CN111150841A - 一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111150841A
CN111150841A CN201911406025.0A CN201911406025A CN111150841A CN 111150841 A CN111150841 A CN 111150841A CN 201911406025 A CN201911406025 A CN 201911406025A CN 111150841 A CN111150841 A CN 111150841A
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
active
microcarrier
glu
cpg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911406025.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111150841B (zh
Inventor
倪健
梁辉
崔大祥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Youjian Biopharmaceutical Technology Shenzhen Co ltd
Shanghai National Engineering Research Center for Nanotechnology Co Ltd
Original Assignee
Yourui Biomedical Technology (shenzhen) Co Ltd
Shanghai National Engineering Research Center for Nanotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yourui Biomedical Technology (shenzhen) Co Ltd, Shanghai National Engineering Research Center for Nanotechnology Co Ltd filed Critical Yourui Biomedical Technology (shenzhen) Co Ltd
Priority to CN201911406025.0A priority Critical patent/CN111150841B/zh
Publication of CN111150841A publication Critical patent/CN111150841A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111150841B publication Critical patent/CN111150841B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2086—IL-13 to IL-16
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1658—Proteins, e.g. albumin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明提供一种主动免疫调控微粒，包括微载体，所述微载体上至少负载有SYNZIP1多肽、SYNZIP2多肽、核酸分子CpG、T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原，所述SYNZIP1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述SYNZIP2多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明中的主动免疫调控微粒可以克服肿瘤微环境的免疫抑制环境，打破免疫耐受，提高整个免疫系统对肿瘤抗原的免疫应答，快速高效的激活肿瘤特异性B细胞和T细胞的免疫反应杀伤肿瘤，通过细胞因子的刺激还可以促进免疫细胞的扩增。以通过皮下注射的方式给药，并且可以通过毛细血管被动靶向到肿瘤组织内部，迅速的被免疫细胞和肿瘤细胞内吞。

