ES2395588T3 - Marcador predictivo para el tratamiento con inhibidor de EGFR - Google Patents

Abstract

Un método in vitro para predecir la respuesta de un paciente con NSCLC al tratamiento con erlotinib quecomprende:determinar un nivel de expresión de un gen PTP4A1 en una muestra de tumor de un paciente y comparar el nivel deexpresión del gen PTP4A1 con un valor representativo de un nivel de expresión del gen PTP4A1 en los tumores deuna población de pacientes que no obtienen ningún beneficio clínico del tratamiento, en el que un nivel de expresiónmás bajo del gen PTP4A1 en la muestra de tumor del paciente es indicativo de un paciente que obtendrá unbeneficio clínico del tratamiento.

Description

Marcador predictivo para el tratamiento con inhibidor de EGFR

La presente invención proporciona un biomarcador que es predictivo para el beneficio clínico del tratamiento con inhibidor de EGFR en pacientes con cáncer

Una serie de tumores malignos humanos se asocian con expresión aberrante o sobre-expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). EGF, factor de crecimiento transformante-a (TGF-a), y un número de otros ligandos que se unen al EGFR, estimulando la autofosforilación del dominio tirosina quinasa intracelular del receptor. Posteriormente se activan una serie de rutas intracelulares, y estos eventos corriente abajo resultan en la proliferación de células tumorales in vitro. Se ha postulado que la estimulación de las células tumorales a través de la EGFR pueden ser importante para el crecimiento del tumor y en la supervivencia del tumor in vivo.

Los primeros datos clinicos con Tarceva ™, un inhibidor de la tirosina quinasa del EGFR, indican que el compuesto es seguro y bien tolerado en dosis que proporcionan la concentracion diana efectiva (según se ha determinado en los datos preclinicos). Los ensayos clinicos de fase I y II en pacientes con enfermedad avanzada han demostrado que Tarceva ™ ha presentado una actividad clínica prometedora en una serie de tumores epiteliales. En efecto, Tarceva ™ ha demostrado que es capaz de inducir remisiones parciales duraderas en pacientes tratados previamente para el cancer de cabeza y cuello y NSCLC (cancer de pulmon de celulas grandes) en una magnitud similar a la quimioterapia establecida de segunda linea, pero con el beneficio adicional de un mejor perfil de seguridad que la quimioterapia y una mayor comodidad (comprimidos en lugar de administración por vía intravenosa [iv]). Un ensayo recientemente finalizado, aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo (BR.21) ha demostrado que el agente Tarceva ™ por sí solo, prolonga significativamente y mejora la supervivencia de pacientes con NSCLC en los que ha fallado el tratamiento estándar para la enfermedad avanzada.

Tarceva ™ (erlotinib) es una molecula quimica pequena, es un inhibidor, activo por via oral, potente y selectivo de la tirosina quinasa de EGFR (EGFR-TKI).

El cancer de pulmon es la principal causa de muerte relacionada con cancer en America del Norte y Europa. En los Estados Unidos, el número de muertes secundarias al cáncer de pulmón supera las muertes totales combinadas de la segunda (colon), tercera (mama) y cuarta (próstata) de las causas principales de muerte por cáncer. Alrededor del 75% al 80% de todos los cánceres de pulmón son NSCLC, aproximadamente el 40% de los pacientes con enfermedad localmente avanzada y / o inextirpable. Este grupo suele incluir aquellos estadíos con masa IIIA y IIIB de la enfermedad, con exclusión de los derrames pleurales malignos.

La incidencia bruta de cáncer de pulmón en la Unión Europea es del 52,5, la tasa de mortalidad de 48,7 casos/100000/ano. Entre los hombres las tasas son de 79,3 y 78,3, entre las mujeres de 21,6 y 20,5, respectivamente. El NSCLC representa el 80% de todos los casos de cancer de pulmon. Alrededor del 90% de la mortalidad por cancer de pulmon entre los hombres y el 80% entre las mujeres, es atribuible al consumo de tabaco.

En los EE.UU., segun la Sociedad Americana del Cancer, en 2004, habia aproximadamente 173.800 nuevos casos de cancer de pulmon (93.100 en varones y 80.700 en mujeres) y representa alrededor del 13% de todos los nuevos casos de cáncer. La mayoria de los pacientes mueren como consecuencia de su enfermedad a los dos anos desde el diagnóstico. Para muchos pacientes con NSCLC, el éxito del tratamiento sigue siendo difícil de alcanzar. Los tumores avanzados a menudo no son susceptibles de cirugia y tambien pueden ser resistentes a las dosis tolerables de la radioterapia y la quimioterapia. En los ensayos aleatorizados, las quimioterapias de combinación actuales más activas alcanzaron tasas de respuesta de aproximadamente 30% a 40% y una tasa de supervivencia a 1 ano entre el 35% y el 40%. Esto es realmente un avance sobre la tasa de supervivencia del 10% a 1 ano vista con solo tratamiento de apoyo (Shepherd 1999).

Hasta hace poco, las opciones terapéuticas para los pacientes con recaída tras una recaída, se limitaban a la mejor atencion de apoyo posible o paliativos. Un estudio reciente que comparo docetaxel (Taxotere) con el mejor tratamiento de apoyo, mostro que los pacientes con NSCLC podrian beneficiarse de la quimioterapia de segunda línea después de que regímenes de primera línea a base de cisplatino hubieran fracasado. Pacientes de todas las edades y con estado funcional ECOG de 0, 1 o 2 mostraron una mejora en la supervivencia con docetaxel, al igual que los que habían sido refractarios al tratamiento previo a base de platino. Los pacientes que no se beneficiaron de la terapia incluyen aquellos con perdida de peso del 10%, niveles elevados de lactato deshidrogenasa, participacion de múltiples órganos, o afectación hepática. Además, el beneficio de la monoterapia con docetaxel no se extiende más allá de la configuración de segunda línea. Los pacientes tratados con docetaxel como tratamiento de tercera línea o más no mostraron prolongación de la supervivencia. Docetaxel como agente único se convirtió en un estandar de tratamiento de segunda linea para el NSCLC. Recientemente, otro ensayo aleatorizado de fase III para el tratamiento de segunda linea de NSCLC comparó pemetrexed (Alimta ®) con docetaxel. El tratamiento con pemetrexed resultó en una eficacia clínicamente equivalente, pero con considerablemente menos efectos secundarios en comparación con docetaxel.

