KR101169245B1

KR101169245B1 - Ｅｇｆｒ 저해제 치료에 대한 예측 마커

Info

Publication number: KR101169245B1
Application number: KR1020107003292A
Authority: KR
Inventors: 뽈 델마; 바르바라 클루그함머; 베레나 루츠; 파트리샤 맥러플린
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2007-08-14
Filing date: 2008-08-07
Publication date: 2012-08-03
Also published as: IL203362A; US20110230506A1; EP2188393A1; MX2010001579A; CA2694587A1; CN101778951A; BRPI0817361A2; CN101778951B; JP5421260B2; EP2188393B1; ES2437122T3; AU2008286333B2; WO2009021680A1; AU2008286333A1; JP2010536328A; KR20100037635A

Abstract

본 발명은 암 환자에서 EGFR 저해제를 이용한 치료에 대한 응답성을 예측하는 바이오마커 (RAPGEF5) 를 제공한다.

Description

ＥＧＦＲ 저해제 치료에 대한 예측 마커{PREDICTIVE MARKER FOR EGFR INHIBITOR TREATMENT}

본 발명은 암 환자에서 EGFR 저해제를 이용한 치료에 대한 응답성을 예측하는 바이오마커를 제공한다.

다수의 인간 악성종양이 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 의 일탈 또는 과발현과 연관되어 있다. EGF, 형질전환 성장 인자 α (TGF-α) 및 다수의 기타 리간드가 EGFR 에 결합하여, 수용체의 세포내 타이로신 키나아제의 자가인산화를 자극한다. 여러가지 세포내 경로들이 후속하여 활성화되며, 이들 하류방향 사건들은 시험관내 종양 세포 증식을 초래한다. EGFR 을 통한 종양 세포의 자극이 생체내 종양 성장 및 종양 생존의 두가지 모두에 중요하다는 것은 기정사실이다.

EGFR 타이로신 키나아제의 저해제인 Tarceva^TM 를 이용한 초기의 임상 데이터는, 그 화합물이 안전하며, 표적으로 하는 유효 농도를 제공하는 투여량 (전임상 데이터로 결정됨) 에서 일반적으로 널리 용인된다고 했다. 진행된 질환이 있던 환자에서의 임상 I 상 및 II 상 시도는, Tarceva^TM 가 일정 범위의 상피 종양에서 유망한 임상 활성을 갖는다는 것을 증명했다. 실제로, Tarceva^TM 가 두경부암이 있는 환자 및 NSCLC (비-소세포 폐암) 이 있는 환자에서 기존 확립된 2 차 항암치료의 화학요법과 비슷한 정도로 오래가는 부분적인 차도를 유도할 수 있고, 화학요법보다 더 나은 안전성 프로파일 및 개선된 편의성 (정맥내 [i.v.] 투여 대신 정제) 의 장점을 추가하는 것으로 나타났다. 최근 완결된, 무작위적인 이중맹검 위약 통제 시도 (BR.21) 는, 후기 질환에 대한 표준 요법이 실패한 NSCLC 환자의 생존을 단일 약제 Tarceva^TM 가 현저하게 연장시키고 개선시킨다는 것을 보여줬다.

Tarceva^TM (에를로티니브; erlotinib) 는 소형 화학 분자이다; 이는 경구활성인, EGFR 타이로신 키나아제 (EGFR-TKI) 의 강력하고 선택적인 저해제이다.

폐암은 북미 및 유럽에서 암 관련한 사망의 주된 요인이다. 미국에서, 폐암에 부차적인 사망자 숫자는 암 관련 사망 원인을 주도하여, 두번째 (대장암), 세번째 (유방암) 및 네번째 (전립선암) 를 총합한 사망자 수를 능가한다. 전체 폐암의 약 75% 내지 80% 이 비-소세포폐암 (NSCLC) 이며, 약 40% 의 환자들은 국소적으로 진행되고/되거나 수술로 치유불가능한 질환을 나타내고 있다. 이러한 군에는 일반적으로 악성 흉수를 제외한, 종양의 부피가 큰 상태인 IIIA 기 및 IIIB 기 질환을 가진 이들이 포함된다.

유럽 연합에서, 매 년 폐암의 대략적인 발생율은 100,000 명당 52.5 명이며, 사망율은 48.7　명이다. 남성들 중에서는 상기 비율이 79.3 및 78.3 이며, 여성들 중에서는 상기 비율이 21.6 및 20.5 이다. NSCLC 은 폐암 전체의 80% 를 차지한다. 남성 폐암 사망의 약 90% 및 여성 폐암 사망의 80% 는 흡연이 원인이다.

US 에서, 미국 암 학회에 따르면, 2004 년도에, 약 173,800 건의 신규한 폐암 발병 (남성 93,100 건, 여성 80,700 건) 이 있었으며, 이는 모든 신규한 암 발병의 약 13% 를 차지했다. 대부분의 환자들은 진단 후 2 년 내에 그 질환의 결과로 사망한다. 다수의 NSCLC 환자에 있어서, 성공적인 치료는 찾기 힘든 것으로 남아있다. 한참 진행된 종양은 종종 수술로도 치료불가능하며, 용인가능한 투여량의 방사선요법 및 화학요법에도 내성을 띄게 될 수 있다. 무작위적인 시도에서, 현재 가장 활발한 병용 화학요법은 약 30% 내지 40% 의 종양응답성율을 달성하며, 1 년 생존율은 35% 내지 40% 이다. 이는 단독적인 보존적 치료가 보여주는 10% 의 1 년 생존율을 훨씬 앞선다 (Shepherd 1999).

최근까지, 재발한 환자에 대한 치료 선택폭은 최선의 보존적 치료 또는 일시적 완화로 제한되어 있었다. 도세탁셀 (Taxotere

) 과 최선의 보존적 치료를 비교한 최근의 시도는, NSCLC 가 있는 환자가, 시스플라틴 기반의 1 차 항암치료의 식이요법이 실패한 후, 2 차 항암치료의 화학요법으로 이득를 볼 수 있다는 것을 보여줬다. 모든 연령대의, ECOG 전신 상태 (ECOG performance status) 가 0, 1, 또는 2 인 환자에서, 먼저 했던 백금-기반의 치료로는 치료가 어려웠던 이들에서처럼, 도세탁셀의 이용으로 생존이 개선되었음을 증명했다. 요법으로 이득을 못 본 환자들에는, 10% 를 넘는 체중 손실이 있거나, 락테이트 디히드로게나아제 수준이 높거나, 여러 장기에 연루되어 있거나 또는 간에 연루되어 있는 이들이 포함되어 있었다. 추가적으로, 도세탁셀 단독이용요법의 장점은 2 차 항암치료 설정을 넘어서진 못했다. 3 차 이상의 항암치료로서 도세탁셀을 수용한 환자들은 생존의 연장을 보여주지 않았다. 단일 약제 도세탁셀은 NSCLC 에 대한 표준 2 차 항암치료 요법이 되었다. 최근, NSCLC 의 2 차 항암치료 요법에서 또다른 무작위적인 III 상 시도에서는 페메트렉세드 (Alimta

) 와 도세탁셀을 비교했다. 페메트렉세드를 이용한 치료는 임상적으로 동등한 효능을 도출했으나, 도세탁셀보다 훨씬 더 적은 부작용이 있었다.

