KR20210087017A - 개선된 렌티 바이러스 벡터 - Google Patents

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KR20210087017A
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cells
car
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KR1020217008649A
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현수 이
남철 정
유 왕
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이뮤노테크 바이오팜 씨오., 엘티디.
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Abstract

본 발명은 생물 의학 분야에 속한다. 구체적으로, 본 발명은 개선된 t 렌티 바이러스 벡터 및 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 치료용 T 세포 제조에 특히 적합한 렌티 바이러스 벡터에 관한 것이다.

Description

개선된 렌티 바이러스 벡터
본 발명은 생물의학분야에 속한다. 구체적으로, 본 발명은 개선된 t 렌티 바이러스 벡터(t lentiviral vector) 및 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 치료용 T 세포 제조에 특히 적합한 렌티 바이러스 벡터에 관한 것이다.
T 세포는 체내의 종양 세포와 바이러스에 감염된 세포를 죽이는 주요 면역 세포이다. 최근에는, 시험관 내 유도 또는 종양 침윤 림프구로부터 유래된 항원-특이적 T 세포, 유전적으로 변형된 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T 세포), 유전적으로 변형된 T 세포 수용체 T 세포 (TCR-T 세포)를 포함하는 T 세포는 악성 종양의 치료에 사용되어 일부 임상 환자에서 상당한 종양 제거 및 제어 효과를 나타낸다. 그러나, 환자의 종양 면역 탈출 효과로 인해 일부 종양 환자는 주입된 T 세포에 대한 내성이 있어 T 세포가 항-종양 효과를 발휘할 수 없다.
생체 내(in vivo) 및 시험관 내(in vitro) 연구 모두 TGF-β가 중요한 T 세포 억제 인자이며, 표적 세포에 대한 T 세포의 사멸 효과를 약화시키거나 상실시키는 것으로 나타났다. 임상적으로, TGF-β는 다양한 종양 조직에서 광범위하게 발현되며, 종양 세포에서 종양-특이적 T 세포의 사멸 활성을 현저히 억제하며, 이는 면역 요법 실패의 중요한 원인이다. 우성 음성 TGF-β 수용체 II 형 (dominant negative TGF-β receptor type II, DNRII)은 TGF-β의 음성 조절 수용체로, T 세포에 대한 TGF-β의 억제 효과를 억제할 수 있다. 동물에서 T 세포 특이적-DNRII를 투여 또는 발현하거나, 가용성 TGF-β RII를 투여하여 TGF-β 신호 전달 경로를 방해함으로써 종양에 대한 T 세포의 사멸 효과를 크게 증가시킬 수 있다. Baylor College of Medicine의 Catherin M Bollard가 이끄는 연구팀은 환자에게 EBV-특이적 T 세포 (EBV-CTL) 치료를 제공하면 EBV 감염으로 인한 호지킨 및 비-호지킨 림프종에 특정 효과가 있음을 발견하였다. 그러나 이러한 질병에서는 종양 조직에서 TGF-β의 발현으로 인해 EBV-CTL의 효능이 방해받는다. 연구팀은 재발성 호지킨 림프종의 치료를 위해 EBV-CTL 세포 표면에 DNRII를 발현하기 위해 유전자 형질 도입을 사용하였다. 평가 가능한 7 명의 환자 중 4 명은 완전한 차도를 보였고, 그 중 2 명은 4 년 동안 완전한 차도를 보였으며, 그 중 1 명은 DNRII 유전자 변형없이 EBV-CTL 치료 후 완전한 차도를 얻지 못한 환자였다. 그러나, 이러한 EBV-CTL은 하나의 외인성 단백질, 즉 DNRII 만 발현한다.
현재 CAR-T 세포 및 TCR-T 세포에 적용되는 임상 치료에서 종양 세포가 TGF-β를 발현하여 CAR-T 세포 및 TCR-T 세포 기능을 억제한다는 동일한 문제가 남아있다. 당업계에서는 CAR-T 세포 또는 TCR-T 세포에 DNRII를 도입하는 것이 바람직하다. 그러나 지금까지 종양 치료를 위해 동일한 T 세포에서 CAR/TCR과 DNRII의 공동 발현에 대한 보고는 없다. 이는 임상적 요구를 충족하기 어려운 두 단백질의 낮은 공동-발현 효율 때문일 수 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해서는 2 개 이상의 단백질을 효율적으로 공동-발현하는데 특히 적절한 개선된 렌티 바이러스 벡터와 같은 개선된 발현 벡터가 필요하다.
달리 표시되거나 정의되지 않는 한, 사용된 모든 용어는 당해 분야에서 통상의 의미를 가지며, 이는 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"； Lewin, " Genes VIII"; 및 Roitt et al., " Immunology" (Version 8) 및 본원에서 인용된 일반적인 선행기술과 같은 표준 매뉴얼을 참조한다. 또한, 달리 설명되지 않는 한, 특별히 상세하지 않은 모든 방법, 단계, 기술 및 동작은 그 자체로 공지된 방식으로 수행될 수 있고 수행되었을 수 있으며, 이는 당업자에 의해 이해될 것이다. 또한, 예를 들어 표준 매뉴얼, 상기에서 언급한 일반적인 선행 기술 및 본원에 인용된 다른 참고 문헌을 참조한다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은 숙주 세포에서 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하기위한 절단된 EF1α 프로모터를 포함하는 렌티 바이러스 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 절단된 EF1α 프로모터는 서열번호 13에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 EF1α 코어 프로모터이다.
본 발명의 범위 내에서 "렌티 바이러스 벡터(lentiviral vector)"는 시스-작용 렌티 바이러스 RNA 또는 DNA 서열을 함유하는 이식 유전자를 숙주 세포로 형질 도입하는데 사용되는 비-복제 벡터를 의미하며, 여기서 렌티 바이러스 단백질 (예를 들어, Gag, Pol 및/또는 Env)은 트랜스 형태(trans form)로 제공되어야한다. 렌티 바이러스 벡터는 기능성 Gag, Pol 및 Env 단백질에 대한 코딩 서열이 없다. 렌티 바이러스 벡터는 바이러스 벡터의 생산 또는 개발 단계에 따라 RNA 또는 DNA 분자의 형태로 존재할 수 있다.의 형태일 수 있다. 상기 렌티 바이러스 벡터는 렌티 바이러스 및 기타 단
상기 렌티 바이러스 벡터는 플라스미드 (예를 들어, 전달 플라스미드 벡터)와 같은 재조합 DNA 분자백질의 복합체에 있는 RNA 분자와 같은 렌티 바이러스 입자 벡터의 형태일 수 있다. 일반적으로, 변형되거나 재조합된 렌티 바이러스 입자에 상응하는 렌티 바이러스 벡터는 단일-가닥 RNA의 두 카피로 구성된 게놈을 함유한다. 이러한 RNA 서열은 숙주 세포의 게놈에 삽입된 이중-가닥 DNA 서열 (제공 벡터 DNA)에서 전사하여 얻거나, 형질 전환된 숙주 세포에서 플라스미드 DNA (플라스미드 벡터 DNA)를 일시적으로 발현하여 수득할 수 있다. 렌티 바이러스 벡터는 숙주 세포에 통합 된 DNA 서열을 나타낼 수도 있다.
렌티 바이러스 벡터는 렌티 바이러스, 특히 인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus) (HIV-1 또는 HIV-2) 유인원 면역 결핍 바이러스 (simian immunodeficiency virus, SIV), 말 감염성 뇌염 바이러스 (equine infectious encephalitis virus, EIAV), 염소 관절염 뇌염 바이러스 (goat arthritis encephalitis virus, CAEV), 소 면역 결핍 바이러스 (bovine immunodeficiency virus, BIV) 및 고양이 면역 결핍 바이러스 (feline immunodeficiency virus, FIV)에서 파생될 수 있고, 이는 병원성에 관여하는 유전적 결정자를 제거하도록 변형되고 외인성 발현 카세트와 함께 도입된다.
일부 실시 양태에서, 상기 렌티 바이러스 벡터는 5'LTR, ψ 서열, RRE 서열, cPPT/CTS 서열, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하기위한 다중 클로닝 사이트, WPRE 서열 및 3'LTR로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 요소를 추가로 포함한다.
일부 실시 양태에서, 상기 렌티 바이러스 벡터는 5'LTR, ψ 요소, RRE 요소, cPPT/CTS 요소, 절단된 EF1α 프로모터, aWPRE 성분, 3'LTR, 및 선택적으로 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하기 위한 다중 클로닝 사이트를 포함하며, 이는 작동가능하게 연결되어 있다.
