KR101169246B1 - Ｅｇｆｒ 저해제 치료에 대한 예측 마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 환자에서 EGFR 저해제 치료에 대한 임상적 유익을 예측하는 바이오마커를 제공한다.

Description

ＥＧＦＲ 저해제 치료에 대한 예측 마커 {PREDICTIVE MARKER FOR EGFR INHIBITOR TREATMENT}
본 발명은 암 환자에서 EGFR 저해제 치료에 대한 임상적 유익을 예측하는 바이오마커를 제공한다.
다수의 인간 악성종양이 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 의 일탈 또는 과발현과 연관되어 있다. EGF, 형질전환 성장 인자-α (TGF-α) 및 다수의 기타 리간드가 EGFR 에 결합하여, 수용체의 세포내 티로신 키나아제 도메인의 자가인산화를 자극한다. 여러가지 세포내 경로들이 후속하여 활성화되며, 이들 하류방향 사건들은 시험관내 종양 세포 증식을 초래한다. EGFR 을 통한 종양 세포의 자극이 생체내 종양 성장 및 종양 생존의 두 가지 모두에 중요할 수 있다는 것은 기정사실화되었다.
EGFR 티로신 키나아제의 저해제인 TarcevaTM 를 이용한 초기의 임상 데이터는, 그 화합물이 안전하며, 표적으로 하는 유효 농도를 제공하는 투여량 (전임상 데이터로 결정됨) 에서 일반적으로 만족스럽게 용인된다는 것을 나타낸다. 진행된 질환을 가진 환자에서의 임상 I 상 및 II 상 시험은, TarcevaTM 가 일정 범위의 상피 종양에서 유망한 임상 활성을 갖는다는 것을 증명했다. 실제로, TarcevaTM 가 사전에 치료받은 두경부암 및 NSCLC (비-소세포 폐암) 환자에서 확립된 2 차 화학요법과 비슷한 정도의 지속적인 부분적인 차도를 유도할 수 있으면서도, 화학요법보다 더 나은 안전성 프로파일 및 개선된 편의성 (정맥내 [i.v.] 투여 대신 정제) 의 장점이 추가된 것으로 나타났다. 최근 완결된, 무작위적인 이중맹검 위약 통제 시험 (BR.21) 은, 진행된 질환에 대한 표준 요법이 실패한 NSCLC 환자의 생존을 단일 약제 TarcevaTM 가 현저하게 연장시키고 개선시킨다는 것을 보여주었다.
TarcevaTM (엘로티닙; erlotinib) 는 소형 화학 분자이다; 이는 경구활성인, 강력하고 선택적인 EGFR 티로신 키나아제 저해제 (EGFR-TKI) 이다.
폐암은 북미 및 유럽에서 암 관련한 사망의 주된 요인이다. 미국에서, 폐암에 부차적인 사망자 수는, 두번째 (대장암), 세번째 (유방암) 및 네번째 (전립선암) 주요 암 사망 원인을 총합한 사망자 수를 능가한다. 전체 폐암의 약 75% 내지 80% 이 NSCLC 이며, 환자들 중 약 40% 는 국소적으로 진행되고/되거나 수술로 치유불가능한 질환을 나타내고 있다. 이러한 군에는 전형적으로 악성 흉수를 제외한, 종양의 부피가 큰 IIIA 기 및 IIIB 기 질환을 가진 이들이 포함된다.
유럽 연합에서, 폐암의 대략적인 발생율은 매 년 100,000 명당 52.5 명이며, 사망율은 48.7　명이다. 남성들 중에서는 상기 비율이 각각 79.3 및 78.3 이며, 여성들 중에서는 상기 비율이 21.6 및 20.5 이다. NSCLC 은 전체 폐암 사례의 80% 를 차지한다. 남성 폐암 사망의 약 90% 및 여성 폐암 사망의 80% 는 흡연이 원인이다.
US 에서, 미국 암 학회에 따르면, 2004 년 동안, 약 173,800 건의 신규한 폐암 발병 (남성 93,100 건, 여성 80,700 건) 이 있었으며, 이는 모든 신규한 암 발병의 약 13% 를 차지했다. 대부분의 환자들은 진단 후 2 년 내에 그 질환의 결과로 사망한다. 다수의 NSCLC 환자에 있어서, 성공적인 치료는 찾기 힘든 것으로 남아있다. 진행된 종양은 종종 수술로도 치료불가능하며, 용인가능한 투여량의 방사선요법 및 화학요법에도 내성을 띄게 될 수 있다. 무작위적인 시험에서, 현재 가장 활성인 병용 화학요법은 약 30% 내지 40% 의 반응율을 달성하였으며, 1 년 생존율은 35% 내지 40% 이었다. 이는 실지로 단독적인 보존적 치료에서 나타나는 10% 의 1 년 생존율을 능가하는 것이다.
최근까지, 재발한 환자에 대한 치료 선택폭은 최선의 보존적 치료 또는 일시적 완화로 제한되어 있었다. 도세탁셀 (Taxotere) 과 최선의 보존적 치료를 비교한 최근의 시험은, NSCLC 환자가, 시스플라틴 기반의 1 차 항암요법이 실패한 후, 2 차 화학요법으로 유익을 얻을 수 있다는 것을 보여주었다. 모든 연령대의, ECOG 활동도 (performance status) 가 0, 1, 또는 2 인 환자들에서, 사전의 백금-기반의 치료로는 치료가 어려웠던 이들에서처럼, 도세탁셀의 이용으로 생존이 개선되었음이 증명되었다. 치료로 유익을 얻지 못한 환자들에는, 10% 이상의 체중 손실이 있거나, 락테이트 데히드로게나아제 수준이 높거나, 다발성 장기 침범 또는 간 침범이 있는 이들이 포함되었다. 추가적으로, 도세탁셀 단독요법의 장점은 2 차 항암치료 설정을 넘어서진 못했다. 3 차 이상의 항암치료로서 도세탁셀을 수용한 환자들은 생존의 연장을 나타내지 않았다. 단일 약제 도세탁셀은 NSCLC 에 대한 표준 2 차 항암요법이 되었다. 최근, NSCLC 의 2 차 항암요법에서 또 다른 무작위적인 III 상 시험에서는 페메트렉세드 (Alimta
Figure 112010009656393-pct00001
) 와 도세탁셀이 비교되었다. 페메트렉세드를 이용한 치료는 임상적으로 동등한 효능을 도출했으나, 부작용이 도세탁셀보다 훨씬 더 적었다.
