BRPI0815543A2 - marcador de previsço para trtamento com inibidor de egfr - Google Patents

Abstract

MARCADOR DE PREVISçO PARA TRATAMENTO COM INIBIDOR DE EGFR. A presente invenção fornece um biomarcador que é capaz de prever o benefício clínico do tratamento com inibidor de EGFR em pacientes com câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MARCADOR DE PREVISÃO PARA TRATAMENTO COM INIBIDOR DE EGFR".

A presente invenção fornece um biomarcador que é capaz de prever o benefício clínico do tratamento com inibidor de EGFR em pacientes com câncer.

Um número de malignidades humanas está associado à expres- são aberrante ou à superexpressão do receptor do fator de crescimento epi- dérmico (EGFR). O EGF, fator de crescimento transformante-? (TGF-?) e um número de outros Iigantes se ligam ao EGFR, estimulando a autofosforilação do domínio de tirosina quinase intracelular do receptor. Uma variedade de vias intracelulares é subseqüentemente ativada e estes eventos a jusante resultam na proliferação de células tumorais in vitro. Foi postulado que a si- mulação de células tumorais através do EGFR pode ser importante tanto para o crescimento de tumor quanto para a sobrevivência de tumor in vivo. Dados clínicos iniciais com Tarceva®, um inibidor da EGFR tiro-

sina quinase, indicam que o composto é seguro e geralmente bem tolerado em doses que fornecem a concentração eficiente buscada (que é determi- nada por dados pré-clínicos). Os testes clínicos em fases I e Il em pacientes com doença avançada demonstraram que o Tarceva® possui atividade clíni- ca promissora em uma faixa de tumores epiteliais. Na verdade, foi mostrado que o Tarceva® é capaz de induzir remissões parciais duráveis em pacientes tratados anteriormente com câncer de cabeça e pescoço e NSCLC (Câncer pulmonar sem ser de células pequenas) de uma ordem similar à quimiotera- pia de segunda linha estabelecida, mas com o benefício adicional de um me- Ihor perfil de segurança que a quimioterapia e maior conveniência (compri- mido ao invés de administração intravenosa [i.v.]). Um teste controlado com placebo duplo cego aleatório completado recentemente (BR.21) mostrou que o agente Tarceva® isolado prolonga e aumenta significativamente a sobrevi- vência de pacientes com NSCLC para os quais a terapia padronizada para doença avançada falhou.

O Tarceva® (erlotinib) é uma molécula química pequena; é um inibidor da EGFR tirosina quinase (EGFR-TKI) seletivo potente ativo oral- mente.

O câncer pulmonar é a causa principal de morte relacionada ao câncer na América do Norte e na Europa. Nos Estados Unidos, o número de mortes secundárias ao câncer pulmonar excede as mortes totais combina- das decorrentes da segunda (cólon), da terceira (mama) e da quarta (prósta- ta) causas principais de mortes por câncer combinadas. Aproximadamente 75% até 80% de todos os cânceres pulmonares são NSCLC, com aproxima- damente 40% dos pacientes apresentado doença avançada local e/ou que não pode ser removida cirurgicamente. Este grupo inclui tipicamente aqueles com doença volumosa nos estágios IIIA e IIIB, excluindo efusões pleurais malignas.

A incidência bruta de câncer pulmonar na União Européia é de 52,5, a taxa de mortalidade de 48,7 casos/100000/ano. Entre os homens as taxas são de 79,3 e 78,3, entre as mulheres de 21,6 e 20,5, respectivamen- te. O NSCLC é responsável por 80% de todos os casos de câncer pulmonar. Aproximadamente 90% da mortalidade causada por câncer pulmonar entre os homens e 80% entre as mulheres, é atribuída ao fumo.

Nos EUA, de acordo com a American Câncer Society, durante 2004, havia aproximadamente 173.800 novos casos de câncer pulmonar (93.100 em homens e 80.700 em mulheres) e eram responsáveis por apro- ximadamente 13% de todos os cânceres novos. A maior parte dos pacientes morre como uma conseqüência de sua doença dentro de um período de dois anos do diagnóstico. Para muitos pacientes com NSCLC, o tratamento bem sucedido permanece evasivo. Os tumores avançados freqüentemente não são susceptíveis à cirurgia e também podem ser resistentes a doses tolerá- veis de radioterapia e quimioterapia. Em testes aleatórios as quimioterapias de combinação mais ativas atualmente atingiram taxas de resposta de apro- ximadamente 30% até 40% e uma taxa de sobrevivência de 1 ano entre 35% e 40%. Este é realmente um avanço em relação à taxa de sobrevivência em 1 ano de 10% observada com tratamento apenas de suporte.

Até recentemente as opções terapêuticas para pacientes reinci- dentes após a recaída eram limitadas a um melhor cuidado de suporte ou paliativo. Um teste recente que compara o docetaxel (Taxotere) com melhor cuidado de suporte mostrou que pacientes com NSCLC poderiam se benefi- ciar da quimioterapia de segunda linha após os regimes de primeira linha baseados em cisplatina terem falhado. Os pacientes de todas as idades e com condição de desempenho de ECOG de O, 1 ou 2 demonstraram maior sobrevivência com docetaxel, como aqueles que tinham sido refratários ao tratamento baseado em platina anterior. Os pacientes que não se beneficia- ram da terapia incluíam aqueles com perda de peso de 10%, altos níveis de Iactato desidrogenase, envolvimento de vários órgãos ou envolvimento do fígado. Adicionalmente, o benefício da monoterapia de docetaxel não se es- tendia além do ajuste de segunda linha. Os pacientes que receberam o do- cetaxel como tratamento de terceira linha ou além não exibiram prolonga- mento da sobrevivência. O docetaxel como único agente se tornou uma te- rapia de segunda linha padronizada para NSCLC. Recentemente outro teste em fase Ill aleatório na terapia de segunda linha de NSCLC comparou o pe- metrexed (Alimta®) com o docetaxel. O tratamento com pemetrexed resultou em uma eficácia clinicamente equivalente, mas com efeitos colaterais signifi- cativamente menores comparados com os do docetaxel.