일부 특정 실시양태에서, 5'LTR은 서열번호 3 또는 11에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; ψ 요소는 서열번호 4 또는 12에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고; RRE 요소는 서열번호 5에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하고; cPPT/CTS 요소는 서열번호 6에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고; WPRE 요소는 서열번호 9 또는 14에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 3'LTR은 서열번호 10 또는 15에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 렌티 바이러스 벡터는 서열번호 11에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'LTR, 서열번호 12로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ψ 요소, 및 서열번호 5로 표시되는 염기 서열의 RRE 요소, 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열을 포함하는 cPPT/CTS 요소, 서열번호 13으로 표시되는 염기 서열의 절단된 EF1α 프로모터, 서열번호 14로 표시되는 염기 서열을 포함하는 WPRE 요소, 서열번호 15에 제시된 뉴클레오티드 서열의 3'LTR, 및 선택적으로 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하기위한 다중 클로닝 사이트를 포함하고, 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시양태에서, 상기 렌티 바이러스 벡터는 서열번호 2로부터 유래되고, CAR-19를 인코딩하는 서열번호 2의 위치 2,042에서 위치 3,499까지의 뉴클레오티드 서열은 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로 대체될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 렌티 바이러스 벡터는 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 관심 폴리펩티드는 복수의 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드이고, 상기 융합 폴리펩티드 내의 복수의 단백질은 자가 절단 가능한 펩티드에 의해 분리된다.
일부 실시양태에서, 상기 관심 폴리펩티드는 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드이고, 상기 융합 폴리펩티드는 제1 단백질과 제2 단백질 사이에 자가 절단 가능한 펩티드를 포함한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 상기 렌티 바이러스 벡터는 자가-절단 가능한 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 상기 자가-절단 가능한 펩티드의 코딩 뉴클레오티드 서열은 렌티 바이러스 벡터에 의한 2 개 이상의 상이한 단백질의 공동-발현에 사용된다.
본원에서 사용되는 "자기 절단 가능한 펩티드(self-cleavable peptide)"는 세포 내에서 자가-절단을 달성할 수 있는 펩티드를 의미한다. 예를 들어, 상기 자가-절단 가능한 펩타이드는 프로테아제 인식 사이트를 포함할 후 있고, 세포 내 프로테아제에 의해 인식되고 특이적으로 절단될 수 있다.
대안적으로, 상기 자가-절단 펩티드는 2A 폴리펩티드일 수 있다. 2A 폴리펩티드는 바이러스에서 유래된 짧은 펩티드의 유형으로, 번역 도중에 자가-절단이 발생한다. 2A 폴리펩티드를 사용하여 두 개의 서로 상이한 표적 단백질을 연결하고 동일한 판독 프레임에서 발현하면 상기 두 표적 단백질은 거의 1 : 1의 비율로 생성된다. 일반적으로 사용되는 2A 폴리펩티드는 돼지 테코 바이러스-1(porcine techovirus-1)의 P2A, 테아 아시냐 바이러스(Thosea asigna virus)의 T2A, 말 비염 A 바이러스(equine rhinitis A virus)의 E2A, 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus)의 F2A 일 수 있다. 그 중에서도, P2A는 절단 효율이 가장 높기 때문에 선호된다. 이들 2A 폴리펩티드의 다양한 기능적 변이체도 당업계에 공지되어 있으며, 이러한 변이체도 본 발명에서 사용될 수 있다.
2A 폴리펩티드에 의해 제1 단백질과 제2 단백질을 분리하여, 동일한 개방 판독 프레임에 배치하고, 동일한 프로모터에 의해 발현을 유도하면, 형질 도입된 세포가 두 단백질을 모두 발현할 가능성을 최대화할 수 있다. 상기 두 단백질이 서로 다른 벡터의 세포로 개별적으로 형질 도입되면, 일부 세포는 제1 단백질만 발현하고, 일부 세포는 제2 단백질만 발현할 수 있기 때문이다. 상기 두 단백질을 공동-발현하는 세포의 비율은 낮을 것이다. 또한 두 단백질의 발현이 동일한 벡터에서 서로 다른 프로모터에 의해 유도되는 경우 프로모터 효율의 차이로 인해, 두 단백질을 발현하는 세포의 비율도 감소한다.
일부 실시양태에서, 상기 제1 단백질은 암-관련 항원 특이적 수용체 단백질이다. 일부 실시양태에서, 제2 단백질은 우성 음성 TGF-β 유형 II 수용체이다.
본 발명에서 사용되는 "우성 음성 TGF-β 유형 II 수용체(dominant negative TGF-β type II receptor)"는 TGF-β 리간드(예컨대, TGF-β1)에 대한 결합을 위해 TGF-β RII와 경쟁할 수 있지만 TGF-β 유형 II 수용체의 변이체 를 의미하나, TGF-β RII 신호 전달 기능을 수행할 수 없다. 일부 실시양태에서, 상기 우성 음성 TGF-β 유형 II 수용체의 세포 내 신호 전달 도메인은 돌연변이되어 세포 내 신호 전달 능력을 상실한다. 일부 실시양태에서, 상기 우성 음성 TGF-β 유형 II 수용체는 TGF-β 유형 II 수용체의 세포 내 신호 전달 도메인이 결여되어 있다. 일부 특정 실시양태에서, 상기 우성 음성 TGF-β 유형 II 수용체는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 "암-관련된 항원 특이적 수용체 단백질(cancer-associated antigen-specific receptor protein)"은 외인성 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR) 일 수 있다.
본 발명의 상기 암-관련된 항원 특이적 수용체 단백질은 CD16, CD64, CD78, CD96, CLL1, CD116, CD117, CD71, CD45, CD71, CD123, CD138, ErbB2 (HER2/neu), 암배아 항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 상피 세포 부착 분자(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM), 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR), EGFR 변이체 III (EGFRvIII), CD19, CD20, CD30, CD40, 디시알릴강글리오사이드(disialylganglioside) GD2, 관 상피 점액(ductal epithelial mucin), gp36, TAG-72, 글리코스핑고지질(glycosphingolipid), 신경교종-관련 항원(glioma-related antigens), β-인간 융모성 성선 자극 호르몬(β-human chorionic gonadotropin), α-페토글로불린(α-fetoglobulin, AFP), 렉틴-반응성(lectin-responsive) AFP, 티로글로불린(thyroglobulin), RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로머라아제 역전사 효소(human telomerase reverse transcriptase), RU1, RU2 (AS), 장 카르복실 에스테라아제(intestinal carboxyl esterase), mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타아제(prostase), 프로스타타아제 특정 항원(prostatase specific antigen, PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGA-1a, p53, 프로스테인(Prostein), PSMA, 생존 및 텔로머라아제(survival and telomerase), 전립선 암 종양 항원-1(prostate cancer tumor antigen-1, PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타아제(neutrophil elastase), 에프린(ephrin) B2, CD22, 인슐린 성장 인자(insulin growth factor, IGF1)-I, IGF-II, IGFI 수용체, 메조텔린(mesothelin), 종양-특이적 펩티드 에피토프(tumor-specific peptide epitopes)를 나타내는 주용 조직호환성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 분자, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2D, 종양 기질 항원(tumor stromal antigen), 피브로넥틴 추가 도메인 A(fibronectin extra domain A, EDA) 및 엑스트라 도메인 B(extra domain B, EDB), 테나신-C A1 도메인(tenascin-C A1 domain, TnC A1), 섬유 아세포-관련 단백질(fibroblast-associated protein, fap), CD3, CD4, CD8, CD24 , CD25, CD33, CD34, CD133, CD138, Foxp3, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), GM-CSF, 사이토카인 수용체(cytokine receptor), 내피 인자(endothelial factor), BCMA (CD269, TNFRSF17), TNFRSF17 (UNIPROT Q02223), SLAMF7 (UNIPROT Q9NQ25), GPRC5D (UNIPROT Q9NZD1), FKBP11 (UNIPROT Q9NYL4), KAMP3, ITGA8 (UNIPROT P53708) and FCRL5 (UNIPROT Q68SN8)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
T 세포 항원 수용체로도 알려진 "T 세포 수용체 (T cell receptor, TCR)"는 항원 펩타이드-MHC 분자를 특이적으로 인식하고 결합하는 T 세포의 분자 구조이며, 일반적으로 CD3 분자와의 복합체 형태로 T 세포 표면에 존재한다. 대부분의 T 세포의 TCR은 α와 β 펩타이드 사슬로 구성되어 있고, 몇몇 T 세포의 TCR은 γ와 δ 펩타이드 사슬로 구성되어 있다.