개별화된 암 치료 방법 개발에 대한 필요가 있음은 오래 전부터 인정되어 왔다. 목표로 삼은 암 치료법을 개발하면서, 종양 표적의 분자적인 프로파일 (즉, 임상적 유익에 대한 예측이 되는 것) 을 제공할 수 있는 방법론이 특별한 관심대상이 되었다. 암에서의 유전자 발현 프로파일에 대한 원리 증명은, 현재의 형태학적 및 면역조직화학적 시험을 기반으로 해서는 명확하지 않은 종양 유형의 분자적 분류로서 이미 확립되어 있다. 유전자 발현 프로파일링을 이용하여, 현재의 단일 분류의 미만성 대형 B-세포로부터 상이한 예후를 가진 두 개의 별개의 질환 실체를 구별하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 암 환자에서의 EGFR 저해제 치료에 대한 임상적 유익을 예측하는 발현 바이오마커를 제공하는 것이다.
첫번째 목적에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, EGFR 저해제를 이용한 치료에 대한 암 환자의 임상적 유익을 예측하는 시험관내 방법을 제공한다: 환자의 종양 시료에서 PTPRF 유전자의 발현 수준을 측정하고, 상기 PTPRF 유전자의 발현 수준을 상기 치료로부터 임상적 유익을 얻지 못하는 환자 집단의 종양에서의 PTPRF 유전자의 발현 수준을 대표하는 값과 비교하는 단계로서, 이 때, 상기 환자의 종양 시료에서의 PTPRF 유전자의 발현 수준이 더 높은 것은 상기 치료로부터 임상적 유익을 얻게 될 환자에 대한 지표가 되는 단계.
약어 PTPRF 는 단백질 티로신 포스파타제, 수용체 유형 F 를 의미한다. 서열번호 1 은 인간 PTPRF, 전사 변형체 1 의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, 서열번호 2 는 인간 PTPRF 전사 변형체 2 의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
용어 "상기 치료로부터 임상적 유익을 얻지 못하는 환자 집단의 종양에서의 PTPRF 유전자의 발현 수준을 대표하는 값"이란 상기 치료로부터 임상적 유익을 얻지 못하는 환자 집단에서의 PTPRF 유전자의 평균 발현 수준에 대한 계산치를 말한다. 임상적 유익은 12 주 이상 동안 치료 반응 (objective response) 또는 질환 안정화 (disease stabilization) 중 하나를 갖는 것으로 정의되었다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 PTPRF 유전자는, 상기 치료로부터 임상적 유익을 얻지 못하는 환자 집단을 대표하는 값과 비교하여, 환자의 종양 시료에서 1.1 내지 1.8 배, 바람직하게는 1.1 내지 1.6 배 이상 더 높은 발현 수준을 나타낸다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 PTPRF 유전자는, 상기 치료로부터 임상적 유익을 얻지 못하는 환자 집단을 대표하는 값과 비교하여, 환자의 종양 시료에서 1.2 내지 1.8 배 이상 더 높은 발현 수준을 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 상기 마커 유전자의 발현 수준은 마이크로어레이 기법 또는, 정량 RT-PCR 처럼 RNA 발현 수준을 평가하는 기타 기법으로, 또는 각각의 단백질의 발현 수준을 관찰하는 임의의 방법, 예를 들어 면역조직화학법 (IHC; immunohistochemistry) 으로 측정한다. 유전자칩의 구축 및 이용은 당업계에 익히 공지되어 있다. U. S. 특허 제 5,202,231 호; 제 5,445,934 호; 제 5,525,464 호; 제 5,695,940 호; 제 5,744,305 호; 제 5,795,716 호 및 제 5,800,992 호를 참조하라. 또한, 문헌 [Johnston, M. Curr. Biol. 8:R171-174 (1998)]; [Iyer VR 등, Science 283:83-87 (1999)] 을 참조하라. 물론, 유전자 발현 수준은 당업자에게 공지된 기타 방법, 예를 들어 노던 블롯, RT-PCR, 실시간 정량 PCR, 프라이머 신장, RNase 보호, RNA 발현 프로파일링으로 측정될 수 있다.
본 발명의 마커 유전자는 다른 바이오마커와 조합되어 바이오마커 세트로 될 수 있다. 바이오마커 세트는 암 환자에서의 EGFR 저해제 치료의 효과에 대한 예측을 위한 예측 바이오마커들의 임의의 조합으로부터 성립될 수 있다. 본원에 기술되는 바이오마커 및 바이오마커 세트는, 예를 들어, 어떻게 암 환자가 EGFR 저해제를 이용한 치료적 중재에 반응할 것인지를 예측하는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "유전자" 라는 용어는 유전자의 변이체를 포함한다. "변이체" 라는 용어는 GenBank 접근 번호로 주어진 핵산 서열과 실질적으로 유사한 핵산 서열에 관한 것이다. "실질적으로 유사한" 이라는 용어는 당업자에게는 익히 이해되는 것이다. 특히, 유전자 변이체는 인간 집단 내에서 가장 우세한 대립유전자의 핵산 서열과 비교하여 뉴클레오티드 교환을 보이는 대립유전자일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 실질적으로 유사한 핵산 서열은 가장 우세한 대립유전자에 대해 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 유사성을 갖는다. "변이체" 라는 용어는 또한 스플라이스 (splice) 변이체에 관한 것을 의미한다.
EGFR 저해제는 게피티닙, 엘로티닙, PKI-166, EKB-569, GW2016, CI-1033 및 항-erbB 항체, 예컨대 트라스투주맙 및 세툭시맙으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 구현예에서, EGFR 저해제는 엘로티닙이다.
또 다른 구현예에서, 암은 NSCLC 이다.
본 발명에 의해 기재되는 유전자의 유전자 발현 검출 및 정량 기술에는 노던 블롯, RT-PCR, 실시간 정량 PCR, 프라이머 확장, RNase 보호, RNA 발현 프로파일링 및 관련 기술이 포함되나 이들에 제한되는 것은 아니다. 이러한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 [Sambrook J 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 3 판 (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 2000)] 를 참조한다.
