KR20230013257A - 종양 미세환경의 역전을 위한 융합 단백질 및 이의 응용 - Google Patents

종양 미세환경의 역전을 위한 융합 단백질 및 이의 응용 Download PDF

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KR20230013257A
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엔디안 메이
용천 자오
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웬슈 자오
준 첸
시아 후앙
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Abstract

본 발명은 면역 치료 기술분야에 속하고, 구체적으로 종양 미세환경의 역전을 위한 융합 단백질, 종양 면역 억제 내성 CAR 및 발현 벡터, 면역 세포 및 응용에 관한 것이다. 상기 융합 단백질은 CEA, CD19, PSCA, BCMA와 같은 상이한 표적의 상이한 CAR 구조와 결합되어 종양 면역 억제 내성 CAR을 형성하거나 또는 병용되어 CD47 양성 종양 세포를 표적화 및 사멸하며; 상기 종양 면역 억제 내성 CAR과 면역 세포는 종양 조직에서 CAR-T 기능에 대한 억제성 신호의 영향을 파괴함으로써, CAR-T 치료 유효성을 구현하는 동시에 일정한 안전성을 보장할 수 있다.

Description

종양 미세환경의 역전을 위한 융합 단백질 및 이의 응용
본 발명은 면역 치료 기술분야에 속하며, 종양 미세환경의 역전을 위한 융합 단백질, 신규 종양 면역 억제 내성 CAR 및 발현 벡터, 면역 세포 및 응용에 관한 것이다.
CAR의 정식 명칭은 키메라 항원 수용체이고, CAR-T는 키메라 항원 수용체 T 세포, 즉 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 림프구이며, 현재 CAR-T 치료는 혈액계 종양에서 획기적인 발전을 이루었지만, 고형 종양에 대한 효과는 혈액계 종양만큼 좋지 않은데, 그 원인은 한편으로는 CAR-T가 고형 종양 내부에 들어가기 어렵기 때문이고, 다른 한편으로는 CAR-T 세포가 고형 종양 내부에 들어가더라도 종양 미세환경으로 인해 정상적으로 기능을 발휘할 수 없기 때문이며, 이는 고형 종양 치료에서 CAR-T 세포의 치료 효과에 영향을 미치고; 종양 미세환경은 종양의 발생, 성장 및 전이와 밀접한 관련이 있으며, 최근 임상 연구에 따르면 종양 미세환경, 특히 고형 종양의 면역 미세환경은 면역 치료(면역 세포 치료 포함)의 치료 효과 및 예후에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 따라서, CAR-T 세포로 고형 종양을 치료할 때 종양 미세환경 억제를 해결하는 것, 즉 종양 미세환경 내성을 구현하는 것이 필수적이다.
PD-1/PD-L1, CTLA-4에 이어 새로운 면역 관문인 CD47은 대식 세포에 “나를 먹지마”라는 신호를 전송하여 선천성 면역의 진행을 억제한다. 현재 CD47 ScFv를 표적화하는 CAR-T를 제조하여 종양을 치료하는 문헌에 대한 보고가 있다. CD47은 종양 탈출의 면역 미세환경을 촉진할 수 있으나, 종양의 이질성으로 인해 CD47 단독 표적화의 치료 효과는 제한적이고, 외인성 ScFv는 강한 친화력으로 인해 CAR-T 세포 과활성화, 낮은 생존율 및 비특이성을 유발하여 안전 위험을 초래할 수 있다. 따라서, 보다 안전하고 효과적인 방법으로 CD47을 인식하여 종양 미세환경의 탈출 신호를 파괴하는 것이 매우 중요하다.
신호 조절 단백질 α(SIRPα)는 CD47의 리간드 중 하나로, CD47에 결합하여 대식 세포의 식균 작용을 억제할 수 있고, 현재 CD47에 대한 대부분의 연구는 SIRPα에 초점을 맞추고 있다. SIRPγ도 CD47에 결합할 수 있고, T 세포 표면에 존재하며, 세포외 영역은 1개의 V 도메인과 2개의 C1 도메인으로 구성되고, 세포내 신호가 없으며, CD47을 통해 단방향 신호만 전달하고, 현재 SIRPγ에 대해 조작하는 연구자는 거의 없으며, 이는 CD47에 대해 종양 미세환경을 파괴하기에 보다 적합한 리간드라고 생각한다. 따라서, SIRPγ 단백질의 세포외 도메인을 선택하여 조작 및 설계하고, 종양 면역 억제 내성 CAR을 추가로 설계한다.
본 발명의 목적은 종양 미세환경을 역전시키고, 종양 세포를 표적화 및 사멸할 수 있는 종양 미세환경의 역전을 위한 융합 단백질 및 상기 단백질을 포함하는 발현 벡터 및 면역 세포를 제공하는 것이다.
상기 목적을 구현하기 위해, 본 발명은 하기와 같은 해결수단을 사용한다.
SIRPγ 단백질의 세포외 도메인을 조작 및 설계하여, 종양 조직의 억제성 신호를 파괴할 수 있는 종양 미세환경의 역전을 위한 융합 단백질을 획득한다.
상기 융합 단백질은 SIRPγ 융합 단백질이고, 상기 SIRPγ 융합 단백질 구조는 세포외 도메인, 막횡단 영역 및 세포내 신호 전달 영역을 포함한다.
추가적으로, 막횡단 구조는 인간 CD28 막횡단 영역 또는 인간 CD8 유래 막횡단 영역으로부터 유래된다.
추가적으로, 상기 막횡단 구조의 아미노산 서열은 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시된다.
바람직하게는, 상기 세포내 신호 전달 영역은 CD28로부터 유래되고, 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 38로 표시된다.
추가적으로, 상기 SIRPγ 융합 단백질의 구조는 SIRPγ-CD28TM-CD28, SIRPγ-CD8TM-4-1BB이다.
추가적으로, 상기 SIRPγ 세포외 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 1 또는 이의 기능적 변이체로 표시된다.
추가적으로, 상기 SIRPγ 융합 단백질 SIRPγ-CD28TM-CD28의 아미노산 서열은 서열번호 2 또는 이의 기능적 변이체로 표시된다.
추가적으로, 상기 SIRPγ 융합 단백질 SIRPγ-CD8TM-4-1BB의 아미노산 서열은 서열번호 3 또는 이의 기능적 변이체로 표시된다.
추가적으로, 상기 SIRPγ 융합 단백질 SIRPγ-CD28TM-CD28의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 13으로 표시된다.
추가적으로, 상기 SIRPγ 융합 단백질 SIRPγ-CD8TM-4-1BB의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 14로 표시된다.
추가적으로, 상기 발현 벡터를 포함하는 면역 세포.
추가적으로, 상기 면역 세포는 T 세포, T 세포 전구체 또는 NK 세포이다.
구체적으로 상기 T 세포는 αβT 세포일 수 있고, γδT 세포일 수도 있으며; γδT 세포는 표면에 수용체 γ 및 δ 사슬을 포함하는 독특한 T 세포 서브그룹으로, 모든 t 림프구의 0.5 ~ 5%를 차지하고, 상기 세포 그룹은 1987년에 처음으로 발견하였다. 이는 γδTCR을 갖고 있지만, 항원 또는 리간드에 대한 인식은 MHC 제한이 없으며, 전통적인 αβT 세포와 다르다. 현재 CN107810267A 및 CN107771215A와 같은 많은 특허에서 세포 치료 및 CAR-T 세포 치료에서의 γδT 세포의 적용을 공개하였다.
구체적으로, SIRPγ 융합 단백질을 설계하는 동시에 PD-1의 융합 단백질 PD-1-28TM-28, PD-1-8TM-BB를 더 설계하였다.
구체적으로, 상기 설계된 SIRPγ 융합 단백질을 CAR1과 병용하는 경우, 단독으로 발현하거나 CAR1과 공동으로 발현하여 작용을 발휘할 수 있다. 또한, 상기 SIRPγ 융합 단백질은 면역 치료에 단독으로 적용될 수도 있다.
구체적으로, 본 발명에서 발명자는 SIRPγ 단백질이 CD47에 대해 종양 미세환경을 파괴하는 보다 적합한 리간드라고 생각한다. 따라서, SIRPγ 단백질의 세포외 도메인을 선택하여 조작 및 설계하고, 종양 면역 억제 내성 CAR을 추가로 설계하며; 따라서, 본 발명은 설계 및 구축된 저산소 조절 가능 프로모터와 결합된 CAR-T 세포 기술 및 저산소 조절 가능 프로모터, SIRPγ 단백질과 결합된 CAR-T 세포 세포 기술을 창의적으로 종양의 면역 치료에 적용하여, 즉 전통적인 CAR 구조를 추가로 조작하여, 고형 종양에서 CAR-T의 치료 효과 및 CAR-T의 안전성을 향상시킨다.
추가적으로, 상기 면역 세포는 종양 항원을 인식하는 키메라 항원 수용체를 갖는 구조를 더 포함하고, 상기 키메라 항원 수용체는 종양 항원을 인식하는 세포외 도메인, 힌지(hinge) 영역, 막횡단 영역 및 세포내 신호 전달 영역을 포함하며, 여기서 종양 항원은 PSCA, PSMA, CD19, BCMA, CD123, CD20, CD22, CEA, EGFR, EGFRVIII, GPC3, 5T4, CD33, Her2, GD2, CD70, CLL-1, Trop2, CD47, GPC3, CLND18.2, CD133, CS1, CD155, CD30, ROR1, MUC1, IL13RAα2 또는 메소텔린(mesothelin)을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 이는 종양 표적 인식을 위한 항원 분자로 사용될 수 있다.
본 발명의 목적은 또한 신규 종양 면역 억제 내성 CAR, 및 상기 CAR을 포함하는 발현 벡터 및 면역 세포를 제공하는 것이다. 상기 신규 종양 면역 억제 내성 CAR와 면역 세포는 종양 조직에서 CAR-T 기능에 대한 억제성 신호의 영향을 파괴함으로써, CAR-T 치료 유효성을 구현하는 동시에 일정한 안전성을 보장할 수 있다.
상기 목적을 구현하기 위해, 본 발명은 하기와 같은 해결수단을 사용한다.
상기 신규 종양 면역 억제 내성 CAR은 목적 1에 따른 종양 미세환경의 역전을 위한 융합 단백질 및 CAR1을 포함하고, 상기 CAR1은 종양 항원을 인식하는 세포외 도메인, 힌지 영역, 막횡단 영역 및 세포내 신호 전달 영역을 포함한다.
추가적으로, 상기 융합 단백질은 폴리시스트론 구조를 통해 CAR1에 연결되고, 상기 폴리시스트론 구조는 자가 절단 폴리펩티드 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)이며, 상기 자가 절단 폴리펩티드는 T2A, P2A, E2A 또는 F2A이다.
추가적으로, 상기 CAR의 구조는 ScFv-hinge-TM-CD3ζ-자가 절단 펩티드-SIRPγ 융합 단백질 또는 ScFv-hinge-TM-4-1BB-CD3ζ-자가 절단 펩티드-SIRPγ 융합 단백질이다.