É reconhecido há muito tempo que há uma necessidade de de- senvolver métodos de tratamento de câncer individualizados. Com o desen- volvimento de tratamentos para câncer direcionados, há um interesse parti- cular em metodologias que poderiam fornecer um perfil molecular do tumor alvo, (isto é, aquele que pode prever o benefício clínico). Já foi estabelecida uma prova de princípio para a obtenção do perfil de expressão gênica no câncer com a classificação molecular de tipos de tumores que não são evi- dentes com base nos testes morfológicos e imunohistoquímicos atuais. Duas entidades de doença separadas foram identificadas com prognósticos dife- rentes partindo da única classificação atual de Iinfoma de células B difusas utilizando a obtenção do perfil de expressão gênica. Portanto, é um objetivo da presente invenção fornecer biomar-

cadores de expressão que podem prever o benefício clínico do tratamento com inibidor de EGFR em pacientes com câncer. Em um primeiro objetivo, a presente invenção fornece um méto- do in vitro de previsão do benefício clínico de um paciente com câncer em resposta ao tratamento com um inibidor de EGFR que compreende as eta- pas: de determinação de um nível de expressão de um gene PTPRF em uma amostra de tumor de um paciente e de comparação do nível de expres- são do gene PTPRF com um valor representativo de um nível de expressão do gene PTPRF em tumores de uma população de pacientes que não obtêm benefício clínico partindo do tratamento, em que um nível de expressão mai- or do gene PTPRF na amostra de tumor do paciente é indicativo de um pa- ciente que obterá benefício clínico partindo do tratamento.

A abreviação PTPRF significa a proteína tirosina fosfatase, do tipo receptor, F. A Seq. Id. N0 1 mostra a seqüência de nucleotídeos da PT- PRF humana, variação de transcrição 1 e a Seq. Id. N0 2 mostra a seqüência de nucleotídeos da PTPRF humana variação de transcrição 2. O termo "um valor representativo de um nível de expressão de

PTPRF em tumores de uma população de pacientes que não obtêm benefí- cio clínico partindo do tratamento" refere-se a uma estimativa do nível médio de expressão do gene PTPRF em uma população de pacientes que não ob- têm um benefício clínico partindo do tratamento. Benefício clínico foi definido como possuindo uma resposta objetiva ou uma estabilização da doença du- rante £ 12 semanas.

Em uma modalidade preferida adicional, o gene PTPRF exibe um nível de expressão entre 1,1 e 1,8, preferivelmente 1,1 e 1,6 ou mais ve- zes maior na amostra de tumor do paciente comparado a um valor represen- tativo da população de pacientes que não obtêm benefício clínico partindo do tratamento.

Em uma modalidade preferida adicional, o gene PTPRF exibe um nível de expressão entre 1,2 e 1,8 ou mais vezes maior na amostra de tumor do paciente comparado a um valor representativo da população de pacientes que não obtêm benefício clínico partindo do tratamento.

Em uma modalidade preferida, o nível de expressão do gene marcador é determinado através da tecnologia de microarranjo ou outras tecnologias que avaliam os níveis de expressão de RNA como a RT-PCR quantitativa ou através de qualquer método que considera o nível de expres- são da respectiva proteína, por exemplo, imunohistoquímica (IHC). A cons- trução e o uso de chips gênicos são bem conhecidos na arte, ver, as Paten- tes U.S. Nes 5.202.231; 5.445.934; 5.525.464; 5.695.940; 5.744.305; 5.795.716 e 1 5.800.992. Ver também, Johnston, M. Curr. Biol. 8:R171-174 (1998); Iyer VR e outros, Science 283:83-87 (1999). Evidentemente, o nível de expressão gênica pode ser determinado através de outros métodos que são conhecidos por um perito na arte tais como, por exemplo, northern blots, RT-PCR, PCR quantitativa em tempo real, extensão de iniciadores, proteção à RNase, obtenção do perfil de expressão de RNA.

O gene marcador da presente invenção pode ser combinado com outros biomarcadores em conjuntos de biomarcadores. Os conjuntos de biomarcadores podem ser construídos partindo de qualquer combinação de biomarcadores de previsão para realizar previsões em relação ao efeito do tratamento com inibidor de EGFR em pacientes com câncer. Os biomarcado- res e os conjuntos de biomarcadores descritos aqui podem ser utilizados, por exemplo, para prever como os pacientes com câncer responderão à in- tervenção terapêutica com um inibidor de EGFR. O termo "gene", como utilizado aqui, compreende variações do

gene. O termo "variação" refere-se a seqüências de ácidos nucléicos que são substancialmente similares às seqüências de ácidos nucléicos forneci- das pelo número de acesso do GenBank. O termo "substancialmente similar" é bem entendido por um perito na arte. Em particular, uma variação gênica pode ser um alelo que exibe alterações de nucleotídeos quando comparado à seqüência de ácido nucléico do alelo mais prevalecente na população hu- mana. Preferivelmente, tal seqüência de ácido nucléico substancialmente similar possui uma similaridade de seqüência com o alelo mais prevalecente de pelo menos 80%, preferivelmente de pelo menos 85%, mais preferivel- mente de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 95%. En- tende-se também que o termo "variações" se refere a variações de proces- samento. O inibidor de EGFR pode ser selecionado do grupo que consiste de gefitinib, erlotinib, PKI-166, EKB-569, GW2016, CI-1033 e um anticorpo anti-erbB tal como trastuzumab e cetuximab.

Em outra modalidade, o inibidor de EGFR é erlotinib.

Ainda em outra modalidade, o câncer é NSCLC.

As técnicas para a detecção e para a quantificação da expres- são gênica dos genes descritos por esta invenção incluem, mas não estão limitadas a northern blots, RT-PCR, PCR quantitativa em tempo real, exten- são de iniciadores, proteção à RNase, obtenção do perfil de expressão de RNA e técnicas relacionadas. Estas técnicas são bem conhecidas pelos peri- tos na arte ver, por exemplo, Sambrook J e outros, Molecular Cloning: A La- boratory Manual, Terceira Edição (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 2000).

As técnicas para a detecção da expressão de proteínas dos res- pectivos genes descritos por esta invenção incluem, mas não estão limitadas à imunohistoquímica (IHC).