본 발명에 의해 기재되는 각 유전자의 단백질 발현 검출 기술에는 면역조직화학법 (IHC) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, 종양 또는 암 생검과 같은 환자 조직 시료로부터의 세포를 분석하여, 하나 이상의 바이오마커의 발현 패턴을 측정할 수 있다. 암 치료의 성공 또는 실패는, 종양 또는 암 생검과 같은 시험 조직으로부터의 세포 (시험 세포) 의 바이오마커 발현 패턴이, 하나 이상의 바이오마커의 대조군 세트의 발현 패턴과 비교적 유사 또는 상이한가에 근거해 결정될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, EGFR 저해제 치료로부터 임상적 유익을 얻지 못한 환자의 종양과 비교하여 EGFR 저해제 치료로부터 임상적 유익을 얻은 환자의 종양에서는, 표 3 의 유전자가 상향조절된 것, 즉 보다 높은 발현 수준을 보인다는 것을 발견하였다. 따라서, 시험 세포가 암 치료에 반응하였던 환자의 바이오마커 발현 프로파일에 상응하는 바이오마커 발현 프로파일을 보이는 경우, 개체의 암 또는 종양이 EGFR 저해제로의 치료에 바람직하게 반응할 것으로 예상되거나 그러할 가능성이 높다. 반대로, 시험 세포가 암 치료에 반응하지 않았던 환자의 바이오마커 발현 패턴에 상응하는 바이오마커 발현 패턴을 보이는 경우, 개체의 암 또는 종양이 EGFR 저해제로의 치료에 반응하지 않을 것으로 예상되거나 그러할 가능성이 높다.
본 발명의 바이오마커, 즉 표 3 에 열거된 유전자는 암 환자들, 특히 난치성 NSCLC 를 가진 환자들에 대한 맞춤 치료 (individualized therapy) 를 향한 첫 단계이다. 상기 맞춤 치료는 진료 의사가 암 치료, 특히 NSCLC 에 있어서 기존의 약물들 중 가장 적절한 제제를 선별할 수 있게 할 것이다. 미래의 각 환자에 대한 맞춤 치료의 유익은 다음과 같다: 반응률 / 유익을 얻는 환자의 수가 증가할 것이고, 효과가 없는 치료로 인한 유해한 부작용의 위험성이 감소할 것이다.
추가 목적에서 본 발명은 본 발명의 시험관 내 방법에 의해 확인된 암 환자를 치료하는 치료 방법을 제공한다. 상기 치료 방법은 표 3 의 유전자의 예측 발현 패턴에 근거해 치료하기로 선택된 환자에게 EGFR 저해제를 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 EGFR 저해제는 엘로티닙이고, 바람직한 치료 대상 암은 NSCLC 이다.
도 1 은 연구 설계를 보여준다;
도 2 는 시료 처리 과정에 대한 도식을 보여준다;
도 3a 는 PTPRF 발현 수준 대 Genechip® 프로파일링에 대한 임상 결과를 보여준다;
도 3b 는 PTPRF 발현 수준 대 qRT-PCR 에 대한 임상 결과를 보여준다;
도 3c 는 PTPRF 에 대한 Genechip® 과 qRT-PCR 측정치 사이의 상관 관계를 보여준다.
실험부
연구에 대한 근거 및 연구 설계
최근 NSCLC 환자의 하위집합의 종양 조직 내의 EGFR 유전자에서의 돌연변이 및, 엘로티닙 및 게피티닙에 대한 감수성을 가진 이러한 돌연변이의 연관성이 기재되었다(Pao W, 등 2004; Lynch 등 2004; Paez 등 2004). 2 가지 연구에서의 환자들을 조합해 보면, 돌연변이된 EGFR 은 게피티닙에 반응을 보였던 환자 14 명 중 13 명에서 관찰되었고, 반응을 보이지 않았던 11 명의 게피티닙-처치된 환자에서는 관찰되지 않았다. 이들 돌연변이의 보고된 유병율은 미선별된 NSCLC 환자 중 8% (25 명중 2 명) 에 달했다. 이들 돌연변이는 선암 (21%), 여성으로부터의 종양 (20%), 및 일본인 환자로부터의 종양 (26%) 에서 더욱 빈번히 발견되었다. 이들 돌연변이는 EGFR 의 시험관 내 활성 증가 및 게피티닙에 대한 감수성 증가를 초래하였다. 돌연변이와 장기적으로 안정된 질환 또는 생존 기간과의 관계는 유망하게 평가되지는 않았다.
BR.21 연구로부터의 예비 분석에 근거하여, 심지어 치료 반응 (objective response) 을 보이는 환자를 분석에서 제외시킨 경우에도 유의한 생존 유익이 유지되기 때문에, 관찰되는 생존 유익은 오직 EGFR 돌연변이로 인한 것 같이 보이지 않는다(자료 보관됨). 기타 분자 메커니즘도 또한 효과에 기여해야만 한다.
Tarceva™ 처리에 대한 반응/이익을 예측하는 유전자 발현 수준의 변화가 있다는 가정하에, 마이크로어레이 분석을 사용하여 이들 변화를 측정하였다.
이를 위해서는 1 차 치료의 실패 후 Tarceva™ 단일요법으로 치료된 명확하게 정의된 연구 집단이 필요하였다. BR.21 연구로부터의 실험에 근거하여, 유익을 얻은 집단을, 치료 반응, 또는 12 주 이상 동안의 질환 안정화를 가진 것으로서 정의하였다. 임상 및 마이크로어레이 데이터 집합을 미리 규정된 통계 계획에 따라 분석하였다.
이 기술을 적용하기 위해서는 신선한 동결 조직 (FFT; fresh frozen tissue) 이 필요하다. 따라서, 치료 시작 전에 의무적인 생검을 실시해야만 한다. 수집된 물질을 액체 질소 (N2) 에서 동결시켰다.
동시에 두번째 종양 시료를 수집하고, 파라핀 중에 보관하였다(포르말린 고정 파라핀 포매: FFPE; formalin fixed paraffin embedded). 상기 시료를 분석하여 EGFR 신호전달 경로에서의 변경에 대해 조사하였다.
기관지경술을 통한 종양 생검을 실시하는 역량이 본 연구를 위한 전제 조건이었다. 기관지경술은 폐암 진단을 확인하기 위한 표준 절차이다. 일반적으로 안전하지만, 출혈과 같은 합병증의 위험이 남아있다.
본 연구는 난치성 NSCLC 을 가진 환자들에 대한 맞춤 치료를 향한 첫 단계였다. 상기 맞춤 치료는 진료 의사가 상기 징후에 대해 기존의 약물들 중 가장 적절한 제제를 선별할 수 있게 할 것이다.
일단 맞춤 치료가 가능해지면, 미래의 각 환자에 대한 유익은 현재의 연구에서 환자들이 감수해야 하는 위험을 능가할 것이다:
ㆍ반응률 / 유익을 얻는 환자의 수가 증가할 것이고,
ㆍ효과가 없는 치료로 인한 유해한 부작용의 위험성이 감소할 것이다.