추가적으로, 상기 CAR의 구조는 ScFv-hinge-TM-CD3ζ-자가 절단 펩티드-SIRPγ-CD28TM-CD28 또는 ScFv-hinge-TM-4-1BB-CD3ζ-자가 절단 펩티드-SIRPγ-CD28TM-CD28이다.
추가적으로, 상기 CAR 구조 a는 일반적인 1세대, 2세대, 3세대 CAR 구조일 수 있고, 개선된 이중 CAR, 조절 가능 CAR 구조(예를 들어 FRB/FKBP12 조절)와 같은 신규 CAR 구조일 수도 있다.
추가적으로, CAR1의 힌지 영역 서열은 IgG, CD8, CD7, CD4로부터 유래될 수 있고; CAR 구조의 막횡단 영역은 CD8, CD28, CD3ε, CD4, CD16, CD137, CD80 및 CD86으로부터 유래될 수 있으며; CAR 구조의 세포내 신호 전달 영역은 CD3, CD137, CD28, CD27, OX40, ICOS, GITR, CD2, CD40, PD-1, PD1L, B7-H3, 림프구 기능 관련 항원-1(LFA-1), ICAM-1, CD7, NKG2C, CD83, CD86 및 CD127로부터 유래될 수 있다.
추가적으로, 상기 ScFv는 CD19, CD123, MOv-γ, PSMA, IL13Rα2, EGFRvIII, EGFR, EPCAM, GD2, MUC1, HER2, GPC3, CEA, Meso, CD133, NKG2D, CD138, LeY, k-Light, CD33, ROR1, BCMA, CD30, CD20, CD22, PSCA, CLL-1, CD70, CD47 중 어느 하나를 인식할 수 있다.
추가적으로, 상기 ScFv는 CD47 또는 CEA 또는 PSCA 또는 CD19 또는 BCMA를 인식할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 CAR 구조는 절단된 EGFRt 조절 태그를 갖고; 일부 실시예에서, 상기 PSCA 표적화 CAR 구조는 일반적인 CAR 구조이며; 일부 실시예에서, 상기 PSCA 표적화 CAR 구조는 iCasp9와 같은 자살 유전자를 지닌다.
일부 실시예에서, 상기 CAR 구조는 자연 살해 세포 수용체(NKR)의 하나 이상의 성분을 포함하여 NKR-CAR을 형성한다. NKR 성분은 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 예를 들어 KIR2DL1, KIR2DL2/L3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, DIR2DS5, KIR3DL1/S1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR2DP1 및 KIR3DP1; 자연 세포 독성 수용체(NCR), 예를 들어, NKp30, NKp44, NKp46; 면역 세포 수용체의 신호 전달 림프구 활성화 분자(SLAM) 패밀리, 예를 들어, CD48, CD229, 2B4, CD84, NTB-A, CRA, BLAME 및 CD2F-10; Fc 수용체(FcR), 예를 들어, CD16 및CD64; 및 Ly49 수용체, 예를 들어, LY49A, LY49C 중 임의의 자연 살해 세포 수용체의 막횡단 도메인, 힌지 도메인 또는 세포질 도메인으로부터 유래될 수 있다. 상기 NKR-CAR 분자는 어댑터 분자 또는 세포내 신호 도메인(예를 들어, DAP12)과 상호작용할 수 있다.
바람직한 해결수단 1로서, 전술한 SIRPγ 융합 단백질과 CAR1로 구성된 CAR 구조에 있어서, 상기 CAR1에서 hinge의 아미노산 서열은 서열번호 24 또는 이의 기능적 변이체로 표시되고, TM의 아미노산 서열은 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되며, CD3ζ의 아미노산 서열은 서열번호 11 또는 이의 기능적 변이체로 표시되고; 융합 단백질 구조에서, SIRPγ의 세포외 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 1 또는 기능적 변이체로 표시되며; 인간 CD28로부터 유래되는 막횡단 영역의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되고; 인간 CD28로부터 유래되는 세포내 신호 전달 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9로 표시된다.
추가적으로, 상기 ScFv의 아미노산 서열은 서열번호 25 또는 이의 기능적 변이체로 표시된다.
구체적으로, 본 바람직한 해결수단은 신규 면역 억제 내성 CAR인 ScFv-hinge-TM-CD3ζ-자가 절단 펩티드-SIRPγ-28TM-28, ScFv-hinge-TM-CD3ζ-자가 절단 펩티드-SIRPγ-8TM-BB, ScFv-hinge-TM-4-1BB-CD3ζ-자가 절단 펩티드-SIRPγ-28TM-28, ScFv-hinge-TM-4-1BB-CD3ζ-자가 절단 펩티드-SIRPγ-8TM-BB, ScFv-hinge-TM-CD3ζ-자가 절단 펩티드-PD-1-28TM-28 및 ScFv-hinge-TM-CD3ζ-자가 절단 펩티드-PD-1-8TM-BB를 발현하는 유전자 변형 T 림프구를 설계하여 신규 면역 억제 내성 CAR의 작용을 검증하였다.
추가적으로, 상기 CAR 구조의 제조 방법은, 상기 SIRPγ 융합 단백질을 포함하지 않는 CAR 구조와 상기 SIRPγ 융합 단백질을 하나의 벡터에 공동 발현시켜 면역 세포를 형질감염시키거나; 또는 상기 SIRPγ 융합 단백질을 포함하지 않는 CAR 구조와 상기 SIRPγ 융합 단백질을 2개의 벡터에 각각 발현시켜 면역 세포를 형질감염시키는 것이다.
바람직한 해결수단 2로서, 전술한 SIRPγ 융합 단백질과 CAR1로 구성된 CAR 구조에서, 상기 CAR1은 항 CEA 단일 사슬 항체, CD8 힌지 영역, CD8 막횡단 영역, CD137 및 CD3ξ 이중 자극 신호를 포함한다.
바람직하게는, 상기 CAR 구조 a는 CEA ScFv-CD8 힌지 영역-CD8 막횡단 영역-CD137-CD3ξ 구조이고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 26으로 표시되는 서열을 포함한다. 여기서, CEA 단일 사슬 항체를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 36으로 표시되고; CD8 힌지 영역-CD8 막횡단 영역-CD137-CD3ξ 구조를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 37로 표시된다.
추가적으로, 저산소 조절 가능 프로모터를 포함하는 상기 CAR 구조를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 31로 표시되는 서열을 포함한다.
바람직한 해결수단 3으로서, 전술한 SIRPγ 융합 단백질과 CAR1로 구성된 CAR 구조에서, 상기 CAR1은 CD19 단일 사슬 항체, CD8 힌지 영역, CD8 막횡단 영역, CD137 및 CD3ξ 이중 자극 신호를 포함하고;
바람직하게는, 상기 CAR 구조 a의 아미노산 서열은 서열번호 27 또는 이의 기능적 변이체로 표시된다.
추가적으로, 상기 CAR 구조를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 32 또는 서열번호 33으로 표시되는 서열을 포함한다.
추가적으로, 상기 CAR 구조의 제조 방법은, 상기 SIRPγ 융합 단백질을 포함하지 않는 CAR 구조와 상기 SIRPγ 융합 단백질을 하나의 벡터에 공동 발현시켜 면역 세포를 형질감염시키거나; 또는 상기 SIRPγ 융합 단백질을 포함하지 않는 CAR 구조와 상기 SIRPγ 융합 단백질을 2개의 벡터에 각각 발현시켜 면역 세포를 형질감염시키는 것이다.
바람직한 해결수단 4로서, 전술한 SIRPγ 융합 단백질과 CAR1로 구성된 CAR 구조에서, 상기 CAR 구조 a는 PSCA 단일 사슬 항체, 힌지 영역, CD28 막횡단 영역, CD28, CD137 및 CD3ξ삼중 자극 신호를 포함하고; 상기 힌지 영역은 G4H 또는 7H이다.
바람직하게는, 상기 CAR 구조 a의 아미노산 서열은 서열번호 28 또는 이의 기능적 변이체로 표시되거나; 또는 서열번호 29 또는 이의 기능적 변이체로 표시된다. 아미노산 서열이 서열번호 28 또는 이의 기능적 변이체로 표시되는 힌지 영역은 G4H의 CAR 구조 a이고; 아미노산 서열이 서열번호 29 또는 이의 기능적 변이체로 표시되는 힌지 영역은 7H의 CAR 구조 a이다.
추가적으로, 상기 CAR 구조를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 34 또는 서열번호 35로 표시되는 서열을 포함하고; 여기서 서열번호 35에는 저산소 조절 가능 프로모터가 포함된다.
추가적으로, 상기 CAR 구조의 제조 방법은, 상기 SIRPγ 융합 단백질을 포함하지 않는 CAR 구조와 상기 SIRPγ 융합 단백질을 하나의 벡터에 공동 발현시켜 면역 세포를 형질감염시키거나; 또는 상기 SIRPγ 융합 단백질을 포함하지 않는 CAR 구조와 상기 SIRPγ 융합 단백질을 2개의 벡터에 각각 발현시켜 면역 세포를 형질감염시키는 것이다.
바람직한 해결수단 5로서, 전술한 SIRPγ 융합 단백질을 포함하고, 바람직한 해결수단 1 내지 바람직한 해결수단 4 중 어느 하나의 CAR1과 CAR 구조를 구성하며, 상기 CAR 구조는 저산소 조절 가능 프로모터를 더 포함하고, 상기 저산소 조절 가능 프로모터의 핵산 서열은 서열번호 30으로 표시되는 서열을 포함한다. 저산소 조절 가능 프로모터를 포함하는 CD19 표적화 CAR 구조는 저산소 미세환경에서 체내 종양을 효과적으로 제거할 수 있고, 저산소 미세환경 유도 프로모터를 이용하여 저산소 환경에서 표적 유전자, 단백질 등 인자의 발현을 향상시킬 수 있으며, 종양의 약물 효과 및 CAR-T 치료의 유효성과 안전성을 향상시킬 수 있고, T 림프구에서 효과적으로 발현시킬 수 있을 뿐만 아니라 저산소 환경에서 CAR 분자의 발현을 향상시킬 수 있으며, CAR-T 세포가 높은 IFN-γ 분비 능력을 갖도록 하고, 종양 표적 세포에 대한 CAR-T 세포의 사멸을 향상시키며, 종양의 표적 치료에 사용할 수 있다.
추가적으로, 상기 저산소 조절 가능 프로모터는 Hifla 조절 요소와 미니프로모터가 연결되어 구성된 것이고; 상기 미니프로모터는 사이토바이러스 프로모터, HSV 티미딘 키나아제 프로모터, 유인원 바이러스 40 프로모터, 아데노바이러스 말기 프로모터 및 합성 프로모터 중 어느 하나로부터 선택된다.