De acordo com a invenção, as células de uma amostra de tecido do paciente, por exemplo, uma biópsia de tumor ou de câncer, podem ser analisadas para determinar o padrão de expressão de um ou mais biomar- cadores. O sucesso ou o fracasso de um tratamento para câncer pode ser determinado com base no padrão de expressão do biomarcador das células provenientes do tecido de teste (células de teste), por exemplo, biópsia de tumor ou de câncer, como sendo relativamente similar ou diferente do pa- drão de expressão de um conjunto de controle do um ou mais biomarcado- res. No contexto desta invenção, foi observado que o gene da tabela 3 é re- gulado para mais, isto é, exibe um nível de expressão maior, em tumores de pacientes que obtiveram benefício clínico partindo do tratamento com inibi- dor de EGFR comparados a tumores de pacientes que não obtiveram bene- fício clínico partindo do tratamento com inibidor de EGFR. Assim, se as célu- Ias de teste exibirem um perfil de expressão de biomarcador que correspon- de aquele de um paciente que respondeu ao tratamento para câncer, é al- tamente provável ou previsto que o câncer ou o tumor do indivíduo respon- derá favoravelmente ao tratamento com o inibidor de EGFR. Em contraste, se as células de teste exibirem um padrão de expressão de biomarcador que corresponde aquele de um paciente que não respondeu ao tratamento para câncer, é altamente provável ou previsto que o câncer ou o tumor do indiví- duo não responderá ao tratamento com o inibidor de EGFR.

O biomarcador da presente invenção, isto é, o gene listado na tabela 3, é uma primeira etapa em direção a uma terapia individualizada pa- ra pacientes com câncer, em particular, pacientes com NSCLC refratário. Esta terapia individualizada permitirá que os médicos que estão fazendo o tratamento selecionem o agente mais apropriado dos fármacos existentes para terapia para câncer, em particular, NSCLC. Os benefícios da terapia individualizada para cada paciente futuro são: as taxas de resposta/o núme- ro de pacientes que se beneficiam aumentarão e o risco de efeitos colaterais adversos causados pelo tratamento ineficiente será reduzido. Em um objetivo adicional a presente invenção fornece um méto-

do terapêutico de tratamento de um paciente com câncer identificado pelo método in vitro da presente invenção. O dito método terapêutico compreen- de a administração de um inibidor de EGFR ao paciente que foi selecionado para o tratamento baseado no padrão de expressão do gene de previsão da tabela 3. Um inibidor de EGFR preferido é erlotinib e um câncer preferido para ser tratado é NSCLC. Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra o planejamento do estudo; A Figura 2 mostra o esquema de processamento de amostras; A Figura 3a mostra os níveis de expressão de PTPRF versus o

resultado clínico para a obtenção de perfil com Genechip®;

A Figura 3b mostra os níveis de expressão de PTPRF versus o resultado clínico para qRT-PCR e

A Figura 3c mostra a correlação entre as medidas de Genechip® e qRT-PCR para o PTPRF. Parte Experimental

Base Lógica para o Estudo e Planejamento do Estudo Recentemente foram descritas mutações dentro do gene EGFR no tecido de tumor de um subconjunto de pacientes com NSCLC e a associ- ação destas mutações com sensibilidade ao erlotinib e ao gefitinib (Pao W, e outros 2004; Lynch e outros 2004; Paez e outros 2004). Para os pacientes combinados de dois estudos, o EGFR mutado foi observado em 13 de 14 pacientes que responderam ao gefitinib e em nenhum dos 11 pacientes tra- tados com gefitinib que não responderam. A prevalência relatada destas mu- tações era de 8% (2 de 25) em pacientes com NSCLC não selecionados. Estas mutações foram observadas mais freqüentemente em adenocarcino- mas (21%), em tumores de mulheres (20%) e em tumores de pacientes ja- poneses (26%). Estas mutações resultam na maior atividade in vitro de EG- FR e na maior sensibilidade ao gefitinib. A relação das mutações com a do- ença estável prolongada ou com a duração de sobrevivência não foi avaliada de forma previdente.

Com base nas análises exploratórias provenientes do estudo

BR.21, parecia improvável que a vantagem de sobrevivência observada era somente devida às mutações de EGFR, uma vez que uma vantagem de so- brevivência significativa é mantida mesmo quando pacientes com resposta objetiva são excluídos das análises (dados no arquivo). Outros mecanismos moleculares também têm que contribuir para o efeito.

Com base na suposição de que há alterações nos níveis de ex- pressão gênica que podem prever uma resposta/benefício em relação ao tratamento com Tarceva®, foi utilizada uma análise de microarranjos para detectar estas alterações. Isto requeria uma população de estudo claramente definida tra-

tada com uma monoterapia de Tarceva® após o fracasso da terapia de 1â linha. Com base na experiência do estudo BR.21, a população beneficiada foi definida como possuindo resposta objetiva ou estabilização da doença durante 12 semanas. Os conjuntos de dados clínicos e de microarranjos fo- ram analisados de acordo com um plano estatístico pré-definido.

A aplicação desta técnica requer tecido congelado fresco (FFT). Portanto uma biópsia obrigatória tinha que ser realizada antes do início do tratamento. O material coletado foi congelado em nitrogênio líquido (N2).

Uma segunda amostra de tumor foi coletada ao mesmo tempo e armazenada em parafina (embebida em parafina fixada com formalina, FF- PE). Esta amostra foi analisada em relação a alterações na via de sinaliza- ção de EGFR.

A capacidade de realizar biópsias tumorais através de broncos- copia era um pré-requisito para este estudo. A broncoscopia é um procedi- mento padronizado para confirmar o diagnóstico de câncer pulmonar. Embo- ra seja geralmente segura, há um risco remanescente de complicações, por exemplo, sangramento.

Este estudo foi uma primeira etapa em direção a uma terapia individualizada para pacientes com NSCLC refratário. Esta terapia individua- lizada permitirá que os médicos que estão fazendo o tratamento selecionem o agente mais apropriado dos fármacos existentes para esta indicação. Uma vez que a terapia individualizada estará disponível, o bene-

fício para cada paciente futuro será mais importante que o risco que os paci- entes têm que correr no presente estudo:

• · as taxas de respostas/o número de pacientes que se benefici-

am aumentarão,

· · o risco de efeitos colaterais adversos devido ao tratamento ine-

ficiente será reduzido. Base Lógica para Seleção de Dosagens

O Tarceva® foi fornecido oralmente uma vez ao dia em uma do- se de 150 mg até a progressão da doença, toxicidades intoleráveis ou morte. A seleção desta dose se baseava nos parâmetros farmacocinéticos, assim como no perfil de segurança e capacidade de tolerância desta dose obser- vada em testes nas Fases I, Il e Ill em pacientes com câncer avançado pré- tratados fortemente. Os níveis de fármacos observados no plasma de paci- entes com câncer que receberam a dose de 150 mg/dia estavam coerente- mente acima da concentração média no plasma de 500 ng/mL direcionada para eficácia clínica. O BR.21 exibiu uma vantagem de sobrevivência com esta dose. Objetivos do Estudo

O objetivo primário era a identificação de genes expressos de forma diferencial que podem prever o benefício (CR, PR ou SD ? 12 sema- nas) do tratamento com Tarceva®. A identificação de genes expressos de forma diferencial que podem prever "resposta" (CR, PR) ao tratamento com Tarceva® era um objetivo adicional importante.