인공 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체 또는 키메라 면역 수용체로도 알려진 "키메라 항원 수용체 (Chimeric antigen receptor, CAR)"는 면역 이펙터 세포에 특정 특이성을 부여할 수 있는 인공적으로 설계된 수용체이다. 일반적으로, 이 기술은 T 세포에 종양 표면 항원을 특이적으로 인식하는 능력을 부여하는데 사용된다. 이러한 방식으로, 다수의 표적 종양 살해 세포가 생성될 수 있다.
상기 CAR은 암-관련된 항원에 대한 세포 외 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 상기 세포 외 항원 결합 도메인은 예를 들어, 단일 클론 항체, 합성 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 단일 도메인 항체, 항체 단일-사슬 가변 단편 (scFV) 및 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 예를 들어, 상기 세포 외 항원 결합 도메인은 FMC63, 리툭시맙(rituximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 에프라투주맙(epratuzumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 비바투주맙(bivatuzumab), 세툭시맙(cetuximab), 라베투주맙(labetuzumab), 팔리비주맙(palivizumab), 세비루맙(sevirumab), 투비루맙(tuvirumab), 바실릭시맙(basiliximab), 다클리주맙(daclizumab), 인플릭시맙(infliximab), 오말리주맙(omalizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 켈릭시맙(Keliximab), 시플리주맙(siplizumab), 나탈리주맙(natalizumab), 클레놀릭시맙(clenoliximab), 펨투모맙(pemtumomab), 에드레콜로맙(Edrecolomab), 칸투주납(Cantuzumab) 등과 같은 상업적으로 이용 가능한 항체를 포함하는 하나 이상의 알려진 항체로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 다양한 측면의 일부 실시양태에서, 상기 CAR은 막 횡단 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 추가로 포함한다. 본 발명에 따른 상기 CAR의 세포 내 신호 전달 도메인은 세포 외 리간드 결합 도메인이 표적에 결합하여 면역 세포의 활성화 및 면역 반응을 유도한 후 세포 내 신호 전달을 담당한다. 상기 세포 내 신호 전달 도메인은 CAR을 발현하는 면역 세포의 하나 이상의 정상 이펙터 기능을 활성화하는 능력을 갖는다. 예를 들어, 상기 T 세포의 이펙터 기능은 사이토카인의 분비를 포함하는 세포 용해 활성 또는 보조 활성일 수 있다.
CAR의 세포 내 신호 전달 도메인은 T 세포 수용체 및 공동-수용체(항원 수용체 결합 후 신호 전달을 시작하기 위해 함께 작용)의 세포질 서열, 및 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열과 같으나 이에 제한되지 않는 세포질 서열일 수 있다. 세포 내 신호 전달 도메인에는 두 가지 유형의 세포질 신호 전달 서열이 포함된다: 항원-의존적 1차 활성화를 시작하는 서열, 및 2차 또는 공동-자극 신호를 제공하기 위해 항원-독립적 방식으로 작용하는 서열. 상기 1차 세포질 신호 전달 서열은 면역 수용체 티로신 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine activation motif)인 ITAM으로 지칭되는 신호 전달 모티프를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 ITAM의 비-제한적인 예로는 TCRζ, FcRγ, FcRβ, FcRε, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d에서 유래된 것들을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 CAR의 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3ζ 신호 전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 상기 CAR의 세포 내 신호 전달 도메인은 공동 자극 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 공동 자극 도메인은 41BB 공동 자극 도메인 또는 CD28 공동 자극 도메인으로부터 선택된다.
CAR은 세포 표면에서 발현된다. 따라서 CAR은 막 관통 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 CAR의 적절한 막 횡단 도메인은 하기 능력을 갖는다: (a) 세포 표면, 바람직하게는 림프구 또는 자연 살해 (NK) 세포와 같지만 이에 제한되지 않는 면역 세포에서의 발현, 및 (b) 리간드 결합 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인과 상호 작용하여 미리 결정된 표적 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 안내하는 단계. 상기 막 관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원에서 유래될 수 있다. 상기 막 횡단 도메인은 임의의 막-결합 단백질 또는 막 횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 상기 막 횡단 도메인은 α 서브 유닛, β 서브 유닛, γ 또는 δ 서브 유닛, CD3 복합체를 구성하는 폴리펩티드, IL-2 수용체의 p55 (α 쇄), p75 (β 쇄) 또는 γ, Fc 수용체의 서브 유닛 사슬, 특히 Fcγ 수용체 III 또는 CD 단백질과 같은 T 세포 수용체의 서브 유닛에서 유래될 수 있다. 대체적으로, 상기 막 관통 도메인은 합성될 수 있으며, 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 막 횡단 도메인은 인간 CD8α 사슬로부터 유래된다. 상기 막 관통 도메인은 세포 외 리간드 결합 도메인과 막 관통 도메인 사이에 위치하는 힌지 영역(hinge region)을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 힌지 영역은 CD8, CD4 또는 CD28의 세포 외 영역에서 유래된다. 일부 실시양태에서, 상기 힌지 영역은 인간 CD8α 사슬의 일부이다.
본 발명의 다양한 측면의 일부 특정 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 상기 CAR은 암-관련된 항원 (예를 들어, scFv), CD8α 힌지 및 막 관통 도메인, CD3ζ 신호 전달 도메인 및 4-1BB 공동 자극 도메인에 특이 적으로 결합하는 세포 외 항원 결합 도메인을 포함 할 수 있다.
일부 특정 실시양태에서, 상기 CAR은 CD19에 대한 세포 외 항원 결합 도메인을 포함한다. 일부 특정 실시양태에서, 상기 CAR은 서열번호 16에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)와 우성 음성 TGF-β II 형 수용체의 공동-발현은 T 세포에서 TGF-β의 억제를 완화할 수 있고, 종양 사멸 활동과 같은 TCR-T 세포 또는 CAR-T 세포의 활성을 현저하게 증가시킬 수 있다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 렌티 바이러스 벡터는 T 세포에서 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR) 및 우성 음성 TGF-β 유형 II 수용체의 공동-발현에 특히 적합하다.
다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 렌티 바이러스 벡터 입자의 제조 방법을 제공한다 :
a) 적합한 숙주 세포를 본 발명의 렌티 바이러스 벡터, Gag 및 / 또는 Pol을 발현하는 하나 이상의 패키징 벡터, 및 VSV-G와 같은 외피 단백질을 발현하는 엔빌로프 벡터로 공동-형질 감염시키는 단계;
b) 렌티 바이러스 벡터를 렌티 바이러스 벡터 입자로 패키징하기 위해 상기 형질 감염된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
c) b) 단계에서 생성된 렌티 바이러스 벡터 입자를 수득하는 단계.
당업계에 공지되어 있고 당업자는 Gag 및/또는 Pol을 발현하기위한 적합한 하나 이상의 패키징 벡터, 및 VSV-G와 같은 외피 단백질을 발현하기위한 엔빌로프 벡터를 쉽게 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 플라스미드이다.
렌티 바이러스 벡터 입자 제조에 적합한 숙주 세포는 293T 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 렌티 바이러스 벡터를 포함하거나 본 발명의 상기 언급된 방법에 의해 제조된 렌티 바이러스 벡터 입자를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 치료용 T 세포의 제조에서 본 발명의 렌티 바이러스 벡터 입자의 용도를 제공하며, 여기서 상기 치료용 T 세포는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR), 및 선택적으로 우성 음성 TGF-β 유형 II 수용체와 같은 암-관련된 항원 특이적 수용체 단백질을 발현한다.
다른 양태에서, 본 발명은 T 세포를 본 발명의 렌티 바이러스 벡터 입자로 형질 도입하는 단계를 포함하는 치료용 T 세포의 제조 방법을 제공한다. 렌티 바이러스 벡터 입자의 형질 도입은 상기 치료용 T 세포가 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR), 및 선택적으로 우성 음성 TGF-β 유형 II 수용체와 같은 암-관련된 항원-특이적 수용체 단백질을 발현하게 한다.