추가적으로, 상기 CAR 구조의 제조 방법은, 상기 SIRPγ 융합 단백질을 포함하지 않는 CAR 구조와 상기 SIRPγ 융합 단백질을 하나의 벡터에 공동 발현시켜 면역 세포를 형질감염시키거나; 또는 상기 SIRPγ 융합 단백질을 포함하지 않는 CAR 구조와 상기 SIRPγ 융합 단백질을 2개의 벡터에 각각 발현시켜 면역 세포를 형질감염시키는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 상기 어느 하나에 따른 신규 종양 면역 억제 내성 CAR(바람직한 해결수단 1 내지 바람직한 해결수단 5 중의 해결수단과 비바람직한 해결수단 포함)을 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 면역 세포를 제공하는 것이다.
추가적으로, 상기 발현 벡터는 렌티바이러스 발현 벡터, 레트로바이러스 발현 벡터, 아데노바이러스 발현 벡터, 아데노 관련 바이러스 발현 벡터, DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드 중 어느 하나이다.
추가적으로, 상기 면역 세포는 T 세포, T 세포 전구체 또는 NK 세포이다.
추가적으로, 상기 면역 세포의 제조 방법은, 상기 SIRPγ 융합 단백질을 포함하지 않는 CAR 구조와 상기 SIRPγ 융합 단백질을 하나의 벡터에 공동 발현시켜 면역 세포를 형질감염시키거나; 또는 상기 SIRPγ 융합 단백질을 포함하지 않는 CAR 구조와 상기 SIRPγ 융합 단백질을 2개의 벡터에 각각 발현시켜 면역 세포를 형질감염시키는 것이다.
일부 실시예에서, 상기 렌티바이러스 벡터는 기본적으로 인간 면역 결핍 바이러스 1(HIV-1), 인간 면역 결핍 바이러스 2(HIV-2), 비스나-메디바이러스(visna-maedi virus, VMV), 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV), 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV), 고양이 면역 결핍 바이러스(FIV), 소 면역 결핍 바이러스(BIV) 및 원숭이 면역 결핍 바이러스(SIV)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 벡터는 왼쪽 (5') 레트로바이러스 LTR, Psi(Ψ) 패키징 신호, 중앙 폴리퓨린 스트레치/DNA 플랩(cPPT/FLAP), 레트로바이러스 도출 요소, 본문에 포함된 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 오른쪽 (3') 레트로바이러스 LTR을 포함한다.
일부 실시예에서, CAR은 B형 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(HPRE) 또는 우드척 전사 후 조절 요소(WPRE)와 최적화된 우드척 전사 후 조절 요소(oPRE)를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 5'LTR의 프로모터는 이종 프로모터에 의해 치환된다.
일부 실시예에서, 상기 이종 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 라우스육종바이러스(Rous Sarcoma Virus, RSV) 프로모터 또는 유인원 바이러스 40(SV40) 프로모터이다.
일부 실시예에서, 상기 5'LTR 또는 3'LTR은 렌티바이러스 LTR이다.
일부 실시예에서, 상기 3'LTR은 자가비활성(SIN) LTR이다.
일부 실시예에서, 상기 CAR 구조의 핵산 서열은 최적화된 Kozark 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 본문에 포함된 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 상기 프로모터는 거대세포바이러스 전초기유전자 프로모터(CMV), 연장 인자 1α 프로모터(EF1-α), 포스포글리세레이트 키나아제-1 프로모터(PGK), 유비퀴틴-C 프로모터(UBQ-C), 거대세포바이러스 인핸서/닭 β-액틴 프로모터(CAG), 폴리오마바이러스 인핸서/단순 포진 티미딘 키나아제 프로모터(MC1), β-액틴 프로모터(β-ACT), 유인원 바이러스 40프로모터(SV40) 및 골수증식성 육종바이러스 인핸서, 음성 대조 영역 결실 및 dl587rev 프라이머 결합 부위 치환(MND) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시예에서, CAR을 포함하는 벡터는 분비형 항 PD-1ScFv를 포함할 수 있고; 일부 실시예에서, CAR을 포함하는 벡터는 PD-1 접합된 형질도입 펩티드(예를 들어, PD-1-CD28-CD137-CD3 신호 구조)를 포함하며; 일부 실시예에서, CAR을 포함하는 벡터는 다수의 CAR 조합을 포함하고, 예를 들어 상이한 항원 또는 동일한 항원의 상이한 인식 부위를 표적화하는 2개의 CAR 조합이다.
본 발명의 목적은 또한 약학적 조성물 및 이의 응용을 제공하는 것이다.
상기 목적을 구현하기 위해, 본 발명은 하기와 같은 해결수단을 사용한다.
상기 약학적 조성물은 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 포함하는 발현 벡터 및 면역 세포 또는 상기 신규 종양 면역 억제 내성 CAR 또는 상기 신규 종양 면역 억제 내성 CAR을 포함하는 상기 면역 세포를 포함한다.
일부 실시예에서, 융합 단백질은 SIRPα 또는 SIRPα의 일부 도메인을 선택할 수 있고, 융합 단백질의 구조는 SIRPα-28TM-28, SIRPα-8TM-137, SIRPα-8TM-OX40, SIRPα-8TM-ICOS와 같은 다양한 융합 단백질일 수 있다. 일부 실시예에서 상기 SIRPα 융합 단백질을 발현하는 면역 세포를 단독으로 사용할 수 있고, 상기 SIRPα 융합 단백질과 CAR 분자를 동일한 면역 세포에 공동 발현시킬 수도 있으며; 또는 SIRPα 융합 단백질, CAR 분자를 각각 발현하는 면역 세포를 특정 비율로 혼합할 수 있다.
일부 구체적인 실시예에서, 상기 활성제 및/또는 치료는 수술, 화학요법, 방사선, 면역 억제제, 예를 들어 사이클로스포린(cyclosporin), 아자티오프린(azathioprine), 메토트렉세이트(methotrexate), 마이코페놀레이트(mycophenolate) 및 FK506, 항체 또는 다른 면역 제거제(immunoablativeagents), 예를 들어 CAMPATH, 항 CD3 항체 또는 다른 항체 치료, 사이톡산(cytoxan), 플루다라빈(fludarabine), 사이클로스포린(cyclosporin), FK506, 라파마이신(rapamycin), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 스테로이드(steroids), FR901228, 사이토카인 및 방사선일 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 세포는 다른 활성제, 예를 들어 CAR 발현 세포 활성을 향상시키는 활성제를 발현할 수 있다. 활성제는 억제성 분자를 차단하는 활성제일 수 있다. PD1과 같은 억제성 분자는 일부 실시형태에서 면역 이펙터 반응을 일으키는 CAR 발현 세포의 능력을 감소시킬 수 있다. 억제성 분자는 PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT,LAIR1, CD160, 2B4, CEACAM(CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIG, LAIR1, CD160, 2B4, CD80, CD86, B7-H3(CD276), B7-H4(VTCN1), HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), KIR, A2aR, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, GAL9, 아데노신, TGFR(TGFRβ) 및 TGFRβ를 포함한다. 상기 억제성 분자의 세포외 도메인은 막횡단 도메인과 세포내 신호 전달 도메인, 예를 들어 PD1 CAR에 융합될 수 있다.
추가적으로, 종양 약물의 제조에서 상기 어느 하나에 따른 융합 단백질 또는 상기 어느 하나에 따른 CAR 구조 또는 상기 어느 하나에 따른 핵산 서열 또는 상기 어느 하나에 따른 발현 벡터 또는 상기 어느 하나에 따른 면역 세포의 응용.
추가적으로, 상기 종양은 악성 종양으로, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 전립선암, 결직장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 폐암, 신장암, 간암, 뇌암 및 피부암을 포함한다.
본 발명에서, CAR 구조에서, Z는 인간 CD3 세포내 신호 CD3ζ을 의미하고, BB는 인간 4-1BB 세포내 신호를 의미하며, BBZ는 4-1BB ICD-CD3ζ의 세포내 도메인을 의미하고, 28Z는 CD28ICD-CD3ζ의 세포내 도메인을 의미한다.
본 발명에서, 상기 “기능적 변이체”는 통상적으로 이와 기본적으로 동일한 기능(예를 들어, 상기 키메라 항원 수용체의 특성을 구비할 수 있음)을 갖고, 이와 적어도 85%(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100%)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 상기 아미노산 서열의 변이체는 이와 기본적으로 동일한 기능을 갖는다.
본 발명에서, CAR 구조에서, CEAZ는 세포내 구조에 CD3ζ만 있는 CEA 표적화 CAR 구조를 의미하고, CEA-28Z는 세포내에 CD28 세포내 도메인으로부터 유래된 공동 자극 신호 및 CD3ζ이 있는 CEA 표적화 CAR 구조를 의미하며, CEA-BBZ는 세포내에 4-1BB 세포내 도메인으로부터 유래된 공동 자극 신호 및 CD3ζ이 있는 CEA 표적화 CAR 구조를 의미하고, BCMA-BBZ는 세포내에 4-1BB 세포내 도메인으로부터 유래된 공동 자극 신호 및 CD3ζ이 있는 BCMA 표적화 CAR 구조를 의미하며; SIRPγ-28TM-28은 세포내에 CD28 세포내 도메인으로부터 유래된 신호만 있는 SIRPγ 융합 펩티드를 의미하고, SIRPγ-28이라고 약칭하며; SIRPγ-8TM-BB는 세포내에 4-1BB 세포내 도메인으로부터 유래된 신호만 있는 융합 펩티드를 의미하고, SIRPγ-BB라고 약칭한다.
본 발명의 유익한 효과는 하기와 같다.
본 발명에서 제공되는 종양 미세환경의 역전을 위한 융합 단백질은 종양 미세환경을 역전시킬 수 있고, CD47 양성 종양 세포를 표적화 및 사멸할 수 있으며; 상기 융합 단백질을 포함하는 신규 종양 면역 억제 내성 CAR 및 면역 세포는 종양 조직에서 CAR-T 기능에 대한 억제성 신호의 영향을 파괴함으로써, CAR-T 치료 유효성을 구현하는 동시에 일정한 안전성을 보장할 수 있다.
도 1은 면역 억제 파괴 융합 단백질 구조도이다.
도 2는 면역 억제성 CAR 구조의 모식도이다.
도 3은 CAR 구축 플라스미드의 검증도이다.
도 4는 표적 세포 구축 결과를 보여준다.
도 5a는 신규 면역 억제 내성 CAR-T의 CAR 양성율을 보여준다.
도 5b는 신규 면역 억제 내성 CAR-T의 발현 강도를 보여준다.
도 6a는 신규 면역 억제 내성 CAR-T의 시험관내 기능 검증을 보여준다.
도 6b는 신규 면역 억제 내성 CAR-T의 시험관내 사멸율을 보여준다.
도 7은 종양 억제 환경의 파괴에 대한 신규 면역 억제 내성 CAR-T의 검증을 보여준다.
도 8a는 NCG 마우스의 CEA, PD-L1, CD47의 삼중 양성 발현을 보여준다.
도 8b는 NCG 마우스의 종양 부피 측정 데이터로 종양 부피 증가 곡선을 플롯한 것을 보여준다.