투여량 선택에 대한 근거
TarcevaTM 를 질병 진행, 용인불가한 독성 또는 사망시까지 150 mg 의 투여량으로 1 일 1 회 경구 투여하였다. 상기 투여량에 대한 선택은 약동학적 변수, 및 사전-치료를 과도히 받은 진행암 환자들에서 제 I, II 및 III 상 시험에서 관찰된 상기 투여량의 안전성 및 내약성 프로파일을 기초로 하였다. 150　mg/일 투여량을 받은 암 환자들의 혈장에서 나타난 약물 수준은 임상적 효능을 목적으로 하는 500　ng　/　ml 의 평균 혈장 농도보다 높은 수준으로 일정했다. BR.21 은, 상기 투여량에 의한 생존 유익을 보여주었다.
연구의 목적
이의 일차적 목적은 TarcevaTM 치료의 유익 (CR, PR 또는 SD ≥ 12 주) 에 대한 예측이 되는 차등 발현 유전자들을 규명하는 것이었다. TarcevaTM 치료에 대한 "반응" (CR, PR) 을 예측하는 차등 발현 유전자들의 규명은 중요한 추가적인 목적이었다.
부차적인 목적은, 치료를 통한 유익에 관해서, EGFR 신호전달 경로에서의 변화를 평가하는 것이었다.
연구 설계
연구 설계 및 투여 방법에 대한 개관
이는 공개 (open-label) 예측 마커 규명 제 II 상 연구였다. 본 연구는 약 12 개국의 대략 26 개 지역에서 수행되었다. 1 가지 이상의 사전 화학요법이 실패한 진행 NSCLC 를 가진 264 명의 환자를 12 개월의 기간에 걸쳐 등록시켰다. 지속적 경구 TarcevaTM 를 150　mg/일의 투여량으로 투여하였다. 약물 요법에 대한 내약성에 기초하여 투여량 감소를 허용하였다. 질병 제어 및 독성을 평가하기 위해 임상 및 실험 변수들을 평가하였다. 치료는 질병 진행, 허용불가능한 독성 또는 사망시까지 계속되었다. 당해 연구 설계는 도 1 에 나타나 있다.
분자적 분석을 위해 종양 조직 및 혈액 시료를 수득하여, TarcevaTM 의 효과를 평가하고 치료를 통해 유익을 얻는 환자들의 하위군을 규명하였다.
예측 마커 평가
종양 생검들은 치료 시작 전 2 주 내에 취하였다. 2 가지의 상이한 시료들을 채취하였다:
첫번째 시료는 항상 액체 N2 중에 즉시 동결시켰다.
두번째 시료는 포르말린 중에 고정시킨 후 파라핀 중에 포매시켰다.
즉시 동결 조직은 본 연구에서 가장 높은 우선순위를 가졌다.
도 2 는 시료 처리 과정에 대한 도식을 보여준다.
마이크로어레이 분석
종양 RNA 및 종양 주변 조직으로부터의 RNA 를 추출하기 위한 종양 세포의 레이저 포획 미세절단 (laser capture microdissection; LCM) 에 상기 즉시 동결 시료를 사용하였다. 상기 RNA 를 Affymetrix 마이크로어레이 칩 (HG-U133A) 상에서 분석하여 상기 환자들의 종양 유전자 발현 프로파일을 확립하였다. Affymetrix 칩의 품질 관리 (Quality Control) 를 이용하여 통계학적 비교를 위한 적절한 품질의 시료들을 선택하였다.
포르말린 고정된 파라핀 포매 조직에 대한 단일 바이오마커 분석
상기 두번째 종양 생검인 FFPE 시료를 이용하여, DNA 변이유발, IHC 및 ISH 분석을 하기 기술된 바와 같이 수행하였다. 초기 진단시 수집된 조직에 대해서도 유사한 분석을 수행하였다.
EGFR 및 EGFR 신호전달 경로에 관여하는 기타 분자들을 인코딩하는 유전자의 DNA 변이유발 상태를 DNA 서열분석을 이용하여 분석하였다. EGFR 및 관련 유전자들에 대한 유전자 증폭은 FISH 로 연구되었다.
단백질 발현 분석에는 EGFR 및 EGFR 신호전달 경로 중의 기타 단백질에 대한 면역조직화학 [IHC] 분석이 포함되었다.
반응 평가
RECIST (Uni-dimensional Tumour Measurement) 기준을 이용하여 반응을 평가하였다. 상기 기준은 하기 링크에서 찾아볼 수 있다: http://www.eortc.be/recist/
다음을 주의해야 한다:
CR 또는 PR 의 상태로 규정하기 위해서는, 상기 치료 기간 중의 임의의 시점과는 적어도 4 주 떨어진 시점에서의 반복 평가에 의해 종양 크기의 변화가 확인되어야 한다.
SD 의 경우, 후속적인 측정치가 연구 시작 후 최소 6 주의 간격으로 1 회 이상 SD 기준을 충족해야 한다.
SD 유지의 경우, 후속적인 측정치가 연구 시작 후 1 회 이상 12 주 이상의 지속 기간에 걸쳐 SD 기준을 충족해야 한다.
생존 평가
환자가 진료소로 방문하거나 또는 전화를 이용하여 3 개월마다 정기적인 상태 점검을 수행하였다. 모든 사망을 기록하였다. 연구의 말미에 각 환자에 대해 최종적 생존 확인을 요청하였다.
방법
RNA 시료 조제 및 RNA 시료에 대한 품질 관리
모든 생검 시료 처리는 병리학 표준 실험실에서 다루어졌다; 신선한 동결 조직 시료는 조사기관 지역에서 Roche Basel 의 Clinical Sample Operations 시설로 수송되었고, 추가적인 처리를 위해 거기에서 상기 병리학 실험실로 수송되었다. 레이저 포획 미세절단을 이용하여 주변 조직으로부터 종양 세포를 선별하였다. LCM 후, 상기 종양 풍부 물질로부터 RNA 를 정제하였다. 상기 병리학 실험실은 그 후 상기 RNA 의 농도 및 품질에 대한 추정을 위한 일련의 단계를 수행하였다.
RNase는 RNA 분해 효소로서, 도처에서 발견되고, 따라서 RNA 가 사용될 모든 절차는 RNA 분해를 최소화하도록 엄격히 조절되어야만 한다. 대부분의 mRNA 종 자체는 다소 짧은 반감기를 가지며, 따라서 상당히 불안정한 것으로 여겨진다. 따라서, 임의 검정 전에 RNA 완전성 체크 및 정량을 수행하는 것이 중요하다.