Description

一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及疫苗制剂领域，特别是涉及一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用。
背景技术
治疗性疫苗(Therapeutic Vaccine)是近年建立和发展起来的肿瘤免疫治疗新概念，是指能够打破慢性感染者体内免疫耐受，重建或增强免疫应答的疫苗。肿瘤治疗性疫苗的基本原理是通过靶向肿瘤相关或肿瘤特异性的抗原肽，提升免疫系统对于含此类抗原肽的癌细胞的识别与杀伤能力。具体步骤包括以下四步：1)外源抗原进入机体后，被抗原呈递细胞(APC)以胞吞形式摄入，进而在胞内被水解为能与MHC-I或MHC-II类分子结合的抗原肽片段；2)通过MHC将抗原肽递呈至APC表面，形成pMHC复合物；3)通过与pMHC-TCR的互作，被MHC-II类分子呈递的抗原肽可激活CD4+T细胞，释放多种细胞因子促使相关免疫细胞的活化和增殖，被MHC-I类分子呈递的抗原肽可激活CD8+T细胞；4)CD8+T细胞在pMHC I-TCR和CD4+Th细胞的共同刺激下进一步分化形成细胞毒性淋巴细胞(CTL)，通过分泌穿孔素等细胞毒素直接杀伤靶细胞，从而实现消除肿瘤的作用。根据肿瘤疫苗的来源，可分为肿瘤细胞疫苗、基因疫苗、多肽疫苗、树突状细胞疫苗等，根据作用机制不同治疗性疫苗可分为两类，一类是通过产生效应细胞起作用，如产生特异性杀伤性T细胞，用于肿瘤治疗或是清除病毒(HBV、HCV、HIV、HPV等)感染细胞；另一类是通过诱导体内产生抗体起作用，抗体可以结合活性分子进而封闭活性分子的功能，抗体还可以通过补体及ADCC效应杀伤肿瘤细胞。肿瘤疫苗作为肿瘤免疫治疗的一个分支，相对于传统肿瘤治疗“杀敌一千自损八百”的方式，肿瘤疫苗能在有效避免健康细胞损伤的前提下激活免疫系统，具有很好的开发前景。肿瘤免疫疗法相比于传统疗法，具有独特的优势。由于免疫疗法的机制在于激活自身的免疫系统，识别并清除肿瘤细胞，因此一旦起效，患者将有可能获得动态的、持续的抗肿瘤免疫反应，肿瘤复发率低，甚至对于晚期癌症可实现临床治愈。
目前治疗性疫苗存在的技术问题：1、内源性蛋白作为抗原产生的抗体起效慢、滴度低，一般的肿瘤疫苗其发挥疗效一般需要3-4个月的时间，且有可能需要进行多次免疫，发挥作用所需的周期太长，并且刺激产生的特异性抗体滴度过低。2、刺激产生的抗体特异性差，3，肿瘤免疫耐受的问题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用，用于解决现有技术中疫苗的抗肿瘤效果不佳的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供第一方面提供一种主动免疫调控微粒，所述主动免疫调控微粒包括微载体，所述微载体上至少负载有SYNZIP1多肽、SYNZIP2多肽、核酸分子CpG、T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原，所述SYNZIP1多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，所述SYNZIP2多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明第二方面提供主动免疫调控微粒的制备方法，至少包括如下步骤：
1)制备SYNZIP2-CpG-微载体颗粒；
2)将SYNZIP1分别与T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原连接，获得连接物I、连接物II和连接物III；
3)将连接物I、连接物II和连接物III和SYNZIP2-CpG-微载体颗粒混合，获得所述主动免疫调控微粒。
本发明第三方面提供前述主动免疫调控微粒在制备细胞因子促进剂或恶性实体瘤治疗药物中的用途。
如上所述，本发明的一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用，具有以下有益效果：
本发明中的主动免疫调控微粒融合了多种免疫刺激分子和免疫细胞靶向分子，本发明中的主动免疫调控微粒可以克服肿瘤微环境的免疫抑制环境，打破免疫耐受，提高整个免疫系统对肿瘤抗原的免疫应答，快速高效的激活肿瘤特异性B细胞和T细胞的免疫反应杀伤肿瘤。同时本发明中还融合了细胞因子IL-15，除了可以激活免疫细胞外，通过细胞因子的刺激还可以促进免疫细胞的扩增。最后本发明中的免疫微球是纳米级别的，可以通过皮下注射的方式给药，并且可以通过毛细血管被动靶向到肿瘤组织内部，迅速的被免疫细胞和肿瘤细胞内吞。总之，本发明克服了目前肿瘤治疗性疫苗的缺点，综合了目前已有的细胞治疗，抗体治疗和治疗性疫苗的诸多有点，开发而成的全新一代主动免疫治疗剂。
附图说明
图1：主动免疫调控微粒模式图。
图2：模拟的多肽SYNZIP1/SYNZIP2三维结构
图3：纯化后的SYNZIP-1-FcOP蛋白电泳图。
图4：IL-15-SYNZIP1纯化后的蛋白电泳图。
图5：显微镜下的主动免疫治疗性纳米微球PLGA-CpG-FcOP-IL-15-neo20
图6：PBMC对免疫微球的内吞作用。
图7：不同浓度的免疫微球刺激后细胞因子分泌情况。
具体实施方式
本发明旨在克服目前肿瘤免疫治疗中的缺点，综合目前肿瘤免疫治疗的优点，设计出了一种主动免疫调控微粒，通过激活机体的免疫系统，刺激机体快速产生特异性的免疫反应，同时激活体液免疫和细胞免疫，既可以产生特异性的抗体，也可以产生针对肿瘤特异性杀伤T细胞。本发明中的主动免疫调控微粒以具有优异的生物相容性和可降解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)为基本骨架，其粒径约为200nm,易穿透血管内皮细胞(肿瘤内皮间隙为200-780nm)到达靶组织，淋巴细胞大部分直径为6-8um，易于被淋巴细胞吞噬。在该纳米颗粒中包含了新型的免疫增强剂CpG基序的寡聚脱氧核苷酸(Oligodeoxy-nucleotides containing CpG motifs，CpG ODN)，IL-15细胞因子，特异性靶向免疫细胞的优化后的抗体片段(FcOP)，以及肿瘤新抗原，本发明中通过在微球中融合一段SYNZIP1/2螺旋拉链结构多肽，通过SYNZIP1/2天然的组成二聚体、将IL-15、优化后的Fc片段和肿瘤新抗原的氨基酸片段偶联到纳米免疫微球表面，制备的微球可以根据治疗的需要通过螺旋拉链结构的自组装获得不同的主动免疫调控的纳米微球，该主动免疫调控剂主要用于基于新抗原治疗的恶性实体瘤的治疗。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
如图1所示，本发明的主动免疫调控微粒，包括微载体，所述微载体上至少负载有SYNZIP1多肽、SYNZIP2多肽、核酸分子CpG、T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原，所述SYNZIP1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述SYNZIP2多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述主动免疫调控微粒是指可以增强免疫系统对肿瘤抗原的免疫应答的物质。
所述主动免疫调控微粒可以为微球。
所述主动免疫调控微粒为纳米级的微粒。
具体的，SYNZIP1核酸序列
AACCTGGTTGCGCAGCTCGAAAACGAAGTTGCGTCTCTGGAAAATGAGAACGAAACCCTGAAGAAAAAGAACCTGCACAAAAAAGACCTGATCGCGTACCTGGAGAAAGAAATCGCGAATCTGCGTAAGAAAATCGAAGAATGA(SEQ ID NO：8)
SYNZIP1氨基酸序列
NLVAQLENEVASLENENETLKKKNLHKKDLIAYLEKEIANLRKKIEE(SEQ ID NO：1)
SYNZIP2核酸序列
GCGCGTAACGCGTATCTGCGTAAGAAAATCGCACGTCTGAAAAAAGACAACCTGCAGCTGGAACGTGATGAACAGAACCTGGAAAAAATCATCGCGAACCTGCGTGACGAAATCGCGCGTCTCGAAAACGAAGTTGCGTCTCACGAACAGTGA(SEQ ID NO：9)
SYNZIP2氨基酸序列
ARNAYLRKKIARLKKDNLQLERDEQNLEKIIANLRDEIARLENEVASHEQ(SEQ ID NO：2)
如图2所示，SYNZIP1多肽或SYNZIP2多肽为螺旋拉链结构。SYNZIP分子之间具有天然的亲和力，通过coil-coil螺旋形成二聚体结构，利用这两个多肽作为接头融合不同的蛋白片段或者是核酸分子，可以获得多种不同类型的分子。如图1和图2所示，本发明中采用了SYNZIP1/SYNZIP2组合为各个分子的接头结构，通过SYNZIP1/SYNZIP2与多种蛋白融合表达或者是偶联可以完成多种蛋白的自组装，可以快速简单的组装获得多种不同类型的免疫调控剂药物。
进一步的，所述SYNZIP1多肽和SYNZIP2多肽组成二聚体。
所述T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原通过所述二聚体分别偶联到所述微载体上。
进一步的，所述T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原分别与所述二聚体中的SYNZIP1多肽相连，所述微载体与所述二聚体中的SYNZIP2多肽相连。
所述T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原分别与SYNZIP1多肽的连接，可以为直接连接，或者可通过接头序列连接。
接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。
可选的，所述T细胞促进剂选自IL-15、IL-2,IL4,IL21，GM-CSF等细胞因子中的一种或多种。
优选为IL-15。IL-15白介素15(IL-15)可以刺激T细胞增殖，诱导细胞毒性T细胞(CTL)产生细胞毒效应，诱导NK细胞激活扩增，并且激活的免疫细胞不容易凋亡，效果优于IL-2，近年来在细胞治疗中作为CAR-T扩增的组件对T细胞的增殖具有很好的效果，本发明在免疫微球中增加IL-15可以将微球模拟成抗原提呈细胞，在体外或者是体内均可以用于刺激T细胞，偶联到微粒上模拟的三维环境对T细胞的效果比二维的更好。
所述IL-15的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。具体的，为：
MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
抗体Fc段为抗体的恒定区，抗体发挥作用主要是通过Fc区与免疫细胞表面的CD16/32/64结合来募集免疫细胞，激发免疫反应来发挥作用，本发明中通过对Fc区氨基酸位点进行预测和替换获得了优化的Fc片段FCOP序列，提高了FcOP与CD16/32/64的亲和力，CD16/32/64为多种免疫细胞表面的分子标记，FcOP可以募集更多的免疫细胞。
在一种实施方式中，所述抗体Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。具体的，为：
PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
所述抗原为肿瘤新抗原(Neoantigen)，所述肿瘤新抗原是指肿瘤细胞所特有的抗原。所述肿瘤新抗原可以用来区分肿瘤细胞和正常细胞，肿瘤新抗原是在癌细胞发生发展过程中产生的大量基因突变，部分基因突变也会产生正常组织、正常细胞所没有的蛋白质，这些突变的蛋白质很有可以激活免疫系统，并且引导免疫系统区分正常组织和肿瘤组织，激发特异性的免疫反应攻击癌细胞。Neoantigen是肿瘤细胞所特有的，是区分肿瘤细胞和正常细胞的理想选择，本发明中通过测序寻找每个患者特有的突变，根据测序获得的新抗原多肽长度为10-20个氨基酸，序列命名为neo 20。获得的多肽序列在氮端(N端)连接上SYNZIP1。命名为SYNZIP1-neo20。
在一种实施方式中，所述抗原的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4-7中的任一种或多种。
具体的，SLLMWITQCAAGIGILTV(SEQ ID NO：4)
EVDPIGHLY KVAELVHFL(SEQ ID NO：5)
KTWGQYWQVYLEPGPVTA(SEQ ID NO：6)
RFMPNAPYLRFMPNAPYL(SEQ ID NO：7)
所述二聚体连接于所述微载体表面。
所述核酸分子CpG负载于所述载体内部。
所述微载体为PLGA。
所述主动免疫调控微粒粒径为198.8-201.8nm。
本发明的主动免疫调控微粒的制备方法，至少包括如下步骤：
1)制备SYNZIP2-CpG-微载体颗粒；
2)将SYNZIP1分别与T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原连接，获得连接物I、连接物II和连接物III；
3)将连接物I、连接物II和连接物III和SYNZIP2-CpG-微载体颗粒混合，获得所述主动免疫调控微粒。
所述SYNZIP2-CpG-微载体颗粒的制备方法包括如下步骤：
1)将SYNZIP2与活化剂混合进行活化；将活化后的SYNZIP2与交联剂混合，进行交联活化反应，得到混合物I；
2)将核酸分子CpG与活化剂混合进行活化；将活化后的核酸分子CpG与交联剂混合，得到混合物II；
3)将微载体溶于有机溶剂，获得混合物III，将混合物I、混合物II混合，形成有机相，以混合物III作为水相，将有机相加入到水相中，去除有机溶剂，得到SYNZIP2-CpG-微载体颗粒。
所述T细胞促进剂选自IL-15、IL-2中的一种或多种。
所述抗体Fc段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
所述抗原为肿瘤新抗原，所述肿瘤新抗原是指肿瘤细胞所特有的抗原。
在一种实施方式中，所述抗原的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4-7中的任一种或多种。
所述二聚体连接于所述微载体表面。
所述核酸分子CpG负载于所述载体内部。
所述微载体选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)。
所述主动免疫调控微粒粒径为198.8-201.8nm。
所述活化剂选自三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
所述交联剂选自4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)。
所述有机溶剂选自二氯甲烷。
步骤3)中，所述SYNZIP2-CpG-微载体颗粒、连接物I、连接物II和连接物III的摩尔比为3:1:1:1。
前述主动免疫调控微粒可用于制备细胞因子促进剂或恶性实体瘤治疗药物。
实施例1主动免疫调节微粒组件的构建过程
1.SYNZIP-1-FcOP蛋白
SYNZIP-1-FcOP蛋白采用基因合成的方式获得。具体的，获得：
Figure BDA0002348654470000071
Figure BDA0002348654470000081
SYNZIP-1-linker-FcOP氨基酸序列(30KD)
MEFGLSWLFLVAILKGVQCNLVAQLENEVASLENENETLKKKNLHKKDLIAYLEKEIANLRKKIEE(GGGGS)3PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO：12)
2.IL-15-SYNZIP1基因克隆
在IL-15-SYNZIP1两端设计酶切位点EcoR I和Not I采用全基因通合成的方式委托苏州金维智生物科技有限公司合成，获得PUC19-IL-15-SYNZIP1克隆质粒。
将获得的PUC19-IL-15-SYNZIP1克隆质粒与PTT5质粒分别采用EcoR I和Not I双酶切，电泳回收IL-15-SYNZIP1和PTT5双酶切后片段，将回收纯化后的IL-15-SYNZIP1和PTT5片段使用T4连接酶16℃连接2h，获得的PTT5-IL-15-SYNZIP1连接产物转化TOP10感受态细菌，挑取阳性菌落，采用菌落PCR方法和双酶切进行鉴定，筛选出阳性克隆PTT5-IL-15-SYNZIP1阳性菌，扩增阳性菌落，测序确认克隆序列的正确，使用质粒无内毒素大抽试剂盒提取PTT5-IL-15-SYNZIP1质粒备用。
PTT5-IL-15-SYNZIP1的转染和表达：
细胞瞬时转染和纯化：293细胞转染按LipofectamineTM 2000操作说明书进行，以6孔板中的1孔为例，简要步骤如下：向该孔接种4×105细胞，37℃、5％CO2培养18h后换液1次，12h后开始转染,贴壁细胞在转染时的理想汇合度为90-95％。将4μg质粒DNA和10μlLipofectamineTM 2000分别用无抗生素、无血清的培养基稀释至250μl，温和混匀，室温静置15min形成脂质体复合物。连续培养三天后收取上清，采用间接ELISA方法检测目的蛋白的表达情况。获得的细胞上清液使用亲和层析镍柱纯化，获得IL-15-SYNZIP1蛋白，纯化后的蛋白在10％SDS-凝胶电泳(图4)，鉴定蛋白的纯度，BCA检测蛋白浓度80mg/ml。
Figure BDA0002348654470000082
Figure BDA0002348654470000091
对应的氨基酸序列24KD：
MEFGLSWLFLVAILKGVQCMDRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(GGGGS)3NLVAQLENEVASLENENETLKKKNLHKKDLIAYLEKEIANLRKKIEEHHHHHH(SEQ ID NO：14)
3.SYNZIP1-neo20特异性多肽
SYNZIP-1-FcOP蛋白采用基因合成的方式获得。具体的，获得：
(SYNZIP1-linker-neo20)
NLVAQLENEVASLENENETLKKKNLHKKDLIAYLEKEIANLRKKIEE(GGGGS)3SLLMWITQCAAGIGILTV(SEQ ID NO：15)；
NLVAQLENEVASLENENETLKKKNLHKKDLIAYLEKEIANLRKKIEE(GGGGS)3EVDPIGHLYKVAELVHFL(SEQ ID NO：16)；
NLVAQLENEVASLENENETLKKKNLHKKDLIAYLEKEIANLRKKIEE(GGGGS)3KTWGQYWQVYLEPGPVTA(SEQ ID NO：17)；
NLVAQLENEVASLENENETLKKKNLHKKDLIAYLEKEIANLRKKIEE(GGGGS)3RFMPNAPYLRFMPNAPYL(SEQ ID NO：18)。
实施例2主动免疫调控微粒的制备
1.PLGA纳米微球制备
20mg SYNZIP2(sulfo-SMCC)交联活化反应：首先是SYNZIP2活化，用10ml PBS溶解SYNZIP2，加入TCEP，打开二硫键；透析去除TCEP，得到活化的SYNZIP2。再加入sulfo-SMCC，交联后透析去除多余的sulfo-SMCC，冷冻干燥后得到20mg SYNZIP2-sulfo-SMCC固体粉末。
(一)核酸分子CpG(CpG ODN 2006和ODN M362)10mg与sulfo-SMCC交联反应：首先是CpG活化，用WFI溶解CpG，加入TCEP，打开二硫键；然后脱盐去除TCEP，得到活化的CpG。
再加入sulfo-SMCC，交联后醇沉离心，得到固体CpG-sulfo-SMCC。
CpG ODN 2006的序列为(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)(SEQ ID NO：19)
CpG-SH ODN M362的序列为(TCGTCGTCGTTCGAACGACGTTGAT)(SEQ ID NO：20)。(二)将15mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于15mL二氯甲烷中得溶液1，加入20mg SYNZIP2-sulfo-SMCC和10mg CpG-sulfo-SMCC，完成SYNZIP2-CpG与PLGA的偶联，作为油相；取15mL溶液1作为水相；在超声功率220W条件下，将油相逐滴加入水相中形成初乳；将所得初乳在400rpm搅拌下逐滴加入20mL超纯水中，继续搅拌4h使二氯甲烷挥发，将所得溶液首先1000rpm离心5分钟保留上清，去除大颗粒；然后再12000rpm离心10分钟保留沉淀，所得沉淀用超纯水洗涤三次，冷冻干燥，得到地SYNZIP2-CpG-PLGA纳米微球，保存备用。采用激光粒度仪检测纳米粒粒径为200.3±1.5(nm)，冻干后粒径223.2±1.9(nm).将获得的纳米颗粒溶解在PBS中。
2).主动免疫调控微粒
将制备的SYNZIP2-CpG-PLGA纳米微球与SYNZIP-1-FcOP，IL-15-SYNZIP1和SYNZIP1-neo20多肽按照摩尔比(3:1:1:1)进行混合后溶解于PBS磷酸缓冲液。通过SYNZIP1/SYNZIP2组合，最终获得包含多个免疫刺激和激活功能的主动免疫调控微粒PLGA-CpG-FcOP-IL-15-neo20，组合完成的主动免疫调控微粒冷冻干燥，获得主动免疫调控微粒PLGA-CpG-FcOP-IL-15-neo20，在显微镜下观察颗粒的均匀度(图5)，可以观察到微球颗粒均匀分布，没有聚团现象。该方法可以按照需求任意组合通过多肽的偶联自组装成需要的分子。
实施例3主动免疫调控微粒的免疫激活活性鉴定试验
1)PBMC对免疫纳米微球的内吞作用
抽取健康人的外周血，采用淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque分离单核细胞PBMC，使用终浓度为5μg/ml的CD3抗体和CD28抗体预先包被的6孔板对分离的PBMC培养，维持PBMC细胞浓度在0.5～1×106细胞/ml。主动免疫调控微粒PLGA-CpG-FcOP-IL-15-neo20使用PBS缓冲液溶解，终浓度为1mg/ml。PBMC对免疫微球的内吞作用的检测实验组分为两组：PBMC+PLGA微球组，PBMC+50ug/ml PLGA-CpG-FcOP-IL-15-neo20组，采用对pH敏感的parodoiTMGreen STP Ester检测PBMC对免疫微球的内吞，这种染料在中性pH值时几乎不发荧光，而在酸性环境下可发出明亮的荧光，细胞的培养环境为中性环境，细胞内部溶酶体内为酸性环境，该染料可以作为理想的细胞内吞指示剂。将偶联后的免疫微球偶联后加入到PBMC细胞中37℃培养90分钟，荧光显微镜下观察内吞情况。试验结果如图6所示，表明PBMC对PLGA-CpG-FcOP-IL-15-neo20具有特异性的内吞作用，对PLGA微球的内吞较少。