맞춤 암 치료 방법 개발에 대한 필요가 있음은 오래 전부터 인정되어 왔다. 목표로 삼은 암 치료법을 개발하면서, 종양 표적의 분자적인 프로파일을 제공할 수 있는 방법론 (즉, 임상적인 장점에 대해 예측하는 것) 이 특별한 관심대상이 되었다. 암에서의 유전자 발현 프로파일링에 대한 법칙의 증거는, 현재의 형태학적 및 면역세포화학적 시험을 근거로 하기에는 명확하지 않은 종양 유형의 분자적 분류를 이용하여 이미 확립되어 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 암 환자에서의 EGFR 저해제 치료에 대한 응답성을 예측하는 발현 바이오마커를 제공하는 것이다.

첫번째 목적에서, 본 발명은 하기를 포함하는, EGFR 저해제를 이용한 치료에 대한 암 환자의 시험관 내에서의 응답성 예측방법을 제공한다:

환자의 종양 시료에서 RAPGEF5 유전자의 발현 수준을 측정하고, RAPGEF5 유전자의 발현 수준을 비응답성 환자 집단의 종양에서의 RAPGEF5 유전자의 발현 수준의 대표값과 비교함, 여기서 환자의 종양 시료에서의 하나 이상의 유전자의 더 높은 발현 수준은 치료에 응답할 환자에 대한 표식임.

약어 RAPGEF5 는 Rap 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 (GEF) 5 를 의미한다. 인간 RAPGEF5 유전자 및 그의 전사 변이체 1, 6 및 11 의 뉴클레오티드 서열은 서열 식별 번호 1 내지 4 에 제공된다. RAPGEF5 유전자 및 그의 변이체의 유전자 은행 접근 번호, 및 해당하는 서열 식별 번호 (Seq. Id. No.) 를 표 4 에 제시한다.

용어 "비응답성 환자 집단의 종양에서의 RAPGEF5 유전자의 발현 수준의 대표값" 은 EGFR 저해제를 이용한 치료에 응답하지 않는 환자 집단의 종양에서의 마커 유전자의 발현 수준을 의미한다.

바람직한 구현예에서, 마커 유전자 RAPGEF5 는 일반적으로, 비응답성 환자 집단의 종양에서의 RAPGEF5 유전자의 발현 수준의 대표값과 비교해 볼 때 응답성 환자의 종양 시료에서 1.5 내지 2.7 배 더 높은 발현을 보여준다.

바람직한 구현예에서, RAPGEF5 유전자의 발현 수준은 마이크로어레이 기법 또는, 정량적 RT-PCR 처럼 RNA 발현 수준을 평가하는 기타 기법으로, 또는 각각의 단백질의 발현 수준을 관찰하는 임의의 방법, 예를 들어 면역염색화학법 (IHC) 으로 측정한다. 유전자칩의 구축 및 이용은 당업계에 널리 공지되어 있다. 참고문헌은, U. S. 특허 제 5,202,231 호; 제 5,445,934 호; 제 5,525,464 호; 제 5,695,940 호; 제 5,744,305 호; 제 5,795,716 호 및 제 5,800,992 호. 또한, Johnston, M. Curr. Biol. 8:R171-174 (1998); Iyer VR 등, Science 283:83-87 (1999) 을 참조. 물론, 유전자 발현 수준은 당업자에게 공지된 기타 방법, 예를 들어 노던 블롯, RT-PCR, 실시간 정량적 PCR, 프라이머 신장, RNase 프로텍션, RNA 프로파일링으로 측정될 수 있다.

본 발명의 유전자는 기타 예측 바이오마커와의 바이오마커 세트로 조합될 수 있다. 바이오마커 세트는 암 환자에서의 EGFR 저해제 치료 효과에 대한 예측을 위해 예측 바이오마커의 임의의 조합으로부터 성립될 수 있다. 본원에 개재되는 다양한 바이오마커 및 바이오마커 세트는, 예를 들어, 어떻게 암 환자가 EGFR 저해제로의 치료 개입에 응답성할 것인지를 예측하는데 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "유전자" 라는 용어는 유전자의 변이체를 포함한다. "변이체" 라는 용어는 GenBank 접근 번호로 주어진 핵산 서열과 실질적으로 유사한 핵산 서열에 관한 것이다. "실질적으로 유사한" 이라는 용어는 당업자에게는 잘 이해된다. 특히, 유전자 변이체는 인간 집단 내에서 가장 우세한 대립형질의 핵산 서열과 비교하여 뉴클레오티드 교환을 보이는 대립형질일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 실질적으로 유사한 핵산 서열은 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 가장 우세한 대립형질과의 서열 유사성을 갖는다. "변이체" 라는 용어는 또한 스플라이싱 (splice) 변이체에 관한 것을 의미한다.

EGFR 저해제는 게피티니브, 에를로티니브, PKI-166, EKB-569, GW2016, CI-1033 및 항-erbB 항체, 예컨대 트라스투주마브 및 세툭시마브로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또다른 구현예에서, EGFR 저해제는 에를로티니브이다.

또다른 구현예에서, 암은 NSCLC 이다.

본 발명에 의해 기재되는 유전자의 유전자 발현 검출 기술에는 노던 블롯, RT-PCR, 실시간 정량 PCR, 프라이머 확장, RNase 보호, RNA 발현 프로파일링 및 관련 기술이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 [Sambrook J 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 2000)] 를 참조한다.

본 발명에 의해 기재되는 각 유전자의 단백질 발현 검출 기술에는 면역조직화학 (IHC; Immunohistochemistry) 이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 종양 또는 암 생검과 같은 환자 조직 시료로부터의 세포를 검정하여, 하나 이상의 바이오마커의 발현 패턴을 측정할 수 있다. 암 치료의 성공 또는 실패는, 종양 또는 암 생검과 같은 시험 조직으로부터의 세포 (시험 세포) 의 바이오마커 발현 패턴이, 하나 이상의 바이오마커의 대조군 세트의 발현 패턴과 비교적 유사 또는 상이한 것인지에 근거해 측정될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, EGFR 저해제 치료에 응답하지 않는 환자의 종양과 비교하여 EGFR 저해제 치료에 응답하는 환자의 종양에서, 표 3 에 열거된 유전자가 상향조절되었다는, 즉 보다 높은 발현 수준을 보인다는 것을 발견하였다. 그러므로, 시험 세포가 암 치료에 응답하였던 환자의 바이오마커 발현 프로파일에 상응하는 바이오마커 발현 프로파일을 보이는 경우, 개체의 암 또는 종양이 EGFR 저해제를 이용한 치료에 바람직하게 응답할 것 같거나 그러할 것으로 예상된다. 반대로, 시험 세포가 암 치료에 응답하지 않았던 환자의 바이오마커 발현 프로파일에 상응하는 바이오마커 발현 프로파일을 보이는 경우, 개체의 암 또는 종양이 EGFR 저해제를 이용한 치료에 바람직하게 응답하지 않을 것 같거나 그러할 것으로 예상된다.

