它们。这些策略包括合用渗透增强剂，如水杨酸盐(酯)、脂一胆汁酸混合微胶粒、缩水甘油和酰基肉碱，但它们常被发现了引起严重的局部毒性问题，如局部刺激和毒性、上皮细胞层完全磨损和组织炎症。这些问题的引起是因为增强剂通常与肽制品同时给予，常出现从剂型中漏出。改善口服给药的其他策略包括将肽与蛋白酶抑制剂如抑肽酶、大豆胰蛋白酶抑制剂和抑氨肽酶A混合以图限制所给的治疗剂的降解。不幸的是，这些蛋白酶抑制剂是非选择性的，内源性蛋白质也受到抑制。此效应是不合需要的。

通过改变候选药物的理化性质增加肽类通过粘膜的渗透作用也已进行试验。结果表明，单纯提高亲脂性不足以增加跨细胞转运。实际上已有人提出，肽-水氢键断裂是达到肽的经膜扩散上所要克服的主要能障(Conradi，R.A.，Hilgers，A.R.，Ho，N.F.H.，and Bur-ton，P.S.，“The influence of peptide structure on transport acrossCaco-2cells”，Pharm.Res.，8，1453—1460，(1991))。一些作者描述了蛋白质稳定的问题。

Abuchowski和Davis(“Soluble polymers-Enzyme adducts”，In：Enzymes as Drugs，Eds.Holcenberg and Roberts，J.Wiley andSons，New York，NY，(1981))揭示了各种酶衍生法，以提供水溶性、非免疫原性、在体内稳定的产物。

目前已发表关于蛋白质稳定的大量工作。Abuchowski和Davis公开了酶与聚合物结合的各种方法(同上)，更具体地，这些聚合物为葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖肽、聚乙二醇和多氨基酸类。据报告，所得的结合多肽保持其非胃肠道应用所需的生物活性和在水中的溶解性。同样的作者在美国专利No.4,179,337中揭示聚乙二醇在与蛋白质偶联后赋予这些蛋白质溶解性和非免疫原性。但是，这些聚合物不含有适于肠粘膜结合的片断，也不含有能促进或增加膜渗透的任何成分。尽管这些结合为水溶性，它们不被计划用于口服。

Meisner等在美国专利No.4,585,754中指出可通过与硫酸软骨素结合使蛋白质稳定化。这种结合的产物通常是多阴离子的，亲水性很强，缺乏细胞渗透能力。它们通常不被计划用于口服。

Mill等在美国专利4,003,792中指出某些酸性多糖(如果胶、algesic acid、透明质酸和角叉菜胶)可被偶联到蛋白质上，产生可溶性和不溶性产物。这些多糖是来自食用植物的多阴离子的物质。它们缺乏细胞渗透能力，通常不被考虑用于口服。

在Pharmacological Research Communication14，11-120(1982)上，Boccu等揭示了可将聚乙二醇偶联到蛋白质如过氧化物岐化酶(“SOD”)上。所得的结合产物的抗变性和酶消化的稳定性提高。聚合物不含进行膜相互作用所必需的成分，因此遭遇到上面提到的同样问题，它们不适于口服。

下面的文章揭示了稳定肽和蛋白质药物的其他技术，其中，蛋白质药物是与较低分子量的化合物(如aminolethicin、脂肪酸、维生素B₁₂和糖甙)结合的：R.Igarishi et al.，“Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Materials，17.366，(1990)；T.Taniguchi etal.Ibid 19，104，(1992)；G.J.Russel-Jones，Ibid，19，102，(1992)；M.Baudys et al.，Ibid，19，210(1992)。这些修饰化合物不是聚合物，因此不含有赋予溶解性和膜亲和力所需的成分，而溶解性和膜亲和力则是口服和非胃肠道给药后生物利用所必须的。许多该类制剂缺乏口服生物利用率。

被采用来延长蛋白质物质体内作用时间的另一方法是胶囊化技术。M.Saffan等在Science，223，1081，(1986)上提出了将蛋白质药物密封在偶氮聚合物膜中用于口服，报导了该膜在胃中不被消化，但在大肠中被微生物区系降解，由此，在该处释放出被密封的蛋白质。该技术利用物理混合物，并不促进被释蛋白质的经膜吸收。

Ecanow在美国专利No.4,963,367中提出生理活性化合物(包括蛋白质)可被凝聚而成的膜密封，制成的产物可适于经膜给药。同一发明的其他制剂可经吸入、口服、非胃肠道和经皮途径给药。这些方法并不提供如口服给药所需的性质—对胃肠道酸度和蛋白分解酶的完整的稳定性。

为稳定蛋白质药物以作口服和非胃肠道给药所采取的另一方法是将治疗剂包裹在脂质体中。该技术的综述见Y.W.Chien，“NewDrug Delivery Systems”，Marcel Dekker，New York，NY，1992。脂质体—蛋白复合物是物理混合物，它们的投药产生不规则的和不能预期的结果。据报道，在这种脂质体—蛋白复合物的使用中，某些器官中产生不希望有的蛋白质成分堆积。除了这些因素之外，使用脂质体时，还有诸如费用高、需复杂的冷冻干燥循环的困难的制备方法和溶剂不相容性等缺点。此外，在开发临床有用的脂质体制剂时，变化的生物分布和抗原性组织成为制约因素。

最近有人描述了“类蛋白质”的使用(Santiago，N.，Milstein，S.J.，Rivera，T.，Garcia，E.，Chang.，T.C.，Baughman，R.A.，and Bucher，D.，“Oral Immunization of Rats with InfluenzaVirus M Protein(M1)Microspheres”，Abstract # A221，Proc.Int.Symp.Control.Rel.Bioac.Mater.，19，116(1992))。该文报导了几类治疗剂用此系统口服给药，该系统将人们感兴趣的药物密封在由高度支化的氨基酸组成的聚合物套中。与脂质体的情形一样，药物不是化学结合于类蛋白质球上，药物从剂型成分中漏出是可能的。

成为很多合成工作的焦点、被致力于改善其给药和生物吸收的肽是胰岛素。

胰岛素用于对糖尿病的治疗可追溯到1922年，当时，Banting等(“Pancreatic Extracts in the Treatment of Diabetes mellitus，”Can.Med.Assoc.J.，12，141-146(1922))证明从胰腺得到的活性提取物对糖尿病狗有治疗效果。同年，用胰腺提取物治疗糖尿病患者导致拯救生命的令人激动的临床改进。每天注射胰岛素的过程对于长期康复是必须的。

胰岛素分子由经二硫链连接的两条氨基酸链组成，胰岛素的分子量约6,000。胰岛的β细胞分泌胰岛素的单链前体，叫作胰岛素原。胰岛素原的蛋白分解导致4个碱性氨基酸的去除(分别在胰岛素链的No.31、32、64和65位：Arg、Arg、Lys、Arg)和连接的(“C”)肽。在所得的双链胰岛素分子中，A链氨基末端为甘氨酸，B链氨基末端为苯丙氨酸。

胰岛素可以单体、二聚体和由三个二聚体形成的六聚体的形式存在。六聚体与两个Zn⁺⁺离子配位结合。生物活性存在于单体中。虽然直至最近，几乎只有牛和猪胰岛素被用于治疗人的糖尿病；但已得知种系之间胰岛素有众多差异。猪胰岛素与人胰岛素最为相似，差异仅在B链的C-末端是丙氨酸而不是苏氨酸。尽管有这些差异，大多数哺乳类胰岛素有类似的特异活性。直至最近，动物提取物提供了治疗该病所用的全部胰岛素。重组技术的出现使人胰岛素的商业规模的制备成为可能，(例如，Humulin^TM胰岛素，可从美国印第安纳波利斯市的Eli Lilly公司购得)。

胰岛素用于糖尿病治疗虽已有70多年，但直至最近的两篇出版物，很少出现有关其制剂稳定性的研究报导。(Brange，J.，Langkjaer，L.，Havelund，S.，and Volund，A.，“Chemical sta-bility of insulin.1.Degradation during storage of pharmaceuticalpreparations，”Pharm.Res.，9，715—726，(1992)；and Brange，J.Havelund，S.，and Hougaard，P.，“Chemical stability of insulin.2.Formulation of higher molecular weight transformation prod-ucts during storage of pharmaceutical prepa rations，”Pharm.Res.，9，727—734(1992))。在这两篇出版物中，作者详细地描述了在温度和pH变化的条件下几种胰岛素制剂的化学稳定性。较早的报导几乎全部集中于作为胰岛素制剂稳定性量度的生物效价。但是，几种新的有力的分析技术，如圆盘电泳、体积排除色谱和HPLC的出现，使详细测定胰岛素的化学稳定性特征成为可能。早期胰岛素稳定性的化学研究是困难的，因为发现受试的重结晶的胰岛素纯度不高于80—90％。最近已可得到单一成分的高纯度胰岛素。该单一成分胰岛素所含杂质低于现行分析技术的检出水平。

配制的胰岛素有多种类型降解倾向。当谷氨酰胺或天门冬酰胺残基上的侧链酰胺基水解成游离羧酸时，出现非酶促脱酰胺基作用。胰岛素的这种脱酰胺基作用有6个可能的位置：Gln^A5、GlnA¹⁵、Asn^A18、Asn^A21、Asn^B3、和Gln^B4。已发表的报告提示，三个Asn残基对此反应最敏感。

Brange等(同上)报导，在酸性条件下，胰岛素通过Asn^A21位的广泛脱酰胺基作用而被迅速降解。相反，在中性配方中，在Asn^B3位发生脱酰胺基作用，其速度慢得多，不依赖于胰岛素浓度和胰岛素来源的种系。然而，温度和制剂类型在决定B₃位的水解速度上起重要的作用。例如，与无定形的相比，如果胰岛素是结晶形的，则B₃位水解为最低限度的。结晶形的柔韧性(三元结构)降低，明显地降低反应速度。将酚掺入中性制剂以稳定三元结构导致脱酰胺基速度降低。

在胰岛素制剂中除水解降解产物外，还形成高分子量转化产物。Brange等用体积排除色谱法证明，胰岛素制剂在4—45℃之间贮存下形成的主要产物是共价的胰岛素二聚物。在含鱼精蛋白的制剂中，也形成共价的胰岛素鱼精蛋白产物。胰岛素二聚物和胰岛素—鱼精蛋白产物的形成速率明显的受温度影响。对于人或猪胰岛素，1％高分子量产物的形成时间(常规N1制备)在37℃时与4℃相比，从154个月减少到1.7个月。对于猪胰岛素的锌混悬制剂，同样的转化在4℃时需357个月，而在37℃时仅需0.6个月。