实施例4主动免疫调控微粒刺激PBMC产生细胞因子的检测抽取健康人的外周血，采用淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque分离单核细胞PBMC，使用终浓度为5μg/ml的CD3抗体和CD28抗体预先包被的T175对分离的PBMC培养，维持PBMC细胞浓度在0.5～1×106细胞/ml。主动免疫治疗性纳米微球PLGA-CpG-FcOP-IL-15-neo20使用PBS缓冲液溶解，终浓度为1mg/ml。将将实验组分为三组：PBMC+PLGA微球组，PBMC+50ug/ml PLGA-CpG-FcOP-IL-15-neo20组，PBMC+100ug/ml PLGA-CpG-FcOP-IL-15-neo20组，PBMC+500ug/ml PLGA-CpG-FcOP-IL-15-neo20组，将对应的分子加入PBMC中,培养48小时后收集上清检测，ELISA检测试剂盒检测IFN-alpha，IFN-gamma和IL-6和分泌情况。试验结果如图7所示，表明PLGA-CpG-FcOP-IL-15-neo20可以刺激PBMC产生高浓度的细胞因子，并且具有浓度梯度效应。
图6可以看到通过制备的免疫微球当前的组合可以有效的被PBMC单核细胞内吞，由此可以说明可以有效的促进抗原的提呈，图7说明了该方法制备的免疫微球可以促进PBMC细胞因子表达量的提高，这说明了免疫微球已经激活了免疫细胞，并且与对照组有显著的差异，表面本发明所述的主动免疫调控微粒可以用于进行主动免疫调控。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 优锐生物医药科技（深圳）有限公司
上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司
<120> 一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asn Leu Val Ala Gln Leu Glu Asn Glu Val Ala Ser Leu Glu Asn Glu
1 5 10 15
Asn Glu Thr Leu Lys Lys Lys Asn Leu His Lys Lys Asp Leu Ile Ala
20 25 30
Tyr Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Leu Arg Lys Lys Ile Glu Glu
35 40 45
<210> 2
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Arg Asn Ala Tyr Leu Arg Lys Lys Ile Ala Arg Leu Lys Lys Asp
1 5 10 15
Asn Leu Gln Leu Glu Arg Asp Glu Gln Asn Leu Glu Lys Ile Ile Ala
20 25 30
Asn Leu Arg Asp Glu Ile Ala Arg Leu Glu Asn Glu Val Ala Ser His
35 40 45
Glu Gln
50
<210> 3
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
1 5 10 15
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
20 25 30
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
35 40 45
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
50 55 60
Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
65 70 75 80
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
85 90 95
Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
100 105 110
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
115 120 125
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
130 135 140
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
145 150 155 160
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
165 170 175
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
180 185 190
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
195 200 205
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu
1 5 10 15
Thr Val
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr Lys Val Ala Glu Leu Val His
1 5 10 15
Phe Leu
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val
1 5 10 15
Thr Ala
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Arg Phe Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Arg Phe Met Pro Asn Ala Pro
1 5 10 15
Tyr Leu
<210> 8
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacctggttg cgcagctcga aaacgaagtt gcgtctctgg aaaatgagaa cgaaaccctg 60
aagaaaaaga acctgcacaa aaaagacctg atcgcgtacc tggagaaaga aatcgcgaat 120
ctgcgtaaga aaatcgaaga atga 144
<210> 9
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcgcgtaacg cgtatctgcg taagaaaatc gcacgtctga aaaaagacaa cctgcagctg 60
gaacgtgatg aacagaacct ggaaaaaatc atcgcgaacc tgcgtgacga aatcgcgcgt 120
ctcgaaaacg aagttgcgtc tcacgaacag tga 153
<210> 10
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
20 25 30
Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
50 55 60
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
65 70 75 80
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
100 105 110
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
115 120 125
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
130 135 140
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
145 150 155 160
Thr Ser
<210> 11
<211> 926
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaattcgccg ccaccatgga gttcggactc agttggctgt tcctggtggc catcctgaag 60
ggtgtgcagt gtaacctggt tgcgcagctc gaaaacgaag ttgcgtctct ggaaaatgag 120
aacgaaaccc tgaagaaaaa gaacctgcac aaaaaagacc tgatcgcgta cctggagaaa 180
gaaatcgcga atctgcgtaa gaaaatcgaa gaagagatca aaggaggagg aggatcagga 240
ggaggaggat caggaggagg aggatcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 300
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 360
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 420
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacgccac gtaccgggtg 480
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 540
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gccgcaacca tctccaaagc caaagggcag 600
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 660
gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 720
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 780
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 840
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 900
ctgtctccgg gtaaatgagc ggccgc 926
<210> 12
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Asn Leu Val Ala Gln Leu Glu Asn Glu Val Ala Ser Leu
20 25 30