도 9는 2세대 면역 억제성 CAR의 체내 유효성을 보여준다.
도 10은 CEA 표적의 각 실험군의 평균 형광 강도 상황을 보여준다.
도 11은CEA 표적의 각 실험군의 양성율 상황을 보여준다.
도 12는 CEA 표적의 각 실험군의 CAR-T의 시험관내 증폭 배수 곡선을 보여준다.
도 13은 CEA 표적의 각 실험군의 표적 세포 DLDL1-CEA에 대한 CAR-T의 사멸 효율을 보여준다.
도 14는 DLD1-CEA 및 DLD1-CEA(CD47-) 세포에서 CEA 표적의 각 실험군의 IFN-γ 분비 상황을 보여준다.
도 15는 DLD1-CEA 및 DLD1-CEA(CD47-) 세포에서 CEA 표적의 각 실험군의 IL-2 분비 상황을 보여준다.
도 16은 DLD1-CEA 및 DLD1-CEA(CD47-) 세포에서 CEA 표적의 각 실험군의 TNF-α 분비 상황을 보여준다.
도 17은 CEA 표적 스크리닝 비교군 a 체내 저산소 모델에서 마우스 종양 성장 상황 검증의 엔티티 이미지를 보여준다.
도 18은 CEA 표적 스크리닝 비교군 a 체내 저산소 모델에서 종양 마우스의 체내 생물발광량 상황의 검증을 보여준다.
도 19는 유세포 분석에 의한 CD19를 표적화하는 각 실험군의 CAR-T의 양성율 상황을 보여준다.
도 20은 CD19를 표적화하는 각 실험군의 세포 사멸 상황을 보여준다.
도 21은 CD19를 표적화하는 각 실험군의 IFN-γ 인자 분비 상황을 보여준다.
도 22는 CD19를 표적화하는 각 실험군의 마우스 체내 생물발광 상황을 보여준다.
도 23은 CD19를 표적화하는 각 실험군의 마우스 체내 종양 성장 상황을 보여준다.
도 24는 PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28의 IFN-γ 인자 분비 상황을 보여준다.
도 25는 PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28의 IFN-γ 인자 분비 상황을 보여준다.
도 26은 PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28의 IFN-γ 인자 분비 상황을 보여준다.
도 27은 PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28의 IFN-γ 인자 분비 상황을 보여준다.
도 28은 PSCA-28BBZ-G4H-28TM, PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28의 IFN-γ 인자 분비 상황을 보여준다.
도 29는 PSCA-28BBZ-7H-28TM, PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28의 IFN-γ 인자 분비 상황을 보여준다.
도 30은 양성/음성 세포에서 PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28의 세포 사멸 상황을 보여준다.
도 31은 양성/음성 세포에서 PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28의 세포 사멸 상황을 보여준다.
도 32는 양성/음성 세포에서 PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28의 세포 사멸 상황을 보여준다.
도 33은 양성/음성 세포에서 PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28의 세포 사멸 상황을 보여준다.
도 34는PSCA-28BBZ-G4H-28TM, PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28의 세포 사멸 상황을 보여준다.
도 35는 PSCA-28BBZ-7H-28TM, PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28의 세포 사멸 상황을 보여준다.
도 10 ~ 도 18에서, 5HCEA-BBZ는 저산소 조절 가능 프로모터를 포함하고 세포내에 4-1BB 세포내 도메인으로부터 유래되는 공동 자극 신호 및 CD3ζ이 있는 CEA 표적화 CAR 구조를 의미하고; CEA-BBZ는 세포내에 4-1BB 세포내 도메인으로부터 유래되는 공동 자극 신호 및 CD3ζ이 있는 CEA 표적화 CAR 구조를 의미하며; CEA-28Z는 세포내에 CD28 세포내 도메인으로부터 유래되는 공동 자극 신호 및 CD3ζ이 있는 CEA 표적화 CAR 구조를 의미하고, SIRPγ-28TM-28은 세포내에 CD28 세포내 도메인으로부터 유래되는 신호만 있는 융합 펩티드를 의미하며, 후속적으로 SIRPγ-28이라고 약칭한다.
도 19 ~ 도 23에서, 5HCD19-BBZ는 세포내에 저산소 조절 가능 프로모터, 4-1BB(BB라고 약칭함) 세포내 도메인으로부터 유래되는 공동 자극 신호 및 CD3ζ이 있는 CD19 표적화 CAR 구조를 의미하고; SIRPγ-28TM-28(SIRPγ-28)은 세포내에 CD28 세포내 도메인으로부터 유래되는 신호만 있는 융합 펩티드를 의미하며; 5HCD19-BBZ-SIRPγ-28은 5HCD19-8H-8TM-CD137-CD3ζ의 구조의 CAR을 의미하고; SIRPγ-28-5HCD19-BBZ는 저산소 조절 가능 프로모터를 포함하는 CAR 융합 단백질을 2개의 벡터에 각각 발현시켜 면역 세포를 형질감염시켜 획득된 CAR-T를 의미한다.
도 24 ~ 도 35에서, RT4-Luc-GFP는 음성 세포이고, PC-3-Luc-GFP는 음성 세포이며; SIRPγ-28TM-28(SIRPγ-28)은 세포내에 CD28 세포내 도메인으로부터 유래되는 신호만 있는 융합 펩티드를 의미하고; PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28 또는 PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28은 PSCA-28BBZ-G4H-28TM 또는 PSCA-28BBZ-7H-28TM 및 SIRPγ-28 및 SIRPγ-28과 융합 단백질 SIRPγ-28을 2개의 벡터에 각각 발현시켜 면역 세포를 형질감염시켜 획득된 제품을 의미한다. PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28 또는 PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28은 PSCA-28BBZ-G4H-28TM 또는 PSCA-28BBZ-7H-28TM 및 SIRPγ-28과 융합 단백질 SIRPγ-28을 하나의 벡터에 공동 발현시켜 면역 세포를 형질감염시켜 획득된 제품을 의미한다.
이하, 도면을 참조하며 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 바람직한 실시예에서 구체적인 조건을 명시하지 않은 실험 방법은 통상적으로 일반적인 조건, 예를 들어 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼(제3판, J.Sambrook 등)에서 설명된 조건을 따르거나, 또는 제조업체에서 권장하는 조건을 따른다. 예시된 실시예는 본 발명의 내용을 보다 잘 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 내용은 예시된 실시예에만 한정되지 않는다. 따라서, 당업자는 상기 발명의 내용에 따라 실시형태에 대해 비본질적인 개선 및 조정을 수행할 수 있고, 이는 여전히 본 발명의 보호범위에 속한다.
본 발명의 실시예에서, 관련된 원래 벡터 구조의 서열은 하기 표 1과 같다.
(표 1)
Figure pct00001
본 발명의 실시예에서(표 1에서): Z는 CD3ζ을 의미하고, CEAZ는 세포내 구조에 CD3ζ만 있는 CAR 구조(ScFv(CEA)-hinge-TM-CD3ζ)를 의미하며, CEA-28Z는 세포내에 CD28 세포내 도메인으로부터 유래되는 공동 자극 신호 및 CD3ζ이 있는 CEA 표적화 CAR 구조(ScFv(CEA)-hinge-TM-CD28-CD3ζ)를 의미하고, CEA-BBZ는 세포내에 4-1BB 세포내 도메인으로부터 유래되는 공동 자극 신호 및 CD3ζ이 있는 CEA 표적화 CAR 구조(ScFv(CEA)-hinge-TM-4-1BB-CD3ζ)를 의미하며, BCMA-BBZ는 세포내에 4-1BB(BB라고 약칭함) 세포내 도메인으로부터 유래되는 공동 자극 신호 및 CD3ζ이 있는 BCMA 표적화 CAR 구조를 의미하고; SIRPγ-28TM-28은 세포내에 CD28 세포내 도메인으로부터 유래되는 신호만 있는 융합 펩티드를 의미하며, 후속적으로 SIRPγ-28이라고 약칭하고, SIRPγ-8TM-BB는 세포내에 4-1BB 세포내 도메인으로부터 유래되는 신호만 있는 융합 펩티드를 의미하며, 후속적으로 SIRPγ-BB라고 약칭한다.
본 발명의 실시예에서, 5HCD19-BBZ는 세포내에 저산소 조절 가능 프로모터, 4-1BB(BB라고 약칭함) 세포내 도메인으로부터 유래되는 공동 자극 신호 및 CD3ζ이 있는 CD19 표적화 CAR 구조를 의미하고; SIRPγ-28TM-28(SIRPγ-28이라고 약칭함)는 세포내에 CD28 세포내 도메인으로부터 유래되는 신호만 있는 융합 펩티드를 의미하며; SIRPγ-28+5HCD19-BBZ는 저산소 조절 가능 프로모터를 포함하는 CAR 융합 단백질을 2개의 벡터에 각각 발현시켜 면역 세포를 형질감염시켜 획득된 CAR-T를 의미한다. 5HCD19-BBZ-P2A-SIRPγ-28은 저산소 조절 가능 프로모터를 포함하는 CAR 융합 단백질을 하나의 벡터에 공동 발현시켜 면역 세포를 형질감염시켜 획득된 CAR-T를 의미한다.
본 발명의 실시예에서, PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28 또는 PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28은 PSCA-28BBZ-G4H-28TM 또는 PSCA-28BBZ-7H-28TM 및 SIRPγ-28과 융합 단백질 SIRPγ-28을 2개의 벡터에 각각 발현시켜 면역 세포를 형질감염시켜 획득된 제품을 의미한다. PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28 또는 PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28은 PSCA-28BBZ-G4H-28TM 또는 PSCA-28BBZ-7H-28TM 및 SIRPγ-28과 융합 단백질 SIRPγ-28을 하나의 벡터에 공동발현시켜 면역 세포를 형질감염시켜 획득된 제품을 의미한다.
본 발명의 실시예에서 인산칼슘법에 의한 렌티바이러스의 패키징 방법은 구체적으로 다음과 같다. 10% FBS(w/v) 함유 DMEM 배지로 293T 세포를 바람직한 상태로 배양하고, 패키징 플라스미드(RRE:REV:2G)와 발현 플라스미드를 일정한 비율로 1.5의 원심분리 튜브에 첨가한 다음, CaCl2 및 2×HBS를 첨가하며, 골고루 혼합하고 실온에서 정치한 다음 처리된 293T 세포 배양액에 첨가하며, 3 ~ 5 h 후 다시 10% FBS가 포함된 10 mL의 DMEM 배지로 교체하고, 48 h 또는 72 h 후 세포 상층액을 수집하여 바이러스를 정제한다.
본 발명의 실시예에서, 항체는 Protein-L-PE로, Protein-L은 항체 경쇄를 인식할 수 있고, CAR 항원 인식 영역의 ScFv 서열의 경쇄는 Protein-L에 의해 인식될 수 있으므로, Protein-L을 이용하여 CAR 양성율 및 CAR 발현 강도를 검출할 수 있다. SIRPγ-28 후에는 GFP 태그가 있고, GFP 양성율로 발현 상황을 결정한다.