본 발명의 마커 유전자는 기타 바이오마커와 바이오마커 세트로 조합될 수 있다. 바이오마커 세트는 암 환자에서의 EGFR 저해제 치료 효과에 대한 예측을 위해 예측 바이오마커의 임의의 조합으로부터 성립될 수 있다. 본원에 개재되는 바이오마커 및 바이오마커 세트는, 예를 들어, 어떻게 암 환자가 EGFR 저해제를 이용한 치료 개입에 응답할 것인지를 예측하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 추가 목적에서는 본 발명의 시험관 내 방법에 의해 확인된 암 환자를 치료하는 치료 방법을 제공한다. 상기 치료 방법은 표 3 에 열거된 RAPGEF5 유전자의 예측 발현 패턴에 근거해 치료하기로 선택된 환자에게 EGFR 저해제를 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 EGFR 저해제는 에를로티니브이고, 치료하고자 하는 바람직한 암은 NSCLC 이다.

도 1 은 연구 설계를 보여준다;
도 2 는 시료 처리 과정 도식을 보여준다;
도 3a 는 RAPGEF5 발현 수준 대 Genechip^® 프로파일링에 대한 임상 결과를 보여준다;
도 3b 는 RAPGEF5 발현 수준 대 qRT-PCR 에 대한 임상 결과를 보여준다;
도 3c 는 RAPGEF5 에 대한 Genechip^® 과 qRT-PCR 측정값 사이의 연관 관계를 보여준다.

실험 부분

연구에 대한 근거 및 연구 디자인

최근 NSCLC 환자의 하위집합의 종양 조직 내의 EGFR 유전자에서의 돌연변이 및, 에를로티니브 및 게피티니브에 대한 감수성을 가진 이러한 돌연변이의 연관성이 기재되어 있다 (Pao W, 등, 2004; Lynch et al. 2004; Paez 등, 2004). 2 가지 연구를 조합한 경우 환자에서, 돌연변이화된 EGFR 은 게피티니브에 응답성을 보였던 환자 14 명 중 13 명에서 관찰되었고, 응답성을 보이지 않았던 11　명의 게피티니브-처리된 환자에서는 관찰되지 않았다. 이들 돌연변이의 보고된 유병율은 미선별된 NSCLC 환자 중 8% (25 명중 2 명) 에 달했다. 이들 돌연변이는 샘암종 (21%), 여성으로부터의 종양 (20%), 및 일본인 환자로부터의 종양 (26%) 에서 더욱 자주 발견되었다. 이들 돌연변이는 EGFR 의 시험관 내 활성 증가 및 게피티니브에 대한 감수성 증가를 야기하였다. 돌연변이와 장기적 안정 병변 또는 생존 기간과의 관계는 유망하게 평가되지는 않았다.

BR.21 연구로부터의 외삽 분석에 근거하여, 심지어 목적하는 응답성을 보이는 환자를 분석에서 제외시킨 경우에도 유의한 생존 이득이 유지되기 때문에 (자료에 근거함), 관찰되는 생존 이득은 EGFR 돌연변이로 인한 것만은 아닌 것으로 보인다. 기타 분자 메커니즘도 또한 효과에 기여하는 것이 분명하다.

Tarceva™ 처리에 대한 응답성/이득을 예측하는 유전자 발현 수준의 변화가 있다는 가정하에, 마이크로어레이 분석을 사용하여 이들 변화를 측정하였다.

이를 위해서는 1 차 항암치료 요법의 실패 후 Tarceva™ 단일요법으로 치료된 명확하게 정의된 연구 집단이 필요하였다. BR.21 연구로부터의 실험에 근거하여, 이득을 본 집단은, 목적하는 응답성, 또는 12 주 이상 동안의 병변 안정화를 가진 것으로서 정의하였다. 임상 및 마이크로어레이 데이터 세트를 미리 규정된 통계 계획에 따라 분석하였다.

이 기술을 적용하기 위해서는 신선한 동결 조직 (FFT; fresh frozen tissue) 이 필요하다. 그러므로, 처리 시작 전에 반드시 생검을 실시해야만 한다. 수집된 물질을 액체 질소 (N₂) 에서 동결시켰다.

동시에 두번째 종양 시료를 수집하고, 파라핀에 저장하였다 (포르말린 고정 파라핀 포매: FFPE; formalin fixed paraffin embedded). 상기 시료를 EGFR 신호 경로에서의 변경에 대해 분석하였다.

기관지경술을 통한 종양 생검을 실시하는 역량이 본 연구를 위한 전제 조건이었다. 기관지경술은 폐암 진단을 확인하기 위한 표준 절차이다. 일반적으로 안전하지만, 출혈과 같은 합병증의 위험이 남아있다.

본 연구는 난치성 NSCLC 을 가진 환자들에 대한 맞춤 치료 (individualized therapy) 를 향한 첫 단계였다. 상기 맞춤 치료는 진료 의사가 상기 징후에 대해 기존의 약물들 중 가장 적절한 제제를 선별할 수 있게 할 것이다.

일단 맞춤 치료가 가능해지면, 미래의 각 환자에 대한 이득은 현재의 연구에서 환자들이 감수해야 하는 위험을 능가할 것이다:

응답율 / 이득을 얻는 환자의 수가 증가할 것이고,

효과가 없는 치료로 인한 유해한 부작용의 위험성이 감소할 것이다.

투여량 선택에 대한 근거

Tarceva^TM 를 질병 진행, 용인불가한 독성 또는 사망시까지 150 mg 의 투여량으로 1 일 1 회 경구 투여하였다. 상기 투여량에 대한 선택은 약동학적 변수, 및 사전-치료를 과도히 받은 진행암 환자들에서 제 I, II 및 III 상 시험에서 관찰된 상기 투여량의 안전성 및 내약성 프로파일을 기초로 하였다. 150　mg/일 투여량을 받은 암 환자들의 혈장에서 나타난 약물 수준은 임상적 효능을 목적으로 하는 500　ng/ml 의 평균 혈장 농도보다 높은 수준으로 일정했다. BR.21 은, 상기 투여량에 의한 생존 이득을 보여주었다.

상기 연구의 목적

이의 일차적 목적은 Tarceva^TM 치료의 이득 (CR, PR 또는 SD ≥ 12 주) 에 대해 예측적인 차등 발현 유전자들을 규명하는 것이었다. Tarceva^TM 치료에 대한 "응답성" (CR, PR) 에 대해 예측적인 차등 발현 유전자들의 확인은 중요한 추가적인 목적이었다.

부차적인 목적은, 치료를 통한 이득에 관해서, EGFR 신호전달 경로에서의 변화를 평가하는 것이었다.