RNA 농도 및 품질 프로파일은 2100 Bioanalyzer
Figure 112010009656393-pct00002
로 불리는 Agilent 기기 (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA) 를 사용하여 평가할 수 있다. 기기 소프트웨어는 정량 추정치인 RNA 완전성 번호 (RIN) (Schroeder, A., 등, The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol, 2006. 7: p.3) 를 생성하고, 총 RNA 시료의 리보솜 비율을 계산한다. RIN 은 RNA 시료의 전체 전기영동적 추적으로부터 측정되며, 이에는 분해 생성물의 존재 또는 부재가 포함된다.
RNA 품질은 2100 Bioanalyzer
Figure 112010009656393-pct00003
로 분석하였다. Affymetrix 플랫폼 상에서의 추가적 분석을 위해, 충분한 RNA 및 첨가된 폴리-I 노이즈 초과의 하나 이상의 rRNA 피크를 갖는 시료만을 선택하였다. 마이크로어레이에 의한 분석을 위해, 정제된 RNA 를 Roche Centre for Medical Genomics (RCMG; Basel, Switzerland) 로 보냈다. 추가적인 처리를 위해 병리학 실험실로부터 122 개의 RNA 시료를 받았다.
조직 RNA 시료의 표적 표지
제조업자의 지시사항에 따른 것으로서, Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, California) 로부터의 2-사이클 표적 표지 증폭 프로토콜에 따라 표적 표지를 실시하였다.
상기 방법은 표준 Eberwine 선형 증폭 방법을 기초로 하지만, 마이크로어레이에 대한 혼성화를 위해 충분히 표지된 cRNA 가 생성되도록 상기 방법의 두 사이클을 사용한다.
표지 반응에서 사용된 총 RNA 투입량은, 10 ng 초과의 RNA 가 활용가능한 경우 이들 시료에 대해 10 ng 이었고; 상기 양 미만이 활용가능하거나 또는 활용가능한 양적 데이터가 없는 경우 (매우 낮은 RNA 농도로 인해), 총 시료의 절반을 반응에 사용하였다. 표지 반응으로부터의 수율은 20 ~ 180 μg cRNA이었다. 모든 시료에 대해 15 μg cRNA 가 사용된 혼성화의 수준에서 표준화 단계를 도입하였다.
인간 표준 RNA (Human Reference RNA; Stratagene, Carlsbad, CA, USA) 를, 시료 각각의 뱃치 (batch) 로의 작업량 내에서 대조군 시료로서 사용하였다. 10 ng의 상기 RNA를 시험 시료과 함께 투입물로서 사용하여, 표지 및 혼성화 시약이 예측한 바와 같이 작용하는지 확인하였다.
마이크로어레이 혼성화
Affymetrix HG-U133A 마이크로어레이는 약 14,500 개의 충분히 분석된 유전자를 나타내는 약 18,400 개의 전사체 및 변이체를 표적으로 하는 22,000 개 초과의 프로브 집합을 포함한다.
Affymetrix 지시사항 (Affymetrix Inc., Expression Analysis Technical Manual, 2004) 에 따라 모든 시료에 대한 혼성화를 수행하였다. 간략하게는, 각각의 시료에 대해, 15 μg의 비오틴-표지된 cRNA 를 2 가 양이온의 존재 하 및 가열 하에 절편화하고, Affymetrix HG-U133A 전체 게놈 올리고뉴클레오티드 어레이에 대해 하룻밤 동안 혼성화하였다. 다음날 어레이를 제조업자의 지시사항에 따라 스트렙타비딘-피코에리트린 (Molecular Probes; Eugene, OR) 으로 염색하였다. 이후 GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix) 을 사용하여 어레이들을 스캐닝하고, GeneChip Operating Software (GCOS) 버전 1.4 (Affymetrix) 로 신호 강도를 자동으로 계산하였다.
통계적 분석
AffymetrixTM 데이터 분석은 5 개 주요 단계로 구성되었다.
단계 1 은 품질 관리였다. 목표는 하위-표준 품질 프로파일을 갖는 어레이 데이터를 확인하고 분석에서 제외시키는 것이었다.
단계 2 는 전-처리 및 표준화였다. 목표는 칩 간 비교되어야 할 표준화 및 스케일링된 "분석 데이터 집합"을 생성하는 것이었다. 이는 배경 노이즈 추정 및 감산, 프로브 요약 및 스케일링을 포함하였다.
단계 3 은 탐색 및 기술이었다. 목표는 변동성의 원천 및 잠재적 편의 (bias) 를 확인하는 것이었다. 이는 다변량 및 단변량 기술적 분석 기법을 적용하여 영향력 있는 공변량을 확인하는 것으로 이루어졌다.
단계 4 는 모델링 및 시험이었다. 목표는 "임상적 유익" 및 "무(無) 임상적 유익" 환자 간의 평균 발현 수준에서의 차이에 대한 통계적 평가를 기준으로 후보 마커의 목록을 밝혀내는 것이었다. 이는 각각의 프로브-집합에 대해 적절한 통계적 모델을 맞추고 통계적 유의성의 척도를 도출하는 것으로 이루어졌다.
단계 5 는 완건성 (robustness) 분석이었다. 이의 목표는 상기 전처리 방법 및 통계학적 가정에 크게 좌우되지 않는 적격 후보 마커들의 목록을 생성하는 것이었다. 이는 상이한 방법론적 접근을 이용한 분석을 반복하여 후보들의 목록과 교차시켜보는 것으로 이루어졌다.
모든 분석은 R 소프트웨어 패키지를 이용하여 수행되었다.
단계 1: 품질 관리
데이터 품질의 평가는 여러 매개변수를 조사한 것을 기준으로 하였다. 이들에는 표준 Affymetrix GeneChipTM 품질 매개변수, 특히 스케일링 인자, 현존 호출 % (Percentage of Present Call) 및 평균 배경이 포함되었다. 당해 단계에는 또한 국지적 혼성화 문제점을 검출하기 위한 가상 칩 영상의 시각적 검사, 및 중간 거동으로부터의 임의의 비정상적 이탈을 검출하기 위해, 각각의 칩을 가상 중간 칩에 대해 비교하는 것이 포함되었다. 또한 칩 간 상관관계 분석을 수행하여 특이점 (outlier) 시료를 검출하였다. 또한, Agilent BioanalyzerTM 2100으로 RNA 시료를 분석하여 수득한 RNA 품질의 부수적 측정치를 고려하였다.