Desde hace tiempo se reconoce que existe una necesidad de desarrollar métodos de tratamiento individualizado contra el cancer. Con el desarrollo de tratamientos dirigidos contra el cancer, hay un interes particular en metodologías que podría proporcionar un perfil molecular de la diana tumoral, (es decir, aquellos que son predictivos para el beneficio clínico). Ya se han establecido pruebas del principio para perfiles de expresión génica en el cáncer con la clasificación molecular de los tipos de tumores que no son aparentes sobre la base de las pruebas morfológicas e inmunohistoquímicas actuales. Dos entidades patológicas diferentes se han diferenciado con pronósticos diferentes con la clasificación actual única de linfoma difuso de células B grandes utilizando perfiles de expresión génica.

Por lo tanto, es un objetivo de la presente invencion proporcionar biomarcadores de expresión que son predictivos para el beneficio clínico del tratamiento con inhibidor de EGFR en pacientes con cáncer. Los siguientes documentos describen la prediccion de la respuesta de un NSCLC al tratamiento con un inhibidor de EGFR, en su mayoria sobre la base de perfiles de expresión:

WO 2005/049829; WO 2004/111273; KAKIUCHI SOJI ET AL: "Prediction of sensitivity of advanced non-small cell lung cancers to gefitinib (Iressa, ZD1839)", HUMAN MOLECULAR GENETICS, vol. 13, nº 24, 15 Deciembre 2004, páginas 3029-3043; OKANO TETSUYA ET AL: "Proteomic signature corresponding to the response to gefitinib (Iressa, ZD1839), an epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor in lung adenocarcinoma", CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. 13, nº 3, páginas 799-805.

En un primer objeto, la presente invención proporciona un método in vitro para predecir el beneficio clínico de un paciente con cáncer en respuesta al tratamiento con un inhibidor de EGFR que comprende los pasos de: determinar un nivel de expresion de un gen PTP4A1 en una muestra de tumor de un paciente y comparar el nivel de expresion del gen PTP4A1 con un valor representativo de un nivel de expresion del gen PTP4A1 en tumores de una poblacion de pacientes que derivan de un tratamiento sin ningún beneficio clínico, donde un nivel menor expresión del gen PTP4A1 en la muestra de tumor del paciente es indicativo de un paciente que obtendrá beneficio clínico del tratamiento.

La abreviatura PTP4A1 significa una proteina tirosina fosfatasa de tipo IVA, miembro 1. El Id. De Sec. N ° 1 muestra la secuencia de nucleotidos de PTP4A1 humano.

El termino "un valor representativo del nivel de expresion del gen PTP4A1 en tumores de una poblacion de pacientes que no obtienen ningún beneficio clinico del tratamiento" se refiere a una estimacion del nivel de expresion medio del gen marcador en tumores de una población de pacientes que no obtienen ningún beneficio clínico del tratamiento. Beneficio clinico se define como tener una respuesta objetiva o estabilización de la enfermedad durante

r 12 semanas.

En una realizacion preferida adicional, el gen PTP4A1 muestra entre 1,2 y 1,8 o mas veces menor nivel de expresion en la muestra tumoral del paciente en comparación con un valor representativo de la población de pacientes que no obtienen ningún beneficio clínico del tratamiento.

En una realización preferida, el nivel de expresión del gen marcador se determina mediante la tecnología de microarrays u otras tecnologias que evaluan los niveles de expresion de ARN como RT-PCR cuantitativa, o mediante cualquier metodo que analiza el nivel de expresion de la proteina correspondiente, por ejemplo, inmunohistoquimica (IHC). La construccion y el uso de chips de genes son bien conocidos en la tecnica, vease la Patente de EE.UU. N ° 5.202.231, 5.445.934, 5.525.464, 5.695.940, 5.744.305, 5.795.716 y 5.800.992. Vease tambien, Johnston, M. Curr. Biol. 8: R171-174 (1998); Iyer VR et al, Science 283:83-87 (1999).. Por supuesto, el nivel de expresión génica se puede determinar mediante otros métodos que son conocidos por un experto en la materia, tales como por ejemplo transferencia Northern, RT-PCR, PCR cuantitativa a tiempo real, extension de cebadores, proteccion de RNasa, perfil del expresion de ARN.

El gen marcador de la presente invención se puede combinar con otros biomarcadores en grupos de biomarcadores. Los grupos de biomarcadores pueden construirse a partir de cualquier combinación de biomarcadores predictivos para hacer predicciones sobre el efecto del tratamiento con inhibidores de EGFR en pacientes con cáncer. Los biomarcadores y grupos de biomarcadores descritos aqui se pueden utilizar, por ejemplo, para predecir como los pacientes con cáncer responderán a la intervención terapéutica con un inhibidor de EGFR.

El termino "gen" como se utiliza aqui comprende variantes del gen. El termino "variante" se refiere a secuencias de ácido nucleico que son sustancialmente similares a las secuencias de ácidos nucleicos dadas por el número de acceso de GenBank. El termino "sustancialmente similar" lo entiende bien un experto en la materia. En particular, una variante del gen puede ser un alelo que muestra intercambios de nucleótidos en comparación con la secuencia de ácido nucleico del alelo más frecuente en la población humana. Preferiblemente, dicha secuencia de ácido nucleico sustancialmente similar tiene una similitud de secuencia con el alelo más frecuente de al menos un 80%, preferiblemente al menos un 85%, más preferiblemente al menos un 90%, lo más preferible al menos un 95%. El termino "variantes" tambien se refiere a las variantes de corte y empalme.

El inhibidor de EGFR se puede seleccionar del grupo que consiste en gefitinib, erlotinib, PKI-166, EKB-569, GW2016, CI-1033 y un anticuerpo anti-erbB tal como trastuzumab y cetuximab.

En otra realización, el inhibidor de EGFR es erlotinib.