胰岛素的这些降解类型对糖尿病患者可能是意义重大的。虽然高分子量产物的形成通常慢于前述水解(化学)降解产物的形成，但其影响可能更严重。有明显的证据表明，对胰岛素的免疫反应的发生可能来自胰岛素共价聚合物的存在(Robbins，D.C.Cooper，S.M.Fineberg，S.E.，and Mead，P.M.，“Antibodies to covalentaggregates of insulin in blood of insulin-using diabetic patients”，Diabetes，36，838-841，(1987)；Maislos，M.，Mead，P.M.，Gaynor，D.H.，and Robbins，D.C.，“The source of the circulatingaggregate of insulin in type 1 diabetic patients is therapeutic in-sulin”，J.Clin.Invest.，77.717-723.(1986)；and Ratner R.E.，Phlilips，T.M.，and Steiner，M.，“Persistent cutaneous insulinallergy resulting from high molecular weight insulin aggregates”.Diabetes，39，728-733，(1990))。有多达30％接受胰岛素治疗的糖尿病患者对共价胰岛素二聚物显示特异抗体。据报导，由于共价胰岛素二聚物的存在，变应性患者产生非常显著的淋巴细胞刺激反应的比例仅占2％。当二聚物含量在0.3—0.6％范围内时，反应不显著。因此，应制剂中的共价胰岛素二聚物的水平控制在1％以下，以避免各种临床表现。

胰岛素制剂有几种市售品；虽然稳定性已改进到无需再冷藏所有制剂的程度，但仍保持对稳定性增加的胰岛素制剂的需求。不易形成高分子量产物的改良胰岛素在药学和医学技术领域中将是实质性的进步，提供这种稳定性(还提供胰岛素口服的可能性)的这些改良对糖尿病的治疗将作出显著的贡献。

多肽和蛋白质除了作为治疗剂在体内使用外，在诊断试剂应用上，多肽和蛋白质也得到实质性的日益增加的使用。在很多这样的应用中，多肽和蛋白质在溶液环境中使用，在溶液环境中，它们对温度及(多)肽和蛋白质的酶促降解敏感，这些(多)肽和蛋白质为诸如用于免疫测定、抗体—半抗原结合用的酶、肽和蛋白质激素、抗体、酶—蛋白质结合物，在诊断或筛选AIDS、肝炎和风诊等疾病的检测方法学上大量使用的病毒蛋白，用于例如组织培养物的肽和蛋白质生长因子，用于临床化学的酶和诸如食物工业所用的不溶性酶。更具体的例子是，在用于生物体液中的抗体或抗原的比色测定的试剂盒中，碱性磷酸酶被用作一种试剂。虽然这种酶以各种形式市售，包括游离酶和抗体结合物，但是它的贮存稳定性和溶液常受限制。结果，碱性磷酸酶结合物经常是冷冻干燥的，并使用牛血清白蛋白和吐温20之类添加剂以增加酶制剂的稳定性。这些方法虽然在某些情况下有利于增强多肽和蛋白质试剂对降解的耐受力，但有各种缺点，限制其普遍应用。

本发明普遍地涉及结合稳定的(多)肽和蛋白质组合物和制剂，及其制备和使用方法。

更具体地，本发明在一个宽的组合方面涉及共价结合的肽复合物，其中肽结合于作为其组成部分掺入亲水基团的一个或一个以上聚合物分子(如线性聚二醇)，该聚合物掺入了一个亲脂基团作为其组成部分。

在另一特殊方面，本发明涉及生理活性肽组合物，包括与含(i)线性聚二醇基团和(ii)亲脂基团的聚合物共价连结的生理活性肽，其中肽、线性聚二醇基团和亲脂性基团相互间在构象上的排列使生理活性肽组合物中生理活性肽相对于单独的生理活性肽(即缺乏偶联于其上的聚合物的非结合形)对酶降解的体内耐受力增强。

在另一方面，本发明涉及三维构象的生理活性肽组合物，包括与含(i)线性聚二醇基团和(ii)亲脂性基团的聚山梨酸酯复合物共价连结的生理活性肽，其中生理活性肽、线性聚二醇基团和亲脂性基团相互间在构象上的排列使(a)在三维构象中亲脂基团外露和(b)生理活性组合物中的生理活性肽相对于单独的生理活性肽对酶降解的体内耐受力增强。

更进一步，本发明涉及多价配体结合的肽复合物，该肽复合物包括甘油三酯主链基团和

通过结合于甘油三酯主链基团碳原子上的聚二醇间隔基与甘油三酯主链基团共价结合的生物活性肽；以及

直接与甘油三酯主链基团上的碳原子共价连接或通过聚二醇间隔基共价结合的至少一个脂肪酸基团。

在这种多价配体结合的肽复合物中，甘油三酯生物活性基团的α′和β碳原子可有直接共价结合其上的，或通过聚二醇间隔基间接地共价结合其上的树脂酸基团。或者，脂肪酸基团可直接地或通过聚二醇间隔基共价结合于甘油三酯主链基团的α和α’碳，而生物活性肽与甘油三酯的β碳共价联结，直接地共价结合于其上或通过聚二醇间隔基间接地结合于其上。人们将会认识到，在上面讨论范围内，对于含甘油三酯主链基团的多价配体结合肽复合物，可以有大量不同的结构、组合物和剂型。

在本发明的很大的范围内，在这种多价配体结合的肽复合物中的生物活性肽以通过烷基间隔基或其他可接受的间隔基与甘油三酯的经修饰的主链基团共价结合比较有利。此时所用的间隔基的可接受性是指空间的、结构上的和末端使用上的特异可接受性特征。

在再一方面，本发明涉及含包括甘油三酯主链的聚山梨酸酯成分的聚山梨酸酯复合物，在甘油三酯主链上具有共价结合于其α、α′和β碳原子的官能团，它包括：

(i)脂肪酸基团；和

(ii)具有共价结合于其上的生理活性基团的聚二醇基团，例如，生理活性基团共价结合至聚二醇基团的适当官能度。

这样的共价结合可以是直接的，例如，结合到聚二醇基团的羟基末端官能团，或者，共价结合可以是间接的，例如，将末端羧基官能间隔基通过反应复盖到聚二醇的羟基末端上，以使所得到的经复盖的聚二醇具有生理活性基团可共价结合于其上的末端羧基官能度。

本发明还进一步涉及稳定的、水溶性的结合肽复合物，它包括共价结合于生理学上相容的聚二醇修饰的糖脂部分上的生理活性肽。在此复合物中，生理活性肽可通过多肽的游离形氨基酸基团的不稳定的共价键共价结合于生理学上相容的聚二醇修饰的糖脂基，其中不稳定的共价键在体内可由生化水解和/或蛋白分解而切断。生理学上相容的聚二醇修饰的糖脂基团以包括聚山梨酸酯聚合物，例如含选自单棕榈酸酯、二棕榈酸酯、单月桂酸酯、二月桂酸酯、三月桂酸酯、单油酸酯、二油酸酯、三油酸酯、单硬脂酸酯、二硬脂酸酯和三硬脂酸酯的脂肪酸酯的聚山梨酸酯聚合物为较有利。在此复合物中，生理学上相容的聚二醇修饰的糖脂部分可适当地包括选自脂肪酸的聚二醇醚和脂肪酸的聚二醇酯的聚合物，其中脂肪酸为例如包括选自月桂酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸的脂肪酸。

在上述复合物中，作为例解，生理活性肽可包括选自以下物质的肽：胰岛素、降钙素、ACTH、胰高血糖素、生长激素释放抑制激素、生长激素、促生长因子、甲状旁腺激素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素、甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽、血管加压素、非天然存在的类啡肽(opiods)、过氧化物岐化酶、干扰素、天门冬氨酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨基酶、腺苷脱氨基酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶。

在另一方面，本发明涉及调节(mediation)胰岛素缺乏的口服剂型，包含药学上可接受的载体和稳定的水溶性结合胰岛素复合物，后者包含共价连接于生理学上相容的聚二醇修饰的糖脂基团的胰岛素或胰岛素原。

更进一步，本发明涉及在显示胰岛素缺乏的人或非人哺乳动物受试者身上治疗胰岛素缺乏的方法，包括给受试者口服有效量的含共价结合物生理学上相容的聚二醇修饰的糖脂基团的胰岛素或胰岛素原的稳定的水溶性结合胰岛素复合物。

本文所用的术语“肽”广义地表示包括分子量≤约10,000的多肽及分子量＞约10,000的蛋白质，其中分子量为数平均分子量。如本文所用的，术语“共价结合的”指特定基团既可相互直接共价结合，也可通过一个或几个间隔基团，如桥、间隔基或连锁基间接地相互共价结合。术语“共轭结合的”指特定基团既可相互共价偶合，也可相互非共价地结合，例如通过氢键、离子键、范德华引力等。

从而，本发明包括治疗应用(体内)的各种组合物，其中轭合的肽复合物的肽成分是生理活性或生物活性肽。在这种含肽组合物中，肽组分与含亲水性和亲脂性基团的聚合物的轭合可以是直接的共价结合或间接的(通过适当的间隔基)的结合，亲水性和亲脂性基团可以任何适当方式排列在聚合物轭合结构中，包括相互之间直接或间接的共价结合。因此，种类繁多的肽可按特定的最终的治疗应用的需要或希望，进行调节以用于本发明的广泛的使用。

在另一方面，如上面描述的那些共价结合的肽组合物可利用拟用于诊断或体外应用的肽组分，其中肽是诸如诊断试剂，一种用于免疫测定或其他诊断或非体内应用的诊断用轭合物的补体。在这样的非治疗性应用中，本发明的肽复合物高度有用地用作稳定的组合物，它们可被配制在相容的溶剂或其他溶液基质的制剂中，以提供能有力地抗降解的稳定的组合物剂型。

在前述治疗和非治疗性(如诊断性)应用中，本发明在一个宽的组合方面涉及共价结合的肽复合物，其中，肽共价结合物一个或一个以上聚合物分子，该聚合物分子掺入亲水性基团(如聚二醇基团)和亲脂性基团(如脂肪酸基团)作为所述聚合物的组成部分。在较佳的方面，肽可通过共价结合与一个或一个以上线性聚二醇聚合物分子共价结合，在该聚二醇聚合物中掺入亲脂性基团(如脂肪酸基团)作为组成部分。

在另一特别宽的方面，本发明涉及非共价结合的肽复合物，其中肽与一个或一个以上聚合物分子非共价地缔合，聚合物分子中掺合亲水性基团(如聚二醇基团)和亲脂性基团(如脂肪酸基团)作为组成部分。该聚合物可以是上述共价结合肽复合物中聚合物的各种结构和排列类似物，但其中肽不是以共价方式结合于聚合物分子，而例如通过诸如氢键、离子键或离子配位、范德华键、特殊的肽的微囊包裹或缔合等缔合键与聚合物缔合。