이들 매개변수를 기준으로, 20 개 어레이로부터의 데이터를 분석에서 제외시켰다. 따라서 102 명 환자를 나타내는 총 102 개 어레이로부터의 데이터를 분석에 포함시켰다. 이들 102 개 시료 집합에 대한 임상적 기술을 하기 표 1에 보고하였다.
분석에 포함된 환자들의 임상적 특징에 대한 기술
변수 값 n = 102
n (%)
최상의 반응


 N/A 16 (15.7%)
PD 49 (48.0%)
SD 31 (30.4%)
PR 6 (5.9%)
임상적 유익
 없음 81 (79.4%)
있음 21 (20.6%)
성별
 여성 25 (24.5%)
남성 77 (74.5%)
인종
 백인 65 (63.7%)
동양인 37 (36.3%)
조직학

 선암 35 (34.3%)
편평 53 (52.0%)
기타 14 (13.7%)
흡연 경험
 없음 20 (19.6%)
있음 82 (80.4%)
단계 2: 데이터 전-처리 및 표준화
rma 알고리즘 (Irizarry, R.A., 등, Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data. Nucl. Acids Res., 2003. 31(4): p. e15) 을 전-처리 및 표준화에 사용하였다. mas5 알고리즘 (AFFYMETRIX, GeneChip
Figure 112010009656393-pct00004
Expression: Data Analysis Fundamentals. 2004, AFFYMETRIX)을, 개별적 프로브-집합에 대한 검출 호출을 만드는데 사용하였다. 모든 시료에서의 "부재" 또는 "한계(marginal)"라 칭하는 프로브-집합을 추가적 분석에서 제거하고; 5930 개 프로브-집합을 상기 기준에 기초하여 분석에서 제거하였다. 따라서 분석 데이터 집합은 102 명 환자에서 측정된 16353개 (22283개 중) 프로브-집합을 갖는 매트릭스로 이루어졌다.
단계 3: 데이터 기술 및 탐색
잠재적 편의 및 변동성의 주요 원천을 규명하기 위해 기술적 탐색적 분석을 수행하였다. 유전자 발현 프로파일에 대해 잠재적 영향을 가진 공변량 집합을 스크리닝하였다. 이는 기술적 및 임상적 변수들을 모두 포함하였다. 기술적 공변량에는 하기가 포함되었다: RNA 처리 (이후, 뱃치 (batch) 로 언급) 날짜, RIN (RNA 품질/완전성의 척도로서의 것), 조작자 및 시료 채취 센터. 임상적 공변량에는 하기가 포함되었다: 조직학적 유형, 흡연 상태, 종양 등급, 활동 점수 (performance score) (Oken, M.M., 등, Toxicity and response criteria of the Eastern Cooperative Oncology Group. Am J Clin Oncol, 1982. 5(6): p. 649-55), 인구통계 데이터, 반응자 상태 및 임상적 유익 상태.
분석 도구에는 단일종속변인 ANOVA 및 주성분 분석이 포함되었다. 이들 각 공변량에 있어서, 각 프로브-집합에 단일종속변인 ANOVA 를 독립적으로 적용하였다.
상기 뱃치 변수의 유의미한 효과가 확인되었다. 실제로, 상기 뱃치 변수는 시료 처리일과 Affymetrix 칩 로트 (lot) 간의 차이점을 포착하였다. 상기 뱃치 변수가 관심 변수들로부터 거의 독립적인 것을 점검한 후에, 뱃치 효과를 문헌 [Johnson, W.E., C. Li, 및 A. Rabinovic, Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostat, 2007. 8(1): p. 118-127] 에 기술된 방법을 이용하여 보정하였다.
뱃치 효과 보정 후의 표준화된 데이터 집합을 이후의 분석에서 분석 데이터 집합으로 이용하였다.
기술적 분석으로 강조된 2 가지 추가적으로 중요한 변수들은 조직학 및 RIN 이었다.
단계 4: 데이터 모델링 및 시험
선형 모델을 각각의 프로브-집합에 대해 독립적으로 맞추었다. 모델에 포함되는 변수를 표 2에 나타내었다. 최대우도 추정법 기술 (maximum likelihood technique)로 모델 매개변수를 추정하였다. "임상적 유익" 변수 (X1) 에 상응하는 매개변수를 사용하여 임상적 유익을 갖는 환자군과 임상적 유익이 없는 환자군 사이의 발현 수준 차이를 평가하였다.
선형 모델에 포함된 변수들에 대한 설명
변수 유형 값
유전자 발현 의존적 (Yip) 환자 p에서의 프로브-집합 i의 log2 강도
절편 (Intercept) 전체 평균 (μ)
임상적 유익 관심 예측자 (X1) 있음/없음
조직학 조정 공변량 (X2) 선암/편평/기타
인종 조정 공변량 (X3) 동양인/백인
성별 조정 공변량 (X4) 여성/남성
RIN 조정 공변량 (X5) [2,...,7.9]
흡연자 조정 공변량 (X6) 현재/과거/무경험
단계 조정 공변량 (X7) 수술불가.III/IV
각각의 프로브-집합 i에 대해, 통계적 시험의 목표는, 표 2에 열거한 기타 조정 공변량을 고려하여, 임상적 유익을 갖는 환자 및 임상적 유익을 갖지 못한 환자에서의 평균 발현 수준이 동등하다는 가설을 거부하는 것이었다. 공식적으로, 동등성의 무효적 가설을 두 측면의 대안에 대해 시험하였다. 무효적 가설 하에서, 본 시험에 대한 t 통계량의 분포는 자유도 92 의 Student t 분포를 따른다. 상응하는 p-값을 표 3에 나타내었다.
두 가지 이유로 선형 모델을 선택하게 되었다. 첫째로, 선형 모델은 다목적적이고 충분히 분석되어 있는 견실한 접근법이어서, 관심 변수의 영향을 추정할 때 혼동 변수가 조정되도록 한다. 둘째로, 표본 크기가 102 이고, 데이터 집합이 표준화 및 스케일링된 것으로 가정하면, 상기 정규 분포 가정은 합리적이고 정당하였다.
각각의 프로브-집합에 대해, 잔류 모델을 기준으로 플리그너-킬린 (Fligner-Killeen) 시험을 사용하여 분산의 동일성 가정을 평가하였다. 분석은 하기 3개 단계로 이루어졌다:
1. 잔차 분산의 동일성에 대해 각각의 범주별 변수를 시험하는 단계,
2. 최소 p-값을 갖는 변수 V에 주목하는 단계, 및
3. 최소 p-값이 0.001 미만인 경우, 상이한 수준의 변수 V가 상이한 분산을 갖도록 모델을 다시 맞추는 단계.