연구 설계

연구 설계 및 투여 방법에 대한 개관

이는 공개 (open-label) 예측 마커 규명 제 II 상 연구였다. 본 연구는 약 12 개국의 대략 26 개 지역에서 수행되었다. 한가지 이상의 사전 화학요법이 실패한 진행성 NSCLC 를 가진 264 명의 환자가 12 개월의 기간에 걸쳐 등록하였다. 지속적으로 경구 Tarceva^TM 가 150　mg/일의 투여량으로 투여되었다. 약물 요법에 대한 내약성에 기초하여 투여량 감소가 허용되었다. 질병 제어 및 독성을 평가하기 위해 임상 및 실험 변수들을 평가하였다. 치료는 질병 진행, 허용불가능한 독성 또는 사망시까지 계속되었다. 당해 연구 설계는 도 1 에 나타나 있다.

분자적 분석을 위해 종양 조직 및 혈액 시료를 수득하여, Tarceva^TM 의 효과를 평가하고 치료를 통해 이득을 얻는 환자들의 하위군을 규명하였다.

예측 마커 평가

종양 생검들은 치료 시작 전 2 주 내에 취하였다. 하기 2 가지의 상이한 시료들을 채취하였다:

첫번째 시료는 항상 액체 N₂ 중에 즉시 동결시켰다.

두번째 시료는 포르말린 중에 고정시킨 후 파라핀 중에 포매시켰다.

즉시 동결 조직은 본 연구에서 가장 높은 우선순위를 가졌다.

도 2 는 시료 가공에 대한 계획도를 보여준다.

마이크로어레이 분석

종양 RNA 및 종양 주변 조직으로부터의 RNA 를 추출하기 위한 종양 세포의 레이저 포획 미세절단 (laser capture microdissection; LCM) 에 상기 즉시 동결 시료를 사용하였다. 상기 RNA 를 Affymetrix 마이크로어레이 칩 (HG-U133A) 상에서 분석하여 상기 환자들의 종양 유전자 발현 프로파일을 확립하였다. Affymetrix 칩에 대한 품질 관리 (Quality Control) 를 이용하여 통계학적 비교를 위한 적절한 품질의 시료들을 선택하였다.

포르말린 고정된 파라핀 포매 조직에 대한 단일 바이오마커 분석

상기 두번째 종양 생검인 FFPE 시료를 이용하여, DNA 변이유발, IHC 및 ISH 분석을 상기 기술한 바와 같이 수행하였다. 초기 진단시 수집된 조직에 대해서도 유사한 분석을 수행하였다.

EGFR 및 EGFR 신호전달 경로에 관여하는 기타 분자들을 인코딩하는 유전자의 DNA 변이유발 상태를 DNA 서열분석을 이용하여 분석하였다. EGFR 및 관련 유전자들에 대한 유전자 증폭은 FISH 로 연구되었다.

단백질 발현 분석에는 EGFR 및 EGFR 신호전달 경로 중의 기타 단백질에 대한 면역조직화학 [IHC] 분석이 포함되었다.

응답성 평가

RECIST (Uni-dimensional Tumour Measurement) 기준을 이용하여 응답성을 평가하였다. 상기 기준은 하기 링크에서 찾아볼 수 있다:http://www.eortc.be/recist/

다음을 주의해야 한다: CR 또는 PR 의 상태로 규정하기 위해서는, 상기 치료 기간 중의 임의의 시점과는 적어도 4 주 떨어진 시점에서의 반복 평가에 의해 종양 크기의 변화가 확인되어야 한다.

SD 의 경우, 후속적인 측정치가 연구 시작 후 최소 6 주의 간격으로 적어도 1 회 SD 기준을 충족해야 한다.

SD 유지의 경우, 후속적인 측정치가 연구 시작 후 적어도 1 회 최소 12 주의 지속 기간에 걸쳐 SD 기준을 충족해야 한다.

생존 평가

환자가 진료소로 방문하거나 또는 전화를 이용하여 3 개월마다 정기적인 상태 점검을 수행하였다. 모든 사망을 기록하였다. 연구의 말미에 각 환자에 대해 최종적 생존 확인을 요청하였다.

에를로티니브 치료에 대한 응답성

12 개국 및 26 개 센터로부터의 총 264 명의 환자가 본 연구에 등록하였다. 26% 는 IIIB 기, 24% 는 IV 기 NSCLC 였다. 환자들의 13.6% (n=36) 는 치료 응답성 (objective response) 을 달성한 반면, 31.4% (n=83) 는 임상적 이득 (12 주 이상 동안 치료 응답성 또는 안정 병변 중 하나를 보이는 것으로 정의됨) 을 가졌다. 전체 생존 중앙값은 7.6 (CI 7-9) 개월이었고, 무진행 생존 중앙값은 11.3 (CI 8-12) 주였다. 임상 데이터에 관한 나머지 상세한 것은 표 1 에 나타나 있다.

모든 환자들로부터 새로 동결된 기관지경 생검들을 수집하였는데, 모든 시료가 미세절단 (LCM) 전에 충분한 종양 함량을 가진 것은 아니었거나 또는 LCM 후 마이크로어레이 분석으로 진행하기에 충분한 RNA 산출량을 가진 것은 아니어서, 종양 재료는 125 명의 환자에 대한 것만 이용가능하였다; 이들 중 122 명은 평가가능한 RNA 를 가졌다. 또 다른 20 개 시료들의 세트는 상기 마이크로어레이 데이터에 대한 본 발명자들의 품질 관리 평가를 통과하지 못하였다. 통계적 분석에 적합하였던 상기 102 개 마이크로어레이 데이터 세트에 대한 임상적 특징들은 표 1 에 나타나 있다. 전체 연구에서 36 명의 환자들이 치료 응답성을 달성한 한편, 이들 중 6 명 만이 마이크로어레이 데이터를 가졌다; 임상적 이득을 달성한 환자들에서와 유사하게, 마이크로어레이 데이터를 가진 환자들의 수는 전체 데이터 세트 중의 83 명에 비해 불과 21 명이었다. 6 명은 부분 응답자 (PR) 들인 것으로 판정되었고, 31 명은 SD 이었고, 49 명은 PD 이었다; PR 인 6 명의 환자들 중, 5 명은 선암을 가졌고, 1 명은 편평상피세포암종을 가졌다. 상기 데이터 세트에서 CR 을 달성한 환자는 없었다.

방법

RNA 시료 조제 및 RNA 시료에 대한 품질 관리

모든 생검 시료 처리는 병리학 표준 실험실에서 다루어졌다; 새로 동결된 조직 시료는 조사기관 지역에서 Roche Basel 의 Clinical Sample Operations 시설로 수송되었고, 추가적인 처리를 위해 거기에서 상기 병리학 실험실로 수송되었다. 레이저 포획 미세절단을 이용하여 주변 조직으로부터 종양 세포를 선별하였다. LCM 후, 상기 종양 풍부 물질로부터 RNA 를 정제하였다. 상기 병리학 실험실에서는 그 후 상기 RNA 의 농도 및 품질에 대한 추정을 위한 일련의 단계를 수행하였다.

RNase는 RNA 분해 효소이며 도처에서 발견되고, 따라서 RNA가 사용될 모든 절차는 RNA 분해를 최소화하도록 엄격히 조절되어야만 한다. 대부분의 mRNA 종은 자체적으로 다소 짧은 반감기를 가지며, 따라서 상당히 불안정한 것으로 간주된다. 그러므로, 임의 검정 전에 RNA 완전성 체크 및 정량화를 수행하는 것이 중요하다.