这种肽组分和聚合物基团的非共价缔合可利用治疗(如体内)用肽组分及如诊断或其他(体外)用非治疗性肽组分。

在这种缔合结合的肽组合物中，可在本领域的技术范围内选择一种方式(例如给予肽与聚合物的氢键力)恰当地构建、修饰聚合物组分或使其适当地官能化，以给予其缔合结合的能力。

在下面的公开和附加的权利要求中，本发明的其他方面、特征和修改将更完全明了。

图1是给予胰岛素本身及复合剂型胰岛素后血清葡萄糖(mg/dL)的时间(小时)函数曲线。

图2是给予各种剂型胰岛素后血清葡萄糖(mg/dL)的时间(分)函数曲线。

图3是胰岛素和OT胰岛素被胰凝乳蛋白酶消化的时间函数曲线。

图4是大鼠经口给予聚合物降钙素轭合物后大鼠的血清钙的时间函数曲线。

图5是表示大鼠经口给予聚合物降钙素OT1-ct或OT2-ct聚合物降钙素轭合物后大鼠血清中钙水平的时间函数条线图。

图6是糖尿病大鼠模型上聚合物—胰岛素效应的条线图。

图7是表示猴(cynomolgous monkey)经口给予001—胰岛素后血中葡萄糖经时百分变化的效应图。

图8是表示猴(cynomolgous monkey)经口给予001—胰岛素后剂量经时效应的效应图。

用无毒、无免疫原性的聚合物修饰肽可提供某些益处。若修饰的进行使产物(聚合物—肽结合物)能保留其全部或大部分生物活性，则可产生如下性质：可增强上皮细胞渗透能力；可保护经修饰的肽免遭蛋白分解消化及其后的活性丧失；可改善对内源性转运系统的亲和性；可赋予对胃酸的化学稳定性；可使聚合物亲脂性和亲水性之间的平衡达到最适速度。具有上述改良性质的蛋白质物质作为替代治疗在口服或非胃肠道给药后可以是有效的。用改良的肽也可以采用其他给药途径，如经鼻和经皮给药。

在非治疗性应用中，当肽组分以本发明的方式共价结合于聚合物时，包括最终品的肽或其他产物的前体和中间体的诊断和/或试剂类肽的结合稳定提供了相应的益处。所得的共价结合肽对环境降解因素，包括溶剂或溶液介导的降解过程具有耐受力。这种对降解耐受力增强的结果，活性肽组分的贮藏寿命可明显延长，伴随而来的是含肽组合物在应用于特定使用中的可靠性的增加。

用本发明方法进行的肽和聚合物的共价结合有效地使水解降解减到最少，获得体外和体内稳定性。

当治疗性，诊断性或试剂类肽按本发明的方法与聚合物非共价、缔合连结时，也见到类似的益处。

利用共价结合于聚合物组分的胰岛素作为本发明的说明性实施例，包括可裂解共价化学键的结合的本质考虑到用聚合物可从肽(胰岛素)裂解的时程来控制。这种裂解可存在酶或化学机制。在聚合物从伏完全裂解后可见全部活性。而且，化学修饰可使所连结的肽(如胰岛素)渗透通过细胞膜。在本发明的一个较佳方面，亲脂性脂肪酸残基的促进膜渗透性质参入在结合聚合物中。在这方面，再利用作为受关注的肽的胰岛素，胰岛素的脂肪酸聚合物衍生物改善了胰岛素的肠道吸收：用长链脂肪酸聚合物将Phe^B1和Lys^B29甲氨酰化，得到提供某种程度降低血糖活性的化合物。这一衍生作用提高胰岛素在肠粘膜的稳定性，增加其从小肠的吸收。

虽然下面的说明主要地、说明性地围绕本发明的各种组合物和制剂中胰岛素作为肽组分的应用，然而应这样理解，本发明的应用并不受此限制，而扩展到以本发明方法共价或缔合地结合的任何种类肽，包括但不限于下述种类的肽：降钙素、ACTH、胰高血糖素、生长激素释放抑制因子、生长激素、促生长因子、甲状旁腺激素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素、甲状腺刺激激素、内啡肽、抗体、血红蛋白、可溶性CD-4、凝血因子、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、脑啡肽、血管加压素、非天然存在的类啡肽、过氧化物岐化酶、干扰素、天门冬氨酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨基酶、腺苷脱氨基酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，和木瓜蛋白酶、碱性磷酸酶，以及其他合适的酶，激素、蛋白质、多肽、酶—蛋白质结合物、抗体—半抗原结合物、病毒表位等。

本发明的一个目的是提供用于和肽结合的合适的聚合物，以便获得上面列举的令人满意的特征。另一个目的是利用这种经修饰的肽以在体内持久地转运肽。再一个目的是用此技术以活性形式口服给予肽。

进一步的目的是将缔合结合的肽应用于免疫测定、诊断和其他非治疗性(如体外)应用方面。本发明的还有一个目的是提供稳定结合的肽组合物，包括种种既适于体内又适于非体内应用的共价结合的组合物，或提供种种既适于体内又适于非体内应用的非共价的、缔合结合肽组合物。

在本发明的广义范围内，可将单一聚合物分子应用于和众多种类肽结合，在本发明的广泛实践中，利用多种聚合物作为某一肽的结合剂也可能是有益的；也可采用这些方法的结合。而且，稳定结合的肽组合物在体内和非体内应用中均有实用性。此外，可认识到，若合乎最终应用，结合的聚合物可利用任何其他基团、成分或其他结合种类。作为例子，在共价结合于聚合物的某些应用上，给聚合物赋予抗UV降解、抗氧化或其他性质或特性的官能团可能是有用的。作为进一步的例子，在使聚合物功能化以赋予某些活性或可交联特性的某些应用上，增强总的结合物质的各种性质或特性可能是有益的。因此，聚合物可含有不妨碍结合组合物对预期目的的效能的任何官能度、重复基团，键，或其他组成结构。本发明的其他目的和优点从下面的说明和所附权利要求书将会更完全明了。

下面在列举的反应流程中描述可用于获得这些期望的特征的说明性的聚合物。在共价结合的肽的应用中，聚合物可被功能化，然后连结在肽的游离氨基酸上，形成不稳定键，在完整的不稳定键存在的状态下，仍保留着活性。然后，通过化学水解和蛋白分解除去此键，增加肽的活性。

本发明所利用的聚合物可在其分子中适当地掺入诸如食用脂肪酸(亲脂性末端)、聚二醇(水溶性末端)、可接受的糖基(受体相互作用末端)和肽连接用的间隔基等成分。在所选的聚合物中，聚山梨酸酯是特别可取的，在下述讨论中，被选来阐明本发明的各种实施方案。本发明的范围当然并不限于聚山梨酸酯，在本发明的广泛实践中可有用的应用含上述基团的各种其他聚合物。有时在聚合物结构中去除这些基团中的一个、保留其他的基团而不失目的可能是所希望的。当希望这样做时，不失去本发明的目的和利益而较宜去除的基团为糖和/或间隔基团。

较佳采用的聚合物分子量落在500—1000道尔顿之间。

在本发明的实践中，C₂—C₄烷基聚二醇的聚二醇残基(较佳为聚乙二醇(PEG))被有利地掺入感兴趣的聚合物系统中。

这些PEG残基的存在对聚合物和相应的聚合物—肽结合物赋予亲水性。已知某些糖脂能稳定蛋白质和肽。这种稳定的机制可能包括糖脂的脂肪酸基团与肽或蛋白质的疏水性区域的结合，从而防止了蛋白质或肽的凝聚。已知的还有，凝聚的肽在小肠比天然肽难以被吸收。因此，本发明期望这样的聚合物—肽产物，其中肽(如胰岛素)与聚合物的亲水性或疏水性残基结合。聚合物的脂肪酸部分供与肽的疏水区缔合，从而防止在溶液中的凝聚。所得到的聚合物—肽结合物从而将是，对化学和酶水解稳定；因PEG残基而具水溶性；及因脂肪酸—疏水区交互作用而不易凝集。

在本发明的实践中，聚二醇衍生物在聚合物—肽结合物制剂中有很多有益的性质，如与下面聚二醇衍生物性质有关的：水溶解度改善，同时不引起抗原或免疫原反应；高度生物相容性；无聚二醇衍生物的体内生物降解；以及易于被活机体排除。

因此，本发明实践中应用的聚合物包含亲脂性和亲水性基团，使所得的聚合物—肽结合物在口服及非胃肠道和其他生理性给药方式中高度有效(生物活性)，在非生理性应用中也高度有效。

下面列为本发明的聚合物—肽结合物的阐述性实施例的是以后简称结合物1、结合物2和结合物3所表示的共价结合的结合物的分子式，其中“Ins”是胰岛素，m、n、w、x和y的具体值将在下面的讨论中描述。结合物1：

其中：w＋x＋y＋z＝20；R＝油酸：

结合物2：

结合物3：

结合物1为位于聚合物系统中心的市售的聚山梨酸酯单油酸酯(polysorbate monopalmitate)，这是一种用于很多药物应用中的糖衍生物。亲脂性和吸收增加的性质由油酸链赋予，而聚乙二醇(PEG)残基提供亲水性(接受氢键)的环境。胰岛素通过邻按聚合物的PEG区的氨基甲酸酯键连结上去。

在结合物2中无糖残基，但胰岛素又通过邻近聚合物的PEG区的氨基甲酸酯键连结于聚合物。因此，聚合物的亲脂性脂肪酸区与胰岛素的连接点有一些距离。

结合物3的情况与上面对结合物2所描述的排列相反，仍然不含糖残基，但在此结构中，亲脂性脂肪酸残基最接近与胰岛素的连接点，而亲水性PEG区远离连接点，该连接也是通过氨基甲酸酯键进行的。

在本发明的广泛实践中，与聚合物和肽连接点有关的亲水性和亲脂性区域可能有多变的组合，这样的变化可产生保护胰岛素的亲脂性和亲水性区域的聚合物。在结合物1、2和3中，聚合物之间的氨基甲酸酯键连接点以Gly^A1的胺官能团为宜。如上所述，可能有一个以上聚合物单元连接到各个肽分子上。例如，如果第二个聚合物连接到胰岛素上，连结点最好是通过Phe^B1的胺官能团。至少在理论上，第三个聚合物可连接到Lys^B29的胺官能团上。但是，经验表明，每个胰岛素分子上连接两个聚合物分子是合理地可得到的最高实际衍生度。

在本发明的一般实践中，将聚合物偶联到肽上的各种方法都是可行的，并在下文作更完全的讨讨。在进行蛋白质和多肽的工作中，应认识到，肽上的特定残基在其生物学完整性上是重要的。重要的是选择合适的偶联剂，它并不过分干扰这种残基。在某些情况下，可能难于避免这些重要残基的偶联因而阻碍其活性，但某些活性可能换来稳定性提高而保持现有的有益性质。例如，在体内应用中，给药频率可因而降低，使费用减少，病人顺应性提高。