En aun otra realizacion, el cancer es NSCLC.

Las tecnicas para la deteccion y cuantificacion de la expresion genica de los genes descritos por esta invencion incluyen, pero no se limitan a transferencias Northern, RT-PCR, PCR cuantitativa a tiempo real, extensión de cebadores, proteccion de RNasa, perfiles de expresion de ARN y tecnicas relacionadas. Estas tecnicas son bien conocidas por los expertos en la técnica, véase, por ejemplo, Sambrook J et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Edicion (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 2000).

Las técnicas para la detección de la expresión de proteínas de los correspondientes genes descritos por esta invencion incluyen, pero no se limitan a tecnicas de inmunohistoquimica (IHC).

De acuerdo con la invencion, las celulas de una muestra de tejido del paciente, por ejemplo, una biopsia de tumor o de cáncer, puede analizarse para determinar el patrón de expresión de uno o más biomarcadores. El éxito o el fracaso de un tratamiento contra el cáncer puede determinarse basándose en el patrón de expresión de biomarcadores de las celulas del tejido analizado (celulas de ensayo), por ejemplo, una biopsia de tumor o del cáncer, al ser relativamente similares o diferentes del patrón de expresión de un grupo control de uno o más de los biomarcadores. En el contexto de esta invención, se encontró que el gen de la tabla 3 está regulado negativamente, es decir, muestra un nivel de expresion mas bajo, en los tumores de los pacientes que obtienen beneficio clinico del tratamiento inhibidor de EGFR en comparación con los tumores de los pacientes que no obtienen beneficio clínico del tratamiento con un inhibidor EGFR. Por lo tanto, si las celulas de ensayo muestran un perfil de expresion de biomarcadores que corresponde a la de un paciente que respondio al tratamiento del cancer, es muy probable o predecible que el cáncer o tumor del individuo responderá favorablemente al tratamiento con el inhibidor de EGFR. Por el contrario, si las celulas de ensayo muestran un patron de expresion de biomarcadores correspondiente a la de un paciente que no responde al tratamiento del cancer, es muy probable o predecible que el cancer o tumor del individuo no responda al tratamiento con el inhibidor de EGFR.

El biomarcador de la presente invención, es decir el gen listado en la tabla 3, es un primer paso hacia una terapia individualizada para los pacientes con cáncer, en particular para los pacientes con NSCLC refractario. Esta terapia individualizada permitirá a los médicos tratantes seleccionar el agente más apropiado de los medicamentos existentes para el tratamiento del cancer, en particular para el NSCLC. El beneficio de la terapia individualizada para cada futuro paciente es: tasas de respuesta / numero de pacientes que se benefician aumentara y el riesgo de efectos secundarios adversos debidos al tratamiento ineficaz se reducirá.

En un objeto adicional de la presente invencion se proporciona un método terapéutico de tratamiento de un paciente de cáncer identificado por el método in vitro de la presente invención. Dicho método terapéutico comprende la administración de un inhibidor de EGFR para el paciente que ha sido seleccionado para el tratamiento basado en el patron de expresion predictivo del gen de la tabla 3. Un inhibidor de EGFR preferido es erlotinib y un cancer preferido para tratar es NSCLC.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el diseno del estudio; La Figura 2 muestra el esquema de procesamiento de muestras; La Figura 3a muestra los niveles de expresión de PTP4A1 en comparación con el resultado clínico del perfil de Genechip®; La Figura 3b muestra los niveles de expresión de PTP4A1 en comparación con el resultado clínico de qRT-PCR y La Figura 3c muestra la correlación entre las mediciones de Genechip® y qRT-PCR para PTP4A1.

Parte experimental

Bases del estudio y diseno del estudio

Se ha descrito recientemente mutaciones en el gen EGFR en el tejido tumoral de un subgrupo de pacientes con NSCLC y la asociacion de estas mutaciones con la sensibilidad a erlotinib y gefitinib (Pao W, et al 2004;. Lynch et al 2004;. Paez et al. 2004). Para los pacientes combinados de dos estudios, se observo EGFR mutado en 13 de 14 pacientes que respondieron al gefitinib y en ninguno de los 11 pacientes tratados con gefitinib que no respondieron. La prevalencia de estas mutaciones fue del 8% (2 de 25) en pacientes no seleccionados con NSCLC. Estas mutaciones se encuentran más frecuentemente en adenocarcinomas (21%), en los tumores que afectan a mujeres (20%), y en tumores de pacientes japoneses (26%). Estas mutaciones resultan en un aumento de la actividad in vitro de EGFR y aumento de sensibilidad a gefitinib. La relacion de las mutaciones con enfermedad estable o duración de la supervivencia prolongada no ha sido evaluada prospectivamente.

Con base en los analisis exploratorios del estudio BR.21, parecia poco probable que el beneficio en la supervivencia observado sea sólo debido a las mutaciones del EGFR, ya que se mantiene un beneficio significativo en la supervivencia incluso cuando los pacientes con respuesta objetiva se excluyen del analisis (datos en el archivo). Otros mecanismos moleculares tambien deben contribuir al efecto.

Con base en el supuesto de que se produzcan cambios en los niveles de expresion de genes que son predictivos de la respuesta / beneficio para el tratamiento con Tarceva ™, se utilizo el analisis de microarrays para detectar estos cambios.

Esto requirió una población de estudio claramente definida tratados con Tarceva en monoterapia ™ tras el fracaso de la terapia de primera linea. Con base en la experiencia del estudio BR.21, la población beneficiaria se define como loa que tienen respuesta objetiva, o estabilización de la enfermedad durante 12 semanas. Se analizaron los conjuntos de datos clinicos y de microarrays de acuerdo con un plan estadistico predefinido.

La aplicacion de esta tecnica requiere tejido fresco congelado (FFT). Por lo tanto tuvo que realizarse obligatoriamente una biopsia antes del inicio del tratamiento. El material recogido se congeló en nitrógeno líquido (N2).

Una segunda muestra de tumor se recogio al mismo tiempo y se almacenó en parafina (fijada en formol e incluida en parafina, FFPE). Esta muestra se analizó para detectar alteraciones en la ruta de senalizacion de EGFR.