RNA 농도 및 품질 프로필은 2100 Bioanalyzer

로 불리는 Agilent 기기 (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA) 를 사용하여 평가될 수 있다. 기기 소프트웨어는 RNA 완전성 번호 (RIN), 정량화 추정 (Schroeder, A., 등, The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol, 2006. 7: p.3) 을 생성하고, 전체 RNA 시료의 리보솜 비율을 계산한다. RIN 은 RNA 시료의 전체 전기영동적 추적으로부터 측정되며, 이에는 분해 생성물의 존재 또는 부재가 포함된다.

RNA 품질을 2100 Bioanalyzer

로 분석하였다. Affymetrix 플랫폼 상에서의 추가적 분석을 위해, 충분한 RNA 및 첨가된 폴리-I 노이즈 초과의 하나 이상의 rRNA 피크를 갖는 시료만을 선택하였다. 마이크로어레이에 의한 분석을 위해, 정제된 RNA를 로셰 의학 게놈학 센터 {Roche Centre for Medical Genomics (RCMG; 바젤, 스위스)} 로 보냈다. 추가적인 처리를 위해 병리학 실험실로부터 122개 RNA 시료를 받았다.

조직 RNA 시료의 표적 표지

생산자의 지시사항에 따른 것으로서, Affymetrix 로부터의 2-사이클 표적 표지 증폭 프로토콜 (Affymetrix, Santa Clara, California)에 따라 표적 표지를 실행하였다.

상기 방법은 표준 에버와인 선형 증폭 방법을 기준으로 하지만, 마이크로어레이에 대한 하이브리드화를 위해 충분히 표지된 cRNA가 생성되도록 상기 방법의 두 사이클을 사용한다.

표지 응답성에서 사용된 총 RNA 투입량은, 10 ng 초과의 RNA 가 활용가능한 경우 이들 시료에 대해 10 ng 이었고; 상기 양 미만이 활용가능하거나 또는 활용가능한 양 데이터가 없는 경우 (매우 낮은 RNA 농도로 인해), 총 시료의 절반을 응답성에 사용하였다. 표지 응답성으로부터의 수율은 20 ~ 180 μg cRNA 이었다. 15 μg cRNA가 모든 시료에 대해 사용된 경우 하이브리드화의 수준에서 정규화 단계를 도입하였다.

Human Reference RNA (Stratagene, Carlsbad, CA, USA) 를, 시료의 각 회분을 이용한 작업 흐름시 대조군 시료로서 사용하였다. 10 ng 의 상기 RNA를 시험 시료과 함께 투입물로 사용하여, 표지 및 하이브리드화 시약이 예측한 바와 같이 작용하는지 확인하였다.

마이크로어레이 하이브리드화

Affymetrix HG-U133A 마이크로어레이는 특징분석이 잘 되어있는 약 14,500 개의 유전자를 나타내는 약 18,400개의 전사체 및 변이체를 표적하는 22,000 개가 넘는 프로브 집합을 포함한다.

Affymetrix 지시사항 (Affymetrix Inc., Expression Analysis Technical Manual, 2004) 에 따라 모든 시료에 대한 하이브리드화를 수행하였다. 간략하게는, 각각의 시료에 대해, 15 μg의 바이오틴-표지된 cRNA 를 2가 양이온의 존재 하 및 가열 하에 절편화하고, Affymetrix HG-U133A 전체 게놈 올리고뉴클레오티드 어레이에 대해 하룻밤 동안 하이브리드화하였다. 다음날 어레이를 제조사의 지시사항에 따라 스트렙타비딘-피코에리트린 (Molecular Probes; Eugene, OR) 으로 염색하였다. 이후 GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix) 을 사용하여 어레이를 스캐닝하고, GeneChip Operating Software (GCOS) 버전 1.4 (Affymetrix) 로 신호 세기를 자동으로 계산하였다.

통계적 분석

Affymetrix^TM 데이터의 분석은 5 개 주요 단계로 구성되었다.

단계 1 은 품질 제어였다. 목표는 표준 미만인 품질 프로필을 갖는 분석 어레이 데이터를 확인하고 제외시키는 것이었다.

단계 2 는 예비-처리 및 정규화였다. 목표는 칩 간 비교되어야 할 정규화 및 척도화된 "분석 데이터 집합" 을 생성하는 것이었다. 이는 배경 노이즈 추정 및 감산, 프로브 요약 및 척도화를 포함하였다.

단계 3 은 탐색 및 기술이었다. 목표는 가변성의 공급원 및 잠재적 경향을 확인하는 것이었다. 이는 다변수 및 단변수 기술적 분석 기법을 적용하여 유력한 공변을 확인하는 것으로 이루어졌다.

단계 4는 모델링 및 시험이었다. 목표는 "응답자 (최상의 응답성으로서 "일부 응답성" 또는 "전체 응답성"을 갖는 환자) 및 "비응답자" (최상의 응답성으로서 "진행성 질환"을 갖는 환자) 사이의 평균 발현 수준에서의 차이의 통계적 평가를 기준으로 후보 마커의 목록을 확인하는 것이었다. 이는 각각의 프로브-집합에 대해 적당한 통계적 모델을 맞추고 통계적 유의성 측정을 추론하는 것으로 이루어졌다. R 소프트웨어 패키지를 사용하여 모든 분석을 수행하였다.

단계 1: 품질 제어

데이터 품질의 평가는 여러 매개변수의 체크를 기준으로 하였다. 이들에는 표준 Affymetrix GeneChip^TM 품질 매개변수, 특히 척도화 인자, 현존 호출 % (Percentage of Present Call) 및 평균 배경이 포함된다. 이러한 단계는 또한 국지적 하이브리드화 문제점을 검출하기 위한 가상 칩 영상의 시각적 검사, 중간 거동으로부터의 임의 비정상적 이탈을 검출하기 위한, 가상 중간 칩에 대한 각각의 칩의 비교가 포함된다. 칩 간 상관관계 분석을 또한 수행하여 영외 표본을 검출하였다. 또한, Agilent Bioanalyzer^TM 2100으로 RNA 시료를 분석하여 수득한 RNA 품질의 부수적 측정을 고려하였다.

이들 매개변수를 기준으로, 20 개 어레이로부터의 데이터를 분석에서 제외시켰다. 따라서 102 명 환자를 나타내는 총 102 개 어레이로부터의 데이터를 분석에 포함시켰다. 이들 102 명 환자 집합의 임상적 기술을 하기 표 1 에 보고하였다.