用于按本发明的蛋白质/肽结合物的聚合物被设计成掺入好的物理特性，使其达到预期目的。吸收促进剂使肽能渗透细胞膜，但不改善肽的稳定性特性，因此体内应用可以免用这种渗透促进剂的制剂形式，而利用本发明的聚合物—肽结合物。因此，本发明的一个方面涉及在聚合物中掺入脂肪酸衍生物以模拟渗透促进剂。

在本发明的共价结合的聚合物—肽轭合物中，肽可通过不稳定化学键共价结合于水溶性聚合物。肽和聚合物之间的这种共价键可经化学或酶反应而断裂。聚合物—肽产物保持可接受量的活性；当聚合物完全与肽裂解后，肽成分的全部活性才显现出来。同时，聚乙二醇部分存在于结合的聚合物中，使聚合物—肽具有高水溶性和长时间在血中循环的能力。糖脂通常以其脂肪酸基团占据肽的疏水区的方式与聚合物缔合，这就防止了凝聚。肽的凝聚导致其在小肠中吸收差。不凝聚的肽较易被小肠吸收。糖脂掺入结合的聚合物，从而达到改善稳定性和防止结合后肽产生凝聚的目的。上述这些修饰赋予肽改善的溶解性、稳定性和膜亲和性等性质。这些特性改善的结果，可用活性聚合物—肽进行非胃肠道和口服给药，肽随后在体内水解裂解，被生物利用。

在下面所述的实施方案中所用的聚合物可分类为聚乙二醇修饰的糖脂和聚乙二醇修饰的脂肪酸。在较佳的结合聚合物中可提及聚山梨酸酯，包括单棕榈酸酯、二棕榈酸酯、三棕榈酸酯、单月桂酸酯、二月桂酸酯、三月桂酸酯、单油酸酯、二油酸酯、三油酸酯、单硬脂酸酯、二硬脂酸酯和三硬脂酸酯。从每种结合得到的聚合物的数平均分子量较宜在约500至约10,000道尔顿范围内。这个实施方案优先可供选择的聚合物为脂肪酸的聚乙二醇醚或酯，这样的脂肪酸为月桂酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸，聚合物为数平均分子量从500—10,000道尔顿。较佳的是在聚合物中有可衍生基团，此类基团可在以聚乙二醇终止的末端或在以脂肪酸终止的末端。可衍生基团也可位于聚合物内部，从而可作为肽和聚合物之间的间隔物。

修饰脂肪酸山梨糖醇酐以获得所需聚合物的一些方法将用结构图解作更详细的讨论。聚山梨酸酯是山梨糖醇及其酐的酯，由1摩尔山梨糖醇和山梨糖醇酐与约20摩尔环氧乙烷共聚合而成。下面所示是代表性聚合物的结构。W、X、Y、Z的总数为20，R₁，R₂和R₃各自独立地选自月桂酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸根组成的组，或R₁和R₂各为羟基而R₃为月桂酸、棕榈酸、油酸或硬脂酸根。这些聚合物有市售品，用于药物制剂。当需要较高分子量聚合物时，可从糖脂(山梨糖醇单月桂酸酯、山梨糖醇单油酸酯、山梨糖醇单棕榈酸酯或山梨糖醇单硬脂酸脂)和合适的聚乙二醇合成得到。可用作起始试剂的糖脂的结构描述如下。

在有三个位置被聚乙二醇取代的糖脂聚合物的合成中，所需的末端具有两个游离羟基的聚乙二醇的一个端基用1摩尔三苯甲基氯进行三苯甲基化(在吡啶中)加以保护。聚乙二醇的剩下的一个游离羟基被转为甲苯磺酸酯或其溴化物。将所需的糖脂溶于合适的惰性溶剂，并用氢化钠处理。将被保护的聚乙二醇的甲苯磺酸酯或其溴化物溶于惰性溶剂，并以过量加入糖脂溶液中。在室温下，用对甲苯磺酸在无水惰性溶剂中的溶液处理该产物，并用柱色谱法提纯。此转换的结构式描述如下。

       m＝10-16

     x，y，z的总数＝8 to 240(式3)通过调节试剂的摩尔当量和用适当分子量范围的聚乙二醇，按上面的步骤可得到所需分子量范围的单取代或二取代糖脂。

其中n和m均可各自改变，其值为适于被稳定化的特定肽的任何适当值，如1—16。

上述糖脂的糖部分可被结构式如下的甘油或氨基甘油取代。

在这种修饰中，如下所示，用脂肪酸基团(如月桂酸、油酸、棕榈酸或硬脂酸)醚化或酯化伯醇；及用脂肪酸使氨基衍生成酰胺或仲胺基。

其中m可取任一适当值，如10—16。

剩下的伯醇基用三苯甲基保护，而仲醇基用聚乙二醇转化为所需的聚合物。通常，聚乙二醇在一端带有一可离去基团，而在另一端带有甲氧基。将聚乙二醇溶于惰性溶剂，并加到含糖脂和氢化钠的溶液中。将产物于室温下在对甲苯磺酸中脱去保护，得到如下所示的所需聚合物。

有时需在聚乙二醇链的不同部位掺入脂肪酸衍生物，在获得与被2或3分子脂肪酸取代的聚山梨酸酯(如聚山梨酸酯三油酸酯)相同的某些物理化学性质。

下面的反应流程中显示代表聚合物的结构，为开链聚山梨酸酯。

Pr＝肽：蛋白质、蛋白质药物；

R＝烷基，C₅—C₁₈；

n＝5—120；

  Pr＝肽：蛋白质、蛋白质药物；

  R＝烷基，C₅—C₁₈；

  n＝5—120；

  m＝2—15；

  Pr＝肽：蛋白质、蛋白质药物；

  R＝烷基，C₅—C₁₈；

  m＝5—18；

  n＝2—15

  y＝5—120；

  其中，m，n和y可相互独立地在上述范围内变化。

                                           (式8)

在聚合物A的合成中，需保护甘油〔例如Solketal(商品名，DL-α，β-亚异丙基丙三醇)〕1位和2位碳上的羟基。剩下的羟基在惰性溶剂中转为钠盐，并与卤化或甲苯磺酰化的聚乙二醇(其中聚乙二醇的一末端已成酯而被保护)反应。除去甘油的保护，将所得的两个游离羟基转化为相应的钠盐。将这些盐在惰性溶剂中与用脂肪酸部分衍生化的聚乙二醇反应。反应发生在游离羟基被转化为甲苯磺酸酯或其溴化物之后。

除了被保护的甘油先与末端碳被卤化的脂肪酸酯反应外，以同样的方法合成聚合物G。

在聚合物C的合成中，以从1，3-二卤代-2-丙醇开始为佳。将二卤代化合物溶于惰性溶剂，并与已用1摩尔脂肪酸基团衍生化的2摩尔聚乙二醇的钠盐进行反应。产物用色谱法或渗析法提纯。所得的干产物在惰性溶剂中用氢化钠处理。将这样生成的钠盐与被部分保护的聚乙二醇的卤化衍生物反应。

有时，可能需省略聚合物的糖部分。所得聚合物仍含聚乙二醇片断。用亲脂性长链烷烃适当取代脂肪酸，可保护脂肪酸基团的膜亲和性；从而保持生物相容性。本实施方案的一种情况是在惰性溶剂中用氢化钠处理带两个末端游离羟基的聚乙二醇。将1当量重量的脂肪酸类基团的一级溴化物加到聚乙二醇溶剂混合物中。以惰性溶剂提取所需产物，若需要，可用柱色谱法提纯。

当脂肪酸和聚乙二醇之间需形成酯键时，在合适的惰性溶剂中，用过量所需的聚乙二醇处理该酸的酰氯化物。在惰性溶剂中提取聚合物，若需要，用色谱法作进一步提纯。

在肽的某些修饰中，需将脂肪酸直接结合到肽上。在此情况下，用位于脂肪酸基团上的可衍生官能团合成聚合物。将在惰性溶剂中的适当分子量的单氧基聚乙二醇溶液用氢化钠处理，接着加入在末端碳上带有可离去基团的脂肪酸的乙酯的溶液，溶剂提取后，若需要，用柱色谱法提纯产物。 用稀酸或碱处理除去酯保护。

当需要与多肽形成氨基甲酸酯时，用本领域已知的化学还原方法将羧基或酯转化成羟基。

HO—(CH₂)_m—OC₂2H₄)_nXR    (式13)

用于与多肽结合的官能团通常在聚合物的末端，但有时以官能团位于聚合物内为佳。这时，衍生的基团起间隔基的作用。在此实施方案的一种情况下，脂肪酸基团可在羧基的α碳上被溴化，而酸基团被酯化。此类化合物的实验步骤与上面所列的相同，得到如下产物：

当需延长的间隔基时，可将聚乙二醇单醚转化为氨基，并用以脂肪酸基团衍生化的琥珀酸酐处理。将带有伯胺基团的所需聚乙二醇溶于pH8.8的磷酸钠缓冲液，并用如下式所示取代的琥珀酸酐脂肪酸基团处理。产物用溶剂提取法分离，若需要，再用柱色谱法提纯。

要理解的是，上面提供的反应式仅仅为了说明的目的，并不限于这样的反应和结构，它们在本发明的广泛实践中肽的修饰上可被有益地利用，例如，达到适于非胃肠道和口服给药的溶解度、稳定性和细胞膜亲和性。

本发明提供生物相容的聚合物与生物活性大分子、诊断试剂等(它们可以由诸如肽、蛋白质、酶、生长激素、生长因子和类似物质组成)的结合物。这样的大分子化合物可通过α-氨基酸进入酰胺键，形成肽寡聚物和聚合物而制取。根据这些物质的功能，肽成分可以是蛋白质、酶、生长激素等。为简便起见，这儿将这些物质统称为肽，用Pr表示。在各种情况下，生物活性肽含游离氨基或羧基。聚合物和肽之间的键合一般通过游离氨基或羧基而产生。

本说明书为阐述目的所选的肽是在医药、农业、科学和家庭以及工业应用的范围中特别受人注目的。它们可以是用于替代治疗的酶；促进动物生长或细胞培养中细胞生长的激素；或用于各种用途的活性蛋白质物质，例如生物技术和生物及医学诊断学。可提及的酶为过氧化物岐化酶、干扰素、天门冬氨酰胺酶、谷氨酸酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨基酶、腺苷脱氨基酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，和木瓜蛋白酶。在肽激素中，可提及的为：胰岛素、降钙素、ACTH、胰高血糠素、生长激素释放抑制因子、生长激素、促生长因子、甲状旁腺激素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素、甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽、和血管加压素。