본 발명의 T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다양한 비-제한적 방법에 의해 많은 비-제한적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, 이용 가능하고 당업자에게 공지된 세포주가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 건강한 기증자 또는 암 진단을 받은 환자로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 상이한 표현형 특징을 나타내는 혼합된 세포 집단의 일부일 수 있다. 예를 들어, 상기 T 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리한 다음 특정 항체를 사용하여 활성화 및 확장하여 얻을 수 있다.
본 발명의 다양한 측면의 일부 실시양태에서, 상기 T 세포는 개체의 자가 세포로부터 유래된다. 본원에 사용된 "자가 조직(autologous)"은 개체를 치료하기 위해 사용된 세포, 세포주 또는 세포 집단이 개체로부터 유래된 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 상기 T 세포는 동종 이계 세포(allogeneic cells), 예컨대, 상기 개체의 인간 백혈구 항원 (HLA)에 적합한 공여자로부터 유래된다. 표준 체계를 사용하여 기증자의 세포를 비-동종이식 세포로 전환하고 필요에 따라 세포를 복제하여, 한 명 이상의 환자에게 투여할 수 있는 세포를 생성한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 렌티 바이러스 벡터, 적합한 패키징 벡터, 적합한 엔빌로프 벡터 및/또는 293T 세포와 같은 적합한 숙주 세포를 포함하는 렌티 바이러스 벡터 입자를 생산하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 또한 세포 형질 감염 시약을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 렌티 바이러스 벡터 입자를 포함하는 관심 폴리펩티드를 세포에서 발현시키기 위한 키트를 제공한다.
도 1은 CAR-19 발현을 위한 렌티 바이러스 벡터의 게놈 및 이의 완전성을 확인하기위한 전략을 나타낸다. (A) PEF1α-L을 함유하는 오래된 벡터 pPVLV1 (긴 프로모터, 531bp); (B) PEF1α-S를 포함하는 새로운 벡터 pPVLV2(짧은 프로모터, 212bp). 바이러스 벡터 게놈의 완전성은 랜덤 6량체 프라이머(random hexamer primer)를 사용하여 역전사-cDNA에서 예상 PCR 산물(F1-F5 : PCR 단편)을 생성하여 확인하였다.
도 2는 pPVLV1과 pPVLV2의 차이점을 나타낸다. (A) 예상되는 DNA 단편은 바이러스 게놈의 역전사-cDNA에서 증폭되었다. 바이러스 유전자 단편을 함유하는 PEF1α-L (긴 프로모터)에서 결함 유전자 사이트가 관찰되었다. 예상치 못한 크기의 DNA 단편은 화살표로 표시되었다 (왼쪽 패널). (B) CAR-19 발현 세포의 백분율 비교, 및 (C) 293T 세포로의 형질 도입 48 시간 후 각 벡터의 역가(titer).
도 3은 CAR-19-Fluc의 구조 및 루시퍼라제 활성을 나타낸다. (A) 및 (B) P2A-Fluc 카세트(cassette)의 업스트림에 복제된 CAR-19를 인코딩하는 Bicistronic 구조물이 이 실험에서 사용되었다. (C) CAR-19 및 Fluc 분자의 개략도. (D) 렌티 바이러스 벡터의 루시퍼라제 활성은 293T 세포의 형질 도입 후 48 시간에 결정되었다.
도 4는 CAR-19-DNRII의 구조 및 바이러스 벡터를 나타낸다. (A) 및 (B)는 절단된 TGFBRII (DNRII)를 공동 발현하는 CAR-19의 벡터지도를 보여준다. (C) 공동-발현된 CAR-19 및 DNRII 분자의 개략도.
도 5는 형질도입된 293T 세포에서 CAR-19 및 DNRII 발현의 형질 도입 효율을 나타낸다. 도면의 숫자는 형질 도입되지 않은 293T 세포의 음성 대조군에 비해 CAR-19 (상단) 또는 DNRII (하단) 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 10 개의 독립적인 실험에서 대표적인 실험 결과를 제시한다.
도 6은 형질도입된 T 세포에서 CAR-19 및 DNRII의 발현을 나타낸다. 활성화된 T 세포를 렌티 바이러스 벡터로 형질 도입하여 CAR-19 또는 CAR-19-DNRII를 발현하고 유세포 분석으로 평가하였다. 도면의 숫자는 형질 도입되지 않은 T 세포의 음성 대조군에 비해 CAR-19 (상단) 또는 DNRII (하단) 양성 세포의 백분율을 나타낸다. 상기 결과는 세 가지 독립적인 실험을 나타낸다.
도 7은 CAR-19 또는 CAR-19-DNRII 벡터로 형질도입 후 세포 생존력 및 계수를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SD로 표시된다.
도 8은 DNRII가 SMAD2의 TGF-β1-유도된 인산화를 감소시킨 것을 나타낸다.
도 9는 CAR-T-19 및 CAR-T-19-DNRII 세포에서 IFN-γ 및 TNF-α의 mRNA 수준을 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM으로 표현된다.
도 10은 TGF-β1의 존재하에 CAR-T-19 및 CAR-T-19-DNRII 세포에 의한 CD19+ 종양 세포의 항원-특이적 사멸을 나타낸다. CAR T 세포의 초기 활성화 12 일 후, 세포 용해 활성은 DELFIA®EuTDA 세포 독성 분석에 의해 측정되었다. T 세포는 측정 3 일 전에 수집하여 rhTGF-β1 (10ng/ml)과 함께 72 시간 동안 배양하였다. 표적 세포를 BATDA 시약으로 15분 동안 표지한 다음, 이펙터 세포로서 형질도입된 T 세포를 지정된 E : T 비율로 추가하였다. 4 시간 배양 후 용해를 측정하였다.
실시예의 통계분석은 GraphPad 소프트웨어 (GraphPad Prism v5.0; GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 사용하여 수행되었다. 데이터는 Paired t-test에 이어 Newman-Keuls 테스트로 분석되었다. 결과는 평균±으로 표현되었다. <0.05의 p-값은 중요한 것으로 간주되었다.
실시예 1. CAR의 발현을 위한 렌티 바이러스 벡터의 최적화
CAR을 형질도입하는데 사용되는 렌티 바이러스 벡터는 필요한 CAR 이식 유전자를 함유해야하며 상기 세포에서 CAR을 발현할 수 있어야한다. CAR을 발현하기위한 2 개의 3-세대 렌티 바이러스 벡터, 즉 오래된 벡터 pPVLV1 (도 1A) 및 새로운 벡터 pPVLV2 (도 1B)가 설계되었다. pPVLV1은 531bp 길이의 인간 신장 인자 1α (human elongation factor 1α, EF1α) 프로모터를 함유하고, pPVLV2는 212bp 절단된 인간 EF1α 프로모터를 함유한다. 두 벡터에 함유된 다양한 요소와 그 설명은 하기 표 1에 나타내었다.
본 출원의 실시예에서 발현되는 CAR은 CD19를 표적으로하는 scFv, 인간 CD8의 힌지(hinge) 및 막 관통 도메인(transmembrane domain), 세포 내 도메인 4-1BB 및 CD3ζ를 포함한다. CD19를 표적으로하는 CAR의 아미노산은 서열번호 16에 표시되고, 뉴클레오티드 서열은 서열번호 8에 표시된다.
pPVLV1 및 pPVLV2 렌티 바이러스 벡터의 관련 요소
Feature Location (size, bp) description
pPVLV11) pPVLV22)
5’LTR 1-675
(675)
5’R-U5-Δgag
(서열번호 3)		 1-181
(181)
절단된
(서열번호 11)		 HIV-1에서 5’절단됨.
바이러스 전사(viral transcription), 역전사(reverse transcription) 및 통합에 필수적임.
HIV-psi (ψ) 703-1,560
(858)
(서열번호 4)		 228-353
(126)
(서열번호 12)		 HIV-1의 패키징 신호(Packaging signal). 이동 플라스미드 패키징에 필수적임.
RRE 850-1,083
(234)
(서열번호 5)		 846-1,079
(234)
(서열번호 5)		 핵에서 바이러스 전사체(viral transcripts)의 세포질로의 Rev-의존성 mRNA 수출에 필수적임.
cPPT/CTS 1,610,-1,727
(118)
(서열번호 6)		 1,606-1,723
(118)
(서열번호 6)		 HIV-1의 cPPT/CTS. 벡터 통합 및 변환 효율성을 개선.
EF1α프로모터 1,827-2,357
(531)
(서열번호 7)		 1,817-2,028
(212)
(서열번호 13)		 이식 유전자(transgene)의 유비쿼터스(ubiquitous) 발현을 유도하는 프로모터(promoter).