Glu Asn Glu Asn Glu Thr Leu Lys Lys Lys Asn Leu His Lys Lys Asp
35 40 45
Leu Ile Ala Tyr Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Leu Arg Lys Lys Ile
50 55 60
Glu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
85 90 95
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
100 105 110
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
115 120 125
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
130 135 140
Gln Tyr Asn Ala Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
145 150 155 160
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
165 170 175
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
180 185 190
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
195 200 205
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
210 215 220
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
225 230 235 240
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
245 250 255
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
260 265 270
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
275 280 285
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
290 295
<210> 13
<211> 791
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaattcgccg ccaccatgga gttcggactc agttggctgt tcctggtggc catcctgaag 60
ggtgtgcagt gtatggacat gagaatttcg aaaccacatt tgagaagtat ttccatccag 120
tgctacttgt gtttacttct aaacagtcat tttctaactg aagctggcat tcatgtcttc 180
attttgggct gtttcagtgc agggcttcct aaaacagaag ccaactgggt gaatgtaata 240
agtgatttga aaaaaattga agatcttatt caatctatgc atattgatgc tactttatat 300
acggaaagtg atgttcaccc cagttgcaaa gtaacagcaa tgaagtgctt tctcttggag 360
ttacaagtta tttcacttga gtccggagat gcaagtattc atgatacagt agaaaatctg 420
atcatcctag caaacaacag tttgtcttct aatgggaatg taacagaatc tggatgcaaa 480
gaatgtgagg aactggagga aaaaaatatt aaagaatttt tgcagagttt tgtacatatt 540
gtccaaatgt tcatcaacac ttctgagatc aaaggaggag gaggatcagg aggaggagga 600
tcaggaggag gaggatcaaa cctggttgcg cagctcgaaa acgaagttgc gtctctggaa 660
aatgagaacg aaaccctgaa gaaaaagaac ctgcacaaaa aagacctgat cgcgtacctg 720
gagaaagaaa tcgcgaatct gcgtaagaaa atcgaagaac atcatcatca tcatcatcat 780
tgagcggccg c 791
<210> 14
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Met Asp Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser
20 25 30
Ile Gln Cys Tyr Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu
35 40 45
Ala Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro
50 55 60
Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu
85 90 95
Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu
100 105 110
Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His
115 120 125
Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser
130 135 140
Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu
145 150 155 160
Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln
165 170 175
Met Phe Ile Asn Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
180 185 190
Gly Gly Gly Gly Ser Asn Leu Val Ala Gln Leu Glu Asn Glu Val Ala
195 200 205
Ser Leu Glu Asn Glu Asn Glu Thr Leu Lys Lys Lys Asn Leu His Lys
210 215 220
Lys Asp Leu Ile Ala Tyr Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Leu Arg Lys
225 230 235 240
Lys Ile Glu Glu His His His His His His
245 250
<210> 15
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Asn Leu Val Ala Gln Leu Glu Asn Glu Val Ala Ser Leu Glu Asn Glu
1 5 10 15
Asn Glu Thr Leu Lys Lys Lys Asn Leu His Lys Lys Asp Leu Ile Ala
20 25 30
Tyr Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Leu Arg Lys Lys Ile Glu Glu Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Leu
50 55 60
Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
65 70 75 80
<210> 16
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Asn Leu Val Ala Gln Leu Glu Asn Glu Val Ala Ser Leu Glu Asn Glu
1 5 10 15
Asn Glu Thr Leu Lys Lys Lys Asn Leu His Lys Lys Asp Leu Ile Ala
20 25 30
Tyr Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Leu Arg Lys Lys Ile Glu Glu Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
50 55 60
Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu
65 70 75 80
<210> 17
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Asn Leu Val Ala Gln Leu Glu Asn Glu Val Ala Ser Leu Glu Asn Glu
1 5 10 15
Asn Glu Thr Leu Lys Lys Lys Asn Leu His Lys Lys Asp Leu Ile Ala
20 25 30
Tyr Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Leu Arg Lys Lys Ile Glu Glu Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Thr
50 55 60
Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala
65 70 75 80
<210> 18
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Asn Leu Val Ala Gln Leu Glu Asn Glu Val Ala Ser Leu Glu Asn Glu
1 5 10 15
Asn Glu Thr Leu Lys Lys Lys Asn Leu His Lys Lys Asp Leu Ile Ala
20 25 30
Tyr Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Leu Arg Lys Lys Ile Glu Glu Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Phe
50 55 60
Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Arg Phe Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
65 70 75 80
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25