La capacidad de realizar biopsias de tumores a través de broncoscopia es un requisito previo para este estudio. La broncoscopia es un procedimiento estándar para confirmar el diagnóstico de cáncer de pulmón. Aunque generalmente es segura, existe el riesgo remanente de complicaciones, por ejemplo, sangrado.

Este estudio fue un primer paso hacia una terapia individualizada para pacientes con NSCLC refractario. Esta terapia individualizada permitirá a los médicos tratantes seleccionar el agente más apropiado de los medicamentos existentes para esta indicación.

Una vez que esté disponible la terapia individualizada, el beneficio para cada paciente futuro sera mayor que el riesgo que tienen que tomar los pacientes en el presente estudio: aumentará la tasa de respuesta / numero de pacientes que se benefician, se reducirá el riesgo de efectos secundarios adversos debido a un tratamiento ineficaz.

Bases de la selección de la dosis

Tarceva ™ se administra por via oral una vez al dia a una dosis de 150 mg hasta la progresion de la enfermedad, toxicidad intolerable o la muerte. La selección de esta dosis se basa en los parámetros farmacocinéticos, así como en el perfil de seguridad y tolerabilidad de esta dosis observado en los ensayos de Fase I, II y III en pacientes fuertemente pretratados con cáncer avanzado. Los niveles del medicamento observados en el plasma de pacientes con cancer que reciben la 150 mg / dia de dosis fueron consistentemente por encima de la concentración plasmática media de 500 ng / ml dirigido para la eficacia clinica. BR.21 mostro un beneficio de supervivencia con esta dosis.

Objetivos del estudio

El objetivo primario fue la identificacion de genes expresados diferencialmente que son predictivos de beneficio (RC, RP o EE 12 semanas) del tratamiento con Tarceva ™. Es un objetivo adicional importante la identificación de genes expresados diferencialmente predictivos de "respuesta" (RC, RP) para el tratamiento con Tarceva ™.

Los objetivos secundarios fueron evaluar las alteraciones en las vias de senalizacion del EGFR con respecto al beneficio del tratamiento.

Diseno del estudio

Descripcion del diseno del estudio y regimen de dosificacion

Este fue un estudio de Fase II abierto, de identificación de marcadores predictivos. El estudio se llevó a cabo en aproximadamente 26 centros de cerca de 12 países. Se reclutaron 264 pacientes con NSCLC avanzado tras el fracaso de al menos un régimen de quimioterapia en un período de 12 meses. Se administró Tarceva ™ oral de forma continua a una dosis de 150 mg / dia. Se permitió la reducción de dosis en base a la tolerabilidad al tratamiento farmacologico. Los parametros clinicos y de laboratorio se analizaron para evaluar el control de la enfermedad y la toxicidad. El tratamiento continuo hasta la progresión de la enfermedad, toxicidad inaceptable o la muerte. El diseno del estudio se representa en la figura 1.

Se obtuvieron muestras de tejido tumoral y de sangre para los análisis moleculares para analizar los efectos de Tarceva ™ y para identificar subgrupos de pacientes que se benefician de la terapia.

Análisis de los marcadores predictivos Las biopsias del tumor fueron tomadas dentro de las 2 semanas antes del inicio del tratamiento. Se recogieron dos muestras diferentes:

Se tomaron muestras del tumor a las 2 semanas antes del inicio del tratamiento. Se recogieron dos muestras diferentes: La primera muestra se congelo siempre inmediatamente en N2 líquido. La segunda muestra se fijo en formol e incluida en parafina. El tejido congelado rápidamente tuvo la más alta prioridad en este estudio. La Figura 2 muestra un esquema del procesamiento de la muestra.

Análisis de microarray Las muestras congeladas rápidamente se utilizaron para microdiseccion de captura por laser (LCM) de las celulas tumorales para extraer el ARN del tumor y el ARN del tejido circundante al tumor. El ARN se analizo en chips de microarrays Affymetrix (HG-U133A) para establecer el perfil de expresión de los genes tumorales de los pacientes. El control de calidad de los chips Affymetrix se utilizo para seleccionar aquellas muestras con una calidad adecuada para la comparación estadística.

Análisis de biomarcadores únicos de tejido fijado en formol incluido en parafina

La segunda biopsia del tumor, la muestra FFPE, se utilizó para realizar el análisis de mutaciones del ADN, IHC y ISH como se describe a continuación. Se realizaron análisis similares en el tejido recogido en el diagnostico inicial. El estado de las mutaciones del ADN de los genes que codifican EGFR y de otras moléculas implicadas en la ruta

de senalizacion de EGFR se analizaron por secuenciacion de ADN. La amplificacion genica de EGFR y de los genes

relacionados se estudiaron mediante FISH. Los análisis de expresión de proteínas incluyeron análisis inmunohistoquímico [IHC] de EGFR y de otras proteínas dentro de la ruta de senalizacion de EGFR.

Análisis de respuesta

Se utilizaron los criterios RECIST (Medición unidimensional del tumor) para evaluar la respuesta. Estos criterios se pueden encontrar en el siguiente enlace: http://www.eortc.be/recist/ A tener en cuenta que: Para asignar un estado de RC o RP, los cambios en las medidas del tumor deben

confirmarse mediante evaluaciones repetidas de al menos 4 semanas de diferencia, en cualquier momento durante

el período de tratamiento. En el caso de EE, las medidas de seguimiento deben haber cumplido los criterios de EE por lo menos una vez después de entrar en el estudio con un intervalo mínimo de 6 semanas.

En el caso de mantenerse la EE, las medidas de seguimiento deben cumplir con los criterios de EE al menos una vez después de entrar en el estudio con una duración de mantenimiento de al menos 12 semanas.

Análisis de la supervivencia Se llevó a cabo una revisión regular del paciente cada 3 meses ya sea en la visita del paciente a la clínica o por teléfono. Se registraron todas las muertes. Al final del estudio fue necesaria la confirmación definitiva de la supervivencia de cada paciente.