본 발명의 실시예에서, 표적 세포에 대한 상이한 CAR-T의 사멸 능력의 검출 방법은 다음과 같다. ACEA xCELLigence RTCA MP 기기를 이용하여 수행하고, 실험 단계는 기기의 설명서에 따라 수행한다. ACEA xCELLigence RTCA MP 원리는 웰 바닥에 부착된 종양 세포에 대해 저항 지수를 데이터로 15분마다 기록하고, 저항 지수를 통해 부착된 표적 세포의 증식 또는 사멸 상황을 판단한다. 저항 지수를 이용한 분석 결과 공식은 CAR-T 세포 사멸율=기준선 저항 지수-실시간 저항 지수이다.
본 발명의 실시예에서, IFN-γ 검출은 BD IFN-γ 키트를 사용하고 검출하고, 실험 단계는 제품 설명서에 따라 수행하며; IL-2 검출은 inritrogen IL-2 키트를 사용하여 검출하고, 실험 단계는 제품 설명서에 따라 수행하며; TNF-α 검출은 Biolegend 키트를 사용하여 검출하고, 실험 단계는 제품 설명서에 따라 수행한다.
본 발명의 실시예에서, 저산소 모델의 구축 완료 여부의 검증 방법은 다음과 같다. 재조합 플라스미드 바이러스를 이용하여 활성화된 PBMC를 감염시켜 시험관내 저산소 세포 모델을 구축하고, 12 ~ 18 h 동안 배양한 후 배지를 교체하며; CoCl2를 이용하여 저산소 환경을 유도하고, N일까지 배양한 다음 CAR 구조 상의 경쇄 항체를 검출하여 CAR 발현 상황을 검출한다.
본 발명의 실시예에서, 체내 검증에 사용된 마우스는 NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicCrl이고, NOG 마우스라고 약칭하며, 이롭 실험동물연구소(CIEA)의 Mamoru Ito에 의해 사육되고, 국제적으로 CAR-T 체내 관련 종양 형성 실험에 가장 많이 사용되는 품종이다.
본 발명의 실시예에서, 체내 저산소 모델의 검증 방법은 다음과 같다. 6 ~ 8주령의 암컷 NOG 마우스를 선택하고, 귀에 번호를 표시한 후 마우스의 등에 1×10^6/cells의 표적 세포를 피하 주사하며, 종양 형성 12일차에 마우스의 종양 부피를 측정한다.
제1 부분
실시예 1 플라스미드 구축
도 1에 도시된 바와 같은 CAR 패턴에 기반하여, SIRPγ 및 CD47 전장 플라스미드, pL-CAG-2AGFP, pL-CAG-PD1-CD28-2ACherry, pL-CAG-PD1-BB-2Acherry를 주형으로 하고, 도 2에 도시된 바와 같은 CAR 구조 및 대응되는 단일 표적 CAR 구조를 구축하였다. 구축된 벡터: CEAZ-PD1-28, CEAZ-PD1-BB, CEAZ-SIRPγ-BB, CEAZ-SIRPγ-28, CEABBZ-P2A-SIRPγ-28, CEABBZ-P2A-SIRPγ-BB, BCMA-BBZ-P2A-SIRPγ-28 및 단일 표적 CAR: CEAZ, PD1-28, PD1-BB, SIRPγ-28TM-28, SIRPγ-8TM-BB. 절단 및 시퀀싱 비교에 의한 검증 후, 결과는 도 3에 도시된 바와 같고, 재조합 플라스미드의 절단 동정은 다음과 같다. 1-3:pL-CAG-CEAZ-PD1-28 플라스미드, 순서: 원래 플라스미드, CEAZ(1371bp), PD1-28(783bp); 4-6:pL-CAG-CEAZ-PD1-BB 플라스미드, 순서: 원래 플라스미드, CEAZ(1371bp), PD1-BB(798bp); 7-9:pL-CAG-CEAZ-SIRPγ-28 플라스미드, 순서: 원래 플라스미드, CEAZ(1371bp), SIRPγ-28(1374bp); 10-12:pL-CAG-CEAZ-SIRPγ-BB 플라스미드, 순서: 원래 플라스미드, CEAZ(1371bp), SIRPγ-BB(1368bp); M1:DL5000DNA 분자량 표준; M2:DL15000DNA 분자량 표준; 13-15:pL-CAG-SIRPγ-28-2AGFP 플라스미드, 순서: 원래 플라스미드, SIRPγ-28(1292bp), 2AGFP(785bp); 16-18:pL-CAG-SIRPγ-BB-2AGFP 플라스미드, 순서: 원래 플라스미드, SIRPγ-BB(1286bp), 2AGFP(785bp)19-20:pL-CAG-CD47 플라스미드, 순서: CD47(974bp), 원래 플라스미드; M3: DL5000DNA 분자량 표준; 구축 성공.
실시예 2 표적 세포 구축
인산칼슘법을 이용하여 CEA, PD-L1, CD47 항원의 바이러스를 제조하고, CHO 세포를 각각 감염시켜 CHO-CEA 세포, CHO-CEA-PD-L1 세포주 및 CHO-CEA-CD47 세포주를 구축하였다. 신호 조절 단백질 α(SIRPγ)는 CD47의 리간드 중 하나로, CD47에 결합할 수 있으므로, CD47 양성 표적 세포로 CEAZ-SIRPγ-BB, CEAZ-SIRPγ-28, SIRPγ, SIRPγ-28, SIRPγ-BB를 평가할 수 있다.
3개의 세포주는 10번의 계대 배양 후 양성율을 검출하고, 결과는 도 4에 도시된 바와 같으며, CHO-CEA의 양성율은 97.1%,이고, CHO-CEA-CD47의 이중 양성율은 97.6%이며, CHO-CEA-PD-L1의 이중 양성율은 87%이고, 실험 요구사항에 부합되므로, 세포주가 성공적으로 구축되었음을 나타내며, 표적 세포로 후속적인 CAR-T 약효 평가에 사용될 수 있다.
실시예 3 렌티바이러스 제조 및 T 림프구 감염
인산칼슘법으로 렌티바이러스를 패키징하여, 실시예 1의 5개의 단일 발현 CAR(CEAZ, PD1-28, PD1-BB, SIRPγ-28, SIRPγ-BB) 및 6개의 신규 면역 억제 내성 CAR(CEAZ-PD1-28, CEAZ-PD1-BB, CEAZ-SIRPγ-28, CEAZ-SIRPγ-BB, CEABBZ-SIRPγ-28, CEABBZ-SIRPγ-BB) 바이러스 입자를 획득하였다.
구배 원심분리법으로 림프구를 분리하고; 원심분리 후 두 번째 백색 림프구층을 취하여 생리식염수로 세척하며, 10% FBS 함유 RPMI 1640 완전 배지를 첨가하고 배양하여, 인간 PBMC 세포를 획득하였다. 획득된 PBMC 세포를 항 CD3, CD28 단클론 항체로 24 h 동안 활성화시킨 다음, 일정한 감염다중도(MOI)에 따라 활성화된 PBMC를 감염시키고, 바이러스 감염 12일차에 CAR-T의 양성율을 검출하며, 검출 방법은 유세포 분석이고, 항체는 Protein-L-PE이며, Protein-L은 항체 경쇄를 인식할 수 있고, CAR 항원 인식 영역의 ScFv 서열의 경쇄는 Protein-L에 의해 인식될 수 있으므로, Protein-L을 이용하여 CAR 양성율 및 CAR 발현 강도를 검출할 수 있다.
결과는 도 5a에 도시된 바와 같고, 면역 억제 파괴 융합 단백질은 T 세포 표면에서 성공적으로 발현될 수 있으며, 도 5b에 도시된 바와 같이 신규 면역 억제 내성 CAR은 성공적으로 발현되었다.
실시예 4 신규 면역 억제 내성 CAR-T의 시험관내 기능 검증
면역 억제 파괴 융합 단백질을 발현하지 않은 Control T 세포를 대조군으로 사용하여, 면역 억제 파괴 융합 단백질 SIRPγ-28TM-28, SIRPγ-8TM-BB의 기능을 검증하였다. 표적 세포는 CD47을 발현하는 CHO 세포주이다. 결과는 도 6a에 도시된 바와 같고, SIRPγ-28TM-28 및 SIRPγ-8TM-BB 융합 단백질은 CD47 양성 표적 세포에 대해 모두 사멸 작용이 있다.
CEAZ군을 양성 대조군으로 사용하고, Control-T군을 음성 대조군으로 사용하며, CEAZ-PD1-28, CEAZ-PD1-BB, CEAZ-SIRPγ-28, CEAZ-SIRPγ-BB군을 실험군으로 설정하고, CHO-CEA-CD47 및 CHO-CEA-PD-L1을 표적 세포로 하여, 신규 면역 억제 내성 CAR-T의 시험관내 유효성을 검증하였다. 결과는 도 6b 및 하기 표 2에 나타낸 바와 같고, CEAZ-PD1-28 및 CEAZ-SIRPγ-28군의 세포 사멸율은 CEAZ군보다 현저히 높으며, CEAZ-PD1-BB 및 CEAZ-SIRPγ-BB군의 표적 세포의 사멸은 CEAZ군에 비해 유의하게 향상되지 않았다. 또한, CEAZ-PD1-28, CEAZ-PD1-BB군이 CHO-CEA-CD47과 공동 배양되는 경우 및 CEAZ-SIRPγ-28, CEAZ-SIRPγ-BB군이 CHO-CEA-PD-L1과 공동 배양되는 경우, 사멸 효율은 CEAZ군에 비해 모두 유의한 차이가 없고, 이는 신규 면역 억제 내성 CAR-T군이 사멸 특이성을 가지며, CEAZ-PD1-28 및 CEAZ-SIRPγ-28이 표적 세포에 대해 현저한 사멸 효과가 있음을 나타낸다.
(표 2)
Figure pct00002
K562-BCMA를 표적 세포로 하고, Control-T군을 음성 대조군으로 하여, BCMA-BBZ-P2A-SIRPγ-28의 기능을 검증하였으며, 결과는 BCMA-BBZ-P2A-SIRPγ-28이 우수한 사멸 기능을 나타낼 수 있음을 보여준다.