분석에 포함된 환자의 임상적 특징 기술
변수	값	n = 102
최상의 응답성	N/A	n (%) 16 (15.7%)
	PD	49 (48.0%)
	SD	31 (30.4%)
	PR	6 (5.9%)
임상적 이득	없음	81 (79.4%)
임상적 이득	있음	21 (20.6%)
성별	여성	25 (24.5%)
성별	남성	77 (74.5%)
인종	백인	65 (63.7%)
인종	동양인	37 (36.3%)
조직학	선암	35 (34.3%)
	편평	53 (52.0%)
	기타	14 (13.7%)
흡연 경험	없음	20 (19.6%)
흡연 경험	있음	82 (80.4%)

단계 2: 데이터 예비-처리 및 정규화

rma 알고리즘 (Irizarry, R.A., 등, Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data. Nucl. Acids Res., 2003. 31(4): p. e15) 을 예비-처리 및 정규화에 사용했다. mas5 알고리즘 (AFFYMETRIX, GeneChip

Expression: Data Analysis Fundamentals. 2004, AFFYMETRIX) 을, 개별적 프로브-집합에 대한 검출 호출을 만드는데 사용했다. 모든 표본에서의 "부재" 또는 "최저한 (marginal)"이라 칭하는 프로브-집합을 추가적 분석에서 제외하고; 5930개 프로브-집합을 상기 기준을 근거로 분석에서 제외했다. 그러므로 분석 데이터 집합은 102명 환자에서 측정된 16353개 (22283개 중) 프로브-집합을 갖는 행렬로 이루어졌다.

단계 3: 데이터 기술 및 설명

잠재적인 성향 및 가변성의 주된 요인을 밝혀내기 위해 기술적 탐구 분석을 수행했다. 유전자 발현 프로파일에 잠재적인 영향을 주는 공변 (covariate) 설정을 스크리닝했다. 이는 기술적인 변수 및 임상적인 변수의 두가지 모두를 포함했다. 기술적인 공변에는 하기의 것이 포함된다: RNA 프로세싱 날짜 (이후, 뱃치로서 언급됨), RIN (RNA 품질/완결성의 측정값으로서), 연산자 및 시료 수집의 센터. 임상적인 공변에는 하기의 것이 포함된다: 조직학적 유형, 흡연 상태, 종양 등급, 성능 스코어 (Oken, M.M., 등, Toxicity and response criteria of the Eastern Cooperative Oncology Group . Am J Clin Oncol, 1982. 5(6): p. 649-55), 인구통계학적 데이터, 응답자의 상태 및 임상적 이득 상태.

분석도구에는 단변량 ANOVA 및 주성분 분석이 포함된다. 각각의 상기 공변에 대해서, 단변량 ANOVA 을 각각의 프로브 집합에 대해 독립적으로 적용했다.

뱃치 변수 (batch variable) 의 유의한 효과를 확인했다. 실제에서, 뱃치 변수는 시료 처리 날짜와 Affymetrix 칩 무리의 날짜 사이의 차이를 잡아냈다. 뱃치 변수가 관심대상의 변수로부터 거의 독립적이라는 점을 확인한 후, 뱃치 효과를 Johnson, W.E., C. Li, and A. Rabinovic, Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods . Biostat, 2007. 8(1): p. 118-127 에 기재되어 있는 방법을 이용하여 보정했다.

뱃치 효과 보정 후 정규화된 데이터 세트는 후속 분석에서 분석 데이터로서 제공했다.

조직학 및 RIN 는 기술 분석에서 각광받는 두가지 추가적인 중요한 변수이다.

단계 4 : 데이터 모델링 및 시험.

각각의 프로브 집합에 대해 선형 모델을 독립적으로 맞춤했다. 모델에 포함된 변수는 표 2 에서 보고한다. 모델 한도는 최대 우도 기법 (maximum likelihood technique) 으로 어림잡았다. "응답자" 변수 (X1) 의 한도는 "응답성" 군 및 "비응답성" 군 환자들 사이의 발현 수준에서의 차이를 평가하기 위해 이용했다.

선형 모델에 포함된 변수의 설명. 정규 분포 오차항을 포함하는 이들 변수에 의해 정의되는 선형 모델은 각각의 프로브 집합에 대해 맞춰졌다.
변수	타입	값
유전자 발현	종속성 ( Y _ip )	환자 p 에서의 프로브 집합 i 의 정규화 log2 강도
절편	전체 평균(μ)
응답성	관심대상의 예측변수 ( X1 )	있음 / 없음
조직학	보정 공변 ( X2 )	선암 / 편평 / 기타
인종	보정 공변 ( X3 )	동양계 / 백인
성별	보정 공변 ( X4 )	여성 / 남성
RIN	보정 공변 ( X5 )	[2,…,7.9]

상기 모델에서, 응답성 변수는 하기와 같이 정의된다:

?응답성 = 있음: 최상의 응답 환자로서 부분적인 응답성이 있는 환자 (n=6)

?응답성 = 없음: 최상의 응답으로서 진행성 질환 (PD) 이 있거나 또는 종양 측정값이 없는 환자 (n=65)

안정 병변 상태에 있는 환자를 추출했다 (n=31). 이론적 근거는, 요법에 대해 표시가 더 나는 응답성을 가진 환자에 집중함으로써, 비-응답자 그룹이 더욱 동질이 된다는 것이다.

각각의 프로브 집합 i 에 대해, 통계 테스트의 목적은, 표 2 에 제시한 다른 보정 공변을 고려하여, 치료에 대해 응답성이 있는 환자와 치료에 대해 응답성이 없는 환자에서의 평균 발현 수준이 동등하다는 가설을 거부하는 것이었다. 정식으로, 동등함의 귀무가설을 양측 대립가설에 대해 테스트했다. 귀무 가설 하에, 상기 테스트에 대한 왈드 통계량 (Wald-statistic) 의 분포는 자유도 64 의 카이제곱 분포를 따른다 대응하는 p-값은 표 3 에서 보고한다.

선형 모델의 선택은 두가지 근거를 동기로 했다. 첫번째로는, 선형 모델은 관심대상의 변수의 효과를 추정할 때 혼선 조정을 가능하게 하는 다용도의, 특징분석이 잘 된 강건한 접근법이다. 두번째로는, 주어진 표본 크기가 71 이고, 데이터 세트의 정규화 및 척도화에 있어서, 정규 분포 가정은 합리적이었으며 타당했다.

다중적 테스트의 쟁점은, 별도로 발현된 유전자 목록을 밝혀내기 위한 잘못 선별될 비율 (False Discovery Rate (FDR)) 기준을 이용하여 다뤘다 (Benjamini 등, Journal of the Royal Statistical Society Series B-Methodological, 1995. 57(1): p. 289-300). 0.3 분계점 미만의 FDR 을 가진 프로브 집합을 유의한 것으로 했다. 0.3 컷-오프는, 허위 양성의 위험의 엄중한 제어를 이용한 다중적 테스트에 대한 엄격한 보정과 진정한 감별 마커를 놓칠 위험 사이의 합리적인 타협점으로서 선택했다. 확인된 마커 유전자는 표 3 에서 보고한다.