聚合物与肽生成共价结合产物的反应易于进行。本文为讨论简便起见，将聚合物称作(P)。聚合物含羟基时，先将其转变为活性碳酸酯衍生物，如碳酸对硝基苯酯。然后在温和的条件下，将该活化的衍生物与肽短时间反应，产生氨基甲酸酯衍生物，该衍生物保持生物活性。

上述反应和试剂仅起阐述性作用，并非排他性的；导致氨基甲酸乙酯或其他键的形成的其他激活剂也可应用。用本领域已知的试剂可将羟基转为氨基。再通过它们的羧基与肽相继偶联，导致酰胺的形成。

聚合物含羧基时，可将其转化为混合酐，并与肽的氨基反应，形成含酰胺键的结合物。在另一方法中，可用水溶性碳二亚胺处理，并与肽反应，产生含酰胺键的结合物。

肽结合物的活性和稳定性可以几种方式加以改变，如改变聚合物与肽的分子比，及使用不同分子大小的聚合物。通过改变掺入聚合物组合物中的聚乙二醇片断的比例和大小，可改变结合物的溶解度。通过将脂肪酸和和聚乙二醇基团小心的结合可平衡亲水和疏水特性。

下面所列是本发明的聚合物一肽结合物的某些阐述性修饰反应。

在上面包含I、J和K的反应流程中，表明了改善结合聚合物亲水性/亲脂性平衡的途径。结合聚合物中的酯基对酯酶水解敏感；因此，含酯基的结合聚合物可被修饰，酯基转变为醚基，后者更具抗水解特性。含L和M的反应流程表明羟基转变为羧酸基。在这方面，羧基将提供羧酸根阴离子，它比羟基是稳定性更好的官能团(形成离子配位复合物)，而羟基并不形成这样的复合物。用于含本发明的各种聚合物的配位离子复合物的形成的其它合适的阴离子来源官能团包括硫酸盐和磷酸盐基团。

总之，可有益地应用各种技术以改善本发明的聚合物—肽结合物的稳定性，这些技术包括：具有高度抗水解基团的聚合物的功能化，如前述酯基转为醚基；改善结合聚合物的亲脂性/亲水性平衡，使之适于被聚合物稳定的肽；以及裁减聚合物的分子量至适于被聚合物稳定的肽的分子量的水平。

对于本发明的治疗应用有价值的由聚二醇衍生的聚合物的独特性质是普遍的生物相容性。聚合物具有不同的水溶性，且无毒。它们无抗原性、无免疫原性，不干扰酶的生物活性。它们在血液中循环时间长，并易于从活机体排除。

本发明的产物被发现在维持肽的生物活性上是有用的，并可通过例如溶解于水或可接受的液体介质而制备，用于治疗给药。可通过非胃肠道或口服途径给药。可制备微细胶体悬液用于非胃肠道给药以产生贮存库效应，或经口服途径给药。

在干燥的冻干状态，本发明的肽—聚合物结合物具有良好的贮存稳定性，本发明结合物的溶液制剂同样以良好的贮存稳定性为特征。

本发明的治疗用聚合物—肽结合物可用来预防或治疗肽成分对之有效的任何情况的疾病状态。

此外，本发明的聚合物—肽结合物可用于生物系统或标本的成分、状况或疾病状态的诊断，也可用于非生理系统的诊断目的。

而且，本发明的聚合物—肽结合物在植物系统状况或疾病状态的预防或治疗上可有应用性。作为例子，结合物的肽成分在各种植物系统上可有经得起使用检验的杀虫、除草、杀真菌和/或农药功效。

更进一步，本发明的结合物对于诊断、免疫学和/或测试目的可以是相称的抗体或抗原。

在治疗使用上，本发明精心考虑了患有这些状况或疾病状态或对之潜在敏感及需要作这种治疗的动物试体的治疗方法，包括对这种动物投予有效量的对所述状况或疾病状态治疗有效的本发明的聚合物—肽结合物。

用本发明的聚合物—肽结合物治疗的试体包括人和非人动物(例如鸟、狗、猫、牛、马)试体，较好为哺乳动物试体，最好为人试体。

按所面临的具体情况或疾病状态，可以任何合适的治疗有效和安全剂量(在本技术领域内可容易地确定，无需过分实验)给动物试体投予本发明的聚合物—肽结合物。

—般来说，式(1)化合物达到治疗功效的合适剂量在接受者每公斤重每天1μg—100mg的范围内，较好在每公斤体重每天10μg—50mg的范围内，最好在每公斤体重每天10μg—50mg的范围内。所需的剂量全天适当的间隔以2、3、4、5、6或更多分剂量投予为宜。这些分剂量可以单位剂量形式给予，例如每单位剂量形式含有效成分10μg—1000mg，较好为50μg—500mg，最好为50μg—250mg。或者，如果接受者的病情需要，这些剂量可连续输注。

给药方式和剂量形式当然会影响化合物的治疗总量，它们对于特定的治疗应用是合乎需要的和有效的。

例如，对于同样的活性成分而言，口服给药剂量典型地为非胃肠道给药方法所用剂量水平的至少2倍，例如2—10倍。

本发明的聚合物—肽结合物本身可投药，也可以其药物学上可接受的酯、盐和其他生理功能衍生物的形式投药。

本发明还包括兽医用和人医用药物制剂，它们包括一种或一种以上本发明的聚合物—肽结合物作为活性剂。

在这样的药物制剂中，活性剂宜与一或或一种以上药物学上可接受的载体，并可任选地与任何其他治疗成分一起使用。在与其制剂成分相容的意义上，载体必须是药物学上可接受的，并且对其接受者必须不过分有害。如上所述，以获得所需药理效应的有效量和适于达到所需每日剂量的量提供活性剂。

制剂包括适于非胃肠使用的(注射)及非非胃肠道使用的(非注射)，具体给药方式包括口服、直肠、口腔、局部、鼻腔、眼、皮下、肌肉、静脉、经皮、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管、淋巴管、阴道和子宫内给药。以适于口服和非胃肠道给药的制剂为佳。

当活性剂用于含液体溶液的制剂时，制剂以口服或非胃肠道给药有利。当活性剂以液体混悬液制剂形式或作为粉剂以生物相容载体制剂形式使用时，制剂以口服、直肠或支气管给药有利。

当活性剂直接以粉状固体形式使用时，以口服给药有利。或者，可经粉末喷雾(在气体载体中)支气管给药，以形成粉末的气体混悬物，从包含合适的喷雾装置的呼吸器被患者吸入。

含本发明活性剂的制剂可方便地以单位剂量形式提供，可用药学领域任何公知的方法制备。这些方法通常包括将活性化合物与构成一种或一种以上附加成分的载体合并的步骤。典型的是，均匀地、紧密地将活性化合物与液体载体、细分的固体载体或与这二者合并，然后，若需要再将产物成形为所需制剂的剂量形式。

适于口服给药的本发明的制剂可制成分离的单位、如胶囊、扁囊剂、片剂或糖绽、各合预定量的粉末或颗粒状活性成分；或在水液或非水液体中的混悬液，如糖浆、醑剂、乳剂或顿服药。

任选地与一种或一种以上附加成分一起，通过压制或模制可制成片剂。压制的片剂可在合适的机器中压制而成，活性化合物为自由流动形，如粉末或颗粒，它们可任选地与粘合剂、崩解剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或排出剂一起混合制片。含粉状活性化合物与合适载体的模压片剂可在合适的机器中模压制成。

将活性化合物加到糖(如蔗糖)的浓水溶液中，其中还可加入任何附加成分，可制成糖浆。这些附加成分可包括调味剂、合适的防腐剂、延缓糖结晶的试剂和增加任何其他成分溶解度的试剂，例如多羟基醇(如丙三醇或山梨糖醇)。

适于非胃肠道给药的制剂以包括活性化合物的灭菌水制剂为适宜，它最好与接受者的血等渗(如生理盐水)。这样的制剂可包含混悬剂和增稠剂或用于将化合物带到血组分或一种或一种以上器官的其他微粒系统。这些制剂可以单位剂量或多单位剂量形式提供。

鼻喷雾制剂包含活性化合物的纯化水溶液和防腐剂及等渗剂。这样的制剂最好调节成与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。

直肠给药的制剂可用合适的载体，如可可脂、氢化脂肪或氢化脂肪羧酸，制成栓剂。

除了pH和等渗因素最好调节成适合眼用之外，用与鼻喷雾剂类似的方法制备眼制剂。

局部用制剂包含溶于或悬浮于一种或几种介质(如矿油、石油、多羟基醇或其他用于局部药物制剂的碱)的活性化合物。

在上述成分之外，本发明的制剂还可包括选自稀释剂、缓冲液、调味剂、崩解剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等的一种或一种以上附加成分。

在本发明的非治疗性应用中，聚合物—肽结合物可利用在肽和聚合物成分之间的共价结合或者非共价结合关系。此外，缔合的肽和聚合物成分可在治疗性肽试剂使用中加以利用，即通过适当的使用方法，如上文有关本发明共价结合的聚合物—肽结合物的说明讨论所描述的那些方法。

在这些非治疗性缔合肽—聚合物组合物中，肽和聚合物成分可先配制在一起以增强稳定性和抗降解能力，或者，这些成分可以是诸如多部分组合物的分开的部分，该组合物在使用时加以混合，并且在所得到的混合物中聚合物和肽之间没有缔合键时，该组合物将对快速衰变或其他降解方式敏感。不管缔合肽和聚合物组合物的形式，相对于缺乏这些缔合聚合物时的肽成分而言，本发明注重于增强肽的某些特性或方面或增加其实用性的缔合。

因此，本发明包括为在溶液中肽的体外稳定提供合适的聚合物，作为非治疗性应用的较好的阐述性应用。例如，聚合物可用来提高肽的温度稳定性和抗酶降解性。经本发明方法结合的肽，其温度稳定特性的提高，提供了改善诊断和研究试剂及试剂盒(如免疫测定试剂盒)的贮藏寿命，室温稳定性和牢固性的方法。作为具体例子，可将碱性磷酸酶按本发明方法共价地或缔合地联结于合适的聚合物，使这种磷酸酶在用作生物液体中抗体或抗原比色测定试剂盒中的试剂时具有稳定性。

下面的实施例用于阐述本发明，而不应看作对其的限制。

实施例1

轭合物1

聚山梨酸酯三油酸酯(polysorbate trioleate)碳酸对硝基苯酯

向在50ml无水丙酮中的氯甲酸对硝基苯酯(0.8g，4mmole)溶液中加入干燥的聚山梨酸酯三油酸酯(7g，4mmole)，再加入二甲基氨基吡啶(0.5g，4mmole)。将反应混合物于室温下搅拌24小时，减压除去溶剂，所得沉淀用干燥的苯稀释，通过硅藻土过滤。残渣在干苯中冷藏过夜，过滤除去多余沉淀。减压除去溶剂，剩余的苯在低压下挥发除去，得到6.4g聚山梨酸酯三油酸酯碳酸对硝基苯酯。