CAR-19 2,507-3,964
(1,458)
(서열번호 8)		 2,042-3,499
(1,458)
(서열번호 8)		 이식 유전자(transgene); 키메라 항원 수용체를 표적으로하는 CD19.
WPRE 4,022-4,611
(590)
(서열번호 9)		 3,524-4,112
(589)
(서열번호 14)		 mRNA 전사체 성숙(mRNA transcript maturation)을 촉진하여 이식 유전자 발현을 개선.
3’LTR 4,631-5,320
(690)
3’SIN LTR
(서열번호 10)		 4,184-4,417
(234)
Δ-U3
(서열번호 15)		 HIV-1에서 자가 비활성화 3’3’LTR). 바이러스 전사, 역전사 및 통합에 필수적임. 바이러스 복제를 방지하기위한 안전 조치 함유.
1) EF1α 긴 프로모터를 포함하는 PPVLV1 벡터 (5,320 bp, 서열번호 1)
2) EF1α 짧은 프로모터를 포함하는 PPVLV2 벡터 (4,417 bp, 서열번호 2)
렌티 바이러스 상층액은 gag/pol 패키징 플라스미드, VSV-G 엔벨로프 플라스미드 및 상기 언급된 렌티 바이러스 벡터 서열을 포함하는 전달 구축물로 293T 세포의 형질 감염을 통해 생성되었다. 요약하면, DNA 혼합물을 Opti-MEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)에서 혼합하고 Lipofectamine 3000 (Life Technologies)을 함유하는 동일한 부피의 Opti-MEM과 조합하였다. 상기 생성된 혼합물을 실온에서 15 분 동안 배양한 후 293T 세포에 적용하였다. 렌티 바이러스-함유 배지는 형질 감염 후 24 시간에 수집되었다. 수집 후. 상기 상층액을 PVDF 막 (0.45 μpore)을 통해 여과하였다. 렌티 바이러스 수확물을 조합하고 4 ℃에서 보관한 후 20,000 x g에서 1 시간 30 분 동안 초 원심분리하였다. 렌티 바이러스 펠렛을 PBS에 재현탁시켰다.
도 1은 두 개의 렌티 바이러스 벡터 구조의 개략도와 PCR 산물을 중첩하여 렌티 바이러스의 완전성을 확인하는 전략을 보여준다. 랜덤 프라이머를 사용하여 역전사-cDNA로부터 겹치는 단편 F1-F5를 증폭하도록 적절한 프라이머를 설계하였다. 예상 크기의 PCR 생성물은 렌티 바이러스의 완전성을 증명할 수 있다.
도 2A는 바이러스 게놈에서 역전사 된 cDNA에서 증폭된 각 DNA 단편을 보여준다. 예기치 않게, PEF1α-L (긴 프로모터)을 함유하는 바이러스 유전자 단편에서 결함이 있는 유전자 사이트가 관찰되었다. 화살표는 예상치 못한 DNA 단편의 존재를 나타낸다(왼쪽). 이 현상은 PEF1α-S (짧은 프로모터)를 함유하는 바이러스 유전자 단편에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결함이있는 바이러스 게놈은 역가 및 형질 도입 효율에 영향을 미칠 수 있다.
이를 위해, 두 렌티 바이러스의 역가 및 형질 도입 효율을 테스트했다. 렌티 바이러스 적정을 위해, 2 x 106 293T 세포를 6-웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하고 다양한 부피의 농축된 렌티 바이러스로 형질 도입하였다. 형질 도입 후 48 시간 후, 293T 세포를 플레이트에서 분리하였다. CAR의 존재는 Alexa Fluor 488-표지된 염소 항-인간 IgG F(ab)2를 사용하여 유세포 분석을 통해 검출되었다. 5' LTR에서 3' LTR까지의 바이러스 게놈 RNA는 기존 PCR을 사용하여 확인되었다.
상기 결과는 도 2B 및 C에 나타내었다. PEF1α-L (pPVLV1 벡터 기준)을 사용하는 바이러스의 형질 도입 효율 (CAR-발현 세포의 비율)은 9.95 %에 불과하며, 이는 PEF1α-S (pPVLV2 벡터 기준)를 사용하는 바이러스의 70.4 %보다 훨씬 낮다. 또한, PEF1α-L (pPVLV1 벡터 기준)이 있는 바이러스의 역가는 PEF1α-S (pPVLV2 벡터 기준)가 있는 렌티 바이러스보다 훨씬 낮다. 이는 pPVLV2 벡터가 pPVLV1 벡터보다 우수하다는 것을 보여주며, 이는 EF1α 프로모터의 길이가 다르기 때문일 수 있다.
실시예 2. 프로모터가 CAR 유전자의 형질도입 및 발현에 미치는 영향
다른 프로모터의 영향을 추가로 입증하기 위해 도 3에 나타난 두 개의 CAR-루시퍼라제 리포터 벡터(luciferase reporter vectors)가 pPVLV2를 기반으로 구성되었다.
차이점은 단지 CAR-19가 P2A-Fluc (반딧불이 형광(Firefly Fluorescence)) 카세트의 업스트림에 클로닝되어 바이시스트론(bicistron)이 형성되는 이식유전자(transgene) 발현을 유도하기위한 프로모터에만 있다 (도 3A 및 B).
벡터가 세포 내로 형질도입된 후, P2A 자가-절단 가능한 펩티드의 코딩 서열의 존재로 인해, 두 분자, CAR-19 및 루시퍼라제가 약 1 : 1의 비율로 동일한 세포에서 발현될 것이며, 형광 강도는 CAR-19의 형질 도입 효율을 반영할 수 있다 (도 3C의 개략도 참조). 도 3D는 2 개의 렌티 바이러스 벡터를 293T 세포로 형질도입한 후 48 시간에 측정된 루시퍼라제 활성을 나타낸다. 상기 결과는 PEF1α-S와 함께 렌티 바이러스 벡터로 형질도입된 세포의 형광이 PEF1α-L과 함께 렌티 바이러스 벡터로 형질도입된 세포보다 유의하게 더 강하다는 것을 보여주었다. 또한 PEF1α-S가 세포에서 이식유전자의 발현을 현저히 향상시켰다는 것이 입증되었다.
이 실시예는 기존의 강력한 프로모터인 531bp EF1α 프로모터가 렌티 바이러스 벡터에서 단백질 발현에 사용될 때, 예기치 않게 낮은 형질도입 효율로 이어질 것임을 증명한다. 절단된 EF1α 프로모터 (212bp)를 사용하면, 상기 형질도입 효율이 크게 향상될 수 있으며 세포에서 CAR과 같은 외래 단백질의 발현이 향상될 수 있다.
실시예 3. 세포에서 CAR 및 DNRII의 공동-발현
TGF-β는 중요한 T 세포 억제 인자이며, 표적 세포에 대한 치료용 T 세포의 살해 효과를 약화시키거나 상실시킬 수 있다. 임상적으로, TGF-β는 다양한 종양 조직에서 광범위하게 발현되며, 종양 세포에서 종양-특이적 T 세포의 사멸 활성을 현저하게 억제하고, 이는 면역 요법 실패의 중요한 원인이다. 우성 음성 TGF-β 수용체 II 형 (DNRII)은 TGF-β의 음성 조절 수용체로, T 세포에 대한 TGF-β의 억제 효과를 억제할 수 있다. 다음 실시예는 T 세포에서 CAR 및 DNRII의 공동 발현 효과를 연구한다. DNRII의 아미노산 서열은 서열번호 17에, 뉴클레오티드 서열은 서열번호 18에 나타낸다.
먼저, 실시예 2와 유사하게, 도 4 (A 및 B)에 나타낸 바와 같이 wo CAR-19-DNRII 벡터는 pPVLV2를 기반으로 구축되었다. 상기 차이점은 이식 유전자의 발현을 유도하는 프로모터에만 있다. CAR-19 및 DNRII는 2A 폴리펩티드 코딩 서열을 사이에 두고 동일한 오픈 리딩 프레임에 있었다. 도 4C는 CAR-19 및 DNRII 분자 구조의 개략도를 보여준다. DNRII는 TGFBRII의 세포 내 세린/트레오닌 키나아제 도메인이 부족하며 신호를 다운스트림으로 전송할 수 없다.