Métodos Preparacion de muestras de ARN y control de calidad de las muestras de ARN Todo el procesamiento de muestras de biopsias se realizó por un laboratorio de referencia de patologías; las

muestras frescas de tejido congeladas fueron enviadas desde los centros de investigación a las instalaciones de operaciones de muestras clínicas en Roche Basilea y desde alli al laboratorio de patologia para su posterior procesamiento. Se utilizó microdisección mediante captura con láser para seleccionar las celulas tumorales del tejido circundante. Despues de LCM, el ARN se purifico a partir del material tumoral enriquecido. El laboratorio de patología a continuación, llevó a cabo una serie de pasos para hacer una estimacion de la concentracion y la calidad del ARN.

Las RNasas son enzimas que degradan el ARN y se encuentran en todas partes y todos los procedimientos en los que el ARN se utiliza deben estar estrictamente controlados para minimizar la degradacion del ARN. La mayoria de las especies de ARNm tienen vidas medias más bien cortas y por lo tanto se consideran bastante inestables. Por lo tanto es importante realizar comprobaciones de integridad del ARN y cuantificacion antes de realizar cualquier ensayo.

La concentracion de ARN y el perfil de calidad puede analizarse usando un instrumento de Agilent (Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, CA) llamado 2100 Bioanalyzer ®. El software del instrumento genera un numero de integridad del ARN (RIN), una estimacion de cuantificacion (Schroeder, A., et al, El RIN:. Un numero de integridad del ARN para la asignacion de valores de integridad para mediciones de RNA. BMC Mol Biol, 2006 7: P. 3), y calcula las proporciones ribosómicas del ARN total de la muestra. El RIN se determina a partir del rastro electroforético total de la muestra de ARN, y por lo tanto incluye la presencia o ausencia de productos de degradación.

La calidad del ARN se analizo mediante un 2100 Bioanalyzer®. Solo las muestras con al menos un pico de rRNA por encima del ruido anadido de poli-I y con suficiente ARN se seleccionaron para su posterior analisis en la plataforma Affymetrix. El ARN purificado se trasladó al Centro de Roche de Genomica Medica (RCMG, Basilea, Suiza) para el analisis de microarrays. Se recibieron 122 muestras de ARN desde el laboratorio de patologia para su posterior procesamiento.

Marcaje de dianas de muestras de tejido de ARN

El marcaje de las dianas se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo de amplificación del marcaje de dianas en dos ciclos de Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, California), segun las instrucciones del fabricante.

El método se basa en el procedimiento de amplificación lineal estándar Eberwine pero utiliza dos ciclos de este procedimiento para generar suficiente ARNc marcado para la hibridación en un microarray.

La entrada de ARN total usado en la reaccion de marcaje fue de 10 ng para aquellas muestras en las que estaba disponible mas de 10 ng de RNA, si estaba disponible menos de esta cantidad o si no había datos cuantitativos disponibles (debido a una concentracion de ARN muy baja), se utilizó la mitad de la muestra total en la reacción. Los rendimientos de las reacciones de marcaje osciló entre 20-180 !g de ARNc. Un paso de normalizacion se introdujo al nivel de hibridación donde se utilizó 15 !g de ARNc para cada muestra.

Se utilizo ARN de referencia humano (Stratagene, Carlsbad, CA, USA) como muestra control en el flujo de trabajo con cada lote de muestras. Se utilizó 10 ng de este ARN como entrada junto con las muestras de prueba para verificar que los reactivos de marcaje y la hibridacion trabajaban como se esperaba.

Hibridaciones de microarray

Los microarrays HG-U133A de Affymetrix contienen más de 22.000 grupos de sondas dirigidas a aproximadamente

18.400 transcritos y a las variantes que representan unos 14.500 genes bien caracterizados.

La hibridacion para todas las muestras se llevo a cabo de acuerdo con las instrucciones de Affymetrix (Affymetrix Inc., Expression Analysis Technical Manual, 2004). Brevemente, para cada muestra, 15 mg de ARNc marcado con biotina se fragmento en presencia de cationes divalentes y se calentó e hibridó durante la noche en microarrays HG-U133A de Affymetrix de oligonucleotidos de genoma completo. Las dias siguientes se tineron los microarrays con estreptavidina-ficoeritrina (Molecular Probes; Eugene, OR) segun las instrucciones del fabricante. Los microarrays se escanearon utilizando un escaner GeneChip 3000 (Affymetrix), y las intensidades de senal se calcula ron automáticamente mediante el programa de funcionamiento GeneChip (SMOC) Version 1.4 (Affymetrix).

Análisis estadístico

El analisis de los datos de Affymetrix ™ constaba de cinco pasos principales.

Paso 1 de control de calidad. El objetivo fue identificar y excluir del análisis datos de la matriz con un perfil de calidad por debajo del estándar.

Paso 2 de pre-procesamiento y normalizacion. El objetivo fue crear un "conjunto de datos para análisis" escalado y normalizado susceptibles de comparación entre chips. Comprendia una estimacion y sustracción del ruido de fondo,

el resumen de la sonda y escalado.

Paso 3 de exploracion y la descripcion. El objetivo fue identificar los posibles sesgos y las fuentes de variabilidad. Consistio en la aplicacion de tecnicas descriptivas de analisis multivariados y univariados para identificar covariables influyentes.

Paso 4 de modelado y análisis. El objetivo fue identificar una lista de marcadores candidatos en base a la evaluación estadística de la diferencia en el nivel de expresión medio entre los pacientes con "beneficio clinico" y "sin beneficio clinico". Consistia en ajuste de un modelo estadistico adecuado para cada grupo de sondas y obtener una medida de significación estadística.

Paso 5 de analisis de la robustez. El objetivo fue generar una lista cualificada de marcadores candidatos que no dependen en gran medida de los métodos de pre-procesamiento y supuestos estadisticos. Consistia en reiterar el análisis con diferentes enfoques metodologicos y que intersecciona la lista de candidatos. Todos los analisis se realizaron utilizando el paquete de programas R.