단계 5: 완건성
완건성 분석의 목표는 분석의 결과가 전-처리 단계 또는 통계적 분석의 기저가 되는 가정의 결과로서 인위적일 수 있는 위험성을 감소시키는 것이었다. 하기의 세 가지 측면이 고려되었다: a) 품질 관리 단계에서의 몇몇 여분의 칩의 포함 또는 제외; b) 전-처리 및 정규화 알고리즘; c) 통계적 가정 및 시험 접근법.
후보 마커의 목록은, 상이한 분석 설정에서 유의한 것으로서 일관적으로 표명된 유전자의 하위집합으로 정의하였다. 적용된 상이한 분석 옵션은 하기와 같다:
a) 보다 엄격한 품질 관리 기준에 기초하여 8 개 칩의 추가적인 하위집합을 규명하였다. 이들 8 개 칩을 제외시킴으로써 "감소된 데이터 집합"을 정의하였다.
b) 전-처리 및 정규화용 rma 에 대한 대안물로서 MAS5 를 규명하였다. MAS5 는 배경 추정, 프로브 요약 및 정규화에 대해 상이한 방법을 사용한다.
c) 2 가지의 부가적인 통계학적 검정을 사용하였다.
a. 임상적 및 무(無)임상적 유익 사이의 차이에 대한 윌콕슨 (wilcoxon) 검정 및
b. 임상적 유익을 응답 변수로서 하고 유전자 발현을 공변량으로서 하는 로지스틱 회귀 모델을 검정하는 우도비 검정 (LRT; likelihood ratio test). 이들 2 가지 부가적인 검정은 상이한 집합의 기저의 통계학적 가정에 좌우된다. 각 프로브-집합에 있어서, LRT 는 자유도 1 의 카이-제곱을 따랐다.
요약하면, 2 가지 표본 집합 ("풀 (full)" 데이터-집합 및 "감소 (reduced)" 데이터-집합), 및 2 가지의 전처리된 알고리즘 (mas5 및 rma) 이 고려되었다; 이는 4 가지의 상이한 분석 데이터 집합을 산출하였다. 상기 4 가지의 데이터 집합 각각에, 3 가지의 상이한 통계학적 검정을 적용하였다. 따라서, 각 프로프-집합에 대해, 3 가지 p-값을 계산하였다. 각각의 분석 데이터 집합에서, 복합 기준을 적용하여, 상이하게 조절되는 유전자 목록을 확인하였다. 상기 복합 기준을 다음과 같이 정의하였다: 최대 p-값은 0.05 미만이고, 최소 p-값은 0.001 미만이다. 마커 유전자를 규명하기 위해 기준 1 을 사용하는 완건성 분석으로 PTPRF 가 EGFR 저해제 치료에 대한 예측 마커임을 확인하였다.
표 3: 복합 기준 적용 후 완건성 분석에 기초한 임상적 유익에 대한 유전자 마커.
제 1 열은 프로브-집합의 Affymetrix 확인자이다. 제 2 열은 상응하는 유전자 서열의 GenBank 접근 번호이다. 제 3 열은 상응하는 공식적인 유전자 명칭이다. 제 4 열은 선형 모델로부터 추정한 바의 임상적 및 무(無)임상적 유익 환자 사이의 발현 수준에 있어서의 상응하는 보정 평균 배수 변화이다. 제 5 열은 선형 모델로부터 유도한 바의 임상적 유익 및 무(無)임상적 유익 환자 간의 발현 수준의 차이에 대한 검정에 대한 p-값이다. 제 6 열은 발현 수준에 있어서의 보정 평균 배수 변화에 대한 95% 신뢰 구간이다.
Figure 112010009656393-pct00005
추가의 통계학적 분석
선별된 후보 마커인 PTPRF 에 대해, 독립적인 통계학자에 의해 인증된 환경에서 하기 부가적인 분석을 수행하였다:
? 일차 Affymetrix 분석으로부터의 PFS (Progression free survival: 무진행 생존기간) 에 대한 단변량 콕스 회귀,
? 일차 Affymetrix 분석으로부터의 임상적 유익에 대한 단변량 로지스틱 회귀,
? 일차 Affymetrix 분석으로부터의 생존에 대한 단변량 콕스 회귀.
상기 분석 결과를 하기에 제시한다. 이들은 일차 분석 결과와 일치하며, 선별된 마커 선택을 확인시켜준다.
결과: 일차 Affymetrix 분석으로부터의 PFS (Progression free survival: 무진행 생존기간) 에 대한 단변량 콕스 회귀:
Figure 112010009656393-pct00006
결과: 일차 Affymetrix 분석으로부터의 임상적 유익에 대한 단변량 콕스 회귀:
Figure 112010009656393-pct00007
결과: 일차 Affymetrix 분석으로부터의 생존에 대한 단변량 콕스 회귀:
Figure 112010009656393-pct00008
qRT - PCR
qRT-PCR 을 위한 SuperScriptTM III First-strand Synthesis SuperMix (Invitrogen, CA, USA) 를, 제조업자의 지시사항에 따르되 RNase H 소화물 (digest) 을 포함시키지 않고 사용하여, cDNA 를 합성하였다.
제조업자의 권장사항에 따라 ABI PRISM® 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, CA, USA) 상에서 TaqMan® Gene Expression Assays 를 이용하여 정량 PCR 을 수행하였다. 모든 검정은 3 벌로 수행하였다.
사용된 프라이머 및 프로브는 엑손 경계를 가로지르거나 또는 관심 Affymetrix Genechip® 프로브 서열 내에 존재하였다. 2 가지의 하우스-키핑 (house-keeping) 유전자들이 내인성 대조로서 포함되었다: 베타-2-마이크로글로불린 (B2M; Assay Hs99999907_m1) 및 히포잔틴포스포리보실 트랜스페라제 (HPRT; Assay Hs99999909_m1).
모든 실행에는 보정 시료 (calibrator sample) (성인의 폐로부터의 MVPTM 총 RNA; Stratagene, CA, USA) 및 표준 곡선이 포함되었다. PTPRF 표준 곡선에 대해서는 Universal Human Reference 총 RNA (Stratagene, CA, USA) 를 주형으로 사용하였다. 모든 시료를 3 벌로 측정하였다.
상대 정량은 -ΔCt 방법을 이용하여 수행하였다.