Claims (11)

1.一种主动免疫调控微粒，其特征在于，所述主动免疫调控微粒包括微载体，所述微载体上至少负载有SYNZIP1多肽、SYNZIP2多肽、核酸分子CpG、T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原，所述SYNZIP1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述SYNZIP2多肽的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。
2.如权利要求1所述的主动免疫调控微粒，其特征在于，所述SYNZIP1多肽和SYNZIP2多肽组成二聚体。
3.如权利要求2所述的主动免疫调控微粒，其特征在于，所述T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原通过所述二聚体分别偶联到所述微载体上。
4.如权利要求3所述的主动免疫调控微粒，其特征在于，所述T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原分别与所述二聚体中的SYNZIP1多肽相连，所述微载体与所述二聚体中的SYNZIP2多肽相连。
5.如权利要求1所述的主动免疫调控微粒，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
1)所述T细胞促进剂选自IL-15、IL-2中的一种或多种；
2)所述抗体Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
3)所述抗原为肿瘤新抗原，所述肿瘤新抗原是指肿瘤细胞所特有的抗原；
4)所述二聚体连接于所述微载体表面；
5)所述核酸分子CpG负载于所述载体内部；
6)所述微载体选自PLGA；
7)所述主动免疫调控微粒粒径为198.8-201.8nm。
6.如权利要求5所述的主动免疫调控微粒，其特征在于，所述抗原的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4-7中的任一种或多种。
7.一种主动免疫调控微粒的制备方法，至少包括如下步骤：
1)制备SYNZIP2-CpG-微载体颗粒；
2)将SYNZIP1分别与T细胞促进剂、抗体Fc段和抗原连接，获得连接物I、连接物II和连接物III；
3)将连接物I、连接物II和连接物III和SYNZIP2-CpG-微载体颗粒混合，获得所述主动免疫调控微粒。
8.如权利要求7所述的主动免疫调控微粒的制备方法，其特征在于，所述SYNZIP2-CpG-微载体颗粒的制备方法包括如下步骤：
1)将SYNZIP2与活化剂混合进行活化；将活化后的SYNZIP2与交联剂混合，进行交联活化反应，得到混合物I；
2)将核酸分子CpG与活化剂混合进行活化；将活化后的核酸分子CpG与交联剂混合，得到混合物II；
3)将微载体溶于有机溶剂，获得混合物III，将混合物I、混合物II混合，形成有机相，以混合物III作为水相，将有机相加入到水相中，去除有机溶剂，得到SYNZIP2-CpG-微载体颗粒。
9.如权利要求7所述的主动免疫调控微粒的制备方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
a.所述T细胞促进剂选自IL-15、IL-2中的一种或多种；
b.所述抗体Fc段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
c.所述抗原为肿瘤新抗原，所述肿瘤新抗原是指肿瘤细胞所特有的抗原；
d.步骤3)中，所述SYNZIP2-CpG-微载体颗粒、连接物I、连接物II和连接物III的摩尔比为3:1:1:1；
e.所述微载体选自PLGA；
f.所述主动免疫调控微粒粒径为198.8-201.8nm。
10.如权利要求8所述的主动免疫调控微粒的制备方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：
g.所述活化剂选自TCEP；
h.所述交联剂选自sulfo-SMCC；
i.所述有机溶剂选自二氯甲烷。
11.如权利要求1-6任一所述的主动免疫调控微粒在制备细胞因子促进剂或恶性实体瘤治疗药物中的用途。
CN201911406025.0A 2019-12-31 2019-12-31 一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用 Active CN111150841B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911406025.0A CN111150841B (zh) 2019-12-31 2019-12-31 一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911406025.0A CN111150841B (zh) 2019-12-31 2019-12-31 一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111150841A true CN111150841A (zh) 2020-05-15
CN111150841B CN111150841B (zh) 2023-08-15