실시예 5 종양 억제 환경에 대한 신규 면역 억제 내성 CAR-T의 파괴 검증
CAR-T 세포는 종양 조직에 침투된 후 종종 종양 면역 억제의 환경 영향을 받고, PD1, LAG-3, Tim-3 약독화 분자를 고발현하여, 종양 세포를 사멸하는 효과적인 기능이 약화되며, CART 세포의 자가사멸이 증가된다. 신규 면역 억제 내성 CAR-T가 종양 억제 미세환경 신호를 파괴할 수 있는지 여부를 검증하기 위해, CEAZ, CEA-28Z, CEA-BBZ, CEAZ-PD1-28, CEAZ-PD1-BB, CEAZ-SIRPγ-28, CEAZ-SIRPγ-BB 및 Control-T군의 CAR-T 세포를 Day 7까지 배양하였을 때 CAR-T 세포와 DLD-1-CEA-Luc-GFP 세포를 12웰 세포 배양 플레이트에서 공동 배양하고, 48 h 후 CAR-T 세포를 수집하며, 항 인간 CD3, PL, PD1, LAG-3, Tim-3 유세포 분석 항체를 표지한 후 유세포 분석을 수행하고, 검출 결과를 분석하여 이펙터 능력을 평가하였다. CEAZ-PD1-28 및 CEAZ-PD1-BB군에서 PD1을 외인성으로 발현하기 때문에, 이 두 군의 PD1 양성율은 CAR-T 세포의 감손 정도를 평가하는 데 사용되지 않는다. 감손 분자의 검출 결과는 도 7 및 표 3에 나타낸 바와 같고, CD3+PL+에서 CEAZ-SIRPγ-28의 PD1, LAG-3, Tim-3의 발현 정도는 CEAZ군보다 낮으며, 이는 항원 자극 후 CEAZ-SIRPγ-28의 감손 정도가 비교적 낮음을 나타낸다.
(표 3)
Figure pct00003
아울러, BCMA 항원 자극 후 BCMA-BBZ-P2A-SIRPγ-28도 비교적 낮은 감손 분자 발현을 나타냈다.
실시예 6 신규 면역 억제 내성 CAR-T의 체내 기능 검증
체내 검증에 사용된 마우스는 NCG 마우스이다. 30마리의 NCG 마우스를 선택하고, 종양 보유를 위해 DLD-1-CEA-Luc-GFP(CEA, PD-L1, CD47 삼중 양성 발현, 도 8a 도시된 바와 같음)를 주입하였다. 종양이 녹두 크기로 자라 측정 가능할 때 종양 크기를 측정하고, 실험 과정에서 실험군 마우스는 무기력해져 죽어가며, 반신 또는 전신 마비이고, 체중이 20% 감소(실험 시작 전과 비교)되며, 종양 부피◎1500 mm3일때 실험을 종료하였다.
종양 보유 후 Day 5에 마우스의 종양 형광값을 측정하고, 생체 이미징 형광값으로 랜덤으로 그룹화하며, 각 군의 마우스의 체중 및 형광값에 유의한 차이가 없는지 확인하고, 평균 체중을 계산하였다. Day 6에 CAR-T 세포를 재주입하고, 부피는 100 μL(유효 CAR-T 세포수 3Х106 포함)이며, 동일한 총 세포수를 투여한 형질감염되지 않은 T 세포를 대조군으로 사용하였다. NCG 마우스의 종양 부피 측정 데이터로 종양 부피 증가 곡선을 플롯하고, Day 27 ~ 30에 CEAZ-SIRPγ-28이 종양에 대해 유의한 억제 효과가 있음을 발견하였으며, 결과는 도 8b에 도시된 바와 같다.
추가적으로, 2세대 CAR과 융합 단백질이 결합하여 설계된 면역 억제성 CAR, 즉 CEABBZ-P2A-SIRPγ-28 구조의 체내 유효성을 검증하였고, NCG 마우스에도 DLD-1-CEA-Luc-GFP 세포를 주사하여 종양을 보유하며, 종양 보유 13일 후 CAR-T 세포를 재주입하고, 총 세포수는 8Х106이다. 결과는 도 9에 도시된 바와 같고, 본 발명의 면역 억제성 CAR-T(CEABBZ-P2A-SIRPγ-28)는 체내에서 기능을 잘 발휘할 수 있으며, 효과는 대조군 2세대 CAR 구조의 CEABBZ보다 유의하게 우수하다.
제2 부분 CEA 표적화 CAR 구조(여기서 CAR1 아미노산 서열은 27임)의 실험 부분
실시예 7 CEA 표적화 플라스미드 구축
(1) 실험군 플라스미드 구축
미니프로모터 miniCMV에 의해 저산소 조절 가능 프로모터 서열 5HRE-CMVmini promoter가 합성되고, 이의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1로 표시된다. 그 다음 5HRE-CMVmini promoter, 렌티바이러스 발현 벡터, CEAScFv-CD8 힌지 영역-CD8 막횡단 영역-CD137-CD3
Figure pct00004
-P2A-SIRPγ-CD28(5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28)의 CAR 구조를 이중 절단으로 각각 절단하고 단편을 회수하며, 유전자 단편을 연결 및 형질전환하고 단클론을 선택하여, CEA 표적화 CAR-T 세포 제제의 SIRPγ 융합 단백질 함유 재조합 플라스미드 PBKL1-5H1P-CEA-OPRE(SIRPγ 융합 단백질)를 구축하며, 이 단계에서 CAR 및 융합 단백질을 하나의 벡터에 공동 발현시켜 면역 세포를 형질감염시키거나 또는 CAR 및 융합 단백질을 공동으로 하나의 벡터에 각각 발현시켜 면역 세포를 형질감염시키는 방법을 사용하여 융합 단백질을 포함하는 CAR 구조를 획득하고, 여기서 CAR 및 융합 단백질을 공동으로 하나의 벡터에 각각 발현시켜 면역 세포를 형질감염시켜 획득된 제품을 "5HCEA-BBZ+SIRPγ-28"로 약칭한다.
(2) 대조군 플라스미드 구축
실시예 1에서 (1)의 방법에 따라 5HCEA-BBZ-8H-8을 구축하였다.
실시예 8 CEA 표적화 플라스미드의 시험관내 기능 모델 검증
5HCEA-BBZ-8H-8, 5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28, SIRPγ-28에 각각 CoCl2를 추가하여 실험군으로 설정하여 저산소 모델을 검증하고, 결과는 도 10 및 도 11에 도시된 바와 같으며, 5HCEA-BBZ-8H-8, 5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28, SIRPγ-28의 평균 형광 강도 및 양성율은 유사하고, 도 12에 도시된 바와 같이 5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28의 증폭 배수는 더 우수하다.
실시예 9 CEA 표적화 CAR-T의 유효성 검증
(1) 표적 세포 DLDL1-CEA의 사멸 효율
CEA 양성의 DLD1-CEA 및 DLD1-CEA(CD47-) 세포를 각각 표적 세포로 하였다. 이펙터 세포(일반적인 CAR-T 세포 및 저산소 조절 가능 프로모터 CAR 발현을 포함하는 CAR-T 세포)의 저산소 처리 후, 1:1의 이펙터-표적 비율에 따라 표적 세포에 도포하여, 표적 세포에 대한 상이한 CAR-T의 사멸 능력을 검출하였다.
CAR-T를 첨가한 24 h 후, 표적 세포 DLDL1-CEA에 대한 각 군의 CAR-T의 사멸 효율 결과는 도 13 및 하기 표 4에 나타낸 바와 같고, 5HCEA-BBZ-8H-8, 5HCEA-BBZ+SIRPγ-28 및 5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28은 강한 사멸 기능을 가지며, SIRPγ-28군도 사멸 기능을 갖는다.
(표 4)
Figure pct00005
(2)IFN-γ, IL-2, TNF-α의 분비 검출
(1)에 이어서, 사멸 24시간 후 세포 상층액을 수집하고, CAR-T 세포가 표적 세포에 의해 자극된 후 IFN-γ, IL-2, TNF-α의 분비 능력을 검출하였다. 수집된 상층액은 키트를 사용하여 ELISA 방법으로 IFN-γ 및 IL-2의 분비 상황을 검출하였다.
결과는 도 14, 도 15, 도 16에 도시된 바와 같고, 표적 세포가 DLD1-CEA인 경우, 5HCEA-BBZ-8H-8은 IFN-γ, IL-2, TNF-α의 분비가 적으며, 5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28은 IFN-γ, IL-2, TNF-α의 분비가 5HCEA-BBZ-8H-8군보다 훨씬 높고, 표적 세포는 DLD1-CEA(CD47-) 세포이며, IFN-γ, IL-2, TNF-α는 낮거나 검출선에 도달하지 못한다. 본 발명의 5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28은 CAR-T의 증식 및 종양 사멸 관련 인자의 분비에 더 도움이 되고, 이는 실제로 CAR-T의 유효성을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 8 SIRPγ 융합 단백질을 포함하는 플라스미드의 체내 기능 검증
체내 검증에 사용된 종양 형성 표적 세포는 DLD1-CEA-Luc-GFP 세포를 선택하여, 인간 CEA+고형 종양 보유 모델을 구축하였다.
종양 부피에 따라 랜덤으로 Control T(CT)군, 5HCEA-BBZ-8H-8, 5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28로 나누고, 대조군은 Control T군이다. 종양 형성 12일차에 상이한 군의 마우스에 대응되는 CAR-T 세포 1Х10^7 Copies/마리를 꼬리 정맥 주사하고; Control T군은 812일차에 동일한 총 수의 T 림프구를 재주입하였다. 3일마다 각 군의 마우스의 종양 부피를 측정하고, 실험 결과는 도 17 및 도 18에 도시된 바와 같으며, 볼 수 있다시피 5HCEA-BBZ-8H-8은 5HCEA-BBZ-P2A-SIRPγ-28군에 비해 체내 유효성이 현저히 향상되고, 또한 5HCEA-BBZ-8H-8군은 종양에 대해 현저한 제거 작용을 갖는다.
제3 부분 CD19 표적의 CAR 구조의 실험 부분
실시예 9 CD19 표적화 플라스미드 구축
SIRPγ 및 CD47 전장 플라스미드, pL-CAG-2AGFP, pL-CAG-PD1-CD28-2ACherry, pL-CAG-PD1-BB-2Acherry를 주형으로 하고, CD19 표적 CAR 구조를 구축하였다. 구축된 벡터: SIRPγ-28, 5HCD19-BBZ, 5HCD19-BBZ-SIRPγ-28. 시퀀싱 비교에 의한 검증 후, 성공적으로 구축되었다.
실시예 10 렌티바이러스의 제조 및 T 림프구의 감염
인산칼슘법으로 렌티바이러스를 패키징하여, 실시예 1의 3개의 바이러스 입자(SIRPγ-28, 5HCD19-BBZ, 5HCD19-BBZ-P2A-SIRPγ-28)를 획득하였다.
구배 원심분리법으로 림프구를 분리하고, 원심분리 후 두 번째 백색 림프구층을 취하여 생리식염수로 세척하며, 10% FBS 함유 RPMI 1640 완전 배지를 첨가하고 배양하여, 인간 PBMC 세포를 획득하였다. 획득된 PBMC 세포를 항 CD3, CD28 단클론 항체로 24 h 동안 활성화시킨 다음, 일정한 감염다중도(MOI)에 따라 활성화된 PBMC를 감염시키고, 바이러스 감염 8일차에 유세포 분석으로 CAR-T의 양성율을 검출하며, 결과는 도 19 및 하기 표 5에 나타낸 바와 같다.