CAR-19 및 DNRII 코딩 서열은 2A 코딩 서열에 의해 분리되고, 동일한 오픈 리딩 프레임에 배치되고, 동일한 프로모터에 의해 발현되며, 이는 수득된 형질도입된 세포가 CAR-19 및 DNRII를 모두 발현하도록 보장할 수 있다. 이는 CAR-19와 DNRII가 서로 다른 벡터의 세포로 개별적으로 형질도입되면 일부 세포는 CAR-19 만 발현하고 일부 세포는 DNRII만 발현하며 두 단백질을 공동 발현하는 세포의 비율이 매우 낮기 때문이다. 또한, 상기 두 단백질의 발현이 동일한 벡터에서 서로 상이한 프로모터에 의해 구동되는 경우, 프로모터 효율의 차이로 인해 두 단백질을 공동 발현하는 세포의 비율도 감소한다.
두 개의 CAR-19-DNRII 렌티 바이러스 벡터를 동일한 MOI (감염다중도(multiplicity of infection))로 293T 세포로 형질 도입하였다. CAR 또는 DNRII의 발현은 표지된 염소 항-인간 IgG F(ab)2 또는 항-DNRII 항체로 MACSQuant 분석기 10을 사용하는 유세포 분석에 의해 검출되었고, 상기 데이터는 FlowJo 소프트웨어로 분석되었다.
상기 결과는 도 5에 나타내었다. PEF1α-S와 함께 렌티 바이러스 벡터로 형질도입된 293T 세포에서 CAR-19 및 DNRII의 발현은 PEF1α-L과 함께 tje 렌티 바이러스 벡터로 형질 도입 된 293T 세포에서보다 유의하게 높았다.
또한, 2 개의 CAR-19 렌티 바이러스 벡터 및 2 개의 CAR-19-DNRII 렌티 바이러스 벡터는 T 세포로의 형질 도입 후 CAR-19 및 DNRII의 발현에 대해 테스트되었다.
건강한 기증자의 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 항-CD3/CD28 Dynabeads 마그네틱 비드로 2일 동안 활성화하고(비드 : 세포 = 3 : 1), IMSF100 무 혈청 배지(LONZA, Belgium)에 rhIL-2(200IU / mL))가 보충된 1x106 세포/ml로 재현탁하였다. CAR-19 및 CAR-19-DNRII 렌티 바이러스 상층액을 각각 형질 도입을 위해 첨가한 다음, 1,200 xg에서 32℃에서 2 시간 동안 원심 분리하였다. 24 시간 후, 바이러스 벡터를 포함하는 상층액을 제거하였다. 세포를 rhIL-2 (200IU/mL)를 포함하는 배지에 3x105 세포/ml로 현탁시키고, CAR-19 분자를 발현하는 CAR T-19 세포 및 CAR-19 분자와 DNRII 분자를 공동-발현하는 CAR-T-19-DNRII 세포를 수득하기 위해 12일 동안 2 내지 3 일마다 교체하는 배지로 확장 및 배양하였다.
동일한 배양 조건에서 배양되었지만 형질도입되지 않은 PBMC는 대조군 (NC)으로 사용되었다. 유세포 분석을 사용하여 형질도입 후 수득한 CAR-T 세포의 각 단백질 분자의 발현을 검출하였다. 세포를 2-3 일마다 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide, PI)로 염색하고, 세포 생존율을 유세포 분석법으로 검출하였다. 세포 배양 과정에서 트리판 블루 염색(trypan blue staining)을 사용하여 2-3 일마다 세포를 계수하고(각 샘플에 대해 3 번 반복), 세포 수를 계산하였다 (평균 ±SD).
상기 결과는 도 6에 나타나 있으며, 형질 도입되지 않은 세포 (NC)는 CAR-19 또는 DNRII를 발현하지 않았다. PEF1α-S 발현된 CAR-19를 함유하는 pPVLV2 벡터를 이용한 CAR-T-19 (발현율 67.4 %); CAR-T-19-DNRII 세포는 CAR-19 (발현율 62.9 %) 및 DNRII (발현율 62.3 %)를 모두 발현하였다. 이는 CAR-19와 DNRII가 CAR-T-19-DNRII 세포에서 공동-발현되었고, 형질도입 효율은 CAR-19 단독의 것과 동등하다는 것을 보여준다. PEF1α-L 벡터를 사용할 때, CAR-19와 DNRII도 CAR-T-19-DNRII 세포에서 공동-발현되었으나 발현율이 현저히 감소하였고; CAR-T-19 세포에서는 CAR-19의 발현율도 현저하게 감소하였다.
또한, 도 7에 나타난 바와 같이, CAR-T-19-DNRII 세포 및 CAR-T-19 세포 사이에는 세포 생존력과 세포 수의 차이가 없다.
따라서, 이 실시예는 pPVLV2 벡터 (PEF1α-S 포함)의 백본이 T 세포와 같은 세포에서 CAR의 발현에 특히 적합하고, CAR 및 DNRII와 같은 다른 단백질의 공동-발현에 특히 적합하다는 것을 결정하였다. 또한 CAR 및 DNRII 코딩 서열을 동일한 오픈 리딩 프레임에 배치하면 두 분자의 높은 공동-발현 속도를 달성할 수 있다.
실시예 4. DNRII의 발현은 TFG-β1에 의해 유도된 SMAD2 분자의 인산화를 감소.
T 세포에 대한 TFG-β의 억제 효과는 TFG-β가 수용체에 결합한 후 SMAD2 분자의 인산화에 의해 달성된다.
형질 도입 9일 후, CAR-T-19 세포 및 CAR-T-19-DNRII 세포를 재조합 인간 TFG-β1(10ng/ml)과 함께 24시간 동안 배양하여 인산화된 SMAD2 (pSMAD2)의 발현 수준을 결정하였다. GAPDH 및 비-인산화된 SMAD2 분자를 대조군으로 사용하여, pSMAD2 분자의 상대적 정량화를 웨스턴 블롯으로 수행하였다.
구체적으로 Bradford 분석 키트 (Sigma-Aldrich)를 사용하여 전체 세포 용해물의 단백질 농도를 측정하였다. 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE 겔의 웰에 로딩하고 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인 (Thermo Scientific)으로 이동하였다. TBST에서 10 %(w/v) 탈지유로 막을 차단한 다음 4 ℃에서 밤새 1 차 항체(항-pSMAD2 및 -SMAD2 (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA, USA); 모두 1 : 1000 희석)와 함께 배양하였다. 이어서 멤브레인을 TBST로 세척하였고 HRP-접합된 염소 항-토끼 IgG (1 : 2000 희석; Cell Signaling Technologies)와 함께 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 그런 다음 멤브레인을 ECL 시약(Thermo Scientific)에 노출시키고 결과 신호를 발광 이미지 분석기 (LAS-4000; Fuji Film, Tokyo, Japan)를 사용하여 검출하였다.
상기 결과는 도 8에 나타내었다. CAR-T-19-DNRII 세포에서 pSAMD2의 수준은 CAR-T-19 세포에서보다 유의하게 낮았다. 이는 DNRII의 발현이 TGF-β 신호 전달 경로의 주요 신호 전달 분자 인 SMAD2의 인산화를 억제하는 것을 보여준다.
실시예 5. 재조합 인간 TGF-β1로 처리된 CAR-T-19-DNRII 세포 및 CAR-T-19 세포에서 IFN-γ 및 TNF-α의 발현
IFN-γ 및 TNF-α는 T 세포가 표적 세포를 죽이는 특징적인 사이토 카인이다. 이 두 가지 사이토카인의 높은 발현 수준은 T 세포가 표적 세포에 대해 높은 사멸 잠재력을 가지고 있음을 나타내며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다.
형질도입된-T 세포는 형질 도입 후 9 일 후 24 시간 동안 10 ng/ml rhTGF-β1의 유무에 관계없이 배양되었다. 그 후, 각각의 형질도입된-T 세포를 각각 24 시간 동안 CD19+ -K562를 혼합하였다. IFN-γ 및 TNF-α mRNA 수준의 양을 결정하기 위해, 각 혼합된 세포를 수확하고 PureLink RNA Mini 키트(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, USA)를 사용한 DNase 분해 및 농도 측정 후, 전체 RNA 샘플은 특정 프라이머와 One-step SensiFAST SYBR Low-ROX 키트(Bioline, Maryland, USA), QuantStudio3 Real-Time PCR 검출 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용한 실시간 정량 RT-PCR 분석을 수행하였다. 상기 18s rRNA는 내부 대조군으로 증폭되었다. 발현 수준은 ΔΔCt 법으로 계산하였으며, 폴드 발현은 식 2-ΔΔCt를 사용하여 구하였다. 모든 실험은 삼중으로 진행되었다.