Os objetivos secundários eram avaliar as alterações nas vias de sinalização de EGFR em relação ao benefício proveniente do tratamento. Planejamento do Estudo Visão Geral do Planejamento do Estudo e do Regime de Dosa-

gem

Este era um estudo aberto em Fase Il de identificação de mar- cadores que podem fazer uma previsão. O estudo foi realizado em aproxi- madamente 26 locais em aproximadamente 12 países. 264 pacientes com NSCLC avançado após o fracasso de pelo menos um regime de quimiotera- pia anterior foram registrados ao longo de um período de 12 meses. O Tar- ceva® oral contínuo foi fornecido em uma dose de 150 mg/dia. Reduções de doses foram permitidas com base na capacidade de tolerância à terapia com o fármaco. Parâmetros clínicos e laboratoriais foram analisados para avaliar o controle da doença e a toxicidade. O tratamento continuou até a progres- são da doença, toxicidade inaceitável ou morte. O planejamento do estudo é representado na figura 1.

Amostras de tecido tumoral e de sangue foram obtidas para aná- lises moleculares para a avaliação dos efeitos do Tarceva® e para a identifi- cação de subgrupos de pacientes que se beneficiaram da terapia; Avaliações dos Marcadores de Previsão

Biópsias do tumor foram realizadas dentro de um período de 2 semanas antes do início do tratamento. Foram coletadas duas amostras di- ferentes:

A primeira amostra era sempre congelada imediatamente em N2

líquido

A segunda amostra era fixada em formalina e embebida em pa- rafina

O tecido congelado instantaneamente tinha a maior prioridade neste estudo.

A figura 2 mostra um esquema do processamento das amostras.

Análise de Microarranios

As amostras congeladas instantaneamente foram utilizadas para microdissecação com captura a laser (LCM) de células tumorais para extrair o RNA do tumor e o RNA do tecido que circunda o tumor. O RNA foi anali- sado em chips de microarranjo Affymetrix (HG-U133A) para estabelecer o perfil de expressão gênica do tumor dos pacientes. O Controle de Qualidade dos chips do Affymetrix foi utilizado para selecionar as amostras de qualida- de adequada para comparação estatística.

Análises de Biomarcadores Isolados em Tecido Embebido em Parafina Fixado com Formalina A segunda biópsia de tumor, a amostra de FFPE1 foi utilizada

para realizar análises de mutação do DNA, de IHC e de ISH como descrito abaixo. Análises similares foram realizadas em tecidos coletados no diag- nóstico inicial.

O estado de mutação do DNA dos genes que codificam EGFR e de outras moléculas envolvidas na via de sinalização de EGFR foi analisado através do sequenciamento do DNA. A amplificação gênica de EGFR e ge- nes relacionados foi estudada por FISH.

As análises de expressão de proteínas incluíam análises imuno- histoquímicas [IHC] de EGFR e outras proteínas dentro da via de sinalização de EGFR.

Avaliações das Respostas

Os critérios de RECIST (Medida Unidimensional de Tumor) fo- ram utilizados para avaliar a resposta. Estes critérios podem ser encontrados no link a seguir: http://www.eortc.be/recist/

Observar que:

Para ser determinado um estado de CR ou PR, alterações nas medidas de tumor têm que ser confirmadas através de avaliações repetidas pelo menos 4 semanas de intervalo em qualquer tempo durante o período de tratamento.

No caso de SD, as medidas de acompanhamento têm que ter satisfeito os critérios de SD pelo menos uma vez após a entrada no estudo em um intervalo mínimo de 6 semanas.

No caso de SD mantido, as medidas de acompanhamento têm que ter satisfeito os critérios de SD pelo menos uma vez após a entrada no estudo com duração de manutenção de pelo menos 12 semanas. Avaliação da Sobrevivência

Uma verificação regular do estado a cada 3 meses foi realizada através da visita do paciente à clinica ou por telefone. Todas as mortes fo- ram registradas. No final do estudo era necessária uma confirmação definiti- va de sobrevivência para cada paciente. Métodos

Preparação de Amostras de RNA e Controle de Qualidade de Amostras de RNA

Todo o processamento de amostras de biópsia foi realizado por um laboratório de referência de patologia; amostras de tecidos congelados frescos foram enviadas dos locais de pesquisa para as instalações do Clini- cai Sample Operations na Roche Basel e de lá para o laboratório de patolo- gia para processamento adicional. A microdissecação por captura a laser foi utilizada para selecionar células tumorais do tecido circundante. Após a LCM, o RNA foi purificado do material tumoral enriquecido. O laboratório de patologia então realizou um número de etapas para a obtenção de uma es- timativa da concentração e da qualidade do RNA.

As RNases são enzimas que degradam o RNA e são encontra- das em qualquer lugar e assim todos os procedimentos em que o RNA será utilizado têm que ser rigorosamente controlados para minimizar a degrada- ção do RNA. A maior parte das espécies de mRNA por si só possui meias- vidas particularmente curtas e assim são consideradas bastante instáveis. Portanto é importante realizar verificações da integridade do RNA e a quanti- ficação antes de qualquer ensaio.

A concentração e o perfil de qualidade do RNA podem ser avali- ados utilizando um instrumento da Agilent (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA) chamado de um 2100 Bioanalyzer®. O software do instrumento gera um Número de Integridade do RNA (RIN), uma estimativa da quantifi- cação (Schroeder, A. e outros, The RIN: an RNA integrity number for assig- ning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol, 2006. 7: p. 3) e calcula proporções ribossomais da amostra de RNA total. O RIN é determi- nado partindo do rastro eletroforético inteiro da amostra de RNA e inclui as- sim a presença e a ausência de produtos de degradação.