Paso 1: Control de calidad

La evaluación de la calidad de los datos se basó en la comprobación de varios parámetros. Estos incluían parámetros de calidad estándar de Affymetrix GeneChip ™, en particular: factor de escalado, porcentaje de la presente convocatoria y ruido de fondo medio. Este paso tambien incluye la inspeccion visual de las imagenes virtuales del chip para la deteccion de problemas de hibridacion localizados, y la comparacion de cada chip con una media de chip virtual para detectar cualquier desplazamiento atípico del comportamiento medio. También se realizó un análisis de correlación entre chips para detectar valores atípicos en las muestras. Además, fueron tomadas en consideración las medidas auxiliares de calidad de ARN obtenidas a partir del analisis de muestras de ARN con el Bioanalyzer Agilent 2100 ™.

Basado en estos parametros, se excluyeron del análisis los datos de 20 microarrays. Asi, se incluyeron en el analisis los datos de un total de 102 microarrays que representan 102 pacientes. La descripcion clinica de este conjunto de 102 muestras se presentan en la tabla 1.

Tabla 1: Descripción de las características clínicas de los pacientes incluidos en el análisis

Variable

Valor n=102

n (%)

Mejor respuesta

N/A 16 (15,7%)

EP

49 (48,0%)

EE

31 (30,4%)

RP

6 (5,9%)

Beneficio clínico

NO 81 (79,4%)

SI

21 (20,6%)

SEXO

MUJER 25 (24,5%)

HOMBRE

77 (74,5%)

ETNIA

CAUCASIANA 65 (63,7%)

ORIENTAL

37 (36,3%)

Histología

ADENOCARCINOMA 35 (34,3%)

ESCAMOSO

53 (52,0%)

OTROS

14 (13,7%)

FUMADOR

NO 20 (19,6%)

SI

82 (80,4%)

Paso 2: Datos de pre-procesamiento y normalizacion

Se utilizó el algoritmo Therma (Irizarry, RA, et al, Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data. Nucl Acids Res, 2003 31 (4): p. e15) para pre-procesamiento y normalizacion. Se utilizó el algoritmo mas5 (Affymetrix, GeneChip ® Expression: Data Analysis Fundamentals 2004, Affymetrix) para realizar la detección para los grupos de sondas individuales. Los grupos de sondas llamados "ausente" o "marginal" en todas las muestras se extrajeron del posterior análisis, 5930 grupos de sondas se retiraron del análisis según en este criterio. El grupo de datos para el análisis consistió por lo tanto de una matriz con 16353 grupos de sondas (de 22283) medidas en 102 pacientes.

Paso 3: Descripción y exploración de los datos

Se realizó un analisis descriptivo exploratorio para identificar los posibles sesgos y las principales fuentes de variabilidad. Se seleccionó un conjunto de covariables con un impacto potencial sobre los perfiles de expresion génica. Comprendia ambas variables tecnicas y clinicas. Las covariables técnicas incluyeron: fecha de procesamiento del ARN (referido más adelante como lote), RIN (como medida de la calidad / integridad del ARN), y

operador y centro de recogida de muestras. Las covariables clinicas incluyeron: tipo histológico, tabaquismo, estadío tumoral, puntuacion de rendimiento (Oken, MM, et al, Toxicity and response criteria of the Eastern Cooperative Oncology Group. Am J Clin Oncol, 1982. 5 (6): p. 649 -55), datos demográficos, estado del respondedor y el estado de beneficio clínico.

Las herramientas de analisis incluyen ANOVA univariante y analisis de componentes principales. Para cada una de estas covariables, se aplico ANOVA univariante de forma independiente para cada grupo de sonda.

Se identificó un efecto significativo de la variable de lotes. En la práctica, la variable de lotes capturó diferencias entre las fechas de procesamiento de la muestra y el lote del chip Affymetrix. Despues de comprobar que la variable de lote fue casi independiente de las variables de interés, el efecto lote se corrigió usando el método descrito en Johnson, WE, Li C., y Rabinovic A., Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostat 2007. 8 (1): p. 118-127.

Los grupos de datos normalizados establecido después de la corrección del efecto de los lotes sirvieron como datos de análisis establecido en los análisis posteriores.

Histologia y RIN dos variables adicionales importantes destacados mediante el análisis descriptivo.

Paso 4: Modelado de datos y análisis.

Se ajusto un modelo lineal de forma independiente para cada grupo de sondas. Las variables incluidas en el modelo se describen en la tabla 2. Los parámetros del modelo se estimaron mediante la técnica de máxima probabilidad. El parámetro correspondiente a la variable de "beneficio clinico" (X1) se utilizo para evaluar la diferencia en el nivel de expresion entre el grupo de pacientes con beneficio clinico y el grupo sin beneficio clinico.

Tabla 2: Descripción de las variables incluidas en el modelo lineal.

Variable

Tipo Valor

expresión génica

Dependiente (Yip) log2 de la intensidad del grupo de sondas i en el paciente p.

Intercepcion

Media general (!)

Beneficio Clinico

Predictor de interés (X1) SI / NO

Histología

Ajuste de covarible (X2) ADENO. / ESCAM. / OTRO

RAZA

Aj. Cov. (X3) ORIENT. / CAUCAS.

SEXO

Aj. Cov. (X4) MUJER / HOMBRE

RIN

Aj. Cov. (X5) [2,...,7.9]

FUMADOR

Aj. Cov. (X6) ACTUAL/EX-FUMADOR/NUNCA

Estadío

Aj. Cov. (X7) INEXTIRPABLE.III / IV

Para cada grupo de sondas i, el objetivo de la prueba estadistica fue rechazar la hipotesis de que los niveles de expresión media en pacientes con beneficio clinico y pacientes sin beneficio clínico son iguales, teniendo en cuenta el ajuste de otras covariables enumeradas en la tabla 2. Formalmente, la hipótesis nula de igualdad se analizó contra una alternativa de dos colas. Los correspondientes valores de p se indican en la tabla 3.

La elección del modelo lineal fue motivada por dos razones. En primer lugar, el modelado lineal es un método versatil, bien caracterizado y solido que permite el ajuste de las variables de confusion cuando se estima el efecto de la variable de interes. En segundo lugar, dado el tamano de muestra de 102, y la normalizacion y escalado del conjunto de datos, la asunción de distribucion normal era razonable y justificada.