상기 결과는 재조합 인간 TGF-β1로 처리한 후, IFN-γ 및 TNF-α의 발현이 CAR-T-19-DNRII 세포에서 CAR-T-19 세포에서보다 현저하게 높음을 나타내었다(도 9).
실시예 6. 특히 CAR-T-19-DNRII 세포 및 재조합 인간 TGF-β1로 처리 된 CAR-T-19 세포에 의한 종양 표적 세포의 사멸
형질 도입 12일 후 CAR-T-19 세포 및 CAR-T-19-DNRII 세포를 사용하여 표적 세포 사멸 실험을 수행하였다.
TDA 방출 분석은 TGF-β1의 존재 하에 K562 또는 CD19+ -K562에 대한 CAR-T-19 세포 및 CAR-T-19-DNRII 세포의 세포 독성 활성을 결정하기 위해 수행되었다. CAR-T-19 세포 및 CAR-T-19-DNRII 세포를 재조합 인간 TGF-β1(10ng/ml)과 함께 72 시간 동안 배양하였다. 표적 세포를 BA-TDA (Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut, USA)로 15 분 동안 표지하였고, 이펙터 세포 (T 세포) : 표적 세포 (종양 세포) 비율 각각 20 : 1, 10 : 1, 5 : 1, 및 2.5 : 1에 따라 이펙터 세포와 혼합하였고, TDA 방출 (표적 세포 용해)은 4 시간의 공동-배양 후 검출되었다. 시간-분해 형광 (time-resolved fluorescence, TRF) 판독기 (Thermo Scientific)를 사용하여 분석 상층액의 TDA 방출을 검출하였다. 특정 용해는 다음과 같이 계산된다 : % 용해 = (실험적 용해-자발 용해)/(최대 용해-자발 용해)×100.
상기 결과는 도 10에 나타내었다. 재조합 인간 TGF-β1로 처리한 후, CD19를 발현하는 K562 표적 세포에 대한 CAR-T-19 세포의 사멸 효과는 배경(CAR-T 세포 없음) 수준으로 감소되었다 (도 10A). CD19를 발현하는 K562 표적 세포에 대한 CAR-T-19-DNRII 세포의 사멸 효과는 거의 감소하지 않았으며, 이는 CAR-T 세포를 추가하지 않은 사멸 효과와 상당히 상이한 것이다 (도 10B). 이는 DNRII가 T 세포 사멸에 대한 TGF-β의 억제 효과를 효과적으로 역전시켰음을 보여준다.
서열목록
SEQ ID NO:1 pPVLV1 vector containing CAR-19 coding sequence
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SEQ ID NO:2 pPVLV2 vector containing CAR-19 coding sequence
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SEQ ID NO:3 5’R-U5-Δgag
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SEQ ID NO:4 HIV-psi (ψ)
gatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatc
SEQ ID NO:5 RRE
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SEQ ID NO:6 cPPT/CTS
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SEQ ID NO:7 EF1αpromoterlong
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SEQ ID NO:8 CAR-19 coding sequence
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SEQ ID NO:9 WPRE
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SEQ ID NO:10 3’SIN LTR
atcgagacctagaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgattgtgcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattggcagaactacacaccagggccagggatcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagcaagagaaggtagaagaagccaatgaaggagagaacacccgcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagagagaagtattagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacatggcccgagagctgcatccggactgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagca
SEQ ID NO:11 truncated 5’
gggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagca
SEQ ID NO:12 HIV-psi (ψ)
ctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtc
SEQ ID NO:13 EF1αpromotershort
gggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgatccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacag
SEQ ID NO:14 WPRE
aatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgc
SEQ ID NO:15 3’LTR Δ-U3
tggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagca
SEQ ID NO:16 CAR-19vamino acid sequence
MALPVTALLL PLALLLHAAR PDIQMTQTTS SLSASLGDRV TISCRASQDI SKYLNWYQQK PDGTVKLLIY HTSRLHSGVP SRFSGSGSGT DYSLTISNLE QEDIATYFCQ QGNTLPYTFG GGTKLEITGG GGSGGGGSGG GGSEVKLQES GPGLVAPSQS LSVTCTVSGV SLPDYGVSWI RQPPRKGLEW LGVIWGSETT YYNSALKSRL TIIKDNSKSQ VFLKMNSLQT DDTAIYYCAK HYYYGGSYAM DYWGQGTSVT VSSTTTPAPR PPTPAPTIAS QPLSLRPEAC RPAAGGAVHT RGLDFACDIY IWAPLAGTCG VLLLSLVITL YCKRGRKKLL YIFKQPFMRP VQTTQEEDGC SCRFPEEEEG GCELRVKFSR SADAPAYQQG QNQLYNELNL GRREEYDVLD KRRGRDPEMG GKPRRKNPQE GLYNELQKDK MAEAYSEIGM KGERRRGKGH DGLYQGLSTA TKDTYDALHM QALPPR
SEQ ID NO:17 amino acid sequence of DNRII
MGRGLLRGLW PLHIVLWTRI ASTIPPHVQK SVNNDMIVTD NNGAVKFPQL CKFCDVRFST CDNQKSCMSN CSITSICEKP QEVCVAVWRK NDENITLETV CHDPKLPYHD FILEDAASPK CIMKEKKKPG ETFFMCSCSS DECNDNIIFS EEYNTSNPDL LLVIFQVTGI SLLPPLGVAI SVIIIFYCYR VNRQQKLSST WETGKTRKLM EFSEHCAII
SEQ ID NO:18 nucleotide sequence of DNRII
ATGGGTCGGG GGCTGCTCAG GGGCCTGTGG CCGCTGCACA TCGTCCTGTG GACGCGTATC GCCAGCACGA TCCCACCGCA CGTTCAGAAG TCGGTTAATA ACGACATGAT AGTCACTGAC AACAACGGTG CAGTCAAGTT TCCACAACTG TGTAAATTTT GTGATGTGAG ATTTTCCACC TGTGACAACC AGAAATCCTG CATGAGCAAC TGCAGCATCA CCTCCATCTG TGAGAAGCCA CAGGAAGTCT GTGTGGCTGT ATGGAGAAAG AATGACGAGA ACATAACACT AGAGACAGTT TGCCATGACC CCAAGCTCCC CTACCATGAC TTTATTCTGG AAGATGCTGC TTCTCCAAAG TGCATTATGA AGGAAAAAAA AAAGCCTGGT GAGACTTTCT TCATGTGTTC CTGTAGCTCT GATGAGTGCA ATGACAACAT CATCTTCTCA GAAGAATATA ACACCAGCAA TCCTGACTTG TTGCTAGTCA TATTTCAAGT GACAGGCATC AGCCTCCTGC CACCACTGGG AGTTGCCATA TCTGTCATCA TCATCTTCTA CTGCTACCGC GTTAACCGGC AGCAGAAGCT GAGTTCAACC TGGGAAACCG GCAAGACGCG GAAGCTCATG GAGTTCAGCG AGCACTGTGC CATCATC
<110> Immunotech Biopharm Co.,Ltd. <120> Improved lentiviral vector <130> IP21-0002 <150> 201810986752.8 <151> 2018-08-28 <150> PCT/CN 2019/084828 <151> 2019-04-28 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pPVLV1 vector containing CAR-19 coding sequence <400> 1 gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60 ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120 tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180 agtggcgccc gaacagggac ttgaaagcga aagggaaacc agaggagctc tctcgacgca 240 ggactcggct tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc 300 caaaaatttt gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta 360 agcgggggag aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa 420 aatataaatt aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc 480 ctggcctgtt agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc 540 ttcagacagg atcagaagaa cttagatcat tatataatac 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ttctgccgcc tcccgcctgt ggtgcctcct gaactgcgtc cgccgtctag 360 gtaagtttaa agctcaggtc gagaccgggc ctttgtccgg cgctcccttg gagcctacct 420 agactcagcc ggctctccac gctttgcctg accctgcttg ctcaactcta cgtctttgtt 480 tcgttttctg ttctgcgccg ttacagatcc aagctgtgac cggcgcctac g 531 <210> 8 <211> 1458 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR-19 coding sequence <400> 8 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120 accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180 ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240 tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300 caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360 ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420 ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480 ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540 cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600 tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660 gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720 cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gccaaggaac ctcagtcacc 780 gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840 cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900 agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960 gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1020 tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080 agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140 agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200 ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260 ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320 atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380 gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440 caggccctgc cccctcgc 1458 <210> 9 <211> 590 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WPRE <400> 9 taatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 60 tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 120 tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 180 gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 240 tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 300 tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 360 gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct 420 cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 480 caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 540 tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc 590 <210> 10 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' SIN LTR <400> 10 atcgagacct agaaaaacat ggagcaatca caagtagcaa tacagcagct accaatgctg 60 attgtgcctg gctagaagca caagaggagg aggaggtggg ttttccagtc acacctcagg 120 tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa 180 aggggggact ggaagggcta attcactccc aacgaagaca agatatcctt gatctgtgga 240 tctaccacac acaaggctac ttccctgatt ggcagaacta cacaccaggg ccagggatca 300 gatatccact gacctttgga tggtgctaca agctagtacc agttgagcaa gagaaggtag 360 aagaagccaa tgaaggagag aacacccgct tgttacaccc tgtgagcctg catgggatgg 420 atgacccgga gagagaagta ttagagtgga ggtttgacag ccgcctagca tttcatcaca 480 tggcccgaga gctgcatccg gactgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct 540 gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag 600 tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac 660 ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca 690 <210> 11 <211> 181 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> truncated 5'LTR <400> 11 gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca 60 ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg 120 tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc 180 a 181 <210> 12 <211> 126 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV-psi <400> 12 ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg caagaggcga ggggcggcga 60 ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga aggagagaga tgggtgcgag 120 agcgtc 126 <210> 13 <211> 212 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a promoter short <400> 13 gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgat 60 ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 120 gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 180 tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac ag 212 <210> 14 <211> 589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WPRE <400> 14 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120 atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180 tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240 ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300 attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360 ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420 gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480 aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540 cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589 <210> 15 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' LTR delta-U3 <400> 15 tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agca 234 <210> 16 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR-19 amino acid sequence <400> 16 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln 35 40 45 Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr 50 55 60 Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly 100 105 110 Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 130 135 140 Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser 145 150 155 160 Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly 165 170 175 Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly 180 185 190 Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser 195 200 205 Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys 210 215 220 Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys 225 230 235 240 His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 17 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val 20 25 30 Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro 35 40 45 Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln 50 55 60 Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro 65 70 75 80 Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr 85 90 95 Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile 100 105 110 Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys 115 120 125 Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn 130 135 140 Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu 145 150 155 160 Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu 165 170 175 Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn 180 185 190 Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys 195 200 205 Leu Met Glu Phe Ser Glu His Cys Ala Ile Ile 210 215 <210> 18 <211> 657 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 atgggtcggg ggctgctcag gggcctgtgg ccgctgcaca tcgtcctgtg gacgcgtatc 60 gccagcacga tcccaccgca cgttcagaag tcggttaata acgacatgat agtcactgac 120 aacaacggtg cagtcaagtt tccacaactg tgtaaatttt gtgatgtgag attttccacc 180 tgtgacaacc agaaatcctg catgagcaac tgcagcatca cctccatctg tgagaagcca 240 caggaagtct gtgtggctgt atggagaaag aatgacgaga acataacact agagacagtt 300 tgccatgacc ccaagctccc ctaccatgac tttattctgg aagatgctgc ttctccaaag 360 tgcattatga aggaaaaaaa aaagcctggt gagactttct tcatgtgttc ctgtagctct 420 gatgagtgca atgacaacat catcttctca gaagaatata acaccagcaa tcctgacttg 480 ttgctagtca tatttcaagt gacaggcatc agcctcctgc caccactggg agttgccata 540 tctgtcatca tcatcttcta ctgctaccgc gttaaccggc agcagaagct gagttcaacc 600 tgggaaaccg gcaagacgcg gaagctcatg gagttcagcg agcactgtgc catcatc 657

Claims (18)

  1. 숙주 세포에서 관심 폴리펩티드(polypeptide of interest)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하기 위한 절단된 EF1α 프로모터(truncated EF1α promoter)를 포함하는 렌티 바이러스 벡터(lentiviral vector)로서, 예를 들어, 상기 절단된 EF1α 프로모터는 서열번호 13으로 표시한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 EF1α 코어 프로모터인 렌티 바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 렌티 바이러스 벡터는 비-복제 렌티 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 렌티 바이러스 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 5'LTR, ψ 요소, RRE 요소, cPPT/CTS 요소, 절단된 EF1α 프로모터, WPRE 요소, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하기 위한 다중 클로닝 사이트, 및 3′LTR로 이루어진 그룹으로 선택되는 요소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 렌티 바이러스 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 5'LTR, ψ 요소, RRE 요소, cPPT/CTS 요소, 절단된 EF1α 프로모터, WPRE 요소, 3'LTR, 및 선택적으로, 작동 가능하게 연결된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하기위한 다중 클로닝 사이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 렌티 바이러스 벡터.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 5'LTR은 서열번호 3 또는 11에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고; ψ 요소는 서열번호 4 또는 12에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; RRE 요소는 서열번호 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고; cPPT/CTS 요소는 서열번호 6에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고; WPRE 요소는 서열번호 9 또는 14에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 3'LTR은 서열번호 10 또는 15에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 렌티 바이러스 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 11에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'LTR, 서열번호 12에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 ψ 요소, 서열번호 5에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RRE 요소, 서열번호 6에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cPPT/CTS 요소, 서열번호 13에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 절단된 EF1α 프로모터, 서열번호 14에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 WPRE 요소, 서열번호 15에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 3'LTR, 및 선택적으로, 작동 가능하게 연결된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하기위한 다중 클로닝 사이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 렌티 바이러스 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 렌티 바이러스 벡터.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 폴리펩티드는 복수의 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드이고, 융합 폴리펩티드에서 상기 복수의 단백질이 자가-절단 가능한 펩티드에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 렌티 바이러스 벡터.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 폴리펩티드는 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드 이며, 상기 융합 폴리펩티드는 제1 단백질 및 제2 단백질 사이에 자가-절단 가능한 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 렌티 바이러스 벡터.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 자가-절단 가능한 펩티드는 2A 폴리펩티드이며, 예를 들어, 상기 자가-절단 가능한 펩티드는 P2A, F2A, E2A 또는 T2A 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체로부터 선택된 것을 특징으로 하는 렌티 바이러스 벡터.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 제1 단백질은 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR) 또는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)와 같은 암-관련된 항원-특이적 수용체 단백질인 것을 특징으로 하는 렌티 바이러스 벡터.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 단백질은 우성 음성 TGF-β II형 수용체(dominant negative TGF-β type II receptor)인 것을 특징으로 하는 렌티 바이러스 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 우성 음성 TGF-β II형 수용체는 TGF-β II형 수용체의 세포 내 신호 전달 도메인이 부족하며, 예를 들어, 상기 우성 음성 TGF-β II형 수용체는 서열번호 18에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 렌티 바이러스 벡터.
  14. 렌티 바이러스 입자를 제조하는 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 렌티 바이러스 벡터, Gag 및/또는 Pol을 발현하는 하나 이상의 패키징 벡터, VSV-G와 같은 엔빌로프 단백질(envelope protein)을 발현하는 엔빌로프 벡터(envelope vector)로 적합한 숙주 세포를 공동-형질감염시키는 단계;
    b) 상기 렌티 바이러스 벡터를 렌티 바이러스 벡터 입자에 패키징하기 위해 상기 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    c) b) 단계에서 생성된 렌티 바이러스 벡터 입자를 수확하는 단계를 포함하는 렌티 바이러스 입자를 제조하하는 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 렌티 바이러스 벡터를 포함하거나 제14항의 방법으로 제조된 렌티 바이러스 벡터 입자.
  16. 치료용 T 세포의 제조에 사용되는 제15항의 렌티 바이러스 벡터 입자의 용도로서, 상기 치료용 T 세포는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)와 같은 암-관련된 항원-특이적 수용체 단백질, 및 선택적으로, 우성 음성 TGF-β 유형 II 수용체를 발현하는 것인 용도.
  17. 제15항의 렌티 바이러스 벡터 입자로 T 세포를 형질도입하는 단계를 포함하는 치료용 T 세포의 제조 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 렌티 바이러스 벡터 입자의 형질도입은 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR) 및 선택적으로 우성 음성 TGF-β II형 수용체와 같은 암-관련된 항원-특이적 수용체 단백질을 발현하도록 치료용 T 세포를 야기하는 것을 특징으로 하는 방법.
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