胰岛素与激活的聚合物的联结

向激活的聚山梨酸酯三油酸酯氯甲酸对硝基苯酯(1g)在蒸馏水的溶液中加入牛胰岛素(50mg)在0.1M pH8.8磷酸盐缓冲液的溶液。若需要，加入1N NaOH以维持pH。室温下将反应混合物搅拌2.5小时，然后，混合物用Sephadex G-75作凝胶过滤色谱。用0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液洗脱，用自动分级收集器收集流分，提纯得结合物1。用三硝基苯磺酸(TNBS)试验测定聚合物含量，用Biuret法测蛋白质浓度。聚合物对胰岛素的摩尔比测得为1∶1。

实施例2

轭合物2

如上所述，通过与氯甲酸对硝基苯酯反应使聚乙二醇单硬脂酸酯的末端羟基激活。向激活的聚合物(1g)在蒸馏水的溶液中加入溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH8.8)的牛胰岛素(80mg)。小心地用1NNaOH调节来维持该pH。搅拌3小时后，用过量甘氨酸终止反应，并用Sephadex G-75作凝胶过滤色谱。收集并冻干胰岛素/聚合物轭合物。用Biuret试验测定蛋白质含量，得到定量的得率。

实施例3

轭合物3

四氢-2-(12-溴代十二烷氧基)-2H吡喃

向12-溴-1-十二醇(1摩尔)在含对甲苯磺酸吡啶鎓盐(P-TSA)的二氯甲烷溶液中加入二氢吡喃(2摩尔)。将反应混合物搅拌24小时，然后用水洗二次，用无水MgSO₄干燥。减压除去二氯甲烷。如果需要，将所得产物用硅胶色谱法提纯。

聚乙二醇与四氢呋喃衍生物联结

将溶于干苯中的上述四氢吡喃衍生物加入至聚乙二醇(1摩尔)在含NaH(1摩尔)的干苯溶液中。反应混合物于室温下搅拌24小时。然后，将混合物通过硅胶柱，用苯洗脱。若需要，再进行柱色谱法提纯。室温下用P-TSA处理，除去保护性的四氢吡喃基。若需要，用柱色谱法提纯最终产物。如上所述，通过与氯甲酸对硝基苯酯反应激活聚合物的羟基。如对于轭合物1所描述的，进行与胰岛素的轭合。

实施例4

用牛胰岛素进行聚合物—胰岛素轭合物和天然胰岛素对比研究，在动物模型上测定它们的相对稳定性和活性。在动物研究中，聚合物—胰岛素降低血糖水平的效能与天然胰岛素的降血糖效能进行了比较。将平均重25g的雌性和雄性小白鼠禁食过夜，使用5只一组，用于历时2天分数期进行的处理。

在零时间，每只受试动物接受单剂天然胰岛素(第1组，100μg/kg，皮下注射)；天然胰岛素(第2组，1.5mg/kg，灌胃)；轭合物1(第3组，100μg/kg，灌胃)；或轭合物1(第4组，100μg/kg，皮下注射)。还有一组(第5组)不给任何种类的胰岛素，但在规定的取样时间前30分钟给葡萄糖。动物在处理前禁食过夜，及在研究间期禁食。所有试验物质均用磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)配制。在胰岛素处理后0.5、1、2、4、8和24小时的预定取样时间前30分钟，给动物大剂量葡萄糖(5g/kg，50％溶液，灌胃)，以使每只动物仅接受一剂胰岛素或轭合物1及一次葡萄糖冲击。在规定取样时间，从尾静脉取血，立即用一次触摸数字式葡萄糖测试仪(Life Scan)分析葡萄糖含量。试验结果见图1，第1—5组。

在30分钟时，第1组动物(天然胰岛素，皮下注射)的血糖水平是对照组(第5组，未处理)动物的约30％。第1组动物降血糖效应仅持续3.5小时。天然胰岛素经口给予(第2组)降低血糖水平最多至对照组的60％，此最大反应出现在胰岛素处理后30分钟。相反，第3组动物(轭合物1,100μg/kg，p.o.)葡萄糖水平降低，降血糖活性明显延迟发生。第3组动物的降血糖活性大于第2组动物，即使给予第3组的胰岛素剂量仅为给予第2组的1/15。在3小时后各个时间，第3组动物葡萄糖水平低于其他任何处理组，最大差异在4—8小时取样时间。在研究的前4个小时中，第4组动物(轭合物1,100μg/kg，s.c.)的葡萄糖水平按与第1组动物同样的历程变化。4小时后，第2组葡萄糖水平保持在对照组(未处理，第5组)之上，而在8小时时第4组葡萄糖水平降到第5组水平的62％，维持在第5组水平之下。

实施例5

在雄性和雌性小白鼠上进行胰岛素效能研究，用非结合形式的胰岛素和轭合物1作为试验物质。本研究的一个目的是确定轭合物1形式的胰岛素皮下给药时是否能以同样方式对血糖水平起作用。第二个目的是确定轭合物1的胰岛素复合物是否与游离胰岛素不同，口服给药时能起降低血糖水平的作用。结果见图2，其中“胰岛素复合物”指轭合物1。

从10只未处理的被禁食小白鼠(5雄5雌)得到基础血样，用于血清葡萄糖分析；图2中基础值用符号“○”表示。将另外三组(每组5雄5雌)禁食过夜，只灌胃给予葡萄糖负荷(5g/kg体重)。在给药后30、60和120分钟各处死10只动物，得到血样用于葡萄糖分析，分别对禁食小鼠经口(p.o.)和非胃肠道(s.c.)给予市售的胰岛素和轭合物1(在三个时刻各处死5雄5雌作血分析)，以提供不同的处理方式。用于表示图2结果的处理、给药途径和符号包括：(i)葡萄糖(5g/kg，p.o.)，符号“·”；(ii)胰岛素(100μg/kg，s.c.)和葡萄糖(5g/kg，p.o.)，符号：“_”；(iii)胰岛素(1.5mg/kg，p.o.)和葡萄糖(5g/kg，p.o.)，符号：“_”；(iv)轭合物1(100μg/kg.s.c.)和葡萄糖(5g/kg，p.o.)，符号：“□”；(v)轭合物1(250μg/kg，s.c.)和葡萄糖(5k/kg，p.o.)，符号：“□”；(vi)轭合物1(1.5mg/kg，s.c.)和葡萄糖(5g/kg，p.o.)，符号：“△”，在轭合物1的这些试验中，给药溶液中蛋白质的浓度为0.1mg蛋白/ml溶液；为对比的目的，还包括在给药溶液中蛋白质浓度为0.78mg蛋白/ml溶液的经修饰的共价结合的胰岛素-聚合物轭合物，(vii)经修饰的轭合物1(100μg/kg，s.c.)和葡萄糖(5g/kg，p.o.)，符号：“△”。

在葡萄糖负荷前15分钟给予胰岛素。

除了基础组动物外，对所有动物灌胃给予葡萄糖，剂量5g/kg(以生理盐水配制的50％w/v溶液，10ml/kg)。当皮下注射胰岛素时，剂量为100μg/kg(以生理盐水配制的0.004％(w/v)溶液，2.5ml/kg)。当轭合物1聚合物—胰岛素复合物以灌胃给予时，剂量为1.56mg/kg(2.0ml/kg未稀释的受试物)。当轭合物1聚合物—胰岛素复合物以皮下注射给药时，剂量为100μg/kg(1.28ml/kg，0.78mg/ml所接受的溶液的1∶10稀释液)或250μg/kg(3.20ml/kg所接受溶液的1∶10稀释剂)。经修饰的轭合物1含0.1mg胰岛素/ml，剂量为1.0ml/kg，即100μg/kg。

用Gemini centrifugal Analyzer和市售葡萄试剂盒测定葡萄糖。测试方法是联合酶促反应，即，将己糖激酶催化的葡萄糖和ATP的反应与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶反应联用，得到NADH。分析双份样品，报告平均值。为了测定存在于某些样品中的很高的葡萄糖浓度，必须稀释(1∶2或1∶4)某些血清样品。

葡萄糖负荷后30分钟，平均血清葡萄糖升至高水平，60分钟时降低，120分钟时低于基线。如果皮下注射市售胰岛素(100μg/kg体重)，在防止血糖升高上高度有效。然而，若经口给予胰岛素(1.5mg/kg的高剂量)，对血糖的升高无效。这是意料之中的，因为胰岛素是一种蛋白质，在消化道易水解，不能完整地吸收进血流。

当以100或250μg/kg皮下注射轭合物1时，在葡萄糖负荷后抑制血糖升高上高度有效。皮下注射轭合物1 100μg/kg后，在30和60分钟时，平均血清葡萄糖值都明显地低于皮下注射100μg/kg游离形胰岛素时的情形。皮下注射轭合物1 250μg/kg后，在30分钟时平均血清葡萄糖降低(虽不显著)，60分钟时显著降低，120分钟时回到基线。无论是皮下注射游离形胰岛素100μg/kg或轭化合物1 100μg/kg，120分钟时葡萄糖水平均在基线以下。

要修饰的轭合物1 100μg/kg在给药后30分钟时产生血糖明显降低。

实施例6

聚山梨酸酯单棕榈酸酯(Polysorbate Monopalmitate)的碳酸对硝基苯酯的制备

用干苯经共沸法先将聚山梨酸酯单棕榈酸酯干燥。

向干聚合物(2g，2mmole)在10ml干吡啶的溶液中加入氯甲酸对硝基苯酯(0.6g，3mmole)。将混合物在室温下搅拌24小时。将反应混合物在冰中冷却，用于苯稀释，经过滤器过滤。重复此步骤，最后在旋转式蒸发器上除去溶剂。真空除去痕量溶剂。产物的产量为1.8g。

实施例7

聚山梨酸酯单棕榈酸酯与胰岛素轭合物的制备

按照前面所述的实施例1的轭合反应方法，但聚山梨酸酯单棕榈酸酯的用量为1g，胰岛素素的用量为80mg，用HPLC分离反应产物，得到胰岛素—聚山梨酸酯单棕榈酸酯共价结合的轭合物。

实施例8

酶—聚合物轭合物的制备

用与实施例1中关于轭合物1所描述的同样方法进行碱性磷酸酶(AP)与聚合物的偶联。而且，为确定聚合物/蛋白质是高比例还是低比例更有利，用140摩尔聚合物/摩尔酶和14摩尔聚合物/摩尔酶制备轭合物。对于每分子轭合的AP，高、低比例的聚合物基团数分别为30和5。