Para cada grupo de sondas, la asunción de homogeneidad de varianza se evaluó utilizando pruebas Fligner-Killeen basadas en la residualidad del modelo. El análisis consistió en 3 pasos:

1.

Analizar cada una de las variables categóricas para la homogeneidad de la varianza residual

2.

Tener en cuenta la variable V con el menor valor de p

3.

Si al menos el valor p es menor que 0,001, reajustar el modelo permitiendo diferente nivel de variables V para tener una varianza diferente.

Paso 5: Robustez

El objetivo del analisis de la robustez fue reducir el riesgo de que los resultados del análisis pudieran ser un artefacto y un resultado de los pasos de pre-procesamiento o suposiciones subyacentes en el analisis estadistico. Se consideraron los siguientes tres aspectos: a) inclusión o exclusión de algunas chips adicionales en el paso de control de calidad; b) algoritmo de pre-procesamiento y normalizacion, y c) supuestos estadisticos y pruebas de aproximación.

La lista de marcadores candidatos se define como el subconjunto de genes declarado consistentemente como significativo con diferentes ajustes de análisis. Las diferentes opciones de análisis aplicados han sido los siguientes:

a) Un subgrupo adicional de 8 chips se identificó en base a criterios de control de calidad más estrictos. Un "grupo

5 de datos reducido" se definio mediante la exclusión de estos 8 chips. b) MAS5 se identificó como una alternativa a rma para el pre-procesamiento y normalizacion. MAS5 utiliza diferentes métodos para la estimación de ruido de fondo, el resumen de la sonda y la normalizacion. c) Se utilizaron dos pruebas estadísticas adicionales.

10 a. Una prueba de Wilcoxon para la diferencia entre beneficio clinico y sin beneficio clínico y

b. una prueba de razón de verosimilitud (LRT) para el modelo de regresion logistica donde el beneficio clínico se tomó como la variable de respuesta y la expresion de genes como covariable. Estas dos pruebas adicionales se basan en un conjunto diferente de supuestos estadisticos subyacentes. Para cada grupo de sondas, la LRT estaba siguiendo un Chi-cuadrado con 1 grado de libertad.

15 En resumen, se consideraron dos conjuntos de muestras (el conjunto de datos "completo" y el conjunto de datos"reducido"), y 2 algoritmos de pre-procesamiento (mas5 y rma); esto resulto en cuatro diferentes conjuntos de análisis de datos. Para cada uno de estos cuatro conjuntos de datos, se aplicaron tres pruebas estadísticas diferentes. Por lo tanto, para cada grupo de sondas, se calcularon tres valores de p. En cada conjunto de analisis de

20 datos, se aplicó un criterio compuesto para identificar la lista de genes regulados diferencialmente. Este criterio compuesto se define como: el máximo valor p es inferior a 0,05 y los minimos valores de p son inferiores a 0,001. El análisis de robustez utilizando un criterio de 1 para la identificación de genes marcadores proporcionó PTP4A1 como marcador predictivo para el tratamiento inhibidor de EGFR.

25 Tabla 3:

Gen marcador para un beneficio clínico basado en el análisis de la robustez después de la aplicación del criterio compuesto. La columna 1 es el identificador de Affymetrix del grupo de sondas. La columna 2 es el numero de acceso de GenBank de la correspondiente secuencia del gen. La columna 3 es el correspondiente nombre oficial del gen. La columna 4 es el correspondiente cambio medio ajustado de numero de veces en el nivel de expresión entre beneficio clinico y ningun beneficio clinico al paciente, estimado a partir del modelo lineal. La columna 5 es el valor p para la prueba de la diferencia en el nivel de expresion entre pacientes con beneficio clinico y sin beneficio clínico a, derivado del modelo lineal. La columna 6 es el intervalo de confianza del 95% para el cambio medio ajustado de veces en el nivel de expresion.

ID del grupo de sonda Affymetrix

GenBank Gen cambio medio ajustado Valor p IC 95 %

200732_s_at

NM 003463 (Id. De Sec. N° 1) PTP4A1 -1,44 3,2x1E-3 -1,8 , -1,2

Análisis estadístico adicional

Para el marcador candidato PTP4A1 seleccionado, se realizaron los siguientes analisis adicionales en un entorno 30 validado por estadísticos independientes:

• Regresion de Cox univariante para la SLP (supervivencia libre de progresión) a partir del análisis primario de Affymetrix,

• Regresión logística univariante para el beneficio clínico a partir del análisis primario de Affymetrix, y 35 • Regresion de Cox univariante para la supervivencia a partir del análisis primario de Affymetrix

Los resultados de estos análisis se presentan a continuación. Estos son consistentes con los resultados del análisis principal y confirma la elección del marcador seleccionado.

40 Resultados: Regresion de Cox univariante para la SLP (supervivencia libre de progresión) a partir del análisis primario de Affymetrix:

Gen

N° de pacientes Proporción de riesgo IC 95 % CI para la proporción de riesgo valor p

PTP4A1

102 1,69 1,23; 2,33 0,0011

Resultados: Regresión logística univariante para el beneficio clínico a partir del análisis primario de Affymetrix:

Gen

N° de pacientes Razón probabilidades de IC 95 % CI para la razón de probabilidades valor p

PTP4A1

102 0,22 0,08; 0,57 0,0018

Resultados: Regresion de Cox univariante para la supervivencia a partir del análisis primario de Affymetrix:

Gen

N° de pacientes Proporción de riesgo IC 95 % para la proporción de riesgo valor p

PTP4A1

102 1,63 1,15; 2,30 0,0055

qRT-PCR

Se sintetizó ADNc utilizando SuperScriptTM III First-strand Synthesis SuperMix para qRT-PCR (Invitrogen, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante, pero sin la inclusión de una digestión de RNasa H.

La PCR cuantitativa se realizo utilizando ensayos de expresion genica TaqMan ® en un sistema de detección de

10 secuencias ABI PRISM@ 7900HT de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Applied Biosystems, CA, EE.UU.). Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Los cebadores y sondas utilizados sobrepasaron los limites del exón o estaban dentro de la secuencia de la sonda de interés Affymetrix GeneChip ®. Dos genes de mantenimiento se incluyeron como controles endogenos: beta-2

15 microglobulina (B2M; Ensayo Hs99999907 ml) e hipoxantinafosforibosil transferasa (HPRT; Ensayo Hs99999909_ml).