Family

ID=70559841

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911406025.0A Active CN111150841B (zh) 2019-12-31 2019-12-31 一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111150841B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112220919A (zh) * 2020-09-27 2021-01-15 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 以氧化石墨烯为载体的纳米冠状病毒重组疫苗
CN113583091A (zh) * 2021-07-26 2021-11-02 郑州大学第一附属医院 免疫抑制细胞紧密连接蛋白的特异性靶向多肽及其应用
CN113621028A (zh) * 2021-07-27 2021-11-09 南通大学 一种多肽自组装水凝胶支架及其应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1481899A (zh) * 2002-09-13 2004-03-17 新的肿瘤抗原疫苗及其制备方法和疫苗组合物
WO2006012451A2 (en) * 2004-07-22 2006-02-02 Five Prime Therapeutics, Inc. Compositions and methods of use for mgd-csf in disease treatment
US20070014804A1 (en) * 2003-02-17 2007-01-18 Peter Burkhard Peptidic nanoparticles as drug delivery and antigen display systems
CN101932594A (zh) * 2008-02-01 2010-12-29 阿尔法-O肽股份公司 可用作疫苗的自装配肽纳米颗粒
US20110262389A1 (en) * 2001-02-13 2011-10-27 Mosca Joseph D Tumor-derived Biological Antigen Presenting Particles
CN104788565A (zh) * 2003-05-02 2015-07-22 赞科股份有限公司 优化的Fc变体及其产生方法
CN109758575A (zh) * 2018-02-14 2019-05-17 上海微球生物科技有限公司 充分多样的双亲性mhc ii结合多肽、免疫载体微球及其制备方法和应用
CN110087665A (zh) * 2016-08-03 2019-08-02 H·李·莫菲特癌症中心与研究所公司 Tlr9靶向治疗