下面的操作是为了得到约5基团/摩尔的碱性磷酸酶：将4.1mg(无盐的)溶于0.05M碳酸氢钠。向此溶液中加入激活的聚合物(0.75mg)的水/二甲亚砜溶液，室温下将溶液搅拌3—12小时。将所得反应混合物在透析管中对盐溶液(0.3N NaCl)透析(MW截止值12,000—14,000)12小时，换4—6次透析液。同样方法用于高比例轭合物。用Biuret法测定透析后物质的总蛋白浓度。

活性评估和稳定性研究

按A.Voller等Bulletin WHO，53，55(1976)的方法进行磷酸酶试验。将等量酶液(50μl)加到微孔中，与200μl底物溶液(10g/l，磷酸4-硝基苯酯在20％乙醇胺缓冲液中的溶液，pH9.3)混合，于室温下培养45分钟。用50μl 3M NaCl终止反应。在微板读数仪上测量405nm处吸收值。

在各种条件下比较磷酸酶与天然酶的活性。

将含同样浓度碱性磷酸酶和碱性磷酸酶—聚合物轭合物的稀溶液在各种温度下贮存。定期测试酶活性。将5℃、15℃、35℃和55℃下受试的两种聚合物与贮于5℃的对照用碱性磷酸酶进行比较。

如表A所示，两种聚合物的起始酶活性均比对照组高约三倍。两种聚合物—酶轭合物均比天然酶提高热稳定性，以聚合物/酶较高比例为特征的轭合物尤为明显。

                      DAY

TEMP℃        0        2        3        4        5        6

AP/HIGH 5    399       360      321      371      343      337

        15             158      115      126      24       184

        35             132      112      135      138      123

        55             36       25       10       14AP/LOW

    5    324    252    210    220    162    159

   15          83     47     40     38     51

   35          61     36     35     33     32

   55          17     6      2      2AP/CONTROL

   5    100   100    100    100    100    100

   15         89     74     43     36     28

   35         53     48     21     20     20

   55         10     2      1      2实施例9

结合物1A

向用pH9.2的0.05M碳酸氢钠缓冲液配制的胰岛素(50mg)溶液中加入用水/二甲亚砜配成的活化聚合物(1g)的溶液，于室温下搅拌3小时。小心地用1N NaOH调节，保持混合物的pH。然后将反应混合物对0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液透析。将提纯的产物冻干。用Biuret法测定蛋白质含量(48mg)。用TNBB试验测定联结于胰岛素的聚合物链的数目，测得比例为摩尔聚合物对1摩尔胰岛素。

实施例10

按如下方法合成降钙素-OT₅₀。在5℃下，在用去离子水(1.5ml)和硼酸盐缓冲液配制的鲑降钙素(5mg，Becham)溶液中边搅拌边加入活化OT(160mg)在2.0ml水中的溶液。所得溶液于20℃下搅拌1.5小时，将溶液的pH调至8.8。将反应液再搅拌0.5小时，然后用1M稀盐酸使pH达3.8。反应混合物贮于5℃过夜。先用透板膜(MWCO3500)将溶液对PBS缓冲液(pH7.5，2L)透析，再对PBS缓冲液(调至pH3.6，4×1L)透析。将透析液通过0.22μ过滤器过滤，并贮于5℃。用Biuret法和HPLC测蛋白浓度，以天然降钙素为标准。用HPLC法，在体积排除色谱柱上，用0.05M磷酸盐缓冲液(调至pH3.8)洗脱，进行纯度分析。

实施例11

按如下方法合成降钙素-001。在5℃下，去用去离子水(2ml)和硼酸盐缓冲液(1.5ml，0.1M，pH8.8)配制的鲑降钙素(5mg)溶液中，边搅拌边加入活化001(130mg)的二甲亚砜(1ml)溶液。将该溶液于20℃下搅拌1.5小时，用1N盐酸调节pH至8.8。将反应液再搅拌1小时，然后将pH调至3.8，反应混合物贮于5℃过夜。在反应混合物中加入4ml去离子水，并将上清液在透析膜(MWCO3500)中先对磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4，2L)透析，再对PBS缓冲液(调节至pH3.6)透析4次。透析液通过0.22μ过滤器过滤，并贮于5℃。用Biuret法和HPLC法测蛋白浓度，以天然降钙素为标准。用HPLC分析纯度，使用C—8反相柱，以乙腈/0.1％TFA作梯度洗脱(30—55％，经25分钟)。

实施例12

按如下方法制备胰岛素-OT。称取2.0g活化OT聚合物于250ml圆底烧瓶中。将OT聚合物完全溶于10ml无水DMSO，加入20ml去离子水，搅拌5分钟。将所得的OT溶液冷至10℃。将溶于40ml 0.1M硼酸钠缓冲液(pH9.3)的100mg胰岛素(Sigma/牛胰腺/Zn)一次全部加入至OT聚合物溶液中。反应混合物转为浅黄色。30分钟后；用2N HCl将溶液的pH调至8.8。再将反应液搅拌1.5小时，调节pH至8.4。反应混合物通过0.8μ滤膜过滤，并在PBS缓冲(pH7.4)中透析。经透析的混合物通过0.22μ滤器过滤并浓缩。用Sephadex G-75将浓缩的样品作色谱层析(洗脱液为0.05M磷酸钠缓冲液)。柱：2.5cm(直径)×32cm(高)。分析表明，胰岛素轭合物的得率是定量的，为每摩尔胰岛素2摩尔聚合物。

实施例13

将001-胰岛素分别以0.5mg、2mg和5mg剂量经口给予已给冲击量葡萄糖的治疗组猴(cynomolgus monkey)。计算每一治疗组的曲线下的面积(AUC)。用这一方法，较低的AUC值表示降血糖的最大效能。AUC结果见图18。这些结果表明，单剂经口给予001-胰岛素对于防止cynomlgus猴在给予冲击量葡萄糖后的血糖升高上是有效的。经口给予001-胰岛素后的AUC比未治疗的动物的AUC少1/2，证明001-胰岛素在猴上的显著降血糖活性。

实施例14

在大鼠低钙血模型上，评估经口给予的聚合物—降钙素轭合物的降血钙活性。以如下方法评估两个聚合物—降钙素衍生物(OT-降钙素和001-降钙素)。雄性Sprague-Dawley大鼠(平均重54g)被禁食过夜。将动物随机分配到各治疗组(每组5只)，测各组的基础血清钙水平。然后治疗组分别接受单剂来修饰的降钙素(50mg/kg)、OT-降钙素(25ng/kg)和001-降钙素，(250ng/kg、2.5μg/kg和25μg/kg)。这些剂量经口给予。给药后2小时和4小时测定血清钙。结果在图4中以原血清钙水平的百分数对时间表示。□代表降钙素；○代表001，250ng；■代表001，2.5μg；△代表001，25μg，●代表OT，2.5μg。结果显示剂量依赖性的血清钙显著降低，表明轭合物在开始评估的4个多小时内有活性。延的作用时间可能与口服后的显著生物利用度相符合。

实施例15

按如下方法证明在大鼠模型上口服聚合物—降钙素后的降血钙活性。雄性Sprague-Dawley大鼠，平均重54克，禁食过夜。将动物随机分配到各治疗组(每组4只)，测定每组的基础血清钙水平。对照组通过皮下注射(s.c.)途径(50ng/kg)或口服(2.5μg/kg)接受单剂未修饰的降钙素(ct)。治疗组通过口服途径接受OT1-ct或OT2-ct(25μg/kg)。给药2小时和4小时后测定血清钙。结果在图5中以原血清钙水平的百分数对时间表示。OT1-ct和OT2-ct是相同降钙素-聚合物轭合物的重复制剂，对它们挨个进行评估以证明一个批量与另一批量的反应一致性。结果显示血清钙的显著降低，表明轭合物在开始评估的4个多小时内有活性。

实施例16

按如下方法在糖尿病(BB)大鼠模型上评估聚合物—胰岛素。BB大鼠是人胰岛素依赖性糖尿病的可靠模型。不每天皮下注射(sc)胰岛素，BB大鼠在2天内死亡。在14天的研究中，停用皮下注射胰岛素，动物改为用口服低剂量(100μg/kg/天)，中剂量(3mg/kg/gd)和高剂量(6mg/kg/天)的聚合物—胰岛素进行治疗。结果(平均存活时间)见图6。从皮下注射突然改为口服构成了特别严格的对聚合物胰岛素的试验。结果表明，低剂量给药的动物未摄取到可以存活的足够量的胰岛素；中剂量给药组显示存活时间增加；高剂量给药组中某些动物仅口服聚合物胰岛素即存活了整个研究时期(14天)。聚合物胰岛素是以非最适化制剂形式给药。研究还显示下午比上午血糖水平有统计学意义的降低，若动物每天接受多次给药代替单次大剂量，则血糖水平将受到更好的控制。对正常(非糖尿糖)动物每天经口给予聚合物—胰岛素，引起上午血糠水平明显降低。

实施例17

猴(cynomolgous monkey)口服001-胰岛素后效果如下所示。6只猴(3雄3雌，平均重2.5kg)禁食过夜。测定基础血糖水平，然后用50％的葡萄糖溶液灌胃使动物接受3mg/kg的冲击量葡萄糖。在不同时间(0—4小时)报告血糖水平。二天后，再将动物禁食，以3g/kg葡萄糖进行冲击。这时动物经口接受001-胰岛素(相当于胰岛素5mg/kg)。在各个时间记录血糖水平。再用同样的动物和方案测定2mg/kg和0.5mg/kg剂量001-胰岛素的效应，在治疗之间给予二天的排除时间。每次治疗(对照、0.5、2或5mg/kg)的结果以血糖对时间的百分变化计算，结果见图7，其中□代表葡萄糖，△代表5mmg，·代表2mg，○代表0.5mg。给予冲击量的葡萄糖2小时后，治疗组血糖水平的平均升高为非治疗组的1/3。

实施例18

按如下方法测定胰岛素和OT胰岛素的胰凝乳蛋白酶消化。将胰凝乳蛋白酶(提纯的Sigam 1S型)与溶于磷酸盐缓冲盐水(pH8)的胰岛素(牛)或OT-胰岛素轭合物一起在37℃下培养。定期取出一定量，加入1/10体积的2％三氟乙酸(TFA)以停止反应。用HPLC分析试样，结果见图3，其中OT-胰岛素用■代表，胰岛素用□代表。

实施本发明的最佳方式

本发明所提供的最佳结合稳定的多肽聚合物组合物和制剂涉及共价轭合的肽复合物，其中，肽共价结合于掺入亲水成分(如线性聚二醇)作为其组成部分的一个或一个以上聚合物分子，并且其中所述聚合物掺入一个亲脂性成分作为其组成部分。