(표 5)
Figure pct00006
실시예 11 CD19 표적화의 시험관내 약력학 평가
Control T를 대조군으로 하고, 실험군은 SIRPγ-28군, 5HCD19-BBZ군, 5HCD19-BBZ-P2A-SIRPγ-28군으로 설정하며, Nam6-Luc-GFP(CD19 양성), K562-Luc-GFP(CD19 양성)를 표적 세포로 하고, 시험관내 사멸 및 시험관내 인자 분비를 통해 시험관내 유효성을 검증하였다. 결과는 도 20 및 하기 표 6에 나타낸 바와 같고, 하나의 공동 발현된 벡터를 사용하여 면역 세포를 형질감염시켜 얻은 제품(5HCD19-BBZ-P2A-SIRPγ-28)과 2개의 개별적으로 발현된 벡터를 사용하여 면역 세포를 공동 형질감염시켜 얻은 제품(SIRPγ-28+5HCD19-BBZ)의 시험관내 사멸은 SIRPγ-28 및 5HCD19-BBZ군보다 현저히 높고, 음성 세포의 사멸은 없다.
도 21 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 하나의 공동 발현된 벡터를 사용하여 면역 세포를 형질감염시켜 얻은 제품(5HCD19-BBZ-P2A-SIRPγ-28)과 2개의 개별적으로 발현된 벡터를 사용하여 면역 세포를 공동 형질감염시켜 얻은 제품(SIRPγ-28+5HCD19-BBZ)의 인자 분비는 SIRPγ-28군 및 5HCD19-BBZ군보다 현저히 높다.
(표 6)
Figure pct00007
(표 7)
Figure pct00008
실시예 12 CD19 표적화의 체내 약력학 평가
NCG 마우스(암컷, 6주령)를 선택하고, 1Х106 Cells/마리의 용량으로 Nalm6-Luc-GFP 세포를 피하 주사(s.c.)하여 체내 종양 보유 모델을 구축하며, 종양 보유 후 8d에 1Х107 CAR-T Cells/마리의 용량으로 상이한 군(Control T, 5HCD19-BBZ, 5HCD19-BBZ-P2A-SIRPγ-28)에 CAR-T를 꼬리 정맥 주사(i.v.)하였다. 생체 이미징을 통해 체내의 종양 성장 상황을 관찰하고, 체내에서 림프종에 대한 상이한 CAR-T의 치료 효과를 평가하였다. 결과는 도 22 및 도 23에 도시된 바와 같고, Control T군 및 5HCD19-BBZ군에 비해 5HCD19-BBZ-P2A-SIRPγ-28의 체내 항종양 효과는 유의하며, 종양을 유의하게 제거할 수 있다.
제4 부분 PSCA 표적의 CAR 구조의 실험 부분
실시예 13 PSCA 표적화 플라스미드의 구축 및 T 세포 감염
(1) 플라스미드 구축
렌티바이러스 발현 벡터, PSCA ScFv-G4H 힌지 영역-CD28 막횡단 영역-CD28-CD137-CD3
Figure pct00009
-P2A-SIRPγ-28(PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28)의 CAR 구조를 이중 절단으로 각각 절단하고 단편을 회수하며, 유전자 단편을 연결 및 형질전환하고 단클론을 선택하였다.
렌티바이러스 발현 벡터, PSCA ScFv-7H 힌지 영역-CD28 막횡단 영역-CD28-CD137-CD3
Figure pct00010
-P2A-SIRPγ-28(PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28)의 CAR 구조를 이중 절단으로 각각 절단하고 단편을 회수하며, 유전자 단편을 연결 및 형질전환하고 단클론을 선택하였다.
(2) T 세포 감염
획득된 플라스미드로 T 세포를 감염시켜, CAR-T 세포를 획득하였다.
실시예 14 PSCA 표적화의 IFN-γ 인자 분비 상황
Control T를 대조군으로 하고, 실험군은 PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28, PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28, PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28, PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28, PSCA-28BBZ-G4H-28TM, PSCA-28BBZ-7H-28TM으로 각각 설정하며, RT4-Luc-GFP(PSCA 양성)를 표적 세포로 하고, 시험관내 인자 분비를 통해 시험관내 유효성을 검증하였다. 결과는 표 8 ~ 표 13 및 도 24 ~ 도 29에 나타낸 바와 같다. 하나의 공동 발현된 벡터를 사용하여 면역 세포를 형질감염시켜 얻은 제품 PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28 또는 PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28과 2개의 개별적으로 발현된 벡터를 사용하여 면역 세포를 공동 형질감염시켜 얻은 제품 PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28 또는 PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28의 IFN-γ 인자 분비는 대조군 및 PSCA-28BBZ-G4H-28TM군 또는 PSCA-28BBZ-7H-28TM군보다 현저히 높고, 음성 세포의 사멸은 없다.
(표 8)
Figure pct00011
(표 9)
Figure pct00012
(표 10)
Figure pct00013
(표 11)
Figure pct00014
(표 12)
Figure pct00015
(표 13)
Figure pct00016
실시예 14 PSCA 표적화의 세포 사멸 상황
실험군은 PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28, PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28, PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28, PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28, PSCA-28BBZ-G4H-28TM, PSCA-28BBZ-7H-28TM으로 각각 설정하고, RT4-Luc-GFP(PSCA 양성), PC-3-Luc-GFP(PSCA 음성)를 각각 표적 세포로 하며, 결과는 표 14 ~ 표 19 및 도 30 ~ 도 35에 나타낸 바와 같다. 하나의 공동 발현된 벡터를 사용하여 면역 세포를 형질감염시켜 얻은 제품 PSCA-28BBZ-G4H-28TM-P2A-SIRPγ-28 또는 PSCA-28BBZ-7H-28TM-P2A-SIRPγ-28과 2개의 개별적으로 발현된 벡터를 사용하여 면역 세포를 공동 형질감염시켜 얻은 제품 PSCA-28BBZ-G4H-28TM+SIRPγ-28 또는 PSCA-28BBZ-7H-28TM+SIRPγ-28의 시험관내 사멸은 대조군 및 PSCA-28BBZ-G4H-28TM군 또는 PSCA-28BBZ-7H-28TM군보다 현저히 높고, 음성 세포의 사멸은 없다.
(표 14)
Figure pct00017
(표 15)
Figure pct00018
(표 16)
Figure pct00019
(표 17)
Figure pct00020
(표 18)
Figure pct00021
(표 19)
Figure pct00022
마지막으로 설명해야 할 것은, 상기 실시예는 본 발명의 기술적 해결수단을 한정하기 위한 것이 아닌 설명하기 위한 것일 뿐이며, 바람직한 실시예를 참조하여 본 발명을 상세하게 설명하였지만, 당업자는 본 발명의 기술적 해결수단에 대해 수정 또는 동등한 대체를 이룰 수 있으며, 본 발명의 기술적 해결수단의 취지 및 범위를 벗어나지 않는 전제하에 이는 모두 본 발명의 특허청구범위에 속해야 함을 이해해야 한다.
Sequence listing <110> CHONGQING PRECISION BIOTECH COMPANY LIMITED.,CHONGQING PRECISION BIOLOGICAL INDUSTRIAL TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE CO., LTD. <120> FUSION PROTEIN FOR REVERSING TUMOR MICROENVIRONMENT AND USE THEREOF <160> 38 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 362 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 1 Met Pro Val Pro Ala Ser Trp Pro His Pro Pro Gly Pro Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Thr Leu Leu Leu Gly Leu Thr Glu Val Ala Gly Glu Glu Glu Leu 20 25 30 Gln Met Ile Gln Pro Glu Lys Leu Leu Leu Val Thr Val Gly Lys Thr 35 40 45 Ala Thr Leu His Cys Thr Val Thr Ser Leu Leu Pro Val Gly Pro Val 50 55 60 Leu Trp Phe Arg Gly Val Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr Asn Gln 65 70 75 80 Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu Thr Lys 85 90 95 Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Ser Ile Thr Pro Ala 100 105 110 Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser Pro Glu 115 120 125 Asn Val Glu Phe Lys Ser Gly Pro Gly Thr Glu Met Ala Leu Gly Ala 130 135 140 Lys 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gggctccaac aggtcctctt 120 gtcgagccac agtgcatacg tgggctccaa caggtcctct tgtcgagcca cagtgcatac 180 gtgggctcca acaggtcctc ttgtcgagat ctggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 240 taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcactaggct agcatggctc tgccagtgac 300 agctctgctg ctgcctctgg ctctgctgct gcacgcagct agacccgaca tccagatgac 360 ccagagccct tcttctctga gcgccagcgt gggagacaga gtgaccatca cttgcagggc 420 cagccaggac atcagcaagt acctgaattg gtaccagcag aagccaggca aggcccctag 480 actgctgatc taccacacaa gcagactgca cagcggagtg cctagcagat tcagcggcag 540 cggaagcgga accgactaca ccctgaccat cagcagcctg cagccagagg acttcgccac 600 ctactactgc cagcagggca acacactgcc ttacaccttc ggcggaggca caagactgga 660 gatcaagggc agcacaagcg gaagcggcaa accaggaagc ggagaaggaa gcaccaaggg 720 acaggtgcag ctgcaggaaa gcggaccagg actggtgaag ccttctcaga ccctgagcct 780 gacttgcacc gtgtcaggag tgtccctgcc agattacggc gtgtcttgga tcagacagcc 840 cccaggaaag gccctggagt ggctgggagt gatttgggga agcgagacca cctactacaa 900 cagcagcctg aagacccggc tgaccatcag caaggacaac agcaagaacc 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Artificial Sequence <400> 34 gacatccagg atatccagct gacacagtcc cctagctccc tgagcgcctc cgtgggcgac 60 agggtgacca tcacatgcag cgcctctagc tccgtgagat tcatccactg gtaccagcag 120 aagcccggca aggcccctaa gaggctgatc tatgatacct ctaagctggc cagcggagtg 180 ccctcccgct tctctggcag cggctccggc accgacttta ccctgacaat ctctagcctg 240 cagccagagg attttgccac atactattgc cagcagtggt cctctagccc cttcaccttt 300 ggccagggca caaaggtgga gatcaaggga tctaccagcg gatccggcaa gcctggatct 360 ggagagggca gcacaaaggg ctccgaggtg cagctggtgg agtccggagg aggactggtg 420 cagccaggag gatctctgag gctgagctgt gcagcctccg gcttcaacat caaggactac 480 tatatccact gggtgagaca ggcacctggc aagggactgg agtgggtggc atggatcgac 540 cctgagaatg gcgataccga gttcgtgcca aagtttcagg gcagggccac aatctctgcc 600 gacaccagca agaacacagc ctacctgcag atgaatagcc tgcgcgccga ggataccgcc 660 gtgtactatt gtaagacagg aggattttgg ggacagggca ccctggtgac agtgtcctct 720 ctcgaggcac cacctcgggc cagcgccctg cctgcaccac ccaccggctc cgccctgcca 780 gaccctcaga cagcatctgc cctgccagat cctccagcag caagcgccct gcccgaattc 840 ttctgggtgc tggtcgtggt gggtggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtgacagtg 900 gccttcatca tcttttgggt gaggagcaag cggagcagag gcggccacag cgactacatg 960 aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 1020 cgcgacttcg cagcctatcg ctccgttaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 1080 aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 1140 tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 1200 gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1260 gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1320 agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1380 gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1440 taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1500 ccccctcgc 1509 <210> 35 <211> 2088 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 35 gacatccagg atatccagct gacacagtcc cctagctccc tgagcgcctc cgtgggcgac 60 