A qualidade do RNA foi analisada por um 2100 Bioanalyzer®. Somente as amostras com pelo menos um pico de rRNA acima do ruído de poli-l adicionado e com RNA suficiente foram selecionadas para análises adicionais na plataforma de Affymetrix. O RNA purificado foi enviado para o Roche Centre for Medicai Genomics (RCMG; Basel, Suíça) para análise por microarranjo. 122 amostras de RNA foram recebidas do laboratório de pato- logia para processamento adicional. Marcação Direcionada de amostras de RNA do tecido

A marcação direcionada foi realizada de acordo com o Two- Cycle Target Labeling Amplification Protocol da Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, Califórnia), seguindo as instruções do fabricante.

O método se baseia no procedimento de amplificação linear pa- dronizado de Eberwine, mas utiliza dois ciclos deste procedimento para ge- rar cRNA suficiente para hibridização, mas utiliza dois ciclos deste procedi- mento para gerar cRNA marcado suficiente para hibridização a um microar- ranjo.

A entrada de RNA total utilizada na reação de marcação era de ng para aquelas amostras em que mais de 10 ng de RNA estavam dispo- níveis; se estivesse disponível menos que essa quantidade ou se não hou- vesse dados de quantidade disponíveis (devido à concentração de RNA mui- to baixa), metade da amostra total era utilizada na reação. Os rendimentos provenientes das reações de marcação variavam de 20-180 pg de cRNA. Uma etapa de normalização foi introduzida no nível de hibridização em que μς de cRNA eram utilizados para cada amostra.

O RNA de Referência Humana (Stratagene, Carlsbad, CA, USA) foi utilizado como uma amostra de controle no fluxo de trabalho com cada batelada de amostras. 10 ng deste RNA foram utilizados como entrada junto com as amostras de teste para verificar se os reagentes de marcação e de hibridização estavam funcionando como esperado. Hibridizações em Microarranios

Os microarranjos Affymetrix HG-U133A contêm mais de 22.000 conjuntos de sondas que se direcionam a aproximadamente 18.400 produtos da transcrição e variações que representam aproximadamente 14.500 genes bem caracterizados.

A hibridização para todas as amostras foi realizada de acordo com as instruções do Affymetrix (Affymetrix Inc., Expression Analysis Tech- nical Manual, 2004). Sucintamente, para cada amostra, 15 pg de cRNA mar- cado com biotina foram fragmentados na presença de cátions divalentes e calor e hibridizados durante a noite aos arranjos de oligonucleotídeos de ge- noma completo do Affymetrix HG-U133A. No dia seguinte os arranjos foram corados com estreptavidina-ficoeritrina (Molecular Probes; Eugene, OR) de acordo com as instruções do fabricante. Os arranjos foram então verificados utilizando um GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix) e as intensidades de si- nal foram calculadas automaticamente pelo GeneChip Operating Software (GCOS) Versão 1,4 (Affymetrix). Análise Estatística

A análise dos dados do Affymetrix® consistiam de cinco etapas

principais.

A Etapa 1 consistia do controle de qualidade. A meta era identifi- car e excluir deste arranjo de análise dados com um perfil de qualidade a- baixo do padrão.

A Etapa 2 consistia do pré-processamento e da normalização. A

meta era criar um "conjunto de dados de análise" normalizado e graduado, sensível à comparação interchips. Este compreendia a estimativa e a sub- tração do ruído de fundo, a compactação e a classificação das sondas.

A Etapa 3 consistia da exploração e da descrição. A meta era identificar a tendência potencial e as fontes de variabilidade. Consistia da aplicação de técnicas de análises descritivas multivariadas e univariadas para identificar co-variedades que exerciam influência.

A Etapa 4 consistia da modelagem e do teste. A meta era identi- ficar uma lista de marcadores candidatos com base na avaliação estatística da diferença no nível médio de expressão entre pacientes com "benefício clínico" e "sem benefício clínico". Consistia no ajuste de um modelo estatísti- co adequado para cada conjunto de sondas e da derivação de uma medida de significância estatística.

A Etapa 5 consistia de uma análise de força. A meta era gerar uma lista qualificada de marcadores candidatos que não dependem forte- mente dos métodos de pré-processamento e das suposições estatísticas. Consistia na repetição da análise com abordagens metodológicas diferentes e do cruzamento da lista de candidatos.

Todas as análises foram realizadas utilizando o pacote de pro- gramas R.

Etapa 1: Controle de Qualidade A avaliação da qualidade dos dados se baseava na verificação

de vários parâmetros. Estes incluíam os parâmetros de qualidade do Affyme- trix GeneChip®, em particular: Fator de Escalonamento (Scaling Factor), Porcentagem da Solicitação Presente (Percentage of Present Call) e Média de Fundo (Average Background). Esta etapa também incluía inspeção visual de imagens virtuais de chips para a detecção de problemas de hibridização localizados e comparação de cada chip com um chip intermediário virtual para a detecção de qualquer desvio do comportamento mediano. A análise de correlação interchips também foi realizada para detectar amostras discre- pantes. Em adição, medidas auxiliares da qualidade do RNA obtidas partin- do da análise de amostras de RNA com o Agilent Bioanalyzer® 2100 foram levadas em consideração.

Com base nestes parâmetros, os dados provenientes de 20 ar- ranjos foram excluídos da análise. Assim os dados provenientes de um total de 102 arranjos representando 102 pacientes foram incluídos na análise. A descrição clínica deste conjunto de 102 amostras é relatada na tabela 1. Tabela 1: Descrição de características clínicas de pacientes incluídos na a - nálise

Variable Value n=102 η (%) Best Response N/A 16 (15.7%) PD 49 (48.0%) SD 31 (30.4%) PR 6 (5.9%) Clinicai Benefit NO 81 (79.4%) YES 21 (20.6%) SEX FEMALE 25 (24.5%) MALE 77 (74.5%) ETHNICITY CAUCASIAN 65 (63.7%) ORIENTAL 37 (36.3%) Histology ADENOCARCINOMA 35 (34.3%) SQUAMOUS 53 (52.0%) OTHERS 14 (13.7%) Ever-Smoking NO 20 (19.6%) YES 82 (80.4%)

Vairável Valor N = 102 N (%) Melhor Resposta N/A 16(15,7%) PD 49 (48,0%) SD 31 (30,4%) PR 6 (5,9%) Benefício Clínico Não 81 (79,4%) Sim 21 (20,6%) Sexo Feminino 25 (24,5%) Masculino 77 (74,5%) Etnicidade Caucasiano 65 (63,7%) Vairável Valor N = 102 Oriental 37 (36,3%) Histologia Adenocarcinoma 35 (34,3%) Escamoso 53 (52,0%) Outros 14(13,7%) Alguma vez fumante Não 20(19,6%) Sim 82 (80,4%)