"응답자" 와 "진행자" 의 비교에 입각한 마커. 응답자는 "부분적 응답성" (PR) 과 동등한 최상의 응답성이 있는 환자로 정의했다. "진행자" 는 "진행성 질환" (PD) 과 동등한 최상의 응답성이 있거나 또는 측정이 불가능한 경우의 환자로 정의했다. 종양 측정을 하지 않은 환자는 "진행자" 그룹에 포함시켰는데, 이는 그들 대부분의 경우에 있어서, 질환 진행 또는 사망으로 인한 조기 탈퇴로 측정이 누락되었기 때문이다. 컬럼 1 은 프로브 집합의 Affymetrix 식별자이다. 컬럼 2 는 해당하는 유전자 서열의 GenBank 접근 번호이다. 컬럼 3 은 해당하는 공식적인 유전자 명칭이다 컬럼 4 는 선형 모델로 추정한 "응답자" 와 "진행자" 사이의 발현 수준에 있어서의 해당하는 보정된 평균 폴드 체인지 (fold change) 이다. 컬럼 5 는 선형 모델로부터 온 "응답자" 와 "진행자" 사이의 발현 수준 차이의 테스트에 대한 p-값이다. 컬럼 6 은 발현 수준에 있어서 보정된 평균 폴드 체인지에 대한 95% 신뢰 구간이다.
Affymetrix 프로브 집합 ID	GenBank	유전자	보정된 평균 폴드 체인지	P-값	CI 95%
204681_s_at	NM_012294 XM_928602 XM_935655 XM_937844	RAPGEF5	2	2.10E-05	1.5, 2.7

각각의 프로브 집합에 대해, 분산의 동질성 가정을, 모델 잔차를 근거로 하는 Fligner-Killeen 테스트를 이용하여 평가했다. 분석은 세 단계로 이루어졌다:

그들의 수준 사이의 잔차 분산의 상등에 대한 모든 범주형 변수를 테스트하는 단계

최소 p-값을 가진 변수 V 를 기록하는 단계

최소 p-값이 0.001 미만인 경우, 상이한 수준의 변수 V 가 다른 분산을 갖도록 하는 모델로 다시 맞추는 단계

추가적인 통계 분석

선별된 후보 마커 RAPGEF5 에 대해, 독립적인 통계전문가로 하여금 승인된 환경에서 하기의 추가적인 분석을 수행했다:

?Primary Affymetrix Analysis 으로부터의 PFS (무진행 생존; Progression free survival) 에 대한 단변량 Cox 회귀분석,

?Primary Affymetrix Analysis 로부터의 응답성에 대한 단변량 로지스틱 회귀분석 (Logistic Regression), 및

?Primary Affymetrix Analysis 로부터의 생존성에 대한 단변량 Cox 회귀분석

상기 분석 결과들은 하기에 제시한다. 이들은 1 차 분석 결과와 일치하며, 선별한 마커의 선택을 확인해 준다.

결과: Primary Affymetrix Analysis 으로부터의 PFS (무진행 생존) 에 대한 단변량 Cox 회귀분석:

유전자 환자수 위험비 위험비에 대한 95% CI p-값

PSPH 102 0.44 0.28; 0.69 0.0003

결과: Primary Affymetrix Analysis 으로부터의 응답성에 대한 단변량 Cox 회귀분석:

유전자 환자수 교차비 교차비에 대한 95% CI p-값

PSPH 102 95.77 5.84; >1000 0.0014

결과: Primary Affymetrix Analysis 으로부터의 생존성에 대한 단변량 Cox 회귀분석:

PSPH 102 0.47 0.28; 0.78 0.0040

qRT - PCR

RNase H 소화는 포함하지 않고 제조사의 지시에 따라 qRT-PCR 용 SuperScript^TM III First-strand Synthesis SuperMix (Invitrogen, CA, USA) 를 이용하여 cDNA 를 합성했다.

정량적 PCR 은, 제조사 (Applied Biosystems, CA, USA) 의 권장사항에 따라 ABI PRISM

7900HT Sequence Detection System 상에서 TaqMan

Gene Expression Assays 를 이용하여 수행했다. 모든 검정은 3 회씩 했다.

Gene Expression Assays 는 Hs00920287_m1 [RAPGEF5]) 를 이용했으며, 프라이머와 프로브가 엑손 경계에서 교차하거나 또는 관심대상의 Affymetrix Genechip

프로브 서열 내에 있도록 했다. 2 가지의 하우스-키핑 유전자 (house-keeping gene) 를 내부 표준으로서 포함시켰다: 베타-2-마이크로글로불린 (B2M; Assay Hs99999907_m1) 및 하이포크산틴포스포리보실 트랜스퍼라아제 (HPRT; Assay Hs99999909_m1).

모든 실행에는 보정 시료 (MVP^TM 인간 성인 폐 유래의 전체 RNA; Stratagene, CA, USA) 및 표준 곡선을 포함했다. Universal Human Reference total RNA (Stratagene, CA, USA) 을 EGFR 및 PSPH 표준 곡선에 대한 템플레이트로서 이용했다. RAPGEF5 mRNA 는 Universal Human Reference total RNA 에서 인정할 수 없을 만큼 낮은 수준으로 존재하여, MVP^TM 인간 성인 폐 유래의 전체 RNA 를 상기 유전자에 대한 표준 곡선 구축에 이용했다. 모든 시료는 3 회씩 측정했다. 상대적 정량은 -ΔCt 방법을 이용하여 수행했다.

결과

선행기술에서 보고한 바와 같이, Affymetrix Genechip

유전자 발현 프로파일은 본 연구에 포함된 102 명의 환자에 대해 측정했다. 상기 환자들 중에서, qRT-PCR 결과는 75 명에 대해 수득했다 (표 4). qRT-PCR 결과가 있는 환자의 인구통계 및 임상적 특징분석은 전체 집단 및 Genechip

유전자 발현 프로파일을 이용가능한 환자의 것과 유사했다.

기저값 특징: qRT - PCR 분석한 환자 (n=75)
특징
연령 (중앙값, 범위)	62 (39-85)
성별; n (%)
남성	19 (25)
여성	56 (75)
ECOG 전신 상태; n (%)
0	7 (9)
1	45 (60)
2	23 (31)
조직학; n (%)
선암	27 (36)
편평상피세포암	34 (45)
대세포암종	2 (3)
기타	12 (16)
질환 단계; n (%)
IIIB	22 (29)
IV	53 (71)
과거 화학요법 시행횟수; n (%)
0	19 (25)
1	36 (48)
≥2	20 (27)
민족; n (%)
백인	51 (68)
아시아인	24 (32)
흡연력 ; n (%)
없음	12 (16)
현재	24 (32)
과거	39 (52)

qRT-PCR 결과를 낸 75 명의 환자들 중, 4 명 (5%) 은 부분적인 응답성 (PR) 을 나타내며, 23 명 (31%) 은 SD 를 나타내며, 39 명 (52%) 은 PD 를 나타내며, 9 명 (12%) 은 평가하지 않았다. 상기 결과들은 전체 연구 집단 (n=264) 에서 관찰된 것과 매우 유사했다.

Affymetrix Genechip

데이터, qRT - PCR 데이터 및 임상 결과의 상관성

도 3 은 Affymetrix Genechip

프로파일링 및 qRT-PCR 로 평가한, 개별 환자에서의 RAPGEF5 에 대한 상대적 mRNA 수준을 보여준다. 도 3a 는 Genechip

프로파일링에 대한 발현 수준 대 임상 결과를 보여주며, 도 3b 는 qRT-PCR 에 대한 발현 수준 대 임상 결과를 보여준다.