agggtgacca tcacatgcag cgcctctagc tccgtgagat tcatccactg 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cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1860 aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1920 ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1980 aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 2040 accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgc 2088 <210> 36 <211> 804 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 36 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggacatcc agatgaccca gagcccaagc agcctgagcg ccagcgtggg tgacagagtg 120 accatcacct gtagtaccag ttcgagtgta agttacatgc actggtacca gcagaagcca 180 ggtaaggctc caaggctgct gatctacagc acatccaacc tggcttctgg tgtgccaagc 240 agattcagcg gtagcggtag cggtaccgac ttcaccttca ccatcagcag cctccagcca 300 gaggacatcg ccacctacta ctgccatcag tggagtagtt atcccacgtt cggccaaggg 360 accaaggtgg aaatcaaagg atccacttcc ggttcaggaa agcccgggag tggtgaaggt 420 agcactaaag gccaggtcca gctgcaggag agcggtccag gtcttgtgag acctagccag 480 accctgagcc tgacctgcac cgtgtctggc 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aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 540 gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 600 taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 660 ccccctcgct aa 672 <210> 38 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 38 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40

Claims (32)

  1. 종양 미세환경의 역전을 위한 융합 단백질로서,
    상기 융합 단백질은 SIRPγ 융합 단백질이고, 상기 SIRPγ 융합 단백질 구조는 세포외 도메인, 막횡단 구조 및 세포내 신호 전달 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    막횡단 구조는 인간 CD28 막횡단 영역 또는 인간 CD8 유래 막횡단 영역으로부터 유래되고, 바람직하게는 상기 세포내 신호 전달 영역은 CD28 또는 4-1BB로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 막횡단 구조의 아미노산 서열은 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되고; 바람직하게는, 상기 세포내 신호 전달 영역은 CD28로부터 유래되며, 서열은 서열번호 9 또는 서열번호 38로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 SIRPγ 융합 단백질의 구조는 SIRPγ-CD28TM-CD28 또는 SIRPγ-CD8TM-4-1BB인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 SIRPγ 세포외 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 1 또는 이의 기능적 변이체로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 SIRPγ 융합 단백질 SIRPγ-CD28TM-CD28의 아미노산 서열은 서열번호 2 또는 이의 기능적 변이체로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 SIRPγ 융합 단백질 SIRPγ-CD8TM-4-1BB의 아미노산 서열은 서열번호 3 또는 이의 기능적 변이체로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 SIRPγ 융합 단백질 SIRPγ-CD28TM-CD28의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 13으로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 SIRPγ 융합 단백질 SIRPγ-CD8TM-4-1BB의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 14로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하는 발현 벡터.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 발현 벡터는 렌티바이러스 발현 벡터, 레트로바이러스 발현 벡터, 아데노바이러스 발현 벡터, 아데노 관련 바이러스 발현 벡터, DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  12. 제10항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 면역 세포.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 면역 세포는 T 세포, T 세포 전구체 또는 NK 세포인 것을 특징으로 하는 면역 세포.
  14. 제13항에 있어서,
    종양 항원을 인식하는 키메라 항원 수용체를 갖는 구조를 포함하고, 상기 키메라 항원 수용체는 종양 항원을 인식하는 세포외 도메인, 힌지(hinge) 영역, 막횡단 영역 및 세포내 신호 전달 영역을 포함하며, 상기 종양 항원은 종양 표적 인식을 위한 항원 분자로 사용될 수 있는 PSCA, PSMA, CD19, BCMA, CD123, CD20, CD22, CEA, EGFR, EGFRVIII, GPC3, 5T4, CD33, Her2, GD2, CD70, CLL-1, Trop2, CD47, GPC3, CLND18.2, CD133, CS1, CD155, CD30, ROR1, MUC1, IL13RAα2 또는 메소텔린(mesothelin)을 포함하지만 이에 한정되지 않는 것을 특징으로 하는 면역 세포.
  15. 신규 종양 면역 억제 내성 CAR로서,
    상기 CAR은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 및 CAR1을 포함하고, 상기 CAR1은 종양 항원을 인식하는 세포외 도메인, 힌지 영역, 막횡단 영역 및 세포내 신호 전달 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 신규 종양 면역 억제 내성 CAR.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 폴리시스트론 구조를 통해 CAR1에 연결되고, 상기 폴리시스트론 구조는 자가 절단 폴리펩티드 또는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)이며, 상기 자가 절단 폴리 펩티드는 T2A, P2A, E2A 또는 F2A인 것을 특징으로 하는 신규 종양 면역 억제 내성 CAR.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 CAR의 구조는 ScFv-hinge-TM-CD3ζ-자가 절단 펩티드-SIRPγ 융합 단백질 또는 ScFv-hinge-TM-4-1BB-CD3ζ-자가 절단 펩티드-SIRPγ 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 신규 종양 면역 억제 내성 CAR.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 CAR의 구조는 ScFv-hinge-TM-CD3ζ-자가 절단 펩티드-SIRPγ-CD28TM-CD28 또는 ScFv-hinge-TM-4-1BB-CD3ζ-자가 절단 펩티드-SIRPγ-CD28TM-CD28인 것을 특징으로 하는 신규 종양 면역 억제 내성 CAR.
  19. 제15항에 있어서,
    CAR1 구조에서, hinge의 아미노산 서열은 서열번호 24 또는 이의 기능적 변이체로 표시되고, TM의 아미노산 서열은 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되며, CD3ζ의 아미노산 서열은 서열번호 11 또는 이의 기능적 변이체로 표시되고; 융합 단백질 구조에서, SIRPγ 세포외 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 1 또는 이의 기능적 변이체로 표시되며; 인간 CD28로부터 유래되는 막횡단 영역의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되고; 인간 CD28로부터 유래되는 세포내 신호 전달 영역의 아미노산 서열은 서열번호 9로 표시되는 것을 특징으로 하는 신규 종양 면역 억제 내성 CAR.
  20. 제17항 또는 제18항 또는 제19항에 있어서,
    상기 ScFv는 CD19, CD123, MOv-γ, PSMA, IL13Rα2, EGFRvIII, EGFR, EPCAM, GD2, MUC1, HER2, GPC3, CEA, Meso, CD133, NKG2D, CD138, LeY, k-Light, CD33, ROR1, BCMA, CD30, CD20, CD22, PSCA, CLL-1, CD70, CD47 중 하나 이상을 인식할 수 있는 것을 특징으로 하는 신규 종양 면역 억제 내성 CAR.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 ScFv의 아미노산 서열은 서열번호 25 또는 이의 기능적 변이체로 표시되는 것을 특징으로 하는 신규 종양 면역 억제 내성 CAR.
  22. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    상기 CAR1은,
    a) CAR1은 CEA 단일 사슬 항체, CD8 힌지 영역, CD8 막횡단 영역, CD137 및 CD3ξ 이중 자극 신호를 포함하고; 바람직하게는, 상기 CAR 구조 a의 아미노산 서열은 서열번호 26 또는 이의 기능적 변이체로 표시되는 것; 또는
    b) 상기 CAR1은 CD19 단일 사슬 항체, CD8 힌지 영역, CD8 막횡단 영역, CD137 및 CD3ξ 이중 자극 신호를 포함하고; 바람직하게는, 상기 CAR 구조 a의 아미노산 서열은 서열번호 27 또는 이의 기능적 변이체로 표시되는 것; 또는
    c) 상기 CAR1은 PSCA 단일 사슬 항체, 힌지 영역, CD28 막횡단 영역, CD28, CD137 및 CD3ξ 삼중 자극 신호를 포함하고; 상기 힌지 영역은 G4H 또는 7H이며; 바람직하게는, 상기 CAR 구조 a의 아미노산 서열은 서열번호 28 또는 이의 기능적 변이체로 표시되거나; 또는 서열번호 29 또는 이의 기능적 변이체로 표시되는 것 중 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 신규 종양 면역 억제 내성 CAR.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 a) 및 b)의 CAR1 구조에는 저산소 조절 가능 프로모터가 더 포함되고, 상기 저산소 조절 가능 프로모터의 핵산 서열은 서열번호 30으로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 신규 종양 면역 억제 내성 CAR.
  24. 핵산 서열로서,
    제21항 또는 제22항에 따른 신규 종양 면역 억제 내성 CAR을 코딩하고, 상기 핵산 서열은 서열번호 31 또는 서열번호 32 또는 서열번호 33 또는 서열번호 34 또는 서열번호 35로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열.
  25. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 신규 종양 면역 억제 내성 CAR을 포함하는 발현 벡터로서,
    상기 발현 벡터는 렌티바이러스 발현 벡터, 레트로바이러스 발현 벡터, 아데노바이러스 발현 벡터, 아데노 관련 바이러스 발현 벡터, DNA 벡터, RNA 벡터, 플라스미드 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  26. 제25항에 따른 발현 벡터를 포함하는 면역 세포.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 면역 세포는 T 세포, T 세포 전구체 또는 NK 세포인 것을 특징으로 하는 면역 세포.
  28. 제14항에 따른 면역 세포의 제조 방법으로서,
    상기 SIRPγ 융합 단백질을 포함하지 않는 CAR 구조와 상기 SIRPγ 융합 단백질을 하나의 벡터에 공동 발현시켜 면역 세포를 형질감염시키거나; 상기 SIRPγ 융합 단백질을 포함하지 않는 CAR 구조와 상기 SIRPγ 융합 단백질을 각각 2개의 벡터에 발현시켜 면역 세포를 형질감염시키는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  29. 약학적 조성물로서,
    상기 약학적 조성물은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또는 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 신규 종양 면역 억제 내성 CAR 또는 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 면역 세포 또는 제26항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 면역 세포 또는 제10항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터 또는 제25항에 따른 발현 벡터 또는 제24항에 따른 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 CAR 발현 활성을 향상시킬 수 있는 활성제 및/또는 치료제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  31. 종양 약물의 제조에서 제29항 또는 제30항에 따른 약학적 조성물의 응용.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 종양은 악성 종양으로, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 전립선암, 결직장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 폐암, 신장암, 간암, 뇌암 및 피부암을 포함하고, 상기 종양은 CD19, CD123, MOv-γ, PSMA, IL13Rα2, EGFRvIII, EGFR, EPCAM, GD2, MUC1, HER2, GPC3, CEA, Meso, CD133, NKG2D, CD138, LeY, k-Light, CD33, ROR1, BCMA, CD30, CD20, CD22, PSCA, CLL-1, CD70, CD47 중 하나 이상을 고발현하는 것을 특징으로 하는 응용.
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