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110262389A1 (en) * 2001-02-13 2011-10-27 Mosca Joseph D Tumor-derived Biological Antigen Presenting Particles
CN1481899A (zh) * 2002-09-13 2004-03-17 新的肿瘤抗原疫苗及其制备方法和疫苗组合物
US20070014804A1 (en) * 2003-02-17 2007-01-18 Peter Burkhard Peptidic nanoparticles as drug delivery and antigen display systems
CN104788565A (zh) * 2003-05-02 2015-07-22 赞科股份有限公司 优化的Fc变体及其产生方法
WO2006012451A2 (en) * 2004-07-22 2006-02-02 Five Prime Therapeutics, Inc. Compositions and methods of use for mgd-csf in disease treatment
US20070264277A1 (en) * 2004-07-22 2007-11-15 Dirk Behrens Compositions and Methods of Use for Mgd-Csf in Disease Treatment
CN101932594A (zh) * 2008-02-01 2010-12-29 阿尔法-O肽股份公司 可用作疫苗的自装配肽纳米颗粒
CN110087665A (zh) * 2016-08-03 2019-08-02 H·李·莫菲特癌症中心与研究所公司 Tlr9靶向治疗
CN109758575A (zh) * 2018-02-14 2019-05-17 上海微球生物科技有限公司 充分多样的双亲性mhc ii结合多肽、免疫载体微球及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HELENA GRADIŠAR等: "Self-assembled bionanostructures: proteins following the lead of DNA nanostructures", vol. 12, no. 4, pages 1 - 9 *
JAMES J MOON等: "Antigen-displaying lipid-enveloped PLGA nanoparticles as delivery agents for a Plasmodium vivax malaria vaccine", vol. 7, no. 2, XP055751250, DOI: 10.1371/journal.pone.0031472 *
KENNETH EVAN THOMPSON等: "SYNZIP protein interaction toolbox: in vitro and in vivo specifications of heterospecific coiled-coil interaction domains", vol. 1, no. 4, pages 118 - 129, XP055285294, DOI: 10.1021/sb200015u *
MAJA KLAUS等: "Engineering of Chimeric Polyketide Synthases Using SYNZIP Docking Domains", vol. 14, no. 3, pages 426 - 433, XP055673940, DOI: 10.1021/acschembio.8b01060 *
MARIE-LUCE DE TEMMERMAN等: "Particulate vaccines: on the quest for optimal delivery and immune response", vol. 16, no. 13, pages 569 - 582, XP028231719, DOI: 10.1016/j.drudis.2011.04.006 *
SAMAR HAMDY等: "Co-delivery of cancer-associated antigen and Toll-like receptor 4 ligand in PLGA nanoparticles induces potent CD8+ T cell-mediated anti-tumor immunity", vol. 26, no. 39, pages 5046 - 5057, XP024529234, DOI: 10.1016/j.vaccine.2008.07.035 *
YOGITA KRISHNAMACHARI等: "Innovative strategies for co-delivering antigens and CpG oligonucleotides", vol. 61, no. 3, pages 205 - 217, XP002598161, DOI: 10.1016/J.ADDR.2008.12.013 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112220919A (zh) * 2020-09-27 2021-01-15 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 以氧化石墨烯为载体的纳米冠状病毒重组疫苗
CN113583091A (zh) * 2021-07-26 2021-11-02 郑州大学第一附属医院 免疫抑制细胞紧密连接蛋白的特异性靶向多肽及其应用
CN113621028A (zh) * 2021-07-27 2021-11-09 南通大学 一种多肽自组装水凝胶支架及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111150841B (zh) 2023-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111150841B (zh) 一种主动免疫调控微粒及其制备方法和应用
JP4768121B2 (ja) Ｍａｇｅファミリーからの腫瘍関連抗原及びそれらをコードする核酸配列、融合タンパク質の及びワクチン接種のための組成物の調製のための使用
JP5995879B2 (ja) 血管生成の抑制剤、並びにその製造方法、修飾方法及び抗腫瘍薬の製造における用途
JP2017502076A5 (zh)
CN1270635A (zh) 包含hpv抗原和应激蛋白或者其表达载体的组合物激发的抗hpv抗原免疫应答
WO2018013924A1 (en) Synthetic nanoparticles for delivery of immunomodulatory compounds
JP2024028887A (ja) 偽ウイルス粒子及びその使用
Kazaks et al. Melanoma vaccine candidates from chimeric hepatitis B core virus‐like particles carrying a tumor‐associated MAGE‐3 epitope
Meng et al. Biomimetic nanoparticles for DC vaccination: a versatile approach to boost cancer immunotherapy
CN112662695A (zh) 一种细菌生物膜囊泡（bbv）作为疫苗载体的构建方法和应用
CN110194800B (zh) 一种融合蛋白、细胞外泌体和肿瘤疫苗及其应用
RU2316342C1 (ru) Вакцинная композиция для профилактики и лечения онкологических заболеваний, рекомбинантная плазмидная днк, обеспечивающая синтез гибридного белка, способ его получения
CN116359509A (zh) 一种用于胃癌治疗的肿瘤新抗原筛选方法和新型纳米疫苗的制备方法及应用
CN112972666B (zh) 个性化基因修饰肿瘤dc疫苗的制备方法
CN112538462B (zh) 一种用于nk细胞快速扩增的细胞膜及其应用
CN110548135A (zh) 磷酸化多肽抗原疫苗及其制备方法和应用
CN108175853A (zh) 一种肿瘤细胞疫苗及其制备方法
CN110898219B (zh) 基于铁蛋白与preS1抗原基因融合表达的疫苗
JP2004081210A (ja) システイン残基を改変したタンパク質からなる中空ナノ粒子およびそれを用いた薬剤
CN114292337B (zh) 一种可溶性nk-car融合蛋白及制备方法和在介导免疫细胞靶向杀肿瘤细胞药物中应用
EP3517542B1 (en) Dendritic-cell-targeted peptide, fusion peptide utilizing said peptide, and vaccine utilizing said fusion peptide
JP2005538690A (ja) 腫瘍の治療用の自己ワクチンの調製のための長いペントラキシンｐｔｘ３機能性誘導体
CN113388042B (zh) 一种重组蛋白、重组表达载体、重组细胞和nk细胞激活磁珠及其制备方法和应用
CN113318225B (zh) 肿瘤免疫增强剂及其制法和应用
CN114790248B (zh) MUC1-PDL1-IgG1 Fc肿瘤疫苗及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address
CP03 Change of name, title or address

Address after: 518118 unit 1505, block a, innovation Plaza, No. 2007, Pingshan street, Pingshan District, Shenzhen, Guangdong

Patentee after: Youjian Biopharmaceutical Technology (Shenzhen) Co.,Ltd.

Country or region after: China

Patentee after: SHANGHAI NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER FOR NANOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: 518118 unit 1505, block a, innovation Plaza, No. 2007, Pingshan street, Pingshan District, Shenzhen, Guangdong

Patentee before: Yourui Biomedical Technology (Shenzhen) Co.,Ltd.

Country or region before: China

Patentee before: SHANGHAI NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER FOR NANOTECHNOLOGY Co.,Ltd.