Etapa 2: Pré-processamento de dados e normalização

O algoritmo rma (Irizarry, R.A. e outros, Summaries of Affymetrix GeneChip probe levei data. Nucl. Acids Res., 2003. 31(4): p. e15) foi utiliza- do para o pré-processamento e para a normalização. O algoritmo mas5 (AFFYMETRIX, GeneChip® Expression: Data Analysis Fundamentais. 2004, AFFYMETRIX) foi utilizado para fazer a detecção das solicitações em rela- ção aos conjuntos de sondas individuais. Os conjuntos de sondas chamados de "ausentes" ou "marginais" em todas as amostras foram removidos da a- nálise adicional; 5930 conjuntos de sondas foram removidos da análise com base neste critério. O conjunto de dados de análise consistia, portanto, de uma matriz com 16353 (de 22283) conjuntos de sondas medidos em 102 pacientes.

Etapa 3: Descrição e Exploração dos Dados

A análise exploratória descritiva foi realizada para identificar ten- dências potências e fontes principais de variabilidade. Foi verificado um con- junto de co-variedades com um impacto potencial sobre os perfis de expres- são gênica. Este compreendia tanto variáveis técnicas quanto clínicas. As co-variedades técnicas incluíam: data do processamento de RNA (posteri- ormente referida como batelada), RIN (como uma medida de qualida- de/integridade do RNA), Operador e Centro de coleta de amostras. As co- variedades clínicas incluíam: Tipo de histologia, condição de fumante, grau de tumor, escore de desempenho (Oken, M.M. e outros, Toxicity and res- ponse criteria of the Eastern Cooperative Oncology Group. Am J Clin Oncol, 1982. 5(6): ρ. 649-55), dados demográficos, condição de capacidade de res- posta e condição de benefício clínico.

As ferramentas de análises incluíam ANOVA univariado e análi- se de componentes principais. Para cada uma destas co-variedades, o A- NOVA univariado foi aplicado independentemente a cada conjunto de son- das.

Um efeito significativo da variável de batelada foi identificado. Na prática, a variável de batelada capturava diferenças entre as datas de pro- cessamento de amostras e o lote de chips do Affymetrix. Após a verificação de que a variável de batelada era quase independente das variáveis de inte- resse, o efeito da batelada foi corrigido utilizando o método descrito em Johnson, W.E., C. Li e A. Rabinovic, Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostat, 2007. 8(1): p. 118- 127.

O conjunto de dados normalizados após a correção dos efeitos

de batelada servia como o conjunto de dados de análise nas análises sub- sequentes.

A histologia e o RIN eram duas variáveis adicionais importantes destacadas pela análise descritiva. Etapa 4: Modelagem e Teste dos Dados

Um modelo linear foi ajustado independentemente a cada con- junto de sondas. As variáveis incluídas no modelo são relatadas na tabela 2. Os parâmetros do modelo foram estimados pela técnica de probabilidade máxima. O parâmetro correspondente à variável de "Benefício Clínico" (X1) foi utilizado para avaliar a diferença no nível de expressão entre o grupo de pacientes com benefício clínico e o grupo sem benefício clínico.

Tabela 2: Descrição das variáveis incluídas no modelo linear.

Variável Tipo Valor expressão gênica Dependente (Υ,ρ) log2 de intensidade de conjunto de sondas i no paciente p. Intercepção Média geral (μ) Variável Tipo Valor Benefício Clínico Prognosticador de inte- resse (X1) SIM/NÃO Histologia Covariável de Ajuste (X2) ADE- NO./ESCAM./OUTROS RAÇA Cov. de Aj. (X3) ORIENT./CAUCAS. SEXO Cov. de Aj. (X4) SEXO FEMININO/SEXO MASCULINO RIN Cov. de Aj. (X5) [2,...,7,9] FUMANTE Cov. de Aj. (X6) ATUALMENTE/NO PASSADO/NUNCA Estágio Cov. de Aj. (X7) UNRESEC.III/IV

Para cada conjunto de sondas i. o objetivo do teste estatístico

era rejeitar a hipótese de que os níveis médios de expressão em pacientes com benefício clínico e em pacientes sem benefício clínico eram equivalen- tes, levando em consideração as outras covariáveis de ajuste listadas na tabela 2. Formalmente, a hipótese nula de igualdade foi testada contra uma alternativa bilateral. Sob a hipótese nula, a distribuição da estatística t para este teste segue uma distribuição de t de Student com 92 graus de liberda- de. Os valores de ρ correspondentes são relatados na tabela 3.

A escolha do modelo linear foi motivada por duas razões. Em primeiro lugar, a modelagem linear é uma abordagem versátil, bem caracte- rizada e robusta que permite o ajuste de variáveis confusas quando é esti- mado o efeito da variável de interesse. Em segundo lugar, fornecido o tama- nho da amostra de 102 e a normalização e o escalonamento do conjunto de dados, a hipótese de distribuição normal era razoável e justificada. Para cada conjunto de sondas, a hipótese de homogeneidade de

variância foi avaliada utilizando testes de Fligner-Killeen baseados nos resi- duais do modelo. A análise consistia de 3 etapas:

1. Teste de cada uma das variáveis categóricas em relação à homogeneidade de variância residual 2. Observação da variável V com o valor de ρ mínimo

3. Se o valor de ρ mínimo for menor que 0,001, reajustar o mo- delo que permite o nível diferente de variáveis V para obter uma variância

diferente.

Etapa 5: Força

A meta da análise de força era reduzir o risco de que os resulta- dos da análise pudessem ser provenientes de artefatos e um resultado das etapas de pré-processamento ou hipóteses que sustentam a análise estatís- tica. Foram considerados os três aspectos a seguir: a) inclusão ou exclusão de alguns chips extras na etapa de controle de qualidade; b) algoritmo de pré-processamento e normalização; c) hipóteses estatísticas e abordagem deteste.