결과
앞서 보고한 바와 같이, 본 연구에 포함된 102 명의 환자에 대해 Affymetrix Genechip® 유전자 발현 프로파일을 결정하였다. 이들 환자 중, 75 명에 대해 qRT-PCR 결과가 수득되었다(표 4). qRT-PCR 결과가 나온 환자들의 인구통계 및 임상적 특징은 전체 집단 (n=264) 및 이용가능한 Genechip® 유전자 발현 프로파일을 가진 환자들과 유사하였다.
치료전 특징들(Baseline characteristics): qRT-PCR 분석된 환자들 (n=75)
특징
연령 (중앙값, 범위) 62 (39-85)
성별; n (%)
남성 19 (25)
여성 56 (75)
ECOG 활동도; n (%)
0 7 (9)
1 45 (60)
2 23 (31)
조직학; n (%)
선암 27 (36)
편평상피세포암종 34 (45)
대세포 암종 2 (3)
기타 12 (16)
질병 단계; n (%)
IIIB 22 (29)
IV 53 (71)
사전 화학요법의 수; n (%)
0 19 (25)
1 36 (48)
≥2 20 (27)
인종; n (%)
백인 51 (68)
아시아인 24 (32)
흡연 경력; n (%)
전혀 없음 12 (16)
현재 흡연중 24 (32)
과거 경험있음 39 (52)
qRT-PCR 결과가 나온 75 명의 환자 중, 4 명 (5%) 은 부분 반응 (PR) 을 나타내었고, 23 명 (31%) 은 SD 를 나타내었고, 39 명 (52%) 은 PD 를 나타내었고, 9 명 (12%) 은 평가가능하지 않았다. 이러한 결과는 전체 연구 집단 (n=264) 에서 관찰된 결과와 매우 유사하였다.
도 3 은 Affymetrix Genechip® 프로파일링 및 qRT-PCR 로 평가된 바 개별 환자들에서 PTPRF 에 대한 상대적 mRNA 수준을 보여준다. 도 3a 는 발현 수준 대 Genechip® 프로파일링에 있어서의 임상 결과를 나타내고, 도 3b 는 qRT-PCR 에 대한 발현 수준을 보여준다.
PTPRF mRNA 전사체에 있어서 Genechip® 및 qRT-PCR 측정치 간에 양호한 상관관계가 있었다(도 3c; 피어슨 (pearson) R=0.76, p<0.01). Genechip® 프로파일링으로 관찰되는 바와 같이, qRT-PCR 을 이용하여 평가된 PTPRF mRNA 수준은 엘로티닙에 대한 반응과 상관관계가 있는 것으로 보였고, 비반응자들에 비해 반응자들에서 더 높은 수준이 관찰되었다.
토의
조직 시료를 고밀도 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 기술을 이용하여 분석하고, 그 데이터에 통계학적 모델링을 적용함으로써, 본 발명자들은 엘로티닙을 이용한 치료로부터 임상적 유익을 얻는 환자를 발현 수준을 통해 예측할 수 있는 유전자를 규명할 수 있었다.
종합적 기준 (상기 정의됨) 을 적용하였다. 그 결과, PTPRF 이 EGFR 저해제 치료에 대한 예측 마커인 것으로 나타났다.
염색체 1p34 상에 위치한 PTPRF 유전자는 단백질 티로신 포스파타제 (PTP) 패밀리의 단백질 구성원을 인코딩한다. 이는 세포외 영역, 단일 막획단 영역, 및 2 개의 직렬 세포질내 촉매활성 도메인을 가지며, 따라서 PTP 수용체-유형을 나타낸다. 상기 세포외 영역은 3 개의 Ig-유사 도메인, 및 9 개의 비(非)-Ig 유사 도메인을 포함하는데, 신경세포 접착 분자의 것과 유사하다.
본 연구에서, PTPRF 는 엘로티닙을 이용한 치료로부터 임상적 유익을 얻는 환자들에서 상대적으로 상향 조절되어 있는 것으로 나타났다. 이러한 발견은, 상이한 중요한 종양형성 기작들에서 상기 유전자의 잠재적 역할을 입증하는 공개된 보고들의 맥락에서 해석될 수 있다.
먼저, EGFR 이 PTPRF 의 기질이라는 것은 명확히 확립되었다. 상세한 조사에서, EGFR 과 PTPRF 간의 상호작용이 더욱 분석되었는데, 복잡하면서도 엄격히 제어되고 있는 것으로 나타났다. 이러한 관찰은 본 발명자들로 하여금 PTPRF 가 EGFR 수용체로부터의 하류 신호전달을 제어함에 있어서 직접적인 중요한 역할을 하리라는 것을 가정하도록 이끌었다. 또 다른 노선의 증거에서, PTPRF 는 세포 이동에 대한 저해 효과 및 가능하게는 아포토시스 (apoptosis) 의 유도를 통해 작용하여, 종양 억제 활성을 갖는 것으로 관찰되었다. PTPRF 이 세포 이동 과정을 제어하는 기작이 추가로 해명되었다. 두 연구에 의해, 상기 단백질이 베타-카테닌의 활성에 대한 직접적 조절을 매개로 하여, E-카드헤린 (E-cadherin) 복합체와 복잡하게 상호작용하여 기능하는 것으로 나타났다.
EGFR 과의 직접적인 상호작용 및 익히 분석된 종양 억제 활성은, PTPRF 를 엘로티닙에 대한 반응에 대한 특히 최적인 마커가 되게 하는 두 가지 두드러진 특징이다.
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Claims (12)

  1. 하기 단계를 포함하는, 엘로티닙 (erlotinib) 을 이용한 치료에 대한 NSCLC (비-소세포 폐암) 환자의 임상적 유익을 예측하는 시험관내 방법:
    환자의 종양 시료에서 PTPRF 유전자의 발현 수준을 측정하고, 상기 PTPRF 유전자의 발현 수준을 상기 치료로부터 임상적 유익을 얻지 못하는 환자 집단의 종양에서의 PTPRF 유전자의 발현 수준을 대표하는 값과 비교하는 단계로서, 이 때, 상기 환자의 종양 시료에서의 PTPRF 유전자의 발현 수준이 더 높은 것은 상기 치료로부터 임상적 유익을 얻게 될 환자에 대한 지표가 되는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 발현 수준이 마이크로어레이 기법으로 측정되는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 엘로티닙 치료에 대한 NSCLC 환자의 임상적 유익을 예측함에 있어서 PTPRF 유전자를 사용하는 방법.
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