本发明的特佳方面涉及生理活性肽组合物，包括与含(i)线性聚二醇基团和(ii)亲脂基团的聚合物共价连结的生理活性肽，其中肽、线性聚二醇基团和亲脂性基团相互间在构象上的排列使生理活性肽组合物中的生理活性肽相对于单独的生理活性肽(即缺乏偶联于其上的聚合物的非结合形)对酶降解的体内耐受力增强。

在另一方面，本发明涉及三维构橡的生理活性肽组合物，包括与含(i)线性聚二醇基团和(ii)亲脂性基团的聚山梨酸酯复合物共价连结的生理活性肽，其中生理活性肽、线性聚二醇基团和亲脂性基团相互间在构象上的排列使(a)在三维构象中亲脂基团外露和(b)生理活性组合物中的生理活性肽相对于单独的生理活性肽对酶降解的体内耐受力增强。

在另一更佳的方面，本发明涉及多价配体结合的肽复合物，该肽复合物包括甘油三酯主链基团和通过结合于甘油三酯主链基团碳原子上的聚二醇间隔基与甘油三酯主链基团共价结合的生物活性肽；以及直接与甘油三酯主链基团上的碳原子共价连接或通过聚二醇间隔基共价结合的至少一个脂肪酸基团。

在这种多价配体结合的肽复合物中，甘油三酯生物活性基团的α和β碳原子可有直接共价结合其上的，或通过聚二醇间隔基间接地共价结合其上的脂肪酸基团。或者，脂肪酸基团可直接地或通过聚二醇间隔基共价结合于甘油三酯主链基团的α和α′碳，而生物活性肽与甘油三酯的β碳共价联结，直接地共价结合于其上或通过聚二醇间隔基间接地结合于其上。

本发明包括本文讨论的结合稳定的多肽结合物对于缓解和治疗涉及肽缺乏的疾病状态的口服给药剂量的应用。

Claims (39)

1.一种肽组合物，其特征在于包含稳定地、轭合地与含亲脂性基团和亲水性基团的一个或一个以上的非天然存在的聚合物分子联结。

2.按权利要求1所述的肽组合物，其中肽共价地、轭合地与一个或一个以上的非天然存在的聚合物分子联结。

3.按权利要求1所述的肽组合物，其中肽非共价地与非天然存在的聚合物轭合联结。

4.按权利要求3所述的肽组合物，其中肽通过氢键、离子键和范德华键等缔合键非共价地、轭合地与非天然存在的聚合物联结。

5.按权利要求1所述的肽组合物，其中肽为生理活性治疗用肽。

6.按权利要求1所述的肽组合物，其中肽为用于反应性测定体外或体内状况或成分存在与否的诊断用肽。

7.按权利要求1所述的肽组合物，其中肽在预防或治疗植物或其成分的疾病上有效。

8.按权利要求1所述的肽组合物，其中非天然存在的聚合物包含(i)线性聚二醇基团和(ii)亲脂性基团。

9.按权利要求1所述的肽组合物，其中

非天然存在的聚合物包含(i)线性聚二醇基团和(ii)亲脂性基团；

肽包括生理活性肽；以及

生理活性肽、线性聚二醇基团和亲脂性基团在构象上的相互间排列使组合物中的生理活性肽相对于单独的生理活性肽在体内对酶降解的耐受性增强。

10.生理活性肽组合物，其特征在于：包含与含(i)线性聚二醇基团和(ii)亲脂基团的一个或一个以上的聚合物分子共价连结的生理活性肽，其中生理活性肽、线性聚二醇基团和亲脂性基团在构象上相互间的排列使生理活性肽组合物中的生理活性肽相对于单独的生理活性肽对体内酶降解的耐受力增强。

11.三维构象的生理活性肽组合物，其特征在于：包含与含(i)线性聚二醇基团和(ii)亲脂性基团的聚山梨酸酯复合物共价连结的生理活性肽，其中生理活性肽、线性聚二醇基团和亲脂性基团相互间在构象上的排列使(a)在三维构象中亲脂基团外露和(b)生理活性组合物中的生理活性肽相对于单独的生理活性肽对体内酶降解的耐受力增强。

12.多价配体结合的肽复合物，其特征在于：包含甘油三酯主链基团和通过结合于甘油三酯主链基团碳原子上的聚二醇间隔基与甘油三酯主链基团共价结合的生物活性肽；以及直接与甘油三酯主链基团上的碳原子共价连接或通过聚二醇间隔基共价结合的至少一个脂肪酸基团。

13.按权利要求12所述的多价配体结合的肽复合物，其中，甘油三酯生物活性基团的α′和β位碳原子有直接共价结合其上的，或通过聚二醇间隔基间接地共价结合其上的脂肪酸基团。

14.按权利要求12所述的多价配体结合的肽复合物，其中，脂肪酸基团直接地或通过聚二醇间隔基共价结合于甘油三酯主链基团的α和α′碳，而生物活性肽与甘油三酯的β碳共价联结，直接地共价结合于其上或通过聚二醇间隔基间接地结合于其上。

15.聚山梨酸酯复合物，其特征在于：含包括甘油三酯主链的聚山梨酸酯成分，在甘油三酯主链上具有共价结合于其α，α′和β碳原子之一的脂肪酸基团，并具有共价结合于其α、α′和β碳原子之一的聚乙二醇基团。

16.按权利要求15所述的聚山梨酸酯复合物，其中聚山梨酸酯成分具有共价结合于其上的生理活性成分。

17.按权利要求16所述的聚山梨酸酯复合物，其中生理活性成分共价结合于聚乙二醇基团。

18.一种稳定的、水溶性的、轭合的肽复合物，其特征在于包含稳定地、轭合地联结于聚乙二醇修饰的糖脂成分上的肽。

19.按权利要求18所述的肽复合物，其中肽通过多肽中游离氨基酸上的不稳定共价键与聚乙二醇修饰的糖脂成分共价联结，其中不稳定共价键在体内可被生化水解和/或蛋白分解所切断。

20.按权利要求18所述的肽复合物，其中聚乙二醇修饰的糖脂成分包括聚山梨酸酯聚合物。

21.按权利要求20所述的肽复合物，其中聚山梨酸酯聚合物包含选自单棕榈酸酯、二棕榈酸酯、单月桂酸酯、二月桂酸酯、三月桂酸酯、单油酸酯、二油酸酯、三油酸酯、单硬脂酸酯、二硬脂酸酯和三硬脂酸酯的脂肪酸酯基团。

22.按权利要求18所述的肽复合物，其中聚二醇修饰的糖脂部分包括选自脂肪酸的聚二醇醚和脂肪酸的聚二醇酯的聚合物，其中脂肪酸包括选自月桂酸、棕榈酸、油酸和硬脂酸的脂肪酸。

23.按权利要求18所述的肽复合物，其中肽选自胰岛素、降钙素、ACTH、胰高血糖素、生长激素释放抑制激素、生长激素、促生长因子、甲状旁腺激素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素、甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽、血管加压素、非天然存在的类啡肽、过氧化物岐化酶、干扰素、天门冬氨酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨基酶、腺苷脱氨基酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶。

24.按权利要求19所述的肽复合物，其特征还在于：含包括甘油三酯主链的聚山梨酸酯成分，在甘油三酯主链上具有共价结合于其α、α′和β碳原子之一脂肪酸基团，并具有共价结合于其α、α′和β碳原子之一的聚乙二醇基团。

25.按权利要求24所述的肽复合物，其中肽共价结合于甘油三酯主链的β碳原子。

26.按权利要求18所述的肽复合物，其中肽为蛋白质。

27.按权利要求24所述的肽复合物，其中甘油三酯主链在其β碳原子和α或α′碳原子之间包含生物相容的二价间隔基。

28.聚山梨酸酯复合物，其特征在于：聚山梨酸酯成分包含甘油三酯主链，该甘油三酯主链具有分别共价结合于其α、α′和β碳原子上的官能团：(i)脂肪酸基团；和(ii)具有共价结合含于其上的生理活性成分的聚二醇基团。

29.按权利要求28所述的聚山梨酸酯复合物，其中生理活性成分共价结合于聚乙二醇基团的末端官能团。

30.按权利要求1所述的肽组合物，其中聚合物分子量为500—10,000道尔顿。

31.按权利要求1所述的肽组合物，其中肽选自：胰岛素、降钙素、ACTH、胰高血糖素、生长激素释放抑制因子、生长激素、促生长因子、甲状旁腺激素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素、甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽、血管加压素、非天然存在的类啡肽、过氧化物岐化酶、干扰素、天门冬氨酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨基酶、腺苷脱氨基酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，和木瓜蛋白酶。

32.按权利要求1所述的肽组合物，其中肽包括胰岛素。

33.聚合物—肽轭合物，其特征在于：包含选自以下分子式表示的聚合物的轭合聚合物。

其中W、X、Y、Z的总数为4—100，R₁、R₂和R₃各自选自月桂酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸基，或R₁—R₂各为羟基而R₃为月桂酸、棕榈酸、油酸或硬脂酸基；

m＝10-16

x，y，z的总数＝8-240

其中m为10—16、n＋m＝8—240，或当有一个以上n时，全部n＋m的总数为8—240，且其中糖脂中的糖部分可任意地被甘油或氨基甘油取代；

Z＝OTs或Br

X＝O或OCH₂CONH其中，m和n如上所定义；且其中，所述聚合物轭合地联结于肽。

34.缓解胰岛素缺乏用的口服给药剂型，其特征在于：包含药学上可接受的载体和稳定的水溶性轭合的胰岛素复合物，后者包含稳定地、轭合地连接于生理学上相容的聚二醇修饰的糖脂基团的胰岛素。

35.在显示胰岛素缺乏的人或非人哺乳动物受试者身上治疗胰岛素缺乏的方法，其特征在于：给受试者口服有效量的含共价结合于生理学上相容的聚二醇修饰的糖脂基团的胰岛素的稳定的水溶性轭合胰岛素复合物。

36.在人或非人哺乳动物受试者身上用对其有效的肽剂预防或调节性处理潜在或已发展的病情或疾病状态的方法，其特征在于：给予受试者有效量的含稳定的、水溶性、轭合肽复合物的轭合的肽组合物，肽复合物中含偶联于生理相容性聚乙二醇修饰的糖脂成分的上述肽剂。

37.延长活性肽在体内或体外系统中的活性的方法，其特征在于：将所述肽与含亲脂基团和亲水聚合物成分的一个或一个以上的非天然存在的聚合物轭合连结，得到轭合连结的聚合物—肽组合物，并将轭合连结的聚合物—肽组合物引入体内或体外系统。

38.经口服用于治疗胰岛素缺乏的轭合的聚合物—胰岛素组合物。

39.用于以有效的肽剂预防或调节性治疗潜在或已发展的病情或疾病的轭合的肽聚合物组合物，其特征在于，所述组合物包含稳定的、水溶性的、轭合的肽复合物，后者含偶联于生理相容性聚乙二醇修饰的糖脂成分的肽剂。

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