A lista de marcadores candidatos foi definida como o subconjun- to de genes coerentemente declarados como significativos com ajustes de análises diferentes. As opções de análises aplicadas diferentes eram as se- guintes:

a) a) Um subconjunto adicional de 8 chips foi identificado com ba-

se em critérios de controle de qualidade mais rigorosos. Um "conjunto de dados reduzido" foi definido através da exclusão destes 8 chips.

b) b) MAS5 foi identificado como uma alternativa para rma para o pré-processamento e para a normalização. MAS5 utiliza métodos diferentes

para estimativa de fundo, sumarização de sondas e normalização.

c) c) Dois testes estatísticos adicionais foram empregados.

a. a. Um teste de Wilcoxon para a diferença entre benefício clínico e nenhum benefício e

b. b. um teste de proporção de probabilidade (LRT) que testa o modelo de regressão logística em que o benefício clínico foi tomado como

a variável de resposta e a expressão gênica como covariável. Estes dois testes adicionais se baseiam em um conjunto diferente de hipóteses estatís- ticas de suporte. Para cada conjunto de sondas, o LRT era realizado após um Qui-quadrado com 1 grau de liberdade. Em resumo, dois conjuntos de amostras (o conjunto de dados

"completo" e o conjunto de dados "reduzido") e 2 algoritmos de pré- processamento (mas5 e rma) foram considerados; isto resultou em quatro conjuntos de dados de análises diferentes. Para cada um destes quatro con- juntos de dados, três testes estatísticos diferentes foram aplicados. Portanto, para cada conjunto de sondas, foram calculados três valores de p. Em cada conjunto de dados de análise, um critério composto foi aplicado para identifi- car a lista de genes regulados de forma diferencial. Este critério composto foi definido como: o valor de ρ máximo é menor que 0,05 e o valor de ρ mínimo é menor que 0,001. A análise de força utilizando o critério 1 para a identifica- ção de genes marcadores forneceu PTPRF como um marcador de previsão para o tratamento com inibidor de EGFR. Tabela 3: Marcador Gênico para Benefício Clínico com Base na Análise de Força após a Aplicação do Critério Composto.

A coluna 1 é o identificador do Affymetrix do conjunto de sondas. A coluna 2 é o número de acesso do GenBank da seqüência gênica corres- pondente. A coluna 3 é o nome do gene oficial correspondente. A coluna 4 é a alteração média de multiplicações ajustada correspondente no nível de expressão entre paciente com benefício clínico e sem benefício clínico, que é estimada partindo do modelo linear. A coluna 5 é o valor de ρ para o teste da diferença no nível de expressão entre pacientes com benefício clínico e sem benefício clínico que é derivado do modelo linear. A coluna 6 é o inter- valo de confiança de 95% para a alteração de multiplicações média ajustada no nível de expressão.

ID do Con- junto de Sondas do Affymetrix GenBank Gene Alteração de Multipli- cações Mé- dia Ajusta- da Valor de P Cl 95% 200637_s_at NM 002840 (Seq. Id. N0 1) NM 130440 (Seq. Id. N0 2) PT- PRF 1,35 1,2E-3 1,1 ,1,6 200635_s_at NM 002840 (Seq. Id. N0 1) NM 130440 (Seq. Id. N0 2) PT- PRF 1,49 1,7E-4 1,2, 1,8 Análise Estatística Adicional

Para o marcador candidato selecionado PTPRF, foram realiza- das as análises adicionais a seguir em um ambiente validado por estatísticos independentes:

· · Regressão de Cox Univariada para PFS (Sobrevivência sem

progressão) partindo da Análise Primária de Affymetrix,

• · Regressão Logística Univariada para Benefício Clínico partindo da Análise Primária de Affymetrix e

• · Regressão de Cox Univariada para Sobrevivência partindo da Análise Primária de Affymetrix

Os resultados destas análises são apresentados abaixo. Estes são coerentes com os resultados da análise primária e confirmam a escolha do marcador selecionado.

Resultados: Regressão de Cox Univariada para PFS (Sobrevivência sem progressão) partindo da Análise Primária de Affymetrix:

Gene N°de Proporção 95 % de Cl para a ν I d

pacientes de risco Proporção de risco a or ae ρ

PTPRF 102 0,5 0,34; 0,73 0,004

Resultados: Regressão de Cox Univariada para Benefício Clínico partindo da Análise Primária de Affymetrix:

N0 de Razão de 95 % de Cl para a Wl . Gene . , , _ . j Va or de ρ

pacientes chances razao de chances K

PTPRF 102 5,01 1,89; 13,33 0,0012

Resultados: Regressão de Cox Univariada para Sobrevivência partindo da Análise Primária de Affymetrix:

Gene N°d? Proporção 95 % Cl para a Proporção Va|ord

pacientes de risco de risco K

PTPRF 102 0,62 0,39; 0,97 0,0377

qRT-PCR

O cDNA foi sintetizado utilizando SuperScript® Ill First-strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR (Invitrogen, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante, mas sem a inclusão de um produto da digestão da RNase Η.

A PCR quantitativa foi realizada utilizando Ensaios de Expressão Gênica com TaqMan® em um Sistema de Detecção de Seqüências ABI PRISM® 7900HT de acordo com as recomendações do fabricante (Applied Biosystems, CA, USA). Todos os ensaios foram realizados em triplicatas.

Os iniciadores e as sondas utilizados cruzavam os limites dos éxons ou estavam dentro da seqüência de interesse da sonda do Affymetrix Genechip®. Dois genes de manutenção ("house-keeping") foram incluídos como controles endógenos: beta-2-microglobulina (B2M\ Ensaio Hs99999907_m1) e hipoxantinafosforribosil transferase (HPRT\ Ensaio Hs99999909_m1).

Todas as corridas incluíam uma amostra de calibração (RNA total MVP® de pulmão de ser humano adulto; Stratagene1 CA, USA) e uma curva padrão. O RNA total de Referência Humano Universal (Stratagene, CA, USA) foi utilizado como molde para curvas padrão de PTPRF. Todas as amostras foram medidas em triplicatas.

A quantificação relativa foi realizada utilizando o método de -

ACt.

Resultados

Como relatado anteriormente, os perfis de expressão gênica do

Affymetrix Genechip® foram determinados para 102 pacientes incluídos nes- te estudo. Entre estes pacientes, os resultados da qRT-PCR foram obtidos para 75 (tabela 4). As características demográficas e clínicas dos pacientes com resultados de qRT-PCR eram similares àquelas da população inteira (n=264) e dos pacientes com perfis de expressão gênica de Genechip® dis- poníveis.