Todas los análisis incluyeron un calibrador de muestra (ARN total MVPTM de pulmon humano adulto; Stratagene, CA, EE.UU.) y una curva estandar. Se utilizo como plantilla ARN total de referencia universal de humanos

20 (Stratagene, CA, EE.UU.) para las curvas estandar PTPRF. Todas las muestras se midieron por triplicado. La cuantificación relativa se realizó usando el método -LCt.

Resultados

25 Tal como se describió anteriormente, se determinaron los perfiles de expresion genica Affymetrix GeneChip ® para 102 pacientes incluidos en este estudio. Entre estos pacientes, se obtuvieron los resultados de qRT-PCR para 75 (tabla 4). Los datos demograficos y las caracteristicas clinicas de los pacientes con resultados de qRT-PCR fueron similares a los de toda la poblacion (n = 264) y de los pacientes con perfiles de expresion genica GeneChip ® disponibles.

Tabla 4: Caracteristicas basales: pacientes con análisis de qRT-PCR (n=75)

Caracteristica

Edad (mediana, rango)

62 (39-85)

Genero; n (%)

Hombre

19 (25)

Mujer

56 (75)

Escala de calidad de vida ECOG; n (%)

0

7 (9)

1

45 (60)

2

23 (31)

Histologia; n (%)

Adenocarcinoma

27 (36)

Carcinoma de celulas escamosas

34 (45)

Carcinoma de celulas grandes

2 (3)

Otro

12 (16)

Estadio de la enfermedad; n (%)

IIIB

22 (29)

IV

53 (71)

Numero de regimenes previos de quimioterapia; n (%)

0

19 (25)

1

36 (48)

r2

20 (27)

Etnia; n (%)

Caucasiana

51 (68)

Asiática

24 (32)

Tabaquismo; n (%)

No fumador

12 (16)

Fumador

24 (32)

Ex - fumador

39 (52)

De los 75 pacientes con resultados de qRT-PCR, 4 (5%) presentaron una respuesta parcial (RP), 23 (31%)

presentaron EE, 39 (52%) presentaron EP, y 9 (12%) no pudieron evaluarse. Estos resultados fueron muy similares a los observados en la población total del estudio (n=264).

La Figura 3 muestra los niveles relativos de ARNm para PTP4A1 en cada paciente, segun la evaluación del perfil de GeneChip ® de Affymetrix y qRT-PCR. La Figura 3a muestra los niveles de expresion frente a la evolucion clinica de los perfiles de GeneChip ® y la Figura 3b muestra los niveles de expresion de qRT-PCR.

Hubo una buena correlación entre las mediciones de GeneChip ® y qRT-PCR de la transcripcion del mRNA de PTP4A1 (Figura 3c, p de Pearson = 0,6, p <0,01). Segun se observo con los perfiles de GeneChip ®, los niveles de mRNA de PTP4A1 analizados mediante qRT-PCR parecen correlacionarse con la respuesta a erlotinib, con niveles más altos observados en los respondedores frente a los no respondedores.

Discusión

Mediante el analisis de muestras de tejido con tecnologia de microarrays de oligonucleotidos de alta densidad, y la aplicación de modelos estadísticos para los datos, fuimos capaces de identificar los genes cuyos niveles de expresión puede ser predictivos de pacientes que obtienen un beneficio clínico del tratamiento con erlotinib.

Se aplicó un criterio compuesto (definido anteriormente). Resulto en PTP4A1 como marcador predictivo para el tratamiento inhibidor de EGFR.

PTP4A1 es el segundo miembro de la familia de la proteina tirosina fosfatasa. Se encuentra en el cromosoma 6q12 y codifica una proteina que pertenece a una pequena clase de proteina tirosina fosfatasas (PTP) prenilados, que contiene un dominio PTP y un motivo de prenilación C-terminal. Esta tirosina fosfatasa es una proteína nuclear, pero puede estar principalmente asociada a la membrana plasmática.

Varios informes han asociado la alta expresion de PTP4A1 con la actividad oncogénica, específicamente el aumento de la tasa de proliferacion y motilidad celular e invasividad. Un estudio reciente en células grandes de cáncer de pulmon ha demostrado un papel funcional de PTP4A1 en los procesos de migración celular e invasión.

En este estudio, se encontro que PTP4A1 estaba regulada negativamente en los pacientes que obtienen un beneficio clínico del tratamiento con erlotinib. La función oncogénica de este gen es un argumento claro a favor de su utilidad como marcador tumoral.

Listado de secuencias

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

<120> Marcador predictivo para el tratamiento con inhibidor de EGFR

<130> 24411WO

<150> EP07114309.3

<151> 2007-08-14

<160> 1

<170> PatentIn versión 3.4

<210> 1

<211> 5099

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un metodo in vitro para predecir la respuesta de un paciente con NSCLC al tratamiento con erlotinib que comprende:

   determinar un nivel de expresion de un gen PTP4A1 en una muestra de tumor de un paciente y comparar el nivel de expresión del gen PTP4A1 con un valor representativo de un nivel de expresion del gen PTP4A1 en los tumores de una población de pacientes que no obtienen ningún beneficio clínico del tratamiento, en el que un nivel de expresión mas bajo del gen PTP4A1 en la muestra de tumor del paciente es indicativo de un paciente que obtendrá un

   10 beneficio clínico del tratamiento.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, en el que el nivel de expresión se determina mediante tecnologia de microarrays.

3. 3.

   El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que el gen PTP4A1 muestra entre 1,2 y 1,8 o mas veces menor nivel de

   15 expresión en la muestra de tumor del paciente en comparación con el valor representativo de un nivel de expresión genica de PTP4A1 en tumores de una población de pacientes que no obtienen ningún beneficio clínico del tratamiento.
4. 4. El uso de un gen PTP4A1 para predecir la respuesta de un paciente con NSCLC al tratamiento con inhibidor de 20 EGFR, en el que el inhibidor de EGFR es erlotinib.