도 3c 는 RAPGEF5 에 대한 Genechip

및 qRT-PCR 측정값 사이의 상관성을 보여준다.

RAPGEF5 에 대해 Genechip

및 qRT-PCR 측정값 사이에는 상관성이 있다. 에를로티니브를 이용한 임상 결과와 qRT-PCR 로 평가한 RAPGEF5 mRNA 수준과의 연관성은 Genechip

프로파일링으로 관찰된 것보다 약간 덜했다 (도 3b).

에를로티니브에 대한 응답성과 연관된 유전자의 확인

응답자들은 그의 최상의 응답이 부분적 응답인 환자들로 정했고, "진행자" 들은 진행성 질환을 갖고 있거나 또는 측정하지 않는 환자 (대부분의 경우, 질환 진행 또는 사망으로 인해 조기 탈퇴의 결과임) 로 정했다. 따라서, 본 모델에서는, 65 명의 진행자에 대해 6 명의 응답자가 있었다.

선형 모델은, HG-U133A 마이크로어레이 상에서 총 22283 개 중 임의의 새료에 존재하지 않는 상기 프로브 집합의 제거 후 분석에서 이용한 16353 개의 나머지 프로브 집합 각각에 대해 독립적으로 맞췄다. p-값은 각각의 프로브 집합에 대해 응답자와 비응답자 사이의 발현 차이에 대해 계산했다. 다중적 테스트에 대한 보정을 위해, 잘못 선별될 비율 (false discovery rate (FDR)) 을 0.3 으로 하여 적용했다. 이러한 분석으로 찾아낸 마커를 표 3 에 제시한다.

논의

암 요법의 수단으로서 상피 성장 인자 수용체 (EGFR) 를 표적으로 하는 것은, 여러가지 상피암에서 그의 어디에나 존재하는 일탈성 발현을 근거로 하여 제안되었다 (Davies & Chamberlin 1996, Mendelsohn, 2002). EGFR 은, 타이로신 키나아제 도메인에서의 돌연변이 활성화 및/또는 그의 증폭의 결과로서, 40 내지 80% 의 NSCLC 종양을 포함하는 다수 종양의 발병 및 진행에 관여한다. 활성화시, 그 수용체는 이량체화되어, 세포 증식, 전이, 아폽토시스 저해 및 신생혈관형성에서 역할을 하는 하류방향 표적들의 인산화를 초래한다 (Mendelsohn & Baselga, 2003).

2 가지 주된 클래스의 EGFR 저해제가 개발되었는데, 이는 수용체의 세포외 도메인을 표적으로 하는 모노클로날 항체, 및 수용체의 촉매성 도메인을 표적으로 하는 소분자 타이로신 키나아제 저해제이다. 후자에는, 세포내 결합 부위에 대해 ATP 와 경쟁하는 에를로티니브가 포함된다.

여성, 비흡연 상태, 아시아인 기원 및 선암 조직학을 포함하여 몇가지 인자들이 에를로티니브에 대한 감수성에 역할을 하는 것으로 제기되었는데; 그러한 환자들의 임상적 부분집합에서는 강화된 응답율이 분명한데, 환자 계층화에 대한 예측 분자 마커를 밝히고자 하는 집중적인 노력이 진행 중이다. EGFR 에서의 돌연변이화, EGFR 유전자 영역의 증폭 및 단백질 수준에서의 EGFR 의 과발현이 응답성과 정도를 다양하게 하며 연합되어 있는데, 이들은 응답성의 유일한 분자 결정자는 아니다.

고밀도 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 기법을 이용하여 조직 시료를 분석하고, 데이터에 통계 모델링을 적용함으로써, 그의 발현 수준이 에를로티니브에 대한 응답성을 예측케 하는 유전자를 확인할 수 있었다 (PR 대 PD 의 비교) (표 3). 상기 유전자는 응답자에서 과발현하는, 7p15.3 에 위치하는 RAPGEF5 이다 (2.0 배 상향조절; p=0.000021).

RAPGEF5 는 본 발명자의 분석에서 오직 (p=0.000021) 로 PD 에 비해 PR 에서 약 2 배 상향조절하는 것으로 나타났다. RAPGEF5 는, 신호전달에서 기능하는 GTPase 의 RAS 서브패밀리의 구성원인 Rap1 에 대한 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 (GEF) 이다. GEF 는 불활성 GDP- 및 활성 GTP-결합 상태 사이를 순환함으로써, 세포 표면 수용체 및 GTPase 활성화 사이에 중심축이 되는 연결을 제공한다. Rap1 은 Ras 와 밀접하게 연관되어 있으며, 혈소판 활성화, T-세포 면역성 결여, B-세포 활성화, 신경세포 분화의 조절을 포함하는 각종 세포 프로세스의 조절에 연루되어 있으며, 세포 결합 조절 및 인테그린 활성화 조절에 수반된다. 상기 프로세스 중 일부는 또한 NSCLC 의 진행에 대한 관련성이 있는 것으로 보인다. RAPGEF5 는, 최근 혈관 내피 세포 주화성의 중심축이 되는 조절자로 나타난 Rap1 의 조절을 통해 혈관생성에서 간접적인 역할을 맡을 수 있다. 신생혈관생성의 촉진은 신생물성 성장의 두드러진 특징이며; 혈관생성의 중요한 참가자들 중 하나인 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 를 특이적으로 표적으로 하는 약제인 베바시주마브 (bevacizumab) 는 최근 비-평편 NSCLC 에서의 화학요법과 병용하여 생존을 연장시키는 것으로 나타났다. 종양발생에서의 RAPGEF5 의 정확한 역할은 결정되어야 할 것으로 남아있지만, 이는 EGFR 이 신호전달하는 것으로 공지되어 있는 MAPK 경로에 추가적인 연결고리를 제공할 수 있다.

RAPGEF5 변이체 및 그의 해당하는 서열 식별 번호의 목록
유전자은행 접근 번호	유전자	서열 식별 번호
NM _012294	RAPGEF5	Seq . Id . No . 1
XM _928602	RAPGEF5 _ 변이체 _1	Seq . Id . No . 2
XM _935655	RAPGEF5 _ 변이체 _6	Seq . Id . No . 3
XM _937844	RAPGEF5 _ 변이체 _11	Seq . Id . No . 4

서열목록 전자파일 첨부

Claims

하기를 포함하는, 에를로티니브 (erlotinib) 를 이용한 치료에 대한 NSCLC (비-소세포 폐암) 환자의 시험관 내에서의 응답성 예측방법:
환자의 종양 시료에서 RAPGEF5 유전자의 발현 수준을 측정하고, RAPGEF5 유전자의 발현 수준을 비응답성 환자 집단의 종양에서의 RAPGEF5 유전자의 발현 수준의 대표값과 비교함, 여기서 환자의 종양 시료에서의 RAPGEF5 유전자의 더 높은 발현 수준은 치료에 응답할 환자에 대한 표식임.
제 1 항에 있어서, 발현 수준을 마이크로어레이 기법으로 측정하는 방법.
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에를로티니브 치료에 대한 NSCLC 환자의 응답성 예측에 RAPGEF5 유전자를 사용하는 방법.
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