Tabela 4: Características de linha de base: pacientes com análises de qRT- PCR (n=75)

Característica Idade (mediana, faixa) 62 (39-85) Gênero; η (%) Sexo masculino 19(25) Característica Sexo feminino 56 (75) Condição de desempenho de ECOG; η (%) 0 7(9) 1 45 (60) 2 23 (31) Histologia; η (%) Adenocarcinoma 27 (36) Carcinoma de células escamosas 34 (45) Carcinoma de células grandes 2(3) Outros 12(16) Estágio da doença; η (%) IIIB 22 (29) IV 53 (71) Número de regimes de quimioterapia anteriores; η (%) O 19(25) 1 36 (48) >2 20 (27) Etnicidade: η (%) Caucasiana 51 (68) Asiática 24 (32) Histórico de fumo; η (%) Nunca 12(16) Atualmente 24 (32) Ex-fumante 39 (52)

Dos 75 pacientes com resultados de qRT-PCR, 4 (5%) tinham

resposta parcial (PR), 23 (31%) tinham SD1 39 (52%) tinham PD e 9 (12%) não puderam ser avaliados. Estes resultados eram muito similares aos ob- servados na população de estudo inteira (n=264).

A Figura 3 mostra os níveis relativos de mRNA para PTPRF em

pacientes individuais, que são avaliados através da obtenção de perfis com Affymetrix Genechip® e qRT-PCR. A Figura 3a mostra níveis de expressão versus o resultado clínico para a obtenção de perfis com Genechip® e a Fi- gura 3b mostra níveis de expressão para qRT-PCR.

Havia uma boa relação entre as medidas com Genechip® e com qRT-PCR do produto da transcrição de PTPRF (Figura 3c; ρ de Pearson = 0,76, p<0,01). Como observado com a obtenção de perfis com Genechip®, os níveis de mRNA de PTPRF avaliados utilizando qRT-PCR pareciam se correlacionar com a resposta ao erlotinib, com níveis mais altos sendo ob- servados em indivíduos capazes de responder comparados com indivíduos incapazes de responder. Discussão

Através da análise das amostras de tecido com a tecnologia de microarranjo de oligonucleotídeos em alta densidade e da aplicação da mo- delagem estatística aos dados, foi possível identificar os genes cujos níveis de expressão podem ser capazes de prever pacientes que obtêm um bene- fício clínico partindo do tratamento com erlotinib.

Foi aplicado um critério composto (definido anteriormente). Este resultou no PTPRF como um marcador capaz de previsão para o tratamento com inibidor de EGFR.

O gene PTPRF, localizado no cromossomo 1p34, codifica um membro protéico da família das proteínas tirosina fosfatases (PTP). Este possui uma região extracelular, uma única região transmembrana e dois domínios catalíticos intracitoplasmáticos em tandem e representa assim uma PTP do tipo receptora. A região extracelular contém três domínios similares à Ig e nove domínios não similares à Ig, similares aqueles de molécula de adesão de células neurais.

Neste estudo, foi observado que o PTPRF era relativamente re- gulado para mais em pacientes que obtinham um benefício clínico partindo do tratamento com erlotinib. Esta descoberta pode ser interpretada no con- texto de relatos publicados demonstrando a função potencial deste gene em mecanismos importantes diferentes de tumorigênese.

Em primeiro lugar, foi claramente estabelecido que o EGFR é um substrato do PTPRF. Em uma investigação detalhada, a interação entre EGFR e PTPRF foi adicionalmente caracterizada e mostrada como sendo complexa e fortemente controlada. Estas observações levaram os presentes inventores a postular que o PTPRF desempenha uma função importante e direta no controle da sinalização a jusante do receptor de EGFR. Em outra linha de evidência, foi observado que o PTPRF tem uma atividade supresso- ra de tumor, atuando através de um efeito inibidor sobre a migração de célu- las e possivelmente da indução da apoptose. O mecanismo através do qual o PTPRF controla o processo de migração celular foi adicionalmente obtido. Dois estudos mostraram que esta proteína funciona através de uma intera- ção complexa com o complexo de E-caderina, mediada por uma regulação direta da atividade de beta-catenina.

A interação direta com o EGFR e uma atividade supressora de tumor bem caracterizada são duas características proeminentes que tornam o PTPRF um marcador particularmente convincente de resposta ao erlotinib.

Claims (12)

1. Processo in vitro de previsão da resposta de um paciente com câncer ao tratamento com um inibidor de EGFR que compreende: a determinação de um nível de expressão de um gene PTPRF em uma amostra de tumor de um paciente e a comparação do nível de ex- pressão do gene PTPRF a um valor representativo de um nível de expres- são do gene PTPRF em tumores de uma população de pacientes que não obtêm benefício clínico partindo do tratamento, em que um nível maior de expressão do gene PTPRF na amostra de tumor do paciente é indicativo de um paciente que obterá benefício clínico partindo do tratamento.

2. Processo da reivindicação 1, em que o nível de expressão é determinado através da tecnologia de microarranjo.

3. Processo da reivindicação 1 ou 2, em que o gene PTPRF exi- be um nível de expressão entre 1,1 e 1,8, preferivelmente entre 1,1 e 1,6 ou mais vezes maior na amostra de tumor do paciente comparado com o valor representativo de um nível de expressão do gene PTPRF em tumores de uma população de pacientes que não obtêm benefício clínico partindo do tratamento.

4. Processo das reivindicações 1 até 3, em que o gene PTPRF exibe um nível de expressão entre 1,2 e 1,8 ou mais vezes maior na amostra de tumor do paciente comparado com um valor representativo da população de pacientes que não obtêm benefício clínico partindo do tratamento.

5. Processo das reivindicações 1 até 4, em que o inibidor de EGFR é erlotinib.

6. Processo das reivindicações 1 até 5, em que o câncer é NS- CLC.

7. Uso de um gene PTPRF para prever a resposta de um paci- ente com câncer ao tratamento com inibidor de EGFR.

8. Uso da reivindicação 7, em que o câncer é NSCLC.

9. Uso da reivindicação 7 ou 8, em que o inibidor de EGFR é erlotinib.

10. Processo de tratamento de um paciente com câncer identifi- cado através de um processo das reivindicações 1 até 6 que compreende a administração de um inibidor de EGFR ao paciente.

11. Processo da reivindicação 10, em que o inibidor de EGFR é erlotinib.

12. Processo da reivindicação 10 ou 11, em que o câncer é NS- CLC.